CN111272999A - 抗原偶联磁微粒及其制备方法、抗U1-snRNP抗体的检测方法和试剂盒 - Google Patents

抗原偶联磁微粒及其制备方法、抗U1-snRNP抗体的检测方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗原偶联磁微粒及其制备方法、抗U1‑snRNP抗体的检测方法和试剂盒，涉及生物技术领域。该抗原偶联磁微粒用于检测抗U1‑snRNP抗体，抗原偶联磁微粒中磁微粒偶联的抗原包括U1‑70K抗原、U1‑A抗原和U1‑C抗原；U1‑70K抗原、U1‑A抗原和U1‑C抗原的质量比为(2～10)：(2～10)：(2～10)。该抗原偶联磁微粒和抗U1‑snRNP抗体的反应性好，对抗U1‑snRNP抗体的检出率高，检测精度高。

Description

抗原偶联磁微粒及其制备方法、抗U1-snRNP抗体的检测方法 和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种抗原偶联磁微粒及其制备方法、抗U1-snRNP抗体的检测方法和试剂盒。
背景技术
抗U1小核核糖核蛋白抗体(抗U1-snRNP抗体)是混合性结缔组织病(MCTD)的高特异性抗体，阳性率接近100％，并与MCTD的疾病活动度相关。另外，抗U1-snRNP抗体还可见于2～14％的系统性硬化症(SS)患者、25～47％的红斑狼疮(SLE)患者、17％的多肌炎(PM)患者和7％的皮肌炎(DM)患者。临床上，抗U1-snRNP抗体阳性患者常伴随着雷诺现象、间质性肺病(ILD)、糜烂性关节病等。因此，抗U1-snRNP抗体准确检测对自免疫疾病的诊断与治疗具有重要意义。
U1-snRNP由一种核糖核酸(U1-RNA)、七种史密斯(Sm)蛋白和三种U1独有的蛋白(U1-70K，U1-A和U1-C)组成，其中U1-70K、U1-A和U1-C是抗U1-snRNP抗体的靶抗原。U1-70K是一个含有437个氨基酸残基蛋白，N端包含约97个氨基酸残基，高度保守但呈无规则状(2-60号氨基酸残基)，对U1-C在U1-snRNP上的结合起到重要作用；在第100-180号氨基酸残基之间存在一个高度保守的RNA结合区，类似的结合域也存在于U1-A上；C端包含丝氨酸/精氨酸(SR)重复序列，并且丝氨酸残基存在广泛的磷酸化，不同的磷酸化导致整个蛋白的分子量和电荷的不同，从而使U1-70K表现出众多亚型。
U1-A由282个氨基酸组成，包含两个RNA结合域和一个介入式的脯氨酸富集区域。U1-C含有159个氨基酸残基，N端存在非典型性锌指结构，该结构直接和SM蛋白结合，并对U1-RNA在U1-snRNP上的结合起到重要作用；C端富含甲硫氨酸和脯氨酸，并且该区域上的精氨酸存在翻译后修饰(甲基化)。值得注意的是，Li X等人最近的研究显示U1-70K，U1-A和U1-C在U1-snRNP中有直接的物理性结合(图1引自CryoEM structure of Saccharomycescerevisiae U1snRNP offers insight into alternative splicing)：U1-70K的N端从其RNA结合域延伸
Figure BDA0002385770500000021
环绕由7种SM蛋白组成的核心区，最终直接和U1-C相连。Kattah等学者甚至认为U1-snRNP这种天然存在的特性(相同的RNA结合域、相同的自免疫抗原表位和蛋白的直接结合等)是其拥有自免疫反应易感性的基础。
综上所述，由于U1-70K，U1-A和U1-C各自结构的复杂性、三者之间有影响抗体-抗原反应的物理结合以及原料纯度等问题，偶联过程复杂且难以掌控。
专利CN106596919A公开了一种抗U1-70K抗体检测试剂盒的制备方法，该专利使用羧基化磁微粒偶联U1-70K蛋白，但只能检测抗U1-70K抗体，无法检测抗U1-C、U1-A抗体，其临床应用存在不足。专利CN206725583U提供了一种自身抗体联合检测的试剂盒的制备方法，该专利将三种抗原直接喷涂到硝酸纤维素膜上，通过物理吸附的方法结合抗原，但存在吸附稳定性较差、非特异性的蛋白吸附、反应精度差和反应速度慢等缺点。因此，一种改进的用于检测抗U1-snRNP抗体的产品是目前需要的。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于检测抗U1-snRNP抗体的抗原偶联磁微粒，该抗原偶联磁微粒和抗U1-snRNP抗体的反应性好，对抗U1-snRNP抗体的检出率高，检测精度高。
本发明的第二目的在于提供一种所述抗原偶联磁微粒的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种抗U1-snRNP抗体的检测方法。
本发明的第四目的在于提供一种用于检测抗U1-snRNP抗体的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测抗U1-snRNP抗体的抗原偶联磁微粒，所述抗原偶联磁微粒中磁微粒偶联的抗原包括U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原；
U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的质量比为(2～10)：(2～10)：(2～10)。
优选地，U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的质量比为(5～10)：(5～10)：(5～10)。
优选地，U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的质量比为1:1:1。
优选地，所述U1-70K抗原的用量为2～10ng/份；所述U1-A抗原的用量为2～10ng/份；所述U1-C抗原的用量为2～10ng/份；
优选地，所述U1-70K抗原的用量为5～10ng/份；所述U1-A抗原的用量为5～10ng/份；所述U1-C抗原的用量为5～10ng/份。
优选地，所述U1-70K抗原的用量为5ng/份；所述U1-A抗原的用量为5ng/份；所述U1-C抗原的用量为5ng/份。
优选地，所述U1-70K抗原、所述U1-A抗原和所述U1-C抗原分别独立的为重组蛋白；
优选地，所述U1-70K抗原、所述U1-A抗原和所述U1-C抗原的纯度分别独立的≥90％。
优选地，所述磁微粒包括羧基化磁微粒；
优选地，所述磁微粒包括羧基化长方体磁微粒。
优选地，所述U1-70K抗原的用量为5ng/份，所述U1-A抗原的用量为5ng/份，所述U1-C抗原的用量为5ng/份；所述U1-70K抗原、所述U1-A抗原和所述U1-C抗原均为纯度≥90％的重组蛋白。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种所述抗原偶联磁微粒的制备方法，包括将所述U1-70K抗原、所述U1-A抗原和所述U1-C抗原按照配方量和磁微粒偶联，得到所述抗原偶联磁微粒。
优选地，在硼酸盐缓冲液中偶联抗原和经过活化的磁微粒；
优选地，所述硼酸盐缓冲液的浓度为100～120mM，pH为8～9；
优选地，所述硼酸盐缓冲液的浓度为100mM，pH为9；
优选地，所述磁微粒包括羧基化磁微粒，所述活化采用EDC/NHS法活化。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种抗U1-snRNP抗体的检测方法，包括使用所述抗原偶联磁微粒检测待测样本；
优选地，所述检测方法包括采用带有标记的二抗与抗原偶联磁微粒结合的抗U1-snRNP抗体结合；
优选地，所述标记包括荧光蛋白，所述荧光蛋白优选包括藻红蛋白。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于检测抗U1-snRNP抗体的试剂盒，该试剂盒包含所述抗原偶联磁微粒；
优选地，所述试剂盒还包括二抗、缓冲液和封闭液中的一种或多种；
优选地，所述二抗包括藻红蛋白标记的二抗。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的用于检测抗U1-snRNP抗体的抗原偶联磁微粒采用将U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原混合与磁微粒偶联，可对绝大多数样本有较强的反应性，能够有效的检出抗U1-snRNP抗体阳性样本。同时，本发明通过优化了三种抗原用量的比例，提高了抗U1-snRNP抗体的检出率，并且背景极低，使阳性样本的反应性与阴性样本的反应性有较高的区分度。本发明提供的上述抗原偶联磁微粒的制备方法简单，成本低廉。基于本发明提供的用于检测抗U1-snRNP抗体的抗原偶联磁微粒的发明构思，本发明还提供了一种抗U1-snRNP抗体的检测方法和一种用于检测抗U1-snRNP抗体的试剂盒。本发明提供的检测方法和试剂盒均具有抗U1-snRNP抗体阳性样本检出率高，检测精度高的有益效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为U1-snRNP的结构；
图2为使用MES(100mM，pH 5.0)偶联抗原，检测反应性时磁微粒的聚团情况；
图3为使用BBS(100mM，pH 9.0)偶联抗原，检测反应性时磁微粒的聚团情况。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于检测抗U1-snRNP抗体的抗原偶联磁微粒，该抗原偶联磁微粒中磁微粒偶联U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原。其中U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的质量比为(2～10)：(2～10)：(2～10)，例如可以为但不限于为2:10:10、2:2:10、2:5:10、2:10:2、2:10:5、5:10:10、5:5:5、10:5:10和10:10:5；U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的质量比为(5～10)：(5～10)：(5～10)，更优选为1:1:1。
本发明提供的抗原偶联磁微粒采用将U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原混合偶联，可对绝大多数样本有较强的反应性，能够有效的检出抗U1-snRNP抗体阳性样本。本发明通过实验发现，单独使用U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原中的一种检测抗U1-snRNP抗体容易造成漏检，而三种抗原混合偶联反应性较偶联单一抗原普遍较高，能检测出绝大部分阳性样本。同时，本发明通过优化了三种抗原与磁微粒偶联的量，提高了抗U1-snRNP抗体的检出率，并且背景极低，使阳性样本的反应性与阴性样本的反应性有较高的区分度，提高了检测精度。
在一些优选的实施方式中，通过进一步优化检测每份样品的磁微粒上偶联的抗原的量，能够提高检测准确度，以及避免抗原偶联过多造成的检测成本过高的问题。各抗原的优选用量如下：U1-70K抗原的用量为2～10ng/份，例如可以为但不限于为2ng/份、3ng/份、4ng/份、5ng/份、6ng/份、7ng/份、8ng/份、9ng/份或10ng/份；U1-A抗原的用量为2～10ng，例如可以为但不限于为2ng/份、3ng/份、4ng/份、5ng/份、6ng/份、7ng/份、8ng/份、9ng/份或10ng/份；和，U1-C抗原的用量为2～10ng/份，例如可以为但不限于为2ng/份、3ng/份、4ng/份、5ng/份、6ng/份、7ng/份、8ng/份、9ng/份或10ng/份。其中本发明中作为单位的“份”指的是每份待检测的样品，“ng/份”指的是检测一份待检测样品的磁微粒需要偶联的抗原的用量，例如当检测一份样品使用50个磁微粒，则平均每50个磁微粒使用2～10ng的一种抗原偶联；当检测一份样品使用100个磁微粒，则平均每100个磁微粒使用2～10ng的一种抗原偶联。
在一些优选的实施方式中，U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的用量均优选为5～10ng/份。当抗原的用量至少为5ng/份时，能够显著提高抗原偶联磁微粒对抗U1-snRNP抗体弱阳性样本的检出率；而随着抗原用量的进一步提升，反应性能提高的幅度随之减小，因此出于抗原偶联磁微粒的制备成本考虑，各抗原的用量不超过10ng/份。本发明通过实验发现，U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的用量均为5ng/份时，检测效果最佳。
在一些优选的实施方式中，U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原分别独立的选用重组蛋白，重组蛋白为通过蛋白质工程在体外表达系统中表达出的蛋白，相较于天然蛋白的优势是，重组蛋白均不含有除去其自身外其他的U1-snRNP的成分，尤其是SM蛋白的干扰。而天然提取的U1-70K，U1-A和U1-C极易混有SM蛋白，SM蛋白是抗SM抗体的靶抗原，如果磁微粒上偶联的抗原混合有SM蛋白，当样品中含有SM抗体时容易造成检测结果出现假阳性。在一些优选的实施方式中，U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原分别独立的为纯度至少为90％的重组蛋白，以降低蛋白中其他成分的干扰。U1-70K抗原重组蛋白、U1-A抗原重组蛋白和U1-C抗原重组蛋白分别独立的优选购自abcam、Diarect或义翘神州。
在一些优选的实施方式中，磁微粒包括羧基化磁微粒，羧基化磁微粒是表面含有羧基的磁微粒，抗原通过与羧基共价偶联连接到磁微粒。羧基化磁微粒的实例包括但不限于羧基化长方体磁微粒。
在一些优选的实施方式中，所述抗原偶联磁微粒中磁微粒偶联U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原，U1-70K抗原的用量为5ng/份，U1-A抗原的用量为5ng/份，U1-C抗原的用量为5ng/份；U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原均为纯度≥90％的重组蛋白。该实施方式中的抗原偶联磁微粒对抗U1-snRNP抗体阳性样本具有较高的反应性，抗U1-snRNP抗体阳性样本检出率高，对弱阳样本有较好的检出率且反应性较优，并且成本较为合理。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述抗原偶联磁微粒的制备方法，包括将U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原按照配方量和磁微粒偶联，得到所述抗原偶联磁微粒。该制备方法简单，成本低廉。
在一些优选的实施方式中，优选在硼酸盐缓冲液中偶联抗原和经过活化的磁微粒，硼酸盐缓冲液优选硼酸盐浓度为100～120mM，pH为8～9的缓冲液，更优选硼酸盐的浓度为100mM，pH为9的缓冲液。本发明通过实验发现，在硼酸盐缓冲液中偶联抗原和经活化的磁微粒可以明显减少磁微粒的聚团现象。
在一些优选的实施方式中，磁微粒包括羧基化磁微粒，羧基化磁微粒采用EDC/NHS法活化。EDC/NHS法活化是基于磁珠表面所含的羧基与EDC形成一种衍生物，该衍生物能够与NHS生成酯，以防止生成的衍生物在溶液中水解，同时达到活化羧基的目的。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种抗U1-snRNP抗体的检测方法，该检测方法包括使用所述抗原偶联磁微粒检测待测样本。该检测方法和上述用于检测抗U1-snRNP抗体的抗原偶联磁微粒基于相同的发明构思，具有所述抗原偶联磁微粒的所有有益效果，在此不再赘述。需要说明的是，本发明提供的抗U1-snRNP抗体的检测方法出于非疾病的诊断和治疗目的。
在一些实施方式中，抗原偶联磁微粒与检测样本中的抗U1-snRNP抗体结合后，优选采用带有标记的二抗再与抗U1-snRNP抗体结合，所述二抗为能够与抗U1-snRNP抗体结合而不与磁微粒上偶联的抗原结合的抗体。二抗带有的标记优选包括荧光蛋白，以荧光蛋白作为标记，二抗与抗U1-snRNP抗体结合后就可以读取荧光信号，无需底物、酶和底物缓冲液，操作简单，节省成本。在一些优选的实施例中荧光蛋白优选包括藻红蛋白，信号读取效果较佳。
基于上述用于检测抗U1-snRNP抗体的抗原偶联磁微粒的发明构思，本发明还提供了一种用于检测抗U1-snRNP抗体的试剂盒，该试剂盒包括所述用于检测抗U1-snRNP抗体的抗原偶联磁微粒，具有所述抗原偶联磁微粒的所有有益效果，该试剂盒成本低廉，抗U1-snRNP抗体阳性样本检出率高，检测精度高。可以理解的是，所述试剂盒还可以包括常规的检测试剂，包括但不限于为二抗、缓冲液和封闭液中的一种或多种，其中二抗优选包括藻红蛋白标记的二抗。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。
实施例中使用的材料与仪器如下：U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原均为外购重组抗原，均购自Diarect，抗原纯度大于90％。
羧基化长方体磁微粒：购自Applied BioCode公司。
藻红蛋白标记的抗人IgG抗体：抗人IgG抗体来源于鼠。
血清样本：由合作医院提供。
2-吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、三羟甲基氨基甲烷、磷酸二氢钾、十二水和磷酸氢二钠、硼砂、硼酸、Tween20、牛血清白蛋白和其它试剂应达到分析纯。
恒温混匀仪、磁力架、恒温振荡器、磁力板，Biocode-2000判读仪。
实施例1
本实施例提供了一种U1-70K抗原、U1-C抗原和U1-A抗原偶联的磁微粒，磁微粒偶联U1-70K抗原5ng/份、U1-C抗原5ng/份和U1-A抗原5ng/份。
制备方法如下：
(1)取50000个磁微粒(1000份)，磁分离去上清，用100mM MES缓冲液(pH 6.0)洗涤2遍，再采用152μL MES缓冲液(pH 6.0)重悬；
(2)加入28μL新鲜配制的NHS(50mg/mL)，涡旋混匀，再加入20μL新鲜配制的EDC(50mg/mL)，在室温下震荡50min(1500rpm/min)；
(3)采用200μL硼酸盐缓冲溶液(100mM，pH 9.0)洗涤2遍，再用200μL硼酸盐缓冲溶液(100mM，pH 9.0)重悬；
(4)按5ng/份的用量同时加入U1-70K抗原、U1-C抗原和U1-A抗原，在室温下震荡2.5h(1500rpm/min)；
(5)采用封闭液(含1％BSA牛血清白蛋白)洗涤2遍，加入500μL封闭液，在室温下震荡1h(1500rpm/min)；
(6)采用PBST(含1％BSA牛血清白蛋白)洗涤。
实施例2
本实施例提供了一种U1-70K抗原、U1-C抗原和U1-A抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-70K抗原3ng/份、U1-C抗原3ng/份和U1-A抗原3ng/份。
实施例3
本实施例提供了一种U1-70K抗原、U1-C抗原和U1-A抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-70K抗原2ng/份、U1-C抗原2ng/份和U1-A抗原2ng/份。
实施例4
本实施例提供了一种U1-70K抗原、U1-C抗原和U1-A抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-70K抗原2ng/份、U1-C抗原3ng/份和U1-A抗原3ng/份。
实施例5
本实施例提供了一种U1-70K抗原、U1-C抗原和U1-A抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-70K抗原2ng/份、U1-C抗原4ng/份和U1-A抗原4ng/份。
实施例6
本实施例提供了一种U1-70K抗原、U1-C抗原和U1-A抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-70K抗原10ng/份、U1-C抗原10ng/份和U1-A抗原10ng/份。
实施例7
本实施例提供了一种U1-70K抗原、U1-C抗原和U1-A抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于：改变偶联方法第(3)和(4)步，采用MES缓冲溶液(100mM，pH 5.0)偶联混合抗原。
对比例1
本对比例提供了一种U1-70K抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-70K抗原5ng/份。
对比例2
本对比例提供了一种U1-70K抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-70K抗原10ng/份。
对比例3
本对比例提供了一种U1-70K抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-70K抗原15ng/份。
对比例4
本对比例提供了一种U1-C抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-C抗原5ng/份。
对比例5
本对比例提供了一种U1-C抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-C抗原10ng/份。
对比例6
本对比例提供了一种U1-C抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-C抗原15ng/份。
对比例7
本对比例提供了一种U1-A抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-A抗原5ng/份。
对比例8
本对比例提供了一种U1-A抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-A抗原10ng/份。
对比例9
本对比例提供了一种U1-A抗原偶联的磁微粒，与实施例1的区别在于磁微粒偶联U1-A抗原15ng/份。
效果例1
使用实施例1制备的磁微粒测试样本，测试方法如下：
(1)取50μL磁微粒(含50个磁微粒)于透明材质的96孔板，加入50μL采用PBST(含1％BSA牛血清白蛋白)预稀释50倍的血清样本，于37℃条件下振荡15分钟；
(2)采用磁力板吸附磁微粒，移除反应液后，用PBST洗涤2遍；
(3)加入50μL藻红蛋白标记的抗人IgG抗体，于37℃条件下振荡15分钟；
(4)采用磁力板吸附磁微粒，移除反应液后，用PBST洗涤2遍；
(5)采用PBST悬浮并采用判读仪读取荧光信号值。
反应性考察测试结果如表1所示：
表1
Figure BDA0002385770500000121
通过测试32份不同滴度的样本可以看出，阴性样本的本底信号极低、均为个位数；弱阳性样本有较强的荧光信号，与阴性样本差异明显；阳性和强阳性样本的荧光信号极强，且呈递增趋势。实施例1制备得到的磁微粒可使弱阳、阳性、强阳性样本具有较高的区分度(相对于阴性样本，其荧光信号值较高)。
精密度考察结果如表2所示：
表2
Figure BDA0002385770500000131
对同一份样本测试10次，其变异系数在2％以内，测试重复性较优。结论：实施例1磁微粒能够显著区分不同抗体滴度样本值，且测试重复性较优，表明实施例1提供的磁微粒效果较好。
效果例2
使用对比例1～对比例9制备的磁微粒测试样本，测试方法同效果例1，反应性考察结果如表3所示：
表3
Figure BDA0002385770500000141
测试结果表明，各抗原单独使用时，U1-70K和U1-A的最佳用量为5ng/份；U1-C的最适用量为5ng/份或10ng/份，二者相差不大。结论：综合各抗原偶联磁微粒的反应性及成本，U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原单独偶联磁珠时的使用量均优选5ng/份，因此后续对比单独偶联一种抗原的磁微粒和同时偶联U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的磁微粒的性能时，采用对比例1、对比例4和对比例7的磁微粒进行测试。
效果例3
比较对比例1、对比例4和对比例7的磁微粒性能，反应性考察结果如表4所示：
表4
Figure BDA0002385770500000151
测试结果表明，20例抗U1-snRNP抗体阳性血清中有5例对U1-70K抗原、U1-C抗原和U1-A抗原均有较高的反应性；5例血清对U1-C抗原和U1-A抗原有较强的反应性，而对U1-70K抗原无强反应性；分别存在5、2和3例血清仅对一种抗原有明显反应性。
结论：对于抗U1-snRNP抗体的检测，单独使用一种抗原会造成漏检，需使用三种抗原联合检测。
效果例4
测试实施例2、对比例1、对比例4和对比例7的磁微粒，以比较同时偶联U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的磁微粒和只偶联一种抗原磁微粒的效果。反应性考察结果如表5所示：
表5
Figure BDA0002385770500000161
测试结果表明，三种抗原混合偶联可对绝大多数样本有较强的反应性(26/30)，仅有4份样本反应性较低，但与阴性样本相比区分度依然很高。
结论：说明三种抗原混合偶联磁微粒检测抗U1-snRNP抗体的效果优于单独使用其中一种抗原。
效果例5
比较实施例2～5和对比例1、4、7的磁微粒，测试结果如表6所示：
表6
Figure BDA0002385770500000171
测试结果表明，三种抗原混合偶联反应性较偶联单一抗原普遍较高；实施例2比实施例3～5的磁微粒性能更优。
效果例6
比较实施例1、2、6的磁微粒，反应性考察结果如表7所示：
表7
Figure BDA0002385770500000172
Figure BDA0002385770500000181
测试结果表明，U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原混合偶联比例为5ng+5ng+5ng/份和10ng+10ng+10ng/份时，对弱阳样本有较好的检出且反应性较优。
结论：考虑成本因素，实施例1提供的U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原混合偶联比例为5ng+5ng+5ng/份时，效果更佳。
效果例7
比较实施例1和实施例7的磁微粒，反应性考察结果如表8所示：
表8
Figure BDA0002385770500000182
磁微粒聚团情况考察如图2和图3所示，反应性检测时，磁微粒聚团情况。图2为实施例1，使用MES(100mM，pH 5.0)偶联抗原，检测反应性时磁微粒的聚团情况；图3为实施例7，使用BBS(100mM，pH 9.0)偶联抗原，检测反应性时磁微粒的聚团情况；图片由Biocode-2000在明视场下拍摄，聚团的磁微粒用黑色箭头标识。测试结果表明，偶联缓冲溶液选取BBS(100mM，pH 9.0)时，磁微粒聚团情况明显减少。测试结果表明，偶联缓冲溶液选取BBS(100mM，pH 9.0)，反应性最优。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种用于检测抗U1-snRNP抗体的抗原偶联磁微粒，所述抗原偶联磁微粒中磁微粒偶联的抗原包括U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原；
U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的质量比为(2～10)：(2～10)：(2～10)。
2.根据权利要求1所述的抗原偶联磁微粒，其特征在于，U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的质量比为(5～10)：(5～10)：(5～10)；
优选地，U1-70K抗原、U1-A抗原和U1-C抗原的质量比为1:1:1。
3.根据权利要求1所述的抗原偶联磁微粒，其特征在于，所述U1-70K抗原的用量为2～10ng/份；所述U1-A抗原的用量为2～10ng/份；所述U1-C抗原的用量为2～10ng/份；
优选地，所述U1-70K抗原的用量为5～10ng/份；所述U1-A抗原的用量为5～10ng/份；所述U1-C抗原的用量为5～10ng/份；
优选地，所述U1-70K抗原的用量为5ng/份；所述U1-A抗原的用量为5ng/份；所述U1-C抗原的用量为5ng/份。
4.根据权利要求1所述的抗原偶联磁微粒，其特征在于，所述U1-70K抗原、所述U1-A抗原和所述U1-C抗原分别独立的为重组蛋白；
优选地，所述U1-70K抗原、所述U1-A抗原和所述U1-C抗原的纯度分别独立的≥90％。
5.根据权利要求1所述的抗原偶联磁微粒，其特征在于，所述磁微粒包括羧基化磁微粒；
优选地，所述磁微粒包括羧基化长方体磁微粒。
6.根据权利要求1-5任一项所述的抗原偶联磁微粒，其特征在于，所述U1-70K抗原的用量为5ng/份，所述U1-A抗原的用量为5ng/份，所述U1-C抗原的用量为5ng/份；所述U1-70K抗原、所述U1-A抗原和所述U1-C抗原均为纯度≥90％的重组蛋白。
7.权利要求1-6任一项所述抗原偶联磁微粒的制备方法，其特征在于，包括将所述U1-70K抗原、所述U1-A抗原和所述U1-C抗原按照配方量和磁微粒偶联，得到所述抗原偶联磁微粒。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在硼酸盐缓冲液中偶联抗原和经过活化的磁微粒；
优选地，所述硼酸盐缓冲液的浓度为100～120mM，pH为8～9；
优选地，所述硼酸盐缓冲液的浓度为100mM，pH为9；
优选地，所述磁微粒包括羧基化磁微粒，所述活化采用EDC/NHS法活化。
9.一种抗U1-snRNP抗体的检测方法，其特征在于，包括使用权利要求1-6任一项所述的抗原偶联磁微粒检测待测样本；
优选地，所述检测方法包括采用带有标记的二抗与抗原偶联磁微粒结合的抗U1-snRNP抗体结合；
优选地，所述标记包括荧光蛋白，所述荧光蛋白优选包括藻红蛋白。
10.一种用于检测抗U1-snRNP抗体的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述的抗原偶联磁微粒；
优选地，所述试剂盒还包括二抗、缓冲液和封闭液中的一种或多种；
优选地，所述二抗包括藻红蛋白标记的二抗。
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