CN115266286B - 一种新型髓鞘染色试剂盒及其染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型髓鞘染色试剂盒及其染色方法，包括染色剂、染色终止剂、甲酚紫染液与水溶性封片剂，所述染色剂和染色终止剂均为五倍浓度浓缩液，保存在棕色不透光试剂瓶中；本髓鞘染色试剂盒在氯化金染色方法的基础上进行配方和染色方法的改良，具有快速简便、染色效果清晰准确、特异性更高、可重复性好、用量节省、可长久保存、对人体无毒害作用等特点，利用此染色试剂盒可以将髓鞘染成红棕色，清楚地展现出神经系统髓鞘的形态特征，且所染标本不易脱色，可长久保存。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种新型髓鞘染色试剂盒及其染色方法。
背景技术
在神经系统中，髓鞘由少突胶质细胞围绕神经元轴突形成，是包绕在有髓神经纤维轴突外侧的一层膜，由髓磷脂构成，具有保护神经元的作用。
脱髓鞘疾病是以神经髓鞘脱失为主要特征的一种神经系统疾病。感染、中毒、营养缺乏都可以引起继发的神经髓鞘脱失，正常生理条件下，髓鞘脱失后机体会自发地进行髓鞘再生，但在病理条件下，该过程会因多种因素被抑制，导致髓鞘再生不完全或失败，使脱髓鞘发展，病情持续加重。多发性硬化、神经脊髓炎、视神经脊髓炎等多种脱髓鞘性疾病中都会出现髓鞘脱失的病理现象。脱髓鞘性疾病在神经性学中相对普遍且致残率高，髓鞘染色在脱髓鞘疾病的病理诊断和研究中具有重要作用，可用于检测髓鞘发育情况和脱髓鞘以及髓鞘修复的程度。
现有髓鞘染色方法包括Luxol Fast Blue(LFB)染色、油红O染色、苏丹黑染色、银染色以及通过髓鞘相关蛋白MBP、PLP、MAG等的免疫组织化学染色等。传统髓鞘染色方法中普遍存在普适性不足、特异性差、敏感度低、操作复杂、难以长久保存或试剂对人体有毒害作用等缺点，如Luxol Fast Blue法对冰冻切片不能染色；苏丹黑染色对大的纤维束染色效果好但对于单根的有髓鞘纤维染色不灵敏，并且染色时间要求2～8d，时间成本巨大；银染色抗髓鞘基础蛋白(MBP)法对于单根有髓鞘纤维不灵敏。
Schmued等发明氯化金染色法，能够高度特异、高度敏感地将髓鞘清晰地显示出来，但该方法不稳定，不能进行髓鞘染色的定量分析。唐荣华等将氯化金染色法进行改良，但染色试剂储藏超过一周后，染色效果大大下降。
发明内容
本发明提供了一种新型髓鞘染色试剂盒及其染色方法，以解决现有技术的上述问题。
本发明的方案是：
一种新型髓鞘染色试剂盒，包括染色剂、染色终止剂、甲酚紫染液与水溶性封片剂，所述染色剂和染色终止剂均为五倍浓度浓缩液，保存在棕色不透光试剂瓶中；所述染色剂包括四化金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠；所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠与去离子水；所述甲酚紫染液包括甲酚紫、冰醋酸与无水乙酸钠；所述水溶性封片剂包括甘油、聚乙烯醇与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。
作为优选的技术方案，所述染色剂中，所述四氯化金水合物在染色剂中的占百分比为0.1～0.5％，所述氯化钠在染色剂中的占百分比为0.5～1％，所述无水磷酸氢二钠在染色剂中的占百分比为0.3～0.5％，所述无水磷酸二氢钠在染色剂中的占百分比为0.02～0.03％。
作为优选的技术方案，所述染色终止剂中，所述无水硫代硫酸钠在染色终止剂中的占百分比为0.5～5％。
作为优选的技术方案，所述甲酚紫染液中，所述甲酚紫在甲酚紫染液中的占百分比为0.1～0.2％，所述冰醋酸在甲酚紫染液中的占百分比为0.9～1％，所述无水乙酸钠在甲酚紫染液中的占百分比为0.5～0.6％。
作为优选的技术方案，所述水溶性封片剂中，所述甘油在水溶性封片剂中的占百分比为15～20％，所述聚乙烯醇4-88在水溶性封片剂中的占百分比为5～10％，所述1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐在水溶性封片剂中的占百分比为5～10％。
本发明还公开了一种新型髓鞘染色试剂盒的染色方法，包括下列步骤：
1)正常冰冻切片，将样品的切片至14-40μm，贴在载玻片上；
2)切片恢复至室温后，将切片置于37℃烘干30分钟；
3)用四倍体积的去离子水稀释所需剂量的染色剂与染色终止剂；
4)在切片上加入稀释好的染色剂，将载玻片置于湿盒中，45℃避光染色10～50分钟；
5)用去离子水漂洗切片2次，每次1分钟；
6)在切片上加入稀释的染色终止剂，45℃孵育2-3分钟；
7)用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟；显微镜下观察，封片剂封片，拍照。
作为优选的技术方案，所述步骤7)用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟，然后用甲酚紫复染切片，用去离子水漂洗切片3次，每次3分钟。
作为优选的技术方案，所述步骤4)中45℃避光染色30分钟。
由于采用了上述技术方案一种新型髓鞘染色试剂盒，包括染色剂、染色终止剂、甲酚紫染液与水溶性封片剂，所述染色剂和染色终止剂均为五倍浓度浓缩液，保存在棕色不透光试剂瓶中；所述染色剂包括四化金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠；所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠与去离子水；所述甲酚紫染液包括甲酚紫、冰醋酸与无水乙酸钠；所述水溶性封片剂包括甘油、聚乙烯醇与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。
本发明的优点：
本髓鞘染色试剂盒在氯化金染色方法的基础上进行配方和染色方法的改良，具有快速简便、染色效果清晰准确、特异性更高、可重复性好、用量节省、可长久保存、对人体无毒害作用等特点，利用此染色试剂盒可以将髓鞘染成红棕色，清楚地展现出神经系统髓鞘的形态特征，且所染标本不易脱色，可长久保存。
与现有技术相比，本发明提供的动物组织冰冻切片髓鞘检测试剂盒，采用特异性和敏感度更高的改良氯化金染色方法，用于临床及科研定性检测髓鞘结构形态，经实验验证，所述试剂盒中染色剂及染色终止剂对人体无毒害作用，并可长久保存且不影响检测结果，使用方式更简单快捷，检测结果更稳定清晰，极大程度上节约人力和时间成本，有利于提高脱髓鞘疾病的临床诊疗及髓鞘发育、脱髓鞘以及髓鞘修复的相关基础研究水平。髓鞘染色是神经组织疾病的重要诊断指标，是髓鞘基础研究的常用实验手段，该发明的出现将极大提高脱髓鞘疾病的诊疗水平，显著增强基础研究的实验效率，促进患者疾病“早发现早治疗”，将产生多方面的社会效益和经济效益。
附图说明
图1-A为本发明实施例2的P15、P30、成年小鼠脑组织冰冻切片(厚度16μm)染色示意图；
图1-B为本发明实施例3的P15、P30、成年小鼠脊髓组织冰冻切片(厚度16μm)染色示意图。
具体实施方式
为了弥补以上不足，本发明提供了一种新型髓鞘染色试剂盒及其染色方法以解决上述背景技术中的问题。
一种新型髓鞘染色试剂盒，包括染色剂、染色终止剂、甲酚紫染液与水溶性封片剂，所述染色剂和染色终止剂均为五倍浓度浓缩液，保存在棕色不透光试剂瓶中；所述染色剂包括四化金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠；所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠与去离子水；所述甲酚紫染液包括甲酚紫、冰醋酸与无水乙酸钠；所述水溶性封片剂包括甘油、聚乙烯醇与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。
所述染色剂中，所述四氯化金水合物在染色剂中的占百分比为0.1～0.5％，所述氯化钠在染色剂中的占百分比为0.5～1％，所述无水磷酸氢二钠在染色剂中的占百分比为0.3～0.5％，所述无水磷酸二氢钠在染色剂中的占百分比为0.02～0.03％。
所述染色终止剂中，所述无水硫代硫酸钠在染色终止剂中的占百分比为0.5～5％。
所述甲酚紫染液中，所述甲酚紫在甲酚紫染液中的占百分比为0.1～0.2％，所述冰醋酸在甲酚紫染液中的占百分比为0.9～1％，所述无水乙酸钠在甲酚紫染液中的占百分比为0.5～0.6％。
所述水溶性封片剂中，所述甘油在水溶性封片剂中的占百分比为15～20％，所述聚乙烯醇4-88在水溶性封片剂中的占百分比为5～10％，所述1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐在水溶性封片剂中的占百分比为5～10％。
本发明还公开了一种新型髓鞘染色试剂盒的染色方法，包括下列步骤：
1)正常冰冻切片，将样品的切片至14-40μm，贴在载玻片上；
2)切片恢复至室温后，将切片置于37℃烘干30分钟；
3)用四倍体积的去离子水稀释所需剂量的染色剂与染色终止剂；
4)在切片上加入稀释好的染色剂，将载玻片置于湿盒中，45℃避光染色10～50分钟；
5)用去离子水漂洗切片2次，每次1分钟；
6)在切片上加入稀释的染色终止剂，45℃孵育2-3分钟；
7)用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟；显微镜下观察，封片剂封片，拍照。
所述步骤7)用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟，然后用甲酚紫复染切片，用去离子水漂洗切片3次，每次3分钟。
所述步骤4)中45℃避光染色30分钟。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：
新型氯化金染色技术检测不同时期小鼠大脑组织冰冻切片中的髓鞘成分
1)冰冻切片：分别取P15、P30、成年小鼠大脑组织，经4％PFA(1x PBS稀释)灌注并浸泡固定过夜，转入30％蔗糖溶液(1x PBS稀释)脱水，组织沉底后包埋。使用冰冻切片机切片，切片厚度为16μm。
2)金染：切片恢复至室温后，将切片置于37℃烘干30分钟。用四倍体积的去离子水稀释所需剂量的染色剂和染色终止剂。加入染色剂，45℃避光染色30分钟。用去离子水漂洗切片2次，每次1分钟。在切片上加入染色终止剂，45℃孵育2-3分钟。用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟。
3)镜检：在显微镜下观察各时期小鼠大脑组织冰冻切片的染色程度，使用封片剂封片，拍照。结果显示，本发明方法可以定性检测不同时期小鼠大脑组织冰冻切片中髓鞘成分，见图1-A所示。
实施例2、新型氯化金染色技术检测不同时期小鼠脊髓组织冰冻切片中的髓鞘成分
1)冰冻切片：分别取P15、P30、成年小鼠脊髓组织，经4％PFA(1x PBS稀释)灌注并浸泡固定过夜，转入30％蔗糖溶液(1x PBS稀释)脱水，组织沉底后包埋。使用冰冻切片机切片，切片厚度为16μm。
2)金染：切片恢复至室温后，将切片置于37℃烘干30分钟。用四倍体积的去离子水稀释所需剂量的染色剂和染色终止剂。加入染色剂，45℃避光染色30分钟。用去离子水漂洗切片2次，每次1分钟。在切片上加入染色终止剂，45℃孵育2-3分钟。用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟。
3)镜检：在显微镜下观察各时期小鼠脊髓组织冰冻切片的染色程度，使用封片剂封片，拍照。结果显示，本发明方法可以定性检测不同时期小鼠脊髓组织冰冻切片中髓鞘成分，见图1-B所示。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (3)
1.一种髓鞘染色试剂盒的染色方法，其特征在于：包括染色剂、染色终止剂、甲酚紫染液与水溶性封片剂，所述染色剂和染色终止剂均为五倍浓度浓缩液，保存在棕色不透光试剂瓶中；所述染色剂包括四化金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠与无水磷酸二氢钠；所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠与去离子水；所述甲酚紫染液包括甲酚紫、冰醋酸与无水乙酸钠；所述水溶性封片剂包括甘油、聚乙烯醇与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐；
所述染色剂包括四氯化金水合物、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钠，所述四氯化金水合物在染色剂中的占百分比为0.1～0.5％，所述氯化钠在染色剂中的占百分比为0.5～1％，所述无水磷酸氢二钠在染色剂中的占百分比为0.3～0.5％，所述无水磷酸二氢钠在染色剂中的占百分比为0.02～0.03％；
所述染色终止剂包括无水硫代硫酸钠，所述无水硫代硫酸钠在染色终止剂中的占百分比为0.5～5％；
所述甲酚紫染液包括甲酚紫、冰醋酸与无水乙酸钠，所述甲酚紫在甲酚紫染液中的占百分比为0.1～0.2％，所述冰醋酸在甲酚紫染液中的占百分比为0.9～1％，所述无水乙酸钠在甲酚紫染液中的占百分比为0.5～0.6％；
所述水溶性封片剂包括甘油、聚乙烯醇4-88与1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，所述甘油在水溶性封片剂中的占百分比为15～20％，所述聚乙烯醇4-88在水溶性封片剂中的占百分比为5～10％，所述1M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐在水溶性封片剂中的占百分比为5～10％；
髓鞘染色试剂盒的染色方法，包括下列步骤：
1）正常冰冻切片，将样品的切片至14-40μm，贴在载玻片上；
2）切片恢复至室温后，将切片置于37℃烘干30分钟；
3）用四倍体积的去离子水稀释所需剂量的染色剂与染色终止剂；
4）在切片上加入稀释好的染色剂，将载玻片置于湿盒中，45℃避光染色10～50分钟；
5）用去离子水漂洗切片2次，每次1分钟；
6）在切片上加入稀释的染色终止剂，45℃孵育2-3分钟；
7）用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟；显微镜下观察，封片剂封片，拍照。
2.如权利要求1所述的髓鞘染色试剂盒的染色方法，其特征在于：所述步骤7）用去离子水漂洗切片3次，每次1分钟，然后用甲酚紫复染切片，用去离子水漂洗切片3次，每次3分钟。
3.如权利要求1所述的髓鞘染色试剂盒的染色方法，其特征在于：所述步骤4）中45℃避光染色30分钟。
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