CN111836654B - 含维生素c的聚己内酯微球填充物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种含维生素C的聚己内酯微球，包括其的填充物及其制备方法。提供了一种通过将维生素C包封在聚己内酯微球中而获得的聚己内酯微球填充物，当被注入到活体内时，该填充物展现出快速的胶原蛋白形成效果以及高组织修复特性，并且可以长时间保持效果，从而显示优异的软组织(例如脸颊、胸部、鼻子、嘴唇和臀部)的修复或体积扩充性质或改善皱纹的性质，并且减少了皱纹。

Description

含维生素C的聚己内酯微球填充物及其制备方法
技术领域
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年1月10日向韩国知识产权局提交的韩国专利申请第10-2018-0003584号的权益，其全部公开内容通过引用并入本文。
本公开涉及含维生素C的聚己内酯微球填充物及其制备方法，更具体地，涉及这样一种含维生素C的聚己内酯微球填充物及其制备方法，所述填充物不仅通过将维生素C包含于其中而解决了维生素C的体内稳定性问题，而且当应用至活体时，在治疗后展现出快速的胶原蛋白再生和体积增加效果，并还能长时间保持该效果。
背景技术
皮肤填充物是一种注射型医疗器械，其将对人体安全的材料注入面部的真皮层中，以补充皮肤组织，从而例如在外形美观方面改善皱纹和丰满性，并用于所谓的抗衰老治疗，包括肉毒毒素
Figure BDA0002674981820000011
自体脂肪移植、埋线提升、微针、激光治疗、磨皮术等。
首次开发的第一代皮肤填充物是来自动物的胶原蛋白填充物，然而其近年来很少使用，因为治疗后的效果持续时间短，为2到4个月，并且令人烦恼的是，必须在治疗前一个月进行皮肤超敏反应测试。
第二代皮肤填充物是透明质酸填充物，其是目前使用最广泛的填充物，因为它的效果持续时间比胶原蛋白填充物更长，并且由于它是由与人体成分相似的多糖组成的而具有显著更少的副作用(例如皮肤超敏反应)，因此不需要像胶原蛋白填充物那样进行皮肤反应测试。特别是，透明质酸易于处理和去除，具有优异的粘弹性，能够保持皮肤的水分、丰满性和弹性，因此非常适合用作皮肤填充物的原料。最近，已经积极进行了研究，以通过引发透明质酸的交联反应以增加粒度和分子量来延长效果持续时间，但是由于效果持续时间相对较短，为6到12个月，因此令人烦恼的是，必须每6到12个月进行重复治疗。
第三代皮肤填充物是合成的聚合物填充物，例如聚乳酸(PLA)或聚己内酯(PCL)，其在人体中的分解非常缓慢，因此，使用该填充物的目的是展现出比胶原蛋白和透明质酸填充物(它们是吸收性填充物)更长的效果持续时间。特别地，聚己内酯被人体100％吸收，因此是安全的成分，并且具有以下有利方面：在植入皮肤后，聚己内酯比聚乳酸吸收得更慢，能够促进胶原蛋白的产生，并且如同没有异物感的手感柔软的组织的效果能够持续1至4年。然而，聚己内酯填充物是微球形式的填充物，必须通过使该填充物悬浮在凝胶载体(例如羧甲基纤维素(CMC))中来进行施用，并且仅在注入皮肤后的6到8周后显示效果。因此，这是不利的，因为治疗的满意度低于在治疗后立即显示效果的透明质酸填充物。
同时，已知维生素C或L-抗坏血酸、其衍生物和盐能够增强人体的免疫功能，促进胶原蛋白的产生，并表现出保持或增强透明质酸的产生的效果，因此它们表现出对伴随衰老的皮肤皱纹、细纹、雀斑和松弛的预防和改善的抗衰老效果。然而，问题是维生素C在活体内和活体外均非常不稳定，对诸如空气(特别是氧气)、热或光等外部环境敏感而产生反应，并且容易被氧化分解。因此，事实是，在以形成胶原蛋白和改善皱纹为目的的美容产品和类似产品中，通过利用诸如各种衍生物等的稳定形式来限制性地使用维生素C。
因此，需要开发新的聚己内酯微粒填充物，其通过利用现有的聚己内酯微粒填充物的性质并用聚己内酯微球来包封维生素C解决了维生素C的体内稳定性问题而具有改善的功效。
发明内容
技术问题
已设计出本公开来解决上述的维生素C的体内稳定性问题并改善聚己内酯微球填充物的功效，本公开的目的是提供一种含维生素C的聚己内酯微球、包含所述聚己内酯微球的填充物和用于制备所述聚己内酯微球的方法，当被应用至活体时，所述聚己内酯微球在治疗后迅速展现出效果，并能够长时间保持效果。
技术方案
为了实现上述目的，本公开的一个方面提供一种聚己内酯微球，其包含维生素C，所述维生素C的量为基于总计100重量％的含维生素C的聚己内酯微球的0.01至6.5重量％，并且所述聚己内酯微球的平均粒度为10至100μm。
在本公开的另一方面，提供一种用于制备含维生素C的聚己内酯微球的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过将聚己内酯溶解在第一溶剂中并将维生素C溶解在第二溶剂中以制备各自的溶液，然后将两种溶液均匀混合以制备单一溶液，来制备分散相；(b)通过将所述分散相与含有表面活性剂的水溶液(连续相)混合来制备乳液；(c)通过将有机溶剂从在步骤(b)中制备的所述乳液中的所述分散相萃取至连续相中并蒸发来形成微球；和(d)从步骤(c)的所述连续相回收所述微球。
根据本公开的另一方面，提供一种填充物，所述填充物包含本公开的含维生素C的聚己内酯微球；以及药学上可接受的水性载体和聚己内酯微球。
有益效果
包含根据本公开的含维生素C的聚己内酯微球的填充物不仅在应用至活体时展现出快速的胶原蛋白形成效果并展现出高的组织修复特性，而且可以长时间保持效果，从而显示出优异使软组织(例如脸颊、胸部、鼻子、嘴唇和臀部)修复或体积扩充的性质，或皱纹改善的性质。
附图说明
图1a是通过光学显微镜拍摄的根据实施例1-4制备的含抗坏血酸的聚己内酯微球的形状的照片。从照片中可以看出，即使在表面上具有多孔的形貌特征的情况下，也可以确认所制造的微球仍保持球形。
图1b是通过光学显微镜拍摄的根据对比例1-1通过使用过量的抗坏血酸制备的含抗坏血酸的聚己内酯微球的形状的照片。产生的微球没有保持球形，并展现出微球团聚或破碎的形貌特征。
具体实施方式
在下文中，将更详细地描述本公开。
本文所用的“维生素C”作为通用术语进行使用，L-抗坏血酸及其衍生物和盐统称为“维生素C”。维生素C可以选自由L-抗坏血酸、抗坏血酸磷酸酯钠、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸磷酸酯钙、抗坏血酸多肽、抗坏血酸乙基醚、抗坏血酸二棕榈酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸葡萄糖苷和抗坏血酸乙基硅烷醇果胶酸酯组成的组，但不限于此。优选地，可以使用L-抗坏血酸。
在一种实施方式中，本公开的含维生素C的聚己内酯微球中包封的维生素C的量可以为基于总计100重量％的含维生素C的聚己内酯微球的0.01至6.5重量％，优选为0.02至6.0重量％。该包封量是经优化的，以使得维生素C的特有生理活性能够在注射部位展现出协同效应，同时确保维生素C的体内稳定性。
本公开的特点是将这样的维生素C包封在聚己内酯微球中并且一起用作填充物，从而促进了各种生物学功能，例如促进了透明质酸的产生和胶原蛋白的合成。
本公开的含维生素C的聚己内酯微球是使用聚己内酯制备的，其中聚己内酯(其为可生物降解的聚合物)的特性粘度为0.16至1.90dL/g。本文所使用的聚己内酯的特性粘度是指使用乌氏粘度计在25℃下在氯仿中测定的特性粘度。上述聚己内酯聚合物的示例包括购买自Evonik的Resormer C209、C212和C217，以及购买自Corbion的Purasorb PC02、PC04、PC08、PC12和PC17，等等。
根据本公开的含维生素C的聚己内酯微球的平均粒度为10μm或更大至100μm或更小，例如，优选为10至30μm、10至50μm、或10至100μm、20至50μm、30至60μm或40至70μm。本文所使用的平均粒度是指中值粒度，其为对应于粒度分布曲线中50％的体积％的粒度，由D50或D(v,0.5)表示。
当含维生素C的聚己内酯微球的平均粒度小于10μm时，施用于活体内时可能会被巨噬细胞吞噬。当平均粒度大于100μm时，在用注射器注射时可注射性会降低，并且注射针变得更粗，从而导致注射期间更疼痛，这不是优选的。
优选地，根据本公开的含维生素C的聚己内酯微球具有均匀的颗粒分布。与不均匀的微球相比，具有均匀的颗粒分布的微球在注射过程中的残留量的偏差较小，并且堵塞现象较少，因此可以使用细的注射针。优选地，本公开的聚己内酯微球的粒度分布度或跨度值(span value)为1.0或更小。更优选地，尺寸分布为0或更大至0.8或更小。本文使用的粒度分布或跨度值是表示微球的粒度的均匀性的指标，是指由公式粒度分布(跨度值)＝(Dv0.9-Dv0.1)/Dv0.5确定的值。在此，Dv0.1是指对应于微球的粒度分布曲线中10％的体积％的粒度，Dv0.5是指对应于微球的粒度分布曲线中50％的体积％的粒度，并且Dv0.9是指对应于微球的粒度分布曲线中90％的体积％的粒度。根据本公开的含维生素C的聚己内酯微球的特点是展现出均匀的尺寸分布，同时展现出为10μm或更大至100μm或更小的粒度，从而减少了针头堵塞并改善了可注射性。如上所述的粒度范围和跨度值是经优化的，以使得所包含的包封量允许聚己内酯微球中的维生素C长期以适当的量溶出。
根据本公开的含维生素C的聚己内酯微球可以例如使用“溶剂萃取/蒸发法”来制备，但不限于此。
作为本公开的含维生素C的聚己内酯微球的制备方法的具体示例，这样的制备方法包括以下步骤：(a)通过将聚己内酯溶解在第一溶剂中并将维生素C溶解在第二溶剂中以制备各自的溶液，然后将两种溶液均匀混合以制备单一溶液来制备分散相；(b)通过将所述分散相与含有表面活性剂的水溶液(连续相)混合来制备乳液；(c)通过将有机溶剂从在步骤(b)中制备的所述乳液中的分散相萃取至连续相中并进行蒸发来形成微球；和(d)从步骤(c)的所述连续相回收所述微球，以制备含维生素C的聚己内酯微球。
在步骤(a)中，聚己内酯的特性粘度优选在0.16至1.90dL/g的范围内。
在步骤(a)中用于溶解聚己内酯的第一溶剂优选具有不与水混溶的性质。通过利用不与水混溶的有机溶剂的性质，可以在下述步骤(b)中将分散相均匀地混合并分散在作为连续相的含有表面活性剂的水溶液中，从而形成乳液。溶解聚己内酯的溶剂的类型没有特别的限定，优选地可以选自由二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲基乙基酮及其混合溶剂组成的组。更优选地，可以使用二氯甲烷、乙酸乙酯或其混合溶剂。
步骤(a)中的用于溶解维生素C的第二溶剂可以选自由二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙酸及其混合物组成的组。优选地，可以使用二甲基亚砜、甲醇或其混合溶剂。
在步骤(a)中，将聚己内酯和维生素C溶液混合，以制备均匀的混合溶液，从而制备出分散相。优选地，将聚己内酯和维生素C的混合溶液均匀地溶解。例如，当使用二氯甲烷作为聚己内酯的溶剂并且使用二甲基亚砜作为维生素C的溶剂时，相对于二氯甲烷的重量，二甲基亚砜的量优选为3重量％至40重量％。当二甲基亚砜的量小于3重量％时，由于溶解度的降低，维生素C很可能被二氯甲烷沉淀。当二甲基亚砜的量超过40重量％时，分散相的疏水性降低，并且过量的二甲基亚砜在连续相中迅速释放，使得难以形成不与连续相混合的液滴形式的分散相，这不是优选的。
在步骤(b)中，用于使分散相和含有表面活性剂的水溶液均匀混合的方法没有特别的限制，优选地，可以使用高速搅拌器、连续混合器、膜乳化法、微流体乳化法等进行混合。例如，当使用膜乳化法进行混合时，使在步骤(a)中制备的分散相通过具有均匀尺寸微孔的膜，并转移至含有表面活性剂的连续相中，以制备乳液。
对在步骤(b)中使用的表面活性剂的类型没有特别的限制，并且表面活性剂可以没有限制地使用，只要该表面活性剂可以帮助分散相在连续相内形成稳定的液滴乳液。优选地，表面活性剂可以选自由甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、卵磷脂、明胶、聚乙烯醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物及其混合物组成的组。最优选地，可以使用聚乙烯醇。
在步骤(b)中，表面活性剂在含有表面活性剂的连续相中的含量可以为基于含有表面活性剂的连续相的总体积的0.01w/v％至20w/v％，优选为0.1w/v％至5w/v％。当表面活性剂的含量小于0.01w/v％时，可能不能在连续相中形成液滴形式的分散相或乳液。当表面活性剂的含量超过20w/v％时，由于表面活性剂是过量的，在连续相中形成细颗粒之后，可能难以去除表面活性剂。在本公开的实施方式中，使用1至5w/v％的聚乙烯醇来制备含维生素C的聚己内酯微球。
在步骤(c)中，当将包含液滴形式的分散相和含有表面活性剂的连续相的乳液在低于有机溶剂的沸点的温度下保持或搅拌一定时间，例如2至48小时时，可以将有机溶剂从作为分散相的液滴形式的聚己内酯-维生素C溶液萃取到连续相中。萃取到连续相中的一部分有机溶剂可以从连续相的表面蒸发掉。当从液滴形式的溶液中去除有机溶剂时，液滴形式的分散相被固化形成微球，从而获得了含有微球的悬浮液(微球悬浮液)的形式。
在步骤(c)中，为了更有效地去除有机溶剂，可以将连续相的温度加热一定时间。例如，搅拌可以进行例如但不限于48小时或更少，优选地1至36小时，更优选地3至24小时，同时保持温度为5至39.6℃，优选地10至35℃，更优选地15至30℃，从而去除有机溶剂。
在步骤(d)中，可以使用若干已知技术来执行回收聚己内酯微球的方法，例如，可以使用诸如过滤或离心等方法。
在步骤(c)和(d)之间，可以通过过滤和洗涤来去除残留的表面活性剂，然后可以再次进行过滤，以回收微球。
用于去除残留表面活性剂的洗涤步骤通常可以用水进行，并且该洗涤步骤可以重复多次。
进一步地，如上所述，当在步骤(b)中使用高速搅拌器和连续混合器形成乳液时，可以通过在步骤(c)和(d)之间另外使用筛分工艺来获得均匀的微球。可以使用已知技术来执行筛分工艺，并且可以使用具有不同尺寸的筛膜来过滤小颗粒和大颗粒的微球，以获得具有均匀尺寸的微球。
根据本公开的另一方面，提供一种填充物，该填充物包含本公开的含维生素C的聚己内酯微球；以及药学上可接受的水性载体和含维生素C的聚己内酯微球。
对于药学上可接受的水性载体，例如，可以使用注射用水溶液，例如纯净水、生理盐水或磷酸盐缓冲液。进一步地，除了含维生素C的聚己内酯微球和药学上可接受的水性载体之外，如果需要的话，填充物还可以包含选自由纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素(CMC)和羟丙基甲基纤维素(HPMC))、溶质(例如透明质酸、利多卡因、多聚脱氧核糖核苷酸(PDRN)、多核苷酸(PN))和润滑剂(例如甘油)组成的组中的至少一种，但不限于此。透明质酸是优选的。当进一步包含透明质酸并和透明质酸组合时，可以更长地保持初始施用期间的丰满性。
在一种实施方式中，包含本公开的含维生素C的聚己内酯微球的填充物中所含的每种组分的含量可以为基于总计100重量％的填充物配方的2至50重量％的含维生素C的聚己内酯微球(聚己内酯微球中维生素C的含量为0.01至6重量％)、15至97.9重量％的药学上可接受的水性载体、0.1至5重量％的溶质和0至48重量％的润滑剂，但不限于此。当透明质酸作为溶质而添加时，可以使用交联率为0至5％的透明质酸。
包含根据本公开的含维生素C的聚己内酯微球的填充物不仅在治疗后立即在治疗部位展现出快速的胶原蛋白形成作用，并展现出显示自然和理想的丰满感的组织修复特性，而且还保持了维生素C的体内稳定性，具有良好的可注射性，并且在长时间内展现出优异的效果，因此，可以非常有用地用于美容或治疗性目的。
作为具体示例，包含这种聚己内酯微球的填充物可用于填充生物组织、通过填充皱纹来改善皱纹、重塑脸部或修复或增加软组织(例如嘴唇、鼻子、臀部、脸颊或胸部)的丰满性。包含聚己内酯微球的填充物可以以适合于该用途的剂型施用，优选可以是注射剂。
在另一方面，本公开提供一种预填充的注射器，所述预填充的注射器填充有包含聚己内酯微球的填充物。
在下文中，将通过实施例的方式更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅出于说明的目的，并且本公开的范围不限于此。
实施例1：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.9975g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和0.0025g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在19.99g二氯甲烷(制造商：JT Baker，美国)和1.70mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将1w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1200mL的连续相供给至配备有10μm直径多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例1-1：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.985g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和0.015g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在19.94g二氯甲烷(制造商：JT Baker，美国)和1.70mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将1w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1200mL的连续相供给至配备有10μm直径多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例1-2：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.85g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和0.15g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在19.4g二氯甲烷(制造商：JT Baker，美国)和1.76mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将1w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1200mL的连续相供给至配备有10μm直径多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例1-3：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和0.5g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在18g二氯甲烷(制造商：JTBaker，美国)和2.95mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将2w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1100mL的连续相供给至配备有10μm直径多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例1-4：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.0g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和1.0g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在16g二氯甲烷(制造商：JTBaker，美国)和5.23mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将3w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1100mL的连续相供给至配备有10μm直径多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例2：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 02(制造商：Corbion，荷兰)和0.5g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在12.85g二氯甲烷(制造商：JT Baker，美国)和2.95mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将2w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1200mL的连续相供给至配备有10μm直径多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例2-1：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 12(制造商：Corbion，荷兰)和0.5g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在25g二氯甲烷(制造商：JTBaker，美国)和2.95mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将2w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1500mL的连续相供给至配备有10μm直径多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例2-2：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 17(制造商：Corbion，荷兰)和0.5g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在37.5g二氯甲烷(制造商：JT Baker，美国)和2.95mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将5w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将2250mL的连续相供给至配备有10μm直径多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例3：使用高速搅拌器制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和0.5g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在18g二氯甲烷(制造商：JTBaker，美国)和2.95mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将2w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1100mL的连续相置于制备容器中，在所配备的高速混合器以4500rpm的速度搅拌的同时，以7mL/分钟的流速注射分散相。以150rpm的速度搅拌微球悬浮液。将制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，同时使用具有25μm和150μm筛眼的筛网选择微球，然后冻干。
实施例4：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和0.5g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在18g二氯甲烷(制造商：JTBaker，美国)和2.95mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将2w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1100mL的连续相供给至配备有直径为5μm的多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例4-1：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和0.5g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在18g二氯甲烷(制造商：JTBaker，美国)和2.95mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将2w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1100mL的连续相供给至配备有直径为30μm的多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例4-2：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和0.5g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在18g二氯甲烷(制造商：JTBaker，美国)和2.95mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将2w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1100mL的连续相供给至配备有直径为50μm的多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例5：制备包封有抗坏血酸磷酸酯钠的聚己内酯微球
通过将4.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和0.5g抗坏血酸磷酸酯钠(制造商：BASF Care Creations，德国)分别溶解在18g二氯甲烷(制造商：JT Baker，美国)和3.15mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将2w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1100mL的连续相供给至配备有10μm直径多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例5-1：制备包封有抗坏血酸棕榈酸酯的聚己内酯微球
通过将4.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和0.5g抗坏血酸棕榈酸酯(制造商：Thermo Fisher Scientific，美国)分别溶解在18g二氯甲烷(制造商：JT Baker，美国)和1.6mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将2w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，将1100mL的连续相供给至配备有10μm直径多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
实施例6：将羧甲基纤维素用作溶质来制备聚己内酯微球填充物
通过制备用于悬浮微球的溶液，然后混合微球，来制备聚己内酯微球填充物。将2g羧甲基纤维素(制造商：Ashland，美国)添加到75℃的磷酸盐缓冲液中，溶解，并在100rpm搅拌下冷却3小时。当溶液的温度达到25℃时，向其中添加18g甘油，并将在实施例1-3中制备的微球以30％(w/w)混合，以完成聚己内酯微球填充物的制备。
实施例6-1：将透明质酸用作溶质来制备聚己内酯微球填充物
通过制备用于悬浮微球的溶液，然后混合微球，来制备聚己内酯微球填充物。将1g透明质酸(制造商：Bloomage Freda Biopharm，中国)添加到55℃的磷酸盐缓冲液中，溶解，并冷却。当溶液的温度达到25℃时，向其中添加18g甘油，并将在实施例1-3中制备的微球以30％(w/w)混合，以完成聚己内酯微球填充物的制备。
对比例1：制备聚己内酯微球
通过将5g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)与20g二氯甲烷(制造商：JT Baker，美国)混合，来制备分散相。
将1w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1200mL的连续相供给至配备有直径为10μm的多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用三蒸水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
对比例1-1：制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将3.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和1.5g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在14g二氯甲烷(制造商：JTBaker，美国)和9.95mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将3w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，并且将1000mL的连续相供给至配备有10μm直径多孔膜的乳化装置中，同时注射所制备的分散相，以制备微球。将所制备的微球悬浮液置于制备容器中，并以150rpm的速度搅拌。将膜乳化装置和制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃下以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
对比例2：使用高速搅拌器制备包封有抗坏血酸的聚己内酯微球
通过将4.5g生物相容性聚合物Purasorb PC 04(制造商：Corbion，荷兰)和0.5g抗坏血酸(制造商：Tokyo Chemical Industries，日本)分别溶解在18g二氯甲烷(制造商：JTBaker，美国)和2.95mL二甲基亚砜(制造商：Sigma Aldrich，美国)中，然后混合两种溶液，来制备分散相。
将2w/v％的聚乙烯醇水溶液(粘度：4.8至5.8mPa·s)用作连续相，将1100mL的连续相置于制备容器中，在所配备的高速混合器以4500rpm的速度搅拌的同时，以7mL/分钟的流速注射分散相。以150rpm的速度搅拌微球悬浮液。将制备容器的温度保持在25℃。
当完成分散相的注射时，将微球悬浮液在25℃以150rpm的速度搅拌12小时，以去除有机溶剂。当完成有机溶剂的去除时，将微球悬浮液用蒸馏水反复洗涤几次，以去除并获得残留的聚乙烯醇，并将所获得的微球冻干。
对比例3：将羧甲基纤维素用作溶质来制备聚己内酯微球填充物
通过制备用于悬浮微球的溶液，然后混合微球，来制备聚己内酯微球填充物。将2g羧甲基纤维素(制造商：Ashland，美国)添加到75℃的磷酸盐缓冲液中，溶解，并在100rpm的搅拌下冷却3小时。当溶液的温度达到25℃时，向其添加18g甘油，并将在对比例1中制备的微球以30％(w/w)混合，以完成聚己内酯微球填充物的制备。
对比例3-1：将透明质酸用作溶质来制备聚己内酯微球填充物
通过制备用于悬浮微球的溶液，然后混合微球，来制备聚己内酯微球填充物。将1g透明质酸(制造商：Bloomage Freda Biopharm，中国)添加到55℃的磷酸盐缓冲液中，溶解，并冷却。当溶液的温度达到25℃时，向其添加18g甘油，并将在对比例1中制备的微球以30％(w/w)混合，以完成聚己内酯微球填充物的制备。
实验例1：使用光学显微镜观察微球形貌
对于微球的形貌分析，使用光学显微镜来观察在实施例1-4和对比例1-1中制备的微球的形貌。具体地，将微球悬浮液滴在载玻片上，并将载玻片放置在光学显微镜的载物台上(制造商：Olympus BH-2，日本)，在×100放大倍率下观察微球形貌(物镜×10，目镜×10)。
如图1A和1B所示，实施例1-4的微球保持球形，同时在微球表面上具有多孔的形貌特征，而对比例1-1的微球没有保持球形，并且可以观察到团聚或破碎的微球的形貌特征。可以预测，对比例1-1中使用的过量的二甲基亚砜被迅速释放到连续相中，从而降低了分散相的不能与连续相混合的性质，使得难以维持完整的微球。
实验例2：使用激光衍射法来分析微球的粒度
进行该实验以定量测量微球的平均粒度和分布，并确认颗粒的均匀性。实验程序如下。
将50mg微球与1mL超纯水混合，用涡旋混合器混合20秒，然后在超声发生器中放置1分钟并进行分散。将微球分散液置于粒度分析仪(Microtrac Bluewave，日本)中并测量20秒。通过下式来确定跨度值(span value)，用作粒度均匀性的指标。
[式1]
跨度值＝(Dv,0.9–Dv,0.1)/Dv,0.5
[表1]
D<sub>v,0.5</sub>(μm) 跨度值
实施例1 36.7 0.61
实施例1-1 36.2 0.60
实施例1-2 36.8 0.62
实施例1-3 35.6 0.66
实施例1-4 35.4 0.73
实施例2 34.8 0.62
实施例2-1 35.1 0.65
实施例2-2 37.3 0.64
实施例3 32.7 0.92
实施例4 13.9 0.59
实施例4-1 62.8 0.69
实施例4-2 101.8 0.73
实施例5 36.2 0.61
实施例5-1 36.4 0.63
对比例1 35.2 0.58
对比例2 30.1 1.43
如表1所示，实施例1、实施例1-1、实施例1-2、实施例1-3、实施例1-4和对比例1的微球分别使用各种量的抗坏血酸所制备，但是具有相似的约为35μm的平均粒度。因此，证实了用于制备分散相的抗坏血酸对粒度没有显著影响。
在实施例4、实施例4-1和实施例4-2中，确认了可以根据配备有乳化装置的多孔膜的变化来调节粒度。
实施例1-3和对比例2在制备微球的过程中使分散相和含有表面活性剂的水溶液均匀混合的方法有所不同，并且由此制备出的微球显示出不同的平均粒度和跨度值。更详细地，对比例2的微球是使用高速搅拌器制备的微球，证实了与实施例1-3相比，平均粒度相对减小，并且跨度值为1.43，具有宽的粒度分布。
实验例3：聚己内酯微球中抗坏血酸的分析
使用高效液相色谱法来进行该实验，以对包封在聚己内酯微球中的抗坏血酸进行定量分析。详细的实验程序如下。
高效液相色谱中使用的流动相使得含有0.1v/v％三氯乙酸的40v/v％乙腈溶液以0.5mL/分钟的流速流动，并且色谱柱装有C18填充物(Inertsil ODS-3，5μm，4.5×150mm，日本GL Science制造)。将10mg微球在N-甲基吡咯烷酮和乙腈(8:2，v/v)的混合物中稀释，注入高效液相色谱中，并使用UV吸收检测器在245nm波长处进行测量。
[表2]
包封量(wt％)
实施例1 0.02
实施例1-1 0.13
实施例1-2 1.02
实施例1-3 3.24
实施例1-4 5.60
对比例1-1 7.54
如上表2所示，确认了在实施例1、实施例1-1、实施例1-2、实施例1-3和实施例1-4中，含量也随着用于制备分散相的抗坏血酸的量的增加而成比例地增加。特别地，实施例1-4显示，在保持完整微球的形状的同时，抗坏血酸的最大包封量为5.60重量％。
另一方面，对比例1-1显示相对较高的抗坏血酸的包封量，7.54重量％，但是已确认存在微球形状不均匀并且缠结/粘附的现象，因此，它们不适合用作抗坏血酸的包封和递送剂。
实验例4：聚己内酯微球填充物的持久性评估
在该实验中，在向实验动物施用填充物之后，对体积进行分析，以评估聚己内酯微球填充物的持久性。
聚己内酯微球填充物是在实施例6、实施例6-1、对比例3和对比例3-1中所制备的，并将所述聚己内酯微球填充物以100μL的增量皮下注射到出生后6周的SKH1-Hrhr无毛小鼠中，并在预定的时间段(刚施用后的1周、4周和8周)对施用部位进行体积分析。使用PRIMOSLITE(GFMesstechnikGmbH，德国)进行体积测量，并使用PRIMOS 5.6作为分析程序。
[表3]
刚施用后 1周 4周 8周
实施例6 100 94 88 79
实施例6-1 101 114 106 100
对比例3 100％ 64％ 62％ 58％
对比例3-1 102％ 86％ 83 81
如上表3所示，确认了在实施例6和实施例6-1中，根据用于注射的填充物的组成，存在体积变化的差异。确认了在实施例6-1中使用的透明质酸在保持体积方面相对而言比羧甲基纤维素更有效。
如实施例6-1和对比例3-1的结果所示，确认了在使用包封有抗坏血酸的微球的实施例6-1的实例中，在施用后8周，体积的减小相对较少，并且观察到了初始体积增加的现象。可预计将抗坏血酸包封在微球中能够促进各种生物学功能，例如透明质酸的产生和胶原蛋白的合成。

Claims (17)

1.一种聚己内酯微球，包含基于总计100重量％的含维生素C的聚己内酯微球的0.01重量％至6.5重量％的维生素C，并且平均粒度为10μm至100μm，
其中，所述聚己内酯的特性粘度为0.16dL/g至1.90dL/g；
所述维生素C包封在所述聚己内酯微球中；并且
所述微球的跨度值为1.0或更小。
2.根据权利要求1所述的聚己内酯微球，其特征在于，所述维生素C为选自由L-抗坏血酸、抗坏血酸磷酸酯钠、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸磷酸酯钙、抗坏血酸多肽、抗坏血酸乙基醚、抗坏血酸二棕榈酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸葡萄糖苷和抗坏血酸乙基硅烷醇果胶酸酯组成的组中的至少一种。
3.一种用于制备权利要求1所述的含维生素C的聚己内酯微球的方法，包括以下步骤：
(a)通过将聚己内酯溶解在第一溶剂中并将维生素C溶解在第二溶剂中以制备各自的溶液，然后将两种溶液均匀混合以制备单一溶液，来制备分散相；
(b)通过将所述分散相与含有表面活性剂的水溶液(连续相)混合来制备乳液；
(c)通过将有机溶剂从在步骤(b)中制备的所述乳液中的所述分散相萃取至连续相中并进行蒸发来形成微球；和
(d)从步骤(c)的所述连续相回收所述微球，以制备出聚己内酯微球。
4.根据权利要求3所述的用于制备聚己内酯微球的方法，其特征在于，所述聚己内酯的特性粘度为0.16dL/g至1.90dL/g。
5.根据权利要求3所述的用于制备聚己内酯微球的方法，其特征在于，所述维生素C为选自由L-抗坏血酸、抗坏血酸磷酸酯钠、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸磷酸酯钙、抗坏血酸多肽、抗坏血酸乙基醚、抗坏血酸二棕榈酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸葡萄糖苷和抗坏血酸乙基硅烷醇果胶酸酯组成的组中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的用于制备聚己内酯微球的方法，其特征在于，步骤(a)中的所述第一溶剂为选自由二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、甲基乙基酮及其混合溶剂组成的组中的至少一种。
7.根据权利要求3所述的用于制备聚己内酯微球的方法，其特征在于，步骤(a)中的所述第二溶剂为选自由二甲基亚砜、甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、乙酸及其混合物组成的组中的至少一种。
8.根据权利要求3所述的用于制备聚己内酯微球的方法，其特征在于，步骤(b)中的所述表面活性剂为选自由甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、卵磷脂、明胶、聚乙烯醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物及其混合物组成的组中的至少一种。
9.根据权利要求3所述的用于制备聚己内酯微球的方法，其特征在于，步骤(b)中的所述表面活性剂的含量为基于所述含表面活性剂的水溶液的总体积的0.01w/v％至20w/v％。
10.一种聚己内酯微球填充物，包含基于总计100重量％的所述聚己内酯微球填充物的2重量％至50重量％的含维生素C的聚己内酯微球、0.1重量％至5重量％的溶质、0至48重量％的润滑剂和15重量％至97.9重量％的药学上可接受的水性载体，其中，所述微球包含基于所述微球的总重量的0.01重量％至6.5重量％的维生素C，并且所述微球的平均粒度为10μm至100μm，
其中，所述聚己内酯的特性粘度为0.16dL/g至1.90dL/g；
所述维生素C包封在所述聚己内酯微球中；并且
所述微球的跨度值为1.0或更小。
11.根据权利要求10所述的聚己内酯微球填充物，其特征在于，所述维生素C为选自由L-抗坏血酸、抗坏血酸磷酸酯钠、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸磷酸酯钙、抗坏血酸多肽、抗坏血酸乙基醚、抗坏血酸二棕榈酸酯、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸葡萄糖苷和抗坏血酸乙基硅烷醇果胶酸酯组成的组中的至少一种。
12.根据权利要求10所述的聚己内酯微球填充物，其特征在于，所述溶质为选自由羧甲基纤维素(CMC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、透明质酸、利多卡因、多聚脱氧核糖核苷酸(PDRN)、多核苷酸(PN)及其混合物组成的组中的至少一种。
13.根据权利要求10所述的聚己内酯微球填充物，其特征在于，所述润滑剂为甘油。
14.根据权利要求10所述的聚己内酯微球填充物，其特征在于，所述药学上可接受的水性载体是蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液。
15.根据权利要求10所述的聚己内酯微球填充物，其特征在于，所述填充物用于改善皱纹、修复软组织或扩充体积、或修正轮廓。
16.根据权利要求10所述的聚己内酯微球填充物，其特征在于，所述填充物用于注射。
17.一种预填充的注射器，所述预填充的注射器填充有根据权利要求10至16中任一项所述的聚己内酯微球填充物。
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