CN112033783A - 一种dna倍体染色液及制备方法和染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种DNA倍体染色液及制备方法和染色方法，制备的DNA染色液可解决制片中背景易共染，染色时间较长，切片易褪色的问题，从而为肿瘤细胞核DNA含量图像测定提供了一种可靠的组织化学染色技术，利用浓度为95％酒精对细胞核进行固定，避免未经固定的细胞核在染色水解过程中，会使DNA形成小片段，游离出细胞核，影响DNA测量的准确性，固定可以封闭那些在水解前产生的醛基，减少假阳性产物。同时利用BS固定液可以使DNA分子空间结构发生改变，影响对酸水解的敏感性，避免因固定液选择不当或组织固定时间过长，染色反应的强弱存在较大差别，导致染色质着色较淡。通过梯度酒精脱水使得DNA染色结果清晰，背景更干净。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种DNA倍体染色液及制备方法和染色方法。
背景技术
分析细胞的细胞周期和DNA倍体已经日益广泛地应用于临床，为肿瘤的诊断、疗效评价和预后预测提供了重要的依据，在科研中也越来越多地用于细胞动力学，细胞调亡观察等方面。DNA倍体分析结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，提高肿瘤的治愈率和生存率。尤其对细胞抽提物、体液、腺体分泌物、组织的脱落细胞的分析，意义非常重要。DNA倍体分析技术在膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、皮肤黑色素瘤的早期诊断和预后方面具有重要价值，而随着时间变化的增殖状态测量和分析反映了肿瘤的生长速度和侵袭性。肿瘤细胞有异常的DNA含量，通过对异常DNA倍体细胞的检测，可以知道样本是否存在突变的细胞与突变细胞数量。
传统的显微目视技术过多的依靠医务人员的经验，眼睛观察检测，容易因为视觉疲劳对异常细胞视而不见，导致漏诊误诊，检测结果的主观性大，难于量化、标准化。计算机图像技术发展，把显微图像数字化，使用自动化扫描仪对样本实现连续图像采集，对图像分析，可快速采集到图像几何学、形态学、光学等上百种参数。检测结果准确性，特异性与敏感性均提高，肿瘤早期诊断中有非常明显的优势。
而DNA-Feulgen染色方法至今仍然是DNA定量测定的主要染色方法之一，但传统Feulgen染色关键在酸水解，水解不足或过度，均可影响染色效果，同时传统Feulgen染色液存在染色特异性不强，背景易共染，染液配置较复杂，对反应条件要严格，染色时间较长，切片易褪色等问题。
发明内容
本发明旨在克服现有技术缺陷，提供一种DNA倍体染色液及制备方法和应用。本发明解决其技术问题所采用的具体技术方案如下：
一种DNA倍体染色液，每400ML-12000ML所述染色液包括如下组分：0.1g-3g噻嗪类染料硫堇、1.2-36g助染剂亚硫酸氢钠、4-120ml盐酸及58-1740ml叔丁醇、余量为蒸馏水。
本发明的一种DNA倍体染色液的制备方法，包括如下步骤：
S1：将适量噻嗪类染料硫堇与蒸馏水倒入锅中，加热至100℃，2-3min后停火，水温降至60-80℃；
S2：在烧杯内加入适量的叔丁醇及盐酸；
S3：将适量的助染剂亚硫酸氢钠与上述两种液体一同倒入带塞瓶内，搅拌均匀后与磁力转子一同放入通过磁力搅拌器搅拌后过滤即得所述染色液。
优选的，所述步骤S1-S3均在恒温箱内避光进行，温度保持在20℃-35℃，所述步骤3磁力搅拌器的搅拌时长为60-90min。
本发明的一种DNA倍体染色液的应用，包括如下步骤：
S1：细胞学制片完成后，用浓度为95％酒精固定15-30min；
S2：流水清洗5min-10min，用BS固定液固定20-60min；
S3：流水清洗5min-10min，用盐酸水解15-30min；
S4：流水清洗5min-10min，用所述DNA染色液进行染液20-60min；
S5：35℃蒸馏水浸泡5min-10min，用梯度酒精分别脱水2-10min后，用二甲苯透明1-5min中性树胶封片。
优选的，所述BS固定液由320ml甲醇、60ml甲醛及20ml冰醋酸组成。
优选的，所述步骤S5中的梯度酒精浓度分别为50％、75％、95％及无水酒精。
优选的，所述步骤S1-S4均在35℃±2℃恒温箱内避温进行。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：硫堇做为一种噻嗪类染料，其利用酸解的方法打断DNA分子链中的嘌呤一脱氧核糖键，即去嘌呤作用，然后DNA部分区域发生重排，暴露出醛基，硫堇能与细胞中的醛基反应形成一种醌型化合物，使细胞核DNA染成蓝色。经实际应用证实，本发明的利用硫堇染色法较传统Feulgen染色法染色结果清晰可靠，特异性强，背景干净，染液配制方便，染液较稳定，染色方法简单，染色时间短，切片无褪色现象发生，因此能解决制片中背景易共染，染色时间较长，切片易褪色的问题，从而为肿瘤细胞核DNA含量图像测定提供了一种可靠的组织化学染色技术。另一方面本发明的DNA倍体染色液的染色方法中先利用浓度为95％酒精对细胞核进行固定，避免未经固定的细胞核在染色水解过程中，会使DNA形成小片段，游离出细胞核，影响DNA测量的准确性，固定可以封闭那些在水解前产生的醛基，减少假阳性产物。同时利用BS固定液可以使DNA分子空间结构发生改变，影响对酸水解的敏感性，避免因固定液选择不当或组织固定时间过长，染色反应的强弱存在较大差别，导致染色质着色较淡，最后通过梯度酒精脱水使得DNA染色结果清晰，背景更干净。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，其中描述了实现本发明采用的实施例。应明白，还可使用其他的实施例，或者对本文所举的实施例进行结构和功能上的修改，而不会脱离本发明的范围和实质。
实施例1：
一种DNA倍体染色液，每400ML所述染色液包括如下组分：0.3g噻嗪类染料硫堇、3.6g助染剂亚硫酸氢钠、12ml盐酸及175ml叔丁醇、200ml的蒸馏水。
准备上述原料，进行DNA倍体染色液的制备，主要包括如下步骤：
S1：将0.3g硫堇与200ml蒸馏水倒入锅中，加热至100℃，3min后停火，水温降至75℃；
S2：在烧杯内加入175ml的叔丁醇及12ml的5N盐酸；
S3：将3.6g的亚硫酸氢钠与上述两种液体一同倒入带塞瓶内，搅拌均匀后与磁力转子一同放入通过磁力搅拌器搅拌60min后过滤即得所述染色液。
具体的，步骤S1-S3均在恒温箱内避光进行，温度保持在35℃。
本发明的一种DNA倍体染色液的染色方法，包括如下步骤：
S1：细胞学制片完成后，用浓度为95％酒精固定25min；
S2：流水清洗5min，用BS固定液固定40min；
S3：流水清洗5min，用5N盐酸水解25min；
S4：流水清洗5min，用上述制备的DNA染色液进行染液40min，制备的染液较稳定，染色方法简单，染色时间短，切片无褪色现象发生，因此能解决制片中背景易共染，染色时间较长，切片易褪色的问题；
S5：35℃蒸馏水浸泡5min后用梯度酒精分别脱水2min后，用二甲苯透明1-5min中性树胶封片。
具体的，乙醇透入组织细胞非常快，能使组织细胞变硬，可溶解一部分细胞内含物，固定一些水溶性物质；BS固定液由320ml甲醇、60ml甲醛及20ml冰醋酸组成，BS固定液可以使DNA分子空间结构发生改变，影响对酸水解的敏感性，避免因固定液选择不当或组织固定时间过长，染色反应的强弱存在较大差别，导致染色质着色较淡。
具体的，步骤S5中的梯度酒精浓度分别为50％、75％、95％及无水酒精分别脱水2min，若直接用高浓度酒精脱水，高浓度酒精会使生物材料表面急剧脱水形成一层类似于保护膜的结构，影响到内部材料的脱水，通过梯度酒精脱水使得DNA染色结果清晰，背景更干净。
具体的，步骤S1-S4均在35℃±2℃恒温箱内避光进行。
实施效果，DNA蓝紫色，结构清晰，胞浆透明，背景干净，数字扫描仪识别全部细胞，分析正常，结果准确。
实施例2：
一种DNA倍体染色液，每500ML所述染色液包括如下组分：0.6g噻嗪类染料、4g助染剂、20ml强酸及200ml醇类、300ml的蒸馏水。
具体的，噻嗪类染料为硫堇；助染剂为亚硫酸氢钠，醇类为叔丁醇；强酸为盐酸。
准备上述原料，进行DNA倍体染色液的制备，主要包括如下步骤：
S1：将0.6g硫堇与300ml蒸馏水倒入锅中，加热至100℃，3min后停火，水温降至75℃；
S2：在烧杯内加入175ml的叔丁醇及12ml的盐酸；
S3：将0.6g的亚硫酸钠与上述两种液体一同倒入带塞瓶内，搅拌均匀后与磁力转子一同放入通过磁力搅拌器搅拌60min后过滤即得所述染色液。
具体的，步骤S1-S3均在恒温箱内避光进行，温度保持在25℃。
本发明的一种DNA倍体染色液的应用，包括如下步骤：
S1：细胞学制片完成后，用浓度为95％酒精固定30min；
S2：流水清洗5min，用BS固定液固定40min；
S3：流水清洗5min，用5N盐酸水解25min；
S4：流水清洗5min，用上述制备的DNA染色液进行染液40min；
S5：35℃蒸馏水浸泡5min后用梯度酒精分别脱水3min后，用二甲苯透明1-5min中性树胶封片。
具体的，BS固定液由320ml甲醇、60ml甲醛及20ml冰醋酸组成。
具体的，步骤S5中的梯度酒精浓度分别为50％、75％、95％及无水酒精。
具体的，步骤S1-S4均在35℃±2℃恒温箱内避光进行。
实施效果，DNA为蓝紫色，结构清晰，胞浆透明，背景干净，数字扫描仪识别全部细胞，分析正常，结果准确。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等同替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种DNA倍体染色液，其特征在于，每400ML-12000ML所述染色液包括如下组分：0.1g-3g噻嗪类染料硫堇、1.2-36g助染剂亚硫酸氢钠、4-120ml盐酸及58-1740ml叔丁醇、余量为蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的DNA倍体染色液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将适量噻嗪类染料硫堇与蒸馏水倒入锅中，加热至100℃，2-3min后停火，水温降至60-80℃；
S2：在烧杯内加入适量的叔丁醇及盐酸；
S3：将适量的助染剂亚硫酸氢钠与上述两种液体一同倒入带塞瓶内，搅拌均匀后与磁力转子一同放入通过磁力搅拌器搅拌后过滤即得所述染色液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1-S3均在恒温箱内避光进行，温度保持在20℃-35℃，所述步骤3的磁力搅拌器匀速搅拌时长为60-90min。
4.根据权利要求1-3所述的DNA倍体染色液的染色方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：细胞学制片完成后，用浓度为95％酒精固定15-30min；
S2：流水清洗5min-10min，用BS固定液固定20-60min；
S3：流水清洗5min-10min，用盐酸水解15-30min；
S4：流水清洗5min-10min，用所述DNA染色液进行染液20-60min；
S5：35℃蒸馏水侵泡5min-10min，用梯度酒精分别脱水2-10min后，用二甲苯透明1-5min中性树胶封片。
5.根据权利要求4所述的DNA倍体染色液的染色方法，其特征在于，所述BS固定液由320ml甲醇、60ml甲醛及20ml冰醋酸组成。
6.根据权利要求5所述的DNA倍体染色液的染色方法，其特征在于，所述步骤S5中的梯度酒精浓度分别为50％、75％、95％及无水酒精。
7.根据权利要求6所述的DNA倍体染色液的染色方法，其特征在于，所述步骤S1-S4均在35℃±2℃恒温箱内避温进行。
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| US20060199243A1 (en) * | 2005-03-03 | 2006-09-07 | Garner David M | Cytological stain composition and methods of use |
| CN101046434A (zh) * | 2006-11-20 | 2007-10-03 | 东南大学 | 细胞去氧核醣核酸染色试剂盒及其制备方法 |
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2020
- 2020-08-11 CN CN202010804619.3A patent/CN112033783A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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