CN117582541A - 一种注射填充物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种注射填充物及其制备方法和应用，所述的填充物为聚己内酯微粒，所述聚己内酯微粒为球形颗粒，所述球形颗粒的粒径为20‑100μm，所述聚己内酯微粒具有粗糙的表面或不光滑的表面。本发明中的聚己内酯微球具有粗糙的表面或不光滑的表面，增加了与细胞的接触面积，提高了细胞的黏附能力和滞留时间，改善了聚己内酯微球的亲和力，可刺激并加快胶原蛋白的生长。本发明在制备过程中科学筛选了各组分的用量，在控制水相溶液粘度的基础上，配合快速膜乳化法，获得了规则的、表面粗糙、粒径均一的球形聚己内酯微粒。

Description

一种注射填充物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及软组织填充、医学美容填充物技术领域，具体涉及一种注射填充物及其制备方法和应用。

背景技术

皮肤主要由表皮层和真皮层构成，其中胶原蛋白存在真皮层中。随着人生理性衰老以及外界的各种刺激，真皮层中的胶原蛋白等流失速度开始加快，供给不及消耗，使得皮肤开始变得松弛出现皱纹。注射美容是利用注射的方式将填充物注射入真皮层或皮下以改善皮肤状况。

可生物降解的聚合微粒具有在体内分解的特性，利用该特性，其广泛用于整形用填充物等体内植入物。目前，这些注射材料主要有两大类，一类是以交联透明质酸钠凝胶、胶原蛋白凝胶为代表的填充产品，主要作用机理为皮下填充，注射后使皮下缺陷处得到膨胀填充，抚平皱纹；另一类是以聚左旋乳酸(PLLA)和聚己内酯微球等聚酯类为代表的胶原刺激产品，聚酯类材料具有良好的生物相容性、抗凝血性、无毒和低免疫性等优点，在生理环境中可水解降解成低分子量碎片，而低分子量碎片可被巨噬细胞内吞并在细胞内降解，在降解过程中通过刺激宿主的免疫反应，吸引皮下大量的巨噬细胞和其他免疫细胞，导致成纤维细胞的增殖及其肌成纤维细胞的分化，合成大量的胶原蛋白，从而恢复皮下容量、修复皱纹。

目前已经有含有聚乳酸和/或聚己内酯的多个产品应用于皮肤皱纹和凹陷的填充，其主要的形态为聚乳酸微粒、聚乳酸微球和聚己内酯微球等。但是现有的医用聚酯材料亲水性普遍较差，不利于机体蛋白质在其表面的附着，进而影响细胞黏附性能，并且医用聚酯材料在以水为基质的溶液中易于发生沉降，对使用者操作技巧要求高。而且微粒粒径的不均一性会导致被巨噬细胞吞噬，在生成胶原蛋白之前分解或者发生注射针堵塞的现象。

CN104001209和CN101842084公开了PCL的微粒及其用途，制备微球方法中采用甲基纤维素作为表面活性剂，微球流动性能较好，但是微球的粒径分布范围广，不能很好地控制聚合物的尺寸，在使用过程中粒度不均匀不但会堵塞注射针头，而且会影响产品使用效果，会造成产品在人体组织中分散不均匀降解缓慢等，从而形成鼓包和结节等不良反应。，而且由于聚己内酯微球表面光滑，对细胞的黏附能力差，注入皮下层后起效慢，使用者体验感不佳。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种注射填充物及其制备方法和应用，填充物对细胞的黏附能力好，粒度均一，分散稳定性更好，不易堵针，同时具有良好的生物相容性及降解性。

本发明的目的之一是提供一种注射填充物，所述的填充物为聚己内酯微粒，所述聚己内酯微粒为球形颗粒，所述聚己内酯的分子量为5000-30000，所述球形颗粒的粒径为20-100μm，所述聚己内酯微粒具有粗糙的表面或不光滑的表面。

本发明的优选技术方案中，所述聚己内酯微粒粗糙的表面或不光滑的表面具有不规则孔径。

本发明的优选技术方案中，所述球形颗粒的粒径优选20-70μm，更优选为25-50μm。

本发明的优选技术方案中，所述聚己内酯的分子量为10000-25000。

本发明的优选技术方案中，所述聚己内酯的分子量为15000-22000。

本发明的另一目的在于提供一种注射填充物的制备方法，包括下述步骤：

(1)水相制备：将表面活性剂加入到纯化水中，搅拌，溶解；

(2)有机相制备：将可注射填充物加入到有机溶剂中，搅拌至完全溶解；

(3)乳化制粒：将有机相和水相混合均匀，搅拌，使用膜乳化器进行乳化，制备微球；

(4)搅拌挥发：搅拌使有机溶剂挥发；

(5)微球收集：收取混悬液，分离，清洗，干燥，得到可注射填充物微球。

本发明的优选技术方案中，所述的表面活性剂为聚乙烯醇、甲基纤维素、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯亚胺、聚苯乙烯、聚氧硅烷、羟丙基纤维素中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述的有机溶剂为丙酮、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、、二氯甲烷中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述的表面活性剂与纯化水的比例为10-50g/L，优选为15-40g/L，更优选为20-30g/L。

本发明的优选技术方案中，所述水相溶液的粘度为2-10cP，优选4-8cP。

本发明的优选技术方案中，所述的水相溶液制备过程中，向反应釜中加入纯化水，开启机械搅拌，调节转动功率为10-50Hz，优选20-30Hz；将表面活性剂缓慢加入纯化水中，加热至60-120℃，搅拌2～6小时，待表面活性剂完全溶解后降至室温。

本发明的优选技术方案中，所述可注射填充物和有机溶剂的比例为100-300g/L，优选150-250g/L。

本发明的优选技术方案中，所述的有机相制备过程中，将可注射填充物加入到有机溶剂中，搅拌使其完全溶解。

本发明的优选技术方案中，所述的乳化步骤中，调节机械搅拌功率为10～50Hz，将有机相缓慢加入至水相中，搅拌3-10min后，使用膜乳化器调节压力为0.5-1bar，使用10-50μm膜管进行快速膜乳化。

本发明的优选技术方案中，所述的搅拌挥发步骤中，将乳化后样品转移至反应釜中，保持机械搅拌功率为10～50Hz，使用氮气/压缩空气置换釜内气体，维持1-20m/s流速，搅拌12～48小时使有机溶剂完全挥发。

本发明的优选技术方案中，所述的微球收集步骤中，采用离心、沉降、过滤的任一种或其组合分离方式收集微球。

本发明的优选技术方案中，所述的微球收集步骤中，有机溶剂挥发后，收取反应釜中混悬液，使用离心机分离固体微球，所述的离心机转速为2000-5000rpm，离心时间2-8min，优选离心机转速为3000-4000rpm，离心时间3-6min。本发明的优选技术方案中，所述的微球收集步骤中，取收集到的微球，用纯化水和乙醇进行清洗，离心后收集，干燥，即得。

本发明的优选技术方案中，所述的干燥是在30～60℃下干燥10～30小时，优选30～40℃下干燥15～24小时。

本发明的优选技术方案中，所述的干燥为鼓风干燥。

本发明的优选技术方案中，所述的清洗步骤中，纯化水清洗2-5次，乙醇清洗1-2次。

本发明的优选技术方案中，所述的注射填充物为聚己内酯微球。

本发明的优选技术方案中，所述方法制备得到的聚己内酯微球中，所述微球的粒径为20-100μm，具有粗糙的表面或不光滑的表面。

本发明的优选技术方案中，所述聚己内酯微粒粗糙的表面或不光滑的表面具有不规则孔径。

本发明的优选技术方案中，所述球形颗粒的粒径优选20-70μm，更优选为25-50μm。

本发明的优选技术方案中，所述聚己内酯的分子量为5000-30000。

本发明的优选技术方案中，所述聚己内酯的分子量为1000-25000。

本发明的优选技术方案中，所述聚己内酯的分子量为15000-22000。

本发明的另一目的在于提供一种注射填充物的制剂，所述的填充物为聚己内酯微粒，所述聚己内酯微粒为球形颗粒，所述聚己内酯的分子量为5000-30000，所述球形颗粒的粒径为20-100μm，所述聚己内酯微粒具有粗糙的表面或不光滑的表面。

本发明的优选技术方案中，所述制剂中还包含悬浮稳定剂和缓冲液中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述的悬浮稳定剂选自聚乙烯醇(PVA)、明胶、阿拉伯胶、瓜尔胶、硫酸软骨素、透明质酸(HA)、交联透明质酸、羧甲基纤维素钠(CMC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基纤维素(MC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、淀粉、果胶酸、肝素、葡萄糖、β-环糊精、壳聚糖、海藻酸钠的任一种或其组合。优选地，悬浮稳定剂为透明质酸、交联透明质酸和/或羧甲基纤维素钠。

本发明的优选技术方案中，所述的缓冲液选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、氯化钠缓冲液的任一种或其组合。优选地，该缓冲液为氯化钠或磷酸盐缓冲液。

本发明的优选技术方案中，所述制剂还包含多元醇、氨基酸、多肽、蛋白质、核酸、维生素、多糖、局部类麻醉剂中的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述制剂选自液体针剂或粉针剂的任一种。

本发明的优选技术方案中，所述液体针剂选自水凝胶、混悬液、溶液中的任一种或其组合。

本发明的另一目的在于提供一种注射填充物制剂的联用方式，将所述射填充物制剂与其他类型注射填充物、麻醉剂、消炎剂、抗过敏剂的任一种或其组合联合使用；所述的填充物为聚己内酯微粒，所述聚己内酯微粒为球形颗粒，所述聚己内酯的分子量为5000-30000，所述球形颗粒的粒径为20-100μm，所述聚己内酯微粒具有粗糙的表面或不光滑的表面。

本发明的优选技术方案中，所述的其他类型注射填充物选自胶原蛋白、透明质酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、硅胶、自体脂肪的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述的麻醉剂选自利多卡因、普鲁卡因、丁卡因、布比卡因、罗哌卡因、双氯芬酸、吗啡、氢可酮、氧可酮、可待因、芬太尼、戊巴比妥钠、苯巴比妥钠、硫喷妥钠、氯醛糖、氨基甲酸乙酯、水合氯醛的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述的消炎剂选自类固醇类消炎剂、非类固醇类消炎剂的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述的类固醇类消炎剂选自氟轻松、氢化可的松、倍他米松的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述的非类固醇类消炎剂选自阿司匹林、水杨酸镁、水杨酸钠、水杨酸胆碱镁、二氟尼柳、双水杨酸酯、布洛芬、吲哚美辛、氟比洛芬、苯氧基布洛芬、萘普生、萘丁美酮、吡罗昔康、保泰松、双氯灭痛、芬洛芬、酮基布洛芬、酮咯酸、四氯芬那酸、舒林酸、托美丁的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述的抗过敏剂选自苯海拉明、异丙嗪、氯苯那敏、色甘酸钠、酮替芬、倍他司汀、孟鲁斯特、扎鲁斯特、沙丁胺醇、葡萄糖酸钙、肾上腺糖皮质激素的任一种或其组合。

本发明的另一目的在于提供一种注射填充物在制备注射填充剂中的应用，所述的填充物为聚己内酯微粒，所述聚己内酯微粒为球形颗粒，所述球形颗粒的粒径为20-100μm，所述聚己内酯微粒具有粗糙的表面或不光滑的表面。

本发明的优选技术方案中，所述注射填充部位选自面部、颈部、腹部、胸部、臀部、大腿、小腿、上臂、下臂的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述注射填充剂用于改善患者面部消瘦、脂肪萎缩、面颊下陷、眼窝下陷、皮肤皱纹的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述注射填充剂用于制备注射填充面部皱纹的组合物中的应用。

本发明的优选技术方案中，所述面部皱纹选自浅至深层鼻唇沟、眉间、前额、眼角的任一种或其组合。

除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。

本发明采用凝胶渗透色谱(GPC)法(中国药典2020年版四部通则0514)检测聚己内酯分子量，如下所示：

供试品溶液取本品适量，精密称定，加三氯甲烷溶解并稀释制成每1ml中约含10mg的溶液，用0.22μm的有机滤膜过滤，取续滤液。

对照品溶液分别取5-6个不同分子量的聚苯乙烯对照品适量，精密称定，加三氯甲烷溶解并稀释制成每1ml中各约含对照品2mg的溶液，溶解，混匀。

色谱条件采用凝胶色谱柱(Styragel HR 4E THF，7.8×300mm或效能相当的色谱柱)；流动相为三氯甲烷；流速为每分钟0.7ml；检测器为示差折光检测器；柱温为35℃；进样体积10μL。

测定法精密量取供试品溶液及对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。由GPC软件分别计算出对照品溶液的回归方程与供试品的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)及分子量分布(Mw/Mn)。

本发明采用电子拉力试验机测定推挤力：使用速度30mm/min，停机力值：250.00N，停机位移15.0mm。

本发明采用Kinexus Pro⁺流变仪剪切粘度和流变性能。

剪切粘度测试：选择转子型号：PU20 L1917 SS，设置间隙：0.3mm；装载样品后，选择剪切速率扫描程序，设置温度为25℃，起始剪切速率为0.01S^-1，结束剪切速率为100.00S^-1，扫描时间为3min，每一个数量级采点数为20个。得到剪切速率为1.00S^-1时的剪切粘度。

选择转子型号：PU20 L1917 SS，设置间隙：0.3mm。装载样品后，选择频率表(应变控制)，设置温度为25℃，起始频率为10HZ，结束频率为0.1HZ，剪切应变0.5％，每一个数量级采点数为10个，得到频率为1HZ下的G’和G”。

与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：

1、本发明中的聚己内酯微球具有粗糙的表面或不光滑的表面，这与挥发效率等因素相关，相比光滑的表面，表面粗糙、多孔结构的聚己内酯微球具有更高的比表面积，因此增加了与细胞的接触面积，提高了细胞的黏附能力和滞留时间，改善了聚己内酯微球的亲和力，可刺激并加快胶原蛋白的生长，并且降低对局部皮肤的刺激性。

2、本发明在制备过程中科学筛选了各组分的用量，在控制水相溶液粘度的基础上，配合快速膜乳化法，获得了规则的、表面粗糙、粒径均一的球形聚己内酯微粒。

3、采用本发明的制备方法获得的聚己内酯微球粒径分布范围窄且粒径均一，提高了可注射的聚己内酯微球的收率。

4、本发明中得到制剂的聚己内酯微球粒径分布均匀、在注射用水中能够迅速分散均匀，避免了注射时聚集、堵塞针孔和形成结节等缺陷，同时降低了皮肤出血水肿等刺激性反应。

5、该制备方法工艺简便、易于操作，条件温和，耗时短，易实现放大生产。

附图说明

图1实施例1聚合物微球的扫描电镜检测结果；

图2大鼠皮下注射后3天(D4)，填充物大体照片；

图3大鼠皮下注射后2周(D15)，填充物大体照片；

图4大鼠皮下注射后8周(D55)，填充物大体照片；

图5大鼠皮下注射后3天(D4)，HE染色；

图6大鼠皮下注射后3天(D4)，A：PSR染色；B：α-SMA免疫组化；

图7大鼠皮下注射后2周(D15)，HE染色；

图8大鼠皮下注射后2周(D15)，A：PSR染色；B：α-SMA免疫组化；

图9大鼠皮下注射后8周(D55)，HE染色；

图10大鼠皮下注射后8周(D55)，A：PSR染色；B：α-SMA免疫组化。

具体实施方式

以下将结合实施例具体说明本发明。本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。

实施例1:聚己内酯微球的制备

①水相制备：向10L反应釜中加入纯化水5L，开启机械搅拌，调节转动功率为25Hz；缓慢加入聚乙烯醇100g，加热至80℃，搅拌5小时，待聚乙烯醇完全溶解后降至室温(粘度5cP)；

②有机相制备：向烧杯中加入二氯甲烷500mL，称取Mn为20000的聚己内酯100g加入至烧杯中，搅拌使其完全溶解；

③乳化：调节机械搅拌功率为20Hz，将上述有机相缓慢加入至水相中，搅拌5min后，使用膜乳化器调节压力为0.8bar，使用30μm膜管进行快速膜乳化；

④搅拌挥发：将乳化后样品转移至10L反应釜中，保持机械搅拌功率为20Hz，使用氮气/压缩空气置换釜内气体，维持20m/s流速，搅拌24小时使有机溶剂完全挥发；

⑤微球收集：待二氯甲烷挥发后，收取反应釜中混悬液，使用离心机分离固体微球(3500rpm，5min)，并用纯化水和乙醇进行清洗(纯化水清洗3次，乙醇清洗1次)和离心，将离心后得到的样品放入鼓风干燥箱中，调节温度为40℃，干燥20小时；制得粒径为20-80μm的微球。

实施例2聚己内酯微球的制备

①水相制备：向10L反应釜中加入纯化水5L，开启机械搅拌，调节转动功率为25Hz；缓慢加入聚乙烯醇120g，加热至80℃，搅拌6小时，待聚乙烯醇完全溶解后降至室温(粘度5.8cP)；

②有机相制备：向烧杯中加入三氯甲烷500mL，称取Mn为22000聚己内酯110g加入至烧杯中，搅拌使其完全溶解；

③乳化：调节机械搅拌功率为25Hz，将上述有机相缓慢加入至水相中，搅拌5min后，使用膜乳化器调节压力为1bar，使用30μm膜管进行快速膜乳化；

④搅拌挥发：将乳化后样品转移至10L反应釜中，保持机械搅拌功率为20Hz，使用氮气/压缩空气置换釜内气体，维持15m/s流速，搅拌30小时使有机溶剂完全挥发；

⑤微球收集：待三氯甲烷挥发后，收取反应釜中混悬液，使用离心机分离固体微球(3500rpm，5min)，并用纯化水和乙醇进行清洗(纯化水清洗3次，乙醇清洗1次)和离心，将离心后得到的样品放入鼓风干燥箱中，调节温度为40℃，干燥20小时；制得粒径为20-80μm的微球。。

实施例3聚己内酯微球的制备

①水相制备：向10L反应釜中加入纯化水5L，开启机械搅拌，调节转动功率为25Hz；缓慢加入聚乙烯醇80g，加热至80℃，搅拌4小时，待聚乙烯醇完全溶解后降至室温(粘度4.7cP)；

②有机相制备：向烧杯中加入二氯甲烷500mL，称取Mn为20000聚己内酯80g加入至烧杯中，搅拌使其完全溶解；

③乳化：调节机械搅拌功率为20Hz，将上述有机相缓慢加入至水相中，搅拌5min后，使用膜乳化器调节压力为0.8bar，使用30μm膜管进行快速膜乳化；

④搅拌挥发：将乳化后样品转移至10L反应釜中，保持机械搅拌功率为20Hz，使用氮气/压缩空气置换釜内气体，维持20m/s流速，搅拌30小时使有机溶剂完全挥发；

⑤微球收集：待二氯甲烷挥发后，收取反应釜中混悬液，将微球过滤，并用纯化水和乙醇进行清洗(纯化水清洗3次，乙醇清洗1次)和离心，将离心后得到的样品放入鼓风干燥箱中，调节温度为40℃，干燥20小时；制得粒径为20-80μm的微球。。

实施例4聚己内酯微球的制备

①水相制备：向10L反应釜中加入纯化水5L，开启机械搅拌，调节转动功率为25Hz；缓慢加入甲基纤维素60g，加热至80℃，搅拌4小时，待甲基纤维素完全溶解后降至室温(粘度7cP)；

②有机相制备：向烧杯中加入二氯甲烷500mL，称取Mn为18000聚己内酯100g加入至烧杯中，搅拌使其完全溶解；

③乳化：调节机械搅拌功率为20Hz，将上述有机相缓慢加入至水相中，搅拌5min后，使用膜乳化器调节压力为0.8bar，使用30μm膜管进行快速膜乳化；

④搅拌挥发：将乳化后样品转移至10L反应釜中，保持机械搅拌功率为20Hz，使用氮气/压缩空气置换釜内气体，维持20m/s流速，搅拌28小时使有机溶剂完全挥发。

⑤微球收集：待二氯甲烷挥发后，收取反应釜中混悬液，使用离心机分离固体微球(3500rpm，5min)，并用纯化水和乙醇进行清洗(纯化水清洗3次，乙醇清洗1次)和离心，将离心后得到的样品放入鼓风干燥箱中，调节温度为40℃，干燥20小时；制得粒径为20-80μm的微球。。

实施例5聚己内酯制剂的制备

称取羧甲基纤维素钠(型号3000-5000Pa·s)3g，加入磷酸盐溶液96g，甘油1g，搅拌溶解后，加入PCL微球49g，混合均匀后即得。采用本发明的方法检测推挤力、粘弹性，剪切粘度。

平均推挤力：22.543N(27G*12MM针头速度30mm/min)

剪切粘度：310.6pa·s

粘弹性：1HZ时G’:456.8pa G”:547.6pa

实施例6聚己内酯制剂的制备

称取羧甲基纤维素钠(型号9000-11000Pa·s)3g，加入磷酸盐溶液96g，甘油1g，搅拌溶解后，加入PCL微球49g，混合均匀后即得。检测推挤力、粘弹性，剪切粘度

平均推挤力：24.448N(27G*12MM针头速度30mm/min)

剪切粘度：295.3pa·s

粘弹性：G’:844.8pa G”:769.4pa

实施例7聚己内酯制剂的制备

称取羧甲基纤维素钠(型号12000-15000Pa·s)3g，加入磷酸盐溶液96g，甘油1g，搅拌溶解后，加入PCL微球49g，混合均匀后即得。检测推挤力、粘弹性，剪切粘度。

平均推挤力：28.005N(27G*12MM针头速度30mm/min)

剪切粘度：277.4pa·s

粘弹性：1HZ G’:1097pa G”:942.6pa

实施例8聚己内酯制剂的制备

称取交联透明质酸钠凝胶(20mg/g)90g，非交联透明质酸钠溶液(20mg/g)10g，搅拌混合均匀后，加入PCL微球49g，混合均匀后即得。检测推挤力、粘弹性，剪切粘度。

平均推挤力：28.005N(27G*12MM针头速度30mm/min)

剪切粘度：204.2pa·s

粘弹性：1HZ G’844.1pa G”102.9pa

实施例9聚己内酯制剂的制备

称取交联透明质酸钠凝胶(20mg/g)72g，非交联透明质酸钠溶液(20mg/g)8g，磷酸盐溶液20g，搅拌溶解后，加入PCL微球49g，混合均匀后即得。检测推挤力、粘弹性，剪切粘度。

平均推挤力：24.071N(27G*12MM针头速度30mm/min)

剪切粘度：160.7pa·s

粘弹性：1HZ时G’:263.2pa G”:56.61pa

实施例10聚己内酯制剂的制备

称取交联透明质酸钠凝胶(20mg/g)54g，非交联透明质酸钠溶液(20mg/g)6g，磷酸盐溶液40g，搅拌溶解后，加入PCL微球49g，混合均匀后即得。检测推挤力、粘弹性，剪切粘度。

平均推挤力：16.564N(27G 1*12MM针头速度30mm/min)

剪切粘度：116.5pa·s

粘弹性：1HZ时G’:187.1pa G”:33.67pa

试验例1本发明的聚己内酯产品和市售Ellanse(少女针)产品对SD大鼠局部反应试验

(1)实验动物

动物：120只Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌性；

周龄：约6-8周，体重：200-220g；

动物等级：SPF级；

实验动物来源：北京维通利华实验动物技术有限公司。

将大鼠随机分为4组，空白对照组，PCL-1组(实施例5)、PCL-2组(市售Ellanse-S)、PCL-3组(市售Ellanse-M)，分别进行注射局部反应试验。在大鼠背部进行注射填充，注射量为100mg/kg；空白对照组注射同等量的生理盐水。

(2)动物一般状况

试验期间，空白对照组和所有实验组动物均未见死亡，所有动物外观、体征、行为、活动、摄食、饮水、二便等均正常。

(3)注射部位状况

注射后即刻，对照组动物注射部位皮肤出现明显隆起，注射后30min内恢复平坦，之后观察期未再现。

注射后即刻，3种PCL实验组所有动物的注射部位皮肤均明显隆起；注射后24小时，注射局部隆起范围扩大，隆起幅度降低；之后观察期肉眼观察或触诊时，大部分动物可触及皮下异物存在。上述变化在3种产品间未见明显差异。

注射后即刻至8小时内，PCL-1组、PCL-2组、PCL-3组分别有12/30、18/30、17/30动物注射局部皮肤发红，在注射后3天内均完全恢复。

(4)常规观察

3种PCL实验组所有解剖动物注射部位皮下均可见填充物存在，相对于穿刺部位未见明显游移。注射后3天，对照组注射部位周边结缔组织未见异常；3种PCL产品组动物的填充物周边皮下结缔组织均可见不同程度增厚(水肿)，其中，PCL-2组、PCL-3组分别3/5和4/5动物填充物周边结缔组织增厚程度/范围明显较大。

(5)填充物状态

颜色：注射后3天(D4)、2周(D15)和8周(D55)，3种PCL实验组所有取材填充物均呈白色/乳白色。

形状：注射后3天(D4，图1)，3种PCL实验组所有取材填充物呈软凝胶状，形状不固定，随皮肤伸展，填充物形状变化较大；注射后2周(D15，图2)和8周(D55，图3)，所有取材填充物形状相对固定，呈不规则椭圆形/长条状，外缘光滑，填充物被筋膜包裹，与皮下组织界限清晰。

大小：注射后3天(D4)，因填充物尚未定型，表面积测量未进行统计比较。注射后2周(D15)，3种PCL实验组填充物表面积未见明显差异。注射后8周(D55)，3种PCL实验组填充物表面积未见明显差异。

(6)组织病理学

注射后3天(D4，图4-5)，3种PCL填充物周围结缔组织均增厚，表现为急性炎性渗出，渗出物内可见中性粒细胞和纤维素。填充物被结缔组织包裹，结缔组织及填充物浅层区域(外周)的PCL颗粒间可见大量中性粒细胞为主的白细胞浸润，然而，填充物深层(内部)未见新生组织/细胞渗入，在制片过程中脱落。填充物浅层区域(外周)的PCL颗粒间可见大量未定型细胞外基质及少量纤维组织，纤维组织主要由I型、III型胶原组成，不稳定的III型胶原比例较高；间质内可见肌成纤维细胞和新生毛细血管。

注射后2周(D15，图6-7)，3种PCL填充物周围结缔组织未见增厚，未见炎性渗出。填充物浅层区域(外周)PCL颗粒间可见典型肉芽肿炎性细胞浸润及新生组织的形成。与注射后3天(D4)相比较，填充物周围急性炎性消退，填充物浅层区域(外周)可见以巨噬细胞为主的异物肉芽肿性炎性反应，新生组织进一步向填充物深层侵入；PCL颗粒间可见大量巨噬细胞及其衍生的上皮样细胞和组织细胞，可见少量多核巨细胞；可见细胞外基质及以I型、III型胶原纤维为主的纤维组织，I型胶原纤维比例升高；间质内可见大量肌成纤维细胞和新生毛细血管。在该时间点，3中PCL产品引起的局部组织反应大致相当。

注射后8周(D55，图8-9)，3种PCL填充物引起的局部组织反应仍以肉芽肿性炎性反应及新生组织的形成为主。与注射4周(D29)相比较，3种PCL填充物引起的肉芽肿性炎性反应趋于稳定，上皮样细胞及组织细胞比例下降；多核巨细胞比例在PCL-1组(实施例5)和PCL-3组(Ellanse-M)未见明显变化，而在PCL-2组(Ellanse-S)明显升高；PCL-1组(实施例5)与PCL-2组(Ellanse-S)和PCL-3组(Ellanse-M)组相比，炎性渗出较少。3种PCL填充物引起的新生组织均继续生长、成熟，表现为间质扩张，细胞外基质及纤维组织增多/增厚，均形成境界清晰、形状规则的完整纤维网络，更加稳定的I型胶原纤维比例明显升高；肌成纤维细胞数量减少。

以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种注射填充物，所述的填充物为聚己内酯微粒，所述聚己内酯微粒为球形颗粒，所述聚己内酯的分子量为5000-30000，所述球形颗粒的粒径为20-100μm，所述聚己内酯微粒具有粗糙的表面或不光滑的表面。

2.根据权利要求1所述的一种注射填充物，其特征在于，所述球形颗粒的粒径为20-70μm，更优选为25-50μm。

3.根据权利要求1-2任一项所述的一种注射填充物，其特征在于，所述聚己内酯的分子量为10000-25000，更优选为15000-22000。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的一种注射填充物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)水相制备：将表面活性剂加入到纯化水中，搅拌，溶解；

(2)有机相制备：将可注射填充物加入到有机溶剂中，搅拌至完全溶解；

(3)乳化制粒：将有机相和水相混合均匀，搅拌，使用膜乳化器进行乳化，制备微球；

(4)搅拌挥发：搅拌使有机溶剂全部挥发；

(5)微球收集：收取混悬液，过滤，清洗，干燥，得到可注射填充物微球。

5.根据权利要求4的制备方法，其特征在于，所述的表面活性剂为聚乙烯醇、甲基纤维素、聚氧乙烯、聚氧丙烯、聚乙烯亚胺、聚苯乙烯、聚氧硅烷、羟丙基纤维素中的任一种或其组合。

6.根据权利要求4的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为丙酮、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲苯和二氯甲烷中的任一种或其组合。

7.根据权利要求4的制备方法，其特征在于，所述的表面活性剂与纯化水的比例为10-50g/L，优选为15-40g/L，更优选为20-30g/L。

8.根据权利要求4的制备方法，其特征在于，所述水相溶液的粘度为2-10cP，优选4-8cP。

9.一种如权利要求1-3任一项所述的一种注射填充物或者权利要求4-8任一项的制备方法制备得到的注射填充物作为注射填充剂的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述注射填充剂的填充部位选自面部、颈部、腹部、胸部、臀部、大腿、小腿、上臂、下臂的任一种或其组合，优选填充部位为面部。