CN115308006B - 一种改进型髓鞘染色试剂盒及其染色方法 - Google Patents
一种改进型髓鞘染色试剂盒及其染色方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种改进型髓鞘染色试剂盒及其染色方法，一种改进型髓鞘染色试剂盒，包括染色剂、染色终止剂与中性树胶封片剂；本发明在氯化金染色方法的基础上进行配方和染色方法的改良，具有快速简便、染色效果清晰准确、特异性更高、可重复性好、用量节省、可长久保存、对人体无毒害作用等特点，利用此染色试剂盒可以将髓鞘染成黑紫色，清楚地展现出神经系统髓鞘的形态特征，且所染标本不易脱色，可长久保存。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种改进型髓鞘染色试剂盒及其染色方法。
背景技术
脱髓鞘疾病是一类以神经系统多灶性髓鞘脱失、炎性细胞浸润为主要病理特征的自身免疫系统疾病。可发生于外周和中枢神经系统，是神经学中最普遍、致残率最高的疾病之一。临床常见的脱髓鞘疾病包括帕金森、白质中风、脑瘫、视神经脊髓炎以及多发硬化等。感染、中毒、营养缺乏都可以引起继发的神经髓鞘脱失，正常生理条件下，髓鞘脱失后机体会自发地进行髓鞘再生，但在病理条件下，该过程会因多种因素被抑制，导致髓鞘再生不完全或失败，使脱髓鞘发展，病情持续加重。脱髓鞘性疾病在神经性学中相对普遍且致残率高，髓鞘染色在脱髓鞘疾病的病理诊断和研究中具有重要作用，可用于检测髓鞘发育情况和脱髓鞘以及髓鞘修复的程度。
现有髓鞘染色方法包括Luxol Fast Blue(LFB)染色、油红O染色、苏丹黑染色、银染色以及通过髓鞘相关蛋白MBP、PLP、MAG等的免疫组织化学染色等。传统髓鞘染色方法中普遍存在普适性不足、特异性差、敏感度低、操作复杂、难以长久保存或试剂对人体有毒害作用等缺点，如Luxol Fast Blue法对染色特异性差；苏丹黑染色对大的纤维束染色效果好但对于单根的有髓鞘纤维染色不灵敏，并且染色时间要求2～8d，时间成本巨大；银染色抗髓鞘基础蛋白(MBP)法对于单根有髓鞘纤维不灵敏。
Schmued等发明氯化金染色法，能够高度特异、高度敏感地将髓鞘清晰地显示出来，但该方法不稳定，不能进行髓鞘染色的定量分析，虽然现有技术将氯化金染色法进行改良，但该方法仅适用于冰冻切片，不能进行石蜡切片中的髓鞘成分进行特异性染色。
发明内容
本发明提供了一种改进型髓鞘染色试剂盒及其染色方法，以解决现有技术的上述问题。
本发明的方案是：
一种改进型髓鞘染色试剂盒，包括染色剂、染色终止剂与中性树胶封片剂，所述染色剂和染色终止剂均为五倍浓度浓缩液，保存在棕色不透光试剂瓶中；所述染色剂包括四氯化金水合物、氯化亚金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠；所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠与去离子水；所述中性树胶封片剂包括中性树胶与二甲苯。
作为优选的技术方案，所述四氯化金水合物在染色剂中的占百分比为0.1～0.3％，所述氯化亚金水合物在染色剂中的占百分比为0.05～0.2％，所述氯化钠在染色剂中的占百分比为0.5～1％，所述无水磷酸氢二钠在染色剂中的占百分比为0.3～0.5％，所述无水磷酸二氢钠在染色剂中的占百分比为0.02～0.03％。
作为优选的技术方案，所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠，所述无水硫代硫酸钠在染色终止剂中的占百分比为0.5～5％。
作为优选的技术方案，所述中性树胶封片剂包括中性树胶与二甲苯，所述中性树胶在中性树胶封片剂中的占百分比为40～50％，所述二甲苯在中性树胶封片剂中的占百分比为50～60％。
本发明还公开了一种改进型髓鞘染色试剂盒的染色方法，包括下列步骤：
1)正常石蜡切片，将样品的切片至5-8μm，贴在载玻片上；
2)切片干燥后，将切片置于60℃烘干20分钟；
3)脱蜡，将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，10分钟后更换新的二甲苯再次浸泡10分钟；
4)水化，依此将切片置于无水乙醇、95％乙醇以及70乙醇中浸泡5分钟，将切片置于PBS中浸泡5分钟，5分钟后更换新的PBS再次浸泡5分钟
5)在切片上加入稀释为1×工作浓度的染色剂，60℃孵育40-80分钟；
6)在切片上加入稀释为1×工作浓度的染色终止剂，60℃孵育3分钟；
7)用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟；显微镜下观察，中性树胶封片剂封片，拍照。
作为优选的技术方案，所述述中性树胶封片剂包括中性树胶与二甲苯，所述中性树胶在中性树胶封片剂中的占百分比为40～50％，所述二甲苯在中性树胶封片剂中的占百分比为50～60％。
作为优选的技术方案，所述染色剂包括四氯化金水合物、氯化亚金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠。
作为优选的技术方案，所述四氯化金水合物在染色剂中的占百分比为0.1～0.3％，所述氯化亚金水合物在染色剂中的占百分比为0.05～0.2％，所述氯化钠在染色剂中的占百分比为0.5～1％，所述无水磷酸氢二钠在染色剂中的占百分比为0.3～0.5％，所述无水磷酸二氢钠在染色剂中的占百分比为0.02～0.03％。
由于采用了上述技术方案一种改进型髓鞘染色试剂盒，包括染色剂、染色终止剂与中性树胶封片剂，所述染色剂和染色终止剂均为五倍浓度浓缩液，保存在棕色不透光试剂瓶中；所述染色剂包括四氯化金水合物、氯化亚金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠；所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠与去离子水；所述中性树胶封片剂包括中性树胶与二甲苯。
本髓鞘染色试剂盒在氯化金染色方法的基础上进行染色剂配方与染色方法的改良，具有快速简便、适用范围更广、特异性及分辨率更高、可长久保存、对人体无毒害作用等特点，利用此染色试剂盒可以将髓鞘染成黑紫色，清楚地展现出神经系统髓鞘的形态特征，且所染标本不易脱色，可长久保存。
氯化金染色法能够高度特异、高度敏感地将髓鞘清晰地显示出来，但该方法仅适用于冰冻切片，不能进行石蜡切片中的髓鞘成分进行特异性染色。冻切片成本高且使用范围有限，而石蜡切片成本低廉，可连续切片，能使组织结构保存良好，组织结构清晰，抗原定位准确，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，是目前临床病理诊断和脱髓鞘疾病基础研究的必要手段。
与现有技术相比，本发明提供的动物组织石蜡切片髓鞘检测试剂盒，采用改良氯化亚金染色方法，具有快速简便、适用范围更广、特异性及分辨率更高、可长久保存等特点，适用于临床及科研定性检测髓鞘结构形态。经实验验证，所述试剂盒中染色剂及染色终止剂对人体无毒害作用，并可长久保存且不影响检测结果，适用范围更广，使用方式更简单快捷，检测结果更稳定清晰，极大程度上降低成本，节约人力和时间，有利于提高脱髓鞘疾病的临床诊疗及髓鞘发育、脱髓鞘以及髓鞘修复的相关基础研究水平。髓鞘染色是脱髓鞘疾病的重要诊断指标，是髓鞘基础研究的常用实验手段，该发明的出现将极大提高脱髓鞘疾病的诊疗水平，显著增强基础研究的实验效率，促进患者疾病“早发现早治疗”，将产生多方面的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为本发明实施例1的成年小鼠脑组织石蜡切片(厚度5μm)染色示意图。
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了一种改进型髓鞘染色试剂盒及其染色方法以解决上述背景技术中的问题。
一种改进型髓鞘染色试剂盒，包括染色剂、染色终止剂与中性树胶封片剂，所述染色剂和染色终止剂均为五倍浓度浓缩液，保存在棕色不透光试剂瓶中；所述染色剂包括四氯化金水合物、氯化亚金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠；所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠与去离子水；所述中性树胶封片剂包括中性树胶与二甲苯。
所述四氯化金水合物在染色剂中的占百分比为0.1～0.3％，所述氯化亚金水合物在染色剂中的占百分比为0.05～0.2％，所述氯化钠在染色剂中的占百分比为0.5～1％，所述无水磷酸氢二钠在染色剂中的占百分比为0.3～0.5％，所述无水磷酸二氢钠在染色剂中的占百分比为0.02～0.03％。
所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠，所述无水硫代硫酸钠在染色终止剂中的占百分比为0.5～5％。
所述中性树胶封片剂包括中性树胶与二甲苯，所述中性树胶在中性树胶封片剂中的占百分比为40～50％，所述二甲苯在中性树胶封片剂中的占百分比为50～60％。
本发明还公开了一种改进型髓鞘染色试剂盒的染色方法，包括下列步骤：
1)正常石蜡切片，将样品的切片至5-8μm，贴在载玻片上；
2)切片干燥后，将切片置于60℃烘干20分钟；
3)脱蜡，将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，10分钟后更换新的二甲苯再次浸泡10分钟；
4)水化，依此将切片置于无水乙醇、95％乙醇以及70乙醇中浸泡5分钟，将切片置于PBS中浸泡5分钟，5分钟后更换新的PBS再次浸泡5分钟
5)在切片上加入稀释为1×工作浓度的染色剂，60℃孵育40-80分钟；
6)在切片上加入稀释为1×工作浓度的染色终止剂，60℃孵育3分钟；
7)用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟；显微镜下观察，中性树胶封片剂封片，拍照。
所述述中性树胶封片剂包括中性树胶与二甲苯，所述中性树胶在中性树胶封片剂中的占百分比为40～50％，所述二甲苯在中性树胶封片剂中的占百分比为50～60％。
所述染色剂包括四氯化金水合物、氯化亚金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠。
所述四氯化金水合物在染色剂中的占百分比为0.1～0.3％，所述氯化亚金水合物在染色剂中的占百分比为0.05～0.2％，所述氯化钠在染色剂中的占百分比为0.5～1％，所述无水磷酸氢二钠在染色剂中的占百分比为0.3～0.5％，所述无水磷酸二氢钠在染色剂中的占百分比为0.02～0.03％。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：
新型氯化亚金染色技术检测成年小鼠大脑组织石蜡切片中的髓鞘成分
1)石蜡切片：取成年小鼠大脑组织，经1x PBS灌注后用4％PFA灌注固定并浸泡过夜。依此浸入75％乙醇、85％乙醇、90％乙醇、95％乙醇以及无水乙醇中进行梯度脱水。将脱水后的组织进行浸蜡包埋。使用石蜡切片机切片，切片厚度为5μm。
2)染色：切片干燥后，将切片置于60℃烘干20分钟。用四倍体积的去离子水稀释所需剂量的染色剂和染色终止剂。加入染色剂，60℃避光染色60分钟。在切片上加入染色终止剂，60℃孵育3分钟。用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟。
3)镜检：在显微镜下观察小鼠大脑组织石蜡切片的染色程度，使用中性树胶封片剂封片，拍照。结果显示，本发明方法可以定性检测成年小鼠大脑组织石蜡切片中髓鞘成分，见图1所示。
所述述中性树胶封片剂包括中性树胶与二甲苯，所述中性树胶在中性树胶封片剂中的占百分比为40～50％，所述二甲苯在中性树胶封片剂中的占百分比为50～60％。
所述染色剂包括四氯化金水合物、氯化亚金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠。
所述四氯化金水合物在染色剂中的占百分比为0.1～0.3％，所述氯化亚金水合物在染色剂中的占百分比为0.05～0.2％，所述氯化钠在染色剂中的占百分比为0.5～1％，所述无水磷酸氢二钠在染色剂中的占百分比为0.3～0.5％，所述无水磷酸二氢钠在染色剂中的占百分比为0.02～0.03％。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (8)
1.一种改进型髓鞘染色试剂盒，其特征在于：包括染色剂、染色终止剂与中性树胶封片剂，所述染色剂和染色终止剂均为五倍浓度浓缩液，保存在棕色不透光试剂瓶中；所述染色剂包括四氯化金水合物、氯化亚金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠；所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠与去离子水；所述中性树胶封片剂包括中性树胶与二甲苯；
改进型髓鞘染色试剂盒的染色方法，包括下列步骤：
1）正常石蜡切片，将样品切片至5-8μm，贴在载玻片上；
2）切片干燥后，将切片置于60℃烘干20分钟；
3）脱蜡，将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，10分钟后更换新的二甲苯再次浸泡10分钟；
4）水化，依此将切片置于无水乙醇、95％乙醇以及70％乙醇中浸泡5分钟，将切片置于PBS中浸泡5分钟，5分钟后更换新的PBS再次浸泡5分钟
5）在切片上加入稀释为1×工作浓度的染色剂，60℃孵育40-80分钟；
6）在切片上加入稀释为1×工作浓度的染色终止剂，60℃孵育3分钟；
7）用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟；显微镜下观察，中性树胶封片剂封片，拍照。
2.如权利要去1所述一种改进型髓鞘染色试剂盒，其特征在于：所述四氯化金水合物在染色剂中的占百分比为0.1～0.3%，所述氯化亚金水合物在染色剂中的占百分比为0.05～0.2％，所述氯化钠在染色剂中的占百分比为0.5～1%，所述无水磷酸氢二钠在染色剂中的占百分比为0.3～0.5%，所述无水磷酸二氢钠在染色剂中的占百分比为0.02～0.03%。
3.如权利要求1所述的一种改进型髓鞘染色试剂盒，其特征在于：所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠，所述无水硫代硫酸钠在染色终止剂中的占百分比为0.5～5%。
4.如权利要求1所述的一种改进型髓鞘染色试剂盒，其特征在于：所述中性树胶封片剂包括中性树胶与二甲苯，所述中性树胶在中性树胶封片剂中的占百分比为40～50%，所述二甲苯在中性树胶封片剂中的占百分比为50～60%。
5.一种如权利要求1、2、3或4任意一项所述的改进型髓鞘染色试剂盒的染色方法，其特征在于，包括下列步骤：
1）正常石蜡切片，将样品切片至5-8μm，贴在载玻片上；
2）切片干燥后，将切片置于60℃烘干20分钟；
3）脱蜡，将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，10分钟后更换新的二甲苯再次浸泡10分钟；
4）水化，依此将切片置于无水乙醇、95％乙醇以及70％乙醇中浸泡5分钟，将切片置于PBS中浸泡5分钟，5分钟后更换新的PBS再次浸泡5分钟
5）在切片上加入稀释为1×工作浓度的染色剂，60℃孵育40-80分钟；
6）在切片上加入稀释为1×工作浓度的染色终止剂，60℃孵育3分钟；
7）用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟；显微镜下观察，中性树胶封片剂封片，拍照。
6.如权利要求5所述的改进型髓鞘染色试剂盒的染色方法，其特征在于：所述述中性树胶封片剂包括中性树胶与二甲苯，所述中性树胶在中性树胶封片剂中的占百分比为40～50%，所述二甲苯在中性树胶封片剂中的占百分比为50～60%。
7.如权利要求5所述的改进型髓鞘染色试剂盒的染色方法，其特征在于：所述染色剂包括四氯化金水合物、氯化亚金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠。
8.如权利要求5所述的改进型髓鞘染色试剂盒的染色方法，其特征在于：所述四氯化金水合物在染色剂中的占百分比为0.1～0.3%，所述氯化亚金水合物在染色剂中的占百分比为0.05～0.2％，所述氯化钠在染色剂中的占百分比为0.5～1%，所述无水磷酸氢二钠在染色剂中的占百分比为0.3～0.5%，所述无水磷酸二氢钠在染色剂中的占百分比为0.02～0.03%。
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