CN111855857B - 一种盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

一种盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法，该方法使用的流动相为体积比(75‑85):18的醋酸盐缓冲液和乙腈混合溶液，所述醋酸盐缓冲液由0.2‑0.3mol/L醋酸铵溶液、0.08‑0.12mol/L乙二胺四醋酸二钠和三乙胺按体积比(95‑105):(8‑12):1组成。本发明所述方法能够有效将盐酸米诺环素与其常见的杂质A、B、C、E、F、G、H分离，同时降低流动相对色谱系统的损害，提高经济效益。

Description

一种盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法
【技术领域】
本发明涉及药物分析领域，特别涉及一种盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法。
【背景技术】
盐酸米诺环素(Minocycline hydrochloride),又名盐酸二甲胺四环素，化学名为[4S-(4α,4aα,5aα,12aα)]-4,7-双(二甲氨基)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-2-并四苯甲酰胺盐酸盐，属于四环素类广谱抗生素，主要用于大肠杆菌、产气杆菌、志贺氏菌、流感嗜血杆菌、克雷伯氏菌、沙门氏菌等细菌，以及支原体、衣原体和立克次体等引起感染。盐酸米诺环素抗菌广谱性好、强度高，具有较高脂溶性，在组织和体液中的透入性好，已成为目前临床使用最广泛的四环素类抗生素之一。
盐酸米诺环素在生产、运输和储存过程中容易形成反应初始物、中间体、降解物等多种杂质，建立切实可行的分析检测方法，对提高盐酸米诺环素的质量、安全性和稳定性具有重大意义。
高效液相色谱法(HPLC)因具有分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、自动化、适用范围广、处理简单等特点，被广泛应用于药物分析领域，包括含量测定和有关物质检查。盐酸米诺环素现有分析方法包括中国药典2015年版、USP42、BP2019、JPⅹⅦ、注册标准JX20060237和YBH05652017，均采用HPLC法控制。其中ChP2015方法不能有效分离杂质G与米诺环素；USP42等其他标准方法杂质C和H分离效果不理想，且对色谱柱要求较高、甚至需要特定色谱柱，流动相中草酸盐浓度较高，易析出，导致系统不稳定，测定准确度不佳；现行标准方法流动相中均含大量N,N-二甲基甲酰胺，对色谱系统损害较大，色谱柱柱效下降较快，使用寿命明显缩短，分析成本增加经济效益不高。
【发明内容】
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明提供一种盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法，所述方法能够有效将盐酸米诺环素与其常见的杂质A、B、C、E、F、G、H分离，同时降低流动相对色谱系统的损害，提高经济效益。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法，所述方法包括：
配制供试品溶液和对照溶液，分别注入高效液相色谱分析仪进行色谱分析，根据色谱图分析供试品溶液中盐酸米诺环素和杂质情况；其中，固定相为C8色谱柱，流动相为体积比(75-85):18的醋酸盐缓冲液和乙腈混合溶液，所述醋酸盐缓冲液由0.2-0.3mol/L醋酸铵溶液、0.08-0.12mol/L乙二胺四醋酸二钠和三乙胺按体积比(95-105):(8-12):1组成。
在一些具体的实施方式中，所述流动相为体积比82:18的醋酸盐缓冲液和乙腈混合溶液。
在一些具体的实施方式中，所述醋酸盐缓冲液由0.25mol/L醋酸铵溶液、0.1mol/L乙二胺四醋酸二钠和三乙胺按体积比100:10:1组成。
在一些具体的实施方案中，所述高效液相色谱检测方法的流速为1.0-1.5ml/min，优选为1.2ml/min；柱温为28-32℃，优选为30℃；波长为275-285nm，优选为280nm。
在一些具体的实施方式中，所述供试品溶液通过以下方法制备：取待测盐酸米诺环素，研细，精密称取，加水溶解并稀释制成每1ml中约含米诺环素0.5mg的溶液，摇匀，滤过。
在一些具体的实施方式中，所述对照溶液通过以下方式制备：精密量取供试品溶液适量，用水定量稀释制成每1ml中约含米诺环素5μg的溶液。
在一些具体的实施方式中，所述方法还包括配制系统适用性溶液和灵敏度溶液，注入高效液相色谱仪进行色谱分析。
在一些具体的实施方式中，所述系统适用性对照品通过以下方式制备：取含杂质A、B、C、E、F、G、H的系统适用性对照品，加水溶解并稀释，制成每1ml中约含米诺环素0.5mg的溶液，摇匀，滤过。
在一些具体的实施方式中，所述灵敏度溶液通过以下方式制备：精密量取对照溶液适量，用水稀释制成每1ml中约含0.25μg米诺环素的溶液。
【有益效果】
与现有技术相比，本发明所述方法采用的流动相能够有效将盐酸米诺环素与杂质A、B、C、E、F、G、H分离，克服了现有高效液相色谱方法无法将盐酸米诺环素与杂质G分离或无法将盐酸米诺环素与杂质C、杂质H分析的缺陷；
同时，流动相中不含高浓度草酸盐和N,N-二甲基甲酰胺，可减少对色谱系统损害和由此引起系统不稳定，具有提高测定准确度和经济效益的效果。
【附图说明】
图1为系统适用性溶液分离色谱图，其中，杂质H(6.416min)；杂质C(7.551min)；杂质A(8.913min)；杂质B(11.913min)；杂质F(16.677min)；杂质G(20.876min)；杂质E(40.488min)；
图2为空白溶剂分离色谱图；
图3为未破坏的供试品溶液分离色谱图；
图4为酸破坏溶液分离色谱图；
图5为碱破坏溶液分离色谱图；
图6为氧化破坏溶液分离色谱图；
图7为加热破坏溶液分离色谱图；
图8为光照破坏溶液分离色谱图；
图9为盐酸米诺环素线性。
【具体实施方式】
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.色谱条件
色谱柱：Welch Ultimate XB-C8色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)；
流动相：醋酸盐缓冲液[0.25mol/L醋酸铵溶液-0.1mol/L乙二胺四醋酸二钠-三乙胺(100：10：1)，用冰醋酸调节pH值至8.0]]-乙腈(82：18)；
流速：1.2ml/min；
柱温：30℃；
波长：280nm。
2.溶液的制备(避光操作)
①供试品溶液取本品内容物，研细，精密称取适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含米诺环素0.5mg的溶液，摇匀，滤过。
②对照溶液精密量取供试品溶液适量，用水定量稀释制成每1ml中约含米诺环素5μg的溶液。
③系统适用性溶液取系统适用性对照品(EP，含杂质A、B、C、E、F、G、H)5mg，用水溶剂并稀释至10ml，摇匀。
④灵敏度溶液精密量取对照溶液适量，用水稀释制成每1ml中约含0.25μg的溶液。
3.方法学验证
①系统适用性试验：系统适用性溶液色谱图中杂质C峰与杂质H峰、杂质A峰与杂质B峰、杂质G和杂质F均能与米诺环素峰完全分开。见图1。
②专属性试验：供试品溶液，经酸、碱、氧化、加热和光照等条件下破坏，降解产物均能与米诺环素峰分离。见图3-8。
③线性关系考察：取米诺环素，制成每1ml中分别约含0.50、1.00、2.51、5.01、10.03、25.07μg的溶液，照本专利色谱方法测定，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归，回归方程为：A＝0.2444C-0.0093，r＝1.0000；线性范围为0.50～25.07μg/ml。见图9和表1。
④精密度试验：取对照溶液连续进样6针，米诺环素峰面积的RSD为2.0％。
⑤检出限与定量限：米诺环素的检出限与定量限分别为0.8ng和2.5ng。
⑥溶液的稳定性：取供试品溶液和对照溶液，进行溶液的稳定性考察，在2～8℃保存条件下，供试品溶液3小时内均未检出新的杂质峰，但杂质A峰面积有所增加；对照溶液在3小时内，米诺环素峰面积有减小趋势。故本实施例所述方法使用的溶液应临用新制。见表2。
表1盐酸米诺环素线性
Figure BDA0002609181170000051
表2对照溶液稳定性
Figure BDA0002609181170000052
实验例
按实施例1所述方法对某制药生产企业的3批盐酸米诺环素样品进行了有关物质检查，结果均检出杂质A、B、C、E、F、G、H。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述方法包括：
配制供试品溶液和对照溶液，分别注入高效液相色谱分析仪进行色谱分析，根据色谱图分析供试品溶液中盐酸米诺环素，以及欧洲药典中的杂质A、B、C、E、F、G、H情况；
其中，固定相为C8色谱柱，流动相为体积比82:18的醋酸盐缓冲液和乙腈混合溶液，所述醋酸盐缓冲液由0.2-0.3mol/L醋酸铵溶液、0.08-0.12mol/L乙二胺四醋酸二钠和三乙胺按体积比(95-105):(8-12):1组成；
所述供试品溶液通过以下方式制备：取待测盐酸米诺环素，研细，精密称取，加水溶解并稀释制成每1ml中含米诺环素0.5mg的溶液，摇匀，滤过。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相为体积比82:18的醋酸盐缓冲液和乙腈混合溶液，所述醋酸盐缓冲液由0.25mol/L醋酸铵溶液、0.1mol/L乙二胺四醋酸二钠和三乙胺按体积比100:10:1组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测方法的流速为1.0-1.5ml/min，柱温为28-32℃，波长为275-285nm。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测方法的流速为1.2ml/min，柱温为30℃，波长为280nm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照溶液通过以下方法制备：精密量取供试品溶液适量，用水定量稀释制成每1ml中含米诺环素5μg的溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括配制系统适用性溶液和灵敏度溶液，注入高效液相色谱仪进行色谱分析。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述系统适用性对照品通过以下方式制备：取含杂质A、B、C、E、F、G、H的系统适用性对照品，加水溶解并稀释，制成每1ml中含米诺环素0.5mg的溶液，摇匀，滤过；
所述灵敏度溶液通过以下方式制备：精密量取对照溶液适量，用水稀释制成每1ml中含0.25μg米诺环素的溶液。
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