CN117310012A - 盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法 - Google Patents

盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法。测定盐酸米诺环素中的有关物质的方法，包括如下操作：照高效液相色谱法的规范进行，制备供试品溶液、对照品溶液、系统适用性溶液、灵敏度溶液，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以含乙二胺四乙酸二钠的乙酸铵溶液‑甲醇混合液作为流动相A，以乙腈‑甲醇为流动相B，进行线性梯度洗脱，米诺环素峰与RS12峰的分离度应不小于1.5；供试品溶液色谱图中如有相对保留时间对应的杂质峰，按加校正因子的主成分对照品外标法计算该杂质的百分量。本发明还提供了一种盐酸米诺环素。本发明方法具有如说明书所述优良技术效果。

Description

盐酸米诺环素及其杂质的高效液相色谱检测方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及药品的质量分析方法，特别是涉及一种盐酸米诺环素及其杂质，更特别地是涉及一种使用高效液相色谱来检测盐酸米诺环素中的有关物质的方法，本发明的有关物质检测方法可以同时检测到十种以上的盐酸米诺环素中的有关物质。
背景技术
米诺环素(minocycline，二甲胺四环素)，临床上常用其盐酸盐。盐酸米诺环素的分子式为C23H27N3O7·HCl，分子量为493.94，化学名为：[4S-(4α,4aα,5aα,12aα)]-4,7-双(二甲氨基)-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-2-并四苯甲酰胺盐酸盐，其化学结构式如下：
盐酸米诺环素为黄色结晶性粉末，无臭，有引湿性；在甲醇中溶解，在水中略溶，在乙醇中微溶，在乙醚中几乎不溶。
米诺环素属于第二代四环素类抗生素，是一种长效高效的半合成四环素类抗生素，其抗菌谱与四环素相似，抗菌作用为四环素类中最强，抗革兰阳性菌活性比四环素强2～4倍，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有很强的活性，四环素类抗生素之间存在交叉耐药，但米诺环素对临床分离的耐四环素金葡萄、表葡菌和链球菌均有很强的抗菌活性，因其对耐药菌有效而在临床上受到青睐。不良反应与其他四环素类基本相同，可引起可逆性前庭反应，包括恶心、呕吐及运动失调等。
以盐酸米诺环素原料药为例，米诺环素原料药收载于中国药典2020年版本、美国药典USP(生效日期为2020年5月1日)、欧洲药典(EP11.0)和日本药典(JP18)。
中国药典2020年版中采用乙酸铵-二甲基甲酰胺-四氢呋喃-乙二胺四乙酸二钠的流动相体系和C8色谱体系，对有关物质进行控制，主要控制的杂质有差向米诺环素(<1.2％)、其他单一杂质(<1.2％)和其他杂质总量(<2.0％)。而在USP、EP和JP的现行药典中，盐酸米诺环素原料药有关物质检测方法流动相体系均为：草酸盐-二甲基甲酰胺-四氢呋喃-乙二胺四乙酸二钠体系，对差向异构体、其他单一杂质和杂质总量进行控制。
然而，一方面，面对日趋严格的有关物质杂质控制要求，大多数企业内部对于特定杂质的控制不仅限于差向异构体，往往需要对几种甚至十几种特定杂质进行分离和检测，以便更好地控制产品的品质。然而，采用现行标准中的分析方法，差向米诺环素峰、其他杂质，与米诺环素峰，以及部分杂质峰间不能有效分离。因此，需要开发专属性和选择性更好的分析检测方法，对复杂的特定杂质和未知杂质均能有效分离。
随着社会的发展和对人体健康安全的重视程度加深，在实验过程中，运用绿色分析化学理念，减少一些有毒有害试剂的使用已经成了必然趋势。目前，在四环素类抗生素的有关物质检测过程中，主流的检测方法仍然会在配制流动相时，使用四氢呋喃、二甲基甲酰胺等有毒有害试剂，对实验人员身体造成慢性损害，废液的排放也会加重环境污染。为了保障分析人员健康，减少环境污染问题，应尽量避免上述试剂的使用，或者无法避免使用有机试剂时，用低毒性的替代试剂。
目前，有相关的研究团队在进行低毒性溶剂替代方面进行探索研究，也取得了一定进展。例如，高燕霞团队的文献[高燕霞,姜建国,杜增辉.HPLC法测定注射用盐酸米诺环素的含量及有关物质[J].中国抗生素杂志，2005，30(12)：744-746]报道，使用Kromasil C8(4.6mm×250mm，5μm)柱，以0.2mol/L乙酸铵∶N,N-二甲基甲酰胺∶四氢呋喃(600∶398∶2，内含0.01mol/L乙二胺四乙酸二钠)为流动相，检测波长280nm，对盐酸米诺环素有关物质进行检测时，能够对5个特杂：去甲基金霉素、6-去甲四环素(DMTC)、6-去甲-6-去氧四环素(DMDOTC)、11a-氯-6-去甲-6-去氧四环素(11a-C-l DMDOTC)、7-氨基-6-去甲-6-去氧四环素(ADMDOTC)进行有效分离和控制。该方法采用水溶性更好的乙酸盐，降低了盐浓度，避免使用草酸盐(其在低温环境下结晶析出，进而容易损坏仪器和色谱柱)，具有更好的适用性，但是，此文献方法仅对5个特定杂质进行控制，无法满足有关物质中对多个复杂特定杂质的控制要求。
王珑团队的文献[王珑，王红梅.高效液相色谱法测定盐酸米诺环素的有关物质[J].海峡药学，2006年，18(12006):85-86]，采用Kromasil C8色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以醋酸铵缓冲液-乙腈-甲醇(830:170:5)用浓氨水或醋酸调节至pH6.55为流动相，检测波长为280nm，对盐酸米诺环素中可能存在的8种杂质：①7-双去甲基米诺环素，②去甲基四环素，③地美环素，④7-单去甲基米诺环素，⑤吡唑米诺环素，⑥去甲基脱氧四环素，⑦4-差向-米诺环素，⑧羟甲基米诺环素，进行分离和测定，满足上述8种杂质控制的检测要求，又用甲醇、乙腈来替代四氢呋喃作为有机相，降低四氢呋喃对人体的伤害。
梅芊团队的文献[梅芊,李同辉,李少杰,等.盐酸米诺环素胶囊的质量评价[J].中国抗生素杂志，2020，45(3)：224-233]，采用色谱柱为Dikma Platisil ODS(250mm×4.6mm，5μm)；流动相A为0.05mol/L醋酸铵溶液(用氨水调节pH值至8.0)，流动相B为甲醇，流动相C为乙腈，进行梯度洗脱程序，流速1.0mL/min；紫外检测器，检测波长280nm；柱温30℃；进样量10μL，对米诺环素中有关物质进行检测。该方法较现行药典方法柱压更低、杂质间分离效果更好、多检出3种杂质、系统更稳定，除检出差向米诺环素杂质之外，另外检出未知杂质10种，均有效分离。
但是，随着分离技术的不断提高，更多的特定杂质分离提纯出来，企业对杂质控制的要求也日趋严格，特杂的种类增加，增加至十几种、二十几种，限度收紧等方面影响，依靠现有检测手段很难将杂质完全分离，还需要继续改进优化来发展新的分析方法，提高有关物质检测中杂质的分离和检测能力。目前，国内大多数用于盐酸米诺环素原料药检测的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱(C18)或辛烷基硅烷键合硅胶(C8)色谱柱，容易产生峰展宽，拖尾等现象。
然而，本领域仍然需要有新的检测盐酸米诺环素中的有关物质的方法，例如期待该方法能够提高柱效、改善杂质之间分离效果、色谱柱具有更高的通量和更高的柱效等一种或多种有益效果，为抗生素有关物质方法的开发提供一种新的有益选择。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定盐酸米诺环素中的有关物质的方法，期待该种方法能够呈现一个或多个方面的有益效果，例如测定方法准确可靠、劳动保护的成本低等等。
为此，要发明第一方面提供了测定盐酸米诺环素中的有关物质的方法，包括如下操作：
(1)照高效液相色谱法的规范进行，各测试溶液临用新制；
(2)测试溶液的制备：
供试品溶液：取供试品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含米诺环素1mg的溶液；
对照品溶液：取盐酸米诺环素对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液；
系统适用性溶液：取盐酸米诺环素系统适用性对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液；
灵敏度溶液：精密量取对照品溶液适量，用水定量稀释制成每1ml中约含0.5μg的溶液；
(3)色谱条件：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以含有0.002mol/L乙二胺四乙酸二钠的0.25mol/L乙酸铵溶液-甲醇(90:10)混合液(用氨水或冰醋酸调节pH值至6.75±0.05)作为流动相A，以乙腈-甲醇(90:10)为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为280nm；样品盘控温2～8℃，进样体积10μl；
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
12 92 8
22 92 8
42 85 15
50 75 25
60 75 25
60.1 95 5
70 95 5
系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，米诺环素峰与RS12峰的分离度应不小于1.5；灵敏度溶液色谱图中，主峰信噪比应不小于10；对照品溶液连续进样6次，米诺环素峰面积的相对标准偏差应不大于5.0％；
(4)测定并计算杂质百分量：精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有下表所列相对保留时间(RRT)对应的杂质峰，按加校正因子的主成分对照品外标法计算该杂质的百分量，
根据本发明第一方面所述的方法，其中所述高效液相色谱法的规范是历届版本的中国药典或者美国药典或者欧洲药典或者日本药典中收载的高效液相色谱法的规范，例如是中国药典2020年版四部通则0512高效液相色谱法的规范。
根据本发明第一方面所述的方法，其中盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质RS02、RS16、RS32、RS03、RS12、RS15、RS11和米诺环素。
根据本发明第一方面所述的方法，其中盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质RS02、RS16、RS32、RS03、RS12、RS15、RS11和米诺环素，还包含杂质RS17、杂质RS28、杂质RS30、杂质RS33、杂质RS40，其结构式和/或化学名分别为：
杂质RS17：
(4S,4aS,5aR,12aS)-9-氨基-4-(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺(9-氨基山环素)，
杂质RS28或称9-氨基米诺环素：
杂质RS30或称单甲基乙基米诺环素：
杂质RS33：
(4S,4aS,5aR,12aS)-7-氨基-4-(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺(7-氨基山环素)，
杂质RS40或称去甲金霉素：
根据本发明第一方面所述的方法，其中十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱是Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18柱，其规格为4.6mm×150mm，2.7μm，或者是效能相当的其它色谱柱。
根据本发明第一方面所述的方法，其中检测到盐酸米诺环素中含有符合如下限度规定的杂质时认为该盐酸米诺环素合格：RS03不得过1.2％，RS32不得过0.8％，RS02不得过0.6％，RS11不得过0.6％，RS12不得过0.5％，RS15不得过0.5％，RS16不得过0.3％，其他单个杂质不得过0.10％，杂质总量(除RS03外)不得过2.0％，小于灵敏度溶液主峰面积的峰(0.05％)忽略不计。
根据本发明第一方面所述的方法，其中米诺环素峰的理论板数大于1万例如大于2万例如大于5万。
根据本发明第一方面所述的方法，其中盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质RS02、RS16、RS32、RS03、RS12、RS15、RS11和米诺环素，各相邻峰之间的分离度均大于1.5。
根据本发明第一方面所述的方法，其中盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质RS02、RS16、RS32、RS03、RS12、RS15、RS11和米诺环素，还包含杂质RS17、杂质RS28、杂质RS30、杂质RS33、杂质RS40，各相邻峰之间的分离度均大于1.5。
根据本发明第一方面所述的方法，其中检测到盐酸米诺环素中含有符合如下限度规定的杂质时认为该盐酸米诺环素合格：杂质RS17不得过0.2％例如不得过0.10％，杂质RS28不得过0.2％例如不得过0.10％，杂质RS30不得过0.2％例如不得过0.10％，杂质RS33不得过0.2％例如不得过0.10％，杂质RS40不得过0.2％例如不得过0.10％。
根据本发明第一方面所述的方法，其中供试品溶液色谱图中，米诺环素与相邻杂质之间的分离度大于2.0
进一步的，本发明第二方面提供了一种盐酸米诺环素，其使用本发明第一方面任一实施方案所述方法测定其中的有关物质，该盐酸米诺环素中检出具有如下限度规定的杂质：不超过1.2％的RS03，不超过0.8％的RS32，不超过0.6％的RS02，不超过0.6％的RS11，不超过0.5％的RS12，不超过0.5％的RS15，不超过0.3％的RS16，不超过0.10％的其他单个杂质，不超过2.0％的杂质总量(除RS03外)，小于灵敏度溶液主峰面积的峰(0.05％)忽略不计。
根据本发明第二方面的盐酸米诺环素，其使用本发明第一方面任一实施方案所述方法测定其中的有关物质，该盐酸米诺环素中检出具有如下限度规定的杂质：不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质RS17，不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质RS28，不超过0.2％例如不超过0.1％的杂质RS30，不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质RS33，不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质RS40。
本发明方法取得了一些优良效果。例如，本发明方法分离的杂质数量多，可以对12种特定杂质进行有效分离和检测，各杂质之间、杂质与主峰之间的分离度均大于1.5；克服了杂质之间分离度不佳、回收率低、溶液稳定性差的问题；本发明选用特定的液相色谱柱，提高未知杂质之间的分离度，克服了个别未知单杂分离较差导致合并积分，单一杂质限度收紧困难的问题，单一杂质限度可由0.15％收紧至0.10％；本发明方法的流动相中不含有N,N-二甲基甲酰胺及四氢呋喃等毒性较大物质，绿色环保，减少对人体损害，并且提高仪器和色谱系统的稳定性，安全性高，操作简便，成本低。
附图说明
图1：包含7种典型杂质和米诺环素的系统适用性溶液的典型HPLC图。
图2：包含12种杂质和米诺环素的杂质混合液的典型色谱图及其积分数据。
图3：包含12种杂质和米诺环素的杂质混合液的典型色谱图在35～55min期间的局部细节图。
图4：包含12种杂质和低浓度米诺环素的混合液的典型色谱图。
图5：使用本发明实施例1方法测定的三批样品之典型的供试品溶液HPLC图，分别为图5A、图5B、图5C。
具体实施方式
下面提供一些具体实例来进一步说明本发明，这些实例中所用的各种试剂和仪器等，若未特别说明，均是容易从市场获得的。
实施例1：测定盐酸米诺环素中的有关物质的方法
(1)照中国药典2020年版四部通则0512高效液相色谱法的规范进行，各测试溶液临用新制；
(2)测试溶液的制备：
供试品溶液：取供试品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含米诺环素1mg的溶液；
对照品溶液：取盐酸米诺环素对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液；
系统适用性溶液：取盐酸米诺环素系统适用性对照品(符合EP11.0，其中含有RS02、RS16、RS32、RS03、RS12、RS15、RS11和米诺环素)适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液；
灵敏度溶液：精密量取对照品溶液适量，用水定量稀释制成每1ml中约含0.5μg的溶液；
(3)色谱条件：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(本实施例使用AgilentInfinityLab Poroshell HPH-C18柱，4.6mm×150mm，2.7μm；相信效能相当的其它色谱柱亦可以使用)；以含有0.002mol/L乙二胺四乙酸二钠的0.25mol/L乙酸铵溶液-甲醇(90:10)混合液(用氨水或冰醋酸调节pH值至6.75±0.05)作为流动相A，以乙腈-甲醇(90:10)为流动相B，按下表(表1)进行线性梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为280nm；样品盘控温2～8℃，进样体积10μl；
表1：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 95 5
12 92 8
22 92 8
42 85 15
50 75 25
60 75 25
60.1 95 5
70 95 5
系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，米诺环素峰与RS12峰的分离度应不小于1.5；灵敏度溶液色谱图中，主峰信噪比应不小于10；对照品溶液连续进样6次，米诺环素峰面积的相对标准偏差应不大于5.0％；
(4)测定并计算杂质百分量：精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有下表(表2)所列相对保留时间(RRT)对应的杂质峰，按加校正因子的主成分对照品外标法计算该杂质的百分量，
表2：
根据本发明人对一些典型盐酸米诺环素样品的检测，可以一般地确定某些杂质的一般限度，例如，根据本实施例的测试和计算结果，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，按加校正因子的主成分对照品外标法计算，含：
RS03可以一般地规定不得过1.2％，
RS32可以一般地规定不得过0.8％，
RS02可以一般地规定不得过0.6％，
RS11可以一般地规定不得过0.6％，
RS12可以一般地规定不得过0.5％，
RS15可以一般地规定不得过0.5％，
RS16可以一般地规定不得过0.3％，
其他单个杂质可以一般地规定不得过0.10％，杂质总量(除RS03外)可以一般地规定不得过2.0％，小于灵敏度溶液主峰面积的峰(0.05％)可以一般地规定忽略不计。在确定盐酸米诺环素的质量标准时，亦可以采用上述获得的一般性限度结果，即规定：RS03不得过1.2％，RS32不得过0.8％，RS02不得过0.6％，RS11不得过0.6％，RS12不得过0.5％，RS15不得过0.5％，RS16不得过0.3％，其他单个杂质不得过0.10％，杂质总量(除RS03外)不得过2.0％，小于灵敏度溶液主峰面积的峰(0.05％)忽略不计。
本实施例中，表2所列各杂质的化学名及其化学结构式如下：
EP.A：(4R,4aS,5aR,12aS)-4,7-双(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺(4-表米诺环素)，
EP.B：(4S,4aS,5aR,12aS)-4-(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺(山环素)，
EP.C：(4S,4aS,5aR,12aS)-4-(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-7-(甲氨基)-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺(7-单去甲基米诺环素)，
EP.E：(4S,4aS,5aR,12aS)-4,7-双(二甲氨基)-3,10,12a-三羟基-12-亚氨-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,11a,12,12a-十氢并四苯-2-甲酰胺，
EP.F：(4S,4aS,5aR,12aS)-4,7-双(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-N-(羟甲基)-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺，
EP.G：(4S,4aS,5aR,12aS)-4,7,9-三(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺，
EP.H：(4S,4aS,12aS)-4,7-双(二甲氨基)-3,10,11,12a-四羟基-1,12-二氧代-1,4,4a,5,12,12a-六氢并四苯-2-甲酰胺，
本实施例中，系统适用性溶液典型HPLC图如图1所示，其中主成分米诺环素保留时间约为45.5min，各杂质与主成分米诺环素峰的分离度均大于1.5，例如主成分米诺环素峰与最接近的杂质RS12峰之间的分离度达2.3，其余各杂质之间的分离度亦均大于1.5。这表明，本实施例的高效液相色谱法可以有效的用于测定盐酸米诺环素中的典型杂质，并且测定条件具有绿色环保的优点。
实施例2：测定盐酸米诺环素的某些特定杂质
需要特别地说明，上文实施例1的方法中，使用绿色的色谱条件有效地将盐酸米诺环素中的常见杂质例如上文表2所示7种杂质分离开，并有效地对其进行定量。然而，众所周知，根据原料药制备方法及其本身的理化性质，盐酸米诺环素中还存在其它一些比较常见的杂质，例如以下杂质RS17、杂质RS28、杂质RS30、杂质RS33、杂质RS40：
杂质RS17或称杂质EP.I：
(4S,4aS,5aR,12aS)-9-氨基-4-(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺(9-氨基山环素)，
杂质RS28或称9-氨基米诺环素：
杂质RS30或称单甲基乙基米诺环素：
杂质RS33或称杂质EP.D：
(4S,4aS,5aR,12aS)-7-氨基-4-(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺(7-氨基山环素)，
杂质RS40或称去甲金霉素：
本发明人已经发现，使用实施例1的方法，除了可以同时分离测定其中所述7种杂质外，还可以同时测定上述5种杂质，使包括主成份米诺环素的13种物质在同一色谱条件下得以分离和测定，具体实验如下。
参照实施例1进行；取杂质RS17、杂质RS28、杂质RS30、杂质RS33、杂质RS40各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含各杂质0.2～1mg的溶液，作为贮备液，取该贮备液与实施例1所述系统适用性溶液以5：95的体积比混合，得到杂质混合液，取杂质混合液照实施例1的方法注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图；本实验中，杂质混合液典型HPLC图如图2所示，其35min～55min期间的局部细节如图3所示，其中主成分米诺环素保留时间约为45.5min，各杂质与主成分米诺环素峰的分离度均大于1.5，例如主成分米诺环素峰与最接近的杂质RS12峰之间的分离度达2.3，其余各杂质之间的分离度亦均大于1.5；另外，各峰的理论板数均在5000以上尤其是主成分的理论板数达到14万以上。这表明，本发明实施例1的高效液相色谱法可以有效的用于测定盐酸米诺环素中多达12种的典型杂质。
另外，参照实施例1进行；取实施例1之7种杂质以及杂质RS17、杂质RS28、杂质RS30、杂质RS33、杂质RS40和盐酸米诺环素对照品各适量，加水溶解并稀释制成每1ml中含各杂质和米诺环素1～10μg的溶液，作为杂质混合对照品溶液，此溶液中米诺环素的浓度低，便于识别各峰及分离状况；取该杂质混合对照品溶液照实施例1的方法注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图；本实验中，杂质混合对照品溶液典型HPLC图如图4所示，其中主成分米诺环素保留时间约为45.4min，各杂质与主成分米诺环素峰的分离度均大于1.5，例如主成分米诺环素峰与最接近的杂质RS12峰之间的分离度达2.3，其余各杂质之间的分离度亦均大于1.5。这表明，本发明实施例1的高效液相色谱法可以有效的用于测定盐酸米诺环素中多达12种的典型杂质。
实施例3：测定盐酸米诺环素有关物质方法的性能考察
本发明实施例1和实施例2显示，该方法可以有效地用于测定盐酸米诺环素中的有关物质，并且呈现一个或多个方面的优良效果。本实施例3使用本领域技术人员公知的常规药物分析方法就实施例1和实施例2的方法进行方法学性能考察，主要结果汇总如下。
1、专属性及系统适用性的验证结果
(1)空白溶液无干扰；
(2)系统适用性符合要求；
(3)加标供试品溶液中，米诺环素与相邻杂质之间的最小分离度为2.2；
(4)在各强制降解条件下，米诺环素与各杂质峰均能良好分离，米诺环素峰纯度因子均大于999，质量平衡均在95％～105％范围内。以上4个项目的结果均满足本领域的一般质量检测要求。
2、定量限的验证结果
使用配制的定量限溶液重复进样6次，RS02、RS03、RS11、RS12、RS15、RS16、RS17、RS28、RS30、RS32、RS33、RS40及米诺环素的信噪比通常要求应不小于10，峰面积RSD通常要求应不大于10.0％。结果，RS02、RS03、RS11、RS12、RS15、RS16、RS17、RS28、RS30、RS32、RS33、RS40及米诺环素的定量限浓度均在0.4～0.5μg/ml范围内例如测得米诺环素的定量限浓度为0.465μg/ml，信噪比均大于10，峰面积RSD均小于10.0％。
3、检测限的验证结果
使用配制的检测限溶液重复进样3次，RS02、RS03、RS11、RS12、RS15、RS16、RS17、RS28、RS30、RS32、RS33、RS40及米诺环素的信噪比使用配制的应不小于3。结果，RS02、RS03、RS11、RS12、RS15、RS16、RS17、RS28、RS30、RS32、RS33、RS40及米诺环素的检测限浓度均在0.21～0.26μg/ml范围内例如测得米诺环素的定量限浓度为0.233μg/ml，信噪比均大于3。
4、线性和范围的验证结果
经测定，RS02、RS03、RS11、RS12、RS15、RS16、RS17、RS28、RS30、RS32、RS33、RS40在50％～150％(相对于限度浓度)范围内，米诺环素在2.323μg/ml～6.970μg/ml浓度范围内，相关系数均大于0.9999，Y轴截距绝对值通常要求应小于100％线性浓度水平响应值的10％(实测均小于6.6％)。
5、准确度的验证结果
经测定，RS02、RS03、RS11、RS12、RS15、RS16、RS17、RS28、RS30、RS32、RS33、RS40在50％～150％(相对于限度浓度)范围内的回收率均在90％～110％之间，RSD值均小于5.0％；例如各杂质的平均回收率均在92～103％范围内。
6、精密度的验证结果
重复性试验中，分析员A平行配制6份供试品溶液，依法检测：对6份检测结果进行比较，RS02、RS11、RS12、RS15、RS16、RS17、RS28、RS30、RS32、RS33、RS40、其他最大单个杂质极差均小于0.05％；RS03和总杂质(RS03除外)的RSD分别为1.4％、0.8％。
6、溶液稳定性的验证结果
对照品溶液、供试品溶液在2～8℃条件下放置一段时间后检测，各时间点的检测结果同0h结果进行比较，结果，(1)对照品溶液在2～8℃条件下放置22h后检测，同0h相比，主峰面积的RD值小于2.9％；(2)供试品溶液在2～8℃条件下放置54h后检测，检测结果同0h相比，小于0.25％杂质(RS02、RS11、RS12、RS15、RS16、RS17、RS28、RS30、RS32、RS33、RS40、其他最大单个杂质)绝对差值均小于0.05％；RS03和总杂质(RS03除外)的RD值分别为9.8％、8.3％。已经令人遗憾人发现，当将实施例1方法流动相中所用乙酸铵改为同浓度草酸铵时，RS03和总杂质(RS03除外)的RD值分别为21.2％、16.8％，表明乙酸铵不宜被任意替换。
7、耐用性的验证结果
分别改变流速、柱温、流动相pH值：(1)系统适用性均符合要求；(2)各条件下的检测结果与标准条件下的结果相比，小于0.25％杂质(RS02、RS11、RS12、RS15、RS16、RS17、RS28、RS30、RS32、RS33、RS40、其他最大单个杂质)绝对差值均小于0.05％；RS03和总杂质(RS03除外)RD分别为5.9％和4.2％。
上述各项验证结果均完全符合一般的分析方法要求。
实施例4：测试方法和条件的选择
实施例1和实施例2提供的测定盐酸米诺环素中的有关物质的方法，是在付出了巨大创造性劳动之后总结的，已经发现，色谱柱和流动相的独特选择对于成功将12种杂质有效分离是必不可少的，其中出现的一些结果也是现有技术无法预见的，具体试验如下。参照实施例1的方法，不同的仅是改用如下品牌/型号的色谱柱：Sunniest C18柱(4.6mm×250mm，5μm)、Inertsustain C8柱(4.6×250mm，5um)、Waters Symmetey C18柱(4.6×250mm，5μm)、Agilent InfinityLab Poroshell 120Aq-C18柱(4.6mm×150mm，2.7μm)、Agilent InfinityLab Poroshell 120CS-C18柱(4.6mm×150mm，2.7μm)、AgilentInfinityLab Poroshell 120SB-C18柱(4.6mm×150mm，2.7μm)，结果均不能实现全部12种杂质的有效分离；具体地：Sunniest C18柱、Inertsustain C8柱和Waters Symmetey C18柱三者均无法将RS02、RS40和RS16三者有效分离(相邻峰之间分离度均小于0.8)、RS12峰均隐匿到米诺环素峰内部而无法使二者分离、RS15峰与米诺环素峰之间的分离度均在0.9～1.1范围内，例如使用Sunniest C18柱时RS02与RS40之间的分离度仅0.56且RS15峰与米诺环素峰之间分离度为1.03；三种Agilent InfinityLab Poroshell 120柱均无法将RS02与RS40分离开(分离度均在0.7～1.0范围内)、均无法将RS12峰与米诺环素峰分离开(分离度均在0.8～1.0范围内)，例如Agilent InfinityLab Poroshell 120SB-C18柱分离时RS02与RS40分离度为0.84、RS12峰与米诺环素峰分离度为0.92；众所周和，使用反相HPLC进行化学物质的分离分析时，通常要求各峰之间的分离度达到1.5以上，然而本发明人发现，即使是用与本发明实施例1同一品牌的Agilent InfinityLab Poroshell柱，其分离效果显著差于实施例1的色谱柱。参照实施例1的方法，不同的仅是分别改用如下四种药典方法的流动相并以1.0ml/min流速的模式进行洗脱：CP流动相：0.2M醋酸铵-二甲基甲酰胺-四氢呋喃(600:398:2，内含0.01mol/L乙二胺四醋酸二钠)，USP流动相：二甲基甲酰胺-四氢呋喃-0.2M草酸铵-0.01M依地酸二钠(120:80:600:180，氢氧化铵调节pH＝7.2)，JP流动相：一水合草酸铵溶液(7g/250ml)、二甲基甲酰胺、0.1M乙二胺四乙酸二钠(11:5:4)混合液用氢氧化四丁基铵调节pH 6.5，EP流动相：二甲基甲酰胺-四氢呋喃-溶液A(体积比12:8:78，溶液A为：18体积3.75g/L依地酸钠溶液和60体积28.3g/L草酸铵溶液的混合液并用氨水调节pH 7.2)；使用本发明实施例1的条件但流动相分别改为上述四种等度洗脱时，结果均不能实现全部12种杂质的有效分离；具体地：四种流动相均不能将RS33和RS17分离(二峰均重叠)，RS02、RS40、RS16三峰均不能达到可接受的分离(相邻二峰之间分离度均小于0.7)，RS12、米诺环素、RS15三峰均不能达到可接受的分离(相邻二峰之间分离度均小于0.8或者RS12隐匿在米诺环素峰中)，例如使用CP流动相时RS33和RS17二峰重叠，RS02、RS40二峰之间分离度0.46，RS12隐匿在米诺环素峰中、米诺环素峰与RS15分离度为0.68；这些结果表明，即使使用本发明色谱柱但是用现有技术流动相，无法将12种杂质以及米诺环素分离开。参考中国药典2020年版二部盐酸米诺环素品种项下的有关物质检查方法但是改用本发明实施例1的色谱柱进行测定本发明图2所述包含12个杂质和米诺环素的测试溶液时，仅显示7个能达到与相邻峰分离度达1.5以上的杂质峰；参考日本药典JP XVIII版盐酸米诺环素品种项下的有关物质检查方法但是改用本发明实施例1的色谱柱进行测定本发明图2所述包含12个杂质和米诺环素的测试溶液时，仅显示5个能达到与相邻峰分离度达1.5以上的杂质峰；参考欧洲药典11.0版盐酸米诺环素品种项下的有关物质检查方法但是改用本发明实施例1的色谱柱进行测定本发明图2所述包含12个杂质和米诺环素的测试溶液时，仅显示6个能达到与相邻峰分离度达1.5以上的杂质峰。另外，有一些文献记载，在测定盐酸米诺环素中的有关物质时，在流动相中添加约1％三乙胺，本发明人亦尝试在流动相中添加少量三乙胺，以考察其分离效果，发现结果完全不可接受，具体试验是这样进行的；参照实施例1和实施例2的方法，不同的仅是所述流动相A为以含有0.002mol/L乙二胺四乙酸二钠和1％三乙胺的0.25mol/L乙酸铵溶液-甲醇(90:10)混合液(用氨水或冰醋酸调节pH值至6.75±0.05)，其它不变，在对包含12种杂质和米诺环素的生成图2所用杂质混合液进行测定时，R12和R15两个杂质均隐匿在米诺环素峰中，杂质R02与R40之间分离度0.36、R40与R16之间分离度0.53，三个杂质分离度完全不能满足一般测定要求；因此在流动相中添加三乙胺无助于主成分与12种杂质进行有效的分离分析测定。
实施例5：使用本发明方法测定一些盐酸米诺环素的试样
本实施例使用本发明实施例1的方法，对一些盐酸米诺环素试样(三批，批号分别为MN2102002B、MN2102003B、MN2102003B)中的有关物质进行测定，同时以2020年版中国药典、欧洲药典EP11.0版同品种项下的有关物质测定方法进行测定，并作比较，结果如下。
使用本发明实施例1方法测定的结果见以下表3，三批样品之典型的供试品溶液HPLC图分别见图5A、图5B、图5C。
表3：
三批样品还均检出了0.03～0.09％的杂质RS17、RS28、RS30、RS33、RS40，例如MN2102001B还检出了0.04％的RS17、0.09％的RS28、0.03％的RS17、0.06％的RS17、0.05％的RS17。
使用欧洲药典EP11.0版盐酸米诺环素有关物质项下的方法测定，结果见以下表4。
表4：
三批样品均未能将本发明杂质RS17、RS28、RS30、RS33、RS40分离开，可能与上表各峰合并，上表杂质A和杂质H明显的比表4之RS03和RS16大，可能有个别其它杂质隐匿到该两个杂质中。
使用2020年版中国药典盐酸米诺环素有关物质项下的方法测定，结果见以下表5。
表5：
从表中可见，其他最大单个杂质明显比表3大，表明此最大单个杂质可能是多个杂质形成的一个峰，并且无法识别杂质RS15、RS16、RS28、RS30、RS32、RS33、RS40。
根据本发明上下文的结果表明，本发明方法尤其是实施例1方法具有良好的专属性、检测限和定量限、线性与范围、准确度、精密度和溶液稳定性。专属性试验表明，空白溶液不干扰目标杂质峰的检测，系统适用性试验符合要求，表明本方法专属性良好。稳定性试验表明各溶液在2～8℃下放置22小时，各目标杂质峰面积变化均小于10％，表明该分析方法供试品溶液稳定性良好。方法耐用性试验结果表明本方法对柱温、流动相pH值及流动相比例等均有一定的选择性，分析方法中应对上述参数在一定范围内固定。验证结果表明，本分析方法能够对盐酸米诺环素中杂质RS02、RS03、RS11、RS12、RS15、RS16、RS17、RS28、RS30、RS32、RS33、RS40多达12种杂质进行有效检测。
以上对本发明各个方面进行了说明，应当理解，这些实例仅是示意性的，本发明保护范围并不限于此类实例。

Claims (10)

1.测定盐酸米诺环素中的有关物质的方法，包括如下操作：
(1)照高效液相色谱法的规范进行，各测试溶液临用新制；
(2)测试溶液的制备：
供试品溶液：取供试品适量，加水溶解并稀释制成每1ml中约含米诺环素1mg的溶液；
对照品溶液：取盐酸米诺环素对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液；
系统适用性溶液：取盐酸米诺环素系统适用性对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液；
灵敏度溶液：精密量取对照品溶液适量，用水定量稀释制成每1ml中约含0.5μg的溶液；
(3)色谱条件：
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以含有0.002mol/L乙二胺四乙酸二钠的0.25mol/L乙酸铵溶液-甲醇(90:10)混合液(用氨水或冰醋酸调节pH值至6.75±0.05)作为流动相A，以乙腈-甲醇(90:10)为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml；柱温为35℃；检测波长为280nm；样品盘控温2～8℃，进样体积10μl；
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 95 5 12 92 8 22 92 8 42 85 15 50 75 25 60 75 25 60.1 95 5 70 95 5
系统适用性要求：系统适用性溶液色谱图中，米诺环素峰与RS12峰的分离度应不小于1.5；灵敏度溶液色谱图中，主峰信噪比应不小于10；对照品溶液连续进样6次，米诺环素峰面积的相对标准偏差应不大于5.0％；
(4)测定并计算杂质百分量：精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有下表所列相对保留时间(RRT)对应的杂质峰，按加校正因子的主成分对照品外标法计算该杂质的百分量，
2.根据权利要求1的方法，其中所述高效液相色谱法的规范是历届版本的中国药典或者美国药典或者欧洲药典或者日本药典中收载的高效液相色谱法的规范，例如是中国药典2020年版四部通则0512高效液相色谱法的规范。
3.根据权利要求1的方法，其中盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质RS02、RS16、RS32、RS03、RS12、RS15、RS11和米诺环素。
4.根据权利要求1的方法，其中盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质RS02、RS16、RS32、RS03、RS12、RS15、RS11和米诺环素，还包含杂质RS17、杂质RS28、杂质RS30、杂质RS33、杂质RS40，其结构式和/或化学名分别为：
杂质RS17：
(4S,4aS,5aR,12aS)-9-氨基-4-(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺(9-氨基山环素)，
杂质RS28或称9-氨基米诺环素：
杂质RS30或称单甲基乙基米诺环素：
杂质RS33：
(4S,4aS,5aR,12aS)-7-氨基-4-(二甲氨基)-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢并四苯-2-甲酰胺(7-氨基山环素)，
杂质RS40或称去甲金霉素：
5.根据权利要求1的方法，其中十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱是AgilentInfinityLab Poroshell HPH-C18柱，其规格为4.6mm×150mm，2.7μm，或者是效能相当的其它色谱柱。
6.根据权利要求1的方法，其中检测到盐酸米诺环素中含有符合如下限度规定的杂质时认为该盐酸米诺环素合格：RS03不得过1.2％，RS32不得过0.8％，RS02不得过0.6％，RS11不得过0.6％，RS12不得过0.5％，RS15不得过0.5％，RS16不得过0.3％，其他单个杂质不得过0.10％，杂质总量(除RS03外)不得过2.0％，小于灵敏度溶液主峰面积的峰(0.05％)忽略不计。
7.根据权利要求1的方法，其中米诺环素峰的理论板数大于1万例如大于2万例如大于5万。
8.根据权利要求1的方法，其中：
盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质RS02、RS16、RS32、RS03、RS12、RS15、RS11和米诺环素，各相邻峰之间的分离度均大于1.5；
盐酸米诺环素系统适用性对照品中包含杂质RS02、RS16、RS32、RS03、RS12、RS15、RS11和米诺环素，还包含杂质RS17、杂质RS28、杂质RS30、杂质RS33、杂质RS40，各相邻峰之间的分离度均大于1.5；
检测到盐酸米诺环素中含有符合如下限度规定的杂质时认为该盐酸米诺环素合格：杂质RS17不得过0.2％例如不得过0.1％，杂质RS28不得过0.2％例如不得过0.1％，杂质RS30不得过0.2％例如不得过0.1％，杂质RS33不得过0.2％例如不得过0.1％，杂质RS40不得过0.2％例如不得过0.1％；和/或，
供试品溶液色谱图中，米诺环素与相邻杂质之间的分离度大于2.0。
9.一种盐酸米诺环素，其使用权利要求1～8任一项所述方法测定其中的有关物质，该盐酸米诺环素中检出具有如下限度规定的杂质：不超过1.2％的RS03，不超过0.8％的RS32，不超过0.6％的RS02，不超过0.6％的RS11，不超过0.5％的RS12，不超过0.5％的RS15，不超过0.3％的RS16，不超过0.10％的其他单个杂质，不超过2.0％的杂质总量(除RS03外)，小于灵敏度溶液主峰面积的峰(0.05％)忽略不计。
10.根据权利要求9的盐酸米诺环素，其使用权利要求1～8任一项所述方法测定其中的有关物质，该盐酸米诺环素中检出具有如下限度规定的杂质：不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质RS17，不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质RS28，不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质RS30，不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质RS33，不超过0.2％例如不超过0.10％的杂质RS40。
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