CN111278420A - 活性物质-六肽复合体及包含其的化妆品组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及活性物质‑六肽复合体及包含其的化妆品组合物。本发明的活性物质‑六肽复合体通过键合有机酸或类固醇和六肽，抗氧化性及皮肤再生效果优于现有的有机酸、类固醇或六肽。因此，本发明的活性物质‑六肽复合体及包含其的化妆品组合物可有效地用于抗氧化及防止皮肤老化。

Description

活性物质-六肽复合体及包含其的化妆品组合物
技术领域
本发明涉及活性物质-六肽复合体及包含其的化妆品组合物。
背景技术
皮肤的老化现象可分为内源性老化和外源性老化。内源性老化是指自然老化，随着时间的推移胶原纤维、弹力纤维等细胞外基质蛋白的合成量减少而弹力减少，角质层的结构发生变化以减少皮肤细胞内水分含量。外源性老化是指由外部刺激如紫外线、空气污染、烟草烟雾、压力等引起的老化，光老化属于代表性的外源性老化。光老化是皮肤过度暴露于紫外线时产生活性氧类，由此诱发由活化蛋白1(activatorprotetin-1，AP-1)和核因子-kB(nu clearfactor-kB，NF-kB)的活化引起的炎症反应，从而导致构成皮肤的脂质、蛋白质、核酸和酶等受到损害并发生老化。
并且，由暴露于紫外线引起的皮肤内活性氧类的生成通过损坏抗氧化防御机制来造成皮肤蛋白质和其他高分子的氧化应激以及光损伤。这些由暴露于紫外线引起的皮肤老化以各种形式影响皮肤，并引起深皱纹、细皱纹、皮肤粗糙和皮肤干燥等现象，从而加速皮肤老化(Hong Jae Kee，Korean Jou rnal of Aesthetic and Cosmetology，Vol.7No.2：51-62，2009)。
最近，由臭氧层的破坏引起的紫外线照射量的增加、生活空间的干燥化、个人的过敏体质、压力及有害化学物质的增加导致更多的皮肤损伤，因此对这些皮肤损伤的预防及改善的需求正在增加。由于对皮肤损伤的预防和改善的需求增加，与功能性化妆品研究中现有的美白或防皱不同，与皮肤损伤的预防和改善及其抗氧化活性有关的新材料的开发是一个新的且备受关注的领域，它的重要性进一步增加。
尤其，随着对皮肤敏感的消费者因环境污染而增加，为了最小化由化学材料引起的刺激，对使用具有各种功能的天然物的化妆品的需求不断增加。并且，最近，已经积极研究了用于治疗皮炎或特应性疾病的类固醇类材料。
由于这些原因，可具有功效而不对皮肤产生副作用的天然物来源的功能性材料及类固醇类材料的开发备受关注，已报告了许多关于利用其的多种功能性化妆品的开发和功效成分开发的研究。
发明内容
技术问题
为此，本发明人为了开发利用活性物质的化妆品组合物而进行了研究，结果开发了使自然界中存在的有机酸和作为功能性肽的六肽键合的有机酸-六肽复合体。并且，本发明人开发了使对皮肤炎或特应性患者具有功效的类固醇和作为功能性肽的六肽键合并变异的六肽复合体。确认上述有机酸-六肽复合体及变异的六肽复合体具有抗氧化及皮肤再生效果，从而完成了本发明。
解决问题的方案
本发明的一实施方式提供由具有EEMQRR(序列编号1)的氨基酸序列的六肽与活性物质键合而成的活性物质-六肽复合体。
本发明的再一实施方式提供包含上述活性物质-六肽复合体作为有效成分的化妆品组合物。
本发明的另一实施方式提供包含上述活性物质-六肽复合体作为有效成分的用于治疗皮肤伤口的药学组合物。
本分发明的还有一实施方式提供用于改善皮肤状态的本分发明的活性物质-六肽复合体的用途。
本发明的又一实施方式提供制备用于改善皮肤状态的化妆品组合物的本发明的活性物质-六肽复合体的用途。
本发明的又一实施方式提供用于治疗皮肤伤口的本发明的活性物质-六肽复合体的用途。
本发明的又一实施方式提供制备用于治疗皮肤伤口的药剂的本发明的活性物质-六肽复合体的用途。
本发明的又一实施方式提供包括对对象的皮肤处理本发明的活性物质-六肽复合体的步骤的皮肤状态的改善方法。
本发明的又一实施方式提供包括对对象的皮肤处理本发明的活性物质-六肽复合体的步骤的皮肤伤口的治疗方法。
发明的效果
本发明的活性物质-六肽复合体通过键合有机酸或类固醇和六肽，抗氧化性及皮肤再生效果优于现有的有机酸、类固醇或六肽。因此，本发明的活性物质-六肽复合体及包含其的化妆品组合物可有效地用于抗氧化及防止皮肤老化。
附图说明
图1为示出通过高效液相色谱纯化的甲酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图2为示出通过高效液相色谱纯化的葡萄糖醛酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图3为示出通过高效液相色谱纯化的乳酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图4为示出通过高效液相色谱纯化的甲羟戊酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图5为示出通过高效液相色谱纯化的丙酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图6为示出通过高效液相色谱纯化的丙酮酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图7为示出通过高效液相色谱纯化的奎尼酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图8为示出通过高效液相色谱纯化的莽草酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图9为示出通过高效液相色谱纯化的松香酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图10为示出通过高效液相色谱纯化的积雪草酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图11为示出通过高效液相色谱纯化的胆酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图12为示出通过高效液相色谱纯化的熊去氧胆酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图13为示出通过高效液相色谱纯化的乌索酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图14为示出通过高效液相色谱纯化的壬二酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图15为示出通过高效液相色谱纯化的吡啶二羧酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图16为示出通过高效液相色谱纯化的富马酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图17为示出通过高效液相色谱纯化的衣康酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图18为示出通过高效液相色谱纯化的苹果酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图19为示出通过高效液相色谱纯化的草酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图20为示出通过高效液相色谱纯化的丁二酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图21为示出通过高效液相色谱纯化的酒石酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图22为示出通过高效液相色谱纯化的α-酮戊二酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图23为示出通过高效液相色谱纯化的柠檬酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图24为示出通过高效液相色谱纯化的硫辛酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图25为示出通过高效液相色谱纯化的香叶酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图26为示出通过高效液相色谱纯化的山梨酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图27为示出通过高效液相色谱纯化的生物素-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图28为示出通过高效液相色谱纯化的维A酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图29为示出通过高效液相色谱纯化的咖啡酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图30为示出通过高效液相色谱纯化的肉桂酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图31为示出通过高效液相色谱纯化的阿魏酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图32为示出通过高效液相色谱纯化的迷迭香酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图33为示出通过高效液相色谱纯化的烟酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图34为示出通过高效液相色谱纯化的丁香酸-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图35为示出将有机酸键合到六肽的C-末端的合成过程的图。
图36为示出将有机酸键合到六肽的N-末端的合成过程的图。
图37为示出将有机酸键合到六肽的侧链的合成过程的图。
图38a为通过伤口愈合实验确认迷迭香酸-EEMQRR-NH2、咖啡酸-EEM QRR-NH2、阿魏酸-EEMQRR-NH2、酒石酸-EEMQRR-NH2、苹果酸-EEMQ RR-NH2、壬二酸-EEMQRR-NH2、松香酸-EEMQRR-NH2、丙酮酸-EEMQRR-NH2及丁二酸-EEMQRR-NH2复合体的皮肤再生效果的曲线图。
图38b为通过伤口愈合实验确认积雪草酸-EEMQRR-NH2、生物素-EEM QRR-NH2、胆酸-EEMQRR-NH2、肉桂酸-EEMQRR-NH2、柠檬酸-EEMQRR-NH2、吡啶二羧酸-EEMQRR-NH2、甲酸-EEMQRR-NH2、富马酸-EEMQRR-NH2、香叶酸-EEMQRR-NH2、葡萄糖醛酸-EEMQRR-NH2、衣康酸-EEMQR R-NH2、硫辛酸-EEMQRR-NH2、乳酸-EEMQRR-NH2、甲羟戊酸-EEMQRR-NH2、烟酸-EEMQRR-NH2、草酸-EEMQRR-NH2、丙酸-EEMQRR-NH2、奎尼酸-EEMQRR-NH2、莽草酸-EEMQRR-NH2、山梨酸-EEMQRR-NH2、丁香酸-EEMQRR-NH2、维A酸-EEMQRR-NH2、熊去氧胆酸-EEMQRR-NH2、乌索酸-EEMQRR-NH2及α-酮戊二酸-EEMQRR-NH2复合体的皮肤再生效果的曲线图。
图38c为通过伤口愈合实验确认作为本发明的六肽的EEMQRR-NH2、乙酰-EEMQRR-NH2(乙酰六肽-8(Acetyl hexapeptide-8))、迷迭香酸、阿魏酸、迷迭香酸-EEMQRR-NH2及阿魏酸-EEMQRR-NH2复合体的皮肤再生效果的曲线图。
图39为为通过伤口愈合实验确认香叶酸-EEMQRR-NH2、COOH-EEMQ RR-香叶酸及COOH-EE(香叶酸)MQRR-NH2复合体的皮肤再生效果的曲线图。
图40为示出为了解香叶酸-EEMQRR-NH2、COOH-EEMQRR-香叶酸及COOH-EE(香叶酸)MQRR-NH2复合体的细胞毒性而进行的WST-1分析结果的曲线图。
图41为示出以戊二酸酐作为连接子的倍他米松-EEMQRR-NH2复合体的合成工序的图。
图42为示出以丙二酸作为连接子的倍他米松-EEMQRR-NH2复合体的合成工序的图。
图43为示出通过高效液相色谱纯化的倍他米松-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图44为示出通过高效液相色谱纯化的地塞米松-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图45为示出通过高效液相色谱纯化的氢化可的松-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图46为示出通过高效液相色谱纯化的强的松-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图47为示出通过高效液相色谱纯化的甲泼尼龙-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图48为示出通过高效液相色谱纯化的雌三醇-EEMQRR-NH2复合体的分析结果的图。
图49为通过伤口愈合实验确认倍他米松-EEMQRR-NH2、地塞米松-EE MQRR-NH2、氢化可的松-EEMQRR-NH2、强的松-EEMQRR-NH2、甲泼尼龙-EEMQRR-NH2及雌三醇-EEMQRR-NH2复合体的皮肤再生效果的曲线图。
图50为通过伤口愈合实验确认戊酸倍他米松-EEMQRR-NH2、二丙酸倍他米松-EEMQRR-NH2、戊酸双氟可龙-Glutaroyl-EEMQRR-NH2、17-丁酸氢化可的松-EEMQRR-NH2、糠酸莫米松-EEMQRR-NH2及醋丙甲泼尼龙-EEM QRR-NH2复合体的皮肤再生效果的曲线图。
图51为通过伤口愈合实验确认戊酸倍他米松-Gluraric(戊二酸)-EEM QRR-NH2、戊酸倍他米松-Succinic(丁二酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Maleic(马来酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Malonic(丙二酸)-EEMQ RR-NH2、戊酸倍他米松-Adipic(己二酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Fumaric(富马酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Isophthalic(间苯二甲酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Terephthalic(对苯二甲酸)-EEMQRR-NH2及戊酸倍他米松-2，6-Naphthalenedicarboxylic(萘二甲酸)-EEMQRR-NH2复合体的皮肤再生效果的曲线图。
图52为示出为了解戊酸倍他米松-EEMQRR-NH2、二丙酸倍他米松-EE MQRR-NH2、戊酸双氟可龙-Glutaroyl-EEMQRR-NH2、17-丁酸氢化可的松-EEMQRR-NH2、糠酸莫米松-EEMQRR-NH2及醋丙甲泼尼龙-EEMQRR-NH2复合体的细胞毒性而进行的WST-1分析结果的曲线图。
图53为示出为了解戊酸倍他米松-Glutaric(戊二酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Succinic(丁二酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Maleic(马来酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Malonic(丙二酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Adipic(己二酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Fumaric(富马酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Isophthalic(间苯二甲酸)-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Terephthalic(对苯二甲酸)-EEMQRR-NH2及戊酸倍他米松-2，6-Naphthalenedicarboxylic(萘二甲酸)-EEMQRR-NH2复合体的细胞毒性而进行的WST-1分析结果的曲线图。
具体实施方式
下面，详细说明本发明。
本发明的一实施方式提供由具有EEMQRR(序列编号1)的氨基酸序列的六肽和活性物质键合而成的活性物质-六肽复合体。
上述活性物质可以为有机酸。具体地，上述有机酸可以为选自由一元酸、二元酸、三元酸、脂肪酸、肉桂酸及芳香酸组成的组中的一种。上述有机酸可具有至少1个羧基。
上述一元酸可以为选自由甲酸(Formic acid)、葡萄糖醛酸(Glucuroni c acid)、乳酸(Lactic acid)、甲羟戊酸(Mevalonic acid)、丙酸(Propioni c acid)、丙酮酸(Pyruvic acid)、奎尼酸(Quinic acid)、莽草酸(Shikimic acid)、松香酸(Abieticacid)、积雪草酸(Asiatic acid)、胆酸(Cholic ac id)、熊去氧胆酸(Ursodeoxycholicacid)及乌索酸(Ursolic acid)组成的组中的一种。
本发明中使用的术语“甲酸”也被称为蚁酸或甲烷酸，是指除蚂蚁外还包含在荨麻等植物中的有机酸。上述甲酸的结构如下述化学式1所示。
化学式1：
Figure BDA0002416120860000091
本发明中使用的术语“葡萄糖醛酸”以麦秆、木材等结构性多糖类的组分存在，并且是动物界中高级动物的粘多糖的主要成分，是包含在透明质酸、肝素、硫酸软骨素等中的有机酸。上述葡萄糖醛酸的结构如下述化学式2所示。
化学式2：
Figure BDA0002416120860000092
本发明中使用的术语“乳酸”还可以称为“α-羟基丙酸，”是指从乳酸菌中产生的有机酸。上述乳酸在自然界中分布广泛，除了大多数以游离态存在于植物中以外，在植物果实发酵过程中产生。上述乳酸的结构如下述化学式3所示。
化学式3：
Figure BDA0002416120860000101
本发明中使用的术语“甲羟戊酸”也被称为火落酸(hiochic acid)，是指清酒或啤酒中所含的有机酸。上述甲羟戊酸对通过生长于清酒来引起腐败的作为真性火落菌的异型腐酒乳杆菌(Lactobacillus heterohiochii)的生长是必要的。上述甲羟戊酸的结构如下述化学式4所示。
化学式4：
Figure BDA0002416120860000102
本发明中使用的术语“丙酸”是醇或丙酸发酵产物，是指乳糜(chyle)及汗液中所含有的有机酸。上述丙酸的结构如下述化学式5所示。
化学式5：
Figure BDA0002416120860000103
本发明中使用的术语“丙酮酸”是指在细菌、酵母发酵中由埃姆登-迈耶霍夫途径(Embden-Meyerhof Pathway)或恩特纳-杜多罗夫途径(Entner-Dou dor off Pathway)产生的有机酸。上述丙酮酸的结构如下述化学式6所示。
化学式6：
Figure BDA0002416120860000104
本发明中使用的术语“奎尼酸”是指规那树树皮、咖啡种子、苹果及桃子等果实中所含的具有高等植物特有的环结构的有机酸。上述奎尼酸的结构如下述化学式7所示。
化学式7：
Figure BDA0002416120860000111
本发明中使用的术语“莽草酸”为奎尼酸的不饱和衍生物，是指莽草的果实中所含的四氢三羟基苯甲酸类有机酸。上述莽草酸的结构如下述化学式8所示。
化学式8：
Figure BDA0002416120860000112
本发明中使用的术语“松香酸”是指作为松香的主要成分的二萜类有机酸。上述松香酸的结构如下述化学式9所示。
化学式9：
Figure BDA0002416120860000113
本发明中使用的术语“积雪草酸”是指积雪草中所含的达玛醇酸类有机酸。上述积雪草酸的结构如下述化学式10所示。
化学式10：
Figure BDA0002416120860000114
本发明中使用的术语“胆酸”是指存在于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖类等分泌胆汁的动物的胆汁中的有机酸。上述胆酸的结构如下述化学式11所示。
化学式11：
Figure BDA0002416120860000121
本发明中使用的术语“熊去氧胆酸”是指已知以熊胆的主要成分的胆汁酸。上述熊去氧胆酸的结构如下述化学式12所示。
化学式12：
Figure BDA0002416120860000122
本发明中使用的术语“乌索酸”为苹果和樱桃等果实和叶子的蜡状皮膜物质，是指α-香树脂醇类三萜烯类有机酸。上述乌索酸的结构如下述化学式13所示。
化学式13：
Figure BDA0002416120860000123
上述二氧化物可以为选自由壬二酸(Azelaic acid)、吡啶二羧酸(Dipic olinicacid)、富马酸(Fumaric acid)、衣康酸(Itaconic acid)、苹果酸(Ma lic acid)、草酸(Oxalic acid)、丁二酸(Succinic acid)、酒石酸(Tartaric acid)及α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid)组成的组中的一种。
本发明中使用的术语“壬二酸”是指小麦、黑麦及大麦等谷物中所含的饱二羧酸类有机酸。已知壬二酸是一种抗菌剂，减少毛囊和毛孔中的细菌，并具有抗氧化及抗炎症功效。并且，在皮肤细胞或毛囊因痤疮增生或变形的情况下，使其愈合正常并缓解囊性痤疮、由痤疮引起的色素沉着及发红。壬二酸的结构如下述化学式14所示。
化学式14：
Figure BDA0002416120860000131
本发明中使用的术语“吡啶二羧酸”是指包括枯草芽孢杆菌在内的许多芽孢杆菌属细菌的孢子中所含的吡啶二羧酸类有机酸。并且，上述吡啶二羧酸在使用中还用作抗坏血酸的抗氧化剂。上述吡啶二羧酸的结构如下述化学式15所示。
化学式15：
Figure BDA0002416120860000132
本发明中使用的术语“富马酸”是指冰岛酸的苔藓或菌类等中所含的不饱和二羧酸类有机酸。上述富马酸的结构如下述化学式16所示。
化学式16：
Figure BDA0002416120860000133
本发明中使用的术语“衣康酸”也被称为亚甲基丁二酸，是指梅醋霉菌利用糖类产生的二羧酸类有机酸。并且，除了梅醋霉菌以外，紫纹羽病菌也在培养基中积累少量衣康酸。上述衣康酸的结构如下述化学式17所示。
化学式17：
Figure BDA0002416120860000134
本发明中使用的术语“苹果酸”是指对应于苹果或葡萄等果实中所富含的羟基丁二酸的有机酸。上述苹果酸的结构如下述化学式18所示。
化学式18：
Figure BDA0002416120860000141
本发明中使用的术语“草酸”是指以钾盐或钙盐形式广泛分布在植物界中的有机酸。上述草酸是与2个羧基键合的最简单的二羧酸。上述草酸的结构如下述化学式19所示。
化学式19：
Figure BDA0002416120860000142
本发明中使用的术语“丁二酸”也被称为琥珀酸，是指在琥珀(amber)、松节油、斧足类、地衣类、菌类等中的有机酸。上述丁二酸是二聚二羧酸。上述丁二酸的结构如下述化学式20所示。
化学式20：
Figure BDA0002416120860000143
本发明中使用的术语“酒石酸”还可以称为“2,3-二羟基丁二酸，”存在于葡萄和葡萄酒中的二氧丁二酸类有机酸。酒石酸可对通过向酒石中加入碳酸钙来生成的沉淀物处理硫酸来获得。上述酒石酸的结构如下述化学式21所示。
化学式21：
Figure BDA0002416120860000144
本发明中使用的术语“α-酮戊二酸”是指通过假单胞菌属的微生物发酵由葡萄糖经酮葡糖酸合成的有机酸。上述α-酮戊二酸的结构如下述化学式22所示。
化学式22：
Figure BDA0002416120860000151
上述三元醇可以为柠檬酸(Citric acid)。
本发明中使用的术语“柠檬酸”也被称为枸橼酸，是指主要存在于柠檬及酸橙等柑桔类水果中的有机酸。上述柠檬酸是一种具有羟基的多元羧酸，以游离酸的状态包含在许多植物的种子或果汁中。上述柠檬酸的结构如下述化学式23所示。
化学式23：
Figure BDA0002416120860000152
上述脂肪酸可以为选自由硫辛酸(Lipoic acid)、香叶酸(Geranic acid)、山梨酸(Sorbic acid)、生物素(Biotin)及维A酸(Tretinoin)组成的组中的一种。
本发明中使用的术语“硫辛酸”是指与脂肪酸具有二硫键的有机酸。上述硫辛酸的结构如下述化学式24所示。
化学式24：
Figure BDA0002416120860000153
本发明中使用的术语“香叶酸”是指玫瑰、薄荷等中所含的作为香味成分的有机酸。上述香叶酸的结构如下述化学式25所示。
化学式25：
Figure BDA0002416120860000154
本发明中使用的术语“山梨酸”也被称为2，4-己二酸，是指马加木(Sor buscommixta Hedlund)的未成熟果实中所含的有机酸。上述山梨酸抑制微生物的生长而被用作加工食品的保鲜材料。上述山梨酸的结构如下述化学式26所示。
化学式26：
Figure BDA0002416120860000161
本发明中使用的术语“生物素”为维生素B复合体之一，是指含硫并用具有戊酸基的四氢噻吩环和脲基环接合的有机酸。上述生物素的结构如下述化学式27所示。
化学式27：
Figure BDA0002416120860000162
本发明中使用的术语“维A酸”是指作为维生素A的衍生物的视黄酸的全反式(all-trans)异构体。上述维A酸的结构如下述化学式28所示。
化学式28：
Figure BDA0002416120860000163
上述肉桂酸可以为选自由咖啡酸(Caffeic acid)、肉桂酸(Cinnamic ac id)、阿魏酸(Ferulic acid)及迷迭香酸(Rosmarinic acid)组成的组中的一种。
本发明中使用的术语“咖啡酸”是存在于咖啡豆、土豆、谷物和蔬菜等各种农作物中的酚酸化合物的一种，是指由3-(3，4-二羟基苯基)-2-丙烯酸(3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-propenoic acid)表示的有机酸。上述咖啡酸的结构如下述化学式29所示。
化学式29：
Figure BDA0002416120860000171
本发明中使用的术语“肉桂酸”是指肉桂的油或野茉莉等香脂树中所含的不饱和羧酸类有机酸。上述肉桂酸的结构如下述化学式30所示。
化学式30：
Figure BDA0002416120860000172
本发明中使用的术语“阿魏酸”是指形成植物细胞壁的木质素的前体物质。上述阿魏酸的结构如下述化学式31所示。
化学式31：
Figure BDA0002416120860000173
本发明中使用的术语“迷迭香酸”是指主要薄荷、留兰香、迷迭香等薄荷植物中所含的有机酸。上述迷迭香酸的结构如下述化学式32所示。
化学式32：
Figure BDA0002416120860000174
上述芳香酸可以为选自由烟酸(Nicotinic acid)及丁香酸(Syringic aci d)组成的组中的一种。
本发明中使用的术语“烟酸”也被称为维生素B3或尼克酸(niacin)，是指广泛存在于动物的肝、酵母、豆类及谷物等生物体内的吡啶-3羧酸类有机酸。上述烟酸的结构如下述化学式33所示。
化学式33：
Figure BDA0002416120860000181
本发明中使用的术语“丁香酸”是指刺槐(Robinia pseudacacia L)、鼠李皮(Cascara sagrada)等植物中所含的三羟基苯甲酸类有机酸。上述丁香酸的结构如下述化学式34所示。
化学式34：
Figure BDA0002416120860000182
在本发明的活性物质-六肽复合体中，在活性物质为有机酸的情况下，将与有机酸键合的六肽命名为“有机酸-六肽复合体”。
具体地，本发明提供由具有EEMQRR(序列编号1)的氨基酸序列的六肽与有机酸键合而成的有机酸-六肽复合体。
上述有机酸可键合在六肽的N-末端、C-末端或侧链。具体地，上述有机酸的羧基可与六肽的N-末端具有肽键。
上述有机酸可通过连接子来键合在六肽的C-末端。此时，有机酸可通过取代或未取代的C1-6等连接子来键合在六肽的C-末端。在本发明的一实施例中，将二醇用作上述连接子。并且，上述有机酸可与羧基在六肽的C-末端被酰胺基取代的六肽具有肽键。
上述有机酸可键合在六肽的侧链。具体地，上述有机酸可键合在六肽的侧链的羧基或酰胺基位置。此时，在有机酸键合在羧基位置的情况下，可通过乙二醇等连接子来进行键合，在有机酸键合在酰胺基位置的情况下，可具有肽键。
在上述有机酸-六肽复合体的一实例中，可以由下述化学式35表示的。
化学式35：
Figure BDA0002416120860000191
在上述式中，X为有机酸，R'及R"分别独立地为氢或C1-3烷基。
并且，在上述有机酸为通过连接子与六肽的N-末端键合的复合体的一实例中，可以由下述化学式35-1表示。
化学式35-1：
Figure BDA0002416120860000192
在上述式中，X为有机酸，L为连接子，R'及R"分别独立地为氢或C1-3烷基。
在本发明中使用的术语“六肽”是指具有Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg的氨基酸序列的六肽。并且，上述六肽可以为羧基在六肽的C-末端被酰胺基所取代的六肽。上述六肽可以为具有序列编号1表示的氨基酸序列。
上述酰胺基可以为选自由伯酰胺基、仲酰胺基、叔酰胺基组成的组中的一种酰胺基。优选地，上述酰胺基可以为伯酰胺基。上述六肽结构的一实例如下述化学式36所示。
化学式36：
Figure BDA0002416120860000201
上述有机酸-六肽复合体的化学式在表1中示出。
表1
Figure BDA0002416120860000202
Figure BDA0002416120860000211
Figure BDA0002416120860000221
Figure BDA0002416120860000231
Figure BDA0002416120860000241
Figure BDA0002416120860000251
Figure BDA0002416120860000261
Figure BDA0002416120860000271
Figure BDA0002416120860000281
本发明人为了开发利用天然物质的化妆品组合物，制备了将自然界中存在的有机酸与六肽键合的有机酸-六肽复合体(图1至图34)。
并且，本发明人确认上述有机酸-六肽复合体具有与维生素C相当的程度的优异的活性(表7)。进而，本发明人还确认上述有机酸-六肽复合体对皮肤再生及伤口愈合具有优异的效果(图38a至图38c)。因此，可有效地用作皮肤再生及伤口治疗用组合物，其包含本发明的有机酸-六肽复合体作为有效成分。
并且，上述活性物质可以为类固醇。具体地，上述类固醇可以为选自由倍他米松(betamethasone)、地塞米松(dexamethasone)、氢化可的松(hydr ocortisone)、强的松(prednisone)、甲泼尼龙(methyl prednisone)、雌三醇(estriol)、戊酸倍他米松(Betamethasone valerate)、二丙酸倍他米松(Bet amethasone dipropionate)、糠酸莫米松(Mometasone furoate)、17-丁酸氢化可的松(Hydrocortisone 17-butyrate)、戊酸双氟可龙(Diflucortolone valerat e)及醋丙甲泼尼龙(Methylprednisolone aceponate)组成的组中的一种。
本发明中使用的术语“倍他米松”是指具有糖皮质激素作用的肾上腺皮质激素剂。上述倍他米松具有优秀的抗炎效果。上述倍他米松的结构如下述化学式37所示。
化学式37：
Figure BDA0002416120860000291
本发明中使用的术语“地塞米松”为泼尼松龙的衍生物，是指具有糖皮质激素作用的肾上腺皮质激素剂。上述地塞米松的结构如下述化学式38所示。
化学式38：
Figure BDA0002416120860000292
本发明中使用的术语“氢化可的松”也被称为可的松，是指具有糖皮质激素作用的肾上腺皮质激素剂。上述氢化可的松的结构如下述化学式39所示。
化学式39：
Figure BDA0002416120860000301
本发明中使用的术语“强的松”为可的松衍生物，是指具有糖皮质激素作用的肾上腺皮质激素剂。上述强的松的结构如下述化学式40所示。
化学式40：
Figure BDA0002416120860000302
本发明中使用的术语“甲泼尼龙”是指用α甲基取代键合在强的松的6号碳位置的氢的肾上腺皮质激素剂。上述甲泼尼龙的结构如下述化学式41所示。
化学式41：
Figure BDA0002416120860000303
本发明中使用的术语“雌三醇”是指属于卵泡激素的雌激素类激素剂。上述雌三醇的结构如下述化学式42所示。
化学式42：
Figure BDA0002416120860000304
上述戊酸倍他米松的结构如下述化学式43所示。
化学式43：
Figure BDA0002416120860000311
上述二丙酸倍他米松的结构如下述化学式44所示。
化学式44：
Figure BDA0002416120860000312
上述戊酸双氟可龙的结构如下述化学式45所示。
化学式45：
Figure BDA0002416120860000313
上述17-丁酸氢化可的松的结构如下述化学式46所示。
化学式46：
Figure BDA0002416120860000314
上述糠酸莫米松的结构如下述化学式47所示。
化学式47：
Figure BDA0002416120860000321
上述醋丙甲泼尼龙的结构如下述化学式48所示。
化学式48：
Figure BDA0002416120860000322
在本发明的活性物质-六肽复合体中，在活性物质为类固醇的情况下，将与类固醇键合的六肽命名为“变异的六肽复合体”。
具体地，本发明提供具有EEMQRR(序列编号1)的氨基酸序列的六肽与类固醇键合的变异的六肽复合体。
上述类固醇可键合在六肽的N-末端、C-末端或侧链。具体地，上述类固醇可通过连接子键合在六肽的N-末端、C-末端或侧链。
上述类固醇可通过连接子键合在位于六肽的N-末端、C-末端或侧链的羧基或酰胺基。位于上述侧链的羧基可位于谷氨酸的侧链。并且，位于上述侧链的酰胺基可位于谷氨酰胺的侧链。
在上述变异的六肽复合体的一实例中，可以由下述化学式49表示。
化学式49：
Figure BDA0002416120860000331
在上述式中，Y为类固醇，R'及R"分别独立地为氢或C1-3烷基。
在通过连接子与六肽的N-末端键合的复合体的一实例中，上述类固醇可由下述化学式49-1表示。
化学式49-1：
Figure BDA0002416120860000332
Y为类固醇，L’为连接子。具体地，上述连接子可由下述化学式50表示。
化学式50：
Figure BDA0002416120860000333
此时，上述Z为C1-10亚烷基、C2-12亚烯基或C6-14亚芳基。
根据本领域使用的惯例，在本发明的结构式中，
Figure BDA0002416120860000334
用于表示与核或骨架结构有关的残基或取代基的作为附着点的键。
本发明中使用的术语“亚烷基”是指从母体(parent)烷烃的相同或不同的2个碳原子上去除2个氢原子来衍生的具有2个一价基团中心的支链或直链或环状饱和烃基。例如，亚烷基可具有1个至20个碳原子、1个至10个碳原子或者1个至6个碳原子。典型的亚烷基包括亚甲基(-CH2-)、1，1-乙基(-CH(CH3)-)、1，2-乙基(-CH2CH2-)、1，1-丙基(-CH(CH2CH3)-)、1，2-丙基(-CH2CH(CH3)-)、1，3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1，4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等，但并不限定于此。
本发明中使用的术语“亚烯基”是指从母体亚烯基的相同或不同的2个碳原子上去除2个氢原子来衍生的具有2个一价基团中心的支链或直链或环状饱和烃基。例如，亚烯基可具有1个至20个碳原子、1个至10个碳原子或者1个至6个碳原子。典型的亚烯基包括1，2-乙烯基(-CH＝CH-)，但并不限定于此。
只要是本领域的熟练的技术人员则认识，在“烷基”、“芳基”及“杂环”等残基被1个以上的取代基取代的情况下，这些选择性地指“亚烷基”、“亚芳基”、“亚杂环基”等残基(即，是指母体为烷基”、“芳基”、“杂环”残基的1个以上的氢原子被所提及的取代基取代)。在“烷基”、“芳基”及“杂环”等残基在本发明中是指“被取代，”或者在附图中示出被取代的情况下(或任选地被取代，例如取代基的数量为0至正数的情况)，“烷基”、“芳基”及“杂环”等术语应被理解为与“亚烷基”、“亚芳基”及“亚杂环基”等互换。
本发明中使用的术语“芳基”是指从母体芳香族环体系的6个碳原子上去除1个氢原子来衍生的芳香族烃基。例如，芳基可具有6个至20个碳原子、6个至14个碳原子或者6个至12个碳原子。典型的芳基包括衍生自苯(例如，苯基)、取代的苯、取代或未取代的萘、取代或未取代的蒽、取代或未取代的联苯等的基团，但并不限定于此。
具体地，上述X可以为选自由
Figure BDA0002416120860000341
Figure BDA0002416120860000342
Figure BDA0002416120860000351
组成的组中的一种。
具体地，上述连接子可以为选自由戊二酸(Glutaric acid)、丁二酸(Su ccinicacid)、马来酸(Maleic acid)、丙二酸(Malonic acid)、己二酸(Adi pic acid)、富马酸(Fumaric acid)、间苯二甲酸(Isophthalic acid)、对苯二甲酸(Terephthalic acid)及2，6-萘二甲酸(2，6-Naphthalenedicarboxylic acid)组成的组中的一种。
在本发明中使用的术语“六肽”是指具有Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg的氨基酸序列的六肽。并且，上述六肽可以为羧基在六肽的C-末端被酰胺基取代的六肽。上述六肽可以具有由序列编号1表示的氨基酸序列。
上述酰胺基可以为选自由伯酰胺基、仲酰胺基、叔酰胺基组成的组中的一种酰胺基。优选地，上述酰胺基可以为伯酰胺基。上述六肽结构的一实例如同有机酸-六肽复合体中所述。
在表2中示出键合有上述6种类固醇的六肽复合体的化学式。
表2
Figure BDA0002416120860000352
Figure BDA0002416120860000361
并且，在表3中示出通过上述8种连接子来键合倍他米松的六肽复合体的结构。
表3
Figure BDA0002416120860000362
Figure BDA0002416120860000371
Figure BDA0002416120860000381
并且，在表4中示出通过上述9种连接子来键合戊酸倍他米松的六肽复合体。
表4
1 戊酸倍他米松-glutaroyl-EEMQRR-NH<sub>2</sub>
2 戊酸倍他米松-malonoyl-EEMQRR-NH<sub>2</sub>
3 戊酸倍他米松-terephthaloyl-EEMQRR-NH<sub>2</sub>
4 戊酸倍他米松-succinoyl-EEMQRR-NH<sub>2</sub>
5 戊酸倍他米松-adipoyl-EEMQRR-NH<sub>2</sub>
6 戊酸倍他米松-2，6-naphthalenedicarboxyloyl-EEMQRR-NH<sub>2</sub>
7 戊酸倍他米松-maleoyl-EEMQRR-NH<sub>2</sub>
8 戊酸倍他米松-isophthaloyl-EEMQRR-NH<sub>2</sub>
9 戊酸倍他米松-fumaryl-EEMQRR-NH<sub>2</sub>
本发明人为了开发利用六肽的化妆品组合物，通过键合对皮肤炎或特应性皮肤疾病具有功效的类固醇和对化妆品具有生理活性功能的六肽来制备了变异的六肽复合体(图43至图48)。
并且，本发明人确认了利用上述类固醇的复合体具有抗氧化活性(表11)。进而，本发明人确认上述变异的六肽复合体对皮肤再生及伤口愈合具有优异的效果(图50及图51)。因此，可有效地用作用于皮肤再生及伤口治疗的组合物中，其包含本发明的变异的六肽复合体作为有效成分。
本发明的再一实施方式提供包含活性物质-六肽复合体作为有效成分的化妆品组合物。上述活性物质-六肽复合体可以为有机酸-六肽复合体或变异的六肽复合体。
上述化妆品组合物可具有防止皮肤老化和皮肤再生效果。
并且，上述化妆品组合物可以为化妆水、面霜、乳液、精华素、精华液及防晒剂组成的组中的一种剂型。
除了作为有机酸-肽复合体或变异的六肽复合体以外，上述化妆品组合物中所含的成分为有效成分包含通常用于化妆品组合物中的成分，例如，可包含抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料及香料等常规辅助剂或载体。
并且，还可将上述化妆品组合物制备成通常在本领域中制备的任何剂型，例如，可将其剂型化成溶液、悬浮液、乳浊液、糊剂、凝胶、面霜、乳液、粉末、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉末粉底、乳液粉底、蜡粉底及喷雾剂等，但并不限定于此。更详细地，可制备成化妆水(收敛化妆水、柔性化妆水等)、面霜、乳液、精华素、精华液、营养凝胶或按摩霜的剂型。
在上述化妆品组合物的剂型为糊剂、面霜或凝胶的情况下，作为载体成分可使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、胺黄树胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。
在上述化妆品组合物的剂型为溶液或乳浊液的情况下，作为载体成分可使用溶剂、增溶剂或乳化剂。具体地，载体成分可以为水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脱水山梨醇的脂肪酸酯。
在上述化妆品组合物的剂型为悬浮液的情况下，作为载体成分可使用液相稀释剂，如水、乙醇或丙二醇等；悬浮剂，如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯；微晶纤维素、偏羟基铝、膨润土、琼脂或胺黄树胶等。
在上述化妆品组合物的剂型为含表面活性剂的清洁剂的情况下，作为载体成分可使用脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙磺酸盐、咪唑啉鎓衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺基甜菜碱、脂肪族醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
本发明的另一实施方式提供包含活性物质-六肽复合体作为有效成分的用于治疗皮肤伤口的药学组合物。上述活性物质-六肽复合体可以为有机酸-六肽复合体或变异的六肽复合体。
上述药学组合物可包含药剂学上可接受的载体。具体地，药剂学上可接受的载体为制剂时通常所使用的，可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁及矿物油等，但并不限定于此。
除了上述成分以外，上述药学组合物还可包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。
根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易地实施的方法，将上述药学组合物通过利用药剂学上可接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而可将其制备成单位剂量形态或者装入多剂量容器来制备。此时，剂型还可以为油或在水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳化液形态或者浸膏剂、散剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂，还可包括分散剂或稳定剂。
可以将上述药学组合物稀释在软膏基质(Ointment base)中以制备成局部涂敷用软膏剂，并且每天可以将其涂敷于病变部位1次至5次，可以制备成稀释于凝胶制剂的局部涂敷用面膜剂，并且每天可以将其涂敷于病变部位1次至5次。
本发明的还有一实施方式提供用于改善皮肤状态的本发明的活性物质-六肽复合体的用途。
本发明的又一实施方式提供制备用于改善皮肤状态的化妆品组合物的本发明的活性物质-六肽复合体的用途。
本发明的又一实施方式提供用于治疗皮肤伤口的本发明的活性物质-六肽复合体的用途。
本发明的又一实施方式提供制备用于治疗皮肤伤口的药剂的本发明的活性物质-六肽复合体的用途。
本发明的又一实施方式提供皮肤状态的改善方法，包括对对象的皮肤处理本发明的活性物质-六肽复合体的步骤。改善上述皮肤状态可以是指防止皮肤的老化或者促进皮肤的再生。
本发明的又一实施方式提供皮肤伤口的治疗方法，包括对对象的皮肤处理本发明的活性物质-六肽复合体的步骤。
发明的具体实施方式
以下，通过实施例详细说明本发明。但是，下述实施例仅用于示例本发明，本发明并不限定于下述实施例。
实施例1.有机酸-六肽复合体制备
Fmoc-Glu(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH及Fmoc-Arg(Pbf)-OH原料购自上海吉尔生化(GL Biochem，Shanghai))。并且，有机酸购自梯希爱化工(TCI chemicals，TCI，印度)和美国西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich，US)(表5)。并且，二甲基甲酰胺(dimethylformamid e，DMF)、N，N-二异丙基乙胺(N，N-diisopropylethylamine，DIEA)、二氯甲烷(Dichloromethane，DCM)及哌啶(piperidine)购自大井化工(Dae jungchem)。
表5
Figure BDA0002416120860000411
Figure BDA0002416120860000421
实施例1.1.有机酸-六肽复合体合成
有机酸-六肽复合体合成工序示于下述1)至6)的工序过程。并且，合成工序条件示于下述表6。
表6
Figure BDA0002416120860000431
1)树脂溶胀(swelling)
在配有过滤膜的固相(solid-phase)合成反应器中，在合成末端以具有羧基(-COOH)的肽合成使用了2-氯三苯甲基氯树脂(2-Chlorotritylchlorid e resin，比德科技(Bead Tech))。并且，合成末端以肽键(-CONH2)结束的肽合成使用了连接酰胺树脂(Rinkamide resin，吉尔生化(GLS))。使用二氯甲烷及二甲基甲酰胺将树脂溶胀30分钟。
2)氨基酸加载(loading)
使用2-氯三苯甲基氯树脂的合成包括将第一氨基酸加载到树脂的过程。在减压下通过过滤膜从溶胀的树脂中除去了溶剂。将2当量的Fmoc-Arg(P bf)-OH完全溶解于二甲基甲酰胺后添加到2-氯三苯甲基氯树脂，并将考虑密度的N，N-二异丙基乙胺按照相当于4当量的2-氯三苯甲基氯树脂的量添加到该树脂中。随后利用反应器在25℃至32℃的温度下反应5小时以上。
3)树脂Fmoc脱保护
使用上述2-氯三苯甲基氯树脂或连接(Rink)酰胺树脂的合成过程包括进行Fmoc的脱保护反应的过程。树脂Fmoc脱保护过程如下，即，在减压下通过过滤膜去除溶剂后，使用添加20％(v/v)的哌啶的二甲基甲酰胺清洗5分钟。随后，再使用添加20％(v/v)哌啶的二甲基甲酰胺清洗10分钟。在减压下过滤去除反应液并使用二氯甲烷或二甲基甲酰胺清洗6次以上，每次2分钟。
4)氨基酸合成及有机酸键合
在上述连接酰胺树脂中，将3当量至5当量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(吉尔生化)完全溶解于二甲基甲酰胺后，加入到去除溶剂的连接酰胺树脂中。根据氨基酸当量及连接酰胺树脂的量加入适量的2M的1-羟基苯并三唑/二异丙基碳二亚胺(Hydroxybenzotriazole/diisopropylcarbodiimide，HOBt/DIC)作为偶联剂(coupling reagent)。随后，利用反应器在25℃至32℃的温度下合成5小时以上。反应结束后将溶剂排空，然后用干净的二甲基甲酰胺清洗6次，每次2分钟。
清洗后，以与上述氨基酸键合方法相同的方法依次偶联Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH及Fmoc-Glu(tBu)-OH的氨基酸。随后，根据氨基酸当量及树脂的量，将4当量的阿魏酸、2M的1-羟基苯并三唑/二异丙基碳二亚胺加入到合成六肽的状态的树脂中。随后利用反应器在25℃至32℃的温度下反应5小时以上。
5)分离(Cleavage)
反应结束后在减压下通过过滤膜去除溶剂后，用干净的二甲基甲酰胺清洗2次，每次2分钟，用二氯甲烷清洗2次，每次2分钟。随后，几乎将溶剂排空去除。将干燥的阿魏酸-EEMQRR-NH2复合体树脂使用70％(v/v)的三氟乙酸/29％(v/v)的二氯甲烷/1％(v/v)的H2O溶液分离4小时。
6)重结晶(Crystallize)
将分离完成的溶剂使用乙醚(Ethyl ether)重结晶粗(Crude)产品来萃取。
并且，甲酸-EEMQRR-NH2、葡萄糖醛酸-EEMQRR-NH2、乳酸-EEMQRR-NH2、甲羟戊酸-EEMQRR-NH2、丙酸-EEMQRR-NH2、丙酮酸-EEMQRR-NH2、奎尼酸-EEMQRR-NH2、莽草酸-EEMQRR-NH2、松香酸-EEMQRR-NH2、积雪草酸-EEMQRR-NH2、胆酸-EEMQRR-NH2、熊去氧胆酸-EEMQRR-NH2、乌索酸-EEMQRR-NH2、壬二酸-EEMQRR-NH2、吡啶二羧酸-EEMQRR-NH2、富马酸-EEMQRR-NH2、衣康酸-EEMQRR-NH2、苹果酸-EEMQRR-NH2、草酸-EEMQRR-NH2、丁二酸-EEMQRR-NH2、酒石酸-EEMQRR-NH2、α-酮戊二酸-EEMQRR-NH2、柠檬酸-EEMQRR-NH2、硫辛酸-EEMQRR-NH2、香叶酸-EEMQRR-NH2、山梨酸-EEMQRR-NH2、生物素-EEMQRR-NH2、维A酸-EEMQRR-NH2、咖啡酸-EEMQRR-NH2、肉桂酸-EEMQRR-NH2、迷迭香酸-EEMQRR-NH2、烟酸-EEMQRR-NH2及丁香酸-EEMQRR-NH2复合体也以与上述阿魏酸-EEMQRR-NH2复合体合成工序相同的方法来合成。
实施例1.2.有机酸-六肽复合体纯化
将实施例1.1.中合成的阿魏酸-EEMQRR-NH2复合体粗产品溶解于添加10％(v/v)的乙腈的蒸馏水中。随后，在如下所示的梯度(gradient)条件下用高效液相色谱(HPLC)纯化后，通过冷冻干燥来获得阿魏酸-EEMQRR-NH2复合体(图1至图34)。上述梯度示于下述表7中。
A.设备：Shimadzu 8A(5cm*25cm)/8A(prep(dia 5cm))
B.溶剂的组成：缓冲液A＝0.05％的三氟乙酸/乙腈，缓冲液B＝0.05％的三氟乙酸/H2O
C.流速(Flow rate)：14ml/分钟
D.柱：硅胶C18反相(Silicagel C18 reverse phase)
E.吸光度：230nm
E.梯度
表7
时间(分钟) H<sub>2</sub>O(％) 乙腈(Acetonitrile)(％)
0-12 89→77 11→23
12-13 77→5 23→95
13-18 5→5 95→95
18-19 5→89 95→11
19-27 89→89 11→11
并且，甲酸-EEMQRR-NH2、葡萄糖醛酸-EEMQRR-NH2、乳酸-EEMQRR-NH2、甲羟戊酸-EEMQRR-NH2、丙酸-EEMQRR-NH2、丙酮酸-EEMQRR-NH2、奎尼酸-EEMQRR-NH2、莽草酸-EEMQRR-NH2、松香酸-EEMQRR-NH2、积雪草酸-EEMQRR-NH2、胆酸-EEMQRR-NH2、熊去氧胆酸-EEMQRR-NH2、乌索酸-EEMQRR-NH2、壬二酸-EEMQRR-NH2、吡啶二羧酸-EEMQRR-NH2、富马酸-EEMQRR-NH2、衣康酸-EEMQRR-NH2、苹果酸-EEMQRR-NH2、草酸-EEMQRR-NH2、丁二酸-EEMQRR-NH2、酒石酸-EEMQRR-NH2、α-酮戊二酸-EEMQRR-NH2、柠檬酸-EEMQRR-NH2、硫辛酸-EEMQRR-NH2、香叶酸-EEMQRR-NH2、山梨酸-EEMQRR-NH2、生物素-EEMQRR-NH2、维A酸-EEMQRR-NH2、咖啡酸-EEMQRR-NH2、肉桂酸-EEMQRR-NH2、迷迭香酸-EEMQRR-NH2、烟酸-EEMQRR-NH2及丁香酸-EEMQRR-NH2复合体也通过以与上述阿魏酸-EEMQRR-NH2纯化工序相同的方法来纯化。
实验例1.六肽的N-末端、C-末端或侧链位置的有机酸键合确认
为了确认六肽的N-末端、C-末端或侧链位置的有机酸能否进行键合，合成了香叶酸-EEMQRR-NH2、COOH-EEMQRR-香叶酸及COOH-EE(香叶酸)MQRR-NH2复合体。
上述香叶酸-EEMQRR-NH2、COOH-EEMQRR-香叶酸及COOH-EE(香叶酸)MQRR-NH2复合体的合成方法示于图35至图37中。香叶酸-EEMQRR-NH2复合体以与实施例1.相同的方法合成(图35)。
上述COOH-EEMQRR-香叶酸复合体通过下述过程来合成。首先，将三苯甲基树脂(trityl resin)加入反应器，使用二氯甲烷/二甲基甲酰胺清洗2次后，使用二氯甲烷在反应器中将树脂溶胀30分钟。随后，向树脂中加入2eq的精氨酸(Arg，R)氨基酸及1eq的N，N-二异丙基乙胺并加载4小时。加载后，使用二甲基甲酰胺清洗5次。以与加载上述精氨酸的方法相同的方法，以精氨酸、谷氨酰胺(Gln，Q)、蛋氨酸(Met，M)、谷氨酸(Glu，E)、谷氨酸顺序加载剩余5个氨基酸。重复此过程来合成COOH-EEMQRR后，使用5％的三氟乙酸/二氯甲烷从树脂去除COOH-EEMQRR。随后，使用1-羟基苯并三唑、二异丙基碳二亚胺将香叶酸键合在COOH-EEMQRR的N末端(图36)。
将反应完成的COOH-EEMQRR-香叶酸用二甲基甲酰胺清洗3次至4次，用二氯甲烷清洗3次至4次，并利用泵来干燥。干燥过程结束后，使用70％的三氟乙酸以与实施例1.1的(5)分离过程相同的方式进行了4小时的分离过程。
以与实施例1.1的(6)重结晶过程相同的方式，取出在反应器中结束分离过程的溶液(cleavage solution)来移到管中进行空气干燥，使用乙醚以固态回收溶解在溶液中的COOH-EEMQRR-香叶酸。高效液相色谱分析后纯化回收的COOH-EEMQRR-香叶酸。
上述COOH-EE(香叶酸)MQRR-NH2以与上述实验例1.相同的方法合成，对于EEMQRR-NH2，合成肽后，去除谷氨酰胺的保护基(Protecting gr oup)后，添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HoAt)来键合乙二醇连接子，并用二甲基甲酰胺清洗3次后使用1-羟基苯并三唑(HOBt)、二异丙基碳二亚胺(DIC)来键合香叶酸(图37)。随后，以与实施例1.1的(5)分离及(6)重结晶过程相同的方式进行分离及重结晶过程。高效液相色谱分析后纯化回收的COOH-EE(香叶酸)MQRR-NH2。
实验例2.有机酸-六肽复合体的抗氧化效果确认
使用作为稳定的自由基的1，1-二苯基-2-甲基肼基(1，1-Diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH，西格玛D9132-1G)，并利用分光光度计(spectrophoto meter)测量自由基减少程度，从而间接测量样品的抗氧化活性。具体地，向0.4ml的乙醇中分别添加0.5ml的0.1mM的1，1-二苯基-2-甲基肼基溶液及0.1ml的各种浓度的上述实施例1.中合成的有机酸-六肽复合体(试样)，剧烈涡旋10秒钟后，在阴凉处反应30分钟。
随后，利用分光光度计酶联免疫吸附法(ELISA)在517nm的波长处测定吸光度。作为阳性对照组使用了维生素C(Ascorbic acid)。
数学式1：
1，1-二苯基-2-甲基肼基自由基清除能力(％)＝{1-试样的吸光度/空白(Blank)的吸光度)×100}
1，1-二苯基-2-甲基肼基在乙醇中具有固有的紫色，当被抗氧化物质还原时，会失去固有的紫色并变为黄色。可通过分光光度分析测定1，1-二苯基-2-甲基肼基在517nm的波长处的自由基。
其结果确认，在按浓度处理六肽复合体的情况下，1，1-二苯基-2-甲基肼基的自由基清除能力以浓度依赖性地增加抗氧化活性。并且，与抗氧化作用优异的维生素C相比，迷迭香酸-EEMQRR-NH2及咖啡酸-EEMQRR-NH2具有与维生素C类似的1，1-二苯基-2-甲基肼基自由基清除能力(表8)。
表8
Figure BDA0002416120860000481
Figure BDA0002416120860000491
上述表8的SC50是指去除50％的自由基时的试样浓度。此外，确认有机酸-六肽复合体也具有1，1-二苯基-2-甲基肼基自由基清除能力，因此可将上述34种有机酸-六肽复合体用作抗氧化化妆品组合物。
实验例3.有机酸-六肽复合体的皮肤再生效果确认
通过伤口愈合实验(Wound healing assay)，并通过基于有机酸-六肽复合体是否促进细胞增殖及迁移来评估皮肤再生效果。使用人角质形成细胞株HaCaT(人永生化角质形成细胞)(human keratinocyte，美国Addex生物，目录号：T0020001(AddexBio，US，CatalogNo：T0020001))，用于细胞培养的DMEM(培养的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle's Medium))、抗菌-抗真菌剂(Antibiotic-Antimycotic)购自GIBCO，胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)购自开普尼克(Capricorn)。
将HaCaT细胞在100mm/60.1cm2的培养皿中具有10％的胎牛血清、1％的抗菌-抗真菌剂的DMEM中，在37℃、5％的CO2及100％的湿润条件下的培养器中培养。当HaCaT细胞的细胞饱和度为90％左右时，从100mm/60.1cm2的培养皿以1.5×105细胞/12孔板的条件进行接种并在37℃、5％的C O2及100％的湿润条件下的培养器中培养48小时。
随后，用不含胎牛血清的DMEM替换后，每个孔用200μl吸头刮擦。作为实验组使用实施例1.中制备的有机酸-六肽复合体，并以100ng/ml的浓度处理。作为阳性对照组使用人表皮生长因子(hEGF，美国西格玛奥德里奇)，并以0.5ng/ml的浓度处理。作为阴性对照组使用了1×磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
处理实验组或对照组后，立即在显微镜下拍摄细胞照片并在37℃、5％的CO2的条件下进行培养。进一步培养20小时后，利用显微镜拍摄细胞照片并利用使用Image J程序计算细胞再生的程度。通过统计产品与服务解决方案(SPSS)统计分析程序进行统计分析，并通过SigmaPlot程序提供曲线图。统计学显著性是当P值(value)为0.05以下时评估具有显著性。
数学式2：
伤口愈合面积(Wound healing area)(％)＝{(A-B)/A}×100
A＝实验组或对照组处理之后0小时时间段，伤口面积
B＝实验组或对照组处理之后20小时时间段，伤口面积
其结果，与阴性对照组(磷酸缓冲盐溶液)相比，所有34种有机酸-六肽复合体的愈合面积均增加。其中，与阴性对照组相比，阿魏酸-EEMQRR-NH2的愈合面积(healing area)分别增加约2倍以上。而且，比较强效阿魏酸-EEMQRR-NH2和迷迭香酸-EEMQRR-NH2与各个乙酰-EEMQRR-NH2(乙酰六肽-8)、EEMQRR-NH2(六肽)及有机酸的伤口愈合面积，与处理各个物质(有机酸、六肽)时相比，处理有机酸-六肽复合体时愈合面积增加(图38a至图38c)。
并且，通过基于实验例1.中制备的香叶酸-EEMQRR-NH2、COOH-EEMQRR-香叶酸及COOH-EE(香叶酸)MQRR-NH2复合体是否促进细胞增殖及迁移来评估皮肤再生效果。实验方法以与上述方法相同的方式进行。
其结果，与阴性对照组相比，所有香叶酸-EEMQRR-NH2、COOH-EEMQRR-香叶酸及COOH-EE(香叶酸)MQRR-NH2复合体的愈合面积分别增加约2倍以上。由此有机酸-六肽复合体通过促进细胞的增殖和迁移而有效地增加了愈合面积，因此，还具有皮肤再生功效，从而确认可用作化妆品组合物(图39)。
实验例4.有机酸-六肽复合体的细胞毒性确认
为了确认香叶酸-EEMQRR-NH2、COOH-EEMQRR-香叶酸及COOH-EE(香叶酸)MQRR-NH2复合体的细胞毒性，进行了WST-1分析
具体地，将充分生长的细胞以2×104细胞/孔的浓度移到96孔板中进行培养。培养24小时，以使细胞均附着到板底部，几个孔中仅加入培养基而没有细胞。使用DMEM制备样品，使最终体积为100μl。将WST-1试剂每孔分注10μl，分注后在37℃的温度下培养4小时。随后，利用酶标仪(ELISA reader)在450nm的波长下测定吸光度。
其结果确认，如图40所示，在香叶酸-EEMQRR-NH2、COOH-EEMQRR-香叶酸及COOH-EE(香叶酸)MQRR-NH2复合体中均未出现细胞毒性。
实施例2.变异的六肽复合体制备
Fmoc-Glu(tbu)-OH、Fmoc-Met-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH及Fmoc-Arg(Pbf)-OH原料购自吉尔生化(GL Biochem，GLS)(上海)。并且，倍他米松、戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、糠酸莫米松、地塞米松、氢化可的松、17-丁酸氢化可的松、强的松、甲泼尼龙及雌三醇购自美国西格玛奥德里奇。并且，戊二酸酐购自梯希爱化工。并且，戊酸双氟可龙及醋丙甲泼尼龙购自河南天府化工(Henan Tianfu Chemical)。并且，二甲基甲酰胺、N，N-二异丙基乙胺、二氯甲烷及哌啶购自大井化工。
实施例2.1.变异的六肽复合体合成
变异的六肽复合体合成工序以由下述1)至8)的工序构成示出。并且，合成工序条件示于下述表9中。
表9
Figure BDA0002416120860000521
1)树脂溶胀(swelling)
在配有过滤膜的固相合成反应器中，在合成末端以具有羧基(-COOH)的肽合成使用了2-氯三苯甲基氯树脂(比德科技)。并且，合成末端以肽键(-CONH2)结束的肽合成使用了连接酰胺树脂(吉尔生化)。使用二氯甲烷及二甲基甲酰胺将树脂溶胀30分钟。
2)氨基酸加载(loading)
使用2-氯三苯甲基氯树脂的合成包括将第一氨基酸加载到树脂的过程。在减压下通过过滤膜从溶胀的树脂中除去溶剂。将2当量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH完全溶解于二甲基甲酰胺后添加到2-氯三苯甲基氯树脂，并将考虑到密度的N，N-二异丙基乙胺按照相当于4当量的2-氯三苯甲基氯树脂的量添加到上述树脂中。随后利用反应器在25℃至32℃的温度下反应5小时以上。
3)树脂Fmoc脱保护
使用上述2-氯三苯甲基氯树脂或连接酰胺树脂的合成过程包括进行Fmoc的脱保护反应的过程。树脂Fmoc脱保护过程如下，即，在减压下通过过滤膜去除溶剂后，使用添加20％(v/v)的哌啶的二甲基甲酰胺清洗5分钟。随后，再使用添加20％(v/v)哌啶的二甲基甲酰胺清洗10分钟。在减压下过滤去除反应液并使用二氯甲烷或二甲基甲酰胺清洗6次以上，每次2分钟。
4)氨基酸合成
在上述连接酰胺树脂中，将3当量至5当量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH(吉尔生化)完全溶解于二甲基甲酰胺后，加入到去除溶剂的连接酰胺树脂中。根据氨基酸当量及连接酰胺树脂的量加入2M的1-羟基苯并三唑/二异丙基碳二亚胺作为偶联剂。随后，利用反应器在25℃至32℃的温度下合成5小时以上。反应结束后将溶剂排空，然后用干净的二甲基甲酰胺清洗6次，每次2分钟。
清洗后，以与上述氨基酸键合方法相同的方法依次偶联Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(tBu)-OH及Fmoc-Glu(tBu)-OH的氨基酸。
5)连接子键合
5-1)使用N，N-二异丙基乙胺的连接子键合
对上述六肽合成的状态的树脂进行Fmoc脱保护，根据戊二酸酐当量及连接酰胺树脂的量，向清洗的树脂中加入2M浓度的N，N-二异丙基乙胺及3当量的戊二酸酐作为连接子。随后，利用反应器在25℃至32℃的温度下合成5小时以上。反应结束后将溶剂排空，然后用干净的二甲基甲酰胺清洗6次，每次2分钟。
使用丁二酸或马来酸酐(Maleic anhydride)代替上述戊二酸酐，键合丁二酸连接子或马来酸连接子。
5-2)使用1-羟基苯并三唑/二异丙基碳二亚胺的连接子键合
并且，对上述六肽合成的状态的树脂进行Fmoc脱保护，根据丙二酸当量及连接酰胺树脂的量，向清洗的树脂中加入2M浓度的1-羟基苯并三唑/二异丙基碳二亚胺及3当量的丙二酸作为连接子。随后利用反应器在25℃至32℃的温度下合成5小时以上。反应结束后将溶剂排空，然后用干净的二甲基甲酰胺清洗6次，每次2分钟。
使用己二酸、富马酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸或2，6-萘二甲酸代替上述丙二酸，键合己二酸连接子、富马酸连接子、间苯二甲酸连接子、对苯二甲酸连接子或2，6-萘二甲酸连接子。
6)类固醇键合
随后，根据氨基酸当量及树脂的量，向连接子键合的状态的六肽树脂中加入3当量的倍他米松、4-二甲氨基吡啶(DMAP)/2M的二异丙基碳二亚胺。随后利用反应器在25℃至32℃的温度下反应5小时以上。
7)分离
反应结束后在减压下通过过滤膜去除溶剂后，用干净的二甲基甲酰胺清洗2次，每次2分钟，用二氯甲烷清洗2次，每次2分钟。随后，几乎将溶剂排空去除。将干燥的变异的六肽复合体树脂使用70％(v/v)的三氟乙酸/29％(v/v)的二氯甲烷/1％(v/v)的H2O溶液分离4小时(图41及图42)。
8)重结晶
将分离完成的溶剂使用乙醚来重结晶粗产品，并萃取倍他米松-EEMQRR-NH2。
以与上述倍他米松-EEMQRR-NH2合成方法相同的方法合成地塞米松-EEMQRR-NH2、氢化可的松-EEMQRR-NH2、强的松-EEMQRR-NH2、甲泼尼龙-EEMQRR-NH2及雌三醇-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-EEMQRR-NH2、二丙酸倍他米松-EEMQRR-NH2、戊酸双氟可龙-Glutaroyl-EEMQRR-NH2、17-丁酸氢化可的松-EEMQRR-NH2、糠酸莫米松-EEMQRR-NH2、醋丙甲泼尼龙-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Glutaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Succinic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Maleic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Malonic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Adipic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Fumaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Isophthalic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Terephthalic-EEMQRR-NH2及戊酸倍他米松-2，6-Naphthalenedicar boxylic-EEMQRR-NH2。
实施例2.2.变异的六肽复合体纯化
将实施例2.1.中合成的倍他米松-EEMQRR-NH2复合体粗产品溶解于添加10％(v/v)的乙腈的蒸馏水中。随后，在下述梯度条件下用高效液相色谱，纯化后，通过冷冻干燥来获得倍他米松-EEMQRR-NH2复合体(图43至图48)。上述梯度示于下述表10中。
A.设备：Shimadzu 8A(5cm*25cm)/8A(prep(dia 5cm))
B.溶剂的组成：缓冲液A＝0.05％的三氟乙酸/乙腈，缓冲液B＝0.05％的三氟乙酸/H2O
C.流速(Flow rate)：14ml/分钟
D.柱：硅胶C18反相
E.吸光度：230nm
E.梯度
表10
时间(分钟) H<sub>2</sub>O(％) 乙腈(％)
0-12 80→65 20→35
12-13 65→5 35→95
13-18 5→5 95→95
18-19 5→80 95→20
19-27 80→80 20→20
并且，地塞米松-EEMQRR-NH2、氢化可的松-EEMQRR-NH2、强的松-EEMQRR-NH2、甲泼尼龙-EEMQRR-NH2及雌三醇-EEMQRR-NH2复合体、戊酸倍他米松-EEMQRR-NH2、二丙酸倍他米松-EEMQRR-NH2、戊酸双氟可龙-Glutaroyl-EEMQRR-NH2、17-丁酸氢化可的松-EEMQRR-NH2、糠酸莫米松-EEMQRR-NH2、醋丙甲泼尼龙-EEMQRR-NH2复合体、戊酸倍他米松-Glutaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Succinic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Maleic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Malonic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Adipic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Fumaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Isophthalic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Terephthalic-EEMQRR-NH2及戊酸倍他米松-2，6-Naphthalenedicarboxylic-EEMQRR-NH2复合体也通过以与上述倍他米松-EEMQRR-NH2复合体纯化工序相同的方法来纯化。
实验例4.变异的六肽复合体的抗氧化效果确认
使用作为稳定的自由基的1，1-二苯基-2-甲基肼基(西格玛D9132-1G)测量自由基减少程度，并利用分光光度计从而间接测量样品的抗氧化活性。具体地，向0.4ml的乙醇中分别添加0.5ml的0.1mM的1，1-二苯基-2-甲基肼基溶液及0.1ml的各种浓度的上述实施例2.中合成的变异的六肽复合体(试样)，剧烈涡旋10秒钟后，在阴凉处反应30分钟。
随后，利用分光光度计酶联免疫吸附法在517nm的波长处测定吸光度。作为阳性对照组使用了维生素C。
数学式1：
1，1-二苯基-2-甲基肼基自由基清除能力(％)＝{1-试样的吸光度/空白的吸光度)×100}
1，1-二苯基-2-甲基肼基在乙醇中具有固有的紫色，当被抗氧化物质还原时，会失去固有的紫色并变为黄色。可通过分光光度分析测定1，1-二苯基-2-甲基肼基在517nm的波长处的自由基。
其结果，在按浓度处理变异的六肽复合体的情况下，1，1-二苯基-2-甲基肼基的自由基清除能力以浓度依赖性地增加抗氧化活性(表11)。
表11
Figure BDA0002416120860000561
上述表11为示出变异的六肽复合体的1，1-二苯基-2-甲基肼基自由基清除能力的表。SC50是指去除50％的自由基时的试样浓度。此外，变异的六肽复合体也具有1，1-二苯基-2-甲基肼基自由基清除能力，因此可将6种变异的六肽复合体用作抗氧化化妆品组合物。
实验例5.变异的六肽复合体的皮肤再生效果确认
通过伤口愈合实验，并通过基于变异的六肽复合体是否促进细胞增殖及迁移来评估皮肤再生效果。使用人角质形成细胞株HaCaT(美国Addex生物，目录号：T0020001)，用于细胞培养的DMEM、抗菌-抗真菌剂购自GIBCO，胎牛血清购自开普尼克。
将HaCaT细胞在100mm/60.1cm2的培养皿中具有10％的胎牛血清、1％的抗菌-抗真菌剂的DMEM中，在37℃、5％的CO2及100％的湿润条件下的培养器中培养。当HaCaT细胞的细胞饱和度为90％左右时，从100mm/60.1cm2的培养皿以1.5×105细胞/12孔板的条件进行接种并在37℃、5％的CO2及100％的湿润条件下的培养器中培养48小时。
随后，用不含胎牛血清的DMEM替换后，每个孔用200μl吸头刮擦。作为实验组使用实施例2.中制备的变异的六肽复合体，并以100ng/ml的浓度处理。作为阳性对照组使用人表皮生长因子(美国西格玛奥德里奇)，并以0.5ng/ml的浓度处理。作为阴性对照组使用了1×磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
处理实验组或对照组后，立即在显微镜下拍摄细胞照片并在37℃、5％的CO2的条件下进行培养进一步培养20小时后，利用显微镜拍摄细胞照片并利用使用Image J程序计算细胞再生的程度。通过统计产品与服务解决方案(SPSS)统计分析程序进行统计分析，并通过SigmaPlot程序提供曲线图。统计学显著性是当P值(value)为0.05以下时评估具有显著性。
数学式2：
伤口愈合面积(Wound healing area)(％)＝{(A-B)/A}×100
A＝实实验组或对照组处理之后0小时时间段，伤口面积
B＝实验组或对照组处理之后20小时时间段，伤口面积
其结果，与阴性对照组(磷酸缓冲盐溶液)相比，在所有6种变异的六肽复合体的愈合面积均增加(图49)。
并且，通过基于实施例2.中合成的戊酸倍他米松-EEMQRR-NH2、二丙酸倍他米松-EEMQRR-NH2、戊酸双氟可龙-Glutaroyl-EEMQRR-NH2、17-丁酸氢化可的松-EEMQRR-NH2、糠酸莫米松-EEMQRR-NH2及醋丙甲泼尼龙-EEMQRR-NH2复合体是否促进细胞增殖及迁移来评估皮肤再生效果。实验方法以与上述方法相同的方式进行。
其结果，与阴性对照相比，所有戊酸倍他米松-EEMQRR-NH2、二丙酸倍他米松-EEMQRR-NH2、戊酸双氟可龙-Glutaroyl-EEMQRR-NH2、17-丁酸氢化可的松-EEMQRR-NH2、糠酸莫米松-EEMQRR-NH2及醋丙甲泼尼龙-EEMQRR-NH2复合体的愈合面积分别增加约2倍以上(图50)。
进而，通过基于使用实施例2.中制备的9种连接子键合类固醇的戊酸倍他米松-Glutaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Succinic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Maleic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Malonic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Adipic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Fumaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Isophthalic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Terephthalic-EEMQRR-NH2及戊酸倍他米松-2，6-Naphthalenedicarboxylic-EEMQRR-NH2复合体是否促进细胞增殖及迁移来评估皮肤再生效果。实验方法以与上述方法相同的方式进行。
其结果，与阳性对照组相比，所有戊酸倍他米松-Glutaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Succinic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Maleic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Malonic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Adipic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Fumaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Isophthalic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Terephthalic-EEMQRR-NH2及戊酸倍他米松-2，6-Naphthalenedicarboxylic-EEMQRR-NH2复合体的愈合面积分别增加约2倍以上。由此，变异的六肽复合体通过促进细胞的增殖和迁移而有效地增加了愈合面积，还具有皮肤再生功效，从而确认可用作化妆品组合物(图51)。
实验例6.变异的六肽复合体的细胞毒性确认
为了确认戊酸倍他米松-EEMQRR-NH2、二丙酸倍他米松-EEMQRR-NH2、戊酸双氟可龙-Glutaroyl-EEMQRR-NH2、17-丁酸氢化可的松-EEMQRR-NH2、糠酸莫米松-EEMQRR-NH2、醋丙甲泼尼龙-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Glutaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Succinic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Maleic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Malonic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Adipic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Fumaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Isophthalic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Terephthalic-EEMQRR-NH2及戊酸倍他米松-2，6-Naphthalenedicarboxylic-EEMQRR-NH2复合体的细胞毒性，进行了WST-1分析。
具体地，将充分生长的细胞以2×104细胞/孔的浓度移到96孔板中进行培养。培养24小时，以使细胞均附着到板底部，几个孔中仅加入培养基而没有细胞。使用DMEM制备样品，使最终体积为100μl。将WST-1试剂每孔分注10μl，分注后在37℃的温度下培养4小时。随后，利用酶标仪在450nm的波长下测定吸光度。
其结果确认，如图52及图53所示，在戊酸倍他米松-EEMQRR-NH2、二丙酸倍他米松-EEMQRR-NH2、戊酸双氟可龙-Glutaroyl-EEMQRR-NH2、17-丁酸氢化可的松-EEMQRR-NH2、糠酸莫米松-EEMQRR-NH2、醋丙甲泼尼龙-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Glutaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Succinic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Maleic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松--Malonic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Adipic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Fumaric-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-Isophthalic-EEMQRR-NH2、戊酸倍他米松-对苯二甲酸-EEMQRR-NH2及戊酸倍他米松-2，6-Naphthalenedicarboxylic-EEMQRR-NH2复合体中均未出现细胞毒性。
序列表
<110> 安尼根有限公司
<120> 活性物质-六肽复合体及包含其的化妆品组合物
<130> P20110521WP
<150> KR 2017/0119516
<151> 2017-09-18
<150> KR 2017/0119529
<151> 2017-09-18
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 六肽的氨基酸序列
<400> 1
Glu Glu Met Gln Arg Arg
1 5

Claims (27)

1.一种活性物质-六肽复合体，其特征在于，由具有序列编号1的EE MQRR氨基酸序列的六肽与活性物质键合而成。
2.根据权利要求1所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述活性物质为有机酸或类固醇。
3.根据权利要求2所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述有机酸为选自由一元酸、二元酸、三元酸、脂肪酸、肉桂酸及芳香酸组成的组中的一种。
4.根据权利要求3所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述一元酸为选自由甲酸、葡萄糖醛酸、乳酸、甲羟戊酸、丙酸、丙酮酸、奎尼酸、莽草酸、松香酸、积雪草酸、胆酸、熊去氧胆酸及乌索酸组成的组中的一种。
5.根据权利要求3所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述二元酸为选自由壬二酸、吡啶二羧酸、富马酸、衣康酸、苹果酸、草酸、丁二酸、酒石酸及α-酮戊二酸组成的组中的一种。
6.根据权利要求3所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述三元酸为柠檬酸。
7.根据权利要求3所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述脂肪酸为选自由硫辛酸、香叶酸、山梨酸、生物素及维A酸组成的组中的一种。
8.根据权利要求3所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述肉桂酸为选自由咖啡酸、肉桂酸、阿魏酸及迷迭香酸组成的组中的一种。
9.根据权利要求3所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述芳香酸为选自由烟酸及丁香酸组成的组中的一种。
10.根据权利要求2所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述类固醇为选自由倍他米松、地塞米松、氢化可的松、强的松、甲泼尼龙、雌三醇、戊酸倍他米松、二丙酸倍他米松、糠酸莫米松、17-丁酸氢化可的松、戊酸双氟可龙及醋丙甲泼尼龙组成的组中的一种。
11.根据权利要求2所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述类固醇通过连接子来进行键合。
12.根据权利要求11所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述连接子由下述化学式50表示：
Figure FDA0002416120850000026
化学式50：
上述Z为C1-10亚烷基，C2-12亚烯基或C6-14亚芳基。
13.根据权利要求12所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述Z为选自由
Figure FDA0002416120850000022
Figure FDA0002416120850000023
Figure FDA0002416120850000024
及
Figure FDA0002416120850000025
组成的组中的一种。
14.根据权利要求11所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述连接子为选自由戊二酸、丁二酸、马来酸、丙二酸、己二酸、富马酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸及2，6-萘二甲酸组成的组中的一种。
15.根据权利要求1所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述活性物质与六肽的N-末端具有肽键。
16.根据权利要求1所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，羧基在上述六肽的C-末端被酰胺基取代。
17.根据权利要求16所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述酰胺基为选自由伯酰胺基、仲酰胺基及叔酰胺基组成的组中的一种。
18.根据权利要求16所述的活性物质-六肽复合体，其特征在于，上述酰胺基为伯酰胺基。
19.一种化妆品组合物，其特征在于，包含权利要求1至18中任一项所述的活性物质-六肽复合体作为有效成分。
20.根据权利要求19所述的化妆品组合物，其特征在于，上述化妆品组合物为选自由化妆水、面霜、乳液、精华素、精华液组成的组中一种剂型。
21.一种用于治疗皮肤伤口的药学组合物，其特征在于，包含权利要求1至18中任一项所述的活性物质-六肽复合体作为有效成分。
22.一种用于改善皮肤状态的权利要求1的活性物质-六肽复合体的用途。
23.一种制备用于改善皮肤状态的化妆品组合物的权利要求1的活性物质-六肽复合体的用途。
24.一种用于治疗皮肤伤口的权利要求1的活性物质-六肽复合体的用途。
25.一种用于制备皮肤伤口用药学组合物的权利要求1的活性物质-六肽复合体的用途。
26.一种皮肤状态的改善方法，其特征在于，包括对对象的皮肤处理权利要求1的活性物质-六肽复合体的步骤。
27.一种皮肤伤口的治疗方法，其特征在于，包括对对象的皮肤处理利要求1的活性物质-六肽复合体的步骤。
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