CN111246877A - 新城疫病毒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文描述的包含包装基因组的嵌合新城疫病毒，所述包装基因组包含编码白细胞介素‑12的转基因。所述嵌合新城疫病毒以及其组合物与程序性细胞死亡蛋白1(“PD‑1”)或其配体的拮抗剂组合在治疗癌症方面是有用的。特别地，本文描述的是治疗癌症的方法，所述方法包括与PD‑1或其配体的拮抗剂组合地施用所述嵌合新城疫病毒，其中所述嵌合新城疫病毒包含包装基因组，所述包装基因组包含编码白细胞介素‑12的转基因。

Description

新城疫病毒及其用途
本申请要求2017年5月12日提交的美国临时专利申请No.62/505,759，以及2017年5月17日提交的美国临时专利申请No.62/507,690的优先权的权益，它们的每一个通过完全引用合并在本文中。
本发明是在美国国立卫生研究院授予的T32 CA009207和HHSN26620070010C的政府支持下完成的。政府在本发明中拥有一定权利。
本申请含有序列表，它已经以ACSII格式电子提交，通过完全引用合并在本文中。所述ASCII拷贝在2018年5月4日创建，命名为6923-272-228_SL.txt，大小是263,022字节。
1.技术领域
本文描述的是治疗癌症的方法，包括向对象施用嵌合新城疫病毒(Newcastle diseasevirus,“NDV”)(或包含这样的嵌合NDV的组合物)以及程序性细胞死亡蛋白1(“PD-1”)或其配体的拮抗剂(或包含这样的拮抗剂的组合物)，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码白细胞介素-12(“IL-12”)的转基因。在具体的方面，本文描述的是治疗癌症的方法，包括施用嵌合新城疫病毒(或包含这样的嵌合NDV的组合物)以及阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1和PD-L2两者)抗体之间的相互作用的抗PD-1抗体(或包含这样的拮抗剂的组合物)，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12的转基因。在另一个方面，本文描述的是用于治疗对象的癌症的方法的嵌合新城疫病毒，其中所述嵌合NDV包含包装基因，所述包装基因包含编码IL-12的转基因，其中所述方法疾病包括施用阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或这两者)抗体之间的相互作用的抗PD-1抗体。
2.背景技术
2.1新城疫病毒
新城疫病毒(NDV)是副粘病毒科的Avulavirus属的一员，已显示该病毒感染许多鸟类物种(Alexander，DJ(1988).Newcastle disease，Newcastle disease virus--an avianparamyxovirus.Kluwer Academic Publishers:Dordrecht，The Netherlands，pp 1-22)。NDV具有负义的单链RNA基因组，不经历与宿主基因组或与其他病毒的重组(Alexander，DJ(1988).Newcastle disease，Newcastle disease virus—an avianparamyxovirus.Kluwer Academic Publishers:Dordrecht，The Netherlands，pp 1-22)。所述基因组RNA含有按照3'-NP-P-M-F-HN-L-5'的顺序的基因，下文中进一步详细描述。两种另外的蛋白质V和W，通过由RNA编辑产生的可选择mRNA由NDV从P基因中产生。基因组RNA还含有3'末端的前导序列。
病毒粒的结构元件包括病毒包膜，其是衍生自细胞质膜的脂质双分子层。糖蛋白、血细胞凝集素-神经氨酸酶(HN)从包膜上突出，容许病毒含有血细胞凝集素(例如，受体结合/膜融合)以及神经氨酸酶两者的活性。融合糖蛋白(F)也与病毒膜相互作用，首先作为无活性的前体产生，然后翻译后裂解产生两个二硫化物连接的多肽。通过促进病毒包膜与宿主细胞质膜的融合，活性的F蛋白参与NDV穿透进入宿主细胞。基质蛋白(M)参与病毒组装，与病毒膜以及核衣壳蛋白两者相互作用。
所述核衣壳的主要蛋白质亚基是对衣壳赋予螺旋对称性的核衣壳蛋白(NP)。与所述核衣壳相连的是P和L蛋白。磷蛋白(P)经历磷酸化，被认为在转录中起到调节作用，也可能涉及甲基化、磷酸化和多聚腺苷酸化。L基因编码RNA依赖性RNA聚合酶，与P蛋白一起是病毒RNA合成所需的。L蛋白占据病毒基因组的编码容量的几乎一半，是最大的病毒蛋白质，在转录和复制中都起到重要作用。已经显示V蛋白抑制干扰素-alpha并贡献NDV的毒力(Huang等(2003)Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesisand functions as an Alpha Interferon Antagonist.Journal of Virology 11:8676-8685)。
已经报道了天然地发生的NDV在各种动物肿瘤模型中是有效的溶瘤剂(Sinkovics，JG，和Horvath，JC(2000).Newcastle disease virus(NDV):brief history of itsoncolytic strains.J Clin Virol 16:1-15；Zamarin等，2009；Mol Ther 17:697；Elankumaran等，2010；J Virol 84:3835；Schirrmacher等，2009；Methods Mol Biol 542:565；Bart等，1973；Nat New Biol 245:229)。NDV的天然发生的菌株已经用于针对晚期人类癌症的多项临床试验(Sinkovics，JG，and Horvath，JC(2000).Newcastle disease virus(NDV):brief history of its oncolytic strains.J Clin Virol 16:1-15；Lorence等(2007).Phase 1 clinical experience using intravenous administration of PV701，an oncolytic Newcastle disease virus.Curr Cancer Drug Targets 1:157-167；Hotte等(2007).An optimized clinical regimen for the oncolytic virus PV701.ClinCancer Res 13:977-985；Freeman等(2006).Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJoncolytic virus in recurrent glioblastoma multiforme.Mol Ther 13:221-228；Pecora等(2002).Phase I trial of intravenous administration of PV701，anoncolytic virus，in patients with advanced solid cancers.J Clin Oncol 20:2251-2266；Csatary等(2004).MTH-68/H oncolytic viral treatment in human high-gradegliomas.J Neurooncol 67:83-93)。然而，用于晚期人类癌症的这些临床试验中NDV的天然发生的菌株的成功仅仅是勉强够格的(Hotte等(2007).An optimized clinical regimenfor the oncolytic virus PV701.Clin Cancer Res 13:977-985；Freeman等(2006).Phase I/II trial of intravenous NDV-HUJ oncolytic virus in recurrentglioblastoma multiforme.Mol Ther 13:221-228；Pecora等(2002).Phase I trial ofintravenous administration of PV701，an oncolytic virus，in patients withadvanced solid cancers.J Clin Oncol 20:2251-2266)。因而，仍然需要在癌症特别是晚期癌症的治疗中有用的基于NDV的治疗。
2.2 PD-1拮抗剂
已经批准了抗PD-1阻断性抗体和抗PD-L1阻断性抗体用于治疗某些类型的癌症。例如，已经批准派姆单抗(pembrolizumab)用于治疗几种类型的癌症，包括(1)难治性经典霍奇金淋巴瘤，(2)复发性和转移性头颈部鳞状细胞癌，(3)不可切除性或转移性黑素瘤，(4)局部或晚期或转移性尿路上皮癌，(5)具有表达程序性死亡配体1(“PD-L1”)的肿瘤的，复发性局部晚期或转移性胃或胃食管腺癌，(6)在先期治疗之后进展的、没有满意的可选治疗选择的、不可切除性或转移性、高度微卫星不稳定的癌症或错配修复缺陷的实体肿瘤，或在用氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康治疗之后进展的结肠直肠癌症，以及(7)具有表达PD-L1的肿瘤的转移性非小细胞肺癌；纳武单抗(nivolumab)已经被批准用于治疗不同类型的癌症，包括不可切除性或转移性黑素瘤。虽然这些治疗已经显示了一定的成功，仍然需要治疗癌症的疗法。
3.发明概述
在一个方面，本公开内容提供了嵌合NDV，其包含包装基因组，所述包装基因组编码白细胞介素-12(“IL-12”)(例如，IL-12的p35和p40亚基)或其衍生物。在具体的实施方式中，所述IL-12转基因是本文公开的IL-12转基因(参见，例如，章节5.2、5.2.1、5.7、5.10和6)。在具体的实施方式中，所述转基因包含SEQ ID NO:26、53、61、63、66或68中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因编码多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:22、39、42或43中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述IL-12是人类IL-12。在具体的实施方式中，所述IL-12或其衍生物由所述嵌合NDV感染的细胞表达。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV可以用于例如癌症的治疗。本文公开的嵌合NDV出人意料地显著提高肿瘤样品的表15中(参见下文章节6.3.1.14)的18-基因标志的基因表达谱评分。
在另一个方面，本文提供的是利用嵌合NDV或包含这样的嵌合NDV的组合物、与PD-1(例如，人类PD-1)或其配体的拮抗剂或包含这样的拮抗剂的组合物组合地用于治疗癌症的方法，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组编码IL-12(例如，IL-12的p35和p40亚基)或其衍生物。在具体的实施方式中，所述IL-12或其衍生物由所述嵌合NDV感染的细胞表达。
本文描述的治疗癌症的方法部分地基于对象中所见的强大的抗肿瘤活性，所述对象被肿瘤内地施用了包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组被工程化以编码IL-12转基因(“NDV-IL-12”)，与阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用的抗PD-1抗体相组合施用。在NDV-IL-12注射的肿瘤和无注射的肿瘤中都观察到治疗的对象中强大的抗肿瘤活性，因此，观察到远隔效应。本文描述的癌症本文描述的癌症治疗方法还部分地基于在单独地或与抗PD-1抗体组合施用的NDV-IL-12的对象中观察到的基因表达，所述抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)之间的相互作用。
在一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向对象施用嵌合NDV以及PD-1(例如，人类PD-1)或其配体的拮抗剂，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因。在具体的实施方式中，所述IL-12或其衍生物由所述嵌合NDV感染的细胞表达。在另一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向对象施用有效量的嵌合NDV以及有效量的PD-1(例如，人类PD-1)或其配体的拮抗剂，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因。在具体的实施方式中，所述IL-12或其衍生物由所述嵌合NDV感染的细胞表达。所述嵌合NDV和拮抗剂可以同时地或顺序地向所述对象施用。在某些实施方式中，所述嵌合NDV和拮抗剂在同一组合物中施用。在其他实施方式中，所述嵌合NDV和拮抗剂在不同的组合物中施用。所述NDV和所述拮抗剂可以通过相同的或不同的施用途径向所述对象施用。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV肿瘤内地施用给对象，并且所述拮抗剂静脉内地施用给所述对象。
在另一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用包含嵌合NDV的第一组合物和包含PD-1(例如，人类PD-1)或其配体的拮抗剂的第二组合物，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12的转基因，其中所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基。在另一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用嵌合NDV以及PD-1(例如，人类PD-1)或其配体的拮抗剂，其所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组编码IL-12，以及其中所述PD-1的拮抗剂是抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)之间的相互作用。在另一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用包含嵌合NDV的第一组合物和包含抗PD-1抗体的第二组合物，所述抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)之间的相互作用，其中所述所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，其中所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基。在具体的实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向人类对象施用包含嵌合NDV的第一组合物和包含抗PD-1抗体的第二组合物，所述抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)之间的相互作用，其中所述所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述转基因编码人类IL-12 p40亚基和人类IL-12 p35亚基。所述第一和第二组合物可以通过相同的或不同的施用途径施用。在具体的实施方式中，所述第一组合物肿瘤内地施用，以及所述第二组合物静脉内地施用。参见，例如，关于NDV的信息，下文的章节5.1、5.2和6，关于PD-1或其配体的拮抗剂(包括PD-1阻断性抗体)的信息，下文的章节5.5和6，关于组合物和施用途径的信息，下文的章节5.5.1，关于治疗癌症的方法的信息，下文的章节5.7和6。
在另一个方面，本文提供的用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症的方法的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，其中所述转基因编码IL-12p40亚基和IL-12 p35亚基，以及其中所述方法进一步包括施用PD-1(例如，人类PD-1)或其配体的拮抗剂。在另一个实施方式中，本文提出的是用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症的方法的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，其中所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基，其中所述方法进一步包括施用PD-1或其配体的拮抗剂，以及其中所述PD-1(例如，人类PD-1)的拮抗剂是抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)之间的相互作用。在另一个实施方式中，本文提出的是用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症的方法的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，其中所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基，以及其中所述方法进一步包括施用抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)之间的相互作用。所述嵌合NDV以及所述PD-1或其配体的拮抗剂或所述抗PD-1抗体可以通过相同的或不同的施用途径施用。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV肿瘤内地施用，以及所述PD-1或其配体的拮抗剂或所述抗PD-1抗体静脉内地施用。参见，例如，关于NDV的信息，下文的章节5.1、5.2和6，关于PD-1或其配体的拮抗剂(包括PD-1阻断性抗体)的信息，下文的章节5.5和6，关于组合物和施用途径的信息，下文的章节5.5.1，关于治疗癌症的方法的信息，下文的章节5.7和6。
在另一个实施方式中，本文提出的是嵌合NDV在制备药物中的用途，所述药物用于与PD-1(例如，人类PD-1)或其配体的拮抗剂组合地治疗对象(例如，人类对象)的癌症，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，其中所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基。在另一个实施方式中，本文提出的是嵌合NDV在制备药物中的用途，所述药物用于与PD-1(例如，人类PD-1)或其配体的拮抗剂组合地治疗对象(例如，人类对象)的癌症，其中所述所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组编码IL-12，以及其中所述PD-1的拮抗剂是抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)之间的相互作用。在另一个实施方式中，本文提出的是嵌合NDV在制备药物中的用途，所述药物用于与抗PD-1抗体组合地治疗对象(例如，人类对象)的癌症，所述抗PD-1抗体阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)之间的相互作用，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，其中所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基。所述嵌合NDV以及所述PD-1或其配体的拮抗剂或所述抗PD-1抗体可以通过相同的或不同的施用途径施用。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV肿瘤内地施用，以及所述PD-1或其配体的拮抗剂或所述抗PD-1抗体静脉内地施用。参见，例如，关于NDV的信息，下文的章节5.1、5.2和6，关于PD-1或其配体的拮抗剂(包括PD-1阻断性抗体)的信息，下文的章节5.5和6，关于组合物和施用途径的信息，下文的章节5.5.1，关于治疗癌症的方法的信息，下文的章节5.7和6。
所述嵌合NDV可以具有任何NDV类型或毒株的主干，包括但不限于，天然发生的毒株、变体或突变体、诱变的病毒、重配体和/或遗传工程化病毒。在具体的实施方式中，充当所述嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是缓发型毒株。在具体的实施方式中，充当所述嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是中发型毒株。在具体的实施方式中，充当所述嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是速发型毒株。在一个实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码具有突变的裂解位点的突变F蛋白的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述F蛋白的裂解位点被突变以产生多碱性氨基酸序列，其容许所述蛋白被细胞内蛋白酶裂解，这使得所述病毒更有效地进入细胞和形成合胞体。在另一个具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述F蛋白的裂解位点被替换为含有一个或两个额外的精氨酸残基的裂解位点，容许所述突变体裂解位点被弗林蛋白酶(furin)家族的遍在性表达的蛋白酶激活。表达这样的突变F蛋白的NDV的具体实例包括但不限于rNDV/F2aa和rNDV/F3aa。关于导入NDV F蛋白中的突变以产生具有突变的裂解位点的突变F蛋白的说明，参见，例如，Park等(2006)Engineered viral vaccine constructs with dual specificity:avian influenza andNewcastle disease.PNAS USA 103:8203-2808，通过引用以其整体合并在本文中。在某些实施方式中，所述嵌合NDV包含具有NDV LaSota毒株的或巨细胞病毒(CMV)的糖蛋白B的F蛋白裂解位点的突变F蛋白。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含具有衍生自巨细胞病毒的糖蛋白B的F蛋白裂解位点的突变F蛋白，所述F蛋白裂解位点包含氨基酸序列111N-R-T-K-S/F117(SEQ ID NO:56)，例如，国际专利申请公开No.WO 2015/032755中描述的。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含具有F蛋白裂解位点的突变F蛋白，所述F蛋白裂解位点具有以下序列之一:S116:111H-N-R-T-K-S/F 117(SEQ ID NO:56)；S116K:111H-N-K-T-K-S/F117(SEQID NO:58)；S116m:111H-N-R-M-K-S/F117(SEQ ID NO:69)；S116KM:111H-N-K-M-S/F-I118(SEQID NO:70)；或R116:111H-N-R-T-K-R/F-I118(SEQ ID NO:71)，例如，国际专利申请No.WO2015/032755中描述的。对于可以工程化到NDV F蛋白之中的突变F蛋白裂解位点的类型的说明，参见，例如，国际专利申请公开No.WO 2015/032755，通过引用以其整体合并在本文中。在某些实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变F蛋白包含氨基酸突变L289A(即，相应于LaSota F蛋白的L289的氨基酸位置上的L到A突变)。在具体的实施方式中，所述L289A突变F蛋白具有所述裂解位点中的一个、两个或三个精氨酸残基。在某些实施方式中，所述突变F蛋白来自与主干NDV不同类型或毒株的NDV。在其他实施方式中，所述突变F蛋白来自与主干NDV相同类型或毒株的NDV。在某些实施方式中，所述突变F蛋白对于所述主干NDV F蛋白是额外的。在具体的实施方式中，所述突变F蛋白替换所述主干NDV F蛋白。
用于与本文描述的NDV组合的所述PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.1、章节5.2、章节5.5、章节5.7和/或章节6)可以是本领域技术人员已知的任何PD-1或其配体的拮抗剂。PD-1的配体的具体实例包括PD-L1和PD-L2。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂(完全地或部分地)阻断PD-1的天然配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)与PD-1之间的相互作用。在优选的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂(完全地或部分)阻断PD-1的天然配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)与PD-1之间的相互作用，并且阻止或降低由PD-1与PD-1的天然配体(例如，PD-L1和/或PD-L2)的相互作用诱导的抑制信号的传导。
在特定的方面，PD-1或其配体的拮抗剂是PD-1的拮抗剂。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1的抗体。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1并(完全地或部分地)阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用的抗体。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1、(完全地或部分地)阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用、并且阻止或降低抑制信号的传导的抗体。在优选的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1并(完全地或部分地)阻断PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体。在另一个优选的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1、阻断PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用、并阻止或降低抑制信号的传导的抗体。在某些实施方式中，所述抗体是骆驼化抗体、人抗体或人源化抗体。在具体的实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在另一个具体的实施方式中，所述抗体是scFv。
在另一个方面，PD-1或其配体的拮抗剂是PD-1的配体(例如，PD-L1或PD-L2)的拮抗剂。在具体的实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是PD-L1的拮抗剂。在某些实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是PD-L1的拮抗剂，其结合PD-L1并(完全地或部分地)阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用。在某些实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是PD-L1的拮抗剂，其结合PD-L1、(完全地或部分地)阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用、并阻止或降低抑制信号的传导。在某些实施方式中，PD-L1的拮抗剂还(完全地或部分地)阻断PD-L1与CD80(B7.1)之间的相互作用。
在具体的实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是PD-L2的拮抗剂。在某些实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是PD-L2的拮抗剂，其结合PD-L2并(完全地或部分地)阻断PD-1与PD-L2之间的相互作用。在某些实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是PD-L2的拮抗剂，其结合PD-L2并(完全地或部分地)阻断PD-1与PD-L2之间的相互作用并阻止或降低抑制信号的传导。
在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是特异性结合PD-1的天然配体的抗体或可溶受体。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是特异性结合PD-1的天然配体、并(完全地或部分地)阻断所述天然配体结合PD-1和传导抑制信号的抗体或可溶受体。在某些具体的实施方式中，所述可溶受体是结合PD-1的配体的PD-1的片段、PD-1的衍生物的片段(例如，PD-1或PD-1的衍生物的细胞外结构域)。在某些特定的实施方式中，所述可溶受体是融合蛋白，所述融合蛋白包含PD-1或PD-1的衍生物的至少一部分(例如，所述PD-1或PD-1的衍生物的细胞外结构域)和异源氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含PD-1或PD-1的衍生物的至少一部分和免疫球蛋白的Fc部分或其片段。在具体的实施方式中，所述PD-1或其衍生物的部分是例如PD-1或其衍生物的细胞外结构域。
在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1的天然配体的抗体。所述抗体可以结合PD-L1或PD-L2。在某些实施方式中，所述抗体是骆驼化抗体、人抗体或人源化抗体。在具体的实施方式中，所述抗体可以是单克隆抗体。在另一个具体的实施方式中，所述抗体可以是单链可变片段(scFv)。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1、但不传导抑制信号的抗体或配体。在另一个实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1、但不传导抑制信号的配体。在某些具体的实施方式中，所述配体是融合蛋白，所述融合蛋白包含PD-1的配体或PD-1的配体的衍生物的至少一部分和异源氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含PD-1的配体或PD-1的配体的衍生物的至少一部分以及免疫球蛋白的Fc部分或其片段。
在具体的实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是PD-1阻断性抗体。在另一个具体的实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是纳武单抗。在优选的实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是派姆单抗。在另一个具体的实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是PD-L1阻断性抗体(例如，德瓦鲁单抗(duralumab)或阿维鲁单抗(avelumab))。
在一个方面，本文提供的治疗癌症的方法，包括向有需要的人类对象施用包含嵌合新城疫病毒(NDV)的第一组合物和包含人类PD-1或其配体的拮抗剂的第二组合物，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人白细胞介素-12(“IL-12”)的转基因，其中所述转基因编码人类IL-12 p40亚基和人类IL-12 p35亚基。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV的所述包装基因组进一步包含编码突变F蛋白的核苷酸序列，所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中，其中所述突变F蛋白包含突变的裂解位点。在具体的实施方式中，所述突变的裂解位点是111H-N-R-T-K-R/F-I118(SEQ ID NO:71)。在另一个具体的实施方式中，所述嵌合NDV的所述包装基因组进一步包含编码具有氨基酸突变L289A的突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中。在具体的实施方式中，所述转基因包含SEQ ID NO:26中列出的核苷酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列，以及所述IL-12 p35亚基包含SEQID NO:41中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12p40亚基包含SEQID NO:38中列出的氨基酸序列，以及所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因编码SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因编码SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因编码一氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因编码一氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列，以及所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因被插入到所述包装基因组的两个转录单元之间。在特定的实施方式中，所述包装基因组的所述两个转录单元是NDV P基因和NDV M基因的转录单元。在具体的实施方式中，所述第一组合物肿瘤内地或结节内地施用给所述对象。在另一个具体的实施方式中，所述第二组合物静脉内地施用给所述对象。
在另一个方面，本文提供的是应用于治疗人类对象的癌症的方法的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类白细胞介素-12(“IL-12”)的转基因，其中所述转基因编码人类IL-12 p40亚基和人类IL-12 p35亚基，以及其中所述方法进一步包括施用人类PD-1或其配体的拮抗剂。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV的所述包装基因组进一步包含编码突变F蛋白的核苷酸序列，所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中，其中所述突变F蛋白包含突变的裂解位点。在具体的实施方式中，所述突变的裂解位点是111H-N-R-T-K-R/F-I118(SEQ ID NO:71)。在另一个具体的实施方式中，所述嵌合NDV的所述包装基因组进一步包含编码具有氨基酸突变L289A的突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中。在具体的实施方式中，所述转基因包含SEQID NO:26中列出的核苷酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQID NO:38中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQID NO:23中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p35亚基包含SEQID NO:25中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQID NO:38中列出的氨基酸序列，以及所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因编码SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因编码一氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列，以及所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因编码SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列，以及所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因被插入到所述包装基因组的两个转录单元之间。在特定的实施方式中，所述包装基因组的所述两个转录单元是NDV P基因和NDV M基因的转录单元。在具体的实施方式中，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:51中列出的。在具体的实施方式中，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:52中列出的。在具体的实施方式中，所述第一组合物肿瘤内地或结节内地施用给所述对象。在另一个具体的实施方式中，所述第二组合物静脉内地施用给所述对象。
在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含缓发型的NDV主干。在另一个具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含LaSota毒株的NDV主干。在另一个具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含Hitchner B1毒株的NDV主干。在另一个具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含r73T-R116病毒的NDV主干。
在具体的实施方式中，所述人类PD-1或其配体的拮抗剂是结合人类PD-1的抗体。在另一个具体的实施方式中，所述人类PD-1或其配体的拮抗剂是结合人类PD-1、并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是派姆单抗。在另一个实施方式中，所述抗体是纳武单抗或MEDI0680。在具体的实施方式中，所述抗体包含，包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)可变轻链区(VLCR)互补决定区(CDR)1，包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)的VLCR CDR2，包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)的VLCR CDR3，包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)的可变重链区(VHCR)CDR 1，包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:7)的VHCR CDR2，以及包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)的VHCR CDR3。在另一个实施方式中，所述抗体包含:(a)VLCR，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:4)；和(b)VHCR，其包含氨基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQG TTVTVSS(SEQ ID NO:9)。在另一个实施方式中，所述抗体包含:(a)轻链，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:5)；和(b)重链，其包含氨基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:10)。在另一个实施方式中，所述抗体包含，包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:11)的VLCR CDR1，包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:12)的VLCR CDR2，包含氨基酸序列QQSSNWPRT(SEQ ID NO:13)的VLCR CDR3，包含氨基酸序列NSGMH(SEQ ID NO:16)的VHCR CDR1，包含氨基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG(SEQ ID NO:17)的VHCR CDR2，以及包含氨基酸序列NDDY(SEQ ID NO:18)的VHCR CDR3。在另一个实施方式中，所述抗体包含:(a)VLCR，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:14)；和(b)VHCR，其包含氨基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:19)。在另一个实施方式中，所述抗体包含:(a)轻链，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:15)；和(b)重链，其包含氨基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:20)。
在具体的实施方式中，所述人类PD-1或其配体的拮抗剂是结合人类PD-L1的抗体。在特定的实施方式中，所述抗体是度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、bms-936559或阿特珠单抗(atezolizumab)。
在具体的实施方式中，在本文提供的治疗癌症的方法施用本文描述的嵌合NDV诱导IL-12p70、IFN-γ表达，或IL-12p70和IFN-γ表达两者。在具体的实施方式中，在本文提供的治疗癌症的方法施用本文描述的嵌合NDV提高基因表达谱(GEP)评分。关于GEP评分，参见，例如，下文的实施例6.3。在具体的实施方式中，本文提供的提高对抗PD-1治疗的响应的方法。
在具体的实施方式中，根据本文公开的方法治疗的患者展现皮肤的或皮下的肿瘤或淋巴结内的肿瘤。
在另一个具体的实施方式中，所述癌症是黑素瘤、肾脏癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌(例如，肾细胞癌)、结肠直肠癌症(例如，结肠直肠的癌)、乳腺癌(例如，乳腺癌)、或头颈癌(例如，头颈部鳞状细胞癌)。在特定的实施方式中，所述癌症是选自由黑素瘤、头颈部鳞状细胞癌和乳腺癌的实体肿瘤。在另一个具体的实施方式中，所述癌症是非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。在另一个具体的实施方式中，所述癌症是转移性的。在另一个具体的实施方式中，所述癌症是不可切除的。在特定的实施方式中，所述癌症包含真皮的、皮下的或结节的转移。在具体的实施方式中，所述癌症是难治性的或复发性的、或这两者。在具体的实施方式中，所述癌症的活检无是PD-L1阳性的。在特定的实施方式中，所述活检物具有至少1％的肿瘤比例评分。在其他具体实施方式中，所述癌症的活检物是PD-L1阴性的。在特定的实施方式中，所述活检物具有小于1％的肿瘤比例评分。
在具体的实施方式中，所述对象对于使用抗体的单一治疗是难治性的，所述抗体结合PD-1并阻断PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用。在另一个具体的实施方式中，所述对象对于使用人类PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性或不响应的。在特定的实施方式中，所述对象对于使用纳武单抗、AMP-224、MEDI0680、派姆单抗、度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、bms-936559或阿特珠单抗的单一治疗是难治性或不响应的。
3.1术语
如本文使用的，术语“约”或“大约”当与数值联用时，是指该参考数的1％、5％或10％之内的任何数字。
如本文使用的，术语“激动剂”是指结合另一个分子并诱导生物反应的分子。在具体的实施方式中，激动剂是结合细胞上的受体并触发一个或更多个信号转导途径的分子。例如，激动剂包括结合细胞上的受体并诱导一个或更多个信号转导途径的抗体或配体。在某些实施方式中，所述抗体或配体结合细胞上的受体并诱导一个或更多个信号转导途径。在其他实施方式中，所述激动剂促进天然配体与天然受体的相互作用。
术语“氨基酸序列同一性”是指一对被比对的氨基酸序列之间的同一性或相似性的程度，通常表示为百分比。同一性百分比是在对准序列并在有必要时引入缺口以实现最大的序列同源性百分比之后，在候选序列中与所述肽(或多肽或蛋白)中的相应氨基酸残基相同的(即，在比对中给定位置处的氨基酸残基是相同的残基)或相似的(即，在比对中给定位置处的氨基酸取代是保守性取代，如下文讨论的)氨基酸残基的百分比。
如本文使用的，术语“拮抗剂”是指抑制另一个分子的活动而不激起其生物学反应的分子。在具体的实施方式中，拮抗剂是结合细胞上的受体并阻断或阻抑激动剂的生物学活性的分子。例如，拮抗剂包括抗体或配体，所述抗体或配体结合细胞上的受体并阻断或阻抑天然配体与所述受体的结合而不诱导一个或更多个信号转导途径。拮抗剂的另一个实例包括抗体或可溶受体，所述抗体或可溶受体与细胞上的天然受体竞争结合所述天然配体，因而，阻断或阻抑当所述天然受体结合所述天然配体时诱导的一个或更多个信号转导途径。拮抗剂的另一个实例包括抗体或可溶受体，所述抗体或可溶受体不阻止天然受体与天然配体的结合，但是通过其他方式阻止信号转导(例如，通过抑制受体多聚化)。
如本文使用的，术语“抗体”是指含有抗原结合位点的分子，例如免疫球蛋白。抗体包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、合成的抗体、嵌合抗体、多克隆抗体、单结构域抗体、骆驼化抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫化物连接的双特异性Fv(sdFv)、内抗体(intrabodies)、和抗独特性(抗Id)抗体(包括，例如，针对抗体的抗-Id和抗-抗-Id抗体)，以及任何上述的表位结合片段。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。在具体的实施方式中，抗体是人类或人源化抗体。在另一个具体的实施方式中，抗体是单克隆抗体或scFv。在某些实施方式中，抗体是人类的或人源化的单克隆抗体或scFv。在其他具体实施方式中，所述抗体是双特异性抗体。在某些实施方式中，所述双特异性抗体特异性结合免疫细胞的共刺激受体、或免疫细胞的抑制性受体、以及癌细胞上的受体。在某些实施方式中，所述双特异性抗体特异性结合免疫细胞上的两个受体，例如，免疫细胞上的两个共刺激受体、免疫细胞上的两个抑制性受体、或免疫细胞上的一个共刺激受体与免疫细胞上的一个抑制性受体。
“保守性取代”是本领域技术人员理解的术语，一般是指一个类别的氨基酸用同一类别的另一个氨基酸替换。在特定的实施方式中，保守性取代不改变多肽的结构或功能，或结构和功能两者。对于保守性取代而言的氨基酸类别可以包括疏水性的、中性亲水性的、酸性的、碱性的、构象破坏的、和芳香族的。疏水性氨基酸可以包括Met、Ala、Val、Leu、和Ile。中性亲水性氨基酸可以包括Cys、Ser和Thr。酸性氨基酸可以包括Asp和Glu。碱性氨基酸可以包括Asn、Gln、His、Lys和Arg。构象破坏氨基酸可以包括Gly和Pro。芳香族氨基酸可以包括Trp、Tyr和Phe。
如本文使用的，蛋白质或多肽的上下文中的术语“衍生物”是指:(a)至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、或80％到85％、80％到90％、80％到95％、90％到95％、85％到99％、或95％到99％相同于天然多肽的多肽；(b)由至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、或80％到85％、80％到90％、80％到95％、90％到95％、85％到99％、或95％到99％相同于编码天然多肽的核酸的核酸序列编码的多肽；(c)相对于天然多肽含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个、或2到5、2到10、5到10、5到15、5到20、10到15、或15到20个氨基酸突变(即，添加、删除和/或取代)的多肽；(d)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列可以在高度、中度或典型的严格杂交条件下与编码天然多肽的核酸序列杂交；(e)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列可以在高度、中度或典型的严格杂交条件下与编码至少10个连续氨基酸、至少12个连续氨基酸、至少15个连续氨基酸、至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸、至少40个连续氨基酸、至少50个连续氨基酸、至少75个连续氨基酸、至少100个连续氨基酸、至少125个连续氨基酸、至少150个连续氨基酸、或10到20、20到50、25到75、25到100、25到150、50到75、50到100、75到100、50到150、75到150、100到150、或100到200个连续氨基酸的天然多肽的片段的核酸序列杂交；或(f)天然多肽的片段。衍生物还包括多肽，所述多肽包含哺乳动物多肽的天然发生的成熟形式的氨基酸序列以及异源信号肽氨基酸序列。另外，衍生物包括已经被化学修饰的多肽，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解性裂解、连接到细胞配体或其他蛋白部分，等等。进一步地，衍生物包括包含一个或更多个非典型氨基酸的多肽。在一个实施方式中，衍生物是分离的。在具体的实施方式中，衍生物保持了衍生它的天然多肽的一种或更多种功能。
可以使用本领域技术人员已知的任何方法确定同一性百分比。在具体的实施方式中，所述同一性百分比使用Sequence Analysis Software Package(Version 10；GeneticsComputer Group，Inc.，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，Wisconsin)的“Best Fit”或“Gap”程序确定。已经描述了关于杂交条件的信息(例如，高度、中度和典型的严格条件)，参见，例如，美国专利申请公开No.US 2005/0048549(例如，第72-73段)。
如本文使用的，在蛋白质性试剂(例如，蛋白质)的片段的上下文中术语“片段”是指蛋白质性试剂的8个或更多个连续氨基酸、10个或更多个连续氨基酸、15个或更多个连续氨基酸、20个或更多个连续氨基酸、25个或更多个连续氨基酸、50个或更多个连续氨基酸、75个或更多个连续氨基酸、100个或更多个连续氨基酸、150个或更多个连续氨基酸、200个或更多个连续氨基酸、或10到300个连续氨基酸、10到200个连续氨基酸、10到250个连续氨基酸、10到150个连续氨基酸、10到100个连续氨基酸、10到50个连续氨基酸、50到100个连续氨基酸、50到150个连续氨基酸、50到200个连续氨基酸、50到250个连续氨基酸、50到300个连续氨基酸、25到50个连续氨基酸、25到75个连续氨基酸、25到100个连续氨基酸、或75到100个连续氨基酸的片段。在具体的实施方式中，蛋白质性试剂的片段保留了所述蛋白质性试剂的一种或更多种功能，换句话说，它是功能性片段。例如，蛋白质性试剂的片段保持了与另一个蛋白相互作用、和/或诱导、增强或活化一个或更多个信号转导途径的能力。
如本文使用的，在蛋白质性试剂的上下文中术语“功能性片段”是指蛋白质性试剂的一部分，其保留了所述蛋白质性试剂的一种或更多种活性或功能。例如，抑制性受体的功能性片段可以保持结合一个或更多个它的配体的能力。共刺激受体的配体的功能性片段可以保持结合所述受体和/或诱导、增强或活化由所述配体对它的共刺激受体的结合所诱导的一种或更多种信号转导途径的能力。
如本文使用的，术语“GEP评分”是指基于表15中的18-基因标志的、人类肿瘤组织培养样品的RNA基因表达谱(RNA Gene Expression Profiling)。来自每个单独样品的分离的RNA的基因表达数据通过HK(持家)归一化来进行归一化。对于每个肿瘤样品，将原始计数进行log 10转换，然后通过减去所有持家基因的算术平均值将每个基因归一化(表15)。基因表达谱(GEP)标志评分计算为18个基因Up-Down标志的持家标准化值的加权总和(表15)。每个基因的持家标准值乘以来自该评分权重组的基因的系数，产生18种基因标志的每一个基因的加权的RNA值，添加该加权的RNA值来产生肿瘤样品的标志评分。
如本文使用的，术语“异源”是指在自然中不与天然发生的NDV相关地(例如，由天然发生的NDV的基因组编码和/或表达)存在的实体。
如本文使用的，术语“老年人”是指65岁或以上的人类。
如本文使用的，术语“人类成年人”是指18岁或以上的人类。
如本文使用的，术语“人类儿童”是指1岁到18岁的人类。
如本文使用的，术语“人类学步儿童”是指1岁到3岁的人类。
如本文使用的，术语“人类婴儿”是指新生儿到1岁的人类。
在某些实施方式中，如本文使用的，术语“高度膜融合”等是指NDV形成涉及大量细胞的合胞体的能力。在具体的实施方式中，相对于感染衍生出所述病毒的亲本病毒的细胞，该亲本细胞具有未突变的F蛋白，感染本文描述的被工程化以表达突变F蛋白的NDV的细胞具有提高的能力形成合胞体。在另一个具体的实施方式中，相对于感染衍生出所述嵌合病毒、具有未突变的F蛋白的亲本病毒的形成合胞体的细胞数量，约10％到约25％、约25％到约50％、约25％到约75％、约50％到约75％、约50％到约95％、或约75％到约99％、或约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％或更多的、感染本文描述的被工程化以表达突变F蛋白的NDV的细胞形成合胞体。在某些实施方式中，通过在一定时间之后(例如，约8小时到约12小时、约12小时到约24小时、约24小时到约36小时、或约36小时到约48小时)对每个合胞体的核的数目进行计数，在显微镜下测定合胞体。
如本文使用的，术语“干扰素拮抗剂”是指降低或抑制细胞的干扰素免疫反应的试剂。在一个实施方式中，干扰素拮抗剂是降低或抑制细胞的干扰素免疫反应的蛋白质性试剂。在具体的实施方式中，干扰素拮抗剂是降低或抑制细胞的干扰素反应的病毒蛋白质或多肽。
在具体的实施方式中，干扰素拮抗剂是降低或抑制干扰素表达和/或活性的试剂。在一个实施方式中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制I型IFN的表达和/或活性。在另一个实施方式中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制II型IFN的表达和/或活性。在另一个实施方式中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制III型IFN的表达和/或活性。在具体的实施方式中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制IFN-α、IFN-β或两者的表达和/或活性。在另一个具体的实施方式中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制INF-γ的表达和/或活性。在另一个实施方式中，所述干扰素拮抗剂降低或抑制IFN-α、IFN-β和IFN-γ的一种、两者或全部的表达和/或活性。
在某些实施方式中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的技术测量的，相对于不表达、或不接触这样的干扰素拮抗剂的对照含胚卵或细胞中的IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性，干扰素拮抗剂降低含胚卵或细胞中的IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性大约1到大约100倍、大约5到大约80倍、大约20到大约80倍、大约1到大约10倍、大约1到大约5倍、大约40到大约80倍、或1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。在某些实施方式中，按照本文描述的或本领域技术人员已知的技术测量的，相对于不表达、或不接触这样的干扰素拮抗剂的对照含胚卵或细胞中的IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性，干扰素拮抗剂降低含胚卵或细胞中的IFN-α、IFN-β和/或IFN-γ的表达和/或活性至少20％到25％、至少25％到30％、至少30％到35％、至少35％到40％、至少40％到45％、至少45％到50％、至少50％到55％、至少55％到60％、至少60％到65％、至少65％到70％、至少70％到75％、至少75％到80％、至少80％到85％、至少85％到90％、至少90％到95％、至少95％到99％、或20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％。
如本文使用的，用语“IFN缺陷系统”或“IFN缺陷底物”是指例如细胞、细胞系和动物(例如小鼠、鸡、火鸡、兔、大鼠、马等)的系统，其不产生一种、两种或更多种类型的IFN，或不产生任何类型的IFN，或产生低水平的一种、两种或更多种类型的IFN，或产生低水平的任何IFN(即，与相同条件下的IFN完全系统相比，任何IFN表达的5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％或更高的降低)，不响应或降低效地响应一种、两种或更多种类型的IFN，不响应任何类型的IFN，对一种、两种或更多种类型的IFN具有延迟的响应，和/或在由一种、两种或更多种类型的IFN诱导的、或任何类型的IFN诱导的抗病毒基因的活性方面有缺陷。
“白细胞介素-12”和“IL-12”是指本领域技术人员已知的任何IL-12。在某些实施方式中，所述IL-12可以是人类、狗、猫、马、猪或奶牛的IL-12。在具体的实施方式中，所述IL-12是人类IL-12。典型的IL-12由两个独立的基因IL-12A(p35亚基)和IL-12B(p40亚基)编码的异二聚体组成，是本领域技术人员已知的。GenBankTM登记号NM_000882.3(GI编号325974478)提供了示范性的人类IL-12A核酸序列。GenBankTM登记号NM_002187.2(GI编号24497437)提供了示范性的人类IL-12B核酸序列。GenBankTM登记号NP000873.2(GI编号24430219)提供了示范性的人类IL-12A(p35亚基)氨基酸序列。GenBankTM登记号NP_002178.2(GI编号24497438)提供了示范性的人类IL-12B(p40亚基)氨基酸序列。在某些实施方式中，IL-12由单个多肽链组成，包含p35亚基和p40亚基，任选地由接头序列分隔(例如，SEQ ID NO:24和46-49的任一个)。在优选的实施方式中，IL-12包含章节6中提供了p35和p40亚基序列，例如，分别为SEQ ID NO:25和23，或分别为SEQ ID NO:41和40。在某些实施方式中，IL-12由四元缀合的超过一个多肽链例如p35和p40组成。如本文使用的，术语“白细胞介素-12”和“IL-12”涵盖通过翻译后加工，例如信号肽裂解、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的糖基化)、蛋白酶裂解和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)被修饰的白细胞介素-12多肽。在某些实施方式中，IL-12的亚基或由单个多肽链组成的IL-12之一或两者包括信号序列。在其他实施方式中，IL-12的亚基或由单个多肽链组成的IL-12之一或两者不包括信号序列。所述信号序列可以是天然发生的信号肽序列或其变体。在某些实施方式中，所述信号肽是IL-12信号肽。在某些实施方式中，所述信号肽对于IL-12信号肽是异源的。
如本文使用的，在抗体的上下文中，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”是类似的术语，是指特异性结合抗体(例如，表位或免疫复合物)的分子，这是本领域技术人员理解的。通过例如免疫分析(例如，ELISA)、表面等离子体共振(例如，
Figure BDA0002363284960000201
)、KinEx分析(使用例如，KinExA 3000仪器(Sapidyne Instruments，Boise，ID))或本领域抑制的其他分析所测定的，特异性结合抗原的分子可以以较低的亲和力结合其他肽或多肽。在具体的实施方式中，与分子结合其他抗原时的Ka相比，特异性结合抗原的分子以至少2logs、2.5logs、3logs、3.5logs、4logs或更大的解离常数(即，Ka)结合抗原。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”是一种技术术语，一般是指从同质的或基本上同质的抗体的群体获得的抗体，每个单克隆抗体一般将识别抗原上的单个表位(例如，单个构象表位)。
如本文使用的，用语“感染复数”或“MOI”是每个被感染细胞的病毒的平均数量。MOI通过用添加的病毒的数量(添加的ml×Pfu)除以添加的细胞的数量(添加的ml×细胞/ml)来确定。
如本文使用的，术语“天然配体”是指结合天然发生的受体的任何天然发生的配体。在具体的实施方式中，所述配体是哺乳动物配体。在另一个具体的实施方式中，所述配体是人类配体。
如本文使用的，在蛋白质或多肽的上下文中术语“天然多肽”是指任何天然发生的氨基酸序列，包括蛋白质的不成熟形式、前体形式和成熟形式。在具体的实施方式中，所述天然多肽是人类蛋白质或多肽。
如本文使用的，术语“天然受体”是指结合天然发生的配体的任何天然发生的受体。在具体的实施方式中，所述受体是哺乳动物受体。在另一个具体的实施方式中，所述受体是人类受体。
“程序性细胞死亡蛋白1”、“PD1”和“PD-1”是指本领域技术人员已知的任何PD-1。在某些实施方式中，PD-1可以是人类、狗、猫、马、猪或牛的PD-1。在具体的实施方式中，所述PD-1是人类PD-1。GenBankTM登记号NM005018.2(GI编号167857791)提供了示范性的人类PD-1核酸序列。GenBankTM登记号NP005009.2(GI编号167857792)提供了示范性的人类PD-1氨基酸序列。PD-1的配体包括程序性死亡配体1(也称为“PD-L1”、“PDL1”、“分化聚簇274”、“CD274”、“B7同源物1”、和“B7-H1”)和程序性细胞死亡1配体2(也称为“PDL2”、“PD-L2”和“B7-DC”)。PD-L1是指本领域技术人员已知的任何PD-L1。在某些实施方式中，所述PD-L1可以是人类、狗、猫、马、猪或牛的PD-L1。在具体的实施方式中，所述PD-L1是人类PD-L1。GenBankTM登记号NM_001314029.1、NM_001267706.1和NM_014143.3(GI编号分别为930425328、390979638和292658763)提供了示范性的人类PD-L1核酸序列。GenBankTM登记号NP_001300958.1、NP_001254635.1和NP_054862.1(GI编号分别为930425329、390979639和7661534)提供了示范性的人类PD-L1氨基酸序列。PD-L2是指本领域技术人员已知的任何PD-L2。在某些实施方式中，所述PD-L2可以是人类、狗、猫、马、猪或牛的PD-L2。在具体的实施方式中，所述PD-L2是人类PD-L2。GenBankTM登记号NM025239.3(GI编号190014604)提供了示范性的人类PD-L2核酸序列。GenBankTM登记号NP079515.2(GI编号190014605)提供了示范性的人类PD-L2氨基酸序列。如本文使用的，PD-1、PD-L1和PD-L2分别涵盖通过翻译后加工例如信号肽裂解、二硫键形成、糖基化(例如，N-连接的糖基化)、蛋白酶裂解和脂质修饰(例如，S-棕榈酰化)而修饰的PD-1、PD-L1和PD-L2多肽。在某些实施方式中，PD-1、PD-L1和PD-L2分别包括具有信号序列的PD-1、PD-L1和PD-L2多肽。在其他实施方式中，PD-1、PD-L1和PD-L2分别包括不包括信号序列的PD-1、PD-L1和PD-L2多肽。关于PD-1的结构的信息，包括关于PD-1的信号序列的信息，参见例如，(Ishida等，1992，EMBO J.11:3887-3895andShinohara等，1994，Genomics 23:704-706每一个通过引用以其整体合并在本文中)。当在PD-1或其配体的抗体的上下文中使用时，所述抗体靶向PD-1、PD-L1或PD-L2的成熟形式。
“难治性”是领域公认的术语，其一般是指不响应治疗的癌症，即，在“治疗”下不接受所描述的有益效果。所述癌症可以是在开始治疗时是抗性的，或它可以在治疗期间变得有抗性。
“复发的”是领域公认的术语，其一般是指如下所述的通过治疗的一段时间改善之后疾病或疾病的体征和症状的回返。
如本文使用的，术语“对象”或“患者”可以互换地使用。如本文使用的，术语“对象”是指动物。在某些实施方式中，所述对象是哺乳动物，包括非灵长类(例如，骆驼、驴、斑马、牛、马、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类(例如，猴、黑猩猩和人类)。在某些实施方式中，所述对象是非人哺乳动物。在某些实施方式中，所述对象是宠物(例如，狗或猫)或农畜(例如，马、猪或牛)。在其他实施方式中，所述对象是人类。在某些实施方式中，所述哺乳动物(例如，人类)是0到6个月大、6到12个月大、1到5岁、5到10岁、10到15岁、15到20岁、20到25岁、25到30岁、30到35岁、35到40岁、40到45岁、45到50岁、50到55岁、55到60岁、60到65岁、65到70岁、70到75岁、75到80岁、80到85岁、85到90岁、90到95岁或95到100岁。在具体的实施方式中，所述对象是非鸟类的动物。
如本文使用的，在施用治疗的上下文中术语“治疗”(treat、treatment、treating)是指对象可以从中接受有益影响的治疗/疗法，例如，癌症或其症状的减少、降低、减弱、消除、稳定、缓解、压抑、抑制或延滞。在某些实施方式中，对象接受的所述治疗/疗法引起至少一种或更多种以下的作用:(i)癌症和/或与之相关的症状的严重度的降低或改善；(ii)与癌症相关的症状的持续时间的降低；(iii)防止与癌症相关的症状的复发；(iv)癌症和/或与之相关的症状的消退；(v)对象的住院的减少；(vi)住院时间的减少；(vii)对象的存活的提高；(viii)抑制癌症和/或与之相关的症状的发展；(ix)增强或改善另一种治疗的治疗效果；(x)降低或消除癌细胞群体；(xi)肿瘤或赘生物的生长的降低；(xii)肿瘤大小的降低；(xiii)肿瘤形成的降低；(xiv)原发的、局部的和/或转移性癌症的根除、移除或控制；(xv)转移的数量或大小的降低；(xvi)死亡率的降低；(xvii)患者的无癌症存活率的提高；(xviii)无复发存活的提高；(xix)症状缓解的患者的数量提高；(xx)住院率的降低；(xxi)通过本领域技术人员可利用的常规方法，例如MRI、X射线、CT扫描和PET扫描来测量的，在施用治疗后，肿瘤的大小得以维持并且大小不增加，或肿瘤大小的提高小于5％或10％；(xxii)防止癌症和/或与之相关的症状的发展或发作；(xxiii)患者的症状缓解的时长的提高；(xxiv)与癌症相关的症状的数目降低；(xxv)癌症患者的无症状存活的提高；(xxvi)转移的限制或降低；(xxvii)总体存活；(xxviii)无进展存活(例如通过RECIST v1.1评估的)；(xxix)总体响应率；和/或(xxx)响应持续时间的提高。在某些实施方式中，对象接受的治疗/疗法不治愈癌症，但是防止疾病的发展或恶化。在某些实施方式中，对象接受的治疗/疗法不防止癌症的发作/发展，但可以防止癌症症状的发作。熟练的技术人员已知的任何方法可以用于评估对象接受的治疗/疗法。在具体的实施方式中，根据根据实体瘤反应评价标准(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors,“RECIST”)公布的规则评价治疗/疗法。在具体的实施方式中，根据2000年2月公开的RECIST规则(也称为“RECIST 1”)评估所述治疗/疗法(see，e.g.，参见，例如Therasse等，2000，Journal of National CancerInstitute，92(3):205-216，通过引用以其整体合并在本文中)。在具体的实施方式中，根据2009年1月公开的RECIST规则(也称为“RECIST 1.1”)评估所述治疗/疗法。(参见，例如Eisenhauer等，2009，European Journal of Cancer，45:228-247，通过引用以其整体合并在本文中)。在具体的实施方式中，根据评估之时熟练的技术人员使用的RECIST规则评估所述治疗/疗法。在具体的实施方式中，根据免疫相关的RECIST(“irRECIST”)公开的规则评估所述治疗/疗法(参见，例如，Bohnsack等，2014，ESMO Abstract 4958，通过引用以其整体合并在本文中)。在具体的实施方式中，根据评估之时熟练的技术人员使用的irRECIST规则评估所述治疗/疗法。在具体的实施方式中，根据Lugano指标评估所述治疗/疗法。在具体的实施方式中，通过肿瘤相关血清标志物，例如CA-125、CEA、CA-19-9、PSA、AFP、抑制素A、抑制素B HCG、CA 15-3、甲状腺球蛋白、HE4的降低来评估所述治疗/疗法。
如本文使用的，在向对象施用疗法的上下文中术语“组合”是指使用超过一种疗法。使用术语“组合”不限制向对象施用的疗法的顺序。第一疗法可以在向对象施用第二疗法之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、相伴地、或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用。例如，本文描述的嵌合NDV可以在施用PD-1或其配体的拮抗剂之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、相伴地、或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)施用。
如本文使用的，术语“疗法”可以指用于治疗癌症的任何方案、方法和/或药剂。在某些实施方式中，术语“疗法”是指生物学疗法、支持疗法、激素疗法、化疗、免疫疗法和/或在治疗癌症中有用的其他疗法。在具体的实施方式中，疗法包括佐剂疗法。例如，与药物疗法、生物学疗法、手术和/或支持疗法一起使用疗法。在某些实施方式中，术语“疗法”是指本文描述的嵌合NDV。在其他实施方式中，术语“疗法”是指不是嵌合NDV的药剂。在某些实施方式中，术语“疗法”是指PD-1或其配体的拮抗剂。在其他实施方式中，术语“疗法”是指不是PD-1或其配体的拮抗剂的药剂。在某些实施方式中，术语“疗法”是指本文描述的嵌合NDV和PD-1或其配体的拮抗剂。在某些实施方式中，术语“疗法”是指既不是本文描述的嵌合NDV也不是PD-1或其配体的拮抗剂的药剂。
4.附图的简要说明
图1.NDV感染上调体外感染的B16F10细胞的表面上MHC I、MHC II和ICAM-1的表达(感染后24小时)。
图2A-2E.肿瘤内NDV处理引起巨噬细胞、NK细胞、CD8和CD4效应细胞的浸润，并降低Tregs的频率。图2A)总体研究方案。图2B)总CD45+浸润。图2C)总免疫细胞浸润。图2D)相对CD4 FoxP3+和FoxP3-子集的代表性的流式细胞术点图。图2E)Teff/Treg和CD8/Treg比例。
图3A-3C.NDV治疗展现了对远端肿瘤的肿瘤微环境的良好的作用。图3A)相对CD4FoxP3+和FoxP3-子集的代表性的流式细胞术点图。图3B)每克肿瘤的CD4效应物、Treg和CD8细胞的绝对数量。图3C)Teff/Treg和CD8/Treg比例。
图4A-4C.淋巴细胞浸润远端肿瘤上调活化、溶胞和增殖标志物。显示了CD4效应物细胞上的代表性表达绘图(上部)以及CD4效应物、CD8、Tregs(底部)中相应的百分比，附图4A)，CD44，附图4B)，颗粒酶B，以及附图4C)，Ki-67。
附图5A-D.NDV单一治疗延迟了远端肿瘤的生长并提供了对肿瘤再激发的一定保护。如附图2A中描述的建立双侧腹部肿瘤，治疗动物并跟踪存活。附图5A)，右侧腹(治疗的)肿瘤的生长。附图5B)左侧腹(无治疗的)肿瘤的生长。附图5C)总体存活。方框中的数字代表无肿瘤动物的百分比。附图5D)，在第75天用B16F10黑素瘤细胞再次激发的、NDV治愈B16F10黑素瘤的动物中的存活。10只小鼠每组的两个不同实验的代表性结果。
附图5E-5F.来自治疗和无治疗的肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞都响应于NDV疗法上调CTLA-4。附图5E)右侧(治疗的)肿瘤中CD8、CD4效应物和Treg中的CTLA-4表达的代表性的点图。附图5F)左侧(无治疗的)肿瘤中CD8、CD4效应物和Treg中的CTLA-4表达的代表性的点图。
附图6A-6C.NDV感染上调B16F10肿瘤中的PD-L1表达。附图6A)感染NDV24小时的B16F10细胞上的表面PD-L1表达。附图6B)用来自感染的B16F10细胞的UV灭活上清液处理的B16F10细胞上的表面PD-L1表达。附图6C)从来自附图2A中治疗的动物的注射的和远端肿瘤分离的肿瘤细胞的表面上PD-L1的上调(2个左侧画面-代表性的流式细胞术图，右侧画面-每组5只小鼠的计算的平均值)。
附图7A-7F.NDV和抗PD-1的组合疗法针对B16黑素瘤是全身地有效的，引起具有活化标志物上调的提高的T细胞浸润。附图7A)总体存活。动物如附图2A中描述的有或者没有抗PD-1抗体地治疗。附图7B)肿瘤中CD45、CD3、CD8和CD4效应细胞的绝对数量。附图7C)肿瘤浸润性淋巴细胞中调节性T细胞的相对百分比。附图7D和附图7E)来自远端肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞进行分离，对于ICOS(附图7D)和颗粒酶B(附图7E)的表达进行染色。附图7F)肿瘤浸润性淋巴细胞用加载了肿瘤溶胞产物的树突细胞再刺激，通过细胞内的细胞因子染色评估IFNγ表达。
附图8A-8D.NDV感染限制于注射的肿瘤。附图8A)重组NDV-Fluc肿瘤内地(IT)或静脉内地(IV)施用给带有CT26肿瘤的Balb/C动物，在接下来72小时获取图像。附图8B)NDV-Fluc施用给带有双侧B16F10黑素瘤肿瘤的C57BL/6小鼠，监视动物120小时。显示了代表性的荧光图像。附图8C)对于背景荧光归一化的、来自肿瘤位点的荧光的定量。附图8D)从画面(附图8C)中的数据计算的曲线下面积(AUC)。数据显示了来自3-5只小鼠/组的3个独立实验之一的代表性结果。***p<0.001(p<0.05指示统计显著性)。
附图9A-9F.NDV感染提高了病毒注射的肿瘤中的肿瘤白细胞浸润。根据附图10A中描述的方案治疗动物。在第15天切除肿瘤，标记TIL，通过流式细胞术进行分析。附图9A)肿瘤浸润性CD45+和CD3+细胞的百分比的代表性的流式细胞术图。附图9B)每克肿瘤的CD45+细胞的绝对数量。附图9C)每克肿瘤的先天免疫细胞的绝对数量。附图9D)CD4+FoxP3+(Treg)和CD4+FoxP3-(T conv)细胞的百分比的代表性的图。附图9E)每克肿瘤的常规和调节性CD4+细胞和CD8+细胞的绝对数量。附图9F)来自肿瘤的计算的Tconv/Treg和CD8+/Treg比例。数据代表来自3-5只小鼠每组的3个独立实验的累积结果。显示了平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
附图10A-10M.NDV提高远端肿瘤淋巴细胞浸润并延迟肿瘤生长。附图10A)治疗方案。附图10B)肿瘤浸润性CD45+和CD3+细胞的百分比的代表性的流式细胞术图。附图10C)每克肿瘤的CD45+细胞的绝对数量。附图10D)每克肿瘤的先天免疫细胞的绝对数量。附图10E)来自远端肿瘤的肿瘤切片用H&E染色(上部画面)或对CD3和FoxP3标记(底部画面)，通过显微镜检查进行分析。箭头指出的区域表示坏死和炎症性浸润的区域。比例尺代表200μm。附图10F)CD4+FoxP3+(Treg)和CD4+FoxP3-(Tconv)细胞的百分比的代表性的流式细胞术图。附图10G)根据流式细胞术计算的、每克肿瘤的常规和调节性CD4+细胞和CD8+细胞的绝对数量。附图10G)CD45+细胞中Tregs的相对百分比。附图10I)计算的Tconv/Treg和CD8+/Treg比例。(附图10J和附图10K)肿瘤浸润性Tconv(附图10J)和CD8+细胞(附图10K)上ICOS、颗粒酶B和Ki-67的上调。附图10L)NDV注射的和远端肿瘤的生长。附图10M)总体动物存活。数据代表n＝3-5每组的3个(附图10B-10K)或2个(附图10L-10M)独立实验的累积结果。显示了平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
附图11A-11E.在双侧爪垫黑素瘤模型中NDV疗法提高了远端肿瘤淋巴细胞浸润。带有双侧爪垫黑素瘤肿瘤的动物根据附图10A中描述的日程治疗。在第15天切除远端肿瘤，标记TIL，通过流式细胞术进行分析。附图11A)肿瘤浸润性CD45+和CD3+细胞的百分比的代表性的流式细胞术图。附图11B)CD4+FoxP3+和CD4+FoxP3-细胞的百分比的代表性的流式细胞术图。附图11C)每克肿瘤的常规和调节性CD4+细胞和CD8+细胞的绝对数量。(附图11D和附图11E)肿瘤浸润性CD8+(附图11D)和Tconv(附图11E)淋巴细胞上ICOS、颗粒酶B和Ki-67的上调。数据显示了来自5只小鼠/组的2个独立实验之一的代表性结果。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
附图12A-12I.NDV诱导过继转移的肿瘤特异性淋巴细胞的浸润并促进肿瘤炎症。附图12A)治疗方案。附图12B)来自用NDV以及过继转移的Trp1-Fluc淋巴细胞治疗的动物的代表性的荧光图像。附图12C)来自肿瘤位点的平均荧光的定量。附图12D)从画面附图12C中的数据计算的曲线下面积(AUC)。附图12E)根据流式细胞术计算的来自远端肿瘤的Pmel淋巴细胞的绝对数量。附图12F)附图12A中的每种治疗方案治疗的动物的CD45+和CD3+细胞浸润性远端肿瘤的百分比的代表性的流式细胞术图。附图12G)用NDV或PBS的单次注射肿瘤内地治疗的动物的血清转移的实验方案。附图12H)浸润血清注射的肿瘤的CD45+和CD3+细胞百分比的代表性的流式细胞术图。附图12I)根据流式细胞术计算的、血清注射的肿瘤中指定细胞子集的绝对数量。附图12B-12E的数据代表n＝4-5每组的3个实验之一。附图12G-12I的数据代表来自n＝5每组的2个独立实验的合并数据。显示了平均值±SEM。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
附图13.肿瘤内NDV提供了对肿瘤再激发的保护。通过NDV由B16F10黑素瘤痊愈的动物在第75天用1×105个B16F10黑素瘤细胞注射，监视肿瘤生长，在肿瘤达到1000mm3时安乐死。显示了总体动物存活。数据显示了来自10只小鼠/组的2个独立实验之一的累积的结果。****p<0.0001.
附图14A-14B.肿瘤浸润性CD8+淋巴细胞响应于NDV疗法上调CTLA-4。在NDV治疗的(附图14A)和远端(附图14B)肿瘤中CD8+细胞中CTLA-4表达的代表性的点图(左侧)和累积结果(右侧)。来自3只小鼠每组的3个实验之一的代表性结果。*p<0.05.
附图15A-15B.NDV疗法引起肿瘤和肿瘤浸润性白细胞上PD-L1的上调。附图15A)体外感染的(左侧画面)和体内病毒注射的和远端肿瘤中B16F10细胞上的PD-L1表达。顶部，来自肿瘤的B16F10细胞上PD-L1表达的代表性的流式细胞术直方图，底部，平均值中值荧光强度(MFI)。附图15B)从远端肿瘤分离的肿瘤浸润性白细胞的表面上的PD-L1表达。顶部:代表性的流式细胞术直方图，底部:每个细胞子集的计算的平均值MFI。
附图16A-16D.NDV与阻断PD-1的抗体的组合疗法在双侧腹部B16黑素瘤模型中产生增强的抗肿瘤效力。附图16A)治疗方案。附图16B)右侧腹(NDV注射的)肿瘤生长。附图16C)左侧腹(远端)肿瘤生长。附图16D)总体存活。
附图17A-17D.NDV与阻断PD-L1的抗体的组合疗法在双侧腹部B16黑素瘤模型中产生增强的抗肿瘤效力。附图17A)治疗方案。附图17B)右侧腹(NDV注射的)肿瘤生长。附图17C)左侧腹(远端)肿瘤生长。附图17D)总体存活。
附图18A-18E.NDV和抗PD-1疗法的组合疗法引起效应物而不是调节性T细胞的提高的远端肿瘤浸润。附图18A)肿瘤中CD4+和CD8+细胞的百分比的代表性的流式细胞术图。附图18B)Tconv(CD4+FoxP3-)和Treg(CD4+FoxP3+)细胞的百分比的代表性的流式细胞术图。附图18C)由流式细胞术计算的每克肿瘤的T细胞子集的绝对数量。附图18D)来自CD4+T细胞的Tregs的相对百分比。附图18E)计算的Tconv/Treg和CD8/Treg比例。
附图19A-19B.来自用组合NDV和抗PD-1疗法治疗的动物的远端肿瘤的TIL上调溶胞和增殖标志物。附图19A)颗粒酶B和Ki67阳性的Tconv和CD8淋巴细胞的百分比的代表性的流式细胞术图。附图19B)颗粒酶B和Ki67阳性的Tconv和CD8+ T细胞的百分比。
附图20A-20C.NDV诱导病毒注射的和远端肿瘤中的肿瘤免疫浸润以及CD4和CD8细胞上ICOS的上调。附图20A)治疗方案。附图20B)从NDV注射的(右侧腹)肿瘤分离的肿瘤浸润性CD4+FoxP3-和CD8+细胞上的ICOS表达。显示了代表性的流式细胞术图(顶部)和中值荧光强度(MFI)(底部)。附图20C)从远端(左侧腹)肿瘤分离的肿瘤浸润性CD4+FoxP3-和CD8+细胞上的ICOS表达。显示了代表性的流式细胞术图(顶部)和中值荧光强度(MFI)(底部)。
附图21:pT7NDV-LS-L289A质粒的示意图。
附图22A-22D:在B16F10双侧肿瘤模型中与抗muPD-1mAbmuDX400组合的肿瘤内NDV-muIL-12的增强的抗肿瘤效力。小鼠B16F10细胞皮下地植入到免疫活性的C57BL/6J小鼠的右侧腹(2×105个细胞)和左侧腹(1×105个细胞)。在植入后9天(第0天)根据右侧腹(注射的肿瘤)的肿瘤体积(TV)将动物分组，中值TV＝65mm3。6个组的左侧腹(无注射肿瘤)的中值TV为31到38mm3。在第0天启动给药。10mg/kg的小鼠IgG1同种型对照和muDX400每4天腹膜内施用总共3剂。1×107pfu的PBS、NDV WT和NDV-muIL-12每2天施用到右侧腹的肿瘤中总共4剂。每个组中有10只动物。附图22A-22B:分别呈现了注射的肿瘤和无注射肿瘤的生长曲线。肿瘤体积(“TV”)表示为68％置信区间的中值。附图22C和22D:分别呈现了注射的和无注射肿瘤在第13天的单个动物的TV。点线表示第0天的中值TV。标明了图例比较的p值(p<0.05表示统计显著性)。组1:mIgGl对照+PBS；组2:muDX400+PBS；组3:mIgG11对照+NDV-WT；组4:muDX400+NDV-WT；组5:mIgG对照+NDV-muIL-12；组6:muDX400+NDV-muIL-12。对于注射的肿瘤，完全消退的数量如下:组1:0例；组2:0例；组3:1例；组4:1例；组5:2例；和组6:6例。对于注射的肿瘤，完全消退的数量如下:组1:0例；组2:1例；组3:1例；组4:3例；组5:0例；和组6:5例。
附图23A-23D:如附图22A-22D的图例中描述的B16F10双侧肿瘤模型中与抗muPD-1mAbmuDX400组合的用肿瘤内NDVNDV-muIL 12注射的肿瘤中免疫基因的诱导。实验设计在章节6.3.1.9和6.3.1.13中描述。在第14天收获肿瘤，通过RTqPCR评估肿瘤组织中的基因表达，对于遍在蛋白进行归一化。呈现了注射的肿瘤中T细胞标志物(附图23A)、细胞因子(附图23B)、IFN可诱导基因(附图23C)和PD-1以及PD-L1(附图23D)的基因的单个动物表达水平。线代表平均值。对于组3和5、4和6、以及5和6之间的比较，标出了<0.05的p值。
附图24A-24D:如附图22A-22D的图例中描述的B16F10双侧肿瘤模型中与抗muPD-1mAbmuDX400组合的肿瘤内NDVNDV-muIL 12的无注射肿瘤中免疫基因的诱导。实验设计在章节6.3.1.9和6.3.1.13中描述。在第14天收获肿瘤，通过RTqPCR评估肿瘤组织中的基因表达，对于遍在蛋白进行归一化。呈现了无注射肿瘤中T细胞标志物(附图24A)、细胞因子(附图24B)、IFN可诱导基因(附图24C)和PD-1以及PD-L1(附图24D)的基因的单个动物表达水平。线代表平均值。标出了<0.05的p值。
附图25A和25B:与抗muPD-1mAb muDX400组合的NDV-muIL 12治疗提高了带有B16F10的动物的存活。小鼠B16F10细胞皮下地植入到免疫活性的C57BL/6J小鼠的右侧腹(2×105个细胞)和左侧腹(1×105个细胞)。在植入后7天(第0天)根据右侧腹(注射的肿瘤)的肿瘤体积(TV)将动物分配到组中，中值TV＝56mm3。左侧腹(无注射肿瘤)的中值TV是38mm3。在第0天启动给药。10mg/kg的小鼠IgG1同种型对照和muDX400每4天腹膜内施用总共3剂。1×107pfu的PBS、NDV-WT和NDV-muIL-12每2天施用到右侧腹的肿瘤中总共4剂。跟踪动物到第54天。当注射和无注射肿瘤的体积总和>2000mm3或体重损失>20％时将动物安乐死。每组中10只动物。附图25A显示了组1(mIgG1对照+PBS)、2(mIgG1对照+NDV-WT)和5(mIgG1对照+NDV-muIL-12)的存活曲线。附图25B显示了组2(muDX400+PBS)、4(muDX400+NDV-WT)和6(muDX400+NDV-muIL-12)的存活曲线。
附图26A和26B:B16F10双侧肿瘤模型中与抗muPD-1mAb muDX400组合的肿瘤内NDV-muIL-12的注射的和无注射肿瘤的肿瘤中CD3+ T细胞的提高的浸润。小鼠B16F10细胞皮下地植入到免疫活性的C57BL/6J小鼠的右侧腹(2×105个细胞)和左侧腹(1×105个细胞)。在植入后8天(第0天)根据右侧腹(注射的肿瘤)的肿瘤体积(TV)将动物分配到组中，平均TV＝108mm3。左侧腹的平均TV＝63mm3。在第0天启动给药。10mg/kg的小鼠IgG1同种型对照和muDX600每6天腹膜内施用总共2剂。1×107pfu的PBS、NDV WT和NDV-muIL-12每2天施用到右侧腹的肿瘤中总共4剂。实验设计在章节6.3.1.9和6.3.1.10中描述。显示了第8天的注射的肿瘤(附图26A)和无注射肿瘤(附图26B)的代表性的图像。
附图27A:26种人类癌细胞系中NDV-huIL-12的溶胞活性:黑素瘤(n＝3)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC，n＝4)、肺癌(n＝4)、乳腺癌(n＝3)、卵巢癌(n＝3)、结肠癌(n＝4)和胰腺癌(n＝5)。以MOI 2和6用NDV-huIL-12感染细胞，在感染后48小时测定细胞生存力。生存力表示为相对于未感染的细胞在感染的细胞中活细胞的百分比。将用DMSO中的10μM嘌呤霉素处理包括在内作为细胞杀死的阳性对照；生存力表示为相对于DMSO处理的活细胞的百分比。值表示为8个副本的平均值±平均标准误差。点线表示细胞生存力20％降低的截止值。DMSO＝二甲亚砜。MOI＝感染复数。
附图27B:26种人类癌细胞系的面板中IL-12p70、IFN-γ和IP-10的诱导。一系列人类肿瘤细胞系中模拟感染(白色柱条)或用NDV-huIL-12(MOI＝2)感染(黑色柱条)之后48小时收获上清液:黑素瘤(n＝3)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC，n＝4)、肺癌(n＝4)、乳腺癌(n＝3)、卵巢癌(n＝3)、结肠癌(n＝4)和胰腺癌(n＝5)。使用免疫分析测试上清液的各种细胞因子和趋化因子的蛋白质浓度。显示的是IL-12p70(顶部)、IFN-β(中部)和IP-10(底部)的4个副本的平均值±平均标准误差。点线表示LLOQ和ULOQ:IL 12p70(LLOQ＝5pg/mL和ULOQ＝5580pg/mL)、IFN-β(LLOQ＝98pg/mL)以及IP-10(LLOQ＝2pg/mL和ULOQ＝9040pg/mL)。LLOQ＝定量的下限；MOI＝感染复数；ULOQ＝定量的上限。
附图28:用NDV-huIL-12处理的人类肿瘤组织培养中IFN-α-2a、IL-12、IFN-γ和IP-10的诱导。肾细胞癌(RCC，n＝4)、结肠直肠癌(CRC，n＝3)、乳腺癌(n＝2)和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC；n＝1)的样品不处理(培养基)或用3×107pfu NDV-WT或NDV-huIL-12处理达到48小时。从组织培养中采集上清液，用于使用免疫分析评估各种细胞因子和趋化因子的蛋白质浓度。显示的是IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70、IFN-γ和IP-10的平均值±平均标准误差(Wilcoxon符号秩检验，标出了p值<0.05)。点线表示LLOQ值:IFN-α-2a＝2.4pg/mL，IFN-β＝24pg/mL，IL-12p70＝2.4pg/mL。除了IP-10之外，其中上清液在24小时时采集并以1:15的稀释度进行分析，对48小时时间点采集的未稀释的上清液显示了数据。LLOQ＝定量的下限。
附图29A-29D:用NDV-huIL-12处理的人类肿瘤组织培养中IFN可诱导操纵基因、趋化因子、Il-12p40、Ifn-γ和PD-l1(编码PD-L1的基因)的基因表达的诱导。肾细胞癌(RCC，n＝4)、结肠直肠癌(CRC，n＝3)、乳腺癌(n＝2)和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC，n＝1)的样品不处理(培养基)或用3×107pfu NDV-WT或NDV-huIL-12处理达到48小时。将样品急速冷冻，在RNA分离之后，使用Fluidigm RTqPCR平台分析免疫基因的面板的基因表达。显示的是48小时时间点的IFN可诱导基因(附图29A)、趋化因子(附图29B)、Il-12p40和Ifn-γ(附图29C)和Pd-l1(附图29D)的对于遍在蛋白归一化的值的平均值±平均标准误差(Wilcoxon符号秩检验，标出了<0.05的p值)。
附图30:用NDV-huIL 12处理的人类全血中IFN-α-2a、IL-12p70、IFN-γ和IP-10的诱导。来自具有实体癌症的患者(n＝5)和正常的健康供体(n＝5)的全血(1mL)不处理(培养基)或用3×107pfu NDV-WT或NDV-huIL-12处理48小时。采集血浆，用于使用免疫分析评估各种细胞因子和趋化因子的蛋白质浓度。显示的是IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70、IFN-γ和IP-10的平均值±平均标准误差(Wilcoxon符号秩检验，标出了<0.05的p值)。点线表示LLOQ或ULOQ值:IFN-α-2a(LLOQ)＝2.4pg/mL，IFN-β(LLOQ)＝24pg/mL，IP-10(ULOQ)＝2610pg/mL。显示的是在48小时时间点采集的未稀释的上清液的值。LLQO＝定量的下限；ULOQ＝定量的上限。
附图31A-31D:用NDV-huIL 12处理的人类全血中IFN可诱导操纵基因、趋化因子、Il-12p40、Ifn-γ和PD-l1的基因表达的诱导。来自具有实体癌症的患者(n＝5)和正常的健康供体(n＝5)的全血(4mL)不处理(培养基)或用3×107pfu NDV-WT或NDV-huIL-12处理24小时。将全血采集到PAXgene血液RNA试管中，在RNA分离之后，使用Fluidigm RTqPCR平台分析免疫基因的面板的基因表达。显示的是24小时时间点的IFN可诱导基因(附图31A)、趋化因子(附图31B)、Il-12p40和Ifn-γ(附图31C)和Pd-l1(附图31D)的对于遍在蛋白归一化的值的平均值±平均标准误差(Wilcoxon符号秩检验，标出了<0.05的p值)。
附图32:流式病毒计的NDV-huIL-12分析
附图33:还原SDS-PAGE的NDV-huIL-12分析。MW:分子量标志物；CB:澄清的部分；和SFP:无菌过滤的产物。
附图34:NDV-huIL-12感染Vero细胞24小时之后的MOI依赖性huIL-12表达曲线。
附图35:使用
Figure BDA0002363284960000311
Bioassay Detection试剂盒的huIL-12诱导的受体二聚化。每个曲线代表以指定的MOI的NDV-huIL-12感染24小时后Vero细胞产生的huIL-12的滴度。
附图36:BSRT7细胞和尿囊液中的rNDV-mIL12表达。Y轴是使用商业上可获得的ELISA试剂盒(小鼠IL-12p70 Quantikine ELISA试剂盒，R&D Systems，目录号M1270)测定的按照pg/mL的muIL-12的浓度。从左至右:NDV-WT(阴性对照)、NDV-muIL-12(MOI＝3，24hpi)、NDV-muIL-12(MOI＝10，24hpi)、NDV-muIL-12(MOI＝3，48hpi)，NDV-muIL-12(MOI＝10，48hpi)感染的BSRT7细胞、或来自NDV-muIL-12感染的蛋的尿囊液。MOI＝感染复数。hpi＝感染后的小时数。
附图37A-37N:在B16F10双侧肿瘤模型中与抗muPD-1mAbmuDX400组合的NDV-muIL-12对比NDV-muIL-23或NDV-muIL-27的增强的抗肿瘤效力。小鼠B16F10细胞皮下地植入到免疫活性的C57BL/6J小鼠的右侧腹(2×105个细胞)和左侧腹(1×105个细胞)。在植入后9天(第0天)根据右侧腹(注射的肿瘤)的肿瘤体积(TV)将动物分组，中值TV＝65mm3。6个组的左侧腹(无注射肿瘤)的中值TV为31到43mm3。在第0天启动给药。10mg/kg的小鼠IgG1同种型对照和muDX400每4天腹膜内施用总共3剂。1×107pfu的PBS、NDV-WT、NDV-muIL-12、NDV-muIL-23和NDV-muIL-27每2天施用到右侧腹的肿瘤中总共5剂。每组中10只动物。呈现了注射的个体动物生长曲线:组1:mIgG1对照+PBS(附图37A)；组2:muDX400+PBS(附图37B)；组3:muDX400+NDV-WT(附图37C)；组4:muDX400+NDV-muIL-12(附图37D)；组5:muDX400+NDV-muIL-23(附图37E)；组6:muDX400+NDV-muIL-27(附图37F)。附图37G中呈现了第14天的注射的肿瘤的肿瘤体积(68％置信区间的中值)和完全和部分消退的数量。呈现了无注射的个体动物生长曲线:组1:mIgG1对照+PBS(附图37H)；组2:muDX400+PBS(附图37I)；组3:muDX400+NDV-WT(附图37J)；组4:muDX400+NDV-muIL-12(附图37K)；组5:muDX400+NDV-muIL-23(附图37L)；组6:muDX400+NDV-muIL-27(附图37M)。附图37N中呈现了第14天的无注射肿瘤的肿瘤体积(68％置信区间的中值)和完全和部分消退的数量。
附图38A-38J:B16F10双侧肿瘤模型中NDV-muIL-12对比NDV-muIL-2与抗muPD-1mAbmuDX400的增强的抗肿瘤效力。小鼠B16F10细胞皮下地植入到免疫活性的C57BL/6J小鼠的右侧腹(2×105个细胞)和左侧腹(1×105个细胞)。在植入后10天(第0天)根据右侧腹(注射的肿瘤)的肿瘤体积(TV)将动物分配到组中，中值TV＝55mm3。左侧腹(无注射肿瘤)的中值TV是34mm3。在第0天启动给药。10mg/kg的小鼠IgG1同种型对照和muDX400每4天腹膜内施用总共5剂。1×107pfu的PBS、NDV-WT、NDV-muIL-12和NDV-muIL-2每2天施用到右侧腹的肿瘤中总共4剂。每组12只动物。呈现了注射的个体动物生长曲线:组1:mIgG1对照+PBS(附图38A)；组2:muDX400+NDV-WT(附图38B)；组3:muDX400+NDV-muIL-12(附图38C)；组4:muDX400+NDV-muIL-2(附图38D)。呈现了无注射的个体动物生长曲线:组1:mIgG1对照+PBS(附图38E)；组2:muDX400+NDV-WT(附图38F)；组3:muDX400+NDV-muIL-12(附图38G)；组4:muDX400+NDV-muIL-2(附图38H)。对于注射的和无注射肿瘤，附图38I和附图38J中分别呈现了最后一次测量的肿瘤体积(68％置信区间的中值)和完全和部分消退的数量。
附图39:NDV-huIL-12处理的人类肿瘤组织培养中NDV-huIL-12响应标志的诱导。肾细胞癌(RCC，n＝7)和结肠直肠癌(CRC，n＝7)的样品不处理(培养基)或用3×107pfu的NDV-huIL-12处理达到48小时。将样品急速冷冻，在RNA分离之后，使用Fluidigm BiomarkRTqPCR平台分析免疫基因的面板的基因表达。显示的是NDV-huIL-12与未处理的(培养基)之间在6、24和48小时时表达方面的平均改变倍数；对遍在蛋白归一化的值用于计算改变倍数。
附图40A-B:GEP阴性和GEP阳性肿瘤中NDV和NDV-huIL-12对T细胞激惹的、IFN-γ相关基因标志(18-GEP)评分的诱导。肾细胞癌(RCC，n＝10)、结肠直肠癌(CRC，n＝4)、乳腺癌(n＝2)、非小细胞肺癌(n＝2)和头颈部鳞状细胞癌(HNSCC，n＝1)的样品不处理(培养基)或用3×107pfu NDV-WT或3×107pfu NDV-huIL-12处理达到24小时。将样品急速冷冻，在RNA分离之后，使用NanoString平台分析18-基因GEP标志。显示的是平均GEP评分和标准差以及p值(ANOVA Friedman检验，随后是Dunn多重对比检验)(附图40A)和单独的GEP评分(附图40B)。
附图41A-D:重组IL-12和NDV-huIL-12对I型干扰素和IP-10的诱导。来自肾细胞癌(RCC，n＝6)、结肠直肠癌(CRC，n＝1)和非小细胞肺癌(NSCLC，n＝2)的组织培养样品不处理(培养基)或用3×107pfu的NDV-WT、3×107NDV-huIL-12、或重组人类IL-12(10、25和50ng/mL)处理达到48小时。采集上清液，分析IL-12p70(附图41A)、IFN-α-2a(附图41B)、IFN-β(附图41C)和IP-10(附图41D)的分泌。显示的是平均值和SEM以及p值(ANOVA Friedman检验，随后是Dunn多重对比检验)。
5.详细说明
在一个方面，本文提出的是利用本文描述的NDV(例如，下文的章节5.1或章节5.2中描述的NDV或嵌合NDV)或包含这样的嵌合NDV的组合物治疗癌症的方法。在具体的实施方式中，治疗癌症的方法包括用本文描述的嵌合NDV(例如，下文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物感染对象中的癌细胞。在另一个实施方式中，治疗癌症的方法包括向有需要的对象施用本文描述的嵌合NDV(例如，下文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物。在具体的实施方式中，有效量的本文描述的嵌合NDV(例如，下文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或包含有效量的本文描述的嵌合NDV的组合物被施用给对象以治疗癌症。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含编码IL-12(例如，IL-12 p35和IL-12 p40亚基)的包装基因组。在具体的实施方式中，所述IL-12(例如，人IL-12)被感染所述嵌合NDV的细胞表达。在某些实施方式中，所述NDV的基因组还编码突变F蛋白。在某些实施方式中，两种或更多种嵌合NDV被施用给对象以治疗癌症。
在另一个实施方式中，治疗癌症的方法包括向有需要的对象施用癌细胞，所述癌细胞用本文描述的NDV(例如，下文的章节5.1和/或章节5.2中描述的NDV或嵌合NDV)或其组合物感染。在具体的实施方式中，所述癌细胞在或施用或并入所述组合物之前已经用γ幅射处理。在另一个实施方式中，治疗癌症的方法包括有需要的对象施用来自癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜碎片，所述癌细胞用嵌合NDV(例如，下文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物感染。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的包装基因组，其中所述IL-12被所述NDV表达。在某些实施方式中，所述NDV的基因组还编码突变F蛋白，其由所述NDV表达。
在另一个方面，本文提出的是利用本文描述的NDV(例如，下文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或包含所述NDV的组合物与一种或更多其他疗法组合治疗癌症的方法。在一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向对象(例如，人类对象)施用本文描述的NDV(例如，下文章节5.2中描述的嵌合NDV)或一种或更多种其他疗法。在另一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向对象(例如，人类对象)施用有效量的本文描述的NDV或包含有效量的本文描述的NDV的组合物，以及一种或更多种其他疗法。在具体的实施方式中，本文提出的是本文描述的NDV(例如，下文的章节5.2中描述的嵌合NDV)在制备药物中的用途，所述药物与一种或更多种其他疗法组合用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症。在另一个具体的实施方式中，本文提出的是应用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症的方法的本文描述的NDV(例如，下文的章节5.2中描述的嵌合NDV)，其中所述方法进一步包括施用一种或更多种其他疗法。
在优选的实施方式中，所述一种或更多种疗法包括PD-1或其配体的拮抗剂(例如，阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)之间的相互作用的抗PD-1抗体，或阻断PD-L1与PD-1之间的相互作用的抗PD-L1抗体)。所述NDV和一种或更多种其他疗法可以同时地或顺序地向所述对象施用。在某些实施方式中，所述NDV和一种或更多种其他疗法在同一组合物中施用。在其他实施方式中，所述NDV和一种或更多种其他疗法在不同的组合物中施用。所述NDV和一种或更多种其他疗法可以通过相同的或不同的施用途径向所述对象施用。
在另一个方面，本文提出的是利用本文描述的嵌合NDV(例如，下文的章节5.2中描述的嵌合NDV)、或包含所述嵌合NDV的组合物，与PD-1或其配体的拮抗剂组合地治疗癌症的方法，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因。在一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向对象(例如，人类对象)施用本文描述的嵌合NDV(例如，下文的章节5.2中描述的嵌合NDV)和PD-1或其配体的拮抗剂，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因。在另一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向对象(例如，人类对象)施用有效量的本文描述的嵌合NDV、或包含有效量的本文描述的嵌合NDV的组合物，以及PD-1或其配体的拮抗剂，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因。所述嵌合NDV以及PD-1或其配体的拮抗剂可以同时地或顺序地向所述对象施用。在某些实施方式中，所述嵌合NDV以及PD-1或其配体的拮抗剂在同一组合物中施用。在其他实施方式中，所述嵌合NDV以及PD-1或其配体的拮抗剂在不同的组合物中施用。所述嵌合NDV以及PD-1或其配体的拮抗剂可以通过相同的或不同的施用途径向所述对象施用。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV肿瘤内地施用，以及所述拮抗剂静脉内地施用。
在一个实施方式中，本文提出的是嵌合NDV在制备药物中的用途，所述药物用于与PD-1或其配体的拮抗剂组合地用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症，本文描述的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因。在另一个实施方式中，本文提出的是用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症的方法的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，以及其中所述方法进一步包括施用PD-1或其配体的拮抗剂。所述嵌合NDV以及PD-1或其配体的拮抗剂可以同时地或顺序地向所述对象施用。在某些实施方式中，所述嵌合NDV以及PD-1或其配体的拮抗剂在同一组合物中施用。在其他实施方式中，所述嵌合NDV以及PD-1或其配体的拮抗剂在不同的组合物中施用。所述嵌合NDV以及PD-1或其配体的拮抗剂可以通过相同的或不同的施用途径向所述对象施用。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV肿瘤内地施用，以及所述拮抗剂静脉内地施用。
国际专利申请公开No.WO 2014/158811和美国专利申请公开No.2016/0015760A1和2014/0271677A1通过引用以它们的整体合并在本文中。例如，在国际专利申请公开No.2014/158811和美国专利申请公开No.2016/0015760A1和2014/0271677A1的例如章节3、5.1、5.2、5.5和5.6中描述的概述、NDV的说明、嵌合NDV的说明、组合物的说明、施用途径的说明、以及抗癌和其他用途的说明通过引用以它们的整体合并在本文中。
5.1新城疫病毒
可以在本文公开的组合疗法中使用任何NDV型或毒株，包括但不限于天然发生的毒株、变体或突变体、诱变的病毒、重配体和/或遗传工程化的病毒。本领域技术人员将理解，在培养、传代或增殖时，病毒可能经历突变。除了为了克隆目的导入的突变之外，所述NDV可以含有这些天然发生的突变。所述NDV可以是没有或具有一个或更多个这些突变的同质的或异质的群体。在具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是天然发生的毒株。在某些实施方式中，所述NDV是溶胞毒株。在其他实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是非溶胞毒株。在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是缓发型毒株。在某些实施方式中，所述NDV是中发型毒株。在其他实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是速发型毒株。关于缓发型、中发型和速发型NDV毒株的讨论参见，例如，Newcastle Disease，Avian Paramyoxvirus-1 Infection，Goose ParamyoxvirusInfection，Ranikhet disease，the Center for Food Security&Public Health，IowaState University，Institute for International Cooperation in Animal Biologies，College of Veterinary Medicine，Iowa State University，pp.1-9(2016年1月)通过引用以其整体合并在本文中。NDV毒株的具体实例包括但不限于，73-T毒株、NDV HUJ毒株、Ulster毒株(参见，例如，GenBank No.U25837)、MTH-68毒株、Italien毒株(参见，例如，GenBank No.EU293914)、Hickman毒株(参见，例如，Genbank No.AF309418)、PV701毒株、HitchnerB1毒株(参见，例如，GenBank No.AF309418或NC_002617)、La Sota毒株(参见，例如，GenBank Nos.AY845400和JF950510.1和GI No.56799463)、YG97毒株(参见，例如，GenBank Nos.AY351959或AY390310)、MET95毒株(参见，例如，GenBank No.AY143159)、Roakin毒株(参见，例如，GenBank No.AF124443)、和F48E9毒株(参见，例如，GenBankNos.AF163440和U25837)。在具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是Hitchner B1毒株。在另一个具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是GenBank No.AF309418或NC_002617标识的B1毒株。在另一个具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是由ATCC No.VR2239标识的NDV。在另一个具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是La Sota毒株。在具体的实施方式中，La Sota基因组的核苷酸序列是SEQ ID NO:50中列出的。本领域技术人员将理解，NDV基因组RNA序列是编码所述NDV基因组的cDNA序列的反向互补物。因而，可以使用产生核苷酸序列与它的反向补充序列的任何程序，来将编码NDV基因组的cDNA序列转换成基因组RNA序列(参见，例如，www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html、www.fr33.net/seqedit.php和DNAStar)。
在具体的实施方式中，通过本领域技术人员已知的技术评估的，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV在鸟类中不是致病性的。在某些具体的实施方式中，通过用病毒颅内注射1天龄雏鸡、记录8天的发病和死亡进行评估，组合疗法中使用的NDV不是致病性的。在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV具有小于0.7、小于0.6、小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2或小于0.1的颅内致病性指标。在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV具有为零的颅内致病性指标。
在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是已被遗传工程化的中发型毒株，从而通过本领域技术人员已知的技术评估认为在鸟类中不是致病性的。在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是已被遗传工程化的速发型毒株，从而通过本领域技术人员已知的技术评估认为在鸟类中不是致病性的。
在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV表达突变F蛋白。在具体的实施方式中，组合疗法中使用的所述NDV表达突变F蛋白是高度膜融合性的并能够形成合胞体。在另一个具体的实施方式中，所述突变F蛋白被掺入病毒粒中。
在一个实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的NDV的基因组被工程化以表达具有突变的裂解位点的突变F蛋白。在具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV被工程化以表达突变F蛋白，其中F蛋白的裂解位点被突变以产生多碱性氨基酸序列，其容许所述蛋白质被细胞内蛋白酶裂解，这使得所述病毒在进入细胞和形成合胞体方面更为有效。在另一个具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV被工程化以表达突变F蛋白，其中所述F蛋白的裂解位点被替换为含有一个或两个额外的精氨酸残基的突变的裂解位点，容许所述突变裂解位点被弗林蛋白酶(furin)家族的遍在性表达的蛋白酶活化。表达这样的突变F蛋白的NDV的具体实例包括但不限于rNDV/F2aa和rNDV/F3aa。对于导入NDVF蛋白以产生具有突变的裂解位点的突变F蛋白的突变的说明，参见，例如，Park等(2006)Engineered viral vaccine constructs with dual specificity:avianinfluenza and Newcastle disease.PNAS USA 103:8203-2808，通过引用以其整体合并在本文中。在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV被工程化以表达具有氨基酸突变L289A(即，相应于LaSota F蛋白的L289的氨基酸位置处L到A的突变)的突变F蛋白。对于L289A突变的说明，参见，例如，Sergei等(2000)A Single Amino Acid Change inthe Newcastle Disease Virus Fusion Protein Alters the Requirement for HNProtein in Fusion.Journal of Virology 74(11):5101-5107，通过引用以其整体合并在本文中。在具体的实施方式中，所述L289A突变F蛋白具有处在所述裂解位点中的一个、两个或三个精氨酸残基。在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是LaSota毒株，其被工程化以表达具有氨基酸突变L289A(即，相应于LaSota F蛋白的L289的氨基酸位置处L到A的突变)的突变F蛋白。在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是LaSota毒株，其被工程化以表达具有氨基酸突变L289A(即，相应于LaSota F蛋白的L289的氨基酸位置处L到A的突变)、并具有LaSota毒株F蛋白裂解位点(GRQGRL(SEQ ID NO:72))的突变F蛋白。在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是Kim等，2017，PLOS ONE 12(3):e0173965和Kim等，2016，J.of General Virology 97:1297-1303中公开的NDV，通过引用将它们的每一个以其整体合并在本文中。在某些实施方式中，所述突变F蛋白来自与主干NDV不同类型或不同毒株的NDV。在某些实施方式中，所述突变F蛋白来自与主干NDV相同的NDV毒株。在某些实施方式中，所述突变F蛋白对于所述主干NDV F蛋白是额外的。在具体的实施方式中，所述突变F蛋白替换主干NDV F蛋白。在具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV包含La Sota毒株主干，其被工程化以表达具有氨基酸突变L289A的突变F蛋白。在具体的实施方式中，所述La Sota毒株基因组的核苷酸序列是SEQID NO:50中列出的。
在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV包含具有NDV LaSota毒株的或巨细胞病毒(CMV)的糖蛋白B的F蛋白裂解位点的突变F蛋白。在具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV包含具有F蛋白质裂解的突变F蛋白，其具有以下序列修饰之一:S116:111H-N-R-T-K-S/F117(SEQ ID NO:56)；S116K:111H-N-K-T-K-S/F117(SEQ IDNO:58)；S116m:111H-N-R-M-K-S/F117(SEQ ID NO:69)；S116KM:111H-N-K-M-S/F-I118(SEQ IDNO:70)；或R116:111H-N-R-T-K-R/F-I118(SEQ ID NO:71)，例如国际专利申请No.WO 2015/032755中描述的。关于可以被工程化到NDV F蛋白中的突变F蛋白裂解位点的类型的说明，参见，例如，国际专利申请公开No.WO 2015/032755，通过引用以其整体合并在本文中。在某些实施方式中，所述突变F蛋白对于所述主干NDV F蛋白是额外的。在具体的实施方式中，所述突变F蛋白替换主干NDV F蛋白。
在另一个具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是国际专利申请No.WO 2015/032755中描述的修饰的73T毒株，通过引用以其整体合并在本文中。在另一个具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是国际专利申请No.WO 2015/032755中描述的r73T-R116病毒(具有F蛋白裂解位点111H-N-R-T-K-R/F-I118(SEQ ID NO:71)，通过引用以其整体合并在本文中。在进一步的实施方式中，所述NDV包含长度为60、102、144、198或318nt的HN和L基因间的非编码序列。
在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是减毒的，使得所述NDV至少部分地保持传染性并且可以体内复制，但是仅产生低滴度，引起非致病性的亚临床水平的感染(参见，例如Khattar等，2009，J.Virol.83:7779-7782)。这样的减毒NDV可以特别适合于一些实施方式，其中病毒被施用给对象以作为免疫原，例如，活疫苗。所述病毒可以通过本领域已知的任何方法减毒。在具体的实施方式中，所述NDV基因组包含减毒病毒的感染和复制所必须的序列，使得产生子代并且感染水平是亚临床的。在具体的实施方式中，所述NDV在人类细胞中是具有复制能力的。
在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV不包含NDV V蛋白编码序列。在其他实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV表达突变的V蛋白。对于突变V蛋白的实例，参见，例如，Elankumaran et al，2010，J.Virol.84(8):3835-3844，通过引用合并在本文中。在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的中发型或速发型NDV毒株表达突变V蛋白，例如，由Elankumaran et al，2010，J.Virol.84(8):3835-3844公开的。
在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是美国专利No.7,442,379、美国专利No.6,451,323、美国专利No.6,146,642、美国专利申请公开No.2014/0271677A1、国际专利申请公开No.WO 2014/0158811、或美国专利申请公开No.2016/0015760 A1中公开的NDV，它们的每一个通过引用以其整体合并在本文中。在具体的实施方式中，本文描述的组合疗法中使用的所述NDV是美国专利申请公开No.2014/0271677 A1、国际专利申请公开No.WO 2014/0158811、或美国专利申请公开No.2016/0015760 A1的章节5.1中描述的NDV，它们的每一个通过引用以其整体合并在本文中。在具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV被遗传工程化以编码和表达异源肽或蛋白。在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是本领域技术人员已知的嵌合NDV、或本文公开的嵌合NDV(参见，例如，下文的章节5.2和/或章节6)。在某些实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是美国专利申请公开No.2012/0058141、2012/0122185、2016/0015760 A1、或2014/0271677 A1、或国际专利申请公开No.WO 2014/158811中公开的嵌合NDV，它们的每一个通过引用以其整体合并在本文中。在具体的实施方式中，本文公开的组合疗法中使用的所述NDV是包含基因组的嵌合NDV，所述基因组被工程化以表达细胞因子，例如，IL-12。
5.2嵌合新城疫病毒
在一个方面，本文描述的是包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12或IL-12衍生物的转基因(参见，例如，章节5.2.1)。换句话说，所述NDV充当“主干”，其被工程化以编码IL-12或IL-12衍生物，所述IL-12或IL-12衍生物在被所述病毒感染的细胞中表达。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含IL-12或其衍生物。任何NDV类型或毒株可以充当本文描述的嵌合NDV的主干，包括但不限于天然发生的毒株、变体或突变体、诱变的病毒、重配体和/或遗传工程化的病毒。在具体的实施方式中，充当嵌合NDV的遗传工程主干的所述NDV是上文的章节5.1中描述的NDV。在具体的实施方式中，与非癌细胞相比，所述嵌合NDV优先地在癌细胞中复制。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV是减毒的，但是至少部分保持了传染性并可以在体内复制，但是是非致病性的并仅产生低滴度的NDV子代，引起亚临床水平的感染。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV基因组包含病毒的感染和复制所必须的序列，使得产生子代并且感染水平是亚临床的。NDV减毒的技术是本领域已知的，例如，基因组内的突变或取代以及NDV V蛋白的修饰或删除可以用于减毒本文描述的嵌合NDV。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV在人类细胞中是具有复制能力的。
在具体的方面，本文描述的是包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，所述IL-12或其衍生物可以在被所述病毒感染的细胞中表达。在另一个具体的实施方式中，本文描述的是包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因和编码突变F蛋白的核苷酸序列。在特定的实施方式中，所述突变F蛋白是高度膜融合的。在具体的实施方式中，所述突变F蛋白具有突变裂解位点(例如本文描述的)。在某些实施方式中，所述突变F蛋白包含氨基酸突变L289A(即，相应于LaSota F蛋白的氨基酸位置L到A的取代)。在某些实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码具有氨基酸突变L289A(即，相应于LaSota F蛋白的L289的氨基酸位置处L到A的取代)的突变F蛋白的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述突变F蛋白来自与主干NDV不同类型或不同毒株的NDV。在其他实施方式中，所述突变F蛋白来自与主干NDV相同类型或NDV毒株。在具体的实施方式中，所述L289A突变F蛋白具有处在所述裂解位点中的一个、两个或三个精氨酸残基。在某些实施方式中，所述突变F蛋白对于所述主干NDVF蛋白是额外的。在具体的实施方式中，所述突变F蛋白替换主干NDV F蛋白。在具体的实施方式中，所述突变F蛋白被掺入病毒粒中。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列以及包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因的核苷酸序列，其中充当所述嵌合NDV的主干的所述NDV是缓发型的。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列以及包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因的核苷酸序列，其中编码所述突变F蛋白的核苷酸序列替换充当所述嵌合NDV的主干的所述NDV的基因组的F蛋白。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列以及包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因的核苷酸序列，其中充当所述嵌合NDV的主干的所述NDV是La Sota毒株。在另一个具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码突变的NDV F蛋白的核苷酸序列和包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因的核苷酸序列，其中充当所述嵌合NDV的主干的所述NDV是La Sota毒株，其中所述编码突变的F蛋白的核苷酸序列替换充当所述嵌合NDV的主干的所述NDV的基因组的F蛋白，以及其中所述突变的NDV F蛋白具有氨基酸突变L289A(即，相应于LaSota F蛋白的L289的氨基酸位置处的L到A取代)。在另一个具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码突变的NDV F蛋白的核苷酸序列和包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因的核苷酸序列，其中充当所述嵌合NDV的主干的所述NDV是La Sota毒株，其中所述编码突变的F蛋白的核苷酸序列替换充当所述嵌合NDV的主干的所述NDV的基因组的F蛋白，以及其中所述突变的NDV F蛋白具有氨基酸突变L289A(即，相应于LaSota F蛋白的L289的氨基酸位置处的L到A取代)和所述LaSota毒株F蛋白裂解位点(GRQGRL(SEQ IDNO:72))。
在某些实施方式中，本文描述的是包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，其中充当所述嵌合NDV的主干的所述NDV是Kim等，2017，PLOSONE 12(3):e0173965和Kim等，2016，J.of General Virology 97:1297-1303中公开的NDV，它们的每一个通过引用以其整体合并在本文中。
在某些实施方式中，本文描述的是包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，其中充当所述嵌合NDV的主干的所述NDV包含具有SEQ IDNO:50中列出的序列的基因组。在具体的实施方式中，本文描述的是包含包装基因组的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含或由SEQ ID NO:50的核苷酸序列和编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因组成。在特定的实施方式中，所述转基因被掺入到两个NDV基因的转录单元之间(例如，P和M转录单元)。
在某些实施方式中，本文描述的是包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含(i)编码IL-12或其衍生物的转基因，和(ii)编码突变的NDV V蛋白编码序列的核苷酸序列，例如，由Elankumaran等，2010，J.Virol.84(8):3835-3844公开的。在其他实施方式中，包含包装基因组的嵌合NDV不包含NDV V蛋白编码序列，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因。在某些实施方式中，所述嵌合NDV的亲本主干是被工程化以编码突变的V蛋白的中发型或速发型NDV毒株，例如，由Elankumaran等，2010，J.Virol.84(8):3835-3844公开的。
在某些实施方式中，本文提供的是包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因以及编码突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变F蛋白具有NDV LaSota毒株或巨细胞病毒(CMV)的糖蛋白B的F蛋白裂解位点。在具体的实施方式中，本文提供的是包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因以及编码突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变F蛋白具有F蛋白质裂解位点，其具有以下序列之一:S116:111H-N-R-T-K-S/F 117(SEQ ID NO:56)；S116K:111H-N-K-T-K-S/F117(SEQID NO:58)；S116m:111H-N-R-M-K-S/F117(SEQ ID NO:69)；S116KM:111H-N-K-M-S/F-I118(SEQID NO:70)；or Rl 16:111H-N-R-T-K-R/F-I118(SEQ ID NO:71)，例如国际专利申请No.WO2015/032755中描述的。关于可以被工程化到NDV F蛋白中的突变F蛋白裂解位点的类型的说明，参见，例如，国际专利申请公开No.WO2015/032755，通过引用以其整体合并在本文中。在某些实施方式中，所述突变F蛋白对于所述主干NDV F蛋白是额外的。在具体的实施方式中，所述突变F蛋白替换主干NDV F蛋白。
在某些实施方式中，本文提供的包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，其中充当所述嵌合NDV的主干的所述NDV是国际专利申请No.WO2015/032755中描述的修饰的73T毒株，通过引用以其整体合并在本文中。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，其中充当所述嵌合NDV的主干的所述NDV是国际专利申请No.WO 2015/032755中描述的r73T-R116病毒(具有F蛋白裂解位点111H-N-R-T-K-R/F-I118(SEQ ID NO:71))，通过引用以其整体合并在本文中。在进一步的实施方式中，所述嵌合NDV包含长度为60、102、144、198或318个核苷酸的HN和L基因间的非编码序列。
在具体的实施方式中，所述嵌合NDV是下文的章节6中描述的嵌合NDV。在优选的实施方式中，所述嵌合NDV是下文的章节6中描述的NDV-huIL-12。在另一个优选的实施方式中，所述嵌合NDV包含具有SEQ ID NO:51中列出的序列的基因组。在另一个实施方式中，所述嵌合NDV包含具有SEQ ID NO:52中列出的序列的基因组。在另一个优选的实施方式中，所述嵌合NDV包含具有SEQ ID NO:60中列出的序列的基因组。
在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因包含SEQ ID NO:61中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列，其中所述IL-12包含信号肽。在具体的实施方式中，所述转基因包含SEQ ID NO:26中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因包含SEQ ID NO:63中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因包含SEQ ID NO:68中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列，其中所述IL-12包含信号肽。在具体的实施方式中，所述转基因包含SEQ ID NO:53中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因SEQ ID NO:66中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，包含所述包装基因组的嵌合NDV在本文描述的分析中(例如，下文的章节6中描述的分析)诱导IL-12p70的表达、IFN-γ表达、或IL-12p70和IFN-γ两者的表达。在另一个具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，用包含所述包装基因组的嵌合NDV处理肿瘤样品引起相对于用所述嵌合NDV处理之前的肿瘤样品的GEP评分的基因表达谱(GEP)的提高。关于GEP评分，参见，例如，下文的实施例6.3。在另一个具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，相对于例如下文章节6中描述的用所述嵌合NDV处理之前，用包含所述包装基因组的嵌合NDV处理例如下文章节6中描述的肿瘤样品提高所述肿瘤样品的GEP评分。在一个实施方式中，对象的肿瘤样品的表15的18-基因标志的基因表达谱(GEP)评分小于-0.318。在另一个实施方式中，所述对象的肿瘤的表15的18-基因标志的基因表达谱(GEP)评分大于-0.318。不受任何理论的限制，相信的是，GEP评分的提高将使所述肿瘤更可能响应用抗PD-1抗体(例如，抗PD-1阻断抗体)例如派姆单抗的治疗。因而，在具体的实施方式中，向患有对于抗PD-1抗体(例如，抗PD-1阻断抗体，例如，派姆单抗或章节5.5中描述的其他抗体)的治疗为难治性、复发性或不响应的癌症的患者施用包含包含编码IL-12的转基因的包装基因组的嵌合NDV，可以使所述患者变为响应抗PD-1抗体(例如，抗PD-1阻断抗体，例如，派姆单抗或章节5.5中描述的其他抗体)的治疗。特别地，向患有对于派姆单抗(
Figure BDA0002363284960000441
Merck&Co.，Inc.Kenilworth，NJ)的治疗为难治性、复发性或不响应的癌症的患者施用包含包含编码IL-12的转基因的包装基因组的嵌合NDV，可以使所述患者变为响应派姆单抗的治疗。因而，在一个实施方式中，本文提供的是在患有癌症的对象中提高对抗PD-1疗法的响应的方法。
在另一个实施方式中，本文描述的包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含(i)编码IL-12或其衍生物的转基因，和(ii)编码异源干扰素拮抗剂的转基因。参见，例如，美国专利申请公开No.2012-0058141，通过引用将其合并在本文中，例如，被工程化以表达异源干扰素拮抗剂的嵌合NDV。
使用本领域技术人员已知的任何技术可以鉴定干扰素拮抗剂，包括，例如，美国专利Nos.6,635,416；7,060,430；和7,442,527中描述的技术；它们每一个通过引用以其整体合并在本文中。在具体的实施方式中，所述异源干扰素拮抗剂是病毒蛋白质。这样的病毒蛋白质可以获自或衍生自任何病毒，所述病毒可以感染任何物种(例如，所述病毒可以感染人类或非人类哺乳动物)。示范性的异源干扰素拮抗剂无限制地包括，尼帕病毒病毒W蛋白、尼帕病毒V蛋白、埃博拉病毒VP35蛋白、牛痘病毒E3L蛋白、流感病毒NS1蛋白、呼吸道合胞体病毒(RSV)NS2蛋白、单纯性疱疹病毒(HSV)1型ICP34.5蛋白、丙型肝炎病毒NS3-4蛋白酶、阻断对先天免疫的诱导或响应的显性负性细胞蛋白(例如，STAT1、MyD88、IKK和TBK)以及先天免疫反应的细胞调节物(例如，SOCS蛋白、PIAS蛋白、CYLD蛋白、IkB蛋白、Atg5蛋白、Pin1蛋白、IRAK-M蛋白和UBP43)。对于有关异源干扰素拮抗剂的其他信息，参见，例如，美国专利申请公开No.2012-0058141，通过引用以其整体合并在本文中。
任何NDV型或毒株可以充当包含包装基因组的所述嵌合NDV的主干，所述包装基因组被工程化以编码IL-12(例如，人类IL-12)，以及在某些实施方式中，异源干扰素拮抗剂和/或突变F蛋白，包括但不限于天然发生的毒株、变体或突变体、诱变的病毒、重配体和/或遗传工程化的病毒。在具体的实施方式中，充当嵌合NDV的遗传工程主干的所述NDV是章节5.1中描述的NDV。在具体的实施方式中，充当嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是天然发生的毒株。在某些实施方式中，充当嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是溶胞毒株。在其他实施方式中，充当嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是非溶胞毒株。在某些实施方式中，充当嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是缓发型毒株。在某些实施方式中，充当嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是中发型毒株。在其他实施方式中，充当嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是速发型溶胞毒株。NDV毒株的具体实例包括但不限于，73-T毒株、NDV HUJ毒株、Ulster毒株(参见，例如，GenBankNo.U25837)、MTH-68毒株、Italien毒株(参见，例如，GenBankNo.EU293914)、Hickman毒株(参见，例如，GenbankNo.AF309418)、PV701毒株、Hitchner B1毒株(参见，例如，GenBankNo.AF309418或NC_002617)、La Sota毒株(参见，例如，GenBank Nos.AY845400和JF950510.1和GI No.56799463)、YG97毒株(参见，例如，GenBank Nos.AY351959或AY390310)、MET95毒株(参见，例如，GenBankNo.AY143159)、Roakin毒株(参见，例如，GenBankNo.AF124443)、和F48E9毒株(参见，例如，GenBankNos.AF163440和U25837)。在具体的实施方式中，充当嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是Hitchner B1毒株。在另一个具体的实施方式中，充当嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是由GenBank No.AF309418或NC002617标识的B1毒株。在另一个具体的实施方式中，充当嵌合NDV的遗传工程化的主干的所述NDV是由ATCC No.VR2239标识的NDV。在另一个具体的实施方式中，充当遗传工程化的主干的所述NDV是La Sota毒株。
在某些实施方式中，所述嵌合NDV减毒或进一步减毒是期望的，使得所述嵌合NDV至少部分地保持传染性并且可以体内复制，但是仅产生低滴度，引起非致病性的亚临床水平的感染(参见，例如Khattar等，2009，J.Virol.83:7779-7782)。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV是通过删除V蛋白减毒的。这样的减毒的嵌合NDV可以特别适合于一些实施方式，其中病毒被施用给对象以作为免疫原，例如，活疫苗。所述病毒可以通过本领域已知的任何方法减毒。
在包含包装基因组的所述嵌合NDV的特定实施方式中，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，所述包装基因组还包含一种或更多种其他转基因，例如，免疫细胞的抑制性受体的拮抗剂、免疫细胞的共刺激受体的激动剂、其他细胞因子、肿瘤抗原、促细胞凋亡分子、抗细胞凋亡分子、自杀基因、或异源干扰素拮抗剂。免疫细胞的抑制性受体的非限制性实施例在章节5.7.6.1中提供。免疫细胞的共刺激受体的非限制性实施例在章节5.7.6.1中提供。细胞因子的非限制性实例包括IL-2(例如，Genbank Accession No.NM_000586.3和GI No.125661059)、IL-7(例如，Genbank Accession Nos.NM_000880.3、NM_001199886.1、NM_001199887.1和NM_001199888.1和GI Nos.315467865、315467866、315467868和315467870)、IL-9(例如，Genbank Accession No.NM_000590.1和GINo.10834979)、IL-15(例如，Genbank Accession Nos.NM_172175.2以及NM_000585.4和GI Nos.323098328和323098327)、IL-17(例如，Genbank Accession No.NM_002190.2和GINo.27477085)、IL-21(例如，Genbank Accession Nos.NM_021803.3和NM_001207006.2以及GI Nos.365733583和365733582)、IL-22(例如，Genbank Accession No.NM_020525.4和GI No.41393566)、IFN-γ(例如，Genbank Accession No.NM_000619.2和GINo.56786137)、GM-CSF(例如，Genbank Accession No.Ml 1220_1和GI No.183363)，和TNF-alpha(例如，Genbank Accession No.NM_000594.3)。肿瘤抗原的非限制性实例包括MAGE-1、MAGE-3BAGE、GAGE-1、GAGE-2、N-乙酰葡糖氨基转移酶-V、p-15、gp1OO、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)、酪氨酸酶、周期蛋白依赖性激酶4、P-连环蛋白、MUM-1、CDK4、HER-2/neu、人类乳头状瘤病毒-E6、人类乳头状瘤病毒E7、CD20、癌胚抗原(CEA)、表皮生长因子受体、MUC-1、半胱天冬酶-8、CD5、粘蛋白-1、Lewisx、CA-125、p185HER2、IL-2R、Fap-α、肌键蛋白、与金属蛋白酶相关的抗原、以及CAMPATH-1。肿瘤抗原的其他实例包括但不限于KS 1/4泛癌抗原、卵巢癌抗原(CA125)、前列腺酸式磷酸盐、前列腺特异性抗原、黑素瘤相关抗原p97、黑色素瘤抗原gp75、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)、前列腺特异性膜抗原、CEA、多态的上皮粘蛋白抗原、乳脂小球抗原、结肠直肠肿瘤相关抗原(例如，CEA TAG-72、CO17-1A、GICA 19-9、CTA-1和LEA)、伯基特氏淋巴瘤抗原-38.13、CD19、B-淋巴瘤抗原-CD20、CD33、黑素瘤特异性抗原(例如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2、神经节苷脂GM3)、细胞表面抗原的肿瘤特异性移植型(TSTA)(例如，病毒诱导的肿瘤抗原，包括T-抗原DNA肿瘤病毒，和RNA肿瘤病毒的包膜抗原)、癌胚抗原-甲胎蛋白例如结肠、膀胱肿瘤癌胚抗原的CEA、分化抗原(例如人类肺癌抗原L6和L20)、纤维肉瘤的抗原、白血病T细胞抗原-Gp37、新生糖蛋白、鞘脂类、乳腺癌抗原(例如EGFR(表皮生长因子受体)、HER2抗原(p185HER2)和HER2 neu表位)、多态性上皮粘蛋白(PEM)、恶性人类淋巴细胞抗原-APO-1、分化抗原(例如胎儿红血球、原内胚层中发现的I抗原，成年人红血球、着床前胚胎中发现的I抗原、胃腺癌中发现的I(Ma)、乳腺上皮中发现的Ml8、M39、骨髓细胞中发现的SSEA-1、结肠直肠癌症中发现的VEP8、VEP9、Myl、VIM-D5、D156-22、结肠腺癌中发现的TRA-1-85(血型H)、C14肺癌中发现的F3、胃癌中发现的AH6、胚胎癌细胞中发现的Y半抗原、Ley、A431细胞中发现的EGF受体，胰腺癌中发现的E1序列(血群B)，胚胎癌细胞中发现的FC10.2，胃癌抗原，腺癌中发现的CO-514(血群Lea)，腺癌中发现的NS-10，A431细胞的EGF受体中发现的CO-43(血群Leb)、G49，结肠腺癌中发现的MH2(血群ALeb/Ley)，结肠癌中发现的19.9，胃癌粘蛋白、骨髓细胞中发现的T5A7、黑素瘤中发现的R24，胚胎癌细胞中发现的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8，以及4到8细胞期胚胎中发现的SSEA-3和SSEA-4，来自皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体衍生的肽，与乳腺癌相关的C反应蛋白(CRP)，癌抗原-50(CA-50)，癌抗原15-3(CA15-3)，与胃肠癌相关的癌抗原-19(CA-19)和癌抗原242，癌相关抗原(CAA)、嗜铬粒蛋白A、上皮粘蛋白抗原(MC5)、人类上皮特异性抗原(E1A)、Lewis(a)抗原、黑色素瘤抗原、黑素瘤相关抗原100、25和150，粘蛋白样癌相关抗原、多药物抗性相关蛋白质(MRPm6)、多药物抗性相关蛋白质(MRP41)、Neu癌基因蛋白(C-erbB-2)、神经元特异性烯醇酶(NSE)、P-糖蛋白(mdrl基因产物)、多药物抗性相关抗原、p170、多药物抗性相关抗原、前列腺特异性抗原(PSA)、CD56和NCAM。促细胞凋亡分子的非限制性实例包括Bax、Bak Bad、BID、Bcl-xS、Bim、Noxa、Puma、AIF、FasL和TRAIL。抗细胞凋亡分子的非限制性实例包括Bcl-2、Bcl-xL Mcl-1和XIAP。自杀基因的非限制性实例包括胸苷激酶。
在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因以及一个、两个、三个或更多个、或所有以下转基因:(1)免疫细胞的共刺激信号的激动剂；(2)免疫细胞的抑制信号的拮抗剂；(3)细胞因子；(4)肿瘤抗原；(5)异源干扰素拮抗剂；(6)促细胞凋亡分子；(7)抗细胞凋亡分子；和/或(8)自杀基因。另外，所述包装基因组可以包含编码突变F蛋白(例如，本文描述的突变F蛋白)的核苷酸序列。在具体的实施方式中，除了包含编码IL-12或其衍生物的转基因的包装基因组之外，在某些实施方式中，所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列和/或编码异源干扰素拮抗剂的核苷酸序列，所述嵌合NDV的包装基因组包含编码自杀基因(例如，胸苷激酶)或抑制NDV复制或功能的其他分子(使得NDV对抗生素或抗病毒剂敏感的基因)的转基因。在某些实施方式中，除了包含编码IL-12或其衍生物的转基因的包装基因组之外，在某些实施方式中，所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列和/或编码异源干扰素拮抗剂的核苷酸序列，所述嵌合NDV的包装基因组包含编码组织特异性microRNA(miRNA)目标位点(例如，miR-21、miR184、miR-133a/133b miR-137和/或miR-193a microRNA靶向的位点)的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述包装基因组不包含编码miRNA目标位点的核苷酸序列。
在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，其中所述包装基因组不编码异源干扰素拮抗剂。
在某些实施方式中，所述嵌合NDV的向性被改变。在具体的实施方式中，通过将F蛋白裂解位点修饰为被组织特异性或肿瘤特异性蛋白酶例如基质金属蛋白酶(MMP)和尿激酶识别，来改变所述病毒的向性。在其他实施方式中，通过引入组织特异性miRNA目标位点来改变所述病毒的向性。在某些实施方式中，NDV HN蛋白被突变以识别肿瘤特异性受体。
在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，其中本文描述的嵌合NDV的包装基因组不包含额外的转基因。在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组不包含编码异源干扰素拮抗剂的转基因。在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组不包含编码一个、两个或更多个、或所有以下的转基因:(1)编码IL-12以外的一种或更多种的转基因；(2)编码一种或更多种肿瘤抗原的转基因；(3)编码一种或更多种抗细胞凋亡分子的转基因；(4)编码自身基因的转基因；(5)编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂的转基因；(6)编码免疫细胞的抑制信号的一种或更多种拮抗剂的转基因；或(7)编码一种或更多种促细胞凋亡分子的转基因。
在某些实施方式中，所述嵌合NDV的基因组不包含编码IL-12或其衍生物(例如，人类IL-12)之外的异源蛋白质的异源序列。在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV包含包装基因组，其中所述基因组包含NDV中存在的基因以及编码IL-12或其衍生物的转基因。在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV包含包装基因组，其中所述基因组包含NDV中存在的基因以及编码IL-12或其衍生物的转基因，但不包括任何其他转基因。
在特定的实施方式中，所述嵌合NDV的基因组不包含编码IL-12或其衍生物和突变的NDV F蛋白以外的异源蛋白质的异源序列，其中所述突变的NDV F蛋白替换天然发生的NDVF蛋白。在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV包含包装基因组，其中所述基因组包括:(1)NDV F蛋白以外的NDV中存在的基因；(2)编码IL-12或其衍生物(例如，人类IL-12)的转基因，和(3)突变的NDV F蛋白，例如本文描述的，其替换所述NDV F蛋白。在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV包含包装基因组，其中所述基因组包括:(1)NDV F蛋白以外的NDV中存在的基因；(2)编码IL-12或其衍生物(例如，人类IL-12)的转基因，和(3)突变的NDV F蛋白，例如本文描述的，其替换所述NDV F蛋白，但是不包括任何其他转基因。
在某些实施方式中，一种或更多种以下的由细胞中的嵌合NDV表达为嵌合蛋白或融合蛋白:(1)IL-12或其衍生物；(2)异源干扰素拮抗剂；和/或(3)突变F蛋白。在具体的实施方式中，IL-12或其衍生物由细胞中的嵌合NDV表达为嵌合蛋白或融合蛋白。在具体的实施方式中，突变F蛋白由嵌合NDV表达为嵌合蛋白或融合蛋白。在具体的实施方式中，所述嵌合蛋白或融合蛋白包含NDV F或NDV HN蛋白的跨膜和胞质结构域或其片段，以及包含前一句中提及的分子之一的细胞外结构域。这样的嵌合蛋白或融合蛋白的说明参见美国专利申请No.2012-0122185，以及国际申请公开No.WO 2007/064802，其每一个通过引用合并在本文中。
在此处的实施方式中，所述编码IL-12或其衍生物的转基因可以在两个转录单元之间插入主干NDV的基因组中。在具体的实施方式中，所述编码IL-12或其衍生物的转基因在M和P转录单元之间或HN和L转录单元之间插入主干NDV的基因组中。根据此处的其他实施方式，本文描述的一个或更多个其他转基因或核苷酸序列，例如编码异源干扰素拮抗剂和/或突变F蛋白的那些，可以在两个或更多个转录单元之间插入主干NDV的基因组中(例如，M和P转录单元之间或HN和L转录单元之间)。
在某些实施方式中，所述嵌合NDV是美国专利申请公开No.2014/0271677A1或2016/0015760A1、或国际专利申请公开No.WO2014/158811的章节5.2中描述的NDV，它们的每一个通过引用以其整体合并在本文中。
5.2.1 IL-12
在一个方面，本文提供的是包含包装基因组的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物(例如，人类IL-12)的转基因。所述嵌合NDV可以单独地或与一种或更多种其他疗法组合地使用，例如，PD-1或其配体的拮抗剂，来治疗癌症。
在另一个方面，本文提出的是利用嵌合NDV或包含所述嵌合NDV的组合物、与PD-1或其配体的拮抗剂或包含这样的拮抗剂的组合物组合地治疗癌症的方法，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码白细胞介素-12(“IL-12”)(例如IL-12的p35和p40亚基)或其衍生物的转基因。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码所述IL-12 p35亚基或其衍生物的第一转基因和编码所述IL-12 p40亚基或其衍生物的第二转基因。在具体的实施方式中，所述IL-12或其衍生物由所述嵌合NDV感染的细胞表达。在具体的实施方式中，所述拮抗剂是PD-1阻断抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)。在某些实施方式中，所述拮抗剂是PD-L1阻断抗体(例如，阿维鲁单抗)。
在另一个方面，本文提出的是用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症的方法的嵌合NDV或包含所述嵌合NDV的组合物，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，IL-12的p35和p40亚基)或其衍生物的转基因，以及其中所述方法进一步包括施用PD-1或其配体的拮抗剂或包含这样的拮抗剂的组合物。在具体的实施方式中，所述IL-12或其衍生物由所述嵌合NDV感染的细胞表达。在具体的实施方式中，所述拮抗剂是PD-1阻断抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)。在某些实施方式中，所述拮抗剂是PD-L1阻断抗体(例如，阿维鲁单抗)。
本文描述的嵌合NDV的包装基因组中的转基因编码的IL-12或其衍生物可以是本领域技术人员已知的任何IL-12。在某些实施方式中，所述IL-12或其衍生物是人类、狗、猫马、猪或牛的IL-12或其衍生物。在具体的实施方式中，所述IL-12或其衍生物是人类IL-12或其衍生物。典型的IL-12由两个独立基因编码的异二聚体组成，IL-12A(p35亚基)和IL-12B(p40亚基)，是本领域技术人员已知的。GenBankTM登记号NM_000882.3(GI编号325974478)提供了示范性的人类IL-12A核酸序列。GenBankTM登记号NM002187.2(GI编号24497437)提供了示范性的人类IL-12B核酸序列。GenBankTM登记号NP_000873.2(GI编号24430219)提供了示范性的人类IL-12A(p35亚基)氨基酸序列。GenBankTM登记号NP_002178.2(GI编号24497438)提供了示范性的人类IL-12B(p40亚基)氨基酸序列。在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组编码的IL-12或其衍生物由单个多肽链组成，其包含所述IL-12 p35亚基(也称为“IL-12A”)或其衍生物以及所述IL-12 p40亚基(也称为“IL-12B”)或其衍生物，任选地通过接头序列分隔。在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组编码的IL-12或其衍生物由两条多肽链组成:(i)包含所述IL-12 p35亚基或其衍生物的第一多肽；和(ii)包含所述IL-12 p40亚基或其衍生物的第二多肽。在某些实施方式中，编码所述IL-12或其衍生物的转基因包含编码所述IL-12 p35亚基的核苷酸序列以及编码所述IL-12 p40亚基的核苷酸序列，其中所述编码所述IL-12 p35亚基的核苷酸序列以及所述编码所述IL-12p40亚基的核苷酸序列通过内部核糖体进入位点分隔。SEQ ID NO:29、55和65提供了编码所述IL-12 p35亚基的示范性的核苷酸序列。SEQ ID NO:27、54、57、59和64提供了编码所述IL-12 p40亚基的示范性的核苷酸序列。在具体的实施方式中，IL-12包含分别在SEQ ID NO:41和38中列出的p35和p40亚基序列。在另一个具体的实施方式中，IL-12包含分别在SEQ IDNO:25和38中列出的p35和p40亚基序列。在优选的实施方式中，IL-12包含章节6中提供的p35和p40亚基序列，例如，分别为SEQ ID NO:25和23，或分别为SEQ ID NO:41和40。在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组编码的IL-12由单个多肽链组成，所述多肽链包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组编码的IL-12由单个多肽链组成，所述多肽链包含SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组编码的IL-12由单个多肽链组成，所述多肽链包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列。在优选的实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组编码的IL-12由单个多肽链组成，所述多肽链包含章节6中提供的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:22。在具体的实施方式中，所述转基因的核苷酸序列是SEQID NO:26、53、61、63、66或68中列出的。在具体的实施方式中，所述转基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO:26、53、61、63、66或68中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述IL-12p35亚基和IL-12 p40亚基或其衍生物直接相互融合。在具体的实施方式中，直接相互融合的、包含所述IL-12 p35亚基和IL-12 p40亚基或其衍生物的多肽是功能性的(例如，能够特异性结合IL-12受体并诱导IL-12介导的信号转导和/或IL-12介导的免疫功能)。在具体的实施方式中，所述IL-12 p35亚基和IL-12 p40亚基或其衍生物使用一个或更多个接头相互间接融合。适合于制备所述IL-12 p35亚基/p40亚基融合蛋白的接头可以包含一个或更多个氨基酸(例如，肽)。在具体的实施方式中，包含利用氨基酸接头(例如，肽接头)相互间接融合的所述IL-12 p35亚基和IL-12 p40亚基或其衍生物的多肽是功能性的(例如，能够特异性结合IL-12受体并诱导IL-12介导的信号转导和/或IL-12介导的免疫功能)。在具体的实施方式中，所述接头是足够长的，以保留所述IL-12 p35亚基和IL-12 p40亚基或其衍生物形成功能性IL-12异二聚体复合物的能力，所述复合物能够结合IL-12受体并诱导IL-12介导的信号转导。在某些实施方式中，所述接头是长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或更多个氨基酸的氨基酸序列(例如，肽)。在某些实施方式中，所述接头是长度在5到20个或5到15个氨基酸的氨基酸序列(例如，肽)。在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组中的转基因编码的IL-12或其衍生物由四价缔合的超过一条多肽链组成，例如，与包含所述IL-12 p40亚基或其衍生物的多肽链四价缔合的包含所述IL-12 p35亚基或其衍生物的多肽链。在某些实施方式中，所述接头是SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述接头是SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述接头是SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述接头是SEQ ID NO:48中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述接头是SEQ ID NO:49中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述接头是弹性蛋白样多肽序列。在某些实施方式中，所述弹性蛋白样多肽序列包含氨基酸序列VPGXG(SEQ ID NO:44)，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。在某些实施方式中，所述弹性蛋白样多肽序列包含氨基酸序列VPGXGVPGXG(SEQ ID NO:45)，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。在某些实施方式中，所述接头可以是美国专利No.5,891,680中描述的接头，通过引用以其整体合并在本文中。
在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组中的转基因编码的IL-12包含表7中列出的序列的氨基酸序列。在另一个具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组中的转基因编码的IL-12由表7中列出的氨基酸序列组成。在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组中编码IL-12的转基因包含表8中列出的序列的核苷酸序列。在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组中编码IL-12的转基因由表8中列出的序列的核苷酸序列组成。
在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组中编码IL-12的衍生物的转基因是本领域技术人员已知的任何IL-12的衍生物。在具体的实施方式中，所述IL-12衍生物与本领域技术人员已知的IL-12具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、98％或99％的氨基酸序列同一性。在具体的实施方式中，所述IL-12衍生物包含已知的IL-12的删除形式，其中达到约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基从所述已知的IL-12上删除。本文还提供的是包含已知的IL-12的删除形式的IL-12衍生物，其中约1-3个、3-5个、5-7个、7-10个、10-15个或15-20个氨基酸残基从所述已知的IL-12上删除。本文进一步提供的是包含已知的IL-12的改变形式的IL-12衍生物，其中所述已知的IL-12的达到约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基用其他氨基酸取代(例如，保守性取代)。在某些实施方式中，所述IL-12衍生物包含达到约20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个保守性取代的氨基酸(参见，例如，Huang等，2016，Preclinical validation:LV/IL-12 transduction ofpatient leukemia cells for immunotherapy of AML，Molecular Therapy-Methods&Clinical Development，3，16074；doi:10.1038/mtm.2016.74，通过引用以其整体合并在本文中)。在某些实施方式中，所述保存性取代的氨基酸计划不处于细胞因子/受体界面中(参见，例如，Huang et al，2016，Preclinical validation:LV/IL-12transduction ofpatient leukemia cells for immunotherapyof AML，Molecular Therapy-Methods&Clinical Development，3，16074；doi:10.1038/mtm.2016.74；Jones&Vignali，2011，Molecular Interactions within the IL-6/IL-12 cytokine/receptor superfamily，Immunol Res.，51(1):5-14，doi:10.1007/sl2026-011-8209-y；其每一个通过引用一起整体合并在本文中)。在某些实施方式中，所述IL-12衍生物包含具有氨基酸取代L165S的IL-12 p35亚基(即，所述IL-12衍生物中所述IL-12 p35亚基的位置165处的亮氨酸用丝氨酸取代)。在某些实施方式中，所述IL-12衍生物包含具有氨基酸取代C2G的IL-12 p40亚基(即，所述IL-12衍生物中不成熟的IL-12 p40亚基(即，含有信号肽的所述IL-12 p40亚基)的位置2的半胱氨酸用甘氨酸取代)。
在具体的实施方式中，所述IL-12衍生物至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、或80％到85％、80％到90％、80％到95％、90％到95％、85％到99％、或95％到99％相同于(例如，序列同一性)天然IL-12。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12衍生物是由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、或80％到85％、80％到90％、80％到95％、90％到95％、85％到99％、或95％到99％相同于(例如，序列同一性)编码天然IL-12的核酸序列。在具体的实施方式中，所述IL-12衍生物包含IL-12 p35亚基，所述IL-12 p35亚基至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、或80％到85％、80％到90％、80％到95％、90％到95％、85％到99％、或95％到99％相同于(例如，序列同一性)天然IL-12 p35亚基。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12衍生物是由核酸序列编码的多肽，其中核酸序列的一部分编码IL-12 p35亚基，其中所述部分的所述核酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、或80％到85％、80％到90％、80％到95％、90％到95％、85％到99％、或95％到99％相同于(例如，序列同一性)编码天然IL-12 p35亚基的核酸序列。在具体的实施方式中，所述IL-12衍生物包含IL-12 p40亚基，所述IL-12 p40亚基至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、或80％到85％、80％到90％、80％到95％、90％到95％、85％到99％、或95％到99％相同于(例如，序列同一性)天然IL-12 p40亚基。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12衍生物是由核酸序列编码的多肽，其中核酸序列的一部分编码IL-12 p40亚基，其中所述部分的所述核酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％或99％、或80％到85％、80％到90％、80％到95％、90％到95％、85％到99％、或95％到99％相同于(例如，序列同一性)编码天然IL-12 p40亚基的核酸序列。在另一个具体的实施方式中，相对于天然IL-12，所述IL-12衍生物含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个、或2到5个、2到10个、5到10个、5到15个、5到20个、10到15个、或15到20个氨基酸突变(即，添加、删除和/或取代)。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12衍生物是核酸序列编码的多肽，所述核酸序列可以在高度、中度和典型严格杂交条件下与编码天然IL-12的核酸序列杂交。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12衍生物是核酸序列编码的多肽，所述核酸序列可以在高度、中度或典型严格杂交条件下与核酸序列杂交，所述核酸序列编码至少10个连续氨基酸、至少12个连续氨基酸、至少15个连续氨基酸、至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸、至少40个连续氨基酸、至少50个连续氨基酸、至少75个连续氨基酸、至少100个连续氨基酸、至少125个连续氨基酸、至少150个连续氨基酸、或10到20个、20到50个、25到75个、25到100个、25到150个、50到75个、50到100个、75到100个、50到150个、75到150个、100到150个、或100到200个连续氨基酸的天然IL-12的片段。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12衍生物是天然IL-12的片段。在另一个具体的实施方式中，所述IL-12衍生物包含由核苷酸序列编码的亚基(例如，p35或p40)，所述核苷酸序列在它的全长上与编码天然亚基(例如，天然p40亚基或天然p35亚基)的核苷酸杂交。在具体的实施方式中，所述IL-12衍生物包含天然IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基的衍生物。在具体的实施方式中，所述IL-12衍生物包含天然IL-12 p35亚基和IL-12 p40亚基的衍生物。IL-12衍生物还包括多肽，所述多肽包含IL-12的天然发生的成熟形式的氨基酸序列以及异源信号肽氨基酸序列。此外，IL-12衍生物包括已经被化学修饰的多肽，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解性裂解、连接到细胞配体或其他蛋白，等等。进一步地，IL-12衍生物包括包含一个或更多个非典型氨基酸的多肽。在具体的实施方式中，所述IL-12衍生物保持了衍生出它的天然IL-12的一种、两种或更多种、或所有的功能。确定IL-12衍生物是否保持了衍生出它的天然IL-12的一种或更多种功能的测试是本领域技术人员已知的，本文提供了实例。
在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV的包装基因组中编码IL-12或其衍生物的转基因是密码子优化的。在具体的实施方式中，编码天然IL-12的一个或两个亚基的核苷酸序列可以被密码子优化。编码IL-12 p35或其衍生物的密码子优化的序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:55。编码IL-12 p40或其衍生物的密码子优化的序列的非限制性实例包括SEQID NO:54和59。密码子优化的方法是本领域已知的，例如，Optimum GeneTM
Figure BDA0002363284960000541
方案和美国专利No.8,326,547，通过引用以其整体合并在本文中。
5.3 NDV的构建
本文描述的NDV(例如，章节5.1、5.2和6)可以使用反向遗传学技术产生。反向遗传学技术涉及制备合成的重组病毒RNA，其含有负链病毒RNA的非编码区，所述非编码区对于病毒聚合酶的识别以及对于产生成熟病毒所必需的包装信号是必不可少的。重组RNA从重组DNA模板中合成，并使用纯化的病毒聚合酶复合物在体外重构，以形成可用于转染细胞的重组核糖核蛋白(RNP)。如果在体外或体内的所述合成RNA的转录期间存在病毒聚合酶蛋白，实现更高效的转染。合成的重组RNP可以被拯救成为传染性的病毒颗粒。上述技术描述于1992年11月24日授权的美国专利No.5,166,057；1998年12月29日授权的美国专利No.5,854,037；2000年11月14日授权的美国专利No.6,146,642；1996年2月20日公开的欧洲专利公开EP 0702085A1；美国专利申请系列号No.09/152,845；1997年4月3日公开的国际专利公开PCT WO97/12032，1996年11月7日公开的W096/34625；欧洲专利公开EP A780475；1999年1月21日公开的WO 99/02657；1998年11月26日公开的WO 98/53078；1998年1月22日公开的WO98/02530；1999年4月1日公开的WO99/15672；1998年4月2日公开的WO98/13501；1997年2月20日公开的WO97/06270；和1997年6月25日公开的EP07804751，它们的每一个以其整体通过引用合并在本文中。
也可以使用无辅助细胞质粒技术来工程化的本文描述的NDV。简要地说，构建NDV(例如，Hitchner B1毒株)的完整cDNA，插入质粒载体中，并工程化以含有位于两个转录单元(例如，NDV P和M基因，或NDV HN和L基因)之间的独特限制位点。编码异源氨基酸序列(例如，IL-12转基因或其他序列，例如编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂的核苷酸序列)可以在所述独特限制位点插入病毒基因组中。做为选择，编码异源氨基酸序列(例如，IL-12转基因或其他序列，例如，编码免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或抑制信号的拮抗剂的核苷酸序列)可以工程化入NDV转录单元中，只要所述插入不影响病毒感染和复制的能力。单个的片段位于T7启动子与肝炎delta病毒核酶之间，以产生来自T7聚合酶的精确的负或正转录产物。包含必要的病毒蛋白质的质粒载体和表达载体转染入细胞中，引起重组病毒颗粒的产生(参见，例如，国际公开No.WO 01/04333；美国专利Nos.7,442,379、6,146,642、6,649,372、6,544,785和7,384,774；Swayne等(2003).Avian Dis.47:1047-1050；和Swayne等(2001).J.Virol.11868-11873其每一个通过引用以其整体合并在本文中)。
用于生产表达抗体的嵌合NDV的技术是本领域已知的。对于产生从两个转基因表达完整IgG的重组NDV，参见，例如，Puhler等，Gene Ther.15(5):371-283(2008)。
从单个mRNA产生多个蛋白质的双顺反子技术是本领域技术人员已知的。双顺反子技术容许通过使用IRES序列将多个蛋白质的编码序列工程化到单个mRNA中。IRES序列指导核糖体向RNA分子的内部征募，并容许以不依赖帽的方式进行下游翻译。简要地说，一种蛋白质的编码区被插入到第二蛋白质的ORF的下游。所述插入物的侧翼是IRES和为适当的表达和/或功能所必需的任何非翻译信号序列。所述插入物必需不破坏所述第二蛋白质的开放阅读框、多聚腺苷酸或转录启动子(参见，例如，Garcia-Sastre et al，1994，J.Virol.68:6254-6261and Garcia-Sastre et al，1994 Dev.Biol.Stand.82:237-246，其每一个通过引用以它们的整体合并在本文中)。
克隆嵌合NDV以编码转基因并表达由所述转基因编码的异源蛋白质(例如，IL-12)的方法是本领域技术人员已知的，例如，将所述转基因插入到已经被工程化到NDV基因组中的限制位点中，在所述转基因中包含适当的信号用于NDV RNA依赖性RNA聚合酶识别(例如，转基因的开放阅读框的上游的序列，其容许NDV聚合酶识别前一基因的末尾和转基因的起始，例如，它们可以由单个核苷酸基因间序列间隔)，包含有效的Kozak序列(例如，以改善真核的核糖体翻译)；掺入满足NDV克隆的“六位规则(rule of six)”的转基因；以及包含沉默突变以移除外部基因末端和/或转基因内的基因起始序列)。关于六位规则，本领域技术人员将理解，NDV(更一般地，副粘病毒科的大多数成员)的有效复制取决于为六的倍数的基因组长度，称为“六位规则”(参见，例如Calain，P.&Roux，L.The rule of six，a basic featureof efficient replication of Sendai virus defective interferingRNA.J.Virol.67，4822-4830(1993))。因而，当构建本文描述的嵌合NDV时，应当小心地满足NDV克隆的“六位规则”。可以使用本领域技术人员已知的方法来满足NDV克隆的六位规则，例如，添加转基因下游的核苷酸。对于克隆和拯救NDV(例如，嵌合NDV)的方法的讨论，参见，例如，Ayllon等，Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus fromcDNA.J.Vis.Exp.(80)，e50830，doi:10.3791/50830(2013)，通过引用以其整体合并在本文中。
在具体的实施方式中，本文描述的NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和6)可以根据章节6中描述的方法产生。
在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，本文描述的包含所述包装基因组的嵌合NDV包含La Sota毒株主干。在具体的实施方式中，La Sota毒株主干(即，没有所述转基因)的基因组序列在SEQ ID NO:50中列出。在具体的实施方式中，嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含SEQ ID NO:51、52或60中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，嵌合NDV用包装基因组，所述包装基因组具有SEQ ID NO:51、52或60中列出的核苷酸序列。在某些实施方式中，包含表10中列出的核苷酸序列的质粒用于生产嵌合NDV。在具体的实施方式中，具有表10中列出的核苷酸序列的质粒用于生产嵌合NDV。对于可以用于使用这样的质粒产生嵌合NDV的技术，参见下文的章节6。
5.4 NDV的增殖
本文描述的NDV(例如，嵌合NDV；还参见章节5.1、5.2和6)可以在任何底物中增殖，所述底物容许病毒生长到允许使用本文描述的病毒的滴度。在一个实施方式中，所述底物容许本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)生长到与相应的野生型病毒所测定的可比较的滴度。
本文描述的NDV(例如，嵌合NDV；还参见，例如，章节5.1、5.2和6)可以在对病毒的感染敏感的细胞(例如，禽类细胞、鸡细胞，等)、有胚蛋(例如，鸡蛋或鹌鹑蛋)或动物(例如，鸟类)中生长。这样的方法是本领域技术人员公知的。在具体的实施方式中，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)可以在癌症细胞中增殖，例如，癌细胞(例如，乳腺癌细胞和前列腺癌细胞)、肉瘤细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞和生殖细胞肿瘤细胞(例如，睾丸癌细胞和卵巢癌细胞)。在另一个具体的实施方式中，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)可以在细胞系中增殖，例如，癌症细胞系，例如，HeLa细胞、MCF7细胞、THP-1细胞、U87细胞、DU145细胞、Lncap细胞和T47D细胞。在某些实施方式中，所述细胞或细胞系(例如，癌细胞或癌细胞系)获自和/或衍生自人类。在另一个实施方式中，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)在鸡细胞或有胚蛋中增殖。代表性的鸡细胞包括，但不限于，鸡胚成纤维细胞和鸡胚肾脏细胞。在具体的实施方式中，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)在Vero细胞中增殖。在另一个具体的实施方式中，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)根据下文的章节6中描述的方法在癌细胞中增殖。在另一个具体的实施方式中，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)在鸡蛋或鹌鹑蛋中增殖。在某些实施方式中，本文描述的NDV病毒(例如，嵌合NDV)首先在有胚蛋中增殖，然后在细胞(例如，细胞系)中增殖。
本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)可以在有胚蛋中增殖，例如，6到14天龄、6到12天龄、6到10天龄、6到9天龄、6到8天龄、8到10天龄、或10到12天龄的有胚蛋。幼小或不成熟的有胚蛋可以用于增殖本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)。不成熟的有胚蛋包括小于十天龄的蛋，例如，IFN缺陷的6到9天龄或6到8天龄的蛋。不成熟的有胚蛋还包括一些蛋，其作为生长条件改变的结果，例如，孵育温度方面的改变；用药物处理；或引起蛋延迟发育的任何其他改变，人工地模拟最多但是小于十天龄的不成熟的蛋，从而与十到十二天龄的蛋相比所述IFN系统没有充分发育。在具体的实施方式中，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)在10天龄有胚鸡蛋中增殖。本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)可以在有胚蛋的不同位置增殖，例如，尿囊腔。关于生长和增殖病毒的详述讨论，参见，例如，美国专利No.6,852,522和美国专利No.7,494,808，这两篇通过引用以其整体合并在本文中。
在具体的实施方式中，本文提供的是增殖本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合NDV)的方法，所述方法包括培养用所述NDV感染的底物(例如，细胞系或有胚蛋)。在另一个具体的实施方式中，本文提供的增殖本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合NDV)的方法，所述方法包括:(a)培养用所述NDV感染的底物(例如，细胞系或有胚蛋)；和(b)从所述底物分离或纯化所述NDV。在某些实施方式中，这些方法涉及在培养所述底物之前用所述NDV感染所述底物。对于可以用于增殖本文描述的NDV(例如，本文描述的嵌合NDV)的方法，参见下文的章节6。
对于病毒分离，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)可以从有胚蛋或细胞培养物中移除，或从细胞成分中分离，一般地通过公知的澄清过程，例如，离心、深度过滤和微滤，可以使用本领域技术人员公知的过程按需要进一步纯化，例如，切向流动过滤(TFF)、密度梯度离心、微分萃取或层析。
在具体的实施方式中，从感染的蛋(例如，鸡蛋)的尿囊液中分离病毒从收获尿囊液开始，使用过滤系统(包括例如1.2μm玻璃纤维死端过滤)进行澄清来除去细胞和其他大的碎片，具体地，包括具有净正电荷的膜，使得宿主细胞DNA有可测量的降低。澄清的部分随后通过切向流动过滤处理，例如，通过使用750kD空心纤维膜，将澄清的部分浓缩约五倍。浓缩的澄清部分然后针对四倍体积的高盐缓冲液进行渗滤，随后四倍体积的低盐配方缓冲液，随后浓缩大约10倍。因而，残余的卵蛋白质，例如，主要为卵白蛋白，以及残余的DNA被降低到可接受水平，将缓冲液交换为与施用给对象的组合物的嵌合NDV配方相容的缓冲液。得到的产物然后通过滤器例如0.2μm滤器进行无菌过滤，分配到适当的无菌贮藏容器中，冷冻并在-70℃下保存。
在具体的实施方式中，本文描述的NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和6)根据章节6中描述的方法增殖、分离的和/或纯化。在具体的实施方式中，本文描述的NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和6)使用章节6中描述的方法增殖、分离或纯化、或上述的任何两项或所有。
5.5 PD-1或其配体的拮抗剂
本文还提供的用于与本文描述的NDV组合使用的PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.1、章节5.2、章节5.5、章节5.7和/或章节6)。在本文描述的方法中可以使用本领域技术人员已知的任何PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.5、章节5.7和/或章节6)。PD-1的配体的具体实例包括PD-L1和PD-L2。
在另一个实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是特异性结合PD-1的配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)的抗体(或抗原结合片段)或可溶受体。在具体的实施方式中，所述拮抗剂阻断PD-1的配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)结合PD-1和转导抑制信号。在某些实施方式中，所述可溶受体是PD-1的片段或PD-1的衍生物的片段(例如，PD-1或PD-1的衍生物的细胞外结构域)，其结合PD-1的配体。在某些实施方式中，所述可溶受体是融合蛋白，所述融合蛋白包含PD-1或PD-1的衍生物的至少一部分(例如，PD-1或PD-1的衍生物的细胞外结构域)和异源氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含PD-1或PD-1的衍生物的至少一部分以及免疫球蛋白的Fc部分或其片段。
在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1的配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)的抗体(或抗原结合片段)。在具体的实施方式中，所述拮抗剂(完全地或部分地)阻断PD-1的配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)与PD-1相互作用和转导抑制信号。在某些具体的实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在某些特定的实施方式中，所述抗体是scFv。在某些具体的实施方式中，所述抗体是骆驼化抗体。在特定的实施方式中，所述抗体是人类的或人源化抗体。结合PD-1的配体的抗体的非限制性实例包括度伐鲁单抗(durvalumab)(也称为“medi-4736”；参见，例如Lutzky等，J ClinOncol.2014；32(suppl 5S):abstr 3001)、阿维鲁单抗(例如，用于默克尔细胞癌)(也称为“MSB0010718C”；参见，例如，Heery等J Clin Oncol.2014；32(suppl 5S):abstr 3064)、bms-936559(参见，例如，Brahmer等N.Engl.J.Med.2012；366，2455-2465)，和阿特珠单抗(也称为“mpdl3280A”或
Figure BDA0002363284960000591
参见，例如，McDermott等，J ClinOncol.2016；34(8):833-842，Herbst等，J Clin Oncol.2013；31(suppl):abstr 3000，以及TECENTRIQ的完整处方信息，Reference ID:3933242)。
在具体的实施方式中，其中所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1的配体(例如，PD-L1或PD-L2)的抗体，所述抗体是PD-1配体阻断抗体。在具体的实施方式中，所述抗PD-1配体抗体(例如，抗PD-L1或抗PD-L2抗体)特异性结合PD-1配体(例如，PD-L1或PD-L2)。在具体的实施方式中，所述PD-1配体是人类PD-L1。在另一个具体的实施方式中，所述PD-1配体是人类PD-L2。在具体的实施方式中，抗PD-L1或抗PD-L2抗体抑制或降低PD-L1或PD-L2与PD-1之间的相互作用。在具体的实施方式中，抗PD-L1或抗PD-L2抗体分别是结合PD-L1或PD-L2的抗体，并且(完全地或部分地)阻断PD-L1或PD-L2与PD-1之间的相互作用，从而释放PD-1途径介导的免疫反应抑制，包括抗肿瘤响应。在具体的实施方式中，PD-L1或PD-L2与PD-1之间的相互作用的阻断是完全的。在具体的实施方式中，PD-L1或PD-L2与PD-1之间的相互作用的阻断是指，通过本领域技术人员已知的任何方法评估的，例如，免疫共沉淀或共定位分析，与在存在阴性对照疗法(例如，抗IgG抗体)的情况下PD-L1或PD-L2分别与PD-1之间的相互作用相比，PD-L1PD-L2与PD-1之间的相互作用的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％)、或99％的阻断。在具体的实施方式中，抗PD-L1或抗PD-L2抗体抑制或降低PD-11的PD-L1或PD-L2依赖性活化。在具体的实施方式中，所述配体依赖性活化的抑制是完全的。在具体的实施方式中，所述配体依赖性活化的抑制是指，通过本领域技术人员已知的任何方法评估的，例如磷酸化分析，与存在阴性对照疗法(例如，抗IgG抗体)的情况下的配体依赖性PD-1活化相比，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的配体依赖性活化的抑制。
在某些实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是抗体，其结合PD-L1、(完全地或部分地)阻断PD-L1与PD-1之间的相互作用，并(完全地或部分地)阻断PD-L1与CD80(B7.1)之间的相互作用。在某些实施方式中，所述抗体是IgG1单克隆抗体。在具体的实施方式中，所述抗体是度伐鲁单抗。
在另一个实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是抗体或配体，按本文描述的或本领域技术人员已知的技术测量的，其结合PD-1(例如，人类PD-1)，但是不转导抑制信号。在具体的实施方式中，所述抗体或配体结合人类PD-1。在特定的实施方式中，所述抗体或配体特异性结合PD-1(例如，人类PD-1)。在某些具体的实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在某些特定的实施方式中，所述抗体是scFv。在某些具体的实施方式中，所述抗体是骆驼化抗体。在特定的实施方式中，所述抗体是人类的或人源化抗体。结合PD-1的抗体的非限制性实例包括派姆单抗(“KEYTRUDA”；参见，例如，N Engl J Med.2013；369:134-44，以及KEYTRUDA的完整处方信息，Reference ID:3862712)、纳武单抗(
Figure BDA0002363284960000601
参见，例如，Topalian等，N Engl J Med.2012；366:2443-54以及OPDIVO(纳武单抗)的完整处方信息，Reference ID:3677021)、和MEDI0680(也称为“AMP-514”；参见，例如，Hamid等，AnnOncol.2016；27(suppl_6):1050PD)。在优选的实施方式中，所述抗PD-1抗体是派姆单抗。
在具体的实施方式中，其中所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1(例如，人类PD-1)的抗体，所述抗体是阻断或降低PD-1(例如，人类PD-1)与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)之间的相互作用的抗PD-1抗体。在具体的实施方式中，PD-1阻断抗体结合PD-1并抑制或降低PD-1(例如，人类PD-1)与其配体(例如，PD-L1、PD-L2或两者)之间的相互作用。在具体的实施方式中，所述PD-1阻断抗体特异性结合PD-1。在某些实施方式中，抗PD-1是一种抗体，其结合PD-1(例如，人类PD-1)并(完全地或部分地)阻断PD-1(例如，人类PD-1)与PD-L1、PD-L2或两者之间的相互作用，从而释放免疫反应的PD-1途径介导的抑制，包括抗肿瘤响应。在具体的实施方式中，抗PD-1是一种抗体，其结合PD-1(例如，人类PD-1)并(完全地或部分地)阻断PD-1(例如，人类PD-1)与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用，从而释放免疫反应的PD-1途径介导的抑制，包括抗肿瘤响应。在具体的实施方式中，PD-1(例如，人类PD-1)与PD-L1、PD-L2或两者之间的相互作用的阻断是完全的。在具体的实施方式中，PD-1(例如，人类PD-1)与PD-L1、PD-L2或两者之间的相互作用的阻断是指，通过本领域技术人员已知的任何方法评估的，例如，免疫共沉淀或共定位分析，与在存在阴性对照疗法(例如，抗IgG抗体)的情况下PD-1(例如，人类PD-1)与PD-L1、PD-L2或两者之间的相互作用相比，PD-1(例如，人类PD-1)与PD-L1、PD-L2或两者之间的相互作用的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的阻断。在具体的实施方式中，抗PD-1抗体抑制PD-1(例如，人类PD-1)的配体依赖性(例如，PD-L1、PD-L2或两者)活化。在具体的实施方式中，所述配体依赖性活化的抑制是完全的。在具体的实施方式中，所述配体依赖性活化的抑制是指，通过本领域技术人员已知的任何方法评估的，例如磷酸化分析，与存在阴性对照疗法(例如，抗IgG抗体)的情况下的配体依赖性PD-1(例如，人类PD-1)活化相比，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的配体依赖性活化的抑制。
在另一个实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1(例如，人类PD-1)、但不转导抑制信号的配体。在另一个实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1(例如，人类PD-1)、但仅名义上转导抑制信号的配体。在某些具体的实施方式中，所述配体是融合蛋白，其包含PD-1(例如，人类PD-1)的配体PD-1的配体的衍生物的至少一部分，以及异源氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含PD-1的配体或PD-1的配体的衍生物的至少一部分以及免疫球蛋白的Fc片段或其部分。这样的融合蛋白的实例是AMP-224(参见，例如，Infante等，J Clin Oncol.2013；31(suppl):abstr3044)。
在某些实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂(例如，选择性地)抑制或降低PD-1(例如，人类PD-1)与它的配体的结合诱导的一个或更多个信号转导途径。在具体的实施方式中，相对于不存在所述拮抗剂的情况下由PD-1(例如，人类PD-1)与一种或更多种它的配体(例如，PD-L1、PD-L2或两者)的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，PD-1或其配体的拮抗剂抑制或降低由PD-1(例如，人类PD-1)与一种或更多种它的配体(例如，PD-L1、PD-L2或两者)的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径达至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％、或在25％到50％之间、25％到75％之间、50％到75％之间、50％到95％之间、75％到95％之间或75％到100％之间的范围内。在具体的实施方式中，PD-1的拮抗剂与它的配体:(i)相对于在不存在所述拮抗剂的情况下由PD-1(例如，人类PD-1)与一个特定配体(例如，PD-L1)的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，抑制或降低由PD-1(例如，人类PD-1)与一个特定配体(例如，PD-L1)的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径达至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％、或在25％到50％之间、25％到75％之间、50％到75％之间、50％到95％之间、75％到95％之间或75％到100％之间的范围内；并且(ii)不抑制或降低，或者相对于不存在所述拮抗剂的情况下由PD-1与一种或更多种其他配体的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，抑制或降低由PD-1(例如，人类PD-1)与这样的一种或更多种其他配体(例如，PD-L2)的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径达小于20％、15％、10％、5％或2％，或在2％到5％之间、2％到10％之间、5％到10％之间、5％到15％之间、5％到20％之间、10％到15％之间、或15％到20％之间的范围内。
在具体的实施方式中，相对于不存在所述拮抗剂的情况下由PD-1(例如，人类PD-1)与PD-L1、PD-L2之一或两者的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，PD-1或其配体的拮抗剂抑制或降低由PD-1(例如，人类PD-1)与PD-L1、PD-L2之一或两者的结合所诱导的一个或更多个所述信号转导途径达至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％、或在25％到50％之间、25％到75％之间、50％到75％之间、50％到95％之间、75％到95％之间或75％到100％之间的范围内。在具体的实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂诱导、活化和/或增强一种或更多种免疫活性、功能或反应。所述一种或更多种免疫活性、功能或反应可以是例如抗体反应(体液反应)或细胞免疫反应的形式，例如，细胞因子分泌(例如，干扰素-γ)、辅助细胞活性或细胞的细胞毒性。在一个实施方式中，免疫细胞上活化标志物(例如，CD44、颗粒酶或Ki-67)的表达、免疫细胞上共刺激受体(例如，ICOS、CD28、OX40或CD27)的表达、共刺激受体的配体(例如，B7HRP1、CD80、CD86、OX40L、或CD70)的表达、细胞因子分泌、免疫细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞和/或NK细胞)向肿瘤的浸润、抗体产生、效应物功能、T细胞活化、T细胞分泌、T细胞增值、B细胞分泌、B细胞增值、和/或NK细胞增值，在与PD-1或其配体的拮抗剂接触之后被诱导、活化和/或增强。在另一个实施方式中，骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)肿瘤浸润和增殖、Treg肿瘤浸润、活化和增殖，外周血MDSC和Treg计数在与PD-1或其配体的拮抗剂接触之后被抑制。在另一个实施方式中，PD-1的配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)在与PD-1或其配体的拮抗剂接触之后被诱导、活化和/或增强。在特定的实施方式中，PD-L1的表达在与PD-1或其配体的拮抗剂接触之后被诱导和/或提高。在另一个实施方式中，下文的章节6中描述的一种、两种或更多种作用在与PD-1或其配体的拮抗剂接触之后发生。
PD-1或其配体的拮抗剂的非限制性实例包括派姆单抗(
Figure BDA0002363284960000631
参见，例如，Hamid等，NEngl J Med.2013；369:134-44以及KEYTRUDA(派姆单抗)的完整处方信息)，纳武单抗(
Figure BDA0002363284960000632
参见，例如，以及OPDIVO(纳武单抗)的完整处方信息，ReferenceID:3677021)、AMP-224(参见，例如，Infante等，J Clin Oncol.2013；31(suppl):abstr3044)、MEDI0680(也称为“AMP-514”；参见，例如，Hamid等，Ann Oncol.2016；27(suppl_6):1050PD)、度伐鲁单抗(也称为“medi-4736”；参见，例如，Lutzky等，J Clin Oncol.2014；32(suppl 5S):abstr 3001))、阿维鲁单抗(例如，用于默克尔细胞癌)(也称为“MSB0010718C”；参见，例如，Heery等J Clin Oncol.2014；32(suppl 5S):abstr 3064)、bms-936559(参见，例如，Brahmer等N.Engl.J.Med.2012；366，2455-2465)、以及阿特珠单抗(也称为“mpdl3280A”和
Figure BDA0002363284960000633
参见，例如，McDermott等，J ClinOncol.2016；34(8):833-842，Herbst等，J Clin Oncol.2013；31(suppl):abstr 3000，和TECENTRIQ的完整处方信息，Reference ID:3933242)。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是美国食品与药品管理局批准用于治疗一种或更多种癌症的疗法。美国食品与药品管理局批准用于治疗癌症的PD-1或其配体的拮抗剂的非限制性实例包括派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗和阿维鲁单抗。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是EMA批准用于治疗一种或更多种癌症的疗法。EMA批准用于治疗癌症的PD-1或其配体的拮抗剂的非限制性实例包括派姆单抗、纳武单抗和阿特珠单抗。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是纳武单抗。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是国际专利申请公开No.WO 2008/156712或美国专利No.8,354,509、美国专利No.8,952,136或美国专利No.8,900,587中描述的抗PD-1抗体，其每一个通过引用以其整体合并在本文中。在优选的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是派姆单抗。
在具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1的抗体，该抗体包含可变轻链区(VLCR)互补决定区(CDR)1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)，VLCRCDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)，可变重链区(VHCR)CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)，VHCRCDR2，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:7)，以及VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1的抗体，该抗体包含(a)VLCR，其包含(i)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1),(ii)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，和(iii)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)；和(b)VHCR，其包含(i)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6),(ii)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:7)，和(iii)VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)。在具体的实施方式中，所述抗体是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是人源化单克隆抗体。在另一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:4)；和(b)VHCR，其包含(i)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)，(ii)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:7)，和(iii)VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含(i)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)，(ii)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，和(iii)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)；和(b)VHCR，其包含氨基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQG TTVTVSS(SEQ ID NO:9)。在具体的实施方式中，所述抗体是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是人源化单克隆抗体。在另一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在优选的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:4)；和(b)VHCR，其包含氨基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQG TTVTVSS(SEQ ID NO:9)。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含可变轻链区(VLCR)互补决定区(CDR)1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)，VLCR CDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ IDNO:2)，VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)，可变重链区(VHCR)CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)，VHCRCDR2，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:7)和VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)。在另一个具体的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含(a)VLCR，其包含(i)VLCR CDR 1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1),(ii)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，和(iii)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)；和(b)VHCR，其包含(i)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6),(ii)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:7)和(iii)VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)。在具体的实施方式中，所述抗体是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是人源化单克隆抗体。在另一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:4)；和(b)VHCR，其包含(i)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)，(ii)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ IDNO:7)，和(iii)VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含(i)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)，(ii)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，和(iii)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)；和(b)VHCR，其包含氨基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQG TTVTVSS(SEQ ID NO:9)。在具体的实施方式中，所述抗体是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是人源化单克隆抗体。在另一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含:(a)VLCRCDR1、VLCR CDR2和VLCR CDR3，其分别包含VLCR的VLCR CDR1、VLCR CDR2和VLCR CDR3的氨基酸序列，所述VLCR包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:4)；和(b)VHCR CDR1、VHCR CDR2和VHCRCDR3，其分别包含VHCR的VHCR CDR1、VHCR CDR2和VHCR CDR3的氨基酸序列，所述VHCR包含氨基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQG TTVTVSS(SEQ ID NO:9)。在某些方面，抗体的CDR可以根据Kabat编号系统确定。在具体的实施方式中，所述VCLR CDR1包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)，所述VLCR CDR2包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，所述VLCR CDR3包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)，所述VHCR CDR1包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)，所述VHCR CDR2包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:7)，和所述VHCR CDR3包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)，如根据Kabat编号系统所确定的。在某些方面，抗体的CDR可以根据Chothia编号方案确定，其是指免疫球蛋白结构环的位置(参见，例如，Chothia and Lesk，1987，J.Mol.Biol.，196:901-917；Al-Lazikani等，1997，J.Mol.Biol.，273:927-948；Chothia等，1992，J.Mol.Biol.，227:799-817；Tramontano A等，1990，J.Mol.Biol.215(l):175-82；和美国专利No.7,709,226)。在某些方面，抗体的CDR可以根据IMGT编号系统确定，如在Lefranc，M.-P.，1999，TheImmunologist，7:132-136和Lefranc，M.-P.等，1999，Nucleic Acids Res.，27:209-212中描述的。在某些方面，抗体的CDR可以根据MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，262:732-745确定。也参见，例如，Martin，A.，"Protein Sequence and Structure Analysis of AntibodyVariable Domains,"in Antibody Engineering，Kontermann and Diibel，eds.，Chapter31，pp.422-439，Springer-Verlag，Berlin(2001)。在某些方面，抗体的CDR可以根据AbM编号方案确定，其是指AbM高变区，代表Kabat CDRs和Chothia结构环之间的折中，由OxfordMolecular's AbM抗体建模软件使用。在具体的实施方式中，所述抗体是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是人源化单克隆抗体。在另一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
术语“Kabat编号”和类似的术语是本领域公认的，是指编码抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的氨基酸残基的系统。在某些方面，抗体的CDR可以根据Kabat编号系统确定(参见，例如，Kabat等(1971)Ann.NY Acad.Sci.190:382-391and，Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。对于Kabat编号系统，(i)VH CDR1一般位于重链的氨基酸位置31到35，其任选地包括氨基酸位置35之后的一个或两个额外的氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A和35B)；(ii)VH CDR2一般地位于重链的氨基酸位置50到65；和(iii)VH CDR2一般位于重链的氨基酸位置95到102(Kabat，Elvin A.etal，Sequences of Proteins of Immunological Interest.Bethesda:NationalInstitutes of Health，1983)。对于Kabat编号系统,(i)VL CDR1一般位于轻链的氨基酸位置24到34；(ii)VL CDR2一般地位于轻链的氨基酸位置50到56；和(iii)VL CDR3一般位于轻链的氨基酸位置89到97(Kabat，Elvin A.et al，Sequences of Proteins ofImmunological Interest.Bethesda:National Institutes of Health，1983)。本领域技术人员公知的是，使用Kabat系统，抗体可变域的实际上线性的氨基酸序列由于FR和/或CDR的缩短或延长可以含有较少的或额外的氨基酸，因而氨基酸的Kabat编号不必然与它的线性氨基酸编号相同。
Chothia定义基于结构环区的位置(Chothia et al,(1987)J Mol Biol 196:901-917；和美国专利No.7,709,226)。术语“Chothia CDR”和类似术语是本领域公认的，是指根据Chothia and Lesk，1987，J.Mol.Biol.，196:901-917的方法确定的抗体CDR序列，其在本文中称为“Chothia CDR”。(也参见，例如，美国专利No.7,709,226和Martin，A.，"ProteinSequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains,"in AntibodyEngineering，Kontermann and Diibel，eds.，Chapter 31，pp.422-439，Springer-Verlag，Berlin(2001))。对于Chothia编号系统，使用编号VH区中的氨基酸残基的Kabat编号系统，(i)VH CDR1一般位于重链的氨基酸位置26到32；(ii)VH CDR2一般地位于重链的氨基酸位置53到55；和(iii)VH CDR3一般位于重链的氨基酸位置96到101。在具体的实施方式中，对于Chothia编号系统，使用编号VH区中的氨基酸残基的Kabat编号系统，(i)VH CDR1一般位于重链的氨基酸位置26到32或34；(ii)VH CDR2一般位于重链的氨基酸位置52到56(在一个实施方式中，CDR2位于52A-56，其中52A在位置52之后)；和(iii)VH CDR3一般位于重链的氨基酸位置95到102(在一个实施方式中，在编号96-100的位置没有氨基酸)。对于Chothia编号系统而言，使用编号VL区中的氨基酸残基的Kabat编号系统，(i)VL CDR1一般位于轻链的氨基酸位置26到33；(ii)VL CDR2一般位于轻链的氨基酸位置50到52；和(iii)VL CDR3一般位于轻链的氨基酸位置91到96。在具体的实施方式中，对于Chothia编号系统而言，使用编号VL区中的氨基酸残基的Kabat编号系统，(i)VL CDR1一般位于轻链的氨基酸位置24到34；(ii)VL CDR2一般位于轻链的氨基酸位置50到56；和(iii)VL CDR3一般位于轻链的氨基酸位置89到97(在一个实施方式中，在编号96-100的位置没有氨基酸)。这些Chothia CDR位置可以取决于抗体而不同，可以根据本领域已知的方法来确定。
IMGT定义来自EVIGT(“
Figure BDA0002363284960000691
国际免疫遗传学信息
Figure BDA0002363284960000692
，网站imgt.org，创始人兼董事:Marie-Paule Lefranc，Montpellier，France；参见，例如，Lefranc，M.-P.，1999，The Immunologist，7:132-136and Lefranc，M.-P.等，1999，Nucleic Acids Res.，27:209-212，这两篇通过引用以其整体合并在本文中)。对于IMGT编号系统，(i)VH CDR1一般位于重链的氨基酸位置25到35；(ii)VH CDR2一般位于重链的氨基酸位置51到57；和(iii)VH CDR2一般位于重链的氨基酸位置93到102。对于IMGT编号系统，(i)VL CDR1一般位于轻链的氨基酸位置27到32；(ii)VL CDR2一般位于轻链的氨基酸位置50到52；和(iii)VL CDR3位于轻链的氨基酸位置89到97。
在优选的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:4)；和(b)VHCR，其包含氨基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQG TTVTVSS(SEQ ID NO:9)。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含:(a)轻链，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:5)；和(b)重链，其包含VHCR，所述VHCR包含氨基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:9)。在另一个具体的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含:(a)轻链，其包含VLCR，所述VLCR包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:4)；和(b)重链，其包含氨基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:10)。
在优选的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含:(a)轻链，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:5)；和(b)重链，其包含氨基酸序列QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:10)。
在具体的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1的抗体，该抗体包含VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:11)，VLCR CDR2，其包含氨基酸序列DASNRAT(SEQID NO:12)，VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QQSSNWPRT(SEQ ID NO:13)，VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NSGMH(SEQ ID NO:16)，VHCR CDR2，其包含氨基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG(SEQID NO:17)，和VHCR CDR3，其包含氨基酸序列NDDY(SEQ ID NO:18)。在另一个具体的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含(i)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:11)，(ii)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:12)，和(iii)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QQSSNWPRT(SEQ ID NO:13)；和(b)VHCR，其包含(i)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NSGMH(SEQ ID NO:16)，(ii)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG(SEQ ID NO:17)，和(iii)VHCR CDR3，其包含氨基酸序列NDDY(SEQ ID NO:18)。在具体的实施方式中，所述抗体是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是人源化单克隆抗体。在另一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:14)；和(b)VHCR，其包含(i)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NSGMH(SEQ ID NO:16)，(ii)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG(SEQ ID NO:17)，和(iii)VHCR CDR3，其包含氨基酸序列NDDY(SEQ IDNO:18)。在另一个具体的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含(i)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:11)，(ii)VLCRCDR2，其包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:12)，和(iii)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QQSSNWPRT(SEQ ID NO:13)；和(b)VHCR，其包含QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:19)。在具体的实施方式中，所述抗体是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是人源化单克隆抗体。在另一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2的结合的抗体，该抗体包含VLCR CDR1，QI BAOH氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ IDNO:11)，VLCR CDR2，其包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:12)，VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QQSSNWPRT(SEQ ID NO:13)，VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NSGMH(SEQ ID NO:16)，VHCR CDR2，其包含氨基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG(SEQ ID NO:17)，和VHCR CDR3，其包含氨基酸序列NDDY(SEQ ID NO:18)。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2的结合的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含(i)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:11)，(ii)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:12)，和(iii)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QQSSNWPRT(SEQID NO:13)；和(b)VHCR，其包含(i)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NSGMH(SEQ ID NO:16)，(ii)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG(SEQ ID NO:17)，和(iii)VHCRCDR3，其包含氨基酸序列NDDY(SEQ ID NO:18)。在具体的实施方式中，所述抗体是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是人源化单克隆抗体。在另一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2的结合的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:14)；和(b)VHCR，其包含(i)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NSGMH(SEQID NO:16)，(ii)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG(SEQ ID NO:12)，和(iii)VHCR CDR3，其包含氨基酸序列NDDY(SEQ ID NO:18)。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2的结合的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含(i)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:11)，(ii)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:12)，和(iii)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QQSSNWPRT(SEQ ID NO:13)；和(b)VHCR，其包含QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:19)。在具体的实施方式中，所述抗体是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体。在某些实施方式中，所述抗体是人源化抗体或嵌合抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是人源化单克隆抗体。在另一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2的结合的抗体，该抗体包含:(a)VLCR CDR1、VLCR CDR2和VLCR CDR3，其分别包含VLCR的VLCR CDR1、VLCR CDR2和VLCR CDR3的氨基酸序列，所述VLCR包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:14)；和(b)VHCR CDR1、VHCR CDR2和VHCR CDR3，其分别包含VHCR的VHCR CDR1、VHCR CDR2和VHCR CDR3的氨基酸序列，所述VHCR包含氨基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:19)。在某些方面，抗体的CDR可以根据Kabat编号系统确定。在某些方面，抗体的CDR可以根据Chothia编号方案确定。在某些方面，抗体的CDR可以根据MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，262:732-745确定。在某些方面，抗体的CDR可以根据IMGT编号系统确定，如在Lefranc，M.-P.，1999，TheImmunologist，7:132-136和Lefranc，M.-P.等，1999，Nucleic Acids Res.，27:209-212中描述的。在某些方面，抗体的CDR可以根据AbM编号方案确定。在具体的实施方式中，所述抗体是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体。在另一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2的结合的抗体，该抗体包含:(a)VLCR，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:14)；和(b)VHCR，其包含氨基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:19)。在具体的实施方式中，所述抗体是IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)抗体。在优选的实施方式中，所述抗体是IgG4抗体。在另一个优选的实施方式中，所述抗体是IgG4 kappa免疫球蛋白。
在具体的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含:(a)轻链，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:15)；和(b)重链，其包含VHCR，所述VHCR包含氨基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:19)。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含:(a)轻链，其包含VLCR，所述VLCR包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:14)，和(b)重链，其包含氨基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:20)。
在优选的实施方式中，本文提供的结合人类PD-1并阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体，该抗体包含:(a)轻链，其包含氨基酸序列EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:15)和，(b)重链，其包含氨基酸序列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQ EGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:20)。
PD-1或其配体的拮抗剂可以通过本领域技术人员已知的技术生产。对于可以用于生产PD-1或其配体的拮抗剂的技术，参见，例如，美国专利No.9,642,298、美国专利No.8,952,136、美国专利No.8,900,587、美国专利No.8,168,757、美国专利No.7,488,802、美国专利申请公开No.2016/0137721，和国际专利申请公开No.WO2014/159960。在具体的实施方式中，PD-1或其配体的拮抗剂是分离的。
5.5.1抗体生产
在一个方面，本文提供的是制造本文描述的PD-1或其配体的抗体或其他蛋白性拮抗剂的方法。在具体的实施方式中，通过涉及创造，例如通过序列的合成或遗传工程化的任何方式，可以制备、表达、创造或分离本文描述的PD-1或其配体的抗体或其他蛋白质性拮抗剂。在具体的实施方式中，这样的PD-1或其配体的抗体或其他蛋白质性拮抗剂包含由DNA序列编码的序列，所述DNA序列不天然地存在于动物或哺乳动物(例如，人类)的抗体种系全集之内。
在某些方面，制造本文描述的PD-1或其配体的抗体或其他蛋白质性拮抗剂的方法包括培养细胞(例如，宿主细胞或杂交瘤细胞)的步骤，所述细胞表达所述PD-1或其配体的抗体或其他蛋白质性拮抗剂。在某些实施方式中，制造本文描述的PD-1或其配体的抗体或其他蛋白质性拮抗剂的方法进一步包括纯化由所述细胞表达的所述PD-1或其配体的抗体或其他蛋白质性拮抗剂的步骤。在某些方面，制造本文描述的PD-1或其配体的抗体或其他蛋白质性拮抗剂的方法，包括培养细胞(例如，宿主细胞或杂交瘤细胞)的步骤，所述细胞包含编码所述PD-1或其配体的抗体或其他蛋白质性拮抗剂的多核苷酸或载体。在特定的方面，本文提供的是生产本文描述的抗体的方法，包括从宿主细胞表达这样的抗体。所述细胞可以是原代细胞或细胞系。在特定的实施方式中，所述宿主细胞分离自其他细胞。在另一个实施方式中，所述宿主细胞不存在于对象的身体内。
Sambrook，Fritsch and Maniatis(1982&1989 2nd Edition，2001 3rd Edition)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning，3rd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Wu(1993)RecombinantDNA，Vol.217，Academic Press，San Diego，CA)描述了分子生物学的标准方法。标准方法还见于Ausbel，等(2001)Current Protocols in Molecular Biology，Vols.1-4，John Wiley andSons，Inc.New York，NY，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)，哺乳动物和酵母中的克隆(第2卷)，糖结合物和蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。
描述了蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶(Coligan，等(2000)Current Protocols in Protein Science，Vol.1，John Wiley and Sons，Inc.，NewYork)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白生产和蛋白质的糖基化(参见，例如，Coligan，等(2000)Current Protocols in Protein Science，Vol.2，John Wiley andSons，Inc.，New York；Ausubel，等(2001)Current Protocols in Molecular Biology，Vol.3，John Wiley and Sons，Inc.，NY，NY，pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich，Co.(2001)Products for Life Science Research，St.Louis，MO；pp.45-89；AmershamPharmacia Biotech(2001)BioDirectory，Piscataway，N.J.，pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan，等(2001)Current Protocols inImmunology，Vol.1，John Wiley and Sons，Inc.，New York；Harlow and Lane(1999)UsingAntibodies，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Harlowand Lane，supra)。表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的(参见，例如，Coligan，等(2001)Current Protocols in Immunology，Vol.4，John Wiley，Inc.，New York)。
在某些方面，本文提供的是细胞(例如，宿主细胞)，其表达(例如，重组地表达)本文描述的抗体和相关的表达载体。在另一个方面，本文提供的是载体(例如，表达载体)，其包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码抗体的核苷酸序列，用于在宿主细胞中，优选地在哺乳动物细胞中重组表达。本文还提供的是宿主细胞，其包含编码抗体的多核苷酸，或包含编码抗体的多核苷酸的载体，用于重组表达本文描述的抗体。在具体的实施方式中，本文提供的是包含两种载体的宿主细胞，其中第一载体包含编码本文描述的抗体的可变重链区的多核苷酸，第二载体包含编码抗体的可变轻链区的多核苷酸，用于重组表达本文描述的抗体。所述细胞可以是原代细胞或细胞系。在特定的实施方式中，所述宿主细胞分离自其他细胞。在另一个实施方式中，所述宿主细胞不存在于对象的身体内。
本文描述的抗体(例如，单克隆抗体，例如，嵌合抗体或人源化抗体，或其抗原结合片段)可以通过用于合成抗体的本领域已知的任何方法生产，例如，通过化学合成或通过重组表达技术。除非另有陈述，本文描述的方法采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交和相关领域中的常规技术。这些技术在本文引用的参考文献中描述，并且在文献中被充分解释。参见，例如，Maniatis等(1982)Molecular Cloning:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Sambrook等(1989)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook等(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel et al，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons(1987andannual updates)；Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(1987andannual updates)Gait(ed.)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach，IRL Press；Eckstein(ed.)(1991)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach，IRL Press；Birren等(eds.)(1999)Genome Analysis:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
单克隆、多克隆和人源化抗体可以通过本领域已知的技术制备(参见，例如，Sheperdand Dean(eds.)(2000)Monoclonal Antibodies，Oxford Univ.Press，New York，NY；Kontermann and Dubel(eds.)(2001)Antibody Engineering，Springer-Verlag，NewYork；Harlow and Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.139-243；Carpenter，等(2000)J.Immunol.165:6205；He，等(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等(1989)Nature342:877-883；Foote and Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；U.S.Pat.No.6,329,511)。
单克隆抗体可以使用本领域已知的各种技术来制备，包括杂交瘤的使用、重组、和噬菌体展示技术、或它们的组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来产生，包括本领域已知的那些和例如Harlow et al，Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，2nd ed.1988)；Hammerling等，in:Monoclonal Antibodies and T- Cell Hybridomas 563681(Elsevier，N.Y.，1981)中的教导。本文使用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。
利用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的和本领域公知的。例如，在杂交瘤方法中，如上文中描述的免疫小鼠或其他适当的宿主动物，例如绵羊、山羊、兔、大鼠、仓鼠或恒河猴，引发出淋巴细胞，所述淋巴细胞产生或能产生与用于免疫的蛋白质(例如，PD-1)特异性结合的抗体。做为选择，可以体外免疫淋巴细胞。然后利用适合的融合剂，例如聚乙二醇，将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodies:Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。另外，RIMMS(重复免疫多位点)技术可以用于免疫动物(Kilptrack et al，1997Hybridoma 16:381-9，通过完全引用合并在此)。
如此制备的杂交瘤细胞接种到适合的培养基并在其中生长，所述培养基优选的包含一个或多个抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或生存的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基一般将包括次黄嘌呤、氨蝶呤、和胸腺嘧啶核苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞的生长。
特定的实施方式采用骨髓瘤细胞，其是有效地融合、支持选定的抗体生产细胞以稳定的高水平产生抗体、和对培养基例如HAT培养基敏感的细胞。在这些之中，骨髓瘤细胞系可以是鼠骨髓瘤系，例如，来源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些，可从Salk InstituteCell Distribution Center，San Diego，Calif.USA获得，以及可从美国典型培养物保藏所，Rockville，Md.USA获得的SP-2或X63-Ag8.653细胞。还已经描述了人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系用于人单克隆抗体的生产(Kozbor，J.Immunol，133:3001(1984)；Brodeur et al，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
分析杂交瘤细胞生长的培养基生产针对感兴趣的抗原(例如，PD-1)的单克隆抗体的产量。通过本领域已知的方法，例如，免疫沉淀，或通过体外结合分析，例如，放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)来测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
在鉴定了产生期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释操作和通过标准方法生长来将克隆进行亚克隆(Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。用于这个目的的适合的培养基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培养基。做为选择，可以使用补充有HAT(StemcellTechnologies)的半固体琼脂分离克隆细胞。此外，杂交瘤细胞可以在体内，如动物的腹水肿瘤中生长。
通过常规的免疫球蛋白纯化步骤，例如蛋白质A琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，适当地将所述亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹腔积液或血清分离。
在某些实施方式中，小鼠(或其他动物，例如，大鼠、猴、驴、猪、绵羊、山羊、仓鼠或狗)可以用抗原(例如，人类PD-1)免疫，一旦检测到免疫反应，例如特异于所述抗原的抗体在小鼠血清中检出，收获小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过公知的技术将脾细胞与任何适合的骨髓瘤细胞融合，例如，可获自美国典型培养物保藏所
Figure BDA0002363284960000791
(Manassas，VA)的细胞系SP20的细胞，来形成杂交瘤。通过有限的稀释选择和克隆杂交瘤。在某些实施方式中，收获免疫的小鼠的淋巴结并与NS0骨髓瘤细胞融合。
对于分泌能够结合所述抗原(例如，人类PD-1)多肽的抗体的细胞，然后通过本领域已知的方法分析杂交瘤克隆。一般地含有高水平的抗体的腹腔液体可以通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠来产生。
因而本文描述的是通过培养分泌抗体的杂交瘤细胞来制造本文描述的抗体的方法。在某些实施方式中，本文描述的制造抗体的方法进一步包括纯化所述抗体的步骤。
在具体的实施方式中，小鼠(或其他动物，例如，大鼠、猴、驴、猪、绵羊或狗)用感兴趣的抗原(例如，人类PD-1)免疫，通过融合分离自小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞产生杂交瘤，然后在产自所述融合的杂交瘤中筛选分泌能够与所述抗原结合的抗体的杂交瘤克隆。在某些实施方式中，小鼠(或其他动物，例如，大鼠、猴、驴、猪、绵羊或狗)用感兴趣的抗原(例如，人类PD-1)免疫，通过融合分离自小鼠的淋巴结和骨髓瘤细胞产生杂交瘤，然后在产自所述融合的杂交瘤中筛选分泌能够和所述抗原结合的抗体的杂交瘤克隆。
本文描述的抗体包括抗体片段，其特异性识别感兴趣的抗原(例如，人类PD-1)，可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生。例如，本文描述的Fab和F(ab’)2片段可以通过利用酶例如木瓜蛋白酶(来产生Fab片段)或胃蛋白酶(来产生F(ab’)2片段)蛋白水解裂解免疫球蛋白分子来产生。Fab片段相应于抗体分子的两个相同的臂之一，含有与重链的VH和CH1结构域配对的完整的轻链。F(ab’)2片段含抗体分子的两个抗原结合臂，通过绞链区中的二硫键连接。
进一步地，本文描述的抗体可以利用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在噬菌体颗粒的表面，噬菌体颗粒携带编码它们的多核苷酸序列。特别地，从动物cDNA库(例如，人类或鼠的受影响组织的cDNA库)扩增编码VHCR和VLCR的DNA序列。编码VHCR和VLCR的DNA通过PCR用scFv接头重组在一起，并克隆到噬菌粒载体中。载体被电激(electroporate)到E.coli中，用辅助噬菌体转染E.coli。这些方法中使用的噬菌体一般是包括fd和M13的丝状噬菌体，VHCR和VLCR通常重组融合到噬菌体基因III或基因VIII上。表达与特定抗原结合的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴定，例如，使用标记的抗原或者结合或捕获在固体表面或珠子上的抗原。可以用于产生本文描述的抗体的噬菌体展示方法的实例包括在Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods 182:41-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods 184:177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24:952-958；Persic等，1997，Gene 187:9-18；Burton等，1994，Advances in Immunology 57:191-280；PCT申请No.PCT/GB91/01 134；国际申请Nos.WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/1 1236、WO 95/15982、WO 95/20401、和W097/13844；以及美国专利Nos.5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108中公开的那些。
如在上述参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以被分离并用于产生完整的抗体，包括人类抗体、或任何其他希望的抗原结合片段，并在任何希望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如以下描述的。也可以采用重组地生产抗体片段例如Fab、Fab'和F(ab')2片段的技术，使用本领域已知的方法，例如在PCT公开No.WO 92/22324；Mullinax等，1992，BioTechniques 12(6):864-869；Sawai等，1995，AJRI 34:26-34；和Better等，1988，Science 240:1041-1043中公开的那些。
在一个方面，为了产生完整抗体，包括VHCR或VLCR核苷酸序列、限制位点和侧翼序列以保护所述限制位点的PCR引物可以用于从模板(例如scFv)克隆扩增VHCR或VLCR。利用本领域技术人员已知的克隆技术，PCR扩增的VHCR可以克隆到表达可变重链恒定区的载体中，PCR扩增的VLCR可以克隆到表达可变轻链恒定区，例如人类kappa或lambda恒定区的载体中。VHCR和VLCR还可以克隆到表达必要恒定区的一个载体中。利用本领域技术人员已知的技术，重链转换载体和轻链转换载体然后共同转染到细胞系中来产生表达全长抗体，例如IgG的稳定的或短暂的细胞系。
对于某些用途，包括抗体在人体中的体内用途和体外检测分析，优选地是使用人类的、人源化的或嵌合的抗体。完全的人类抗体对于人类对象的治疗是特别优选的。人类抗体可以通过本领域已知的各种方法产生，包括如上所述使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体显示方法。也参见，美国专利Nos.4,444,887和4,716,111；以及国际公开Nos.WO98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、和WO 91/10741。
嵌合抗体是一种分子，其中抗体的不同部分来自于不同的免疫球蛋白分子。例如，嵌合抗体可以含有与人类抗体的恒定区融合的小鼠单克隆抗体的可变区。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Morrison，1985，Science 229:1202；Oi等，1986，BioTechniques 4:214；Gillies等，1989，J.Immunol.Methods 125:191-202；和美国专利Nos.5,807,715、4,816,567、4,816,397、和6,331,415。
在某些实施方式中，产生人源化抗体。人源化抗体能够结合预定的抗原，并包含大体上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架区，以及大体上具有非人类免疫球蛋白(例如，鼠类免疫球蛋白)的氨基酸序列的CDR。人源化抗体可以利用本领域已知的各种技术来产生，包括但不限于，CDR移植(欧洲专利NO.EP 239,400；国际公开No.WO 91/09967；和美国专利Nos.5,225,539、5,530,101和5,585,089)、饰面或表面重修(欧洲专利Nos.EP592,106和EP519,596；)、链混洗(美国专利No.5,565,332)，以及例如美国专利No.6,407,213、美国专利No.5,766,886、WO 9317105、Tan等，J.Immunol.169:1119 25(2002)，Caldas等，ProteinEng.13(5):353-60(2000)，Morea等，Methods 20(3):267 79(2000)，Baca等，J.Biol.Chem.272(16):10678-84(1997)，Roguska等，Protein Eng.9(10):895 904(1996)，Couto等，Cancer Res.55(23Supp):5973s-5977s(1995)，Couto等，Cancer Res.55(8):1717-22(1995)，Sandhu JS，Gene 150(2):409-10(1994)，和Pedersen等，J.Mol.Biol.235(3):959-73(1994)中公开的技术。还参见美国专利公开No.US 2005/0042664 A1(2005年2月24日)，通过引用以其整体合并在本文中。
人类抗体可以使用本领域已知的任何方法来产生。例如，可以使用不能表达功能性的内源免疫球蛋白、但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。特别地，人类重链和轻链免疫球蛋白复合体可以随机地或通过同源重组导入小鼠胚胎干细胞中。做为选择，除了人类重链和轻链基因之外，人类可变区、恒定区和多变区可以被导入小鼠胚胎干细胞。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以通过同源重组导入人免疫球蛋白基因座来单独地或同时地变得无功能。特别地，JH区域的纯合删除防止内源抗体产生。修饰的胚胎干细胞被扩增并微注射到胚泡中来产生嵌合的小鼠。然后培育嵌合小鼠来产生表达人类抗体的纯合后代。以正常的方式用选定的抗原，例如抗原(例如，人类PD-1)的全部或一部分，来免疫转基因小鼠。针对所述抗原的单克隆抗体可以利用常规的杂交瘤技术从所述免疫的转基因小鼠获得。由转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后经历种类转变和体细胞突变。因而，利用这种技术，有可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于生产人类抗体的这种技术的综述，参见Lonberg和Huszar，Int.Rev.Immunol.，13:65-93，1995。对于生产人类抗体和人类单克隆抗体的这种技术和生产这种抗体的方案的详细论述，参见，例如PCT公开WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；以及美国专利No.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598。
在某些实施方式中，可以使用小鼠-人类杂交瘤产生人类抗体。例如，用Epstein-Barr病毒(EBV)转化的人类外周血淋巴细胞可以与小鼠骨髓瘤细胞融合来产生分泌人单克隆抗体的小鼠-人杂交瘤，可以筛选这些小鼠-人杂交瘤来确定分泌结合目标抗原(例如，流感B病毒NA)的人单克隆抗体的小鼠。这样的方法是已知的和在本领域中描述的，参见，例如，Shinmoto等，Cytotechnology，2004，46:19-23；Naganawa等，Human Antibodies，2005，14:27-31。
在某些实施方式中，通过将编码抗体的人类CDR(例如，VLCR CDR和/或VHCR CDR)的多核苷酸插入到含有编码人类框架区序列的核苷酸序列的表达载体中，可以产生人类抗体。在某些实施方式中，这样的表达载体进一步包含编码人类轻链和/或重链的恒定区的核苷酸序列。在某些实施方式中，通过将获自噬菌体文库的抗体的人类CDR(例如，VLCR CDR和/或VHCR CDR)插入这样的人类表达载体中，可以产生人类抗体。
在某些实施方式中，通过选自与非人类抗体的非人类CDR序列同源的(或基本上同源的)人类CDR序列，并选自与非人类抗体的非人类框架序列同源的(或基本上同源的)人类框架序列，可以产生人类抗体。
单结构域抗体，例如缺乏轻链的抗体，可以通过本领域公知的方法来产生。参见Riechmann等，1999，J.Immunol.231:25-38；Nuttall等，2000，Curr.Pharm.Biotechnol.l(3):253-263；Muylderman，2001，J.Biotechnol.74(4):277302；美国专利No.6,005,079；和国际公开Nos.WO 94/04678、WO 94/25591和WO 01/44301。
双特异性抗体是具有对至少两个不同表位的结合特异性的抗体。示范性的双特异性抗体可以结合抗原的两个不同的表位，或结合两种不同的抗原的两个不同的表位。在具体的实施方式中，双特异性抗体具有两个不同的抗原结合结构域，其中每一个结构域特异性结合不同的抗原。其他这样的抗体可以结合第一抗原(例如，人类PD-1)，并进一步结合第二抗原。双特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab’):双特异性抗体)。
制造双特异性抗体的方法是本领域已知的。(参见，例如，Millstein等，Nature，305:537-539(1983)；Traunecker等，EMBO J.，10:3655-3659(1991)；Suresh等，Methods inEnzymology，121:210(1986)；Kostelny等，J.Immunol.，148(5):1547-1553(1992)；Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)；Gruber等，J.Immunol.，152:5368(1994)；美国专利Nos.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,81；95,731,168；4,676,980；和4,676,980；WO 94/04690；WO 91/00360；WO 92/200373；WO 93/17715；WO 92/08802；和EP 03089。)
例如，结合感兴趣的抗原(例如，人类PD-1)的本文描述的抗体(例如，本文描述的全长抗体、抗体的重链和/或轻链、或单链抗体)的重组表达可以涉及构建载体(例如，表达载体)，所述载体含有编码所述抗体或其片段(例如，VLCR和/或VHCR)的多核苷酸。一旦获得了编码本文描述的抗体分子、抗体的轻链和/或重链、或其抗原结合片段的多核苷酸，用于产生抗体分子的载体可以利用本领域公知的技术通过重组DNA技术产生。本文描述了通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白质的方法。本领域技术人员公知的方法可以用于构建表达载体，所述表达载体含有抗体编码序列和适当的转录和翻译控制信号。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。还提供的是包含与启动子可操作连接的核苷酸序列的可复制载体，所述核苷酸序列编码本文描述的抗体分子、抗体的重链或轻链、抗体或其片段的重链或轻链可变域、或重链或轻链CDR。例如，这样的载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见，例如，国际公开No.WO 86/05807和WO89/01036；以及美国专利No.5,122,464)，抗体的可变域可以克隆到这样的载体中，用于完整的重链、完整的轻链、或完整重链和轻链两者的表达。
用于确定例如抗原性片段、前导序列、蛋白折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包是可用的(参见，例如，GenBank，Vector
Figure BDA0002363284960000831
Suite(Informax，Inc，Bethesda，MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)；
Figure BDA0002363284960000832
(TimeLogicCorp.，Crystal Bay，Nevada)；Menne，等(2000)Bioinformatics 16:741-742；Menne，等(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren，等(2002)Comput.MethodsPrograms Biomed.68:177-181；vonHeijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；vonHeijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。
表达载体可以通过常规技术转移到细胞(例如，宿主细胞)，产生的细胞然后可以通过常规技术培养来产生本文描述的抗体或其片段。因而，本文提供的是宿主细胞，其含有与启动子可操作连接的多核苷酸用于在宿主细胞中表达这样的序列，所述多核苷酸编码本文描述的抗体或其抗原结合片段、或其重链或轻链、或其抗原结合片段，或本文描述的单链抗体。在某些实施方式中，例如，对于双链抗体的表达，分别编码重链和轻链的载体可以在宿主细胞中共同表达，用于表达整个免疫球蛋白分子，如下文详述的。在某些实施方式中，宿主细胞含有包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸编码本文描述的抗体的重链和轻链，或其片段。在具体的实施方式中，宿主细胞含有两种不同的载体，第一载体包含编码本文描述的抗体的重链或其片段的多核苷酸，第二载体包含编码本文描述的抗体的轻链或其片段的多核苷酸。在其他实施方式中，第一宿主细胞包含第一载体，其包含编码本文描述的抗体的重链或其片段的多核苷酸，第二宿主细胞包含第二载体，其包含编码本文描述的抗体的轻链的多核苷酸。
可以利用各种宿主-表达载体系统来表达本文描述的抗体分子(参见，例如，美国专利No.5,807,715)。这样的宿主－表达系统表现为载体，通过所述载体可以产生和随后纯化目标编码序列，但还表现为细胞，当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，其可以原位表达本文描述的抗体分子。这些包括但不限于微生物，例如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，E.coli和枯草芽孢杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母菌属，毕赤氏酵母属)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的、或用重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如，绿藻，如莱茵衣藻)；或哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、MDCK、HEK293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3细胞)，其携带含有来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。在具体的实施方式中，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。优选地，细菌细胞例如大肠杆菌，和更优选地，真核细胞，特别是用于表达完整的重组抗体分子，用于重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，以及载体，例如来自人类巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件，是抗体的有效表达系统(Foecking等，1986，Gene 45:101；and Cockett et al，1990，Bio/Technology 8:2)。在某些实施方式中，本文描述的抗体通过CHO细胞或NS0细胞产生。在具体的实施方式中，编码结合感兴趣的抗原(例如，人类PD-1)的本文描述的抗体(或其片段)的核苷酸序列的表达是通过组成型启动子、可诱导启动子或组织特异性启动子调节的。
在细菌系统中，取决于要表达的抗体分子的预定用途，可以有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量的这样的抗体时，用于抗体分子的药物组合物的生成，直接表达容易纯化的高水平的融合蛋白产物的载体可以是期望的。这种载体包括但不限于，E.coli表达载体pUR278(Ruther et al，1983，EMBO 12:1791)，其中抗体编码序列可以与lac Z编码区按读码框地分别连接到载体中，从而产生融合蛋白；pIN载体(Inouye&Inouye，1985，NucleicAcids Res.13:3101-3109；VanHeeke&Schuster，1989，J.Biol.Chem.24:5503-5509)；等等。pGEX载体也可以用于表达外源的多肽，作为与谷胱甘肽5-转移酶(GST)的融合蛋白。一般地，这样的融合蛋白是可溶的，通过吸附和结合到基质谷胱甘肽琼脂糖珠子继之以在存在游离谷胱甘肽的情况下的洗脱，可以容易地从裂解的细胞制备。pGEX载体被设计以包括凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点，从而克隆的目标基因产物可以从GST部分释放。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病病毒(AcNPV)被用作载体来表达外源基因。病毒在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可以分别克隆到病毒的非关键区(例如，多角体蛋白基因)并置于AcNPV启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制之下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以利用许多基于病毒的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，目标抗体编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，晚期启动子和三联的前导序列。然后可以通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组。在病毒基因组的非关键区(例如，区域E1或E3)中的插入将产生存活的和能在感染的宿主中表达抗体分子的重组病毒(参见，例如Logan&Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 1:355-359)。特定的起始信号也可能是插入的抗体编码序列的有效翻译所需的。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。此外，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框相符以确保完整插入物的翻译。这些外源的翻译控制信号和起始密码子可以是各种来源的，天然的或合成的。通过包含合适的转录增强子元件、转录终止子，等等，可以增强表达的效力(参见，例如，Bittner等，1987，Methods in Enzymol.153:51-544)。
如本文使用的，术语“宿主细胞”是指任何类型的细胞，例如，原代细胞或来自细胞系的细胞。在具体的实施方式中，术语“宿主细胞”是指用多核苷酸转染的细胞，以及这样的细胞的子代或可能的子代。这样的细胞的子代可能由于可能存在于后续世代中的突变或环境影响、或多核苷酸向宿主基因组中的整合而不相同于所述多核苷酸转染的亲本细胞。
此外，可以选择宿主细胞菌株，其调节插入的序列的表达，或以期望的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工(例如，裂解)对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞对于翻译后加工和蛋白与基因产物的修饰具有特征性和特定的机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统来确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用真核的宿主细胞，其具有用于原始转录产物的适当加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机制。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0(一种不内源地产生任何免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O和HsS78Bst细胞。在某些实施方式中，本文描述的人源化单克隆抗体在哺乳动物细胞例如CHO细胞中生产。
对于长期的、高产量的重组蛋白质生产，稳定的表达是优选的。例如，稳定地表达所述抗体分子的细胞系可以被工程化。不使用含有病毒复制起点的表达载体，可以用由适合的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸位点，等等)控制的DNA和选择标记来转化宿主细胞。在导入外源DNA之后，可以容许工程化的细胞在富集培养基中生长1－2天，然后转移到选择培养基。重组质粒中的选择标记赋予了对选择的抗性，容许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中，并生长形成病灶，其随后可被克隆和扩大成细胞系。这种方法可以有益地用于工程化表达所述抗体分子的细胞系。这种工程化细胞系在筛选和评估与所述抗体分子直接或间接作用的组合物中可能是特别有用的。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯性疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell 11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖茎酶(Szybalska&Szybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202)，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，1980，Cell 22:8-17)基因，可以分别应用于tk细胞、hgprt细胞或aprt细胞。并且，抗代谢物抗性可以用作以下基因的选择的基础:dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA 77:357；O'Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527)；gpt，其赋予对麦考酚酸的抗性(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu and Wu，1991，Biotherapy 3:87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan，1993，Science 260:926-932；和Morgan and Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62:191-217；May，1993，TIB TECH ll(5):155-215)；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，1984，Gene 30:147)。重组DNA技术领域公知的方法可以常规地用于选择期望的重组克隆，例如，在Ausubel等(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；and inChapters 12and 13，Dracopoli等(eds.)，Current Protocols in Human Genetics，JohnWiley&Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin et al，1981，J.Mol.Biol.150:1中描述了这样的方法，通过引用将它们完全合并在本文中。
通过载体扩增(对于综述，参见Bebbington and Hentschel，The use of vectorsbased on gene amplification for the expression of cloned genes in mammaliancells in DNA cloning，Vol.3(Academic Press，New York，1987))，可以提高抗体分子的表达水平。当表达抗体的载体系统中的标记物是可扩增的时，宿主细胞的培养物中存在的抑制物水平的提高将提高标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因相连，抗体的生产也将提高(Crouse et al，1983，Mol.Cell.Biol.3:257)。
可以用本文描述的两种或更多种表达载体共转染宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽，第二载体编码轻链衍生的多肽。两种载体可以含有相同的选择标记，其允许重链和轻链多肽的等量表达。
做为选择，可以使用单独的载体，其编码并且能够表达重链和轻链多肽两者。在这种情况中，轻链应当置于重链之前以避免过量的毒性游离重链(Proudfoot，1986，Nature 322:52；和Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:2197-2199)。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。表达载体可以是单顺反子或多顺反子。多顺反子核酸构建体可以编码2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个，或2-5、5-10或10-20个基因/核苷酸序列。例如，双顺反子核酸构建体可以按以下顺序包含启动子、第一基因(例如，本文描述的抗体的重链)和第二基因(例如，本文描述的抗体的轻链)。在这样的表达载体中，两个基因的转录都可以被启动子驱动，而来自第一基因的mRNA的翻译可以通过cap依赖性扫描机制，来自第二基因的mRNA的翻译可以通过cap独立性机制，例如，通过IRES。
一旦通过重组表达产生了本文描述的抗体分子，它可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化，例如，通过层析(例如，离子交换、亲和性，特别是通过对蛋白A特异性抗原的亲和性、以及大小柱层析)、离心、差分溶解、或通过纯化蛋白质的任何其他标准技术。进一步的，本文描述的抗体可以融合到本文描述的或本领域已知的异源多肽序列以便于纯化。
在具体的实施方式中，分离或纯化本文描述的抗体(例如，单克隆抗体，例如，人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合片段)。一般地，分离的抗体是一种抗体，其基本上没有具有与所述分离的抗体不同的抗原特异性的其他抗体。例如，在特定的实施方式中，本文描述的抗体的制品基本上没有细胞材料和/或化学前体。用语“基本上没有细胞材料”包括抗体的制品，其中抗体从细胞的细胞成分分离，所述抗体分离自所述细胞或由所述细胞重组产生。因而，基本上没有细胞材料的抗体包括抗体的制品，其具有小于约30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或0.1％(按干重)的异源蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白质”)和/或抗体的变体，例如，抗体的不同的翻译后修饰形式，或抗体的其他不同版本(例如，抗体片段)。当所述抗体是重组产生的时，它一般还基本上没有培养基，即，培养基低于所述蛋白制品的体积的约20％、10％、2％、1％、0.5％或0.1％。当所述抗体通过化学合成产生时，它一般还基本上没有化学前体或其他化学物质，即，它与蛋白质合成中涉及的化学前体或其他化学物质分离。因而，这样的抗体制品具有小于约30％、20％、10％或5％(按干重)的目标抗体以外的化学前体或化合物。在具体的实施方式中，本文描述的抗体是分离的或纯化的。
5.6组合物&施用途径
本文涵盖的是本文描述的NDV(例如，嵌合NDV；参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)在组合物中的用途。本文还涵盖的是来自NDV感染的细胞的质膜碎片或NDV感染的全癌细胞在组合物中的用途。在具体的实施方式中，所述组合物是药物组合物，例如，免疫原性制剂(例如，疫苗制剂)。所述组合物可以用于治疗癌症的方法中。
在一个实施方式中，药物组合物包含处在与药学上可接受的载体的混合物中的本文描述的NDV(例如，嵌合NDV；参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，其中所述包装基因组的基因组RNA序列是SEQ ID NO:51、52或60中列出的。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂，例如，下文的章节5.7.6中描述的。在具体的实施方式中，药物组合物包含处在药学上可接受的载体中的有效量的本文描述的NDV(例如，嵌合NDV；参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)，以及任选地一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂。在某些实施方式中，所述NDV(例如，嵌合NDV；参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)是所述药物组合物中包括的仅有的活性成分。
在另一个实施方式中，药物组合物(例如，肿瘤裂解物疫苗(oncolysate vaccine))包含处在与药学上可接受的载体的混合物中的、来自NDV感染的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜碎片的制品。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂，例如，下文的章节5.7.6中描述的。在另一个实施方式中，药物组合物(例如，全细胞疫苗)包含处在与药学上可接受的载体的混合物中的NDV感染的癌细胞。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂，例如，下文的章节5.7.6中描述的。
在另一个实施方式中，药物组合物包含处在与药学上可接受的载体的混合物中的本文描述的PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.5)。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂，例如，下文的章节5.7.6中描述的。在具体的实施方式中，药物组合物包含处在药学上可接受的载体中的有效量的本文描述的PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.5)以及任选地一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂。在某些实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.5)是所述药物组合物中包括的仅有的活性成分。
在另一个实施方式中，药物组合物包含处在与药学上可接受的载体的混合物中的PD-1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂，例如，下文的章节5.7.6中描述的。在具体的实施方式中，药物组合物包含处在药学上可接受的载体中的有效量的本文描述的PD-1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)以及任选地一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含本文描述的嵌合NDV(例如，包含包装基因组包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因)。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含本文描述的嵌合NDV(例如，包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因)。在某些实施方式中，所述PD-1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)是所述药物组合物中包括的仅有的活性成分。在具体的实施方式中，所述PD-1阻断抗体是纳武单抗。在优选的实施方式中，所述PD-1阻断抗体是派姆单抗。在具体的实施方式中，所述PD-1阻断包含:(a)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)，(b)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，(c)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)，(d)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)，(e)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:7)，和(f)VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)，如根据Kabat编号系统所确定的。在另一个具体的实施方式中，所述PD-1阻断包含:(a)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQID NO:11)，(b)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:12)，(c)VLCRCDR3，其包含氨基酸序列QQSSNWPRT(SEQ ID NO:13)，(d)VHCRCDR1，其包含氨基酸序列NSGMH(SEQ IDNO:16)，(e)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG(SEQ ID NO:17)，和(f)VHCRCDR3，其包含氨基酸序列NDDY(SEQ ID NO:18)。
在另一个实施方式中，药物组合物包含处在与药学上可接受的载体的混合物中的PD-L1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂，例如，下文的章节5.7.6中描述的。在具体的实施方式中，药物组合物包含处在药学上可接受的载体中的有效量的本文描述的PD-L1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)以及任选地一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含本文描述的嵌合NDV(例如，包含包装基因组包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因)。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含本文描述的嵌合NDV(例如，包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因)。在某些实施方式中，所述PD-L1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)是所述药物组合物中包括的仅有的活性成分。在具体的实施方式中，所述PD-L1阻断抗体是度伐单抗(duralumab)或阿泽鲁单抗(azelumab)。
在包含PD-1或其配体的拮抗剂的药物组合物的特定实施方式中，所述药物组合物被配制为冻干粉剂或饼。在具体的实施方式中，所述冻干粉剂或饼被包装在用于重构的单次使用的小瓶中。在具体的实施方式中，所述冻干粉剂或饼被配制在L-组氨酸、聚山梨酯80和蔗糖中，任选地，用盐酸和/或氢氧化钠将pH值调整到5.5。在具体的实施方式中，所述冻干粉剂或饼使用一定量的灭菌注射水重构，以实现PD-1或其配体的拮抗剂的期望浓度，通过例如，将灭菌注射水注射到包含所述冻干粉剂或饼的小瓶中，缓慢涡旋小瓶以容许所述冻干粉剂或饼的重构，并等待一段时间使所述冻干粉剂或饼完全重构。在具体的实施方式中，2mL重构的拮抗剂含有50mg所述拮抗剂，在L-组氨酸(3.1mg)、聚山梨酯80(0.4mg)和蔗糖(140mg)中配制，任选地，用盐酸和/或氢氧化钠调整pH值到5.5。参见，例如，KETRUDA(派姆单抗)的完整处方信息，Reference ID:3862712，通过引用以其整体合并在本文中。一旦重构，药物组合物应当在室温下保存不超过自重构之时开始的六小时，或在2到8摄氏度下冷藏不超过自重构之时开始的24小时。参见，例如，KETRUDA(派姆单抗)的完整处方信息，Reference ID:3862712，通过引用以其整体合并在本文中。在具体的实施方式中，所述重构的药物组合物进一步配制用于静脉内输注。例如，将期望数量的PD-1或其配体的重构拮抗剂转移到含有例如0.9％氯化钠或5％右旋糖的无菌静脉内袋子中，体积适合于实现PD-1或其配体的拮抗剂的期望浓度。
在包含PD-1或其配体的拮抗剂的药物组合物的另一个特定的实施方式中，所述药物组合物被配制为液体溶液。在具体的实施方式中，所述药物组合物进一步配制用于静脉内输注。例如，将期望数量的药物组合物转移到含有例如0.9％氯化钠或5％右旋糖的无菌静脉内袋子中，体积适合于实现PD-1或其配体的拮抗剂的期望浓度。参见，例如，OPDIVO(纳武单抗)的完整处方信息，Reference ID:3677021，通过引用以其整体合并在本文中。
在另一个实施方式中，药物组合物包含处在与药学上可接受的载体的混合物中的(i)本文描述的NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)，和(ii)本文描述的PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.5)。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂，例如，下文的章节5.7.6中描述的。在具体的实施方式中，药物组合物包含处在药学上可接受的载体中的有效量的(i)本文描述的NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)和(ii)本文描述的PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.5)，以及任选地一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂。在某些实施方式中，所述NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)和所述PD-1或其配体的拮抗剂是所述药物组合物中包括的仅有的活性成分。
在另一个实施方式中，药物组合物包含处在与药学上可接受的载体的混合物中的(i)包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，和(ii)本文描述的PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.5)。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂，例如，下文的章节5.7.6中描述的。在具体的实施方式中，药物组合物包含处在药学上可接受的载体中的有效量的(i)本文描述的NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)和(ii)本文描述的PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.5)，以及任选地一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂。在具体的实施方式中，药物组合物包含处在药学上可接受的载体中的有效量的(i)包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，和(ii)本文描述的PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.5)，以及任选地一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂。在某些实施方式中，所述NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)和所述PD-1或其配体的拮抗剂是所述药物组合物中包括的仅有的活性成分。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，包含所述包装基因组的所述嵌合NDV以及所述PD-1或其配体的拮抗剂是所述药物组合物中包括的仅有的活性成分。
在另一个实施方式中，药物组合物包含处在与药学上可接受的载体的混合物中的(i)包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，和(ii)PD-1阻断抗体(例如,章节5.5中描述的)。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂，例如，下文的章节5.7.6中描述的。在具体的实施方式中，药物组合物包含处在药学上可接受的载体中的有效量的(i)本文描述的NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)和(ii)本文描述的PD-1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)，以及任选地一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂。在具体的实施方式中，药物组合物包含处在药学上可接受的载体中的有效量的(i)包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，和(ii)本文描述的PD-1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)，以及任选地一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂。在某些实施方式中，所述NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)和所述PD-1或其配体的拮抗剂是所述药物组合物中包括的仅有的活性成分。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，包含所述包装基因组的所述嵌合NDV以及所述PD-1阻断抗体是所述药物组合物中包括的仅有的活性成分。在具体的实施方式中，所述PD-1阻断抗体是纳武单抗。在优选的实施方式中，所述PD-1阻断抗体是派姆单抗。在具体的实施方式中，所述药物组合物包含:(i)抗体，其包含:(a)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)，(b)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，(c)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)，(d)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)，(e)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQID NO:7)，和(f)VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)，如根据Kabat编号系统所确定的；以及(ii)包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含SEQ ID NO:51中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述药物组合物包含:(i)抗体，其包含:(a)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)，(b)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，(c)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ IDNO:3)，(d)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)，(e)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:7)，和(f)VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)，如根据Kabat编号系统所确定的；以及(ii)包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含SEQ ID NO:52中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述药物组合物包含:(i)抗体，其包含:(a)VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)，(b)VLCR CDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，(c)VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)，(d)VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)，(e)VHCR CDR2，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQID NO:7)，和(f)VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:8)，如根据Kabat编号系统所确定的；以及(ii)包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含SEQ ID NO:60中列出的核苷酸序列。
在另一个实施方式中，药物组合物包含处在与药学上可接受的载体的混合物中的(i)包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，和(ii)PD-L1阻断抗体(例如,章节5.5中描述的)。在某些实施方式中，所述药物组合物进一步包含一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂，例如，下文的章节5.7.6中描述的。在具体的实施方式中，药物组合物包含处在药学上可接受的载体中的有效量的(i)本文描述的NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)和(ii)本文描述的PD-L1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)，以及任选地一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂。在具体的实施方式中，药物组合物包含处在药学上可接受的载体中的有效量的(i)包含包装基因组的嵌合NDV，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，和(ii)本文描述的PD-L1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)，以及任选地一种或更多种额外的预防性或治疗性试剂。在某些实施方式中，所述NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)和所述PD-L1或其配体的拮抗剂是所述药物组合物中包括的仅有的活性成分。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，包含所述包装基因组的所述嵌合NDV以及所述PD-L1阻断抗体是所述药物组合物中包括的仅有的活性成分。在具体的实施方式中，所述PD-L1阻断抗体是度伐单抗(duralumab)或阿维鲁单抗。
本文提供的药物组合物可以处于容许所述组合物向对象施用的任何形式。在具体的实施方式中，所述药物组合物适合于兽医学和/或人类施用。如本文使用的，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典中或其他一般公认的药典中列出的，用于在动物和更特别地用于人类中的。术语“载体”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体，药物组合物与它们一同施用。盐水溶液与葡萄糖和甘油水溶液也可以用作液体载体，特别是对于可注射的溶液。适和的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、碳酸钙、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。在E.W.Martin的中描述了适合的药物载体的实例。制剂应当适合施用的方式。
在具体的实施方式中，所述药物组合物被配制以适合于对对象的预期的施用途径。例如，所述药物组合物可以被配制以适合于胃肠外的、静脉内的、动脉内的、胸膜内的、吸入的、腹膜内的、口服的、真皮内的、结肠直肠的、腹膜内的、颅内的和肿瘤内的施用。在具体的实施方式中，所述药物组合物可以被配制用于静脉内的、动脉内的、口服的、腹膜内的、鼻内的、气管内的、胸膜内的、颅内的、皮下的、肌肉内的、局部的、肺部的或肿瘤内的使用。
在具体的实施方式中，包含本文描述的NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)的所述药物组合物被配制以适合于向所述对象(例如，人类对象)肿瘤内施用。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，包含包含所述包装基因组的嵌合NDV的所述药物组合物适合于向所述对象(例如，人类对象)肿瘤内施用。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列包含或由SEQID NO:51中列出的序列组成。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列包含或由SEQ ID NO:52中列出的序列组成。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列包含或由SEQ ID NO:60中列出的序列组成。
在具体的实施方式中，包含本文描述的NDV(参见，例如，章节5.1、5.2和/或6)的所述药物组合物被配制以适合于向所述对象(例如，人类对象)静脉内施用。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，包含包含所述包装基因组的嵌合NDV的所述药物组合物适合于向所述对象(例如，人类对象)静脉内施用。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:51中列出的。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:52中列出的。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:60中列出的。
在具体的实施方式中，包含本文描述的PD-1或其配体的拮抗剂(参见，例如，章节5.5)的所述药物组合物被配制以适合于向所述对象(例如，人类对象)静脉内施用。在具体的实施方式中，包含本文描述的PD-1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)的所述药物组合物被配制以适合于向所述对象(例如，人类对象)静脉内施用。在具体的实施方式中，所述PD-1阻断抗体是纳武单抗。在优选的实施方式中，所述PD-1阻断抗体是派姆单抗。在具体的实施方式中，包含本文描述的PD-L1阻断抗体(参见，例如，章节5.5)的所述药物组合物被配制以适合于向所述对象(例如，人类对象)静脉内施用。在具体的实施方式中，所述PD-L1阻断抗体是度伐单抗(duralumab)或阿维鲁单抗。
5.7抗癌用途和其他用途
5.7.1使用NDV-IL12以及PD-1或其配体的拮抗剂治疗癌症的方法
在一个方面，本文提出的是利用本文描述的嵌合NDV(例如，章节5.2和/或章节6中描述的嵌合NDV)或包含这样的嵌合NDV的组合物，与PD-1或其配体的拮抗剂(例如，章节5.5和/或章节6中描述的拮抗剂)或包含这样的拮抗剂的组合物组合地治疗癌症的方法，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组编码IL-12或其衍生物。在具体的实施方式中，所述IL-12或其衍生物由所述嵌合NDV感染的细胞表达。所述嵌合NDV或其组合物，以及所述PD-1或其配体的拮抗剂或其组合物，可以用作任一线的疗法(例如，第一线、第二线、第三线、第四线或第五线疗法)。在具体的实施方式中，所述治疗方法进一步包括向所述对象施用章节5.7.6，例如章节5.7.6.1中描述的一种或更多种额外的疗法。
在一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向对象施用嵌合NDV以及PD-1或其配体的拮抗剂，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物(例如，人类IL-12)的转基因。在具体的实施方式中，所述IL-12或其衍生物由所述嵌合NDV感染的细胞表达。在另一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向对象施用有效量的嵌合NDV以及有效量的PD-1或其配体的有效量，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物(例如，人类IL-12)的转基因。在具体的实施方式中，所述IL-12或其衍生物由所述嵌合NDV感染的细胞表达。所述嵌合NDV以及拮抗剂可以同时地或顺序地向所述对象施用。在某些实施方式中，所述嵌合NDV以及拮抗剂在同一组合物中施用。在其他实施方式中，所述嵌合NDV以及拮抗剂在不同的组合物中施用。所述嵌合NDV以及拮抗剂可以通过相同的或不同的施用途径向所述对象施用。本领域技术人员已知的或本文描述的任何途径可以用于施用所述嵌合NDV和拮抗剂。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV肿瘤内地施用，以及所述拮抗剂静脉内地施用。在某些实施方式中，所述嵌合NDV和所述拮抗剂静脉内地施用。
在另一个方面，本文提出的是嵌合NDV在制备药物中的用途，所述药物用于与PD-1或其配体的拮抗剂组合地用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物(例如，人类IL-12)的转基因。在另一个方面，本文提出的是应用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症的方法中的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，以及其中所述方法进一步包括施用PD-1或其配体的拮抗剂(例如，人类IL-12)。在具体的实施方式中，所述IL-12或其衍生物由所述嵌合NDV感染的细胞表达。所述嵌合NDV以及拮抗剂可以同时地或顺序地向所述对象施用。在某些实施方式中，所述嵌合NDV以及拮抗剂在同一组合物中施用。在其他实施方式中，所述嵌合NDV以及拮抗剂在不同的组合物中施用。所述嵌合NDV以及拮抗剂可以通过相同的或不同的施用途径向所述对象施用。本领域技术人员已知的或本文描述的任何途径可以用于施用所述嵌合NDV和拮抗剂。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV肿瘤内地施用，以及所述拮抗剂静脉内地施用。在某些实施方式中，所述嵌合NDV和所述拮抗剂静脉内地施用。在另一个实施方式中，所述嵌合NDV结节内地施用，以及所述拮抗剂静脉内地施用。
在另一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向有需要的对象(例如，人类对象)施用包含嵌合NDV的第一组合物以及包含PD-1或其配体的拮抗剂的第二组合物，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基。在另一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向有需要的对象(例如，人类对象)施用嵌合NDV以及PD-1或其配体的拮抗剂，其中所述嵌合NDV包含编码IL-12的包装基因组，以及其中所述PD-1的拮抗剂是结合PD-1并(完全地或部分地)阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2之一或两者)之间的相互作用的抗体(本文有时称为“PD-1阻断抗体”)。在另一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向有需要的对象(例如，人类对象)施用包含嵌合NDV的第一组合物以及包含PD-1阻断抗体第二组合物，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基。在另一个实施方式中，本文提出的是治疗癌症的方法，包括向有需要的人类对象施用包含嵌合新城疫病毒(NDV)的第一组合物以及包含PD-1阻断抗体第二组合物，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，所述转基因编码人类IL-12p40亚基和人类IL-12 p35亚基。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:51中列出的。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:52中列出的。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ IDNO:60中列出的。在优选的实施方式中，所述PD-1阻断抗体是派姆单抗。在其他实施方式中，所述PD-1阻断抗体是纳武单抗、MEDI0680、PDR001或阿特珠单抗。所述第一和第二组合物可以通过相同的或不同的施用途径施用。本领域技术人员已知的或本文描述的任何途径可以用于施用所述第一和第二组合物。在具体的实施方式中，所述第一组合物肿瘤内地施用，以及所述第二组合物静脉内地施用。在某些实施方式中，所述第一和第二组合物静脉内地施用。关于NDV的信息参见例如上文的章节5.1和5.2以及下文的章节6，关于PD-1或其配体的拮抗剂的信息参见例如上文的章节5.5和下文的章节6，关于组合物和施用途径的信息参见例如上文的章节5.5.1。
在另一个实施方式中，本文提出的是嵌合NDV在制备药物中的用途，所述药物用于与PD-1或其配体的拮抗剂组合地用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，其中所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基。在另一个实施方式中，本文提出的是嵌合NDV在制备药物中的用途，所述药物用于与PD-1或其配体的拮抗剂组合地用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症，其中所述嵌合NDV包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的包装基因组，其中所述PD-1的拮抗剂是结合PD-1(例如，人类PD-1)并(完全地或部分地)阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2之一或两者)之间的相互作用的抗体(本文有时称为“PD-1阻断抗体”)。在另一个实施方式中，本文提出的是嵌合NDV在制备药物中的用途，所述药物用于与PD-1阻断抗体组合地用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基。在另一个实施方式中，本文提出的是嵌合NDV在制备药物中的用途，所述药物用于与PD-1阻断抗体组合地用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述转基因编码人类IL-12 p40亚基和人类IL-12 p35亚基。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:51中列出的。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:52中列出的。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:60中列出的。在具体的实施方式中，所述转基因编码具有表7中列出的序列的IL-12氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因编码包含表7中列出的氨基酸序列的IL-12氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12的转基因包含表8中列出的序列的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12的转基因由表8中列出的序列组成。在优选的实施方式中，所述PD-1阻断抗体是派姆单抗。在其他实施方式中，所述PD-1阻断抗体是纳武单抗、MEDI0680、PDR001或阿特珠单抗。所述第一和第二组合物(即，所述嵌合NDV和所述拮抗剂)可以通过相同的或不同的施用途径施用。本领域技术人员已知的或本文描述的任何途径可以用于施用所述第一和第二组合物(即，所述嵌合NDV和所述拮抗剂)。在具体的实施方式中，所述第一组合物(即，所述嵌合NDV)肿瘤内地施用，以及所述第二组合物(即，所述拮抗剂)静脉内地施用。在另一个具体的实施方式中，所述第一组合物(即，所述嵌合NDV)结节内地施用，以及所述第二组合物(即，所述拮抗剂)静脉内地施用。在某些实施方式中，所述第一和第二组合物(即，所述嵌合NDV和所述拮抗剂)静脉内地施用。关于NDV的信息参见例如上文的章节5.1和5.2以及下文的章节6，关于PD-1或其配体的拮抗剂的信息参见例如上文的章节5.5和下文的章节6，关于组合物和施用途径的信息参见例如上文的章节5.5.1。
在另一个实施方式中，本文提出的是应用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症的方法的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，所述转基因编码IL-12p40亚基和IL-12 p35亚基，以及其中所述方法进一步包括施用PD-1或其配体的拮抗剂。在另一个实施方式中，本文提出的是应用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症的方法的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12p35亚基，其中所述方法进一步包括施用PD-1或其配体的拮抗剂，以及其中所述PD-1的拮抗剂是结合PD-1(例如，人类PD-1)并(完全地或部分地)阻断PD-1与其配体(例如，PD-L1、PD-L2之一或两者之间的相互作用的抗体(本文有时称为“PD-1阻断抗体”)。在另一个实施方式中，本文提出的是应用于治疗对象(例如，人类对象)的癌症的方法的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)的转基因，所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基，以及其中所述方法进一步包括施用PD-1阻断抗体。在另一个实施方式中，本文提出的是在治疗对象(例如，人类对象)的癌症中使用的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述转基因编码人类IL-12 p40亚基和人类IL-12 p35亚基，以及其中所述方法进一步包括施用PD-1阻断抗体。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:51中列出的。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:52中列出的。在具体的实施方式中，包装基因组包含编码IL-12的转基因，所述包装基因组的序列是SEQ ID NO:60中列出的。在优选的实施方式中，所述PD-1阻断抗体是派姆单抗。在其他实施方式中，所述PD-1阻断抗体是纳武单抗、MEDI0680、PDR001或阿特珠单抗。所述第一和第二组合物(即，所述嵌合NDV和所述拮抗剂)可以通过相同的或不同的施用途径施用。本领域技术人员已知的或本文描述的任何途径可以用于施用所述第一和第二组合物(即，所述嵌合NDV和所述拮抗剂)。在具体的实施方式中，所述第一组合物(即，所述嵌合NDV)肿瘤内地施用，以及所述第二组合物(即，所述拮抗剂)静脉内地施用。在另一个具体的实施方式中，所述第一组合物(即，所述嵌合NDV)结节内地施用，以及所述第二组合物(即，所述拮抗剂)静脉内地施用。在某些实施方式中，所述第一和第二组合物(即，所述嵌合NDV和所述拮抗剂)静脉内地施用。关于NDV的信息参见例如上文的章节5.1和5.2以及下文的章节6，关于PD-1或其配体的拮抗剂的信息参见例如上文的章节5.5和下文的章节6，关于组合物和施用途径的信息参见例如上文的章节5.5.1。
在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，所述转基因编码IL-12 p40亚基和IL-12 p35亚基。IL-12转基因的实例参见例如章节5.2.1、5.7和6。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含LaSota毒株的NDV主干。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含缓发型的NDV主干。在具体的实施方式中，所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列，所述突变F蛋白由所述嵌合NDV表达，其中所述突变F蛋白包含突变的裂解位点。在具体的实施方式中，所述包装基因组包含编码具有氨基酸突变L289A(即，相应于所述NDV La Sota毒株F蛋白的L289的氨基酸位置处L到A的突变)的突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变F蛋白由所述嵌合NDV表达。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含LaSota毒株的NDV主干，以及其中所述包装基因组编码具有氨基酸突变L289A(即，相应于所述NDV La Sota毒株F蛋白的L289的氨基酸位置处L到A的突变)的突变F蛋白，其中所述突变F蛋白由所述嵌合NDV表达。编码IL-12或其衍生物的嵌合NDV的实例参见，例如，章节5.2和6。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组具有SEQ ID NO:51、52或60中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是章节5.5和/或6中描述的拮抗剂。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是特异性结合PD-1的配体的抗体(或抗原结合片段)或可溶受体。在某些实施方式中，所述可溶受体是PD-1的片段或PD-1的衍生物的片段(例如，PD-1或PD-1的衍生物的细胞外结构域)，其特异性结合PD-1的配体。在某些实施方式中，所述可溶受体是融合蛋白，所述融合蛋白包含PD-1或PD-1的衍生物的至少一部分(例如，PD-1或PD-1的衍生物的细胞外结构域)和异源氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含PD-1或PD-1的衍生物的至少一部分以及免疫球蛋白或其片段的Fc部分。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是特异性结合PD-1的配体(例如，PD-L1、PD-L2或PD-L1与PD-L2两者)的抗体(或抗原结合片段)。在另一个实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1、但是不转导抑制信号的抗体(或抗原结合片段)或配体。在另一个实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1、但不转导抑制信号的配体。在某些具体的实施方式中，所述配体是融合蛋白，其包含PD-1的配体或PD-1的配体的衍生物的至少一部分，以及异源氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含PD-1的配体或PD-1的配体的衍生物的至少一部分以及免疫球蛋白的Fc片段或其部分。PD-1或其配体的拮抗剂的非限制性实例包括派姆单抗(
Figure BDA0002363284960001001
参见，例如，Hamid等，NEngl JMed.2013；369:134-44和KEYTRUDA(派姆单抗)的完整处方信息，Reference ID:3862712)、纳武单抗(
Figure BDA0002363284960001002
参见，例如，以及OPDIVO(纳武单抗)的完整处方信息，ReferenceID:3677021)、AMP-224(参见，例如，Infante等，J Clin Oncol.2013；31(suppl):abstr3044)、和MEDI0680(也称为“AMP-514”；参见，例如，Hamid等，Ann Oncol.2016；27(suppl_6):1050PD)、度伐鲁单抗(也称为“medi-4736”；参见，例如，Lutzky等，J Clin Oncol.2014；32(suppl 5S):abstr 3001)、阿维鲁单抗(例如，用于默克尔细胞癌)(也称为“MSB0010718C”；参见，例如，Heery等J Clin Oncol.2014；32(suppl 5S):abstr 3064)、bms-936559(参见，例如，Brahmer等N.Engl.J.Med.2012；366，2455-2465)、以及阿特珠单抗(也称为“mpdl3280A”和
Figure BDA0002363284960001011
参见，例如，McDermott等，J ClinOncol.2016；34(8):833-842，Herbst等，J Clin Oncol.2013；31(suppl):abstr 3000，和TECENTRIQ的完整处方信息，Reference ID:3933242)。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是美国食品与药品管理局批准用于治疗一种或更多种癌症的疗法。美国食品与药品管理局批准用于治疗癌症的PD-1或其配体的拮抗剂的非限制性实例包括派姆单抗、纳武单抗、阿特珠单抗和阿维鲁单抗。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是EMA批准用于治疗一种或更多种癌症的疗法。EMA批准用于治疗癌症的PD-1或其配体的拮抗剂的非限制性实例包括派姆单抗、纳武单抗和阿特珠单抗。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是纳武单抗、MEDI0680或派姆单抗。在优选的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是派姆单抗。在另一个实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂是纳武单抗、AMP-224、MEDI0680、PDR001、度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、bms-936559或阿特珠单抗。
在具体的实施方式中，所述IL-12转基因编码SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12转基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO:52中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间，其中所述包装基因组的所述两个转录单元是NDV P基因和NDV M基因的转录单元。在具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12 p40亚基的核苷酸序列包含SEQ ID NO:54中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12 p35亚基的核苷酸序列包含SEQ ID NO:55中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，所述IL-12转基因编码包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12转基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO:63中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间，其中所述包装基因组的所述两个转录单元是NDV P基因和NDV M基因的转录单元。在具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12 p40亚基的核苷酸序列包含SEQ ID NO:59中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12 p35亚基的核苷酸序列是SEQ ID NO:55中列出的。
在具体的实施方式中，所述IL-12转基因编码SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12转基因的核苷酸序列是SEQ ID NO:26中列出的。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间，其中所述包装基因组的所述两个转录单元是NDV P基因和NDV M基因的转录单元。在具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12 p40亚基的核苷酸序列包含SEQ ID NO:27中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述IL-12p35亚基包含SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12p35亚基的核苷酸序列是SEQ ID NO:29中列出的。
在具体的实施方式中，所述IL-12转基因编码包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12转基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO:61中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间，其中所述包装基因组的所述两个转录单元是NDV P基因和NDV M基因的转录单元。在具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12 p40亚基的核苷酸序列包含SEQ ID NO:57中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12 p35亚基的核苷酸序列包含SEQ ID NO:29中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，所述IL-12转基因编码包含SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12转基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO:66中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间，其中所述包装基因组的所述两个转录单元是NDV P基因和NDV M基因的转录单元。在具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12 p40亚基的核苷酸序列包含SEQ ID NO:64中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12 p35亚基的核苷酸序列包含SEQ ID NO:65中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，所述IL-12转基因编码包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12转基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO:68中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间。在具体的实施方式中，所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间，其中所述包装基因组的所述两个转录单元是NDV P基因和NDV M基因的转录单元。在具体的实施方式中，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12 p40亚基的核苷酸序列包含SEQ ID NO:57中列出的核苷酸序列。在具体的实施方式中，所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述编码IL-12 p35亚基的核苷酸序列包含SEQ ID NO:65中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，包含编码IL-12的转基因的所述包装基因组的序列包含SEQ IDNO:51中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，包含编码IL-12的转基因的所述包装基因组的序列包含SEQ IDNO:52中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，包含编码IL-12的转基因的所述包装基因组的序列包含SEQ IDNO:60中列出的核苷酸序列。
在具体的实施方式中，所述嵌合NDV(或包含所述嵌合NDV的组合物)通过章节5.5.1和/或章节6中描述的途径施用给对象。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV肿瘤内地施用给所述对象。在具体的实施方式中，所述肿瘤内的施用是皮下的。在另一个具体的实施方式中，所述嵌合NDV结节内地施用给对象。在另一个实施方式中，所述嵌合NDV静脉内地施用给所述对象。
在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂(或包含所述拮抗剂的组合物)通过章节5.5.1和/或章节6中描述的途径施用给对象。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂(或包含所述拮抗剂的组合物)静脉内地施用给所述对象。
在具体的实施方式中，所述治疗的癌症是章节5.7.5和/或章节6中描述的癌症。在具体的实施方式中，所述癌症是黑素瘤、肾癌、肺癌、膀胱癌或头颈癌。在具体的实施方式中，所述肺癌是非小细胞肺癌。在具体的实施方式中，所述头颈癌是头颈部的鳞状细胞癌。在具体的实施方式中，所述癌症是子宫癌、胃癌、食道癌、肝癌、脑癌或肉瘤。在具体的实施方式中，所述癌症是复现的或复发的。在具体的实施方式中，所述癌症是转移性的。在具体的实施方式中，所述癌症是不可切除的。在具体的实施方式中，所述癌症包含真皮的、皮下的或结节的转移。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，所述癌症的活检物是PD-L1阳性的。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术例如免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果肿瘤比例评分(TPS)、PD-L1染色细胞的百分比是至少1％、2％、3％、5％、7％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％，活检物是PD-L1阳性的。在另一个具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术例如免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果肿瘤比例评分(TPS)、PD-L1染色细胞的百分比是1％到100％、25％到50％、25％到100％、50％到75％、50％到100％、或75％到100％，活检物是PD-L1阳性的。在其他实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术例如免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，所述癌症的活检物是PD-L1阴性的。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术例如免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果肿瘤比例评分(TPS)小于1％，活检物是PD-L1阴性的。
在具体的实施方式中，所述对象是章节5.7.3和/或章节6中描述的对象。在具体的实施方式中，所述对象对于使用PD-1或其配体的拮抗剂的治疗是难治性的。在具体的实施方式中，所述对象对于使用纳武单抗、AMP-224、MEDI0680、派姆单抗、度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、bms-936559或阿特珠单抗的治疗是难治性的。在具体的实施方式中，所述对象对于使用单独的派姆单抗治疗是难治性的。在具体的实施方式中，所述对象对于使用单独的派姆单抗的治疗是不响应的。
在具体的实施方式中，所述对象患有复发的癌症，并且对于使用PD-1或其配体的拮抗剂的治疗是难治性的。在具体的实施方式中，所述对象患有复发的癌症，并且对于使用纳武单抗、AMP-224、MEDI0680、派姆单抗、度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、bms-936559或阿特珠单抗的治疗是难治性的。在具体的实施方式中，所述对象患有复发的癌症，并且对于使用派姆单抗的治疗是难治性的。
5.7.2其他方法
在一个方面，(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)可以用于治疗癌症。在一个实施方式中，本文提供的治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物。在具体的实施方式中，本文提供的治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用有效量本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物。
在具体的实施方式中，治疗癌症中使用的所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组编码IL-12(参见，例如，章节5.2和/或章节6)。
治疗癌症的方法中使用的本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗或全细胞癌症疫苗可以用作任一线的疗法(例如，第一线、第二线、第三线、第四线或第五线疗法)。
在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)是被施用以治疗癌症的仅有的活性成分。在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)是被施用以治疗癌症的组合物中仅有的活性成分。
所述嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物可以局部地或全身地向对象施用。例如，所述嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物可以胃肠外地(例如，静脉内地、动脉内地、或皮下地)、肿瘤内地、结节内地、胸膜内地、鼻内地、腹膜内地、腔内地、头骨内地、口服地、直肠地、通过吸入、肌内注射地、表面地或皮内地施用给对象。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV通过肝动脉，例如通过肝动脉注射进行施用，其可以通过介入放射学或通过放置动脉输注泵来进行。在另一个具体的实施方式中，所述嵌合NDV是手术中地、腹腔镜地、内窥镜地、或由图像引导进行施用。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV的腹膜内施用通过直接注射、经由导管输注、或在腹腔镜检查期间注射来进行。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV肿瘤内地施用。在某些实施方式中，图像引导被用于施用所述嵌合NDV。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV静脉内地施用。在另一个具体的实施方式中，所述嵌合NDV结节内地施用。
在某些实施方式中，本文描述的方法包括治疗没有可用治疗的癌症。在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物作为其他常规疗法的替代被施用给对象以治疗癌症。
在一个实施方式中，本文提供的治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物，以及一种或更多种额外的疗法，例如，下文的章节5.7.6中描述的疗法。在特定的实施方式中，一种或更多种疗法与本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物组合地施用给对象以治疗癌症。在具体的实施方式中，所述额外的疗法是当前使用的、已经使用的、或已知在治疗癌症中有用的。在另一个实施方式中，本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)或其组合物与支持疗法、疼痛减轻疗法、或对癌症没有治疗效果的其他疗法组合地施用给对象。在具体的实施方式中，与本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)组合地施用的所述一种或更多种额外的疗法是下文的章节5.7.6.1中描述的一种或更多种疗法。在某些实施方式中，本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)和一种或更多种额外的疗法在同一组合物中施用。在其他实施方式中，嵌合NDV和一种或更多种额外的疗法在不同的组合物中施用。
在某些实施方式中，两种、三种或多种NDV(包括本文描述的一种、两种或更多种嵌合NDV，例如，上文的章节5.2中描述的一种、两种或更多种嵌合NDV)被施用给对象以治疗癌症。本文描述的方法包括向对象施用两种、三种或多种NDV以治疗癌症，根据所述方法使用的第二种或更多种嵌合NDV可以是天然发生的嵌合NDV、或被工程化以表达异源氨基酸序列(例如，细胞因子)的工程化的嵌合NDV。所述第一和第二嵌合NDV可以是同一药物组合物或不同的药物组合物的部分。在某些实施方式中，所述第一嵌合NDV和所述第二嵌合NDV通过相同的施用途径施用(例如，都是肿瘤内地或静脉内地施用的)。在其他实施方式中，所述第一嵌合NDV和所述第二嵌合NDV通过不同的施用途径施用(例如，一种是肿瘤内地施用的，另一种是静脉内地施用的)。
在另一个方面，本文描述的NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)可以与例如下文的章节5.7.6(例如，下文的章节5.7.6.1)中描述的一种或更多种额外的疗法组合地用于治疗癌症。在一个实施方式中，本文提供的是治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用本文描述的NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)或其组合物，以及一种或更多种额外的疗法，例如，下文的章节5.7.6(例如，章节5.7.6.1)中描述的疗法。在具体的实施方式中，本文提供的是治疗癌症的方法，包括向有需要的对象施用有效量的本文描述的NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)或其组合物，以及有效量的一种或更多种额外的疗法，例如，下文的章节5.7.6(例如，章节5.7.6.1)中描述的疗法。在某些实施方式中，本文描述的NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)和一种或更多种额外的疗法，例如下文的章节5.7.6(例如，章节5.7.6.1)中描述的疗法在同一组合物中施用。在其他实施方式中，NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)和一种或更多种额外的疗法在不同的组合物中施用。
与一种或更多种额外的疗法组合地使用的所述NDV可以全身地或局部地施用。例如，所述NDV或其组合物可以胃肠外地(例如，静脉内地、动脉内地、或皮下地)、肿瘤内地、结节内地、胸膜内地、鼻内地、腹膜内地、头骨内地、口服地、直肠地、通过吸入、肌内注射地、表面地或皮内地施用给对象。在具体的实施方式中，所述NDV通过肝动脉，例如通过肝动脉注射进行施用，其可以通过介入放射学或通过放置动脉输注泵来进行。在另一个具体的实施方式中，所述NDV手术中地、腹腔镜地或内窥镜地施用。在具体的实施方式中，所述NDV的腹膜内施用通过直接注射、经由导管输注、或在腹腔镜检查期间注射来进行。
与一种或更多种额外的疗法例如下文的章节5.7.6中描述的疗法组合的本文描述的NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、或全细胞癌症疫苗，以用作任一线的疗法(例如，第一线、第二线、第三线、第四线或第五线疗法)用于根据本文描述的方法治疗癌症。
在另一个方面，本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)感染的全癌细胞可以用于治疗癌症。在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)可以与癌细胞或癌细胞的群体接触，感染的癌细胞或癌细胞群体可以施用给对象以治疗癌症。在一个实施方式中，所述癌细胞在用本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)感染之前经历γ辐射。在另一个实施方式中，所述癌细胞在用本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)感染之后经历γ辐射。在特定的实施方式中，所述癌细胞在施用给对象之前处理，使得所述癌细胞在所述对象中不扩增。在具体的实施方式中，所述癌细胞不能在所述对象中扩增，并且所述病毒不能感染所述对象。在一个实施方式中，所述癌细胞在施用给对象之前经历γ辐射。在另一个实施方式中，所述癌细胞在施用给对象之前进行超声化。在另一个实施方式中，所述癌细胞在施用给对象之前用丝裂霉素C处理。在另一个实施方式中，所述癌细胞在施用给对象之前通过冻融处理。在另一个实施方式中，所述癌细胞在施用给对象之前用热处理处理。所述癌细胞可以局部地或全身地向对象施用。例如，所述癌细胞可以胃肠外地(例如，静脉内地或皮下地)、肿瘤内地、结节内地、鼻内地、口服地、通过吸入、胸膜内地、表面地或皮内地施用给对象。在具体的实施方式中，所述癌细胞肿瘤内地或向对象的皮肤(例如，皮内地)施用。所使用的所述癌细胞可以是自体的或同种异体的。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV的主干是非溶胞的毒株。所述癌细胞可以单独地或与额外的疗法组合地施用给对象。所述癌细胞优选地处在药物组合物中。在某些实施方式中，所述癌细胞与一种或更多种额外的疗法，例如，下文的章节5.7.6中描述的疗法组合地施用。在某些实施方式中，所述癌细胞和一种或更多种额外的疗法在同一组合物中施用。在其他实施方式中，所述癌细胞和一种或更多种额外的疗法在不同的组合物中施用。
在另一个方面，感染本文描述的NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)的全癌细胞可以与下文的章节5.7.6中描述的一种或更多种额外的疗法组合地用于治疗癌症。在一个实施方式中，本文提供的是治疗癌症的方法，包括与下文的章节5.7.6中描述的一种或更多种额外的疗法组合地向有需要的对象施用感染本文描述的NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)的全癌细胞。在具体的实施方式中，本文提供的是治疗癌症的方法，包括与有效量的下文的章节5.7.6中描述的一种或更多种额外的疗法组合地向有需要的对象施用有效量的感染本文描述的NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)的全癌细胞。在某些实施方式中，感染本文描述的NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)的全癌细胞以及一种或更多种额外的疗法，例如下文的章节5.7.6(例如，章节5.7.6.1)中描述的疗法在同一组合物中施用。在其他实施方式中，感染本文描述的NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)的全癌细胞以及一种或更多种额外的疗法在不同的组合物中施用。
在另一个方面，来自感染嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)的裂解癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜制品可以用于治疗癌症。在一个实施方式中，包含来自感染本文描述的嵌合NDV的癌细胞的碎片的质膜制品可以用于治疗癌症。在另一个实施方式中，来自感染本文描述的嵌合NDV的癌细胞的蛋白质浓缩物可以用于治疗癌症。本领域技术人员已知的技术可以用于生产所述蛋白质浓缩物或质膜制品。在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV(例如，上文的章节5.2中描述的嵌合NDV)可以与癌细胞或癌细胞群体接触，感染的癌细胞或癌细胞群体可以使用本领域技术人员已知的技术进行裂解以获得NDV感染的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜碎片，所述NDV感染的癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜碎片可以施用给对象以治疗癌症。所述蛋白质浓缩物或质膜碎片可以局部地或全身地向对象施用。例如，所述蛋白质浓缩物或质膜碎片可以胃肠外地(例如，静脉内地或皮下地)、肿瘤内地、结节内地、鼻内地、口服地、通过吸入、胸膜内地、表面地或皮内地施用给对象。在具体的实施方式中，这样的蛋白质浓缩物或质膜制品肿瘤内地或向对象的皮肤(例如，皮内地)施用。用于生产所述蛋白质浓缩物或质膜制品的癌细胞可以是自体的或同种异体的。在具体的实施方式中，所述嵌合NDV的主干是非溶胞的毒株。所述蛋白质浓缩物或质膜制品可以单独地或与额外的疗法组合地施用给对象。所述蛋白质浓缩物或质膜制品优选地处在药物组合物中。在某些实施方式中，所述蛋白质浓缩物或质膜制品与一种或更多种额外的疗法，例如，下文的章节5.7.6(例如，章节5.7.6.1)中描述的疗法组合地施用。在某些实施方式中，所述蛋白质浓缩物或质膜制品以及一种或更多种额外的疗法在同一组合物中施用。在其他实施方式中，所述蛋白质浓缩物或质膜制品以及一种或更多种额外的疗法在不同的组合物中施用。
在另一个方面，来自感染NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)的裂解癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜制品可以与下文的章节5.7.6(例如，章节5.7.6.1)中描述的一种或更多种额外的疗法组合地用于治疗癌症。在一个实施方式中，本文提供的是治疗癌症的方法，包括例如下文的章节5.7.6(例如，章节5.7.6.1)中描述的一种或更多种额外的疗法组合地向有需要的对象施用来自感染NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)的裂解癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜制品。在具体的实施方式中，本文提供的是治疗癌症的方法，包括与有效量的例如下文的章节5.7.6(例如，章节5.7.6.1)中描述的一种或更多种额外的疗法组合地向有需要的对象施用有效量的来自感染NDV(例如，上文的章节5.1中描述的NDV)的裂解癌细胞的蛋白质浓缩物或质膜制品。在某些实施方式中，所述蛋白质浓缩物或质膜制品以及一种或更多种额外的疗法例如下文的章节5.7.6中描述的疗法在同一组合物中施用。在其他实施方式中，所述蛋白质浓缩物或质膜制品以及一种或更多种额外的疗法在不同的组合物中施用。
在某些实施方式中，治疗癌症的方法包括国际专利申请公开No.WO 2014/158811和美国专利申请公开No.2016/0015760 A1和2014/0271677 A1的章节5.6中描述的那些，其每一个通过引用以其整体合并在本文中。
5.7.3患者群体
在某些实施方式中，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给患有癌症的对象。在其他实施方式中，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给对癌症有倾向或敏感的对象。在某些实施方式中，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给被诊断患有癌症的对象。癌症类型的具体实例是本文描述的(参见，例如，章节5.7.5和章节6)。在一个实施方式中，所述对象患有转移性癌症。在另一个实施方式中，所述对象患有1期、2期、3期、或4期癌症。在另一个实施方式中，所述对象处于缓解中。在又一个实施方式中，所述对象有癌症的复发。
在某些实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给0到6个月、6到12个月、6到18个月、18到36个月、1到5岁、5到10岁、10到15岁、15到20岁、20到25岁、25到30岁、30到35岁、35到40岁、40到45岁、45到50岁、50到55岁、55到60岁、60到65岁、65到70岁、70到75岁、75到80岁、80到85岁、85到90岁、90到95岁或95到100岁的人类。在具体的实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给例如1岁、2岁、3年、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁、10岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁、16年或17岁的儿科患者。在某些实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给1到5岁、2到5岁、1到10岁、2到10岁、5到10岁、1到18岁、2到18岁、5到18岁、或10到18岁的人类儿科患者。在某些实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给人类婴儿。在其他实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给人类学步儿童。在其他实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给人类儿童。在某些实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给18岁或以上的成年患者。在其他实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给人类成年人。在又其他的实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给年长的人类。在具体的实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给展现皮肤的或皮下的肿瘤或淋巴结内的肿瘤的患者。
在某些实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给处于免疫受损状态或免疫抑制状态、或有风险变为免疫受损或免疫抑制的对象。在某些实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给接受免疫抑制疗法或从免疫抑制疗法恢复的对象。在某些实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给患有癌症或有风险得到癌症的对象。在某些实施方式中，所述对象是、将要、或已经经历手术、化疗和/或放射治疗。在某些实施方式中，所述患者已经经历手术除去肿瘤或赘生物。在具体的实施方式中，所述患者在手术除去肿瘤或赘生物之后施用NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法。在其他实施方式中，所述患者在进行手术除去肿瘤或赘生物之前施用NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法。在某些实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给有、将要有、或已经有组织移植、器官移植或输血的对象。
在某些实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给患者，所述患者被证明对于所述嵌合NDV或其组合物、肿瘤裂解物、全细胞疫苗、或组合疗法之外的疗法是难治性的、但是不再进行这些疗法。在具体的实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给被证明对于化疗是难治性的患者。在具体的实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给患者，所述患者被证明对于PD-1或其配体的拮抗剂的治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给患者，所述患者被证明对于PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给患者，所述患者被证明对于PD-1阻断抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)的治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给患者，所述患者被证明对于PD-1阻断抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给患者，所述患者被证明对于PD-L1阻断抗体(例如，阿特珠单抗)的治疗是难治性的或未响应的。在另一个具体的实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给患者，所述患者被证明对于PD-L1阻断抗体(例如，阿特珠单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，患者被证明难治性的所述疗法是组合疗法的部分。例如，在具体的实施方式中，所述患者被证明对于PD-1或其配体的拮抗剂治疗是难治性的；然而，不受任何特定理论的限制，所述患者对于与NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法组合的所述PD-1或其配体的拮抗剂的治疗是响应的。癌症是否是难治性的确定可以通过本领域已知的任何方法进行。在某些实施方式中，难治性的患者是对于标准疗法为难治性的患者。在某些实施方式中，患有癌症的患者起初响应疗法，但随后变为难治性的。
在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是在用所述嵌合NDV或其组合物、肿瘤裂解物、全细胞疫苗、或组合疗法之外的疗法治疗之后复发的患者。在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是在用PD-1或其配体的拮抗剂治疗之后复发的患者。在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是在用PD-1或其配体的拮抗剂单一治疗之后复发的患者。在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是在用PD-1阻断抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)治疗之后复发的患者。在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是在用PD-1阻断抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)单一治疗之后复发的患者。在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是在用PD-L1阻断抗体(例如，阿特珠单抗)治疗之后复发的患者。在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是在用PD-L1阻断抗体(例如，阿特珠单抗)单一治疗之后复发的患者。
在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是在用所述嵌合NDV或其组合物、肿瘤裂解物、全细胞疫苗、或组合疗法之外的疗法治疗之后复发的，并且对于PD-1或其配体的拮抗剂的治疗是难治性的或未响应的患者。在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是在用PD-1或其配体的拮抗剂治疗之后复发的、并且对于PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性的或未响应的患者。在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是用PD-1阻断抗体(例如，派姆单抗或纳武单抗)治疗之后复发的、并且对于PD-1阻断抗体的单一治疗是难治性的或未响应的患者。在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是用PD-L1阻断抗体(例如，阿特珠单抗)治疗之后复发的、并且对于PD-L1阻断抗体的单一治疗是难治性的或未响应的患者。
在某些实施方式中，将要根据本文描述的方法治疗的患者是已经用抗生素、抗病毒、抗真菌、或其他生物学疗法/免疫疗法或抗癌疗法治疗的患者。在这些之中，患者是难治性患者，以及太小而不能进行常规疗法的患者。在某些实施方式中，施用NDV(例如，嵌合NDV)、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法的所述对象，在施用所述嵌合NDV或组合物、所述肿瘤裂解物疫苗、或所述全细胞疫苗、或所述组合疗法之前没有接受疗法。
在某些实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给患者以防止有风险发生癌症的患者中癌症的发作。在某些实施方式中，化合物被施用给对常规疗法的不良反应敏感的患者。
在某些实施方式中，施用NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法的所述对象没有接受在先的疗法。在其他实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法被施用给对象，所述对象在施用所述NDV(例如，嵌合NDV)或组合物、所述肿瘤裂解物疫苗、所述全细胞疫苗、或所述组合疗法之前接受了疗法。在某些实施方式中，施用NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法的所述对象经历了在先的疗法的不良副作用，或在先的疗法由于对所述对象不可接受的毒性水平而停止。
在具体的实施方式中，施用NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法的所述对象具有一个或更多个PD-L1阳性肿瘤或恶性肿瘤。在具体的实施方式中，肿瘤或恶性肿瘤是PD-L1阳性的。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术例如免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果所述肿瘤或恶性肿瘤的活检物的肿瘤比例评分(TPS)，PD-L1细胞染色的百分比是至少1％、2％、3％、5％、7％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％，所述肿瘤或恶性肿瘤是PD-L1阳性的。在另一个具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术例如免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果所述肿瘤或恶性肿瘤的活检物的肿瘤比例评分(TPS)，PD-L1的细胞染色的百分比是1％到100％、25％到50％、25％到100％、50％到75％、50％到100％、或75％到100％，所述肿瘤或恶性肿瘤是PD-L1阳性的。
在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术例如免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果所述肿瘤或恶性肿瘤的活检物的联合阳性评分(CPS)，PD-L1细胞染色的百分比是至少1％、2％、3％、5％、7％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％，所述肿瘤或恶性肿瘤是PD-L1阳性的。在另一个具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术例如免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果所述肿瘤或恶性肿瘤的活检物的联合阳性评分(CPS)，PD-L1的细胞染色的百分比是1％到100％、25％到50％、25％到100％、50％到75％、50％到100％、或75％到100％，所述肿瘤或恶性肿瘤是PD-L1阳性的。为了测定CPS，测定来自对象的肿瘤组织样品中活力的PD-L1阳性肿瘤细胞的数量、活力的PD-L1阴性肿瘤细胞的数量、以及活力的PD-L1阳性单核炎性细胞(MIC)的数量，然后使用公式计算联合阳性评分(CPS):CPS＝(PD-L1阳性肿瘤细胞的数量+PD-L1阳性单核炎性细胞(MIC)的数量/PD-L1阳性肿瘤细胞+PD-L1阴性肿瘤细胞的数量)×100％。联合阳性评分(CPS)的说明，参见，例如，美国专利申请公开No.2017/0285037和Kulangara等，Journal of ClinicalOncology 2017 35:15_suppl，el4589-el4589，它们的每一个通过引用以其整体合并在本文中。
在某些实施方式中，施用NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法的所述对象具有一个或更多个PD-L1阴性肿瘤或恶性肿瘤。在具体的实施方式中，肿瘤或恶性肿瘤是PD-L1阴性的。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术例如免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，所述癌症的活检物是PD-L1阴性的。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，免疫组织化学或PD-L1 IHC22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果肿瘤或恶性肿瘤的活检物的肿瘤比例评分(TPS)，PD-L1的细胞染色的百分比小于1％，所述肿瘤或恶性肿瘤是PD-L1阴性的。
在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果肿瘤或恶性肿瘤的活检物的联合阳性评分(CPS)，PD-L1的细胞染色的百分比小于1％，所述肿瘤或恶性肿瘤是PD-L1阴性的。
在具体的实施方式中，施用NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、或本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法的所述对象具有低水平PD-L1的一个或更多个肿瘤或恶性肿瘤。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，或PD-L1 IHC22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果所述肿瘤或恶性肿瘤的活检物具有1％到50％之间、或1％到40％之间、1％到30％之间、1％到25％之间、1％到15％之间、或1％到10％之间的肿瘤比例评分(TPS)，所述肿瘤或恶性肿瘤具有低水平的PD-L1表达。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果所述肿瘤或恶性肿瘤的活检物具有小于50％但1％或更大的肿瘤比例评分(TPS)，所述肿瘤或恶性肿瘤具有低水平的PD-L1表达。
在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，或PD-L1 IHC 22C3pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果所述肿瘤或恶性肿瘤的活检物具有1％到50％之间、或1％到40％之间、1％到30％之间、1％到25％之间、1％到15％之间、或1％到10％之间的联合阳性评分(CPS)，所述肿瘤或恶性肿瘤具有低水平的PD-L1表达。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，免疫组织化学或PD-L1 IHC22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果所述肿瘤或恶性肿瘤的活检物具有小于50％但1％或更大的联合阳性评分(CPS)，所述肿瘤或恶性肿瘤具有低水平的PD-L1表达。
在具体的实施方式中，使用ELISA来确定肿瘤细胞是否是PD-L1阳性，和/或确定肿瘤或恶性肿瘤是否具有低水平的PD-L1。在具体的实施方式中，使用免疫组织化学来确定肿瘤细胞是否是PD-L1阴性、PD-L1阳性、和/或确定肿瘤或恶性肿瘤是否具有低水平的PD-L1。在具体的实施方式中，根据美国批准的用于测定PD-L1水平的一种或更多种分析，肿瘤或恶性肿瘤(或其活检物)被确定为是PD-L1阴性、PD-L1阳性和/或具有低水平的PD-L1。美国食品药品管理局批准的用于测定PD-L1水平的分析的非限制性实例包括PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(由Dako North America，Inc.制造)和Ventana PD-L1(SP142)分析(由Ventana MedicalSystems，Inc.制造)。在另一个具体的实施方式中，肿瘤或恶性肿瘤(或其活检物)中PD-L1的水平根据临床实验室改进修正案验证的实验室中进行的实验室开发的测试来测定。
5.7.4给药&频率
在治疗癌症中有效的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、或全细胞疫苗的数量将取决于癌症的性质、施用途径、对象的一般健康等，应当根据执业医生的判断来决定。任选地可以采用标准的临床技术，例如，体外分析来帮助鉴定最佳的剂量范围。然而，用于施用的NDV的适合的剂量范围一般是约102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012pfu，最优选的约104到约1012、106到1012、108到1012、109到1012、或109到1011pfu，可以以所需的时间间隔施用给对象一次、两次、三次或更多次。用于施用的肿瘤裂解物疫苗的剂量范围可以包括0.001mg、0.005mg、0.01mg、0.05mg.0.1mg.0.5mg、1.0mg、2.0mg、3.0mg、4.0mg、5.0mg、10.0mg、0.001mg到10.0mg、0.01mg到1.0mg、0.1mg到1mg、和0.1mg到5.0mg，可以以所需的时间间隔施用给对象一次、两次、三次或更多次。用于施用的全细胞疫苗的剂量范围可以包括102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011或1012个细胞，可以以需要的时间间隔施用给对象一次、两次、三次或更多次。在某些实施方式中，与当前在临床试验中对于NDV、肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗施用给的那些类似的剂量被施用给对象。有效的剂量可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推断。
在某些实施方式中，NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物作为单次剂量施用给对象，随后是1到6周、1到5周、1到4周、1到3周、1到2周之后的第二剂量。根据这些实施方式，可以在第二接种之后以6到12个月的间隔时间向所述对象施用强化接种。在某些实施方式中，肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗作为单次剂量施用给对象，随后是1到6周、1到5周、1到4周、1到3周、1到2周之后的第二剂量。
在某些实施方式中，同样的NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、或全细胞疫苗的施用可以重复，所述施用可以分隔至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2个月、75天、3个月、或至少6个月。在其他实施方式中，同样的NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、或全细胞疫苗的施用可以重复，所述施用可以分隔1到14天、1到7天、7到14天、1到30天、15到30天、15到45天、15到75天、15到90天、1到3个月、3到6个月、3到12个月、或6到12个月。在某些实施方式中，第一NDV(例如，第一嵌合NDV)或其组合物被施用给对象，随后是第二NDV(例如，第二嵌合NDV)或其组合物的施用。在某些实施方式中，所述第一和第二NDV(例如，所述第一和第二嵌合NDV)或其组合物可以分隔至少1天、2天、3天、5天、6天、7天、10天、14天、15天、21天、28天、30天、45天、2个月、75天、3个月、或至少6个月。在其他实施方式中，所述第一和第二NDV(例如，所述第一和第二嵌合NDV)或其组合物可以分隔1到14天、1到7天、7到14天、1到30天、15到30天、15到45天、15到75天、15到90天、1到3个月、3到6个月、3到12个月、或6到12个月。
在某些实施方式中，NDV或其组合物、或肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗与一种或更多种额外的疗法，例如，下文的章节5.7.6中描述的疗法组合地施用给对象。所述一种或更多种额外的疗法的剂量将取决于各种因素，包括，例如，疗法、癌症的性质、施用途径、对象的一般健康等，应当根据职业医生的判断来决定。在具体的实施方式中，所述其他疗法的剂量是所述疗法的剂量和/或施用频率，是根据本文公开的方法作为单一药剂使用的所述疗法推荐的。在其他实施方式中，所述其他疗法的剂量是与根据本文公开的方法作为单一药剂使用的所述疗法推荐的相比，所述疗法的更低剂量和/或更低频率的施用。批准的疗法的建议剂量可以在Physician's Desk Reference中找到。
在某些实施方式中，NDV或其组合物、或肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗与一种或更多种额外的疗法的施用同时地施用给对象。在其他实施方式中，NDV或其组合物、或肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗每3到7天、1到6周、1到5周、1到4周、2到4周、1到3周、或1到2周施用给对象，以及一种或更多种额外的疗法(例如下文的章节5.7.6中描述的)每3到7天、1到6周、1到5周、1到4周、1到3周、或1到2周施用。在某些实施方式中，NDV或其组合物、或肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗每1到2周施用给对象，以及一种或更多种额外的疗法(例如下文的章节5.7.6中描述的)每2到4周施用。在某些实施方式中，NDV或其组合物、或肿瘤裂解物疫苗或全细胞疫苗每周施用给对象，以及一种或更多种额外的疗法(例如下文的章节5.7.6中描述的)每2周施用。
用于治疗对象的所述PD-1或其配体的拮抗剂的剂量将取决于各种因素，包括，例如，疗法、癌症的性质、施用途径、对象的一般健康状况的，应当根据执业医生的判断决定。在具体的实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂的剂量是所述PD-1或其配体的拮抗剂的剂量和/或施用频率，是根据本文公开的方法作为单一药剂使用的所述PD-1或其配体的拮抗剂推荐的。在某些实施方式中，所述PD-1或其配体的拮抗剂的剂量是与根据本文公开的方法作为单一药剂使用的所述PD-1或其配体的拮抗剂推荐的相比，所述疗法的更低剂量和/或更低频率的施用。批准的疗法的建议剂量可以在Physician's Desk Reference中找到。
在所述PD-1或其配体的拮抗剂是纳武单抗的具体实施方式中，作为每两周一定时间例如30分钟的静脉内输注，纳武单抗的剂量可以是240mg。参见，例如，2018年4月修正的OPDIVO的完整处方信息，通过引用以其整体合并在本文中。在所述PD-1或其配体的拮抗剂是纳武单抗的另一个具体实施方式中，作为每四周一定时间例如30分钟的静脉内输注，纳武单抗的剂量可以是480mg。同上。在所述PD-1或其配体的拮抗剂是纳武单抗的另一个具体实施方式中，作为每两周一定时间例如60分钟的静脉内输注，纳武单抗的剂量可以是3mg/kg。参见，例如，OPDIVO的完整处方信息，Reference ID:3677021，通过引用以其整体合并在本文中。在所述PD-1或其配体的拮抗剂是派姆单抗的具体实施方式中，作为每三周一定时间例如30分钟的静脉内输注，派姆单抗的剂量可以是200mg。参见，例如，2017年11月修正的KEYTRUDA的完整处方信息，通过引用以其整体合并在本文中。在所述PD-1或其配体的拮抗剂是派姆单抗的另一个具体实施方式中，作为每三周一定时间例如30分钟的静脉内输注，派姆单抗的剂量可以是2mg/kg。参见，例如，KEYTRUDA的完整处方信息，Reference ID:3862712，通过引用以其整体合并在本文中。在所述PD-1或其配体的拮抗剂是派姆单抗的另一个具体实施方式中，作为每三周一定时间例如30分钟的静脉内输注，派姆单抗的剂量可以是2mg/kg和至多200mg/kg之间。参见，例如，KEYTRUDA的完整处方信息，Reference ID:3862712，通过引用以其整体合并在本文中。在所述PD-1或其配体的拮抗剂是阿特珠单抗的具体实施方式中，作为每三周一定时间例如60分钟的静脉内输注，阿特珠单抗的剂量可以是1,200mg。参见，例如，TECENTRIQ的完整处方信息，Reference ID:4000525，通过引用以其整体合并在本文中。
5.7.5癌症类型
根据本文描述的方法可以治疗的癌症的具体实例包括，但不限于:白血病，例如，但不限于，急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病，例如，成髓细胞、早幼粒细胞、骨髓单核、单核细胞的和红细胞白血病以及骨髓增生异常综合症；骨髓纤维化、慢性白血病，例如，但不限于，慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于郁积多发性骨髓瘤、非分泌性多发性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、pla癌细胞白血病(placancer cell leukemia)、单生pla癌细胞瘤(solitary placancercytoma)、和髓外pla癌细胞瘤(extramedullary placancercytoma)；华氏巨球蛋白血症；意义不明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨骼肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管肉瘤)、纤维肉瘤、卡波西氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤；脑肿瘤，例如但不限于，胶质瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、室管膜瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、非胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、听神经瘤、颅咽管瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、成松果体细胞瘤、原发脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于三阴性乳腺癌、ER+/HER2-乳腺癌、导管癌、腺癌、小叶(癌细胞)癌、管内癌、髓质乳腺癌、粘质乳腺癌、小管乳腺癌、乳头状乳腺癌、畸形性骨炎和炎症性乳腺癌；肾上腺癌症，例如但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状的或滤泡的甲状腺癌、髓质甲状腺癌、间变性甲状腺癌；胰腺癌，例如但不限于胰岛瘤、胃泌素瘤、胰升血糖素瘤、血管活性肠肽瘤(vipoma)、生长抑素分泌性肿瘤和类癌瘤或胰岛细胞瘤；垂体癌症，例如但不限于垂体嗜碱细胞增殖、催乳素分泌性肿瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼部癌症，例如但不限于眼部黑素瘤，例如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤和睫状体黑素瘤，和视网膜母细胞瘤；阴道癌症，例如鳞状细胞癌、腺癌和黑素瘤；外阴癌症，例如鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和畸形性骨炎(Paget's disease)；宫颈癌，例如但不限于，鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于，卵巢上皮癌、界线瘤、生殖细胞瘤和间质瘤；食道癌症，例如但不限于，鳞癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、pla癌细胞瘤、疣状癌、和oat细胞(癌细胞)癌；胃癌，例如但不限于腺癌、真菌样生长(息肉样的)、溃烂、浅表传播的、广泛传播的恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；直肠癌；肝癌，例如但不限于肝细胞癌和肝胚细胞瘤；胆囊癌，例如腺癌；胆管细胞癌，例如但不限于乳头状的、结节的和弥散的；肺癌，例如非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和癌细胞肺癌；睾丸癌，例如但不限于生殖瘤、精原细胞瘤、间变性、古典的(典型的)、精细胞的、非精原细胞瘤、胚胎癌、畸胎瘤癌、恶性合胞体瘤(卵黄囊肿瘤)、前列腺癌，例如但不限于前列腺上皮内瘤样病变、腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；阴茎癌；口腔癌，例如但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺细胞癌；咽癌症，例如但不限于鳞状细胞癌和疣的；皮肤癌，例如但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤、浅表的传播黑素瘤、结节的黑素瘤、斑点恶性黑色素瘤、肢端雀斑痣性黑素瘤；肾癌，例如但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌症(肾盂和/或子宫)；韦尔姆斯氏瘤；膀胱癌，例如但不限于转移细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。此外，癌症包括粘液肉瘤、骨肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、成血管细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌(这类失调的综述参见Fishman等，1985，Medicine，2d Ed.，J.B.LippincottCo.，Philadelphia and Murphy等，1997，Informed Decisions:The Complete Book ofCancer Diagnosis，Treatment，and Recovery，Viking Penguin，Penguin Books U.S.A.，Inc.，United States of America)。
在具体的实施方式中，本文描述的嵌合NDV或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法在治疗各种癌症和异常增生疾病方面是有用的，包括(但不限于)以下的:癌，包括膀胱者、乳腺、结肠、肾脏、肝脏、肺部、卵巢、胰腺、胃、宫颈、甲状腺的和皮肤；包括鳞状细胞癌；淋巴谱系的造血系统肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤；骨髓谱系的造血系统肿瘤，包括急性和慢性髓细胞性白血病和早幼粒细胞白血病；间充质来源的瘤，包括纤维肉瘤和眼眶横纹肌肉瘤；其它肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、成神经细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和外周神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质来源的肿瘤，包括纤维肉瘤，眼眶横纹肌肉瘤和骨肉瘤的肿瘤；和其它肿瘤，包括黑色素瘤、着色性干皮病、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡癌和畸胎癌。
在某些实施方式中，根据本文描述的方法治疗与细胞凋亡中的畸变相关的癌症。这些癌症可以包括但不限于，滤泡性淋巴瘤、p53突变的癌、乳腺、前列腺和卵巢的激素依赖性肿瘤，和癌前期病变，例如家族性腺瘤息肉病，和脊髓发育不良综合征。在具体实施方案中，根据本文描述的方法治疗皮肤、肺部、肝脏、骨骼、脑、胃、结肠、乳腺、前列腺、膀胱、肾脏、胰腺、卵巢和/或子宫的恶性肿瘤或不良增殖改变(例如组织化生和发育异常)，或超量增殖性失调。在其他具体实施方式中，根据本文描述的方法治疗肉瘤或黑素瘤。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是白血病、淋巴瘤或骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)。根据本文描述的方法可以治疗的白血病和其他血液癌症的具体实例包括但不限于，急性淋巴母细胞性白血病“ALL”、急性的成淋巴细胞的B细胞白血病、急性的成淋巴细胞的T细胞白血病、急性髓母细胞性白血病“AML”、急性早幼粒细胞白血病“APL”、急性的单核细胞白血病、急性的红细胞白血病、急性的巨核细胞白血病、急性髓单核细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、急性未分化性白血病、慢性粒细胞性白血病“CML”、慢性淋巴细胞性白血病“CLL”和毛细胞白血病。
根据本文描述的方法可以治疗的淋巴瘤的具体实例包括但不限于，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤，如弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链病、和真性红细胞增多症。
在另一个实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是实体肿瘤。根据本文描述的方法可以治疗的实体肿瘤的实例包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结肠直肠癌症、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食道癌、胃癌、口腔癌、鼻部癌症、咽喉癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、恶性合胞体瘤、精原细胞瘤、胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、癌细胞肺癌、膀胱癌、肺癌、上皮癌、胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、寡枝神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、皮肤癌、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。在另一个实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是转移性的。在另一个实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是恶性的。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是黑素瘤(例如，晚期黑素瘤)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、经典的霍奇金淋巴瘤、晚期尿路上皮癌、高度微卫星不稳定性的癌症、或胃或食管胃结合部腺癌。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是子宫癌、胃癌、食道癌、肝癌、脑癌或肉瘤。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是(1)难治性经典霍奇金淋巴瘤，(2)复发性和转移性头颈部鳞状细胞癌，(3)不可切除的或转移性黑素瘤，(4)局部或晚期或转移性尿路上皮癌，(5)具有表达程序性死亡配体1(“PD-L1”)的肿瘤的，复发性局部晚期或转移性胃或胃食管腺癌(例如，CPS>1的肿瘤)，(6)在先期治疗之后进展的、没有满意的可选治疗选择的、不可切除性或转移性、高度微卫星不稳定性的癌症或错配修复缺陷的实体肿瘤，或在用氟尿嘧啶、奥沙利铂和伊立替康治疗之后进展的结肠直肠癌症，或(7)具有表达PD-L1的肿瘤的转移性非小细胞肺癌(例如，TPS>1％或50％的肿瘤)。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是黑素瘤、非小细胞肺癌、头颈癌(HNSCC头颈部鳞状细胞癌)、尿路上皮癌症、三阴性乳腺癌、胃癌、经典的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、间皮瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、食道癌、鼻咽癌、肛门癌、胆道癌、结肠直肠癌症、ER+/HER2-乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、唾液癌、子宫内膜癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、高度微卫星不稳定性的(MSI-H)或错配修复缺陷的癌症(组织无关)或高肿瘤突变负担的肿瘤(组织无关)。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是具有不良预后和/或具有对常规疗法如化疗和放疗的不良响应的癌症。在另一个具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是恶性黑色素瘤、恶性的胶质瘤、肾细胞癌、胰腺的腺癌、恶性的侧腹膜间皮瘤、肺部腺癌、肺部小细胞癌、肺部鳞状细胞癌、间变性甲状腺癌和头颈部鳞状细胞癌。在另一个具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是下文的章节6中描述的癌症类型。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是难治性霍奇金淋巴瘤、复现的或转移性头颈部鳞状细胞癌、不可切除的或转移性黑素瘤、或转移性非小细胞肺癌。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是PD-L1阳性的。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术例如免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果肿瘤比例评分(TPS)、癌症的活检物中PD-L1染色细胞的百分比是至少1％、2％、3％、5％、7％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％，所述癌症是PD-L1阳性的。在另一个具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果TPS，癌症的活检物中PD-L1的细胞染色的百分比至少1％或1％到100％，所述癌症是PD-L1阳性的。在另一个具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果TPS，癌症的活检物中PD-L1的细胞染色的百分比是1％到100％、25％到50％、25％到100％、50％到75％、50％到100％、或75％到100％，所述癌症是PD-L1阳性的。在具体的实施方式中，使用TPS评分确定为PD-L1阳性的所述癌症是非小细胞肺癌。
在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术例如免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果联合阳性评分(CPS)、癌症的活检物中PD-L1染色细胞的百分比是至少1％、2％、3％、5％、7％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％，所述癌症是PD-L1阳性的。在另一个具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(AgilentTechnologies Inc.)评估的，如果CPS，癌症的活检物中PD-L1的细胞染色的百分比至少1％或1％到100％，所述癌症是PD-L1阳性的。在另一个具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(AgilentTechnologies Inc.)评估的，如果CPS，癌症的活检物中PD-L1的细胞染色的百分比是1％到100％、25％到50％、25％到100％、50％到75％、50％到100％、或75％到100％，所述癌症是PD-L1阳性的。在具体的实施方式中，使用CPS评分确定为PD-L1阳性的所述癌症是胃癌(例如，复现的局部晚期的转移性胃或胃食管接点腺癌)。
在某些特定的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是PD-L1阴性的。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，免疫组织化学或PD-L1 IHC 22C3pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果TPS，癌症的活检物中PD-L1的细胞染色的百分比小于1％，所述肿瘤或恶性肿瘤是PD-L1阴性的。在具体的实施方式中，使用TPS评分确定为PD-L1阴性的所述癌症是非小细胞肺癌。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症具有低水平的PD-L1表达。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent Technologies Inc.)评估的，如果TPS，所述癌症的活检物中PD-L1细胞染色的百分比在1％到50％之间、或1％到40％之间、1％到30％之间、1％到25％之间、1％到15％之间、或1％到10％之间，所述癌症具有低水平的PD-L1表达。在具体的实施方式中，通过本领域已知的或本文描述的技术，例如，或PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(Agilent TechnologiesInc.)评估的，如果TPS，所述癌症的活检物中PD-L1细胞染色的百分比小于50％但是1％或更大，所述癌症具有低水平的PD-L1表达。
在具体的实施方式中，使用ELISA来确定癌症的活检物是否是PD-L1阴性、PD-L1阳性、和/或具有低水平的PD-L1表达。在具体的实施方式中，使用免疫组织化学来确定癌症的活检物是否是PD-L1阴性、PD-L1阳性、和/或具有低水平的PD-L1表达。在具体的实施方式中，根据美国批准的用于测定PD-L1水平的一种或更多种分析，肿瘤或恶性肿瘤(或其活检物)被确定为是PD-L1阳性、PD-L1阴性和/或具有低水平的PD-L1表达。美国食品药品管理局批准的用于测定PD-L1水平的分析的非限制性实例包括PD-L1 IHC 22C3 pharmDx(由DakoNorth America，Inc.制造)和Ventana PD-L1(SP142)分析(由Ventana Medical Systems，Inc.制造)。在另一个具体的实施方式中，肿瘤或恶性肿瘤(或其活检物)中PD-L1的水平根据临床实验室改进修正案验证的实验室中进行的实验室开发的测试来测定。在另一个具体的实施方式中，肿瘤或恶性肿瘤(或其活检物)中的PD-L1水平使用PCR测定。在另一个具体的实施方式中，肿瘤或恶性肿瘤(或其活检物)中的PD-L1水平通过使用来自NanoStringTechnologies的试剂盒评估某些肿瘤相关基因的基因表达谱来确定。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症对于PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症对于PD-1阻断抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症对于PD-L1阻断抗体(例如，阿维鲁单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是PD-L1阴性的，并且对于PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是PD-L1阴性的，并且对于PD-1阻断抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是PD-L1阴性的，并且对于PD-L1阻断抗体(例如，阿维鲁单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症具有低水平的PD-L1表达，并且对于PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症具有低水平的PD-L1表达，并且对于PD-1阻断抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症具有低水平的PD-L1表达，并且对于PD-L1阻断抗体(例如，阿维鲁单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是复发的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是复发的，并且对于PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性的或未响应的。在另一个具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是复发的，并且对于PD-1阻断抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是复发的，并且对于PD-L1阻断抗体(例如，阿维鲁单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是PD-L1阴性的和复发的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症具有低水平的PD-L1表达并且是复发的。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是复发的、PD-L1阴性的，并且对于PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是复发的、PD-L1阴性的，并且对于PD-1阻断抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是复发的、PD-L1阴性的，并且对于PD-L1阻断抗体(例如，阿维鲁单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症具有低水平的PD-L1表达并且是复发的，并且对于PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症具有低水平的PD-L1表达并且是复发的，并且对于PD-1阻断抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症具有低水平的PD-L1表达并且是复发的，并且对于PD-L1阻断抗体(例如，阿维鲁单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症对于PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是对于PD-1阻断抗体(例如，纳武单抗或派姆单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症对于PD-L1阻断抗体(例如，阿维鲁单抗)的单一治疗是难治性的或未响应的。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是转移性癌症。在具体的实施方式中，所述癌症包含真皮的、皮下的或结节的转移。在具体的实施方式中，所述癌症包含腹膜或侧腹膜的转移。在具体的实施方式中，所述癌症包含内脏器官转移，例如，肝脏、肾脏、脾脏或肺部转移。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是复发的/难治性实体肿瘤类型，例如，黑素瘤、肉瘤、头颈部鳞状细胞癌(SSCHN)、具有真皮转移的乳腺癌，以及其他具有可接近的真皮/SC/结节转移的恶性肿瘤。
在具体的实施方式中，根据本文描述的方法治疗的癌症是不可切除的癌症。本领域技术人员已知的任何方法可以用于确定癌症是否是不可切除的。
5.7.6额外的疗法
可以与本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、或全细胞疫苗组合用于治疗癌症的额外的疗法包括但不限于，小分子、合成药物、肽(包括环状肽)、多肽、蛋白质、核酸(例如，DNA和RNA核苷酸，包括但不限于反义核苷酸序列、三螺旋体、RNAi以及编码生物学活性蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列)、抗体、合成的或天然的无机分子、模拟药剂以及合成的或天然的有机分子。在具体的实施方式中，所述额外的疗法是化学治疗剂。
在某些实施方式中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、或全细胞疫苗与放射疗法组合使用来破坏癌细胞，所述放射治疗包括使用X-射线、γ射线、和其他辐射源。在具体的实施方式中，所述放射疗法作为外粒子束辐射或远距疗法施用，其中所述辐射是从远程源定向施用。在其他实施方式中，所述放射疗法作为内部疗法或近距疗法施用，其中放射源置于身体内部靠近癌细胞和/或肿瘤块。
在某些实施方式中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、或全细胞癌症疫苗与过继性T细胞疗法组合使用。在具体的实施方式中，所述过继性T细胞疗法中使用的T细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞，其分离自对象并扩增了为此用途的特定T细胞或克隆。在某些实施方式中，所述过继性T细胞疗法中使用的T细胞是在患者接受癌症疫苗之后取自患者的血液并在使用之前体外扩增的T细胞。在另一个具体的实施方式中，所述过继性T细胞疗法中使用的T细胞是已经受影响以强力识别和激发肿瘤的T细胞。在另一个具体的实施方式中，所述过继性T细胞疗法中使用的T细胞已经被遗传修饰以表达肿瘤抗原特异性T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)。在具体的实施方式中，使用的所述过继性T细胞疗法类似于国际公开No.WO 2014/158811和美国专利申请公开No.2016/0015760的章节6.2中描述的，其每一个通过引用以其整体合并在本文中。
在某些实施方式中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、或全细胞癌症疫苗与细胞因子组合使用。在具体的实施方式中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、或全细胞癌症疫苗与干扰素(例如，IFN-γ)组合使用。
当前可用的癌症疗法和它们的剂量、施用途径和建议的用法是本领域已知的，已经在这样的文献如Physician's Desk Reference(第67版，2013)中描述。
可以与本文描述的NDV或其组合物组合地使用的抗癌药剂的具体实例包括:激素药剂(例如，芳香酶抑制物、选择性雌激素受体调节物(SERM)、和雌激素受体拮抗剂)、化学治疗剂(例如，微管解散阻断剂、抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂和DNA交联剂或损伤剂)、抗血管生成剂(例如，VEGF拮抗剂、受体拮抗剂、整联蛋白拮抗剂、血管靶向剂(VTA)/血管破坏剂(VDA))、放疗和传统手术。
可以与本文描述的NDV或其组合物组合使用的激素药剂的非限制性实例包括芳香酶抑制物、SERM和雌激素受体拮抗剂。芳香酶抑制物的激素药剂可以是甾族的或非甾族的。非甾族激素药剂的非限制性实例包括来曲唑、阿那曲唑、氨鲁米特、法倔唑和伏氯唑。甾族的激素药剂包括阿诺新(依西美坦)、福美坦和睾丸内脂。SERM的激素药剂的非限制性实例包括他莫昔芬(品牌/市售为
Figure BDA0002363284960001271
)、阿非昔芬、阿佐昔芬、巴多昔芬、氯米芬、芙婷宝(femarelle)、拉索昔芬、奥美昔芬、雷洛昔芬和托瑞米芬。雌激素受体拮抗剂的激素药剂的非限制性实例包括氟维司群。其他激素药剂包括但不限于阿比特龙和洛那立生。
可以与本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、或全细胞疫苗组合使用的化学治疗剂的非限制性实例包括微管解散阻断剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制物和DNA交联剂或损伤剂。微管解散阻断剂阻断剂的化学治疗剂包括但不限于紫杉烷类(例如，紫杉醇(品牌/市售为
Figure BDA0002363284960001272
)、多西紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、拉洛他赛，沃塔紫杉醇和替司他赛)；埃博霉素(例如，伊沙匹隆)；长春花生物碱和(例如，长春瑞滨、长春碱、长春地辛和长春新碱(品牌/市售为
Figure BDA0002363284960001281
))。
抗代谢物的化学治疗剂包括但不限于，叶酸盐抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞)；嘌呤抗代谢物(例如，克拉屈滨、氯法拉滨、氟达拉滨、巯嘌呤、喷司他丁、硫鸟嘌呤)；嘧啶抗代谢物(例如，5-氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨
Figure BDA0002363284960001282
阿糖胞苷、地西他滨、氟尿苷、替加氟)；和脱氧核糖核苷酸抗代谢物(例如，羟基脲)。
拓扑异构酶抑制物的化学治疗剂包括但不限于I类(camptotheca)拓扑异构酶抑制物(例如，托泊替康(品牌/市售为
Figure BDA0002363284960001283
)、伊立替康、鲁比替康和贝洛替康)；II类(鬼臼根)拓扑异构酶抑制物(例如，依托泊苷或VP-16和替尼泊苷)；蒽环类(例如，多柔比星、表柔比星、Doxil、阿柔比星、氨柔比星、道诺霉素、伊达比星、吡柔比星、戊柔比星和佐柔比星)；以及蒽醌类(例如，米托蒽醌和匹杉琼)。
DNA交联剂(或DNA损伤剂)的化学治疗剂包括但不限于，烷化剂(例如，环磷酰胺、甲二氯二乙胺、异环磷酰胺(商标/市售为
Figure BDA0002363284960001284
)、曲磷胺、苯丁酸氮芥、米尔法兰、泼尼莫司汀、苯达莫司汀、乌拉莫司汀、雌莫司汀、卡莫司汀(商标/市售为
Figure BDA0002363284960001285
)、洛莫司汀、司莫司汀、福莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、链脲霉素、白消安、甘露舒凡、曲奥舒凡、卡巴醌、N,N'N'-三乙撑硫代磷酰胺、三亚胺醌、三乙撑蜜胺)；类烷基化剂(例如，卡铂(商标/市售为
Figure BDA0002363284960001286
)、顺铂、奥沙利铂、奈达铂、四硝酸三铂、沙铂、吡铂)；非经典DNA交联剂(例如，丙卡巴肼、达卡巴嗪、替莫唑胺(品牌/市售为
Figure BDA0002363284960001287
)、六甲蜜胺、二溴甘露醇)；和嵌入剂(例如，放线菌素、博莱霉素、丝裂霉素和普卡霉素)。
5.7.6.1免疫调节物
在具体的实施方式中，本文描述的NDV(例如，嵌合NDV)或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、或全细胞疫苗与一种或更多种以下的组合地施用给对象:本领域技术人员已知的、免疫细胞(例如，T淋巴细胞、NK细胞或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞))的共刺激信号的任何激动剂和/或免疫细胞(例如，T淋巴细胞、NK细胞或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞))的抑制信号的任何拮抗剂。
在具体的实施方式中，所述激动剂和/或拮抗剂是人类免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或人类免疫细胞的抑制信号的拮抗剂。
在某些实施方式中，所述共刺激信号的激动剂是免疫细胞例如T淋巴细胞(例如，CD4+或CD8+T淋巴细胞)、NK细胞和/或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)上存在的共刺激分子(例如，共刺激受体)的激动剂。共刺激分子的具体实例包括糖皮质素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)、可诱导的T细胞共刺激物(ICOS或CD278)、OX40(CD134)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、CD40、淋巴细胞毒素alpha(LT alpha)、LIGHT(淋巴细胞毒素样、展现可诱导的表达，并与单纯性疱疹病毒糖蛋白D竞争HVEM，T淋巴细胞表达的受体)、CD226、细胞毒性和调节性T细胞分子(CRTAM)、死亡受体3(DIG)、淋巴细胞毒素-beta受体(LTBR)、跨膜激活子和CAML交互子(TACI)、B细胞活化因子受体(BAFFR)和B细胞成熟蛋白(BCMA)。在具体的实施方式中，所述激动剂是人类免疫细胞共刺激受体的激动剂。在某些实施方式中，所述共刺激受体的激动剂不是ICOS的激动剂。
在具体的实施方式中，共刺激受体的激动剂是特异性结合所述共刺激受体的抗体或其抗原结合片段。共刺激受体的具体实例包括GITR、ICOS、OX40、CD27、CD28、4-1BB、CD40、LTalpha、LIGHT、CD226、CRTAM、DR3、LTBR、TACI、BAFFR和BCMA。在某些具体的实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在其他具体实施方式中，所述抗体是sc-Fv。在其他具体实施方式中，所述抗体是骆驼化抗体。在具体的实施方式中，所述抗体是结合免疫细胞上的两个受体的双特异性抗体。在其他实施方式中，所述双特异性抗体结合免疫细胞上的受体和癌细胞上的另一个受体。在具体的实施方式中，所述抗体是人类抗体或人源化抗体。在某些实施方式中，所述抗体被表达为与NDV F蛋白或其片段、或NDV HN蛋白或其片段的嵌合蛋白。关于产生嵌合F或嵌合NH蛋白的说明，参见，例如，美国专利申请公开No.2012/0122185，通过引用将其合并在本文中。
在另一个实施方式中，所述共刺激受体的激动剂是所述共刺激受体的配体。在某些实施方式中，所述配体是天然配体的片段。天然配体的具体实例包括ICOSL、B7RP1、CD137L、OX40L、CD70、疱疹病毒进入介体(HVEM)、CD80和CD86。编码天然配体的核苷酸序列以及天然配体的氨基酸序列是本领域已知的。例如，B7RP1(或者称为ICOSL；GenBank人类:NM_015259.4、np_056074.1鼠类:NM_015790.3、NP_056605.1)、CD137L(GenBank人类:NM_003811.3、NP_003802.1，鼠类:NM_009404.3、NP_033430.1)，OX40L(GenBank人类:NM_003326.3、NP_003317.1、鼠类:NM_009452.2、NP_033478.1)、CD70(GenBank人类:NM_001252.3、NP_001243.1、鼠类:NM_011617.2、AAD00274.1)、CD80(GenBank人类:NM_005191.3、NP_005182.1、鼠类:NM_009855.2、NP_033985.3)、和CD86(GenBank人类:NM_005191.3、CAG46642.1、鼠类:NM_019388.3、NP_062261.3)的核苷酸和氨基酸序列可以在GenBank中找到。在其他实施方式中，所述配体是天然配体的衍生物。在某些实施方式中，所述配体是融合蛋白，其包含特异性结合所述共刺激受体的所述天然配体或所述天然配体的衍生物的至少一部分以及异源氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含特异性结合所述共刺激受体的所述天然配体或所述天然配体的衍生物的至少一部分以及免疫球蛋白的Fc部分或其片段。配体融合蛋白的实例有与免疫球蛋白的Fc部分融合的4-1BB配体(由Meseck M等，J Immunother.2011 34:175-82描述)。
在某些实施方式中，所述拮抗剂是免疫细胞例如T淋巴细胞(例如，CD4+或CD8+T淋巴细胞)、NK细胞和/或抗原呈递细胞(例如，树突细胞或巨噬细胞)上存在的抑制分子(例如，抑制受体)的拮抗剂。抑制性分子的具体实例包括细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4或CD52)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1或CD279)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、T细胞膜蛋白3(TIM3)、CD 160、腺苷A2a受体(A2aR)、具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)和CD160。在具体的实施方式中，所述拮抗剂是人类免疫细胞抑制性受体的拮抗剂。在具体的实施方式中，所述抑制性分子的拮抗剂是PD-1或其配体的拮抗剂(例如，如上文章节5.5中描述的)。
在另一个实施方式中，所述抑制性受体的拮抗剂是抗体(或抗原结合片段)或可溶受体，其特异性结合所述抑制性受体的天然配体并阻断所述天然配体结合所述抑制性受体和转导抑制信号。抑制性受体的天然配体的具体实例包括PDL-1、PDL-2、B7-H3、B7-H4、HVEM、Gal9、和腺苷。结合天然配体的抑制性受体的具体实例包括CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TEVI3和A2aR。
在具体的实施方式中，所述抑制性受体的拮抗剂是可溶受体，其特异性结合所述抑制性受体的天然配体并阻断所述天然配体结合所述抑制性受体和转导抑制信号。在某些实施方式中，所述可溶受体是天然抑制性受体的片段或天然抑制性受体的衍生物的片段，其特异性结合天然配体(例如，天然抑制性受体或抑制性受体衍生物的细胞外结构域)。在某些实施方式中，所述可溶受体是融合蛋白，其包含所述天然抑制性受体或所述天然抑制性受体的衍生物的至少一部分(例如，所述天然抑制性受体或所述天然抑制性受体的衍生物的细胞外结构域)和异源氨基酸序列。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包含所述天然抑制性受体或所述天然抑制性受体的衍生物的至少一部分以及免疫球蛋白的Fc部分或其片段。可溶受体融合蛋白的实例是LAG3-Ig融合蛋白(由Huard B等，Eur J Immunol.1995 25:2718-21描述)。
在具体的实施方式中，所述抑制性受体的拮抗剂是抗体(或抗原结合片段)或可溶受体，其特异性结合所述抑制性受体的天然配体并阻断所述天然配体结合所述抑制性受体和转导抑制信号。在某些具体的实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在其他具体实施方式中，所述抗体是scFv。在特定的实施方式中，所述抗体是人类的或人源化抗体。抑制性配体的抗体的具体实例是抗PD-L1抗体(Iwai Y，等PNAS 2002；99:12293-12297)。
在另一个实施方式中，所述抑制性受体的拮抗剂是抗体(或抗原结合片段)或配体，其结合所述抑制性受体、但不转导抑制信号。抑制性受体的具体实例包括CTLA-4、PD-1、BTLA、KIR、LAG3、TIM3和A2aR。在某些具体的实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在其他具体实施方式中，所述抗体是scFv。在特定的实施方式中，所述抗体是人类的或人源化抗体。抑制性受体的抗体的具体实例是抗CTLA-4抗体(Leach DR，等Science 1996；271:1734-1736)。抑制性受体的抗体的另一个实例是抗PD-1抗体(Topalian SL，NEJM 2012；28:3167-75)。
在某些实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是CTLA-4的拮抗剂，例如，伊匹单抗(Ipilimumab)或曲美母单抗(tremelimumab)。在某些实施方式中，所述抑制性受体的拮抗剂是PD-1的拮抗剂，例如，MDX-1106(BMS-936558)、MK3475、CT-011、AMP-224或MDX-1105。在某些实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是LAG3的拮抗剂，例如，IMP321。在某些实施方式中，抑制性受体的拮抗剂是结合B7-H3的抗体(例如，单克隆抗体或其抗原结合片段，或scFv)，例如MGA271。在具体的实施方式中，共刺激受体的激动剂是抗CD28 scvFv、ICOSL、CD40L、OX40L、CD137L、GITRL和/或CD70。
在某些实施方式中，免疫细胞的共刺激信号的激动剂诱导(例如，选择性地诱导)由共刺激受体与它的配体的结合所诱导的一个或更多个所述信号转导途径。在具体的实施方式中，相对于不存在所述激动剂的情况下由所述共刺激受体与一个或更多个它的配体的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，所述共刺激受体的激动剂诱导由所述共刺激受体与一种或更多种它的配体的结合诱导的一个或更多个所述信号转导途径达到至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％，或在25％到50％之间、25％到75％之间、50％到75％之间、50％到95％之间、75％到95％之间、75％到100％之间的范围内。在具体的实施方式中，共刺激受体的激动剂:(i)相对于不存在所述激动剂的情况下由所述共刺激受体与特定配体的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，诱导由所述共刺激受体与特定配体的结合诱导的一个或更多个所述信号转导途径达到至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％，或在25％到50％之间、25％到75％之间、50％到75％之间、50％到95％之间、75％到95％之间、75％到100％之间的范围内；和(ii)不诱导，或相对于不存在所述激动剂的情况下通过所述共刺激受体与一个或更多个其他配体的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，诱导由所述共刺激受体与一个或更多个其他配体的结合所诱导的一个或更多个所述信号转导途径小于20％、15％、10％、5％或2％，或在2％到5％之间、2％到10％之间、5％到10％之间、5％到15％之间、5％到20％之间、10％到15％之间、或15％到20％之间的范围内。
在某些实施方式中，免疫细胞的共刺激信号的激动剂活化或增强(例如，选择性地活化或增强)由共刺激受体与它的配体的结合所诱导的一个或更多个所述信号转导途径。在具体的实施方式中，相对于不存在所述激动剂的情况下由所述共刺激受体与一个或更多个它的配体的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，所述共刺激受体的激动剂活化或增强由所述共刺激受体与一种或更多种它的配体的结合诱导的一个或更多个所述信号转导途径达到至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％，或在25％到50％之间、25％到75％之间、50％到75％之间、50％到95％之间、75％到95％之间、75％到100％之间的范围内。在具体的实施方式中，共刺激受体的激动剂:(i)相对于不存在所述激动剂的情况下由所述共刺激受体与特定配体的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，共刺激信号的激动剂活化或增强由所述共刺激受体与特定配体的结合诱导的一个或更多个所述信号转导途径达到至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％，或在25％到50％之间、25％到75％之间、50％到75％之间、50％到95％之间、75％到95％之间、75％到100％之间的范围内；和(ii)不活化或增强，或相对于不存在所述激动剂的情况下由所述共刺激受体与一个或更多个其他配体的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，活化或增强由所述共刺激受体与一个或更多个其他配体的结合所诱导的一个或更多个所述信号转导途径小于20％、15％、10％、5％或2％，或在2％到5％之间、2％到10％之间、5％到10％之间、5％到15％之间、5％到20％之间、10％到15％之间、或15％到20％之间的范围内。
在某些实施方式中，免疫细胞的抑制信号的拮抗剂(例如，选择性地)抑制或降低由抑制性受体与它的配体的结合所诱导的一个或更多个所述信号转导途径。在具体的实施方式中，相对于不存在所述拮抗剂的情况下由所述抑制性受体与一个或更多个它的配体的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，所述抑制性受体的拮抗剂抑制或降低由所述抑制性受体与一种或更多种它的配体的结合所诱导的一个或更多个所述信号转导途径达到至少25％、30％、、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％，或在25％到50％之间、25％到75％之间、50％到75％之间、50％到95％之间、75％到95％之间、75％到100％之间的范围内。在具体的实施方式中，抑制性受体的拮抗剂:(i)相对于不存在所述拮抗剂的情况下由所述抑制性受体与特定配体的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，抑制或降低由所述抑制性受体与特定配体的结合所诱导的一个或更多个所述信号转导途径达到至少25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或99％，或在25％到50％之间、25％到75％之间、50％到75％之间、50％到95％之间、75％到95％之间、75％到100％之间的范围内；和(ii)不抑制或降低，或相对于不存在所述拮抗剂的情况下由抑制性受体与一个或更多个其他配体的结合所诱导的一个或更多个信号转导途径，抑制或降低由抑制性受体与一个或更多个其他配体的结合所诱导的一个或更多个所述信号转导途径小于20％、15％、10％、5％或2％，或在2％到5％之间、2％到10％之间、5％到10％之间、5％到15％之间、5％到20％之间、10％到15％之间、或15％到20％之间的范围内。
在具体的实施方式中，免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂诱导、活化、和/或增强一种或更多种免疫活性、功能或反应。一种或更多种免疫活性、功能或反应可以是例如抗体反应(体液反应)或细胞免疫反应的形式，例如，细胞因子分泌(例如，干扰素-γ)、辅助细胞活性或细胞的细胞毒性。在一个实施方式中，免疫细胞上活化标志物(例如，CD44、颗粒酶或Ki-67)的表达、免疫细胞上共刺激受体(例如，ICOS、CD28、OX40或CD27)的表达、共刺激受体的配体(例如，B7HRP1、CD80、CD86、OX40L、或CD70)的表达、细胞因子分泌、免疫细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞和/或NK细胞)向肿瘤的浸润、抗体产生、效应物功能、T细胞活化、T细胞分泌、T细胞增值、B细胞分泌、B细胞增值、和/或NK细胞增值，在与免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂接触之后被诱导、活化和/或增强。在另一个实施方式中，骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)肿瘤浸润和增殖、Treg肿瘤浸润、活化和增殖，外周血MDSC和Treg计数在与免疫细胞的共刺激信号的激动剂和/或免疫细胞的抑制信号的拮抗剂接触之后被抑制。
5.8生物学分析
在某些实施方式中，下文的章节6中描述的分析被用于表征/评估，例如，嵌合NDV的生产，嵌合NDV表达的IL-12的表达、功能或这两者，或本文描述的方法的效力。
5.8.1体外病毒分析
病毒分析包括使用本领域公知的方法在体外间接地测量培养的细胞中的病毒复制(例如通过蚀斑形成所测定的)或病毒蛋白质生产(例如通过Western印迹分析所测定的)或病毒RNA(例如通过RT-PCR或Northern印迹分析所测定的)的那些。
本文描述的NDV的生长可以通过本领域已知的或本文描述的任何方法来评估(例如，在细胞培养物中(例如，鸡胚肾细胞的培养物，或鸡胚胎成纤维细胞(CEF)的培养物)(参见，例如，章节6)。通过阿静本文描述的NDV的连续稀释物接种到细胞培养物(例如，CEF、MDCK、EFK-2细胞、Vero细胞、原代人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)、H292人上皮细胞系或HeLa细胞)、鸡胚、或活的动物(例如，禽类)中，可以测定病毒滴度。在孵育病毒指定的时间之后，使用标准方法分离病毒。病毒滴度的物理定量可以使用应用于病毒上清液的PCR(Quinn&Trevor，1997；Morgan等，1990)、血细胞凝集分析、组织培养传染剂量(TCID50)或蛋传染剂量(EID50)来进行。在下文的章节6中描述了评估病毒滴度的示范性方法。
编码异源肽或蛋白质(例如，细胞因子、突变F蛋白、突变V蛋白)的核苷酸序列或miRNA目标位点向本文描述的嵌合NDV的基因组中的掺入可以通过本领域已知的或本文描述的任何方法来评估(例如，在细胞培养物中、动物模型、或有胚蛋的病毒培养物中)。例如，使用本领域公知的方法，来自有胚蛋尿囊液的细胞培养物的病毒颗粒可以通过蔗糖夹层离心进行纯化，随后通过Western印迹分析融合蛋白表达。
基于免疫荧光的方法也可以用于检测病毒和评估病毒生长。这样的方法是本领域技术人员公知的，例如，荧光显微镜术和流式细胞术(参见下文的章节6)。流式细胞术的方法是可获得的，包括荧光活化的细胞分选(FACS)(参见，例如，Owens，等(1994)Flow CytometryPrinciples for Clinical Laboratory Practice，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，2nd ed.；Wiley-Liss，Hoboken，NJ；Shapiro(2003)PracticalFlow Cytometry，John Wiley and Sons，Hoboken，NJ)。用作诊断试剂的适合于修饰核酸的荧光试剂，包括核酸引物和探针、多肽和抗体是可获得的(Molecular Probesy(2003)Catalogue，Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue，St.Louis，MO)。
描述了免疫系统的组织学的标准方法(参见，例如，Muller-Harmelink(ed.)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology，Springer Verlag，New York，NY；Hiatt，等(2000)Color Atlas of Histology，Lippincott，Williams，and Wilkins，Phila，PA；Louis，等(2002)Basic Histology:Text and Atlas，McGraw-Hill，New York，NY)。
5.8.2IFN分析
本文描述的NDV的IFN诱导和释放可以使用本领域技术人员已知的或本文描述的技术来确定(参见，例如，章节6)。来如在感染本文描述的NDV之后细胞中诱导的IFN的数量可以使用免疫分析(例如，ELISA或Westernblot分析)进行测定，以测量IFN表达或测量由IFN诱导的蛋白质的表达。做为选择，诱导的IFN的数量可以通过本领域技术人员已知的分析例如Northern印迹和定量RT-PCR在RNA水平测量。在具体的实施方式中，释放的IFN的数量可以使用ELISPOT分析测量。(参见，例如，下文的章节6中描述的方法)。进一步地，细胞因子和/或干扰素刺激的基因的诱导和释放可以通过例如免疫分析或ELISPOT分析在蛋白质水平上测定，和/或定量RT-PCR或Northern印迹在RNA水平上测定。关于测量细胞因子和/或干扰素刺激的基因诱导和释放的分析，参见下文的章节6。
5.8.3活化标志物分析
评估免疫细胞的活化标志物、共刺激分子、配体、或抑制性分子表达的技术是本领域技术人员已知的。例如，免疫细胞(例如，T淋巴细胞或NK细胞)的活化标志物、共刺激分子、配体、或抑制性分子的表达可以通过流式细胞术进行评估。在具体的实施方式中，使用下文的章节6中描述的技术来评估免疫细胞的活化标志物、共刺激分子、配体、或抑制性分子的表达。
5.8.4免疫细胞浸润分析
评估免疫细胞浸润的技术是本领域技术人员已知的。在具体的实施方式中，使用下文的章节6中描述的技术来评估免疫细胞浸润。
5.8.5毒性研究
在某些实施方式中，测试本文描述的NDV或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法在哺乳动物、优选人类细胞系中的细胞毒性(参见，例如，下文的章节6中描述的细胞毒性分析)。在某些实施方式中，在一种或更多种以下细胞系的非限制性实例中评估细胞毒性:U937，人类单核细胞细胞系；原代外周血单核细胞(PBMC)；Huh7，人类肝胚细胞瘤细胞系；HL60细胞、HT1080、HEK 293T和293H、MLPC细胞、人类胚肾细胞系；人类黑素瘤细胞系，例如，SkMel2、SkMel-119和SkMel-197；THP-1，单核细胞；HeLa细胞系；和成神经细胞瘤细胞系，例如，MC-IXC、SK-N-MC、SK-N-MC、SK-N-DZ、SH-SY5Y和BE(2)-C。在某些实施方式中，在各种癌细胞中评估细胞毒性。在某些实施方式中，使用ToxLite分析来评估细胞毒性。
本领域公知的许多分析可以用于评估本文描述的NDV或其组合物感染之后、或用本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗或本文描述的组合疗法治疗之后细胞或细胞系的生存力，因而确定所述NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或组合疗法的细胞毒性。例如，通过测量溴脱氧尿苷(BrdU)掺入、(3H)胸腺嘧啶核苷掺入，通过直接细胞计数，或通过检测已知基因如原癌基因(例如，fos，myc)或细胞周期标志物(Rb、cdc2、周期蛋白A、D1、D2、D3、E等)在转录、翻译或活性方面的改变，可以分析细胞增殖。这样的蛋白质和mRNA的水平和活性可以通过本领域公知的任何方法来测定。例如，蛋白质可以通过已知的免疫诊断方法例如ELISA、Western印迹或免疫沉淀、利用抗体包括商业上可获得的抗体来测定。mRNA可以使用本领域公知的和常规的方法来定量，例如，使用northern分析、RNase保护、聚合酶链式反应连同逆转录。细胞生存力可以通过使用锥石蓝染色或其他本领域已知的细胞死亡或生存力标记物来评定。在具体的实施方式中，测量细胞ATP的水平来确定细胞生存力。在优选的实施方式中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或组合疗法杀死癌细胞，但不杀死健康的(即，非癌的)细胞。在一个实施方式中，本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或组合疗法优先地杀死癌细胞，但不杀死健康的(即，非癌的)细胞。
在具体的实施方式中，使用本领域标准的分析，例如测量细胞内ATP水平的CellTiter-Glo分析试剂盒(Promega)，在三天和七天的时间段内测量细胞生存力。细胞的ATP的降低是细胞毒性效果的指示。在另一个具体的实施方式中，细胞生存力可以在中性红摄取分析中测量。在其他实施方式中，形态变化的视觉观察可以包括膨大、粒度、具有粗糙边缘的细胞、薄膜外观、圆化、从反应孔的表面脱离、或其他改变。
本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或组合疗法可以在动物模型中测试体内毒性(参见，例如，下文的章节6中描述的动物模型)。例如，用于测试化合物对癌症的作用的本文描述的动物模型和/或本领域已知的其他动物模型也可以用于测定本文描述的NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗或组合疗法的体内毒性。例如，向动物施用一定范围的pfu的本文描述的NDV(例如，下文的章节5.2中描述的嵌合NDV)。随后，随着时间监测动物的致死率、体重减轻或体重增加不足，和/或可指示组织损伤的血清标志物水平(例如，作为一般组织损伤的指标的肌酸磷酸激酶水平，作为可能的肝损伤的指标的谷草转氨酶或丙酮酸转氨酶水平)。这些体内分析也可以适合于测试除了剂量之外的各种施用方式和/或方案的毒性。
本文描述的NDV或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法的毒性和/或效力可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学过程来测定，例如，测定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性效应和治疗效应之间的剂量比是治疗指数，它可以表示为比值LD50/ED50。展现大的治疗指数的疗法是优选的。当使用展现了毒性副作用的疗法时，应当小心地设计递送系统，所述递送系统将这些疗法靶向受影响组织以最小化对非癌细胞的潜在损害，从而降低副作用。
从细胞培养分析和动物研究获得的数据可被用于配制用于对象的所述疗法的剂量范围。这些试剂的剂量优选地处在包括很小或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。取决于采用的剂型和使用的给药途径，剂量可以在这个范围内变动。对于本文描述的任何疗法，可以从细胞培养物分析初步估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量来达到包括在细胞培养中测定的IC50的循环血浆浓度范围(即，达到症状的半最大抑制的所述嵌合NDV的浓度)。这种信息可用于更精确地测定对象中有用的剂量。可以通过例如高效液相层析法测定血浆中的水平。
5.8.6抗癌研究
本文描述的NDV或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法可以使用癌症的动物模型测试生物学活性(参见，例如，章节6)。这种动物模型系统包括但不限于，大鼠、小鼠、鸡、牛、猴、猪、狗、兔，等等。在具体的实施方式中，本文描述的NDV或组合疗法的抗癌活性在小鼠模型系统中测试。这样的模型系统是广泛使用和本领域技术人员公知的，例如，SCID小鼠模型或转基因小鼠。
通过向动物模型施用所述NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗、或组合疗法，并验证所述NDV或其组合物、肿瘤裂解物疫苗、全细胞疫苗、或组合疗法有效降低所述动物模型中的癌症的严重度、降低癌症的症状、降低癌症转移和/或降低肿瘤的大小，可以确定本文描述的NDV或其组合物、本文描述的肿瘤裂解物疫苗、本文描述的全细胞疫苗、或本文描述的组合疗法的抗癌活性(参见，例如，下文的章节6)。癌症动物模型的实例一般包括但不限于，对PD-1或其配体的拮抗剂的治疗为难治性的或未响应的动物模型，例如，B16F10小鼠模型(例如，章节6中描述的)，以及陪伴动物的自发性发生的肿瘤(参见，例如Vail&MacEwen，2000，Cancer Invest 18(8):781-92)。肺癌动物模型的实例包括但不限于，由Zhang&Roth(1994，In-vivo 8(5):755-69)描述的肺癌动物模型和具有被破坏的p53功能的转基因小鼠(参见，例如，Morris等，1998，J La State Med Soc 150(4):179-85)。乳腺癌动物模型的实例包括但不限于过量表达周期蛋白D1的转基因小鼠(参见，例如，Hosokawa等，2001，Transgenic Res 10(5):471-8)。结肠癌动物模型的实例包括但不限于TCR b和p53双敲除的小鼠(参见，例如，Kado等，2001，Cancer Res.61(6):2395-8)。胰腺癌动物模型的实例包括但不限于Panc02鼠胰腺腺癌的转移模型(参见，例如，Wang等，2001，Int.J.Pancreatol.29(1):37-46)和产生皮下胰腺肿瘤的nu-nu小鼠(参见，例如，Ghaneh等，2001，Gene Ther.8(3):199-208))。非霍奇金淋巴瘤动物模型的实例包括但不限于严重联合免疫缺陷(“SCID”)小鼠(参见，例如，Bryant等，2000，Lab Invest 80(4):553-73)和IgHmu-HOX11转基因小鼠(参见，例如，Hough等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95(23):13853-8)。食道癌动物模型的实例包括但不限于人类乳头状瘤病毒16型E7癌基因的转基因小鼠(参见，例如，Herber等，1996，J.Virol.70(3):1873-81)。结肠直肠癌动物模型的实例包括但不限于Ape小鼠模型(参见，例如，Fodde&Smits，2001，Trends Mol Med 7(8):36973and Kuraguchi等，2000)和ID8卵巢癌模型。在具体的实施方式中，下文的章节6中描述的癌症动物模型被用于评估NDV或其组合物、肿瘤裂解物、全细胞疫苗或组合疗法的效力。
5.8.7IL-12的表达
嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，测试在感染所述嵌合NDV的细胞中IL-12或其衍生物表达的分析可以使用本领域已知的任何分析进行，例如，Western印迹、免疫荧光和ELISA，或本文描述的任何分析(参见，例如，章节6)。
在具体的方面，利用ELISA来检测感染嵌合NDV的细胞中IL-12或其衍生物的表达，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因。例如，将细胞(例如，Vero细胞)在补充有2％谷氨酰胺(例如，Corning，Cat.No.25-005-CI)的无血清培养基(例如，OptiPRO无血清培养基(Gibco，Cat.No.12309-019)中以适当的浓度(例如，96孔平板1×104个细胞/孔)播种在组织培养平板(例如，96孔平板)中，在标准条件(例如，37±2℃，5±2％CO2)孵育一段时间(例如，大约24小时)。所述嵌合NDV的测试样品在低血清培养基(例如，Opti-MEM(IX)低血清培养基(Gibco，Cat.No.31985-070)中预先稀释到期望的滴度(例如，2×104pfu/mL)。一定体积的预先稀释的测试样品(例如，300μL)添加到例如0.5mLAssay Block(Costar，Cat.No.3956)的一行中，通过将一定体积的样品转移到一定体积的低血清培养基中(例如，150μL的样品到150μL的Opti-MEM(IX)低血清培养基中)，跨行进行连续稀释(例如，2倍连续稀释)。每个样品可以制备两个副本。含有细胞的组织培养平板(例如，96孔平板)在播种一段时间之后(例如，播种后大约24小时)从孵育箱中移出，从平板中移除消耗的培养基。细胞用一定体积(例如，100μL)的连续稀释的测试样品接种，在标准条件下(例如，37℃、5％CO2)孵育。孵育一段时间以后(例如，大约24小时)，一定体积的上清液(例如，90μL)从感染的平板中取出，转移到用抗人IL-12 p70捕获抗体(例如，AffymetrixeBioscience，Cat.No.14-7128-68)预先包被的ELISA平板，孵育一段时间(例如，室温下两小时)。捕获的huIL-12用抗人IL-12 p70检测抗体(例如，Affymetrix eBioscience，Cat.No.33-8261-68A)以及例如抗生物素蛋白-HRP进行检测，用例如HRP底物TMB根据供应商的过程(Affymetrix eBioscience，Human IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go！ELISA试剂盒，Cat.No.88-7126-88)进行显现。在具体的实施方式中，使用ELISA例如下文的章节6.3.1.19描述的ELISA对人类IL-12进行定量。
在一个实施方式中，利用本领域已知的抗体-抗原相互作用的任何分析，通过测试与抗IL-12抗体特异性结合的能力，分析由本文描述的嵌合NDV的包装基因组编码的IL-12或其衍生物的正确折叠和功能性。在另一个实施方式中，使用本领域已知的任何方法，例如，NMR、X射线结晶方法、或二级结构预测方法，例如圆二色性，通过测定IL-12或其衍生物的结构或构象，来分析由本文描述的嵌合NDV的包装基因组编码的IL-12或其衍生物的正确折叠。
嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12或其衍生物的转基因，测试感染所述嵌合NDV的细胞中IL-12或其衍生物的功能性的分析可以使用本领域已知的任何分析进行，例如，
Figure BDA0002363284960001391
Bioassay Detection Kit(DiscoverX，Cat#93-0933)。嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码huIL-12或其衍生物的转基因，例如，为了评估感染所述嵌合NDV的细胞中由嵌合NDV产生的huIL-12的功能性，将细胞(例如，vero细胞)播种在平板(例如，6孔组织培养平板的5×105个vero细胞/孔)中并在对该细胞类型本领域技术人员已知的标准条件下(例如，37℃，5％CO2)孵育一段时间，例如，24小时。所述嵌合NDV的测试样品在低血清培养基(例如，Opti-MEM(IX)低血清培养基)中稀释(例如，至1×106pfu/mL)，将各种数量的稀释的样品转移到所述细胞板中达到0.03-1的MOI。然后将培养基添加到每个反应孔，达到适合于该组织培养平板的大小的最终体积(例如，6孔组织培养平板中2mL每孔)。感染的细胞板在37℃、5％CO2下孵育24小时，然后使用
Figure BDA0002363284960001401
Bioassay Detection试剂盒(DiscoverX，Cat#93-0933)根据厂家的说明分析上清液中产生的huIL-12或其衍生物的功能。简要地说，将U20S IL12RB1/IL12RB2细胞播种在96孔细胞板中(例如，5×103个细胞/孔)，在标准条件下(例如，37℃、5％CO2)孵育一段时间(例如，4-6小时)。所述嵌合NDV感染的平板的每个板中一定体积的上清液(例如，60μL)转移到96孔样品稀释平板的第二列中，在AssayComplete Cell Plating Reagent(DiscoverX，93-0563R5A)中进行3倍连续稀释。每个稀释的上清液的一部分(例如，10μL)转移到U20S细胞板，该平板在标准条件下(例如，37℃，5％CO2)孵育一段时间(例如，16-20小时)。将检测试剂1(例如，10μL)添加到每个反应孔，在室温下孵育平板一段时间(例如，15分钟)。检测试剂2(例如，40μL)添加到每个反应孔中，平板在室温下进一步孵育一段时间(例如，60分钟)。使用平板读取器(例如，SpectraMax M5平板读取器)检测化学发光信号。在具体的实施方式中，使用下文的章节6.3.1.18中描述的分析评估人类IL-12的功能性。
5.9试剂盒
在一个方面，本文提供的是药物包装或试剂盒，其包含一个或更多个容器，所述容器填充有本文描述的组合物(例如，药物组合物)的一种或更多种成分。在具体的实施方式中，本文提供的是药物包装或试剂盒，其包含第一容器和第二容器，其中所述第一容器包含如本文描述的PD-1或其配体的拮抗剂，或包含所述拮抗剂的药物组合物，以及所述第二容器包含嵌合NDV，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，或包含所述嵌合NDV的药物组合物。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是药物包装或试剂盒，其包含第一容器和第二容器，其中所述第一容器包含如本文描述的PD-1阻断抗体，或包含所述PD-1阻断抗体的药物组合物，以及所述第二容器包含嵌合NDV，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，或包含所述嵌合NDV的药物组合物。在一个实施方式中，所述PD-1阻断抗体是纳武单抗。在优选的实施方式中，所述PD-1阻断抗体是派姆单抗。在另一个具体的实施方式中，本文提供的是药物包装或试剂盒，其包含第一容器和第二容器，其中所述第一容器包含如本文描述的PD-L1阻断抗体，或包含所述PD-L1阻断抗体的药物组合物，以及所述第二容器包含嵌合NDV，所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12(例如，人类IL-12)或其衍生物的转基因，或包含所述嵌合NDV的药物组合物。在某些实施方式中，所述PD-L1阻断抗体是度伐单抗(duralumab)或阿维鲁单抗。任选的，与这种容器相关的可以是管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的注意事项，所述注意事项反映了所述制造、使用或销售的机构批准用于人类施用。
5.10序列
表1.示范性的p40序列(氨基酸)
Figure BDA0002363284960001411
表2.示范性的p40序列(核酸)
Figure BDA0002363284960001421
Figure BDA0002363284960001431
Figure BDA0002363284960001441
Figure BDA0002363284960001451
表3.示范性的p35序列(氨基酸)
Figure BDA0002363284960001452
表4.示范性的p35序列(核酸)
Figure BDA0002363284960001453
Figure BDA0002363284960001461
表5.示范性的接头序列(氨基酸)
Figure BDA0002363284960001462
表6.示范性的接头序列(核酸)
Figure BDA0002363284960001471
表7.示范性的IL-12转基因序列(氨基酸)
Figure BDA0002363284960001472
Figure BDA0002363284960001481
表8.示范性的IL-12转基因序列(核酸)
Figure BDA0002363284960001482
Figure BDA0002363284960001491
Figure BDA0002363284960001501
Figure BDA0002363284960001511
Figure BDA0002363284960001521
Figure BDA0002363284960001531
Figure BDA0002363284960001541
表9.示范性的嵌合NDV基因组RNA序列
Figure BDA0002363284960001542
Figure BDA0002363284960001551
Figure BDA0002363284960001561
Figure BDA0002363284960001571
Figure BDA0002363284960001581
Figure BDA0002363284960001591
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表10.编码嵌合NDV的示范性的质粒序列(核酸)
Figure BDA0002363284960001882
Figure BDA0002363284960001891
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表11.NDV质粒序列
Figure BDA0002363284960002141
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Figure BDA0002363284960002221
表12.示范性的抗体相关序列
Figure BDA0002363284960002222
Figure BDA0002363284960002231
Figure BDA0002363284960002241
表13.引物序列
Figure BDA0002363284960002242
Figure BDA0002363284960002251
表15.裂解序列
Figure BDA0002363284960002252
6.实施例
国际专利申请公开No.WO 2014/158811(即国际专利申请公开No.WO 2014/158811的章节6和7)和美国专利申请公开No.2016/0015760 A1(即，美国专利申请公开No.2016/0015760 A1的章节6)和美国专利申请公开No.2014/0271677 A1(即，美国专利申请公开No.2014/0271677 A1的章节6和7)的工作实施例通过引用以其整体合并在本文中。
6.1实施例1
这个实施例证明了与免疫刺激性的免疫检查点调节物组合的NDV疗法在治疗癌症方面的治疗效力。
6.1.1材料&方法
6.1.1.1小鼠
BALB/c小鼠(6-8周龄)和WT C57BL/6小鼠购自Jackson Laboratory。所有小鼠均保持在微隔离笼中，并根据NIH和实验室动物照料条例美国协会进行处置。这项研究的所有小鼠处理和实验均由纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理和使用委员会(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee)批准。
6.1.1.2细胞系
黑素瘤(B16F10)和结肠癌(CT26和MC38)的鼠类癌细胞系维持在补充有10％胎牛血清和青霉素与链霉素的RPMI培养基中。鼠类前列腺癌细胞系TRAMP-C2维持在补充有5％胎牛血清(FCS；Mediatech，Inc.)、5％NuSerum IV(BD Biosciences)HEPES、2-ME、青霉素/链霉素、L-glut、5μg/mL胰岛素(Sigma)和10nmol/L DHT(Sigma)的DMEM培养基中。
6.1.1.3抗体
治疗性抗PD-1(克隆RMP1-14)和抗PD-L1单克隆抗体由BioXcell生产。用于流式细胞术的抗体购自eBioscience、Biolegend、Invitrogen和BD Pharmingen。
6.1.1.4病毒和克隆
所有的实验使用重组缓发型NDV LaSota毒株。使用早先描述的方法从cDNA中拯救病毒，对于插入精确性通过逆转录PCR进行测序。通过连续稀释和Vero细胞中的免疫荧光测定病毒滴度。
6.1.1.5体外感染实验
为了评估NDV对表面MHC-I、MHC-II和ICAM-1的增量调节，以及为了评估来自NDV-ICOSL病毒的ICOSL转基因的表面表达，在6孔平皿中以MOI 2一式三份地感染B16F10细胞。二十四小时后，通过机械刮擦收获细胞，进行处理用于表面标记和通过流式细胞术定量。对于病毒生长曲线实验，以100μl的总体积在指定的MOI下在6孔培养皿中在室温下孵育B16F10细胞和病毒。孵育之后一小时，吸出感染培养基，在具有10％小鸡尿囊液的1mL DMEM中在37℃下孵育细胞。24、48和72小时后，采集上清液，如上述测定病毒滴度。对于体外细胞毒性实验，以类似方式进行感染。感染后24、48、72和96小时，洗涤细胞，在37℃下与1％Triton X-100孵育30分钟。根据厂家的说明，使用Promega CytoTox 96分析试剂盒测定溶胞产物中的LDH活性。
6.1.1.6肿瘤激发存活实验
建立双侧腹部肿瘤模型，以监测注射的和全身性肿瘤中的治疗效力。对每个肿瘤模型建立治疗程序和细胞剂量，以通过作为单一药剂的NDV或抗PD-1实现10-20％的肿瘤清除。对于评估野生型NDV(NDV-WT)与免疫检查点阻断的组合疗法的实验，通过第0天在右侧腹皮内注射2×105个B16F10细胞，和第4天在左侧腹注射5×104个细胞植入B16F10肿瘤。在第7、10、13和16天，以100μl总体积的PBS中2×107pfu NDV的4次肿瘤内注射来治疗小鼠。同时，在第7、10、13和16天，小鼠接受抗PD-1抗体(250μg)的4次腹膜内注射。对照组接受同种型抗体的相应剂量的腹膜内注射和PBS的肿瘤内注射。通过用卡尺测量监测随时间的肿瘤大小和发生率。
对于TRAMP-C2模型，在第0天将5×105个细胞植入右侧腹，在第8天将5×105个细胞植入左侧腹。按照与上述类似的方式在第11、14、17和20天进行治疗。
对于CT26模型，通过在第0天在右侧腹皮内注射1×106个CT26细胞，和在第2天在左侧腹的1×106个细胞来植入肿瘤。在第6、9和12天如上述进行治疗。
6.1.1.7肿瘤浸润性淋巴细胞的分离
通过在第0天在右侧腹皮内注射2×105个B16F10细胞，在第4天在左侧腹的2×105个细胞来植入B16F10肿瘤。在第7、10和13天，小鼠用3次2×107pfu的NDV肿瘤内注射以及250μg腹膜内的指定抗PD-1抗体进行治疗。在第15天，通过吸入CO2处死小鼠。使用钳子和手术剪取出肿瘤和肿瘤引流淋巴结并称重。用剪刀切碎每个组的肿瘤，之后在37℃下与1.67Wünsch U/mL Liberase和0.2mg/mL DNase孵育30分钟。通过反复吸移并通过70μm尼龙滤器过滤将肿瘤均质化。细胞悬浮液用完全RPMI洗涤一次，在Ficoll梯度上进行纯化以除去死细胞。来自肿瘤引流淋巴结的细胞通过70μm尼龙滤器磨碎淋巴结来分离。
6.1.1.8流式细胞计
分离自肿瘤或肿瘤引流淋巴结的细胞进行处理，使用染色CD45、CD3、CD4、CD8、CD44、PD-1、ICOS、CD11c、CD 19、NK1.1、CD11b、F4/80、Ly6C和Ly6G的几种抗体面板进行表面标记。可固定的生存力染料eFluor780(eBioscience)被用于区分活细胞。使用FoxP3固定和透性化试剂盒(eBioscience)对细胞进一步透性化，对Ki-67、FoxP3、颗粒酶B、CTLA-4和IFNγ染色。使用LSRII流式细胞计(BD Biosciences)获得数据，使用FlowJo软件(Treestar)进行分析。
6.1.1.9 DC纯化和加载
来自天然小鼠的脾脏进行分离，在37℃下用1.67Wünsch U/mL Liberase和0.2mg/mLDNase消化30分钟。产生的细胞悬浮液用70μm尼龙滤器过滤，用完全RPMI洗涤一次。使用Miltenyi磁性珠子通过正选择纯化CD11c+树突细胞。分离的树突细胞与重组GM-CSF和B16F10肿瘤溶胞产物培养过夜，在Ficoll梯度上进行纯化。
6.1.1.10细胞因子产生的分析
将来自肿瘤或肿瘤引流淋巴结的细胞悬浮液集中，使用Miltenyi T细胞纯化试剂盒富集T细胞。分离的T细胞进行计数，在存在20U/ml IL-2(R and D)加上布雷菲德菌素A(BDBioscience)的情况下与加载了B16F10肿瘤细胞溶胞产物的树突细胞共培养8小时。在再刺激之后，如上述处理淋巴细胞进行流式细胞术。
6.1.1.11统计学
通过双尾学生T检验分析数据，P<0.05被认为是统计学上显著的。
6.1.2结果
为了表征新城疫病毒(NDV)感染诱导的抗肿瘤免疫反应，评估体外感染的细胞表面上的MHC I和MHC II分子以及ICAM-1的表达。如附图1所示，B16黑素瘤细胞中的NDV感染诱导了I类和II类MHC分子以及粘附分子ICAM-1的上调，所有这些都被认为是对于肿瘤特异性淋巴细胞的征募以及抗肿瘤免疫反应的活化是重要的。接下来，在鼠类黑素瘤模型和建立的双侧腹模型中评估NDV体内感染诱导的抗肿瘤免疫反应，所述双侧腹模型允许监测病毒注射的肿瘤以及未接受病毒的远端肿瘤中的反应。如附图2A-2E中所示，病毒感染的肿瘤显示了免疫细胞如NK细胞、巨噬细胞以及CD8和CD4细胞的显著浸润，但是没有调节性T细胞。由于这种免疫反应的一部分可能是对病毒而不是对肿瘤的响应，评估了对于对侧的肿瘤的免疫反应(附图3A-3C)。有趣的是，这些肿瘤证明了相似程度的提高的CD8和CD4效应，但是没有Treg浸润.对这些细胞的分析显示，它们上调活化、增殖和溶胞标志物(附图4A-4C)。NDV单一治疗在控制被治疗的肿瘤方面是有效的(附图5A)，但是仅或多或少地减慢对侧的肿瘤的生长(附图5B)。然而，清除了肿瘤的小鼠证明了针对进一步的肿瘤激发的一定程度的保护(附图5C-5D)，表明NDV疗法能够诱导持续的免疫。
接下来，评估了是否可能靶向其他机理来增强NDV产生的抗肿瘤作用。对来自NDV注射的肿瘤和非注射肿瘤的肿瘤浸润性淋巴细胞的表征显示了淋巴细胞上抑制性受体CTLA-4的上调(附图5E-F)。
为了确定靶向免疫检查点与NDV疗法组合是否可能是有益的，评估了NDV感染之后对PD-1-PD-L1途径的影响。如附图6A-6C中所示，体外和体内的NDV感染的肿瘤细胞都上调了细胞表面的抑制性PD-L1配体的表达。这种作用不仅仅是直接病毒感染的结果，而当用来自病毒感染的细胞(附图6B)和对侧未感染肿瘤(附图6C)的UV灭活的上清液处理未感染细胞时也见到这种作用。这促使测试NDV与抗PD-1抗体的组合疗法。在侵袭性B16黑素瘤模型中与抗PD-1组合的NDV疗法在大部分动物中引起痊愈，这种作用与活化的效应淋巴细胞的提高的肿瘤浸润相关(附图7A-7F)。
在所进行的整个研究中，当使用更大的肿瘤激发时，组合疗法的治疗效力降低了。接下来，评估了可以预测更好的响应、以及可以被靶向以进一步改善治疗效力的活化标志物。早先已经显示ICOS上调在对于恶性黑色素瘤用抗CTLA-4疗法治疗的患者中与更持久的治疗响应和提高的存活相关。
总体上，这些研究证明，NDV与免疫检查点调节性抗体的组合可以用作一种策略，来绕过溶瘤病毒疗法与抗体疗法的限制。这种发现具有临床应用。
6.2实施例2
这个实施例证明了由溶瘤性NDV诱导的抗肿瘤免疫反应，以及由NDV与PD-1阻断组合所诱导的抗肿瘤反应。
6.2.1材料&方法
6.2.1.1小鼠
C57BL/6J和Balb/C小鼠购自Jackson实验室。C57BL/6J背景的IFNAR-/-小鼠是EricPamer博士的馈赠。Pmel-1和Trp-1 TCR转基因小鼠是已经报道的(Overwijk等，2003，J.Exp.Med，198:568，Muransky等，2008，Blood 112:362)，由N.Restifo(National CancerInstitute，Bethesda，MD)提供。Trp1小鼠与MD安德森癌症中心(Houston，TX)提供的CD2:luciferase小鼠杂交，创建Trp1 Luciferase+(Trp1-Flue)小鼠。所有小鼠均保持在微隔离笼中，并根据NIH和实验室动物照料条例美国协会进行处置。这项研究的所有小鼠处理和实验均由纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理和使用委员会(Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee)批准。
6.2.1.2细胞系
黑素瘤(B16F10)和结肠癌(CT26和MC38)的鼠类癌细胞系维持在补充有10％胎牛血清和青霉素与链霉素的RPMI培养基中。鼠类前列腺癌细胞系TRAMP-C2维持在补充有5％胎牛血清(FCS；Mediatech，Inc.)、5％NuSerum IV(BD Biosciences)、HEPES、2-ME、青霉素/链霉素、L-glut、5μg/mL胰岛素(Sigma)和10nmol/L DHT(Sigma)的DMEM培养基中。
6.2.1.3抗体
治疗性抗PD-1(克隆RMP1-14)、抗PD-L1(克隆9G2)、抗CD8(克隆2.43)、抗CD4(克隆GK1.5)、抗IFN-γ(克隆XMG1.2)和抗NK1.1(克隆PK136)单克隆抗体由BioXcell生产。用于流式细胞术的抗体购自eBioscience、Biolegend、Invitrogen和BD Pharmingen。
6.2.1.4病毒和克隆
所有的实验使用重组缓发型NDV LaSota毒株。使用早先描述的方法从cDNA中拯救病毒，对于插入精确性通过逆转录PCR进行测序。通过连续稀释和Vero细胞中的免疫荧光测定病毒滴度。
6.2.1.5体外感染实验
对于细胞表面标记，在6孔平皿中以MOI 2(B16F10)或MOI 5(TRAMP C2)一式三份感染细胞。二十四小时后，通过机械刮擦收获细胞，进行处理用于表面标记和通过流式细胞术定量。对于体外细胞毒性实验，以指定的MOI感染细胞，在存在250ng/ml TPCK胰蛋白酶的情况下在无血清培养基中37℃孵育。感染后24、48、72和96小时，洗涤细胞，在37℃下与1％Triton X-100孵育30分钟。根据厂家的说明，使用Promega CytoTox 96分析试剂盒测定溶胞产物中的LDH活性。
6.2.1.6肿瘤激发存活实验
建立双侧腹部肿瘤模型，以监测注射的和全身性肿瘤中的治疗效力。对每个肿瘤模型建立治疗程序和细胞剂量，以通过NDV实现10-20％的肿瘤清除。对于评估NDV与抗PD-1抗体的组合疗法的实验，通过在第0天在右侧腹皮内(i.d.)注射2×105个B16F10F10细胞、第4天在左侧腹的5×104个细胞来植入B16F10肿瘤。在第7、9、11和13天，以100μl总体积的PBS中2×107pfu NDV的肿瘤内注射来治疗小鼠。同时，在第7、9、11和13天，小鼠接受抗PD-1抗体(250μg)或抗PD-L1抗体(250μg)的腹膜内(i.p.)注射。对照组接受同种型抗体的相应剂量的腹膜内注射和PBS的肿瘤内注射。有痛苦的迹象或当总体肿瘤体积达到1000mm3时，将动物安乐死。为了耗尽免疫细胞，在肿瘤激发之前一天和之后两天腹膜内注射500μg针对CD8+、CD4+、NK1.1或IFNγ的单克隆抗体，随后整个实验每5天注射250μg。对于TRAMP-C2模型，在第0天将1×106个细胞植入右侧腹，在第4天将5×105个细胞植入左侧腹。按照与上述类似的方式在第7、10、13和16天进行治疗。对于CT26模型，通过在第0天在右侧腹皮内注射1×106个CT26细胞，和在第2天在左侧腹的1×106个细胞来植入肿瘤。在第6、9和12天如上述进行治疗。Trp1和Pmel淋巴细胞的分离和过继转移
从转基因小鼠分离脾脏和淋巴结，通过70μm尼龙滤器磨碎。通过使用Miltenyi磁性珠子的正选择纯化CD4+和CD8+细胞。
按照指定的日程分别以2.5×104个细胞每小鼠和1×106个细胞每小鼠通过尾静脉将分离的Trp1或Pmel细胞注射到接受者动物中。
6.2.1.7血清转移实验
荷瘤小鼠的组用NDV或PBS的单次注射肿瘤内地治疗。在第4天，通过终端出血收集血液，通过离心分离血清。集中来自每个组的血清，在Stratalinker 1800中用300mJ/cm2 UV灯的六次脉冲进行UV处理以灭活任何可能存在的病毒。将未稀释的100μl血清肿瘤内地注射到初始的B16F10荷瘤小鼠，每隔一天给与总共3次注射。最后一次注射之后3天移出肿瘤，如下所述处理以分离肿瘤浸润性淋巴细胞。
6.2.1.8生物发光成像
从第6天开始每2-3天对小鼠成像。小鼠用50μl的PBS中的40mg/ml D-荧光素(CaliperLife Sciences)眼窝后注射，立即使用IVIS成像系统(Caliper Life Sciences)进行成像。灰阶的摄影图像和生物发光彩色图像使用The Living Image,版本4.0(Caliper LifeSciences)软件覆盖叠加。在肿瘤上人工地选择目标区(region of interest，ROI)，ROI的面积保持恒定。
6.2.1.9肿瘤浸润性淋巴细胞的分离
通过在第0天在右侧腹皮内注射2×l05个B16F10细胞，在第4天在左侧腹的2×105个细胞植入B16F10肿瘤。在第7、9和11天，小鼠用2×107pfu的NDV肿瘤内注射、以及指定的抗PD-1抗体的腹膜内注射进行治疗。死于肿瘤负荷的很少的动物(总是在未治疗的对照组中)或完全清除了肿瘤的动物(总是在治疗组中)不用于进行分析。在第15天，处死小鼠，使用钳子和手术剪取出肿瘤和肿瘤引流淋巴结并称重。用剪刀切碎每个组的肿瘤，之后在37℃下与1.67Wünsch U/mL Liberase和0.2mg/mL DNase孵育30分钟。通过反复吸移并通过70μm尼龙滤器过滤将肿瘤均质化。细胞悬浮液用完全RPMI洗涤一次，在Ficoll梯度上进行纯化以除去死细胞。来自肿瘤引流淋巴结的细胞通过70μm尼龙滤器磨碎淋巴结来分离。
6.2.1.10流式细胞术
分离自肿瘤或肿瘤引流淋巴结的细胞进行处理，使用染色CD45、CD3、CD4、CD8、CD44、ICOS、CD11c、CD 19、NK1.1、CD11b、F4/80、Ly6C和Ly6G的几种抗体面板进行表面标记。可固定的生存力染料eFluor506(eBioscience)被用于区分活细胞。使用FoxP3固定和透性化试剂盒(eBioscience)对细胞进一步透性化，对Ki-67、FoxP3、颗粒酶B、CTLA-4和IFNγ染色。使用LSRII流式细胞计(BD Biosciences)获得数据，使用FlowJo软件(Treestar)进行分析。
6.2.1.11 DC纯化和加载
来自天然小鼠的脾脏进行分离，在37℃下用1.67Wünsch U/mL Liberase和0.2mg/mLDNase消化30分钟。产生的细胞悬浮液用70μm尼龙滤器过滤，用完全RPMI洗涤一次。使用Miltenyi磁性珠子通过阳性选择纯化CD11c+DC。分离的DC与重组GM-CSF和B16F10肿瘤溶胞产物培养过夜，在Ficoll梯度上进行纯化。
6.2.1.12细胞因子生产分析
将来自肿瘤或肿瘤引流淋巴结的细胞悬浮液集中，使用Miltenyi T细胞纯化试剂盒富集T细胞。分离的T细胞进行计数，在存在20U/ml IL-2(R and D)加上布雷菲德菌素A(BDBioscience)的情况下与加载了B16F10肿瘤细胞溶胞产物的DC共培养8小时。在再刺激之后，如上述处理淋巴细胞进行流式细胞术。
6.2.1.13免疫荧光和显微镜检查
根据早先描述的方案，从小鼠中解剖出肿瘤，在PBS中洗涤，固定于4％多聚甲醛中，并处理用于石蜡包埋。使用切片机切出切片，固定在载玻片上，进行处理使用苏木色素和曙红(H&E)或用抗-CD3和抗FoxP3抗体染色。在Zeiss Axio 2宽视野显微镜上使用10×和20×物镜分析载玻片。
6.2.1.14统计
适当的情况下通过双尾学生T检验(用于比较2个组)和ANOVA对数据进行分析。存活的数据通过Log-Rank(Mantel-Cox)检验进行分析。双侧的p<0.05被认为是统计学上显著的(P≤0.05(*)，P≤0.01(**)，P<0.001(***)，P<0.0001(****))。
6.2.2结果
6.2.2.1 NDV复制限于注射的肿瘤位点
表征了肿瘤内和全身性NDV施用的病毒分布动力学。表达荧光虫荧光素酶报告物的重组NDV(NDV-Fluc)的肿瘤内注射产生了在注射的侧腹部肿瘤中维持的荧光素酶信号，而病毒的全身性施用没有产生肿瘤中的可检测荧光素酶信号(附图8A)。由于有限的全身性病毒递送不可能诱导足够的肿瘤裂解和免疫反应，研究了肿瘤内NDV注射作为引发抗肿瘤免疫反应的手段，其可能潜在地口服全身性OV疗法的限制。因而，对于进一步研究，建模的转移性疾病通过使用双侧侧腹部B16F10肿瘤模型来建模(附图10A)。向右侧腹肿瘤的NDV-Fluc施用产生了注射的肿瘤内的病毒复制，荧光素酶信号可检测达到96小时(附图8B-8D)。通过冷光成像(附图8B-8D)、通过在有胚蛋中传代或RT-PCR，在对侧的(左侧腹)肿瘤中没有检测到病毒。因而这种系统允许标准病毒注射的肿瘤和未受NDV直接影响的远端肿瘤中的免疫反应。
6.2.2.2 NDV疗法提高局部和远端肿瘤淋巴细胞浸润并延迟肿瘤生长
对病毒注射的肿瘤的分析显示了炎性反应，证据是表达白细胞共同抗原CD45的细胞的提高的浸润(附图9A-9B)。免疫浸润的特征在于先天免疫部分，包括骨髓细胞、NK细胞和NKT细胞方面的提高(附图9C)，以及适应性部分，包括CD8+和常规的CD4+FoxP3-(Tconv)T细胞方面的提高，引起CD8与Tconv对比调节性(Treg)T细胞比例的显著提高(分别为p＝0.0131和p＝0.0006)(附图9D-9F)。显著地，对侧肿瘤的分析显示了炎症性浸润方面相似的提高(附图10B和10C)，特征在于先天免疫细胞(附图10D)和效应T细胞(附图10E和10G)两者的数量提高。值得注意的是，虽然在Treg的绝对数量方面没有大的改变，它们的相对百分比方面由实质性降低(附图10E、10F和10H)，CD8与Tconv对Treg比例有显著增加(分别为p＝0.002与p＝0.0021)(附图10I)。分离自远端肿瘤的效应T细胞分别表达了提高的活化性、增殖性和溶胞标志物ICOS、Ki-67和颗粒酶B(附图10J和10K)。如早先一样，不能从远端肿瘤中分离出病毒或病毒RNA，表明远端肿瘤微环境中观察到的改变不是由于直接的病毒感染。为了进一步排出不可检测局部病毒传播的可能性，在其他远端位点，例如双侧的后爪垫处植入肿瘤，其得到了类似的发现(附图11A-11E)。
与观察到的炎症作用一致，NDV的肿瘤内施用引起了不仅是注射肿瘤、还有对侧肿瘤的生长延迟，引起延长的动物存活(附图10L和10M)。为了确定这种作用是否是短暂的以及持久的抗肿瘤保护是否可能，单侧腹部B16F10荷瘤小鼠用NDV肿瘤内地治疗，长期存活者在对侧侧腹部注射B16F10细胞。大部分动物展现了肿瘤生长延迟，30％的动物完全排除了再次激发的细胞，表明NDV的肿瘤内疗法实际上可以诱导保护性抗肿瘤记忆反应(附图13)。
6.2.2.3 NDV诱导肿瘤浸润和肿瘤特异性淋巴细胞的扩增
为了确定抗肿瘤免疫反应是否取决于NDV注射的肿瘤类型或NDV感染产生的非特异性炎症的结果，使用在相对的侧腹部植入的异源肿瘤(MC38结肠癌和B16F10黑素瘤)进行实验。为了跟踪肿瘤特异性淋巴细胞，识别黑素瘤分化抗原gp100(Pmel)和Trp1(Trp1)的T细胞受体转基因共同遗传标记的CD8+(Pmel)细胞或荧光素酶标记的CD4+(Trp1)细胞进行过继转移(Muranski等，2008，Blood，112:362；Overwijk等，2003，J Exp Med，198:569)。利用生物发光成像来测量过继转移的Trp1细胞的分布和扩增动力学。Trp1细胞向PBS治疗的荷瘤动物中的转移未能引起肿瘤中的Trp1积累，凸显了这个模型中肿瘤微环境的高度免疫抑制性质(附图12B-12D)。向B16F10肿瘤中NDV注射产生了注射的肿瘤内荧光素酶信号的显著提高(附图12B-12D)，表明Trp1 T细胞扩增(曲线下面积(AUC)p＝0.0084)。显著地，在对侧的肿瘤中见到类似的扩增，虽然是延迟的(p＝0.0009)(附图12B-12D)。相比之下，向MC38肿瘤的NDV注射未能诱导进入注射的MC38肿瘤或远端B16F10肿瘤的实质上的Trp1浸润(附图12B-12D)，表明远端肿瘤特异性淋巴细胞浸润可能取决于注射的肿瘤的抗原身份。类似地，NDV的肿瘤内注射引起远端肿瘤中Pmel细胞的提高的浸润，当注射的肿瘤是B16F10而不是MC38时更为显著(附图12E)。
有趣的是，虽然过继转移的淋巴细胞对远端B16F10肿瘤的浸润取决于注射的肿瘤的身份，即使当原始注射的肿瘤是MC38时，远端肿瘤确实展现了提高的免疫浸润(附图12F)，表明非特异性免疫反应部分也可能起到作用。实际上，用UV照射处理以灭活任何可能的病毒的、来自NDV治疗的动物的血清，当肿瘤内地注射到天然B16F10荷瘤小鼠中时，诱导肿瘤白细胞浸润(附图12G和12H)，主要的提高见于NK和CD8+部分(分别为p＝0.0089和p＝0.0443)(附图12I)。
6.2.2.4 NDV上调肿瘤浸润性T细胞上的CTLA-4
尽管在远端肿瘤中见到突出的炎性反应和生长延迟，伴有长期存活的完全的对侧肿瘤排斥仅在大约10％的动物中见到(附图10M)，是肿瘤微环境中主动的免疫抑制机制的暗示。对NDV注射的和远端的肿瘤的表征显示肿瘤浸润性T细胞上CTLA-4的上调(附图14)。
6.2.2.5 NDV疗法引起肿瘤细胞和肿瘤浸润白细胞上PD-L1的上调
为了确定靶向其他免疫检查点与NDV疗法组合是否可能是有益的，评估了NDV感染之后对PD-1-PD-L1途径的影响。如附图15中所示，在体外和体内NDV感染的肿瘤细胞都上调了细胞表面的抑制性PD-L1配体的表达(附图15A)，这也在远端的未感染肿瘤中见到。PD-L1的上调不仅局限于肿瘤细胞，还在先天和适应性免疫谱系的肿瘤浸润性白细胞上见到(附图15B)。
6.2.2.6 NDV与PD-1和PD-L1阻断抗体的组合疗法产生改善的抗肿瘤免疫和长期的动物存活
在上文描述的双侧侧腹部黑素瘤模型中评估了NDV与阻断PD-1的抗体的组合以及NDV与阻断PD-L1的抗体的组合。与抗PD-1或抗PD-L1抗体组合的NDV疗法产生改善的动物存活(附图16A-16D和附图17A-17D)。对来自NDV和抗PD-1抗体的组合治疗的动物的远端肿瘤进行了表征。从附图18A-18E中可以看出，肿瘤内NDV与全身性PD-1阻断的组合引起免疫细胞的显著远端肿瘤浸润，肿瘤浸润性CD8细胞的提高是最明细的发现。浸润性细胞分别上调了增殖和溶胞标志物Ki67和颗粒酶B(附图19A-19B)。
6.2.2.7 NDV诱导了病毒注射的和远端的肿瘤以及肿瘤引流淋巴结(TDLN)中CD4和CD8细胞上ICOS的肿瘤免疫浸润上调
上述发现表明，肿瘤内NDV与全身性免疫检查点阻断的组合产生了两种治疗方案之间显著的协同作用。为了进一步建筑这些发现，研究了通过相关的共刺激途径在肿瘤微环境内T细胞效应物功能的增强可以驱动更好的抗肿瘤免疫反应。早先的研究鉴定了T细胞上可诱导的共刺激子(ICOS)的持续上调作为对患者中CTLA-4阻断的强的响应指征(Carthon等，2010，Clin.Cane.Res.，16:2861)。ICOS是活化的T细胞的表面上上调的CD28同源物，已经显示其对于T细胞依赖性B淋巴细胞反应和全部T辅助细胞子集的发育是关键的(Simpson等，2010Curr Opin Immunol.22:326)。ICOS在CTLA-4阻断的抗肿瘤效力方面的作用近来已经通过小鼠研究予以确认，其中ICOS缺陷小鼠在CTLA-4阻断的抗肿瘤反应的发展中严重受损(Fu等，2011，Cancer Res.，71:5445)。
对用NDV治疗的双侧侧腹部肿瘤模型中ICOS的表达进行了表征，以确定该受体是否可以充当这种治疗方法中的靶点。为了表征肿瘤内NDVNDV的局部和远端效应，使用了双侧侧腹部B16F10黑素瘤模型，病毒施用给单侧的肿瘤(附图20A)。评估了可以预测更好的响应、以及可以被靶向以进一步改善治疗效力的活化标志物。该实施例聚焦于ICOS，因为早先已经显示持续的ICOS上调在对于恶性黑色素瘤用抗CTLA-4疗法治疗的患者中与更持久的治疗响应和提高的存活相关。对分离自肿瘤和肿瘤引流淋巴结的淋巴细胞的分析将共刺激分子ICOS的上调鉴定为受治疗的动物中的活化标志物(附图20B和20C)。
6.2.3结论
为了触发免疫原性肿瘤细胞死亡和炎性反应，采用了非致病性NDV，尽管它有相对弱的溶胞活性，已经证明了它是I型IFN和DC成熟的强力诱导物(Wilden等，2009，Int J Oncol34:971；Kato等，2005，Immunity 23:19)。使用了按照日程交错植入肿瘤的双侧侧腹部黑素瘤模型，其早先被证明不受伴随免疫的影响(Turk等，2004，J Exp Med 200:771)。本实施例证明，NDV的肿瘤内注射在不存在远端病毒传播的情况下引起远端肿瘤免疫浸润。值得注意的是，这种作用与Treg数量的相对降低、以及CD4和CD8效应物对Treg的比例的显著增加相关，其早先已被证明是对免疫疗法的良好免疫学响应的标志物(Quezada等，2006，J ClinInvest 116:1935；Curran等，2010，Proc Natl Acad Sci U S A107:4275)。
本实施例中的数据证明，NDV增强了肿瘤特异性淋巴细胞的肿瘤浸润，是一种取决于病毒注射的肿瘤的身份的作用。增强的肿瘤浸润和过继转移的淋巴细胞的扩增进一步表明溶瘤病毒疗法与使用过继T细胞转移的治疗方法之间的协同作用。合理的是，肿瘤特异性淋巴细胞在初始的病毒感染位点经历活化和扩增，随后它们迁移至其他肿瘤位点，这可能取决于趋化因子和淋巴细胞归巢受体(Franciszkiewicz等，2012，Cancer Res 72:6325)。本实施例中的数据还证明，远端肿瘤免疫浸润是部分非特异性的，可以由异源肿瘤的NDV感染诱导，或由来自治疗动物的血清向天然荷瘤小鼠的转移诱导。由炎症性细胞因子例如IL-6诱导的血管透过性提高可能强烈地促进肿瘤血管系统的活化和进入肿瘤的淋巴细胞征募(Fisher等，2011，The Journal of clinical investigation 121:3846)。
尽管TIL有显著提高，NDV单一治疗的远端肿瘤中的治疗效果是相当一般的，凸显了这些肿瘤的微环境的免疫抑制性质(Spranger等，2013，Sci Transl Med 5)。
总之，本实施例证明了，使用NDV的B16黑素瘤的局部肿瘤内疗法诱导了炎症反应，其引起没有远端病毒传播的远端(无病毒注射)肿瘤中的淋巴细胞浸润和抗肿瘤效应。这种炎症性效果与肿瘤特异性CD4+和CD8+T细胞的远端肿瘤浸润相符，其取决于病毒注射的肿瘤的身份。本实施例证明了，溶瘤性NDV的局部治疗诱导了远端肿瘤中的炎症性免疫浸润，使得它们对免疫调节性抗体的全身性治疗敏感。
6.3实施例3
这个实施例证明了编码IL-的NDV的肿瘤内施用与施用抗PD-1抗体组合在NDV-IL-12注射的和无注射的肿瘤中产生健壮的抗肿瘤活性。如下文所示，这种抗肿瘤活性与免疫基因的诱导和CD3+ T细胞的浸润相关。
6.3.1材料和方法
6.3.1.1病毒的克隆和拯救
NDV基因组含有六个开放阅读框，其编码核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血细胞凝集素-神经氨酸酶(HN)和大病毒聚合酶蛋白(L)。由编码IL-12 p40亚基、GGGGGGS(SEQ ID NO:24)接头和IL-12 p35亚基的核酸序列组成的人类IL-12转基因(SEQID NO:26)插入pT7NDV-LS-L289A质粒的P和M基因之间的SacII克隆位点中(附图21；SEQ IDNO:21)。产生的含有人类IL-12转基因的pT7NDV-LS-L289A质粒(SEQ ID NO:31)在这个实施例中称为“NDV-huIL-12”或“pT7NDV-LS-L289A-huIL-12”。如附图21中所示，pT7NDV-LS-L289A质粒含有处在T7启动子的转录控制下的缓发型NDV LaSota序列。该质粒含有编码NDVF蛋白的序列中的L289A突变。NDV F蛋白中的L289A突变已被报道使得F蛋白与野生型F蛋白相比更具膜融合性，并促进溶瘤活性。参见，例如，Sergei等，2000，J.Virol.74:5101；Altomonte等，2010，Mol.Ther.18:275。
为了产生用于插入pT7NDV-LS-L289A质粒的人类IL-12转基因，使用“六位规则”设计正向和反向引物(SEQ ID NO:32和33)，这些引物用于产生PCR片段，其具有与pT7NDV-LS-L289A质粒中的SacII克隆位点同源的15碱基对的末端。由于NDV的成功拯救需要带有转基因的基因组满足“六位规则”，在引物设计期间考虑了“六位规则”并在必要时进行确认和校正。pT7NDV-LS-L289A质粒用SacII(NEB，Catalogue#R0157S)在37摄氏度下消化过夜，随后用碱性磷酸酶(NEB，目录#M0289S)在37摄氏度下处理30分钟以防止质粒再环化。在消化和碱性磷酸酶处理之后，线性化的质粒使用NucleoSpin clean-up试剂盒(Macherey-Nagel，目录#740609.250)进行纯化。PCR片段和切割的质粒然后使用Takara Clontech的InfusionHD考虑试剂盒熔接在一起。产生的质粒转化到Max Efficiency Stbl2感受态细胞(LifeTechnologies，目录#10268-019)中。通过集落PCR和序列确认来鉴定阳性克隆。对于序列确认，使用了在克隆区之外退火的引物TCGATCGAGGAAATCAGG(SEQ ID NO:36)和GTACAGCCCAATTGTCC(SEQ ID NO:37)。此后，使用PureLink HiPure Midi prep试剂盒(Invitrogen，目录#K210004)产生无内毒素的midi prep。
对于NDV-huIL-12构建体使用如上所述的类似策略，用于克隆和拯救编码鼠类IL-12转基因(SEQ ID NO:30)的NDV。即，使用“六位规则”设计正向和反向引物(SEQ ID NO:34和35)，使用该引物产生PCR片段，其具有与pT7NDV-LS-L289A质粒中的SacII克隆位点同源的15碱基对的末端。使用上文描述的技术将PCR片段克隆到pT7NDV-LS-L289A质粒中，如上文描述的选择阳性克隆。产生的含有鼠类IL-12转基因的pT7NDV-LS-L289A质粒(SEQ ID NO:31)在这个实施例中称为“NDV-muIL-12”或“pT7NDV-LS-L289A-muIL-12”。
使用
Figure BDA0002363284960002371
-LT1转染试剂(Mirrus，目录#MIR2300)，表达T7 RNA聚合酶的婴儿仓鼠肾脏(BHK)衍生的细胞(BSR-T7)用编码L、NP、P和T7 RNA聚合酶蛋白的质粒以及pT7NDV-LS-L289A-huIL-12质粒或pT7NDV-LS-L289A-muIL-12转染。特别地，对于拯救转染，按照以下质粒浓度使用每孔30μL的Trans-IT LT1试剂和150μL的OptiMEM:4.0μg pT7NDV-LS-L289A-huIL-12或pT7NDV-LS-L289A-muIL-12质粒；2.0μg N质粒；1.0μg P质粒；1.0μg L质粒；2.0μg T7opt质粒(Addgene质粒#65974，作为来自Benhur Lee实验室的馈赠获得)。为了产生NDV-WT，按照与pT7NDV-LS-L289A相似的方式拯救转染(即，缺少huIL-12转基因的pT7NDV-LS-L289A-huIL-12质粒)。从cDNA拯救重组NDV的过程说明参见，例如Ayllon等，2013，J.of Visualized Experiments，80:e50830。转染后48小时采集上清液以及细胞(使用细胞刮刀)，保持在冰上，直到注射到9-10天龄有胚鸡蛋的尿囊腔内。注射的蛋在37摄氏度下孵育2天，随后在4摄氏度孵育过夜。然后收获尿囊液。为了收获尿囊液，在无菌条件下打碎蛋壳，使用移液管取出尿囊液，转移到冰上的无菌falcon试管中，通过离心清除细胞碎屑(15×g)。为了确认病毒生长，然后将这种尿囊液的样品用于血细胞凝集分析中。然后将病毒等分，直接冷冻(-80摄氏度)待用。
对于鼠类或人类IL-12转基因向NDV中的导入，在病毒滴度方面没有观察到可见的差异。蛋中培养之后代表性的病毒滴度如下列出:NDV-huIL12为1.40×108；NDV-wt为3×108；NDV-mlIL12为1.7×108。
6.3.1.2血细胞凝集(HA)分析
使用V形底微量滴定板进行HA分析。除了第一行之外，50μL的IXPBS添加到平板中的每个反应孔中。第一行接受100μL纯净的(即，未稀释的)带有病毒的尿囊液。然后跨整行进行病毒悬浮液的两倍连续稀释。在最后一行之后丢弃过量的50μL。所有反应孔具有50μL的最终体积。将50μL的0.5％火鸡红血球悬浮液添加到每个反应孔，轻轻敲击平板。平板在4摄氏度下孵育20-30分钟使红血球沉积。显示了完全的血细胞凝集的样品被认为是病毒阳性的。观察到阴性结果为透明红色小球在板的底部。
6.3.1.3 IL-12表达
通过来自R&D systems的商业上可获得的试剂盒人类L-12 Quantikine ELISA试剂盒(D2050)和小鼠IL-12 Quantikine ELISA试剂盒(Ml270)确认huIL-12和muIL-12表达。
6.3.1.4 NDV-huIL-12的分析
使用Vlasak等，Vaccine 34(2016)2321-2328中描述的技术通过流式病毒计定量和表征NDV-huIL-12，通过引用以其整体合并在本文中。
另外，通过SDS-PAGE在还原条件下分析六种NDV蛋白(F、HN、NP、L、P和M)的表达。具体地，使用Invitrogen NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶(ThermoFisher Scientific，目录号NP0321BOX)在MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸))缓冲基质中进行SDS-PAGE分析。使用十二烷基硫酸锂(LDS)和二硫苏糖醇(DTT)还原样品，在70℃下热处理10分钟。凝胶使用GelCodeBlueStain(ThermoFisher Scientific，目录号24590)染色过夜，用水脱色，之后使用MolecularDynamics Personal Densitometer SI和ImageQuant软件成像。
进一步地，如Newcastle disease virus:propagation，quantification，andstorage.Curr.Protoc Microbiol.2006，Jun，Chapter 15:Unit 15F.2中描述的，在存在胰蛋白酶的情况下通过Vero细胞的蚀斑分析来测定NDV滴度，通过引用以其整体合并在本文中。
6.3.1.5小鼠
WT C57BL/6小鼠购自Jackson实验室。所有小鼠均保持在微隔离笼中，并根据NIH和实验室动物照料条例美国协会进行处置。这项研究的所有小鼠处理和实验由默克研究实验室(Boston and Palo Alto)机构动物护理和使用委员会批准。
6.3.1.6细胞系
鼠类黑素瘤癌细胞系(B16F10)维持在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中。
6.3.1.7抗体
抗小鼠PD-1单克隆抗体(muDX400)和小鼠IgG1同种型对照抗体(Mouse x[HEXON_Adenovirus](TC31.27F11.C2)IgG1)由Merck Research Laboratories生产。
6.3.1.8病毒和克隆
所有的实验使用重组缓发型NDV LaSota毒株。使用早先描述的方法从cDNA中拯救病毒，对于插入精确性通过逆转录PCR进行测序。通过连续稀释和Vero细胞中的免疫荧光测定病毒滴度。
6.3.1.9肿瘤激发实验
建立双侧侧腹部肿瘤模型，以监测注射的和全身性肿瘤中的治疗效力。对每个肿瘤模型建立治疗程序和细胞剂量，以通过作为单一药剂的NDV或抗PD-1实现10-20％的肿瘤清除。对于评估野生型NDV(NDV-WT)或表达鼠IL-12的NDV(NDV-muIL-12)与PD-1阻断的组合治疗的实验，通过分别在右侧腹和左侧腹皮下(SC)注射2×105个和1×105个B16F10细胞植入B16F10肿瘤。在肿瘤植入之后7-9天启动给药。第0天表示给药的第一天。在第0、2、4和6天，小鼠在右侧腹的肿瘤中(称为注射的肿瘤)以总体积100μl的PBS中的1×107pfu NDV-WT或NDV-muIL-12的4次肿瘤内注射进行治疗。左侧腹的肿瘤称为无注射肿瘤。同时，在第0、4和8天，或第0和6天(取决于研究设计)，小鼠接受抗PD-1抗体(10mg/kg)的3次或2次腹膜内注射。对照组接受同种型抗体的相应剂量的腹膜内注射和PBS的肿瘤内注射。通过用卡尺测量监测随时间的肿瘤大小和发生率。在动物安乐死之后，收获肿瘤，使用液氮急速冷冻用于RNA分离或基因表达分析，或在10％中性缓冲的福尔马林中固定48小时，转移到70％乙醇中，包埋在石蜡块中用于免疫组织化学。
6.3.1.10免疫组织化学
对4μm厚度的福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片进行小鼠CD3染色。切片在乙醇系列中脱石蜡和再水化。载玻片进行热诱导的表位恢复和阻断内源过氧化物酶，之后在室温下与1:1000的工作稀释度的一抗、抗小鼠CD3大鼠mAb克隆CD3-12(AbD Serotec，目录号MCA1477)孵育。然后切片与二抗、H&L预吸附的兔抗大鼠IgG(Abeam，ab 102248)孵育15分钟，随后ImmPRESSTM HRP抗兔IgG(过氧化物酶)聚合物检测试剂盒(Vector Laboratories,目录号MP-7401)15分钟。使用3,3-二氨基联苯胺(Dako，目录号K3468)显现抗原-抗体结合。切片用Mayer’s Hematoxylin(Poly Scientific，目录号S216-1GL)复染色、脱水并加盖玻片。
6.3.1.11人类肿瘤组织培养
来自患有肾细胞癌、结肠直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌和头颈部鳞状细胞癌的患者的人类肿瘤样本根据州和联邦条例获自商业来源(BioOptions、Boston BioSource(Tufts)、Folio Biosciences和Tissue Solutions)和学术合作者(University of Rochester)。在手术从患者移除肿瘤之后1小时内采集新鲜的肿瘤组织，植入AQIX转运培养基中，在4℃下过夜转运至加州帕洛阿托的默克研究实验室。肿瘤包埋在1％低熔点凝胶中，使用Mcllwain组织切碎机切割成400μm切片。将肿瘤切片设置在含有1mL Dulbecco改良的Eagle培养基、10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/ml链霉素的6孔平皿中的Millicell-CM插片上。
在以下的实验中，评估了肾细胞癌的5个样品(RCC；n＝4)、结肠直肠癌的3个样品(CRC)、乳腺癌的2个样品以及头颈部鳞状细胞癌的一个样品。做为选择，评估了RCC的6个样品、CRC的1个样品和非小细胞肺癌(NSCLC)的2个样品。肿瘤切片与3×107pfu的NDV-WT或NDV-huIL-12或10、25和50ng/mL的重组IL-12孵育，在5％CO2气氛和37℃下在空气培养基界面上培养24或48小时。对于某些实验，将样品急速冷冻(即，样品置于试管中，浸入液氮直到冷冻，然后在干冰上转运并在-80℃下保存)，如下文章节6.3.1.13中描述的从样品中分离RNA。
对于其他实验，使用各种试剂盒分析来自组织样品的培养基的细胞因子和趋化因子。使用Human Proinflammatory 9-Plex Tissue Culture Kit(MesoScale Discovery，目录号K15007B-2)分析GM-CSF、IFN-γ、IL-10、IL-12p70、IL-1-β、IL-2、IL-6IL-8和TNF-α。IFN-α-2a使用Human IFN-αTissue Culture Kit(Meso Scale Discovery，目录号K151ACB-4)进行分析；IFN-β使用Human IFN-βTissue Culture Kit(Meso Scale Discovery，目录号K151ADB-4)进行分析。Eotaxin、Eotaxin-3、IL-8IP-10、MCP-1、MCP-4、MIP-1a、MIP-1b、MDC和TARC使用V-PLEX Chemokine Panel 1(人)试剂盒(Meso Scale Discovery，目录号K15047D-2)进行分析，IP-10使用IP-10Tissue Culture试剂盒(Meso Scale Discovery，目录号Kl51AVB)进行分析。
6.3.1.12人类全血分析
来自具有实体肿瘤的患者的全血(n＝5)从Conversant Bio(Huntsville，AL)获得，来自健康供体的全血(n＝5)通过默克研究实验室内部血液捐献程序获得。使用以下两个实验条件。(1)1mL全血保持不处理，或用3×107pfu的NDV-WT或NDV-huIL-12处理48小时。使用上文描述的用于人类肿瘤组织培养研究的试剂盒，采集血浆用于评估各种细胞因子和趋化因子的蛋白质浓度。(2)4mL全血保持不处理，或用3×107pfu的NDV-WT或NDV-huIL-12处理24小时。将全血采集到PAXgene血液RNA试管(BDBiosciences，目录号762165)中，在分离RNA之后，使用Fluidigm RTqPCR平台分析免疫基因的面板的基因表达(参见章节6.3.1.13)。
6.3.1.13 RNA提取和实时定量聚合酶链式反应(RTqPCR)
从小鼠B16F10肿瘤(章节6.3.1.9)、人类肿瘤样本(章节6.3.1.11)和人类全血(章节6.3.1.12)分离RNA。通过使用polytron均质器均质化到RNASTAT-60(Tel-Test Inc.，Friendswood，TX)中来分离总RNA。根据厂家的方案提取总RNA。在用异丙醇沉淀之后，使用锁相轻试管(phase-lock light tubes)用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)重新提取总RNA。
DNase处理的总RNA使用QuantiTect Reverse Transcription(Qiagen，目录号2015310)根据厂家的方案进行逆转录。引物从Life Technologies获得:
Figure BDA0002363284960002411
Figure BDA0002363284960002412
在Fluidigm Biomark序列检测系统上根据厂家的方案(Fluidigm，Foster City，CA)，在TAQMANTM RTqPCR反应(Thermo Fisher Scientific，Foster City，CA)中以900nM每种未标记引物和250nM FAM标记的探针，对来自每个样品的10ng cDNA进行实时定量的聚合酶链式反应(RTqPCR)。在独立的反应中测量遍在蛋白的水平，用于通过Δ-ΔCt方法将数据归一化。使用遍在蛋白和每个样品的目标基因的平均循环阈值(Ct)值，使用以下方程获得归一化的值:1.8(Ct遍在蛋白-Ct目标基因)×104。
6.3.1.14 Nanostring基因表达分析
对于下文章节6.3.2.6中进行的分析，使用NanoDrop ND1000分光光度计(ThermoFisher Scientific)对RNA进行定量。在NanoString nCounter基因表达平台(NanoStringTechnologies)上进行基因表达分析。使用由与T细胞生物学、免疫调节以及肿瘤浸润性淋巴细胞与肿瘤相关巨噬细胞的细胞标志物相关的800个基因的面板组成的常规代码组。对于每一份样品，5μL最终体积中的50ng总RNA与来自常规基因表达代码组的3'生物素化的捕获探针和用荧光条码标记的5'报告物探针混合。根据厂家的建议，探针和目标转录产物在65℃下过夜杂交12-16小时。杂交的样品在NanoString nCounter备料站上使用高灵敏度方案允许，其中除去过量的捕获和报告物探针，转录产物特异性三元复合物固定在链霉亲和素包被的柱体上。在nCounter Digital Analyzer上以最大扫描分辨率扫描样品。每份单个样品的基因表达通过FDC(持家)归一化进行归一化。对于每个肿瘤样品，原始计数进行log10转化，任何通过减去所有持家基因的算术平均值(表15)将每个基因归一化。作为18种基因上下标志(Up-Down Signature)的持家归一化值的加权和，计算基因表达谱(GEP)标志评分(表15)。每个基因的持家归一化值乘以来自计分权重组的该基因的系数，产生18种基因标志中的每个基因的加权的RNA值，加和该加权的RNA值以产生肿瘤样品的标志评分。参见Ayers等，2017，J of Clinical Investigation 127:2930-2940和WO2016094377。
表15:
Figure BDA0002363284960002421
Figure BDA0002363284960002431
6.3.1.15细胞生存力分析
细胞(10000个/孔/200μL补充有10％FBS的DMEM或RPMI)一式8份平铺在96孔平板中，在5％CO2气氛下37℃孵育18小时以容许细胞附着。在用NDV-huIL-12感染之前从反应孔中移除细胞培养基。在8个副本中，以MOI 2(20,000pfu)或6(60,000pfu)在20μL无血清培养基(DMEM+0.3％BSA+青霉素/链霉素)中用NDV-huIL-12感染细胞。没有病毒的培养基(模拟感染的)或具有10μM嘌呤霉素(或它的载体DMSO)的培养基添加到平行反应孔中。平板在平面上在室温下孵育1小时，随后抽吸培养基。具有10％血清的细胞培养基(100μL)添加到每个反应孔，平板在5％CO2气氛中37℃孵育48小时。采集上清液，保存在-80℃下用于细胞因子和趋化因子的分析。然后使用Cell Titer Glo分析试剂盒(Promega，目录号G7573)根据厂家的说明书分析平板。
6.3.1.16来自人类肿瘤细胞系的细胞因子和趋化因子的分析
分析来自感染NDV-huIL-12(MOI 2，4个副本)的26种细胞系的上清液的各种细胞因子和趋化因子。使用Human Custom Biomarker试剂盒(Meso Scale Discovery，目录号K15067L-2)分析IL-10、IL-1β、IL-2、MCP 1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、MIP-1b和TNF-α。使用Human Interferon Combo试剂盒(Meso Scale Discovery，目录号K15094K-2)分析IFN-α2a、IFN-β、IFN-γ、和IL-29/IFN-γ1。
6.3.1.17统计
肿瘤体积:由于过度的肿瘤负荷或其他原因，单个动物的跟踪可能早期终止。取决于该原因和最后一次测量的肿瘤大小，最后观察到的肿瘤体积当做该动物的所有后续天数的体积下界(右删失数据)。
为了比较给定天数时的两个治疗组，使用容许右删失数据的非参数性Mann-Whitney(或Wilcoxon秩和)检验的概括:Peto以及Gehan-Breslow检验的Peto版本。根据被比较的两种治疗之间动物的20000次随机再分配估计双侧p值。为了控制给定治疗对的所有时间点之间的家族式差错率，通过Holm方法对p值进行多重性调整。使用小于0.05的p值定义统计显著性。
来自肿瘤激发研究的基因表达数据:为了比较给定天数时的两个治疗组，使用非参数性Mann-Whitney检验。使用小于0.05的p值定义统计显著性。
来自人类肿瘤组织培养和全血研究的细胞因子/趋化因子和/或基因表达数据:为了比较给定天数时的两个治疗组，使用非参数性Wilcoxon符号秩检验。使用小于0.05的p值定义统计显著性。
6.3.1.18 IL-12生物分析
为了评估NDV-huIL-12感染的细胞中由NDV-huIL-12产生的huIL-12的功能性，将Vero细胞以5×105个细胞/孔播种在6孔组织培养平板上，在37℃、5％CO2下孵育24小时。NDV-huIL-12病毒的测试样品在Opti-MEM(IX)低血清培养基中稀释至1×106pfu/mL，将各种数量的稀释的样品转移到所述细胞板中达到0.03-1的MOI。然后将Opti-MEM(IX)低血清培养基添加到每个反应孔达到2mL的最终体积。感染的细胞板在37℃、5％CO2下孵育24小时。使用
Figure BDA0002363284960002441
Bioassay Detection试剂盒(DiscoverX，Cat#93-0933)分析上清液中产生的huIL-12的功能。
Figure BDA0002363284960002442
U20S IL12RB1/IL12RB2细胞进行工程化以表达人类IL-12受体beta 1和beta 2。一个受体与酶供体(Enzyme Donor，ED)融合，另一个受体与酶接受体(EnzymeAcceptor，EA)融合。在与功能性huIL-12结合是，这两个受体二聚化，促使ED和EA互补形成功能性的β-半乳糖苷酶，其水解底物产生化学发光信号。U20S IL12RB1/IL12RB2细胞以5×103个细胞/孔播种到96孔细胞板中，在37℃、5％CO2下孵育4-6小时。来自感染的Vero平板的每个反应孔的总共60μL的上清液转移到96孔样品稀释平板的第二列，在行列之间进行AssayComplete Cell Plating Reagent(DiscoverX，93-0563R5A)中的3倍连续稀释。总共10μL的每种稀释上清液转移到U20S细胞板，将平板在37℃、5％CO2下孵育16-20小时。然后将10μL的检测试剂1添加到每个反应孔中，在室温下孵育平板15分钟。然后将40μl的检测试剂2添加到每个反应孔中，在室温下进一步孵育平板60分钟。使用SpectraMax M5平板读取器检测化学发光信号。
6.3.1.19通过ELISA的huIL-12定量
将Vero细胞以1×104个细胞/孔播种在96孔组织培养平板中的补充有2％谷氨酰胺(Gibco，Cat.No.12309-019)的Opti-PRO无血清培养基(Corning，Cat.No.25-005-CI)中，在37±2℃、5±2％CO2下孵育大约24小时。NDV-huIL-12病毒(批次A和B)的测试样品在Opti-MEM(IX)低血清培养基(Gibco，Cat.No.31985-070)中预先稀释到目标2×104pfu/mL。将总共300μL的每种预稀释的测试样品添加到0.5mL Assay Block(Costar，Cat.No.3956)的第一行，通过将150μL的样品转移到150μL Opti-MEM(IX)低血清培养基中进行跨行的2倍连续稀释。每个样品制备两个副本。播种后24小时将含有Vero细胞的96孔平板从孵育箱中取出，从平板上移除消耗的培养基。细胞用100μL连续稀释的测试样品进行接种，在37℃、5％CO2下孵育。大约24小时的孵育之后，从感染平板中取出90μL的上清液，转移到用抗人IL-12p70捕获抗体(Affymetrix eBioscience，Cat.No.14-7128-68)包被的ELISA平板中，在室温下孵育两小时。捕获的huIL-12用抗人IL-12 p70检测抗体(Affymetrix eBioscience，Cat.No.33-8261-68A)以及抗生物素蛋白-HRP进行检测，用HRP底物TMB根据供应商的过程(Affymetrix eBioscience，人类IL-12 p70 ELISAReady-SET-Go！ELISA试剂盒，Cat.No.88-7126-88)进行显现。将MOI依赖性huIL-12表达曲线与NDV-huIL-12参考标准进行比较(附图34)。
6.3.1.20纯化
从收获的尿囊液纯化NDV-huIL-12使用由以下单元操作组成的过程:(1)澄清，(2)切向流过滤，和(3)过滤除菌。收获的尿囊液使用1.2μm玻璃纤维死端过滤进行澄清，以除去细胞和其他较大的碎屑。用于这一步骤的膜含有净正电荷，其引起宿主细胞DNA的可测量的降低。澄清的部分(clarified bulk，CB)随后使用750kD空心纤维膜通过切向流过滤(TFF)进行处理。在这个步骤期间，该批量被浓缩～5倍，相对于4倍渗滤体积(DV)的高盐缓冲液进行渗滤，随后是4DV的低盐制剂缓冲液，然后浓缩～10倍。这个单元操作构成了主要纯化步骤，借此残余的卵蛋白、大部分卵白蛋白以及残余的DNA被降低到可接受水平。该步骤还用来将缓冲液交换为与制剂相容的缓冲液。然后将TFF产物(TFFP)通过0.2μm滤器进行无菌过滤，分配到适当的无菌贮藏容器中。纯化的病毒体积(PVB)然后进行冷冻，保存在-70摄氏度下。
6.3.2结果
6.3.2.1在同基因的小鼠B16F10双侧肿瘤模型中NDV-muIL-12与抗-muPD-1mAb组合的抗肿瘤效力和作用机制
B16F10肿瘤是T细胞不良渗透的，并对抗PD-1疗法有抗性。B16F10肿瘤展现了极为侵袭性的生长并代表了高bar模型。因而，选择B16F10模型来评估编码小鼠IL-12转基因的NDV载体与未武装的NDV(“NDV野生型”(“NDV-WT”))进行比较。在两个荷瘤C57BL/6小鼠中评估NDV载体，以评估远隔效应(即，不施用NDV的肿瘤中的抗肿瘤效力)。
与小鼠IgG1同种型对照(组1)相比，单独施用muDX400(组2)不引起注射的肿瘤(p＝1.0)或无注射肿瘤(p＝0.475)的肿瘤体积的显著降低(附图22)。与NDV-WT(组3)相比，单独施用NDV-muIL-12(组5)引起注射的肿瘤(p＝0.027)的肿瘤体积的显著降低，但无注射肿瘤(p＝1.0)没有(附图22)。然而，与NDV-muIL-12(组5)相比，与muDX400组合的NDV-muIL-12(组6)引起注射的肿瘤(p＝0.047)和无注射肿瘤(p＝0.020)的肿瘤体积的显著降低(附图22A-22D)。另外，与muDX400组合的NDV-muIL-12分别引起注射的肿瘤和无注射肿瘤的10例中的6例完全消退(CR)和10例中的5例CR(附图22A-22D)。这些结果在独立实验中是可重复的，与早先的发现一致，其证明在小鼠临床前模式中，NDV破坏对免疫检查点阻断的抗性(Zamarin等，2014，Sci.Transl.Med.6:226ra32(2014))。对于注射的肿瘤，完全消退的数量如下:组1:0例；组2:0例；组3:1例；组4:1例；组5:2例；和组6:6例。对于注射的肿瘤，完全消退的数量如下:组1:0例；组2:1例；组3:1例；组4:3例；组5:0例；和组6:5例。
在相同的研究中，在第14天收获肿瘤以评估各种免疫基因的表达。附图23和附图24分别显示注射的肿瘤和无注射肿瘤中T细胞标志物(附图23A和附图24A)、细胞因子(附图23B和附图24B)、IFN可诱导的基因(附图23C和附图24C)以及PD-1途径(附图23D和附图24D)的代表性基因的mRNA表达。IL-12p35的mRNA表达仅在施用NDV-muIL-12的动物(组5和组6)的注射的肿瘤中检测到。这个结果表明NDV本身不诱导IL-12。在组5和6的无注射肿瘤中IL-12p35的mRNA表达也没有检出支持了早先的发现，NDV局限于NDV注射的肿瘤(Zamarin等，2014，Sci.Transl.Med.6:226ra32(2014))。如附图23A-23D所示，注射的肿瘤中CD3-ε、CD8-β、Gzmb、IL-12p35、IL-15、IFN-γ、Irf7、Mx1、Oas1a、PD-1和PD-L1的mRNA表达按照以下治疗的顺序提高:对照(组1)、muDX400单一治疗(组2)、NDV-WT单一治疗(组2)、muDX400和NDV-WT的组合(组4)、NDV-muIL-12单一治疗(组5)、和muDX400与NDV-muIL-12的组合(组6)，在组3和5以及组4和6之间提高是统计学上显著的(p<0.05)。无注射肿瘤中这些基因的提高在对照(组1)、muDX400与NDV-WT(组4)或NDV-muIL-12(组6)的组合之间是统计学上显著的(附图24A-24D)。从独立的实验获得了类似的结果。
在另一个独立的双侧B16F10研究中，小鼠B16F10细胞皮下地植入到免疫活性的C57BL/6J小鼠的右侧腹(2×105个细胞)和左侧腹(1×105个细胞)。在植入后7天(第0天)根据右侧腹(注射的肿瘤)的肿瘤体积(TV)将动物分配到6个组中，中值TV＝56mm3。左侧腹(无注射肿瘤)的中值TV是38mm3。在第0天启动给药。10mg/kg的小鼠IgG1同种型对照和muDX400每4天腹膜内施用总共3剂。1×107pfu的PBS、NDV-WT和NDV-muIL-12每2天施用到右侧腹的肿瘤中总共4剂。跟踪动物到第54天。当注射和无注射肿瘤的体积总和>2000mm3或体重损失>20％时将动物安乐死。每个组中有10只动物。如附图25A-25B所示，肿瘤内NDV-muIL-12与muDX400组合的治疗产生最久的动物总体存活。
在另一个双侧B16F10研究中，小鼠B16F10细胞皮下地植入到免疫活性的C57BL/6J小鼠的右侧腹(2×105个细胞)和左侧腹(1×105个细胞)。在植入后9天(第0天)根据右侧腹(注射的肿瘤)的肿瘤体积(TV)将动物分配到6个组中，中值TV＝108mm3。左侧腹(无注射肿瘤)的中值TV是83mm3。在第0天启动给药。10mg/kg的小鼠IgG1同种型对照和muDX400每4天腹膜内施用总共2剂。1×107pfu的PBS、NDV-WT和NDV-muIL-12每2天施用到右侧腹的肿瘤中总共4剂。在第8天收获注射的和无注射肿瘤(n＝3个/组)，通过免疫组织化学分析CD3表达。如附图26A-26B所示，肿瘤内NDV-muIL-12与muDX400组合的治疗在注射的和无注射肿瘤中产生惊人地高的CD3+ T细胞浸润。流式细胞术分析表明，大部分浸润性CD3+细胞是活化的CD8或CD4效应细胞(未显示)。
另外，对用IL-12武装NDV相比其他细胞因子(IL-23、IL-27和IL-2)与抗muPD-1单克隆抗体(mudx400)的组合在双侧B16F10中的抗肿瘤效力进行了评估。在比较与muDX400组合的NDV-muIL-12与NDV-muIL-23和muIL-27的研究中，用NDV-muIL-12+muDX400治疗在注射和无注射肿瘤中产生了最高数量的消退(完全的和部分的)(附图37A-37N)，但是注射和无注射肿瘤的肿瘤体积方面没有显著降低(p>0.05)。在这项研究中，与抗muDX400和NDV-muIL-23或NDV-muIL-27的组合相比，NDV-muIL-12和muDX400的组合在注射和无注射肿瘤中产生了最高数量的完全消退(附图37G和37N)。进一步地，在比较与muDX400组合的NDV-muIL-12和NDV-mIL-2的研究中，两种治疗对注射的肿瘤的影响是可比较的，在第18天产生可比较数量的完全和部分消退，以及可比较的中值TV和68％的置信区间(参见附图38C、38D和38I)。对于无注射肿瘤(附图38G、38H和38J)，虽然在第18天的肿瘤体积减少在两个治疗之间不是显著的(p>0.05)，与NDV-muIL-2+muDX400:中值TV＝255，68％置信区间(207，1036mm3)相比，NDV-muIL-12+muDX400产生了中值TV＝130mm3，和更紧密的68％置信区间(102,244mm3)。在这项研究中，与muDX400和NDV-muIL-IL-2的组合相比，NDV-muIL-12和muDX400的组合在无注射肿瘤中产生了更高数量的完全消退(附图38J)。
6.3.2.2 NDV-huIL-12在人类肿瘤细胞系中的溶胞活性
在26种人类癌细胞系的面板中以感染复数(MOI)2和6，在感染后48小时评估了NDV-huIL-12的溶胞活性(附图27A)。面板包括7中癌症类型:黑素瘤、HNSCC(头颈部鳞状细胞癌)、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和胰腺癌。在病毒感染后48小时通过基于ATP的定量方法评估了细胞生存力(附图27A)。对于每种细胞系，NDV-huIL-12(MOI 2和6)的溶胞活性表示为相对于模拟感染的细胞的生存力的百分比；10μM嘌呤霉素(阳性对照)的溶胞活性表示为相对于载体(DMSO)处理的细胞的生存力的百分比。
使用单基的F蛋白裂解位点，NDV-huIL-12被限制为在肿瘤细胞中单次复制周期。在这些考虑下，对NDV-huIL-12的敏感性的指标被设置为MOI 2下细胞生存力的>20％降低。按照这种指标，26种细胞系中的22种对于NDV-huIL-12的裂解是敏感的。在6的MOI下，所有细胞对NDV-huIL-12的裂解敏感(细胞生存力>20％的降低)。总之，在人类肿瘤细胞系的范围内证明了NDV-huIL-12的溶胞活性。
6.3.2.3 NDV-huIL-12处理对人类肿瘤细胞系中细胞因子和趋化因子的诱导
来自NDV-huIL-12的溶胞活性分析(MOI 2)或模拟感染的26种人类肿瘤细胞系的细胞培养物上清液在48小时时收获，通过免疫分析来分析各种细胞因子和趋化因子。IL-12p70、IFN-β和IP-10的平均浓度在附图27B中呈现。除了肺癌细胞系H322之外，在所有细胞系中，NDV-huIL-12诱导了高于免疫分析中的检测上限的IL-12p70分泌水平。在任何细胞系中NDV-huIL-12没有诱导IFN-γ(数据未显示)；这是预期的，因为IL-12受体主要由活化的T细胞和NK细胞表达。NDV-huIL 12仅在2种细胞系(乳腺SK BR-3和HNSCC SCC15；数据未显示)中诱导了IFN-α-2a，但是在三分之一的细胞系中诱导了IFN-β。另外，在20种细胞系中NDV-huIL-12诱导了中度/高水平的IP-10。
6.3.2.4 NDV-huIL-12处理对人类肿瘤组织培养和全血中免疫基因的诱导
人类肿瘤组织培养方法容许在存在药物的情况下培养完整的新鲜癌症组织达到48小时。可以评估药物对肿瘤样本中的癌细胞和现有的免疫细胞的影响。在这一平台中评估了NDV-WT和NDV-huIL-12对细胞因子和趋化因子(蛋白质表达)和免疫基因(基因表达)的诱导。在这些研究中，4种肾细胞癌样品(RCC)、3种结肠直肠癌样品(CRC)、2种乳腺癌样品和1种HNSCC样品用3×107pfu的NDV-WT或NDV-huIL-12处理达到48小时。在24和48小时时间点，采集组织培养的上清液，通过免疫分析来分析各种细胞因子和趋化因子，将肿瘤急速冷冻，分析RNA用于免疫基因的分析。IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70和IFN-γ和IP-10的平均浓度在附图28中呈现，IFN可诱导基因IRF7、IFIT2和MX2、趋化因子CXCL9、CXCL10(IP-10)和CXCL11、IL-12P40、IFN-γ和PD-L1在附图29A-29D中呈现。NDV-WT和NDV-huIL-12都诱导了IFN-α-2a和IP-10的分泌；两者都不诱导IFN-β的分泌。仅NDV-huIL 12诱导IL-12p70和IFN-γ。各种免疫基因的基因表达分析显示，在多个肿瘤类型中，NDV-huIL-12诱导强烈的1型IFN和IL-12反应，伴随诱导趋化因子和PD-L1。
类似地，在来自患有实体恶性肿瘤的患者(n＝5)和正常供体(n＝5)的全血中评估了NDV-WT和NDV-huIL-12对细胞因子和趋化因子(蛋白质表达)(附图30)和免疫基因(基因表达)(附图31A-31D)的诱导。虽然癌细胞可能存在于来自癌症患者的全血中，NDV-WT和NDV-huIL-12的免疫活化的模式在来自两组供体的血液之间是可比较的。IFN-α-2a、IFN-β、IL-12p70和IFN-γ以及IP-10，以及IFN可诱导基因、趋化因子12p40、IFN-γ和Pdl1的基因表达的诱导模式类似于人类肿瘤组织培养中观察到的，表明NDV-huIL-12部分地作用于完整肿瘤组织中的免疫细胞。
I型IFN途径作为抗肿瘤免疫反应的重要调节物出现，几项研究证明了它在抗原呈递和树突细胞成熟方面的作用(参见，例如，Zitvogel et al，Nature reviews.Immunology 15，405-414(2015)，Fuertes et al，J Exp Med 208，2005-2016(2011)，Diamond et al，J ExpMed 208，1989-2003(2011)，Kato et al，Immunity 23，19-28(2005))。在人类肿瘤组织培养平台中，用3×107pfu NDV-huIL-12处理肿瘤引起IL-12的分泌水平(11189±2877pg/ml)处在用25ng/ml(9636±1405pg/mL)和50ng/ml(15308±1726pg/ml)重组IL-12处理的范围之内(附图41A-41D)。然而，在大多数测试的供体中，仅有NDV-huIL-12处理、而不是重组IL-12(10到50ng/ml)处理诱导了IFN-α-2a和IFN-β(附图41A-41D)。另外，NDV-huIL-12处理诱导了显著更高水平的IP-10，其在向肿瘤位点的T细胞征募中起到重要作用(附图41A-41D)。
6.3.2.5 NDV-huIL-12响应标志的鉴定
使用人类肿瘤组织培养平台来鉴定在3×107pfu NDV-huIL-12处理达到48小时之后被调节至少2倍、p<0.01的基因。通过RNA测序分析基因表达。包括干扰素可诱导基因(例如，GBP4、IFIT1、IFIT2、IFIT3、OAS3和OASL)、趋化因子(例如，CXCL10和CXCL11)以及PD-L1的响应标志通过RTqPCR分析在其他肿瘤样品(n＝14)中被确认(附图39)。
6.3.2.6 GEP阴性和GEP阳性肿瘤中NDV-huIL-12响应标志的诱导使用来自抗PD-1派姆单抗治疗的患者的基线肿瘤样品的RNA，鉴定了与派姆单抗的临床效益相关的免疫相关性基因表达谱(GEP)(Ayers等，2017，J of Clinical Investigation 127:2930-2940)。T细胞激惹的GEP含有与抗原呈递、趋化因子表达、细胞毒性活性和适应性免疫抗性相关的IFN-γ响应性基因。GEP阴性的患者很少响应派姆单抗。在人类肿瘤组织培养平台中证明了，对于肿瘤治疗，与NDV-WT相比，GEP评分的提高对于NDV-huIL-12是更高的(n＝19)。另外，与培养基对照相比(p<0.0001)，用3×107pfu NDV-huIL-12处理具有GEP评分方面统计学上显著的提高，包括GEP阴性评分(GEP评分<-0.318)到GEP阳性评分(GEP评分>-0.318)的转变(附图40A-B)。
6.3.2.7 NDV-huIL12的分析性发育和表征
根据章节6.3.1.1中提供的方法产生NDV-huIL12。NDV-huIL-12可以通过流式病毒计进行定量和标准(FV，使用流式细胞计分析和测定单个颗粒)。流式病毒计的说明参见，例如Vlasak et al，2016，Vaccine 34:2321-2328。FV分析显示，大部分颗粒可以用抗NDV FIN抗体7B1(ISMMS)标记，表明大部分颗粒是NDV-huIL-12病毒(附图32)。NDV-huIL-12显示多态的颗粒大小分布，与报道的副粘病毒一致(Goff等，2012，J Virol.86(19):10852-6)。
NDV含有六种蛋白质:F、FIN、NP、L、P和M。还原条件下的SDS-PAGE分析可以分离6种蛋白质(F1(～47kDa)、HN(～63kDa)、NP(～53kDa)、L(～250kDa)、P(～42kDa)和M(～40kDa))并充当定性的纯度分析。通过SDS-PAGE分析纯化的NDV-huIL-12(附图33)。其显示与其他报道的NDV相似的蛋白质条带模式，表明疫苗中的大多数蛋白质是病毒蛋白质。
通过感染Vero细胞和测定感染后24小时收获的培养基中的IL-12，确认了NDV-huIL-12产生人类IL-12。通过ELISA分析了IL-12(附图34)。附图34显示与NDV-huIL-12的参考批次相比MOI依赖性的huIL-12表达。
表达的huIL-12的活性使用来自DiscoverX的PathHunter Dimerization分析在基于细胞的功能分析中测量(附图35)。这种分析检测工程化的细胞中huIL-12诱导的受体二聚化。在MOI 0.1-1的NDV-huIL-12感染的vero细胞的上清液中检测到功能性huIL-12(附图35)。优化了基于细胞的分析来表征纯化的病毒。
优化了基于细胞的分析来表征纯化的病毒。
6.4实施例4:临床研究
本文描述的临床前数据支持NDV-huIL-12的肿瘤内施用与免疫检查点抑制物PD-1阻断的全身性静脉内共同施用的组合(参见，例如，章节6.3)。在患有晚期实体肿瘤、具有可接近的皮肤和皮下恶性病变以允许NDV-huIL-12肿瘤内施用的患者中，在临床实验中评估了派姆单抗与NDV-huIL-12的组合。这些实体肿瘤包括复发的/难治性实体肿瘤类型，例如，黑素瘤、头颈部鳞状细胞癌(SSCHN)、乳腺癌、子宫癌、胃癌、食道癌、肝癌、脑癌、具有真皮转移的肉瘤、以及其他具有可接近的真皮/皮下/结节转移的恶性肿瘤。对于批准了抗PD-1/PD L1疗法的指征，难治性的或从这些疗法中复发的患者、以及对这些药剂没有预期响应的患者的治疗被包括在这项研究中。还评估了具有复发的、难治性和/或复发且难治性的肿瘤类型、以及通常不响应抗PD-1/PD-L1但可经受肿瘤内注射的肿瘤的患者。考虑了通过图像引导可接近的其他肿瘤类型，例如，具有肝脏转移的那些。
6.4.1 NDV-huIL-12的生产和病毒纯化
NDV-huIL-12可以在有胚蛋或细胞培养物中产生。在有胚蛋中，NDV-huIL-12可以在无特异病原的有胚鸡蛋的尿囊腔中增殖。可以使用例如上文的章节6.3.1.20中描述的方法纯化NDV-huIL-12。NDV-huIL-12临床药物产品(DP)可以在灭菌注射液中提供。
NDV-huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12p40亚基的核苷酸序列，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列，任选地其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:54或64中列出的核苷酸序列。NDV-huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12 p40亚基的核苷酸序列，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列，任选地其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:57或59中列出的核苷酸序列。NDV-huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12 p40亚基的核苷酸序列，所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列，任选地其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:27中列出的核苷酸序列。
NDV-huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12p35亚基的核苷酸序列，所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列，任选地其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:55或65中列出的核苷酸序列。NDV-huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含编码IL-12 p35亚基的核苷酸序列，所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列，任选地其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:29中列出的核苷酸序列。
NDV huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含SEQ ID NO:51中列出的核苷酸序列。做为选择，所述NDV huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含SEQ IDNO:52中列出的核苷酸序列。做为选择，所述NDV huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含SEQ ID NO:60中列出的核苷酸序列。
NDV-huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含编码氨基酸序列的转基因，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列，任选地其中所述转基因包含SEQ ID NO:53或66中列出的核苷酸序列。NDV-huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含编码氨基酸序列的转基因，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列，任选地其中所述转基因包含SEQ ID NO:63或68中列出的核苷酸序列。NDV-huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含编码氨基酸序列的转基因，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列，任选地其中所述转基因包含SEQ ID NO:26中列出的核苷酸序列。NDV-huIL-12可以包含包装基因组，所述包装基因组包含编码氨基酸序列的转基因，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列，任选地其中所述转基因包含SEQ ID NO:61中列出的核苷酸序列。
6.5实施例5:BSRT7细胞和尿囊液中的rNDV-muIL12表达
评估了感染rNDV-muIL-12的BSRT7细胞中muIL-12的表达。如章节6.3.1.1中描述的产生rNDV-muIL-12。BSRT7细胞以3或10的感染复数(“MOI”)用rNDV-muIL-12感染(也称为“NDV-muIL 12”)，感染后24或48小时采集上清液。使用小鼠IL-12p70 Quantikine ELISA试剂盒(R&DSystems，目录号M1270)测量采集的上清液中的muIL-12浓度。在测试的条件下感染rNDV-muIL-12的BSRT7细胞产生了可检测水平的muIL-12(附图36)。不受任何特定理论的限制，假设是，与在更低MOI下感染的细胞相比，在更高MOI下感染的细胞中更低的muIL-12浓度是由于，与在更低的MO下感染的、产生muIL-12的活细胞的数量相比，在更高的MOI下感染的产生muIL-12的活细胞的数量更低(数据未显示)。
还在用来自早先传代、1:100000稀释度的100μl rNDV-muIL-12感染的10天龄有胚蛋的尿囊液中检测了muIL-12。蛋在37摄氏度下孵育2天，此后根据早先描述的方法从蛋中采集尿囊液(附图36)。使用小鼠IL-12p70Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems，目录号M1270)测量尿囊液中的muIL-12浓度。
7.实施方式
本文提供的是以下示范性的实施方式:
1.一种治疗癌症的方法，包括向有需要的人类对象施用包含嵌合新城疫病毒(NDV)的第一组合物以及包含人类PD-1或其配体的拮抗剂第二组合物，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类白细胞介素-12(“IL-12”)的转基因，所述转基因编码人类IL-12 p40亚基和人类IL-12 p35亚基。
2.实施方式1的方法，其中所述嵌合NDV包含缓发型的NDV主干。
3.实施方式1或2的方法，其中所述嵌合NDV包含LaSota毒株的NDV主干。
4.实施方式1或2的方法，其中所述嵌合NDV包含Hitchner B1毒株的NDV主干。
5.实施方式1或2的方法，其中所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列，所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中，其中所述突变F蛋白包含突变的裂解位点。
6.实施方式5的方法，其中所述突变的裂解位点是111H-N-R-T-K-R/F-I118(SEQ ID NO:71)。
7.实施方式1或2的方法，其中所述嵌合NDV包含r73T-R116病毒的NDV主干。
8.实施方式1到4的任一项的方法，其中所述包装基因组包含编码具有氨基酸突变L289A的突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中。
9.实施方式1到8的任一项的方法，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:29中列出的氨基酸序列。
10.实施方式9的方法，其中所述转基因包含SEQ ID NO:61中列出的核苷酸序列。
11.实施方式1到8的任一项的方法，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列。
12.实施方式11的方法，其中所述转基因包含SEQ ID NO:26中列出的核苷酸序列。
13.实施方式1到8的任一项的方法，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列。
14.实施方式13的方法，其中所述转基因包含SEQ ID NO:63中列出的核苷酸序列。
15.实施方式13的方法，其中所述转基因包含SEQ ID NO:68中列出的核苷酸序列。
16.实施方式1到8的任一项的方法，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列。
17.实施方式16的方法，其中所述转基因包含SEQ ID NO:53中列出的核苷酸序列。
18.实施方式16的方法，其中所述转基因包含SEQ ID NO:66中列出的核苷酸序列。
19.实施方式1到8的任一项的方法，其中所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列。
20.实施方式1到8的任一项的方法，其中所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列。
21.实施方式19或20的方法，其中所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列。
22.实施方式19或20的方法，其中所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。
23.实施方式1到22的任一项的方法，其中所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间。
24.实施方式23的方法，其中所述包装基因组包含NDV NP基因的转录单元、NDV P基因的转录单元、NDV M基因的转录单元、NDV F基因的转录单元、NDV HN基因的转录单元、以及NDV L基因的转录单元。
25.实施方式24的方法，其中所述包装基因组的所述两个转录单元是NDV P基因和NDVM基因的转录单元。
26.实施方式1的方法，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:51中列出的核苷酸序列。
27.实施方式1的方法，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:52中列出的核苷酸序列。
28.实施方式1的方法，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:60中列出的核苷酸序列。
29.实施方式1到28的任一项的方法，其中所述人类PD-1或其配体的拮抗剂是结合人类PD-1的抗体。
30.实施方式29的方法，其中所述抗体阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用。
31.实施方式29或30的方法，其中所述抗体是派姆单抗。
32.实施方式29或30的方法，其中所述抗体是纳武单抗或MEDI0680。
33.实施方式29或30的方法，其中所述抗体包含可变轻链区(VLCR)互补决定区(CDR)1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)，VLCR CDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，VLCRCDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)，可变重链区(VHCR)CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)，VHCRCDR3，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:7)和VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQ IDNO:8)。
34.实施方式29或30的方法，其中所述抗体包含:
(a)VLCR，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:4)；和
(b)VHCR，其包含氨基酸序列
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFD MGFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:9)。
35.实施方式29或30的方法，其中所述抗体包含:
(a)轻链，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:5)；和
(b)重链，其包含氨基酸序列
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:10)。
36.实施方式29或30的方法，其中所述抗体包含VLCR CDR1，其包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:11)，VLCR CDR2，其包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:12)，VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QQSSNWPRT(SEQ ID NO:13)，VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NSGMH(SEQ ID NO:16)，VHCR CDR2，其包含氨基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG(SEQ ID NO:17)，和VHCR CDR3，其包含氨基酸序列NDDY(SEQ ID NO:18)。
37.实施方式29或30的方法，其中所述抗体包含:
(a)VLCR，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:14)；和
(b)VHCR，其包含氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQ GTLVTVSS(SEQ ID NO:19)。
38.实施方式29或30的方法，其中所述抗体包含:
(a)轻链，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:15)；和
(b)重链，其包含氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:20)。
39.实施方式1到28的任一项的方法，其中所述人类PD-L1或其配体的拮抗剂是结合人类PD-L1的抗体。
40.实施方式39的方法，其中所述抗体是度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、bms-936559、或阿特珠单抗。
41.实施方式1到40的任一项的方法，其中所述第一组合物肿瘤内地或结节内地施用给所述对象。
42.实施方式41的方法，其中所述对象展现皮肤的或皮下的肿瘤或淋巴结内的肿瘤。
43.实施方式1到42的任一项的方法，其中所述第二组合物静脉内地施用给所述对象。
44.实施方式1到42的任一项的方法，其中所述第二组合物皮下地施用给所述对象。
45.实施方式1到44的任一项的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肾癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、肝细胞癌、胰腺癌、肾脏癌症、结肠直肠癌症、乳腺癌或头颈癌。
46.实施方式1到44的任一项的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌、经典的霍奇金淋巴瘤、高度微卫星不稳定性的癌症、黑素瘤、胃癌、尿路上皮癌、或头颈部鳞状细胞癌。
47.实施方式1到44的任一项的方法，其中所述癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤或宫颈癌。
48.实施方式1到44的任一项的方法，其中所述癌症是黑素瘤、非小细胞肺癌、头颈癌(HNSCC头颈部鳞状细胞癌)、尿路上皮癌、三阴性乳腺癌、胃癌、胃食管接点腺癌、经典的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、间皮瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、食道癌、鼻咽癌、肛门癌、胆道癌、结肠直肠癌症、ER+/HER2-乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、唾液癌、子宫内膜癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、高度微卫星不稳定性的(MSI-H)或错配修复缺陷的癌症(组织无关)、或高肿瘤突变负担的肿瘤(组织无关)。
49.实施方式45的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
50.实施方式45的方法，其中所述头颈癌是头颈部鳞状细胞癌，所述肾脏癌症是肾细胞癌，所述结肠直肠癌症是结肠直肠癌，或所述乳腺癌症是乳腺癌、三阴性乳腺癌、或ER+/HER2-乳腺癌。
51.实施方式1到44的任一项的方法，其中所述癌症是选自以下构成的组的实体肿瘤:黑素瘤、肉瘤、子宫癌、胃癌、食道癌、肝癌、脑癌、头颈部鳞状细胞癌和乳腺癌。
52.实施方式1到44的任一项的方法，其中所述癌症是非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。
53.实施方式1到52的任一项的方法，其中所述癌症是转移性的。
54.实施方式1到51的任一项的方法，其中所述癌症是不可切除的。
55.实施方式1到52的任一项的方法，其中所述癌症包含真皮的、皮下的或结节的转移。
56.实施方式1到55的任一项的方法，其中所述癌症是难治性的或复发的、或这两者。
57.实施方式1到56的任一项的方法，其中所述癌症的活检物是PD-L1阳性的。
58.实施方式57的方法，其中所述活检物具有至少1％的肿瘤比例评分。
59.实施方式57的方法，其中所述活检物具有至少1的联合阳性评分。
60.实施方式1到56的任一项的方法，其中所述癌症的活检物是PD-L1阴性的。
61.实施方式60的方法，其中所述活检物具有小于1％的肿瘤比例评分。
62.实施方式60的方法，其中所述活检物具有小于1的联合阳性评分。
63.实施方式1到62的任一项的方法，其中所述对象对于抗体的单一治疗是难治性的，所述抗体结合PD-1并阻断PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用。
64.实施方式63的方法，其中所述嵌合NDV的施用诱导IL-12p70表达、IFN-γ表达或IL-12p70与IFN-γ表达两者。
65.实施方式63的方法，其中所述嵌合NDV的施用提高表15的18-基因标志的基因表达谱(GEP)评分。
66.实施方式1到62的任一项的方法，其中所述对象对于人类PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性的或未响应的。
67.实施方式66的方法，其中所述PD-1或其配体的拮抗剂是纳武单抗、AMP-224、MEDI0680、派姆单抗、度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、bms-936559或阿特珠单抗。
68.一种嵌合NDV，其包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列。
69.实施方式68的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:61中列出的核苷酸序列。
70.一种嵌合NDV，其包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列。
71.实施方式70的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:26中列出的核苷酸序列。
72.一种嵌合NDV，其包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列。
73.实施方式72的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:63中列出的核苷酸序列。
74.实施方式72的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:68中列出的核苷酸序列。
75.一种嵌合NDV，其包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列。
76.实施方式75的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:53中列出的核苷酸序列。
77.实施方式75的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:66中列出的核苷酸序列。
78.实施方式68到77的任一项的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含缓发型的NDV主干。
79.实施方式68到78的任一项的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含LaSota毒株的NDV主干。
80.实施方式68到78的任一项的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含Hitchner B1毒株的NDV主干。
81.实施方式68到78的任一项的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列，所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中，其中所述突变F蛋白包含突变的裂解位点。
82.实施方式81的嵌合NDV，其中所述突变的裂解位点是111H-N-R-T-K-R/F-I118(SEQ IDNO:71)。
83.实施方式68到77的任一项的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含r73T-R116病毒的NDV主干。
84.实施方式68到80的任一项的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含编码具有氨基酸突变L289A的突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中。
85.实施方式68到71的任一项的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:51中列出的核苷酸序列。
86.实施方式72、73、75或76的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:52中列出的核苷酸序列。
87.实施方式72、74、75或77的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:60中列出的核苷酸序列。
88.实施方式68到84的任一项的嵌合NDV，其中所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间。
89.实施方式88的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含NDV NP基因的转录单元、NDV P基因的转录单元、NDV M基因的转录单元、NDV F基因的转录单元、NDV HN基因的转录单元、以及NDV L基因的转录单元。
90.实施方式89的嵌合NDV，其中所述包装基因组的所述两个转录单元是NDV P基因和NDV M基因的转录单元。
91.一种应用于治疗人类对象的癌症的方法的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类白细胞介素-12(“IL-12”)的转基因，其中所述转基因编码人类IL-12 p40亚基和人类IL-12p35亚基，以及其中所述方法进一步包含施用人类PD-1或其配体的拮抗剂。
92.实施方式91的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含缓发型的NDV主干。
93.实施方式91或92的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含Hitchner B1的NDV主干。
94.实施方式91或92的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含LaSota毒株的NDV主干。
95.实施方式91或92的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含编码突变F蛋白的核苷酸序列，所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中，其中所述突变F蛋白包含突变的裂解位点。
96.实施方式95的嵌合NDV，其中所述突变的裂解位点是111H-N-R-T-K-R/F-I118(SEQ IDNO:71)。
97.实施方式91的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含r73T-R116病毒的NDV主干。
98.实施方式91到94的任一项的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含编码具有氨基酸突变L289A的突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中。
99.实施方式91到98的任一项的嵌合NDV，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列。
100.实施方式99的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:61中列出的核苷酸序列。
101.实施方式91到98的任一项的嵌合NDV，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列。
102.实施方式101的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:26中列出的核苷酸序列。
103.实施方式91到98的任一项的嵌合NDV，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列。
104.实施方式103的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:63中列出的核苷酸序列。
105.实施方式103的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:68中列出的核苷酸序列。
106.实施方式91到98的任一项的嵌合NDV，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:42中列出的氨基酸序列。
107.实施方式106的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:53中列出的核苷酸序列。
108.实施方式106的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:66中列出的核苷酸序列。
109.实施方式91到98的任一项的嵌合NDV，其中所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:38中列出的氨基酸序列。
110.实施方式91到98的任一项的嵌合NDV，其中所述IL-12 p40亚基包含SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列。
111.实施方式109或110的嵌合NDV，其中所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列。
112.实施方式109或110的嵌合NDV，其中所述IL-12 p35亚基包含SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列。
113.实施方式91到112的任一项的嵌合NDV，其中所述转基因被插入所述包装基因组的两个转录单元之间。
114.实施方式113的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含NDV NP基因的转录单元、NDV P基因的转录单元、NDV M基因的转录单元、NDV F基因的转录单元、NDV HN基因的转录单元、以及NDV L基因的转录单元。
115.实施方式114的嵌合NDV，其中所述包装基因组的所述两个转录单元是NDV P基因和NDV M基因的转录单元。
116.实施方式91的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:51中列出的核苷酸序列。
117.实施方式91的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:52中列出的核苷酸序列。
118.实施方式91的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:60中列出的核苷酸序列。
119.实施方式91到118的任一项的嵌合NDV，其中人类PD-1或其配体的拮抗剂是结合PD-1的抗体。
120.实施方式119的嵌合NDV，其中所述抗体阻断人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用。
121.实施方式119或120的嵌合NDV，其中所述抗体是派姆单抗。
122.实施方式119或120的嵌合NDV，其中所述抗体是纳武单抗或MEDI0680。
123.实施方式119或120的嵌合NDV，其中所述抗体包含可变轻链区(VLCR)互补决定区(CDR)1，其包含氨基酸序列RASKGVSTSGYSYLH(SEQ ID NO:1)，VLCR CDR2，其包含氨基酸序列LASYLES(SEQ ID NO:2)，VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:3)，可变重链区(VHCR)CDR1，其包含氨基酸序列NYYMY(SEQ ID NO:6)，VHCR CDR3，其包含氨基酸序列GINPSNGGTNFNEKFKN(SEQ ID NO:7)和VHCR CDR3，其包含氨基酸序列RDYRFDMGFDY(SEQID NO:8)。
124.实施方式119或120的嵌合NDV，其中所述抗体包含:
(a)VLCR，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:4)；和
(b)VHCR，其包含氨基酸序列
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFD MGFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:9)。
125.实施方式119或120的嵌合NDV，其中所述抗体包含:
(a)轻链，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:5)；和
(b)重链，其包含氨基酸序列
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:10)。
126.实施方式119或120的嵌合NDV，其中所述抗体包含VLCRCDR1，其包含氨基酸序列RASQSVSSYLA(SEQ ID NO:11)，VLCR CDR2，其包含氨基酸序列DASNRAT(SEQ ID NO:12)，VLCR CDR3，其包含氨基酸序列QQSSNWPRT(SEQ ID NO:13)，VHCR CDR1，其包含氨基酸序列NSGMH(SEQ ID NO:16)，VHCR CDR2，其包含氨基酸序列VIWYDGSKRYYADSVKG(SEQ ID NO:17)，和VHCR CDR3，其包含氨基酸序列NDDY(SEQ ID NO:18)。
127.实施方式119或120的嵌合NDV，其中所述抗体包含:
(a)VLCR，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:14)；和
(b)VHCR，其包含氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:19)。
128.实施方式119或120的嵌合NDV，其中所述抗体包含:
(a)轻链，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:15)；和
(b)重链，其包含氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:20)。
129.实施方式91到118的任一项的嵌合NDV，其中所述人类PD-1或其配体的拮抗剂是结合人类PD-L1的抗体。
130.实施方式129的嵌合NDV，其中所述抗体是度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、bms-936559、或阿特珠单抗。
131.实施方式91到130的任一项的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV肿瘤内地或结节内地施用给所述对象。
132.实施方式131的嵌合NDV，其中所述对象展现皮肤的或皮下的肿瘤或淋巴结内的肿瘤。
133.实施方式91到131的任一项的嵌合NDV，其中所述人类PD-1或其配体的拮抗剂静脉内地施用给所述对象。
134.实施方式91到131的任一项的嵌合NDV，其中所述人类PD-1或其配体的拮抗剂皮下地施用给所述对象。
135.实施方式91到134的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症是黑素瘤、肾癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、肝细胞癌、胰腺癌、肾脏癌症、结肠直肠癌症、乳腺癌或头颈癌。
136.实施方式91到134的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症是非小细胞肺癌、经典的霍奇金淋巴瘤、高度微卫星不稳定性的癌症、黑素瘤、胃癌、尿路上皮癌、或头颈部鳞状细胞癌。
137.实施方式91到134的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤或宫颈癌。
138.实施方式91到124的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症是黑素瘤、非小细胞肺癌、头颈癌(HNSCC头颈部鳞状细胞癌)、尿路上皮癌、三阴性乳腺癌、胃癌、胃食管接点腺癌、经典的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、间皮瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、食道癌、鼻咽癌、肛门癌、胆道癌、结肠直肠癌症、ER+/HER2-乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、唾液癌、子宫内膜癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、高度微卫星不稳定性的(MSI-H)或错配修复缺陷的癌症(组织无关)、或高肿瘤突变负担的肿瘤(组织无关)。
139.实施方式135的嵌合NDV，其中所述肺癌是非小细胞肺癌。
140.实施方式135的嵌合NDV，其中所述头颈癌是头颈部鳞状细胞癌，所述肾脏癌症是肾细胞癌，所述结肠直肠癌症是结肠直肠癌，或所述乳腺癌症是乳腺癌、三阴性乳腺癌、或ER+/HER2-乳腺癌。
141.实施方式91到134的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症是选自以下构成的组的实体肿瘤:黑素瘤、肉瘤、子宫癌、胃癌、食道癌、肝癌、脑癌、头颈部鳞状细胞癌和乳腺癌。
142.实施方式91到134的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症是非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤。
143.实施方式91到142的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症是转移性的。
144.实施方式91到141的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症是不可切除的。
145.实施方式91到142的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症包含真皮的、皮下的或结节的转移。
146.实施方式91到145的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症是难治性的或复发的、或这两者。
147.实施方式91到145的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症的活检物是PD-L1阳性的。
148.实施方式147的嵌合NDV，其中所述活检物具有至少1％的肿瘤比例评分。
149.实施方式147的嵌合NDV，其中所述活检物具有至少1的联合阳性评分。
150.实施方式91到146的任一项的嵌合NDV，其中所述癌症的活检物是PD-L1阴性的。
151.实施方式150的嵌合NDV，其中所述活检物具有小于1％的肿瘤比例评分。
152.实施方式150的嵌合NDV，其中所述活检物具有小于1的联合阳性评分。
153.实施方式91到152的任一项的嵌合NDV，其中所述对象对于抗体的单一治疗是难治性的，所述抗体结合PD-1并阻断PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用。
154.实施方式153的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV的施用诱导IL-12p70表达、IFN-γ表达、或IL-12p70与IFN-γ表达两者。
155.实施方式153的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV的施用提高表15的18-基因标志的GEP评分。
156.实施方式91到152的任一项的嵌合NDV，其中所述对象对于PD-1或其配体的拮抗剂的单一治疗是难治性的或未响应的。
157.实施方式156的嵌合NDV，其中所述PD-1或其配体的拮抗剂是纳武单抗、AMP-224、MEDI0680、派姆单抗、度伐鲁单抗、阿维鲁单抗、bms-936559或阿特珠单抗。
本发明在范围上不受本文描述的具体实施方式的限制。实际上，除本文描述的之外对本发明的各种修改根据上述的说明书和附图对于本领域技术人员是显而易见的。这种修改也将落在附随的权利要求的范围之中。
在此引用的所有参考文献在此为了所有目的通过将它们完全引用来合并在此，其程度与具体的或单独的指示为了所有目的通过将其完全引用来合并每个单独的出版物或专利或专利申请相同。
序列表
<110> 西奈山伊坎医学院
纪念斯隆-凯特林癌症中心
默沙东公司
<120> 新城疫病毒及其用途
<130> 6923-272-228
<140>
<141>
<150> 62/507,690
<151> 2017-05-17
<150> 62/505,759
<151> 2017-05-12
<160> 72
<170> PatentIn version 3.5
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Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 20
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述 : 合成的多肽"
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 21
<211> 18632
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述 : 合成的多核苷酸"
<400> 21
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 60
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 180
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 240
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 300
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 360
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 420
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 480
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 540
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 600
cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 660
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 720
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 780
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 840
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 900
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 960
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 1020
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 1080
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 1140
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 1200
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 1260
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 1320
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 1380
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 1440
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 1500
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 1560
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 1620
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 1680
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 1740
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 1800
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 1860
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 1920
aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 1980
cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 2040
atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 2100
cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 2160
gagcagattg tactgagagt gcaccataaa attgtaaacg ttaatatttt gttaaaattc 2220
gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc 2280
ccttataaat caaaagaata gcccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 2340
agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt ctatcagggc 2400
gatggcccac tacgtgaacc atcacccaaa tcaagttttt tggggtcgag gtgccgtaaa 2460
gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg aaagccggcg 2520
aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc gctggcaagt 2580
gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc gctacagggc 2640
gcgtactatg gttgctttga cgtatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa 2700
aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg 2760
tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa 2820
gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgccaagc 2880
tttaatacga ctcactatag ggaccaaaca gagaatccgt gagttacgat aaaaggcgaa 2940
ggagcaattg aagtcgcacg ggtagaaggt gtgaatctcg agtgcgagcc cgaagcacaa 3000
actcgagaaa gccttctgcc aacatgtctt ccgtatttga tgagtacgaa cagctcctcg 3060
cggctcagac tcgccccaat ggagctcatg gagggggaga aaaagggagt accttaaaag 3120
tagacgtccc ggtattcact cttaacagtg atgacccaga agatagatgg agctttgtgg 3180
tattctgcct ccggattgct gttagcgaag atgccaacaa accactcagg caaggtgctc 3240
tcatatctct tttatgctcc cactcacagg taatgaggaa ccatgttgcc cttgcaggga 3300
aacagaatga agccacattg gccgtgcttg agattgatgg ctttgccaac ggcacgcccc 3360
agttcaacaa taggagtgga gtgtctgaag agagagcaca gagatttgcg atgatagcag 3420
gatctctccc tcgggcatgc agcaacggaa ccccgttcgt cacagccggg gccgaagatg 3480
atgcaccaga agacatcacc gataccctgg agaggatcct ctctatccag gctcaagtat 3540
gggtcacagt agcaaaagcc atgactgcgt atgagactgc agatgagtcg gaaacaaggc 3600
gaatcaataa gtatatgcag caaggcaggg tccaaaagaa atacatcctc taccccgtat 3660
gcaggagcac aatccaactc acgatcagac agtctcttgc agtccgcatc tttttggtta 3720
gcgagctcaa gagaggccgc aacacggcag gtggtacctc tacttattat aacctggtag 3780
gggacgtaga ctcatacatc aggaataccg ggcttactgc attcttcttg acactcaagt 3840
acggaatcaa caccaagaca tcagcccttg cacttagtag cctctcaggc gacatccaga 3900
agatgaagca gctcatgcgt ttgtatcgga tgaaaggaga taatgcgccg tacatgacat 3960
tacttggtga tagtgaccag atgagctttg cgcctgccga gtatgcacaa ctttactcct 4020
ttgccatggg tatggcatca gtcctagata aaggtactgg gaaataccaa tttgccaggg 4080
actttatgag cacatcattc tggagacttg gagtagagta cgctcaggct cagggaagta 4140
gcattaacga ggatatggct gccgagctaa agctaacccc agcagcaagg aggggcctgg 4200
cagctgctgc ccaacgggtc tccgaggaga ccagcagcat agacatgcct actcaacaag 4260
tcggagtcct cactgggctt agcgaggggg ggtcccaagc tctacaaggc ggatcgaata 4320
gatcgcaagg gcaaccagaa gccggggatg gggagaccca attcctggat ctgatgagag 4380
cggtagcaaa tagcatgagg gaggcgccaa actctgcaca gggcactccc caatcggggc 4440
ctcccccaac tcctgggcca tcccaagata acgacaccga ctgggggtat tgatggacaa 4500
aacccagcct gcttccacaa aaacatccca atgccctcac ccgtagtcga cccctcgatt 4560
tgcggctcta tatgaccaca ccctcaaaca aacatccccc tctttcctcc ctccccctgc 4620
tgtacaacta cgtacgccct agataccaca ggcacaatgc ggctcactaa caatcaaaac 4680
agagccgagg gaattagaaa aaagtacggg tagaagaggg atattcagag atcagggcaa 4740
gtctcccgag tctctgctct ctcctctacc tgatagacca ggacaaacat ggccaccttt 4800
acagatgcag agatcgacga gctatttgag acaagtggaa ctgtcattga caacataatt 4860
acagcccagg gtaaaccagc agagactgtt ggaaggagtg caatcccaca aggcaagacc 4920
aaggtgctga gcgcagcatg ggagaagcat gggagcatcc agccaccggc cagtcaagac 4980
aaccccgatc gacaggacag atctgacaaa caaccatcca cacccgagca aacgaccccg 5040
catgacagcc cgccggccac atccgccgac cagcccccca cccaggccac agacgaagcc 5100
gtcgacacac agctcaggac cggagcaagc aactctctgc tgttgatgct tgacaagctc 5160
agcaataaat cgtccaatgc taaaaagggc ccatggtcga gcccccaaga ggggaatcac 5220
caacgtccga ctcaacagca ggggagtcaa cccagtcgcg gaaacagtca ggaaagaccg 5280
cagaaccaag tcaaggccgc ccctggaaac cagggcacag acgtgaacac agcatatcat 5340
ggacaatggg aggagtcaca actatcagct ggtgcaaccc ctcatgctct ccgatcaagg 5400
cagagccaag acaataccct tgtatctgcg gatcatgtcc agccacctgt agactttgtg 5460
caagcgatga tgtctatgat ggaggcgata tcacagagag taagtaaggt tgactatcag 5520
ctagatcttg tcttgaaaca gacatcctcc atccctatga tgcggtccga aatccaacag 5580
ctgaaaacat ctgttgcagt catggaagcc aacttgggaa tgatgaagat tctggatccc 5640
ggttgtgcca acatttcatc tctgagtgat ctacgggcag ttgcccgatc tcacccggtt 5700
ttagtttcag gccctggaga cccctctccc tatgtgacac aaggaggcga aatggcactt 5760
aataaacttt cgcaaccagt gccacatcca tctgaattga ttaaacccgc cactgcatgc 5820
gggcctgata taggagtgga aaaggacact gtccgtgcat tgatcatgtc acgcccaatg 5880
cacccgagtt cttcagccaa gctcctaagc aagttagatg cagccgggtc gatcgaggaa 5940
atcaggaaaa tcaagcgcct tgctctaaat ggctaattac tactgccaca cgtagcgggt 6000
ccctgtccac tcggcatcac acggaatctg caccgagttc ccccccgcgg acccaaggtc 6060
caactctcca agcggcaatc ctctctcgct tcctcagccc cactgaatga tcgcgtaacc 6120
gtaattaatc tagctacatt taagattaag aaaaaatacg ggtagaattg gagtgcccca 6180
attgtgccaa gatggactca tctaggacaa ttgggctgta ctttgattct gcccattctt 6240
ctagcaacct gttagcattt ccgatcgtcc tacaagacac aggagatggg aagaagcaaa 6300
tcgccccgca atataggatc cagcgccttg acttgtggac tgatagtaag gaggactcag 6360
tattcatcac cacctatgga ttcatctttc aagttgggaa tgaagaagcc accgtcggca 6420
tgatcgatga taaacccaag cgcgagttac tttccgctgc gatgctctgc ctaggaagcg 6480
tcccaaatac cggagacctt attgagctgg caagggcctg tctcactatg atagtcacat 6540
gcaagaagag tgcaactaat actgagagaa tggttttctc agtagtgcag gcaccccaag 6600
tgctgcaaag ctgtagggtt gtggcaaaca aatactcatc agtgaatgca gtcaagcacg 6660
tgaaagcgcc agagaagatt cccgggagtg gaaccctaga atacaaggtg aactttgtct 6720
ccttgactgt ggtaccgaag agggatgtct acaagatccc agctgcagta ttgaaggttt 6780
ctggctcgag tctgtacaat cttgcgctca atgtcactat taatgtggag gtagacccga 6840
ggagtccttt ggttaaatct ctgtctaagt ctgacagcgg atactatgct aacctcttct 6900
tgcatattgg acttatgacc actgtagata ggaaggggaa gaaagtgaca tttgacaagc 6960
tggaaaagaa aataaggagc cttgatctat ctgtcgggct cagtgatgtg ctcgggcctt 7020
ccgtgttggt aaaagcaaga ggtgcacgga ctaagctttt ggcacctttc ttctctagca 7080
gtgggacagc ctgctatccc atagcaaatg cttctcctca ggtggccaag atactctgga 7140
gtcaaaccgc gtgcctgcgg agcgttaaaa tcattatcca agcaggtacc caacgcgctg 7200
tcgcagtgac cgccgaccac gaggttacct ctactaagct ggagaagggg cacacccttg 7260
ccaaatacaa tccttttaag aaataagctg cgtctctgag attgcgctcc gcccactcac 7320
ccagatcatc atgacacaaa aaactaatct gtcttgatta tttacagtta gtttacctgt 7380
ctatcaagtt agaaaaaaca cgggtagaag attctggatc ccggttggcg ccctccaggt 7440
gcaagatggg ctccagacct tctaccaaga acccagcacc tatgatgctg actatccggg 7500
ttgcgctggt actgagttgc atctgtccgg caaactccat tgatggcagg cctcttgcag 7560
ctgcaggaat tgtggttaca ggagacaaag ccgtcaacat atacacctca tcccagacag 7620
gatcaatcat agttaagctc ctcccgaatc tgcccaagga taaggaggca tgtgcgaaag 7680
cccccttgga tgcatacaac aggacattga ccactttgct cacccccctt ggtgactcta 7740
tccgtaggat acaagagtct gtgactacat ctggaggggg gagacagggg cgccttatag 7800
gcgccattat tggcggtgtg gctcttgggg ttgcaactgc cgcacaaata acagcggccg 7860
cagctctgat acaagccaaa caaaatgctg ccaacatcct ccgacttaaa gagagcattg 7920
ccgcaaccaa tgaggctgtg catgaggtca ctgacggatt atcgcaacta gcagtggcag 7980
ttgggaagat gcagcagttt gttaatgacc aatttaataa aacagctcag gaattagact 8040
gcatcaaaat tgcacagcaa gttggtgtag agctcaacct gtacctaacc gaattgacta 8100
cagtattcgg accacaaatc acttcacctg ctttaaacaa gctgactatt caggcacttt 8160
acaatctagc tggtggaaat atggattact tattgactaa gttaggtgta gggaacaatc 8220
aactcagctc attaatcggt agcggcttaa tcaccggtaa ccctattcta tacgactcac 8280
agactcaact cttgggtata caggtaactg ccccttcagt cgggaaccta aataatatgc 8340
gtgccaccta cttggaaacc ttatccgtaa gcacaaccag gggatttgcc tcggcacttg 8400
tcccaaaagt ggtgacacag gtcggttctg tgatagaaga acttgacacc tcatactgta 8460
tagaaactga cttagattta tattgtacaa gaatagtaac gttccctatg tcccctggta 8520
tttattcctg cttgagcggc aatacgtcgg cctgtatgta ctcaaagacc gaaggcgcac 8580
ttactacacc atacatgact atcaaaggtt cagtcatcgc caactgcaag atgacaacat 8640
gtagatgtgt aaaccccccg ggtatcatat cgcaaaacta tggagaagcc gtgtctctaa 8700
tagataaaca atcatgcaat gttttatcct taggcgggat aactttaagg ctcagtgggg 8760
aattcgatgt aacttatcag aagaatatct caatacaaga ttctcaagta ataataacag 8820
gcaatcttga tatctcaact gagcttggga atgtcaacaa ctcgatcagt aatgctttga 8880
ataagttaga ggaaagcaac agaaaactag acaaagtcaa tgtcaaactg actagcacat 8940
ctgctctcat tacctatatc gttttgacta tcatatctct tgtttttggt atacttagcc 9000
tgattctagc atgctaccta atgtacaagc aaaaggcgca acaaaagacc ttattatggc 9060
ttgggaataa tactctagat cagatgagag ccactacaaa aatgtgaaca cagatgagga 9120
acgaaggttt ccctaatagt aatttgtgtg aaagttctgg tagtctgtca gttcagagag 9180
ttaagaaaaa actaccggtt gtagatgacc aaaggacgat atacgggtag aacggtaaga 9240
gaggccgccc ctcaattgcg agccaggctt cacaacctcc gttctaccgc ttcaccgaca 9300
acagtcctca atcatggacc gcgccgttag ccaagttgcg ttagagaatg atgaaagaga 9360
ggcaaaaaat acatggcgct tgatattccg gattgcaatc ttattcttaa cagtagtgac 9420
cttggctata tctgtagcct cccttttata tagcatgggg gctagcacac ctagcgatct 9480
tgtaggcata ccgactagga tttccagggc agaagaaaag attacatcta cacttggttc 9540
caatcaagat gtagtagata ggatatataa gcaagtggcc cttgagtctc cgttggcatt 9600
gttaaatact gagaccacaa ttatgaacgc aataacatct ctctcttatc agattaatgg 9660
agctgcaaac aacagtgggt ggggggcacc tatccatgac ccagattata taggggggat 9720
aggcaaagaa ctcattgtag atgatgctag tgatgtcaca tcattctatc cctctgcatt 9780
tcaagaacat ctgaatttta tcccggcgcc tactacagga tcaggttgca ctcgaatacc 9840
ctcatttgac atgagtgcta cccattactg ctacacccat aatgtaatat tgtctggatg 9900
cagagatcac tcacattcat atcagtattt agcacttggt gtgctccgga catctgcaac 9960
agggagggta ttcttttcta ctctgcgttc catcaacctg gacgacaccc aaaatcggaa 10020
gtcttgcagt gtgagtgcaa ctcccctggg ttgtgatatg ctgtgctcga aagtcacgga 10080
gacagaggaa gaagattata actcagctgt ccctacgcgg atggtacatg ggaggttagg 10140
gttcgacggc cagtaccacg aaaaggacct agatgtcaca acattattcg gggactgggt 10200
ggccaactac ccaggagtag ggggtggatc ttttattgac agccgcgtat ggttctcagt 10260
ctacggaggg ttaaaaccca attcacccag tgacactgta caggaaggga aatatgtgat 10320
atacaagcga tacaatgaca catgcccaga tgagcaagac taccagattc gaatggccaa 10380
gtcttcgtat aagcctggac ggtttggtgg gaaacgcata cagcaggcta tcttatctat 10440
caaggtgtca acatccttag gcgaagaccc ggtactgact gtaccgccca acacagtcac 10500
actcatgggg gccgaaggca gaattctcac agtagggaca tctcatttct tgtatcaacg 10560
agggtcatca tacttctctc ccgcgttatt atatcctatg acagtcagca acaaaacagc 10620
cactcttcat agtccttata cattcaatgc cttcactcgg ccaggtagta tcccttgcca 10680
ggcttcagca agatgcccca actcgtgtgt tactggagtc tatacagatc catatcccct 10740
aatcttctat agaaaccaca ccttgcgagg ggtattcggg acaatgcttg atggtgtaca 10800
agcaagactt aaccctgcgt ctgcagtatt cgatagcaca tcccgcagtc gcattactcg 10860
agtgagttca agcagtacca aagcagcata cacaacatca acttgtttta aagtggtcaa 10920
gactaataag acctattgtc tcagcattgc tgaaatatct aatactctct tcggagaatt 10980
cagaatcgtc ccgttactag ttgagatcct caaagatgac ggggttagag aagccaggtc 11040
tggctagttg agtcaattat aaaggagttg gaaagatggc attgtatcac ctatcttctg 11100
cgacatcaag aatcaaaccg aatgccggcg cgtgctcgaa ttccatgttg ccagttgacc 11160
acaatcagcc agtgctcatg cgatcagatt aagccttgtc aatagtctct tgattaagaa 11220
aaaatgtaag tggcaatgag atacaaggca aaacagctca tggttaacaa tacgggtagg 11280
acatggcgag ctccggtcct gaaagggcag agcatcagat tatcctacca gagtcacacc 11340
tgtcttcacc attggtcaag cacaaactac tctattactg gaaattaact gggctaccgc 11400
ttcctgatga atgtgacttc gaccacctca ttctcagccg acaatggaaa aaaatacttg 11460
aatcggcctc tcctgatact gagagaatga taaaactcgg aagggcagta caccaaactc 11520
ttaaccacaa ttccagaata accggagtgc tccaccccag gtgtttagaa gaactggcta 11580
atattgaggt cccagattca accaacaaat ttcggaagat tgagaagaag atccaaattc 11640
acaacacgag atatggagaa ctgttcacaa ggctgtgtac gcatatagag aagaaactgc 11700
tggggtcatc ttggtctaac aatgtccccc ggtcagagga gttcagcagc attcgtacgg 11760
atccggcatt ctggtttcac tcaaaatggt ccacagccaa gtttgcatgg ctccatataa 11820
aacagatcca gaggcatctg atggtggcag ctaggacaag gtctgcggcc aacaaattgg 11880
tgatgctaac ccataaggta ggccaagtct ttgtcactcc tgaacttgtc gttgtgacgc 11940
atacgaatga gaacaagttc acatgtctta cccaggaact tgtattgatg tatgcagata 12000
tgatggaggg cagagatatg gtcaacataa tatcaaccac ggcggtgcat ctcagaagct 12060
tatcagagaa aattgatgac attttgcggt taatagacgc tctggcaaaa gacttgggta 12120
atcaagtcta cgatgttgta tcactaatgg agggatttgc atacggagct gtccagctac 12180
tcgagccgtc aggtacattt gcaggagatt tcttcgcatt caacctgcag gagcttaaag 12240
acattctaat tggcctcctc cccaatgata tagcagaatc cgtgactcat gcaatcgcta 12300
ctgtattctc tggtttagaa cagaatcaag cagctgagat gttgtgtctg ttgcgtctgt 12360
ggggtcaccc actgcttgag tcccgtattg cagcaaaggc agtcaggagc caaatgtgcg 12420
caccgaaaat ggtagacttt gatatgatcc ttcaggtact gtctttcttc aagggaacaa 12480
tcatcaacgg gtacagaaag aagaatgcag gtgtgtggcc gcgagtcaaa gtggatacaa 12540
tatatgggaa ggtcattggg caactacatg cagattcagc agagatttca cacgatatca 12600
tgttgagaga gtataagagt ttatctgcac ttgaatttga gccatgtata gaatatgacc 12660
ctgtcaccaa cctgagcatg ttcctaaaag acaaggcaat cgcacacccc aacgataatt 12720
ggcttgcctc gtttaggcgg aaccttctct ccgaagacca gaagaaacat gtaaaagaag 12780
caacttcgac taatcgcctc ttgatagagt ttttagagtc aaatgatttt gatccatata 12840
aagagatgga atatctgacg acccttgagt accttagaga tgacaatgtg gcagtatcat 12900
actcgctcaa ggagaaggaa gtgaaagtta atggacggat cttcgctaag ctgacaaaga 12960
agttaaggaa ctgtcaggtg atggcggaag ggatcctagc cgatcagatt gcacctttct 13020
ttcagggaaa tggagtcatt caggatagca tatccttgac caagagtatg ctagcgatga 13080
gtcaactgtc ttttaacagc aataagaaac gtatcactga ctgtaaagaa agagtatctt 13140
caaaccgcaa tcatgatccg aaaagcaaga accgtcggag agttgcaacc ttcataacaa 13200
ctgacctgca aaagtactgt cttaattgga gatatcagac aatcaaattg ttcgctcatg 13260
ccatcaatca gttgatgggc ctacctcact tcttcgaatg gattcaccta agactgatgg 13320
acactacgat gttcgtagga gaccctttca atcctccaag tgaccctact gactgtgacc 13380
tctcaagagt ccctaatgat gacatatata ttgtcagtgc cagagggggt atcgaaggat 13440
tatgccagaa gctatggaca atgatctcaa ttgctgcaat ccaacttgct gcagctagat 13500
cgcattgtcg tgttgcctgt atggtacagg gtgataatca agtaatagca gtaacgagag 13560
aggtaagatc agacgactct ccggagatgg tgttgacaca gttgcatcaa gccagtgata 13620
atttcttcaa ggaattaatt catgtcaatc atttgattgg ccataatttg aaggatcgtg 13680
aaaccatcag gtcagacaca ttcttcatat acagcaaacg aatcttcaaa gatggagcaa 13740
tcctcagtca agtcctcaaa aattcatcta aattagtgct agtgtcaggt gatctcagtg 13800
aaaacaccgt aatgtcctgt gccaacattg cctctactgt agcacggcta tgcgagaacg 13860
ggcttcccaa agacttctgt tactatttaa actatataat gagttgtgtg cagacatact 13920
ttgactctga gttctccatc accaacaatt cgcaccccga tcttaatcag tcgtggattg 13980
aggacatctc ttttgtgcac tcatatgttc tgactcctgc ccaattaggg ggactgagta 14040
accttcaata ctcaaggctc tacactagaa atatcggtga cccggggact actgcttttg 14100
cagagatcaa gcgactagaa gcagtgggat tactgagtcc taacattatg actaatatct 14160
taactaggcc gcctgggaat ggagattggg ccagtctgtg caacgaccca tactctttca 14220
attttgagac tgttgcaagc ccaaatattg ttcttaagaa acatacgcaa agagtcctat 14280
ttgaaacttg ttcaaatccc ttattgtctg gagtgcacac agaggataat gaggcagaag 14340
agaaggcatt ggctgaattc ttgcttaatc aagaggtgat tcatccccgc gttgcgcatg 14400
ccatcatgga ggcaagctct gtaggtagga gaaagcaaat tcaagggctt gttgacacaa 14460
caaacaccgt aattaagatt gcgcttacta ggaggccatt aggcatcaag aggctgatgc 14520
ggatagtcaa ttattctagc atgcatgcaa tgctgtttag agacgatgtt ttttcctcca 14580
gtagatccaa ccacccctta gtctcttcta atatgtgttc tctgacactg gcagactatg 14640
cacggaatag aagctggtca cctttgacgg gaggcaggaa aatactgggt gtatctaatc 14700
ctgatacgat agaactcgta gagggtgaga ttcttagtgt aagcggaggg tgtacaagat 14760
gtgacagcgg agatgaacaa tttacttggt tccatcttcc aagcaatata gaattgaccg 14820
atgacaccag caagaatcct ccgatgaggg taccatatct cgggtcaaag acacaggaga 14880
ggagagctgc ctcacttgca aaaatagctc atatgtcgcc acatgtaaag gctgccctaa 14940
gggcatcatc cgtgttgatc tgggcttatg gggataatga agtaaattgg actgctgctc 15000
ttacgattgc aaaatctcgg tgtaatgtaa acttagagta tcttcggtta ctgtcccctt 15060
tacccacggc tgggaatctt caacatagac tagatgatgg tataactcag atgacattca 15120
cccctgcatc tctctacagg gtgtcacctt acattcacat atccaatgat tctcaaaggc 15180
tgttcactga agaaggagtc aaagagggga atgtggttta ccaacagatc atgctcttgg 15240
gtttatctct aatcgaatcg atctttccaa tgacaacaac caggacatat gatgagatca 15300
cactgcacct acatagtaaa tttagttgct gtatcagaga agcacctgtt gcggttcctt 15360
tcgagctact tggggtggta ccggaactga ggacagtgac ctcaaataag tttatgtatg 15420
atcctagccc tgtatcggag ggagactttg cgagacttga cttagctatc ttcaagagtt 15480
atgagcttaa tctggagtca tatcccacga tagagctaat gaacattctt tcaatatcca 15540
gcgggaagtt gattggccag tctgtggttt cttatgatga agatacctcc ataaagaatg 15600
acgccataat agtgtatgac aatacccgaa attggatcag tgaagctcag aattcagatg 15660
tggtccgcct atttgaatat gcagcacttg aagtgctcct cgactgttct taccaactct 15720
attacctgag agtaagaggc ctggacaata ttgtcttata tatgggtgat ttatacaaga 15780
atatgccagg aattctactt tccaacattg cagctacaat atctcatccc gtcattcatt 15840
caaggttaca tgcagtgggc ctggtcaacc atgacggatc acaccaactt gcagatacgg 15900
attttatcga aatgtctgca aaactattag tatcttgcac ccgacgtgtg atctccggct 15960
tatattcagg aaataagtat gatctgctgt tcccatctgt cttagatgat aacctgaatg 16020
agaagatgct tcagctgata tcccggttat gctgtctgta cacggtactc tttgctacaa 16080
caagagaaat cccgaaaata agaggcttaa ctgcagaaga gaaatgttca atactcactg 16140
agtatttact gtcggatgct gtgaaaccat tacttagccc cgatcaagtg agctctatca 16200
tgtctcctaa cataattaca ttcccagcta atctgtacta catgtctcgg aagagcctca 16260
atttgatcag ggaaagggag gacagggata ctatcctggc gttgttgttc ccccaagagc 16320
cattattaga gttcccttct gtgcaagata ttggtgctcg agtgaaagat ccattcaccc 16380
gacaacctgc ggcatttttg caagagttag atttgagtgc tccagcaagg tatgacgcat 16440
tcacacttag tcagattcat cctgaactca catctccaaa tccggaggaa gactacttag 16500
tacgatactt gttcagaggg atagggactg catcttcctc ttggtataag gcatctcatc 16560
tcctttctgt acccgaggta agatgtgcaa gacacgggaa ctccttatac ttagctgaag 16620
ggagcggagc catcatgagt cttctcgaac tgcatgtacc acatgaaact atctattaca 16680
atacgctctt ttcaaatgag atgaaccccc cgcaacgaca tttcgggccg accccaactc 16740
agtttttgaa ttcggttgtt tataggaatc tacaggcgga ggtaacatgc aaagatggat 16800
ttgtccaaga gttccgtcca ttatggagag aaaatacaga ggaaagcgac ctgacctcag 16860
ataaagtagt ggggtatatt acatctgcag tgccctacag atctgtatca ttgctgcatt 16920
gtgacattga aattcctcca gggtccaatc aaagcttact agatcaacta gctatcaatt 16980
tatctctgat tgccatgcat tctgtaaggg agggcggggt agtaatcatc aaagtgttgt 17040
atgcaatggg atactacttt catctactca tgaacttgtt tgctccgtgt tccacaaaag 17100
gatatattct ctctaatggt tatgcatgtc gaggagatat ggagtgttac ctggtatttg 17160
tcatgggtta cctgggcggg cctacatttg tacatgaggt ggtgaggatg gcgaaaactc 17220
tggtgcagcg gcacggtacg cttttgtcta aatcagatga gatcacactg accaggttat 17280
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agtacttgag gaagaatatt gacactgcgc tgattgaagc cgggggacag cccgtccgtc 17400
cattctgtgc ggagagtctg gtgagcacgc tagcgaacat aactcagata acccagatca 17460
tcgctagtca cattgacaca gttatccggt ctgtgatata tatggaagct gagggtgatc 17520
tcgctgacac agtatttcta tttacccctt acaatctctc tactgacggg aaaaagagga 17580
catcacttaa acagtgcacg agacagatcc tagaggttac aatactaggt cttagagtcg 17640
aaaatctcaa taaaataggc gatataatca gcctagtgct taaaggcatg atctccatgg 17700
aggaccttat cccactaagg acatacttga agcatagtac ctgccctaaa tatttgaagg 17760
ctgtcctagg tattaccaaa ctcaaagaaa tgtttacaga cacttctgta ctgtacttga 17820
ctcgtgctca acaaaaattc tacatgaaaa ctataggcaa tgcagtcaaa ggatattaca 17880
gtaactgtga ctcttaacga aaatcacata ttaataggct ccttttttgg ccaattgtat 17940
tcttgttgat ttaatcatat tatgttagaa aaaagttgaa ccctgactcc ttaggactcg 18000
aattcgaact caaataaatg tcttaaaaaa aggttgcgca caattattct tgagtgtagt 18060
ctcgtcattc accaaatctt tgtttggtgc gcgcggccgg catggtccca gcctcctcgc 18120
tggcgccggc tgggcaacat tccgagggga ccgtcccctc ggtaatggcg aatgggacgt 18180
cgactgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac 18240
tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa 18300
ctatatgcgc gcagatctgt catgatgatc attgcaattg gatccatata tagggcccgg 18360
gttataatta cctcaggtcg acgtcccatg gccattcgaa ttcgtaatca tggtcatagc 18420
tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 18480
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cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 18600
gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gc 18632
<210> 22
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 22
Met Gly His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg
325 330 335
Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His
340 345 350
His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala
355 360 365
Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His
370 375 380
Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro
385 390 395 400
Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser
405 410 415
Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met
420 425 430
Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Ser Lys Met Tyr Gln
435 440 445
Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg
450 455 460
Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu
485 490 495
Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu
500 505 510
His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr
515 520 525
Leu Asn Ala Ser
530
<210> 23
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Gly His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 25
<211> 197
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Ser Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 26
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 26
atgggtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagtggtggc ggtggcggcg gatctagaaa cctccccgtg 1020
gccactccag acccaggaat gttcccatgc cttcaccact cccaaaacct gctgagggcc 1080
gtcagcaaca tgctccagaa ggccagacaa actctagaat tttacccttg cacttctgaa 1140
gagattgatc atgaagatat cacaaaagat aaaaccagca cagtggaggc ctgtttacca 1200
ttggaattaa ccaagaatga gagttgccta aattccagag agacctcttt cataactaat 1260
gggagttgcc tggcctccag aaagacctct tttatgatgg ccctgtgcct tagtagtatt 1320
tatgaagact cgaagatgta ccaggtggag ttcaagacca tgaatgcaaa gcttctgatg 1380
gatcctaaga ggcagatctt tctagatcaa aacatgctgg cagttattga tgagctgatg 1440
caggccctga atttcaacag tgagactgtg ccacaaaaat cctcccttga agaaccggat 1500
ttttataaaa ctaaaatcaa gctctgcata cttcttcatg ctttcagaat tcgggcagtg 1560
actattgata gagtgatgag ctatctgaat gcttcctaa 1599
<210> 27
<211> 984
<212> DNA
<213> 智人
<400> 27
atgggtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
gaaaactaca ccagcagctt cttcatcagg gacatcatca aacctgaccc acccaagaac 720
ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagt 984
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的寡核苷酸"
<400> 28
ggtggcggtg gcggcggatc t 21
<210> 29
<211> 594
<212> DNA
<213> 智人
<400> 29
agaaacctcc ccgtggccac tccagaccca ggaatgttcc catgccttca ccactcccaa 60
aacctgctga gggccgtcag caacatgctc cagaaggcca gacaaactct agaattttac 120
ccttgcactt ctgaagagat tgatcatgaa gatatcacaa aagataaaac cagcacagtg 180
gaggcctgtt taccattgga attaaccaag aatgagagtt gcctaaattc cagagagacc 240
tctttcataa ctaatgggag ttgcctggcc tccagaaaga cctcttttat gatggccctg 300
tgccttagta gtatttatga agactcgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat 360
gcaaagcttc tgatggatcc taagaggcag atctttctag atcaaaacat gctggcagtt 420
attgatgagc tgatgcaggc cctgaatttc aacagtgaga ctgtgccaca aaaatcctcc 480
cttgaagaac cggattttta taaaactaaa atcaagctct gcatacttct tcatgctttc 540
agaattcggg cagtgactat tgatagagtg atgagctatc tgaatgcttc ctaa 594
<210> 30
<211> 1641
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 30
atgtctgcac ttctgatcct agctcttgtt ggagctgcag ttgctgacta caaagacgat 60
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tggacctcag accagagaca tggagtcata ggctctggaa agaccctgac catcactgtc 240
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tcacatctgc tgctccacaa gaaggaaaat ggaatttggt ccactgaaat tttaaaaaat 360
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<211> 20210
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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gcaggctatc ttatctatca aggtgtcaac atccttaggc gaagacccgg tactgactgt 12060
accgcccaac acagtcacac tcatgggggc cgaaggcaga attctcacag tagggacatc 12120
tcatttcttg tatcaacgag ggtcatcata cttctctccc gcgttattat atcctatgac 12180
agtcagcaac aaaacagcca ctcttcatag tccttataca ttcaatgcct tcactcggcc 12240
aggtagtatc ccttgccagg cttcagcaag atgccccaac tcgtgtgtta ctggagtcta 12300
tacagatcca tatcccctaa tcttctatag aaaccacacc ttgcgagggg tattcgggac 12360
aatgcttgat ggtgtacaag caagacttaa ccctgcgtct gcagtattcg atagcacatc 12420
ccgcagtcgc attactcgag tgagttcaag cagtaccaaa gcagcataca caacatcaac 12480
ttgttttaaa gtggtcaaga ctaataagac ctattgtctc agcattgctg aaatatctaa 12540
tactctcttc ggagaattca gaatcgtccc gttactagtt gagatcctca aagatgacgg 12600
ggttagagaa gccaggtctg gctagttgag tcaattataa aggagttgga aagatggcat 12660
tgtatcacct atcttctgcg acatcaagaa tcaaaccgaa tgccggcgcg tgctcgaatt 12720
ccatgttgcc agttgaccac aatcagccag tgctcatgcg atcagattaa gccttgtcaa 12780
tagtctcttg attaagaaaa aatgtaagtg gcaatgagat acaaggcaaa acagctcatg 12840
gttaacaata cgggtaggac atggcgagct ccggtcctga aagggcagag catcagatta 12900
tcctaccaga gtcacacctg tcttcaccat tggtcaagca caaactactc tattactgga 12960
aattaactgg gctaccgctt cctgatgaat gtgacttcga ccacctcatt ctcagccgac 13020
aatggaaaaa aatacttgaa tcggcctctc ctgatactga gagaatgata aaactcggaa 13080
gggcagtaca ccaaactctt aaccacaatt ccagaataac cggagtgctc caccccaggt 13140
gtttagaaga actggctaat attgaggtcc cagattcaac caacaaattt cggaagattg 13200
agaagaagat ccaaattcac aacacgagat atggagaact gttcacaagg ctgtgtacgc 13260
atatagagaa gaaactgctg gggtcatctt ggtctaacaa tgtcccccgg tcagaggagt 13320
tcagcagcat tcgtacggat ccggcattct ggtttcactc aaaatggtcc acagccaagt 13380
ttgcatggct ccatataaaa cagatccaga ggcatctgat ggtggcagct aggacaaggt 13440
ctgcggccaa caaattggtg atgctaaccc ataaggtagg ccaagtcttt gtcactcctg 13500
aacttgtcgt tgtgacgcat acgaatgaga acaagttcac atgtcttacc caggaacttg 13560
tattgatgta tgcagatatg atggagggca gagatatggt caacataata tcaaccacgg 13620
cggtgcatct cagaagctta tcagagaaaa ttgatgacat tttgcggtta atagacgctc 13680
tggcaaaaga cttgggtaat caagtctacg atgttgtatc actaatggag ggatttgcat 13740
acggagctgt ccagctactc gagccgtcag gtacatttgc aggagatttc ttcgcattca 13800
acctgcagga gcttaaagac attctaattg gcctcctccc caatgatata gcagaatccg 13860
tgactcatgc aatcgctact gtattctctg gtttagaaca gaatcaagca gctgagatgt 13920
tgtgtctgtt gcgtctgtgg ggtcacccac tgcttgagtc ccgtattgca gcaaaggcag 13980
tcaggagcca aatgtgcgca ccgaaaatgg tagactttga tatgatcctt caggtactgt 14040
ctttcttcaa gggaacaatc atcaacgggt acagaaagaa gaatgcaggt gtgtggccgc 14100
gagtcaaagt ggatacaata tatgggaagg tcattgggca actacatgca gattcagcag 14160
agatttcaca cgatatcatg ttgagagagt ataagagttt atctgcactt gaatttgagc 14220
catgtataga atatgaccct gtcaccaacc tgagcatgtt cctaaaagac aaggcaatcg 14280
cacaccccaa cgataattgg cttgcctcgt ttaggcggaa ccttctctcc gaagaccaga 14340
agaaacatgt aaaagaagca acttcgacta atcgcctctt gatagagttt ttagagtcaa 14400
atgattttga tccatataaa gagatggaat atctgacgac ccttgagtac cttagagatg 14460
acaatgtggc agtatcatac tcgctcaagg agaaggaagt gaaagttaat ggacggatct 14520
tcgctaagct gacaaagaag ttaaggaact gtcaggtgat ggcggaaggg atcctagccg 14580
atcagattgc acctttcttt cagggaaatg gagtcattca ggatagcata tccttgacca 14640
agagtatgct agcgatgagt caactgtctt ttaacagcaa taagaaacgt atcactgact 14700
gtaaagaaag agtatcttca aaccgcaatc atgatccgaa aagcaagaac cgtcggagag 14760
ttgcaacctt cataacaact gacctgcaaa agtactgtct taattggaga tatcagacaa 14820
tcaaattgtt cgctcatgcc atcaatcagt tgatgggcct acctcacttc ttcgaatgga 14880
ttcacctaag actgatggac actacgatgt tcgtaggaga ccctttcaat cctccaagtg 14940
accctactga ctgtgacctc tcaagagtcc ctaatgatga catatatatt gtcagtgcca 15000
gagggggtat cgaaggatta tgccagaagc tatggacaat gatctcaatt gctgcaatcc 15060
aacttgctgc agctagatcg cattgtcgtg ttgcctgtat ggtacagggt gataatcaag 15120
taatagcagt aacgagagag gtaagatcag acgactctcc ggagatggtg ttgacacagt 15180
tgcatcaagc cagtgataat ttcttcaagg aattaattca tgtcaatcat ttgattggcc 15240
ataatttgaa ggatcgtgaa accatcaggt cagacacatt cttcatatac agcaaacgaa 15300
tcttcaaaga tggagcaatc ctcagtcaag tcctcaaaaa ttcatctaaa ttagtgctag 15360
tgtcaggtga tctcagtgaa aacaccgtaa tgtcctgtgc caacattgcc tctactgtag 15420
cacggctatg cgagaacggg cttcccaaag acttctgtta ctatttaaac tatataatga 15480
gttgtgtgca gacatacttt gactctgagt tctccatcac caacaattcg caccccgatc 15540
ttaatcagtc gtggattgag gacatctctt ttgtgcactc atatgttctg actcctgccc 15600
aattaggggg actgagtaac cttcaatact caaggctcta cactagaaat atcggtgacc 15660
cggggactac tgcttttgca gagatcaagc gactagaagc agtgggatta ctgagtccta 15720
acattatgac taatatctta actaggccgc ctgggaatgg agattgggcc agtctgtgca 15780
acgacccata ctctttcaat tttgagactg ttgcaagccc aaatattgtt cttaagaaac 15840
atacgcaaag agtcctattt gaaacttgtt caaatccctt attgtctgga gtgcacacag 15900
aggataatga ggcagaagag aaggcattgg ctgaattctt gcttaatcaa gaggtgattc 15960
atccccgcgt tgcgcatgcc atcatggagg caagctctgt aggtaggaga aagcaaattc 16020
aagggcttgt tgacacaaca aacaccgtaa ttaagattgc gcttactagg aggccattag 16080
gcatcaagag gctgatgcgg atagtcaatt attctagcat gcatgcaatg ctgtttagag 16140
acgatgtttt ttcctccagt agatccaacc accccttagt ctcttctaat atgtgttctc 16200
tgacactggc agactatgca cggaatagaa gctggtcacc tttgacggga ggcaggaaaa 16260
tactgggtgt atctaatcct gatacgatag aactcgtaga gggtgagatt cttagtgtaa 16320
gcggagggtg tacaagatgt gacagcggag atgaacaatt tacttggttc catcttccaa 16380
gcaatataga attgaccgat gacaccagca agaatcctcc gatgagggta ccatatctcg 16440
ggtcaaagac acaggagagg agagctgcct cacttgcaaa aatagctcat atgtcgccac 16500
atgtaaaggc tgccctaagg gcatcatccg tgttgatctg ggcttatggg gataatgaag 16560
taaattggac tgctgctctt acgattgcaa aatctcggtg taatgtaaac ttagagtatc 16620
ttcggttact gtccccttta cccacggctg ggaatcttca acatagacta gatgatggta 16680
taactcagat gacattcacc cctgcatctc tctacagggt gtcaccttac attcacatat 16740
ccaatgattc tcaaaggctg ttcactgaag aaggagtcaa agaggggaat gtggtttacc 16800
aacagatcat gctcttgggt ttatctctaa tcgaatcgat ctttccaatg acaacaacca 16860
ggacatatga tgagatcaca ctgcacctac atagtaaatt tagttgctgt atcagagaag 16920
cacctgttgc ggttcctttc gagctacttg gggtggtacc ggaactgagg acagtgacct 16980
caaataagtt tatgtatgat cctagccctg tatcggaggg agactttgcg agacttgact 17040
tagctatctt caagagttat gagcttaatc tggagtcata tcccacgata gagctaatga 17100
acattctttc aatatccagc gggaagttga ttggccagtc tgtggtttct tatgatgaag 17160
atacctccat aaagaatgac gccataatag tgtatgacaa tacccgaaat tggatcagtg 17220
aagctcagaa ttcagatgtg gtccgcctat ttgaatatgc agcacttgaa gtgctcctcg 17280
actgttctta ccaactctat tacctgagag taagaggcct ggacaatatt gtcttatata 17340
tgggtgattt atacaagaat atgccaggaa ttctactttc caacattgca gctacaatat 17400
ctcatcccgt cattcattca aggttacatg cagtgggcct ggtcaaccat gacggatcac 17460
accaacttgc agatacggat tttatcgaaa tgtctgcaaa actattagta tcttgcaccc 17520
gacgtgtgat ctccggctta tattcaggaa ataagtatga tctgctgttc ccatctgtct 17580
tagatgataa cctgaatgag aagatgcttc agctgatatc ccggttatgc tgtctgtaca 17640
cggtactctt tgctacaaca agagaaatcc cgaaaataag aggcttaact gcagaagaga 17700
aatgttcaat actcactgag tatttactgt cggatgctgt gaaaccatta cttagccccg 17760
atcaagtgag ctctatcatg tctcctaaca taattacatt cccagctaat ctgtactaca 17820
tgtctcggaa gagcctcaat ttgatcaggg aaagggagga cagggatact atcctggcgt 17880
tgttgttccc ccaagagcca ttattagagt tcccttctgt gcaagatatt ggtgctcgag 17940
tgaaagatcc attcacccga caacctgcgg catttttgca agagttagat ttgagtgctc 18000
cagcaaggta tgacgcattc acacttagtc agattcatcc tgaactcaca tctccaaatc 18060
cggaggaaga ctacttagta cgatacttgt tcagagggat agggactgca tcttcctctt 18120
ggtataaggc atctcatctc ctttctgtac ccgaggtaag atgtgcaaga cacgggaact 18180
ccttatactt agctgaaggg agcggagcca tcatgagtct tctcgaactg catgtaccac 18240
atgaaactat ctattacaat acgctctttt caaatgagat gaaccccccg caacgacatt 18300
tcgggccgac cccaactcag tttttgaatt cggttgttta taggaatcta caggcggagg 18360
taacatgcaa agatggattt gtccaagagt tccgtccatt atggagagaa aatacagagg 18420
aaagcgacct gacctcagat aaagtagtgg ggtatattac atctgcagtg ccctacagat 18480
ctgtatcatt gctgcattgt gacattgaaa ttcctccagg gtccaatcaa agcttactag 18540
atcaactagc tatcaattta tctctgattg ccatgcattc tgtaagggag ggcggggtag 18600
taatcatcaa agtgttgtat gcaatgggat actactttca tctactcatg aacttgtttg 18660
ctccgtgttc cacaaaagga tatattctct ctaatggtta tgcatgtcga ggagatatgg 18720
agtgttacct ggtatttgtc atgggttacc tgggcgggcc tacatttgta catgaggtgg 18780
tgaggatggc gaaaactctg gtgcagcggc acggtacgct tttgtctaaa tcagatgaga 18840
tcacactgac caggttattc acctcacagc ggcagcgtgt gacagacatc ctatccagtc 18900
ctttaccaag attaataaag tacttgagga agaatattga cactgcgctg attgaagccg 18960
ggggacagcc cgtccgtcca ttctgtgcgg agagtctggt gagcacgcta gcgaacataa 19020
ctcagataac ccagatcatc gctagtcaca ttgacacagt tatccggtct gtgatatata 19080
tggaagctga gggtgatctc gctgacacag tatttctatt taccccttac aatctctcta 19140
ctgacgggaa aaagaggaca tcacttaaac agtgcacgag acagatccta gaggttacaa 19200
tactaggtct tagagtcgaa aatctcaata aaataggcga tataatcagc ctagtgctta 19260
aaggcatgat ctccatggag gaccttatcc cactaaggac atacttgaag catagtacct 19320
gccctaaata tttgaaggct gtcctaggta ttaccaaact caaagaaatg tttacagaca 19380
cttctgtact gtacttgact cgtgctcaac aaaaattcta catgaaaact ataggcaatg 19440
cagtcaaagg atattacagt aactgtgact cttaacgaaa atcacatatt aataggctcc 19500
ttttttggcc aattgtattc ttgttgattt aatcatatta tgttagaaaa aagttgaacc 19560
ctgactcctt aggactcgaa ttcgaactca aataaatgtc ttaaaaaaag gttgcgcaca 19620
attattcttg agtgtagtct cgtcattcac caaatctttg tttggtgcgc gcggccggca 19680
tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg ggcaacattc cgaggggacc gtcccctcgg 19740
taatggcgaa tgggacgtcg actgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg 19800
ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt 19860
ttttgctgaa aggaggaact atatgcgcgc agatctgtca tgatgatcat tgcaattgga 19920
tccatatata gggcccgggt tataattacc tcaggtcgac gtcccatggc cattcgaatt 19980
cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca 20040
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 20100
cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc 20160
attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 20210
<210> 32
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的引物"
<400> 32
gcaccgagtt cccccccgcg gttagaaaaa atacgggtag aaccgccacc atgggtcacc 60
agcag 65
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的引物"
<400> 33
agttggacct tgggtccgcg gattaggaag cattcag 37
<210> 34
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的引物"
<400> 34
gcaccgagtt cccccccgcg gttagaaaaa atacgggtag aaccgccacc atgtacagca 60
tgcag 65
<210> 35
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的引物"
<400> 35
agttggacct tgggtccgcg gattattgag ggcttgt 37
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的引物"
<400> 36
tcgatcgagg aaatcagg 18
<210> 37
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的引物"
<400> 37
gtacagccca attgtcc 17
<210> 38
<211> 306
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser
305
<210> 39
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 39
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr
305 310 315 320
Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu
325 330 335
Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe
340 345 350
Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp
355 360 365
Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser
385 390 395 400
Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser
405 410 415
Ser Ile Tyr Glu Asp Ser Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met
420 425 430
Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln
435 440 445
Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn
450 455 460
Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg
485 490 495
Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
500 505 510
<210> 40
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 41
<211> 197
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu
1 5 10 15
His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys
20 25 30
Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp
35 40 45
His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr
65 70 75 80
Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe
85 90 95
Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr
100 105 110
Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys
115 120 125
Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu
130 135 140
Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser
145 150 155 160
Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu
165 170 175
Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser
180 185 190
Tyr Leu Asn Ala Ser
195
<210> 42
<211> 532
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 42
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg
325 330 335
Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His
340 345 350
His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala
355 360 365
Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His
370 375 380
Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro
385 390 395 400
Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser
405 410 415
Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met
420 425 430
Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln
435 440 445
Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg
450 455 460
Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met
465 470 475 480
Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu
485 490 495
Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu
500 505 510
His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr
515 520 525
Leu Asn Ala Ser
530
<210> 43
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多肽"
<400> 43
Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr
1 5 10 15
Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu
20 25 30
Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly
35 40 45
Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly
50 55 60
Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu
65 70 75 80
Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys
85 90 95
Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys
100 105 110
Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr
115 120 125
Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln
130 135 140
Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly
145 150 155 160
Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala
165 170 175
Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala
180 185 190
Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg
195 200 205
Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu
210 215 220
Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp
225 230 235 240
Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln
245 250 255
Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr
260 265 270
Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala
275 280 285
Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro
290 295 300
Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr
305 310 315 320
Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu
325 330 335
Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe
340 345 350
Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp
355 360 365
Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser
385 390 395 400
Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser
405 410 415
Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met
420 425 430
Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln
435 440 445
Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn
450 455 460
Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr
465 470 475 480
Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg
485 490 495
Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser
500 505 510
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换="Arg"或"Asp"或"Cys"或"Glu"或"Gly"或"Gln"
或"Ser"或"Tyr"或"Asn"或"His"或"Ile"或"Leu" or
"Lys"或"Met"或"Phe"或"Thr"或"Trp"或"Val"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> /注释="序列中给出的变体残基相对于注释中的变体位置没有偏好"
<400> 44
Val Pro Gly Ala Gly
1 5
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> /替换="Arg"或"Asp"或"Cys"或"Glu"或"Gly"或"Gln"
或"Ser"或"Tyr"或"Asn"或"His"或"Ile"或"Leu" 或
"Lys"或"Met"或"Phe"或"Thr"或"Trp"或"Val"
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> /替换="Arg"或"Asp"或"Cys"或"Glu"或"Gly"或"Gln"
或"Ser"或"Tyr"或"Asn"或"His"或"Ile"或"Leu" 或
"Lys"或"Met"或"Phe"或"Thr"或"Trp"或"Val"
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> /注释="序列中给出的变体残基相对于注释中的变体位置没有偏好"
<400> 45
Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly
1 5 10
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 46
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 47
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 48
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 49
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 49
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 50
<211> 15186
<212> RNA
<213> 新城疫病毒
<400> 50
accaaacaaa gauuugguga augacgagac uacacucaag aauaauugug cgcaaccuuu 60
uuuuaagaca uuuauuugag uucgaauucg aguccuaagg agucaggguu caacuuuuuu 120
cuaacauaau augauuaaau caacaagaau acaauuggcc aaaaaaggag ccuauuaaua 180
ugugauuuuc guuaagaguc acaguuacug uaauauccuu ugacugcauu gccuauaguu 240
uucauguaga auuuuuguug agcacgaguc aaguacagua cagaaguguc uguaaacauu 300
ucuuugaguu ugguaauacc uaggacagcc uucaaauauu uagggcaggu acuaugcuuc 360
aaguaugucc uuagugggau aagguccucc auggagauca ugccuuuaag cacuaggcug 420
auuauaucgc cuauuuuauu gagauuuucg acucuaagac cuaguauugu aaccucuagg 480
aucugucucg ugcacuguuu aagugauguc cucuuuuucc cgucaguaga gagauuguaa 540
gggguaaaua gaaauacugu gucagcgaga ucacccucag cuuccauaua uaucacagac 600
cggauaacug ugucaaugug acuagcgaug aucuggguua ucugaguuau guucgcuagc 660
gugcucacca gacucuccgc acagaaugga cggacgggcu gucccccggc uucaaucagc 720
gcagugucaa uauucuuccu caaguacuuu auuaaucuug guaaaggacu ggauaggaug 780
ucugucacac gcugccgcug ugaggugaau aaccugguca gugugaucuc aucugauuua 840
gacaaaagcg uaccgugccg cugcaccaga guuuucgcca uccucaccac cucauguaca 900
aauguaggcc cgcccaggua acccaugaca aauaccaggu aacacuccau aucuccucga 960
caugcauaac cauuagagag aauauauccu uuuguggaac acggagcaaa caaguucaug 1020
aguagaugaa aguaguaucc cauugcauac aacacuuuga ugauuacuac cccgcccucc 1080
cuuacagaau gcauggcaau cagagauaaa uugauagcua guugaucuag uaagcuuuga 1140
uuggacccug gaggaauuuc aaugucacaa ugcagcaaug auacagaucu guagggcacu 1200
gcagauguaa uauaccccac uacuuuaucu gaggucaggu cgcuuuccuc uguauuuucu 1260
cuccauaaug gacggaacuc uuggacaaau ccaucuuugc auguuaccuc cgccuguaga 1320
uuccuauaaa caaccgaauu caaaaacuga guuggggucg gcccgaaaug ucguugcggg 1380
ggguucaucu cauuugaaaa gagcguauug uaauagauag uuucaugugg uacaugcagu 1440
ucgagaagac ucaugauggc uccgcucccu ucagcuaagu auaaggaguu cccgugucuu 1500
gcacaucuua ccucggguac agaaaggaga ugagaugccu uauaccaaga ggaagaugca 1560
gucccuaucc cucugaacaa guaucguacu aaguagucuu ccuccggauu uggagaugug 1620
aguucaggau gaaucugacu aagugugaau gcgucauacc uugcuggagc acucaaaucu 1680
aacucuugca aaaaugccgc agguugucgg gugaauggau cuuucacucg agcaccaaua 1740
ucuugcacag aagggaacuc uaauaauggc ucuuggggga acaacaacgc caggauagua 1800
ucccuguccu cccuuucccu gaucaaauug aggcucuucc gagacaugua guacagauua 1860
gcugggaaug uaauuauguu aggagacaug auagagcuca cuugaucggg gcuaaguaau 1920
gguuucacag cauccgacag uaaauacuca gugaguauug aacauuucuc uucugcaguu 1980
aagccucuua uuuucgggau uucucuuguu guagcaaaga guaccgugua cagacagcau 2040
aaccgggaua ucagcugaag caucuucuca uucagguuau caucuaagac agaugggaac 2100
agcagaucau acuuauuucc ugaauauaag ccggagauca cacgucgggu gcaagauacu 2160
aauaguuuug cagacauuuc gauaaaaucc guaucugcaa guugguguga uccgucaugg 2220
uugaccaggc ccacugcaug uaaccuugaa ugaaugacgg gaugagauau uguagcugca 2280
auguuggaaa guagaauucc uggcauauuc uuguauaaau cacccauaua uaagacaaua 2340
uuguccaggc cucuuacucu cagguaauag aguugguaag aacagucgag gagcacuuca 2400
agugcugcau auucaaauag gcggaccaca ucugaauucu gagcuucacu gauccaauuu 2460
cggguauugu cauacacuau uauggcguca uucuuuaugg agguaucuuc aucauaagaa 2520
accacagacu ggccaaucaa cuucccgcug gauauugaaa gaauguucau uagcucuauc 2580
gugggauaug acuccagauu aagcucauaa cucuugaaga uagcuaaguc aagucucgca 2640
aagucucccu ccgauacagg gcuaggauca uacauaaacu uauuugaggu cacuguccuc 2700
aguuccggua ccaccccaag uagcucgaaa ggaaccgcaa caggugcuuc ucugauacag 2760
caacuaaauu uacuauguag gugcagugug aucucaucau auguccuggu uguugucauu 2820
ggaaagaucg auucgauuag agauaaaccc aagagcauga ucuguuggua aaccacauuc 2880
cccucuuuga cuccuucuuc agugaacagc cuuugagaau cauuggauau gugaauguaa 2940
ggugacaccc uguagagaga ugcaggggug aaugucaucu gaguuauacc aucaucuagu 3000
cuauguugaa gauucccagc cguggguaaa ggggacagua accgaagaua cucuaaguuu 3060
acauuacacc gagauuuugc aaucguaaga gcagcagucc aauuuacuuc auuaucccca 3120
uaagcccaga ucaacacgga ugaugcccuu agggcagccu uuacaugugg cgacauauga 3180
gcuauuuuug caagugaggc agcucuccuc uccugugucu uugacccgag auaugguacc 3240
cucaucggag gauucuugcu ggugucaucg gucaauucua uauugcuugg aagauggaac 3300
caaguaaauu guucaucucc gcugucacau cuuguacacc cuccgcuuac acuaagaauc 3360
ucacccucua cgaguucuau cguaucagga uuagauacac ccaguauuuu ccugccuccc 3420
gucaaaggug accagcuucu auuccgugca uagucugcca gugucagaga acacauauua 3480
gaagagacua aggggugguu ggaucuacug gaggaaaaaa caucgucucu aaacagcauu 3540
gcaugcaugc uagaauaauu gacuauccgc aucagccucu ugaugccuaa uggccuccua 3600
guaagcgcaa ucuuaauuac gguguuuguu gugucaacaa gcccuugaau uugcuuucuc 3660
cuaccuacag agcuugccuc caugauggca ugcgcaacgc ggggaugaau caccucuuga 3720
uuaagcaaga auucagccaa ugccuucucu ucugccucau uauccucugu gugcacucca 3780
gacaauaagg gauuugaaca aguuucaaau aggacucuuu gcguauguuu cuuaagaaca 3840
auauuugggc uugcaacagu cucaaaauug aaagaguaug ggucguugca cagacuggcc 3900
caaucuccau ucccaggcgg ccuaguuaag auauuaguca uaauguuagg acucaguaau 3960
cccacugcuu cuagucgcuu gaucucugca aaagcaguag uccccggguc accgauauuu 4020
cuaguguaga gccuugagua uugaagguua cucagucccc cuaauugggc aggagucaga 4080
acauaugagu gcacaaaaga gauguccuca auccacgacu gauuaagauc ggggugcgaa 4140
uuguugguga uggagaacuc agagucaaag uaugucugca cacaacucau uauauaguuu 4200
aaauaguaac agaagucuuu gggaagcccg uucucgcaua gccgugcuac aguagaggca 4260
auguuggcac aggacauuac gguguuuuca cugagaucac cugacacuag cacuaauuua 4320
gaugaauuuu ugaggacuug acugaggauu gcuccaucuu ugaagauucg uuugcuguau 4380
augaagaaug ugucugaccu gaugguuuca cgauccuuca aauuauggcc aaucaaauga 4440
uugacaugaa uuaauuccuu gaagaaauua ucacuggcuu gaugcaacug ugucaacacc 4500
aucuccggag agucgucuga ucuuaccucu cucguuacug cuauuacuug auuaucaccc 4560
uguaccauac aggcaacacg acaaugcgau cuagcugcag caaguuggau ugcagcaauu 4620
gagaucauug uccauagcuu cuggcauaau ccuucgauac ccccucuggc acugacaaua 4680
uauaugucau cauuagggac ucuugagagg ucacagucag uagggucacu uggaggauug 4740
aaagggucuc cuacgaacau cguagugucc aucagucuua ggugaaucca uucgaagaag 4800
ugagguaggc ccaucaacug auugauggca ugagcgaaca auuugauugu cugauaucuc 4860
caauuaagac aguacuuuug caggucaguu guuaugaagg uugcaacucu ccgacgguuc 4920
uugcuuuucg gaucaugauu gcgguuugaa gauacucuuu cuuuacaguc agugauacgu 4980
uucuuauugc uguuaaaaga caguugacuc aucgcuagca uacucuuggu caaggauaug 5040
cuauccugaa ugacuccauu ucccugaaag aaaggugcaa ucugaucggc uaggaucccu 5100
uccgccauca ccugacaguu ccuuaacuuc uuugucagcu uagcgaagau ccguccauua 5160
acuuucacuu ccuucuccuu gagcgaguau gauacugcca cauugucauc ucuaagguac 5220
ucaagggucg ucagauauuc caucucuuua uauggaucaa aaucauuuga cucuaaaaac 5280
ucuaucaaga ggcgauuagu cgaaguugcu ucuuuuacau guuucuucug gucuucggag 5340
agaagguucc gccuaaacga ggcaagccaa uuaucguugg ggugugcgau ugccuugucu 5400
uuuaggaaca ugcucagguu ggugacaggg ucauauucua uacauggcuc aaauucaagu 5460
gcagauaaac ucuuauacuc ucucaacaug auaucgugug aaaucucugc ugaaucugca 5520
uguaguugcc caaugaccuu cccauauauu guauccacuu ugacucgcgg ccacacaccu 5580
gcauucuucu uucuguaccc guugaugauu guucccuuga agaaagacag uaccugaagg 5640
aucauaucaa agucuaccau uuucggugcg cacauuuggc uccugacugc cuuugcugca 5700
auacgggacu caagcagugg gugaccccac agacgcaaca gacacaacau cucagcugcu 5760
ugauucuguu cuaaaccaga gaauacagua gcgauugcau gagucacgga uucugcuaua 5820
ucauugggga ggaggccaau uagaaugucu uuaagcuccu gcagguugaa ugcgaagaaa 5880
ucuccugcaa auguaccuga cggcucgagu agcuggacag cuccguaugc aaaucccucc 5940
auuagugaua caacaucgua gacuugauua cccaagucuu uugccagagc gucuauuaac 6000
cgcaaaaugu caucaauuuu cucugauaag cuucugagau gcaccgccgu gguugauauu 6060
auguugacca uaucucugcc cuccaucaua ucugcauaca ucaauacaag uuccugggua 6120
agacauguga acuuguucuc auucguaugc gucacaacga caaguucagg agugacaaag 6180
acuuggccua ccuuaugggu uagcaucacc aauuuguugg ccgcagaccu uguccuagcu 6240
gccaccauca gaugccucug gaucuguuuu auauggagcc augcaaacuu ggcuguggac 6300
cauuuugagu gaaaccagaa ugccggaucc guacgaaugc ugcugaacuc cucugaccgg 6360
gggacauugu uagaccaaga ugaccccagc aguuucuucu cuauaugcgu acacagccuu 6420
gugaacaguu cuccauaucu cguguuguga auuuggaucu ucuucucaau cuuccgaaau 6480
uuguugguug aaucugggac cucaauauua gccaguucuu cuaaacaccu gggguggagc 6540
acuccgguua uucuggaauu gugguuaaga guuuggugua cugcccuucc gaguuuuauc 6600
auucucucag uaucaggaga ggccgauuca aguauuuuuu uccauugucg gcugagaaug 6660
agguggucga agucacauuc aucaggaagc gguagcccag uuaauuucca guaauagagu 6720
aguuugugcu ugaccaaugg ugaagacagg ugugacucug guaggauaau cugaugcucu 6780
gcccuuucag gaccggagcu cgccaugucc uacccguauu guuaaccaug agcuguuuug 6840
ccuuguaucu cauugccacu uacauuuuuu cuuaaucaag agacuauuga caaggcuuaa 6900
ucugaucgca ugagcacugg cugauugugg ucaacuggca acauggaauu cgagcacgcg 6960
ccggcauucg guuugauucu ugaugucgca gaagauaggu gauacaaugc caucuuucca 7020
acuccuuuau aauugacuca acuagccaga ccuggcuucu cuaaccccgu caucuuugag 7080
gaucucaacu aguaacggga cgauucugaa uucuccgaag agaguauuag auauuucagc 7140
aaugcugaga caauaggucu uauuagucuu gaccacuuua aaacaaguug auguugugua 7200
ugcugcuuug guacugcuug aacucacucg aguaaugcga cugcgggaug ugcuaucgaa 7260
uacugcagac gcaggguuaa gucuugcuug uacaccauca agcauugucc cgaauacccc 7320
ucgcaaggug ugguuucuau agaagauuag gggauaugga ucuguauaga cuccaguaac 7380
acacgaguug gggcaucuug cugaagccug gcaagggaua cuaccuggcc gagugaaggc 7440
auugaaugua uaaggacuau gaagaguggc uguuuuguug cugacuguca uaggauauaa 7500
uaacgcggga gagaaguaug augacccucg uugauacaag aaaugagaug ucccuacugu 7560
gagaauucug ccuucggccc ccaugagugu gacuguguug ggcgguacag ucaguaccgg 7620
gucuucgccu aaggauguug acaccuugau agauaagaua gccugcugua ugcguuuccc 7680
accaaaccgu ccaggcuuau acgaagacuu ggccauucga aucugguagu cuugcucauc 7740
ugggcaugug ucauuguauc gcuuguauau cacauauuuc ccuuccugua cagugucacu 7800
gggugaauug gguuuuaacc cuccguagac ugagaaccau acgcggcugu caauaaaaga 7860
uccacccccu acuccugggu aguuggccac ccaguccccg aauaauguug ugacaucuag 7920
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agcaucaucu acaaugaguu cuuugccuau ccccccuaua uaaucugggu cauggauagg 8400
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guucauaauu guggucucag uauuuaacaa ugccaacgga gacucaaggg ccacuugcuu 8520
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gcauuuuguu uggcuuguau cagagcugcg gccgcuguua uuugugcggc aguugcaacc 10260
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aggguaucgg ugaugucuuc uggugcauca ucuucggccc cggcugugac gaacgggguu 14640
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uuuggu 15186
<210> 51
<211> 16824
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 51
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cuaacauaau augauuaaau caacaagaau acaauuggcc aaaaaaggag ccuauuaaua 180
ugugauuuuc guuaagaguc acaguuacug uaauauccuu ugacugcauu gccuauaguu 240
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aucugucucg ugcacuguuu aagugauguc cuuuuuuucc cgucaguaga gagauuguaa 540
gggguaaaua gaaauacugu gucagcgaga ucacccucag cuuccauaua uaucacagac 600
cggauaacug ugucaaugug acuagcgaug aucuggguua ucugaguuau guucgcuagc 660
gugcucacca gacucuccgc acagaaugga cggacgggcu gucccccggc uucaaucagc 720
gcagugucaa uauucuuccu caaguacuuu auuaaucuug guaaaggacu ggauaggaug 780
ucugucacac gcugccgcug ugaggugaau aaccugguca gugugaucuc aucugauuua 840
gacaaaagcg uaccgugccg cugcaccaga guuuucgcca uccucaccac cucauguaca 900
aauguaggcc cgcccaggua acccaugaca aauaccaggu aacacuccau aucuccucga 960
caugcauaac cauuagagag aauauauccu uuuguggaac acggagcaaa caaguucaug 1020
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gcagauguaa uauaccccac uacuuuaucu gaggucaggu cgcuuuccuc uguauuuucu 1260
cuccauaaug gacggaacuc uuggacaaau ccaucuuugc auguuaccuc cgccuguaga 1320
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cccacugcuu cuagucgcuu gaucucugca aaagcaguag uccccggguc accgauauuu 4020
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ucuaucaaga ggcgauuagu cgaaguugcu ucuuuuacau guuucuucug gucuucggag 5340
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acuuggccua ccuuaugggu uagcaucacc aauuuguugg ccgcagaccu uguccuagcu 6240
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cauuuugagu gaaaccagaa ugccggaucc guacgaaugc ugcugaacuc cucugaccgg 6360
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<210> 52
<211> 16824
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 52
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gcuauuuuug caagugaggc agcucuccuc uccugugucu uugacccgag auaugguacc 3240
cucaucggag gauucuugcu ggugucaucg gucaauucua uauugcuugg aagauggaac 3300
caaguaaauu guucaucucc gcugucacau cuuguacacc cuccgcuuac acuaagaauc 3360
ucacccucua cgaguucuau cguaucagga uuagauacac ccaguauuuu ccugccuccc 3420
gucaaaggug accagcuucu auuccgugca uagucugcca gugucagaga acacauauua 3480
gaagagacua aggggugguu ggaucuacug gaggaaaaaa caucgucucu aaacagcauu 3540
gcaugcaugc uagaauaauu gacuauccgc aucagccucu ugaugccuaa uggccuccua 3600
guaagcgcaa ucuuaauuac gguguuuguu gugucaacaa gcccuugaau uugcuuucuc 3660
cuaccuacag agcuugccuc caugauggca ugcgcaacgc ggggaugaau caccucuuga 3720
uuaagcaaga auucagccaa ugccuucucu ucugccucau uauccucugu gugcacucca 3780
gacaauaagg gauuugaaca aguuucaaau aggacucuuu gcguauguuu cuuaagaaca 3840
auauuugggc uugcaacagu cucaaaauug aaagaguaug ggucguugca cagacuggcc 3900
caaucuccau ucccaggcgg ccuaguuaag auauuaguca uaauguuagg acucaguaau 3960
cccacugcuu cuagucgcuu gaucucugca aaagcaguag uccccggguc accgauauuu 4020
cuaguguaga gccuugagua uugaagguua cucagucccc cuaauugggc aggagucaga 4080
acauaugagu gcacaaaaga gauguccuca auccacgacu gauuaagauc ggggugcgaa 4140
uuguugguga uggagaacuc agagucaaag uaugucugca cacaacucau uauauaguuu 4200
aaauaguaac agaagucuuu gggaagcccg uucucgcaua gccgugcuac aguagaggca 4260
auguuggcac aggacauuac gguguuuuca cugagaucac cugacacuag cacuaauuua 4320
gaugaauuuu ugaggacuug acugaggauu gcuccaucuu ugaagauucg uuugcuguau 4380
augaagaaug ugucugaccu gaugguuuca cgauccuuca aauuauggcc aaucaaauga 4440
uugacaugaa uuaauuccuu gaagaaauua ucacuggcuu gaugcaacug ugucaacacc 4500
aucuccggag agucgucuga ucuuaccucu cucguuacug cuauuacuug auuaucaccc 4560
uguaccauac aggcaacacg acaaugcgau cuagcugcag caaguuggau ugcagcaauu 4620
gagaucauug uccauagcuu cuggcauaau ccuucgauac ccccucuggc acugacaaua 4680
uauaugucau cauuagggac ucuugagagg ucacagucag uagggucacu uggaggauug 4740
aaagggucuc cuacgaacau cguagugucc aucagucuua ggugaaucca uucgaagaag 4800
ugagguaggc ccaucaacug auugauggca ugagcgaaca auuugauugu cugauaucuc 4860
caauuaagac aguacuuuug caggucaguu guuaugaagg uugcaacucu ccgacgguuc 4920
uugcuuuucg gaucaugauu gcgguuugaa gauacucuuu cuuuacaguc agugauacgu 4980
uucuuauugc uguuaaaaga caguugacuc aucgcuagca uacucuuggu caaggauaug 5040
cuauccugaa ugacuccauu ucccugaaag aaaggugcaa ucugaucggc uaggaucccu 5100
uccgccauca ccugacaguu ccuuaacuuc uuugucagcu uagcgaagau ccguccauua 5160
acuuucacuu ccuucuccuu gagcgaguau gauacugcca cauugucauc ucuaagguac 5220
ucaagggucg ucagauauuc caucucuuua uauggaucaa aaucauuuga cucuaaaaac 5280
ucuaucaaga ggcgauuagu cgaaguugcu ucuuuuacau guuucuucug gucuucggag 5340
agaagguucc gccuaaacga ggcaagccaa uuaucguugg ggugugcgau ugccuugucu 5400
uuuaggaaca ugcucagguu ggugacaggg ucauauucua uacauggcuc aaauucaagu 5460
gcagauaaac ucuuauacuc ucucaacaug auaucgugug aaaucucugc ugaaucugca 5520
uguaguugcc caaugaccuu cccauauauu guauccacuu ugacucgcgg ccacacaccu 5580
gcauucuucu uucuguaccc guugaugauu guucccuuga agaaagacag uaccugaagg 5640
aucauaucaa agucuaccau uuucggugcg cacauuuggc uccugacugc cuuugcugca 5700
auacgggacu caagcagugg gugaccccac agacgcaaca gacacaacau cucagcugcu 5760
ugauucuguu cuaaaccaga gaauacagua gcgauugcau gagucacgga uucugcuaua 5820
ucauugggga ggaggccaau uagaaugucu uuaagcuccu gcagguugaa ugcgaagaaa 5880
ucuccugcaa auguaccuga cggcucgagu agcuggacag cuccguaugc aaaucccucc 5940
auuagugaua caacaucgua gacuugauua cccaagucuu uugccagagc gucuauuaac 6000
cgcaaaaugu caucaauuuu cucugauaag cuucugagau gcaccgccgu gguugauauu 6060
auguugacca uaucucugcc cuccaucaua ucugcauaca ucaauacaag uuccugggua 6120
agacauguga acuuguucuc auucguaugc gucacaacga caaguucagg agugacaaag 6180
acuuggccua ccuuaugggu uagcaucacc aauuuguugg ccgcagaccu uguccuagcu 6240
gccaccauca gaugccucug gaucuguuuu auauggagcc augcaaacuu ggcuguggac 6300
cauuuugagu gaaaccagaa ugccggaucc guacgaaugc ugcugaacuc cucugaccgg 6360
gggacauugu uagaccaaga ugaccccagc aguuucuucu cuauaugcgu acacagccuu 6420
gugaacaguu cuccauaucu cguguuguga auuuggaucu ucuucucaau cuuccgaaau 6480
uuguugguug aaucugggac cucaauauua gccaguucuu cuaaacaccu gggguggagc 6540
acuccgguua uucuggaauu gugguuaaga guuuggugua cugcccuucc gaguuuuauc 6600
auucucucag uaucaggaga ggccgauuca aguauuuuuu uccauugucg gcugagaaug 6660
agguggucga agucacauuc aucaggaagc gguagcccag uuaauuucca guaauagagu 6720
aguuugugcu ugaccaaugg ugaagacagg ugugacucug guaggauaau cugaugcucu 6780
gcccuuucag gaccggagcu cgccaugucc uacccguauu guuaaccaug agcuguuuug 6840
ccuuguaucu cauugccacu uacauuuuuu cuuaaucaag agacuauuga caaggcuuaa 6900
ucugaucgca ugagcacugg cugauugugg ucaacuggca acauggaauu cgagcacgcg 6960
ccggcauucg guuugauucu ugaugucgca gaagauaggu gauacaaugc caucuuucca 7020
acuccuuuau aauugacuca acuagccaga ccuggcuucu cuaaccccgu caucuuugag 7080
gaucucaacu aguaacggga cgauucugaa uucuccgaag agaguauuag auauuucagc 7140
aaugcugaga caauaggucu uauuagucuu gaccacuuua aaacaaguug auguugugua 7200
ugcugcuuug guacugcuug aacucacucg aguaaugcga cugcgggaug ugcuaucgaa 7260
uacugcagac gcaggguuaa gucuugcuug uacaccauca agcauugucc cgaauacccc 7320
ucgcaaggug ugguuucuau agaagauuag gggauaugga ucuguauaga cuccaguaac 7380
acacgaguug gggcaucuug cugaagccug gcaagggaua cuaccuggcc gagugaaggc 7440
auugaaugua uaaggacuau gaagaguggc uguuuuguug cugacuguca uaggauauaa 7500
uaacgcggga gagaaguaug augacccucg uugauacaag aaaugagaug ucccuacugu 7560
gagaauucug ccuucggccc ccaugagugu gacuguguug ggcgguacag ucaguaccgg 7620
gucuucgccu aaggauguug acaccuugau agauaagaua gccugcugua ugcguuuccc 7680
accaaaccgu ccaggcuuau acgaagacuu ggccauucga aucugguagu cuugcucauc 7740
ugggcaugug ucauuguauc gcuuguauau cacauauuuc ccuuccugua cagugucacu 7800
gggugaauug gguuuuaacc cuccguagac ugagaaccau acgcggcugu caauaaaaga 7860
uccacccccu acuccugggu aguuggccac ccaguccccg aauaauguug ugacaucuag 7920
guccuuuucg ugguacuggc cgucgaaccc uaaccuccca uguaccaucc gcguagggac 7980
agcugaguua uaaucuucuu ccucugucuc cgugacuuuc gagcacagca uaucacaacc 8040
caggggaguu gcacucacac ugcaagacuu ccgauuuugg gugucgucca gguugaugga 8100
acgcagagua gaaaagaaua cccucccugu ugcagauguc cggagcacac caagugcuaa 8160
auacugauau gaaugugagu gaucucugca uccagacaau auuacauuau ggguguagca 8220
guaaugggua gcacucaugu caaaugaggg uauucgagug caaccugauc cuguaguagg 8280
cgccgggaua aaauucagau guucuugaaa ugcagaggga uagaaugaug ugacaucacu 8340
agcaucaucu acaaugaguu cuuugccuau ccccccuaua uaaucugggu cauggauagg 8400
ugccccccac ccacuguugu uugcagcucc auuaaucuga uaagagagag auguuauugc 8460
guucauaauu guggucucag uauuuaacaa ugccaacgga gacucaaggg ccacuugcuu 8520
auauauccua ucuacuacau cuugauugga accaagugua gauguaaucu uuucuucugc 8580
ccuggaaauc cuagucggua ugccuacaag aucgcuaggu gugcuagccc ccaugcuaua 8640
uaaaagggag gcuacagaua uagccaaggu cacuacuguu aagaauaaga uugcaauccg 8700
gaauaucaag cgccauguau uuuuugccuc ucuuucauca uucucuaacg caacuuggcu 8760
aacggcgcgg uccaugauug aggacuguug ucggugaagc gguagaacgg agguugugaa 8820
gccuggcucg caauugaggg gcggccucuc uuaccguucu acccguauau cguccuuugg 8880
ucaucuacaa ccgguaguuu uuucuuaacu cucugaacug acagacuacc agaacuuuca 8940
cacaaauuac uauuagggaa accuucguuc cucaucugug uucacauuuu uguaguggcu 9000
cucaucugau cuagaguauu auucccaagc cauaauaagg ucuuuuguug cgccuuuugc 9060
uuguacauua gguagcaugc uagaaucagg cuaaguauac caaaaacaag agauaugaua 9120
gucaaaacga uauagguaau gagagcagau gugcuaguca guuugacauu gacuuugucu 9180
aguuuucugu ugcuuuccuc uaacuuauuc aaagcauuac ugaucgaguu guugacauuc 9240
ccaagcucag uugagauauc aagauugccu guuauuauua cuugagaauc uuguauugag 9300
auauucuucu gauaaguuac aucgaauucc ccacugagcc uuaaaguuau cccgccuaag 9360
gauaaaacau ugcaugauug uuuaucuauu agagacacgg cuucuccaua guuuugcgau 9420
augauacccg ggggguuuac acaucuacau guugucaucu ugcaguuggc gaugacugaa 9480
ccuuugauag ucauguaugg uguaguaagu gcgccuucgg ucuuugagua cauacaggcc 9540
gacguauugc cgcucaagca ggaauaaaua ccaggggaca uagggaacgu uacuauucuu 9600
guacaauaua aaucuaaguc aguuucuaua caguaugagg ugucaaguuc uucuaucaca 9660
gaaccgaccu gugucaccac uuuugggaca agugccgagg caaauccccu gguugugcuu 9720
acggauaagg uuuccaagua gguggcacgc auauuauuua gguucccgac ugaaggggca 9780
guuaccugua uacccaagag uugagucugu gagucguaua gaauaggguu accggugauu 9840
aagccgcuac cgauuaauga gcugaguuga uuguucccua caccuaacuu agucaauaag 9900
uaauccauau uuccaccagc uagauuguaa agugccugaa uagucagcuu guuuaaagca 9960
ggugaaguga uuuguggucc gaauacugua gucaauucgg uuagguacag guugagcucu 10020
acaccaacuu gcugugcaau uuugaugcag ucuaauuccu gagcuguuuu auuaaauugg 10080
ucauuaacaa acugcugcau cuucccaacu gccacugcua guugcgauaa uccgucagug 10140
accucaugca cagccucauu gguugcggca augcucucuu uaagucggag gauguuggca 10200
gcauuuuguu uggcuuguau cagagcugcg gccgcuguua uuugugcggc aguugcaacc 10260
ccaagagcca caccgccaau aauggcgccu auaaggcgcc ccugucuccc cccuccagau 10320
guagucacag acucuuguau ccuacggaua gagucaccaa ggggggugag caaagugguc 10380
aauguccugu uguaugcauc caagggggcu uucgcacaug ccuccuuauc cuugggcaga 10440
uucgggagga gcuuaacuau gauugauccu gucugggaug agguguauau guugacggcu 10500
uugucuccug uaaccacaau uccugcagcu gcaagaggcc ugccaucaau ggaguuugcc 10560
ggacagaugc aacucaguac cagcgcaacc cggauaguca gcaucauagg ugcuggguuc 10620
uugguagaag gucuggagcc caucuugcac cuggagggcg ccaaccggga uccagaaucu 10680
ucuacccgug uuuuuucuaa cuugauagac agguaaacua acuguaaaua aucaagacag 10740
auuaguuuuu ugugucauga ugaucugggu gagugggcgg agcgcaaucu cagagacgca 10800
gcuuauuucu uaaaaggauu guauuuggca agggugugcc ccuucuccag cuuaguagag 10860
guaaccucgu ggucggcggu cacugcgaca gcgcguuggg uaccugcuug gauaaugauu 10920
uuaacgcucc gcaggcacgc gguuugacuc cagaguaucu uggccaccug aggagaagca 10980
uuugcuaugg gauagcaggc ugucccacug cuagagaaga aaggugccaa aagcuuaguc 11040
cgugcaccuc uugcuuuuac caacacggaa ggcccgagca caucacugag cccgacagau 11100
agaucaaggc uccuuauuuu cuuuuccagc uugucaaaug ucacuuucuu ccccuuccua 11160
ucuacagugg ucauaagucc aauaugcaag aagagguuag cauaguaucc gcugucagac 11220
uuagacagag auuuaaccaa aggacuccuc gggucuaccu ccacauuaau agugacauug 11280
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acaucccucu ucgguaccac agucaaggag acaaaguuca ccuuguauuc uaggguucca 11400
cucccgggaa ucuucucugg cgcuuucacg ugcuugacug cauucacuga ugaguauuug 11460
uuugccacaa cccuacagcu uugcagcacu uggggugccu gcacuacuga gaaaaccauu 11520
cucucaguau uaguugcacu cuucuugcau gugacuauca uagugagaca ggcccuugcc 11580
agcucaauaa ggucuccggu auuugggacg cuuccuaggc agagcaucgc agcggaaagu 11640
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aagaugaauc cauagguggu gaugaauacu gaguccuccu uacuaucagu ccacaaguca 11760
aggcgcugga uccuauauug cggggcgauu ugcuucuucc caucuccugu gucuuguagg 11820
acgaucggaa augcuaacag guugcuagaa gaaugggcag aaucaaagua cagcccaauu 11880
guccuagaug aguccaucuu ggcacaauug gggcacucca auucuacccg uauuuuuucu 11940
uaaucuuaaa uguagcuaga uuaauuacgg uuacgcgauc auucaguggg gcugaggaag 12000
cgagagagga uugccgcuug gagaguugga ccuugggucc gcggaucauu aggaagcauu 12060
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gcacagcuug aucuuggucu uguagaaauc uggcuccucc agagaggacu ucugaggcac 12180
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ugucuuucua gaggccaggc aggagccguu ggugaugaag cuugucuccc ggcuguucag 12420
acaggacucg uucuugguca gcuccagugg caggcaggcc uccacugugg aggucuuauc 12480
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ccucacgcug auagaggcgu ucuuucuaca gaucacggug gcagaugucu uaucggugaa 12780
cacucugucc uucuucuccc gcuuggacuu gcccugcacc ugcacgcaaa aggucagaga 12840
gaaauaggag uguggugugc uccagguguc aggguacucc caggacaccu ccaccugucu 12900
gcuauucuuc agaggcuuca gcugcagguu cuuaggggga ucgggcuuga ugaugucccg 12960
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auacucguac uccuuguuau cgccgcgcac ccucucggcg cucagggugg cugcuccgca 13140
ugucacuccc ugugggucag aggauccccu gcuagacuuc acagaaaaug ucagaucggu 13200
ggagauugug gucagccacc aacaggugaa ccggccgcua uaauucuugg ccucgcaccg 13260
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gggggggaac ucggugcaga uuccguguga ugccgagugg acagggaccc gcuacgugug 13740
gcaguaguaa uuagccauuu agagcaaggc gcuugauuuu ccugauuucc ucgaucgacc 13800
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gaauaucccu cuucuacccg uacuuuuuuc uaauucccuc ggcucuguuu ugauuguuag 15060
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cuacggguga gggcauuggg auguuuuugu ggaagcaggc uggguuuugu ccaucaauac 15240
ccccagucgg ugucguuauc uugggauggc ccaggaguug ggggaggccc cgauugggga 15300
gugcccugug cagaguuugg cgccucccuc augcuauuug cuaccgcucu caucagaucc 15360
aggaauuggg ucuccccauc cccggcuucu gguugcccuu gcgaucuauu cgauccgccu 15420
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gcugcugggg uuagcuuuag cucggcagcc auauccucgu uaaugcuacu ucccugagcc 15600
ugagcguacu cuacuccaag ucuccagaau gaugugcuca uaaagucccu ggcaaauugg 15660
uauuucccag uaccuuuauc uaggacugau gccauaccca uggcaaagga guaaaguugu 15720
gcauacucgg caggcgcaaa gcucaucugg ucacuaucac caaguaaugu cauguacggc 15780
gcauuaucuc cuuucauccg auacaaacgc augagcugcu ucaucuucug gaugucgccu 15840
gagaggcuac uaagugcaag ggcugauguc uugguguuga uuccguacuu gagugucaag 15900
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cggacugcaa gagacugucu gaucgugagu uggauugugc uccugcauac gggguagagg 16080
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ucaucugcag ucucauacgc agucauggcu uuugcuacug ugacccauac uugagccugg 16200
auagagagga uccucuccag gguaucggug augucuucug gugcaucauc uucggccccg 16260
gcugugacga acgggguucc guugcugcau gcccgaggga gagauccugc uaucaucgca 16320
aaucucugug cucucucuuc agacacucca cuccuauugu ugaacugggg cgugccguug 16380
gcaaagccau caaucucaag cacggccaau guggcuucau ucuguuuccc ugcaagggca 16440
acaugguucc ucauuaccug ugagugggag cauaaaagag auaugagagc accuugccug 16500
agugguuugu uggcaucuuc gcuaacagca auccggaggc agaauaccac aaagcuccau 16560
cuaucuucug ggucaucacu guuaagagug aauaccggga cgucuacuuu uaagguacuc 16620
ccuuuuucuc ccccuccaug agcuccauug gggcgagucu gagccgcgag gagcuguucg 16680
uacucaucaa auacggaaga cauguuggca gaaggcuuuc ucgaguuugu gcuucgggcu 16740
cgcacucgag auucacaccu ucuacccgug cgacuucaau ugcuccuucg ccuuuuaucg 16800
uaacucacgg auucucuguu uggu 16824
<210> 53
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 53
atgtgccatc agcagctggt catctcatgg ttctccctgg tgtttctggc ctcacctctg 60
gtcgcaatct gggaactgaa aaaggatgtg tacgtggtgg agctggactg gtatcccgat 120
gcccctggcg agatggtggt gctgacctgc gacacacccg aggaggatgg catcacctgg 180
acactggatc agagctccga ggtgctggga agcggcaaga ccctgacaat ccaggtgaag 240
gagttcggcg acgccggcca gtacacctgt cacaagggag gagaggtgct gagccactcc 300
ctgctgctgc tgcacaagaa ggaggatggc atctggtcca cagacatcct gaaggatcag 360
aaggagccaa agaacaagac cttcctgcgg tgcgaggcca agaattatag cggccggttc 420
acctgttggt ggctgaccac aatctccacc gatctgacat tttctgtgaa gtctagcagg 480
ggatcctctg acccacaggg agtgacatgc ggagcagcca ccctgagcgc cgagagggtg 540
cgcggcgata acaaggagta cgagtattcc gtggagtgcc aggaggactc tgcctgtcca 600
gcagcagagg agtccctgcc tatcgaagtg atggtggatg ccgtgcacaa gctgaagtac 660
gagaattata ccagctcctt ctttatccgg gacatcatca agcccgatcc ccctaagaac 720
ctgcagctga agcctctgaa gaatagcaga caggtggagg tgtcctggga gtaccctgac 780
acctggagca caccacactc ctatttctct ctgacctttt gcgtgcaggt gcagggcaag 840
tccaagcggg agaagaagga cagagtgttc accgataaga catctgccac cgtgatctgt 900
agaaagaacg cctctatcag cgtgagggcc caggaccgct actattctag ctcctggtcc 960
gagtgggcct ctgtgccttg cagcggcgga ggaggaggag gatctaggaa tctgccagtg 1020
gcaacccctg acccaggcat gttcccctgc ctgcaccaca gccagaacct gctgagggcc 1080
gtgtccaata tgctgcagaa ggcccgccag acactggagt tttacccttg taccagcgag 1140
gagatcgacc acgaggacat cacaaaggat aagacctcca cagtggaggc ctgcctgcca 1200
ctggagctga ccaagaacga gtcctgtctg aacagccggg agacaagctt catcaccaac 1260
ggctcctgcc tggcctctag aaagacaagc tttatgatgg ccctgtgcct gtctagcatc 1320
tacgaggacc tgaagatgta tcaggtggag ttcaagacca tgaacgccaa gctgctgatg 1380
gaccccaaga ggcagatctt tctggatcag aatatgctgg ccgtgatcga cgagctgatg 1440
caggccctga acttcaatag cgagacagtg cctcagaagt cctctctgga ggagccagat 1500
ttctacaaga ccaagatcaa gctgtgcatc ctgctgcacg cctttcggat cagagccgtg 1560
acaatcgacc gcgtgatgtc ctatctgaat gcttcctaa 1599
<210> 54
<211> 984
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 54
atgtgccatc agcagctggt catctcatgg ttctccctgg tgtttctggc ctcacctctg 60
gtcgcaatct gggaactgaa aaaggatgtg tacgtggtgg agctggactg gtatcccgat 120
gcccctggcg agatggtggt gctgacctgc gacacacccg aggaggatgg catcacctgg 180
acactggatc agagctccga ggtgctggga agcggcaaga ccctgacaat ccaggtgaag 240
gagttcggcg acgccggcca gtacacctgt cacaagggag gagaggtgct gagccactcc 300
ctgctgctgc tgcacaagaa ggaggatggc atctggtcca cagacatcct gaaggatcag 360
aaggagccaa agaacaagac cttcctgcgg tgcgaggcca agaattatag cggccggttc 420
acctgttggt ggctgaccac aatctccacc gatctgacat tttctgtgaa gtctagcagg 480
ggatcctctg acccacaggg agtgacatgc ggagcagcca ccctgagcgc cgagagggtg 540
cgcggcgata acaaggagta cgagtattcc gtggagtgcc aggaggactc tgcctgtcca 600
gcagcagagg agtccctgcc tatcgaagtg atggtggatg ccgtgcacaa gctgaagtac 660
gagaattata ccagctcctt ctttatccgg gacatcatca agcccgatcc ccctaagaac 720
ctgcagctga agcctctgaa gaatagcaga caggtggagg tgtcctggga gtaccctgac 780
acctggagca caccacactc ctatttctct ctgacctttt gcgtgcaggt gcagggcaag 840
tccaagcggg agaagaagga cagagtgttc accgataaga catctgccac cgtgatctgt 900
agaaagaacg cctctatcag cgtgagggcc caggaccgct actattctag ctcctggtcc 960
gagtgggcct ctgtgccttg cagc 984
<210> 55
<211> 594
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 55
aggaatctgc cagtggcaac ccctgaccca ggcatgttcc cctgcctgca ccacagccag 60
aacctgctga gggccgtgtc caatatgctg cagaaggccc gccagacact ggagttttac 120
ccttgtacca gcgaggagat cgaccacgag gacatcacaa aggataagac ctccacagtg 180
gaggcctgcc tgccactgga gctgaccaag aacgagtcct gtctgaacag ccgggagaca 240
agcttcatca ccaacggctc ctgcctggcc tctagaaaga caagctttat gatggccctg 300
tgcctgtcta gcatctacga ggacctgaag atgtatcagg tggagttcaa gaccatgaac 360
gccaagctgc tgatggaccc caagaggcag atctttctgg atcagaatat gctggccgtg 420
atcgacgagc tgatgcaggc cctgaacttc aatagcgaga cagtgcctca gaagtcctct 480
ctggaggagc cagatttcta caagaccaag atcaagctgt gcatcctgct gcacgccttt 540
cggatcagag ccgtgacaat cgaccgcgtg atgtcctatc tgaatgcttc ctaa 594
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 56
His Asn Arg Thr Lys Ser Phe
1 5
<210> 57
<211> 918
<212> DNA
<213> 智人
<400> 57
atatgggaac tgaagaaaga tgtttatgtc gtagaattgg attggtatcc ggatgcccct 60
ggagaaatgg tggtcctcac ctgtgacacc cctgaagaag atggtatcac ctggaccttg 120
gaccagagca gtgaggtctt aggctctggc aaaaccctga ccatccaagt caaagagttt 180
ggagatgctg gccagtacac ctgtcacaaa ggaggcgagg ttctaagcca ttcgctcctg 240
ctgcttcaca aaaaggaaga tggaatttgg tccactgata ttttaaagga ccagaaagaa 300
cccaaaaata agacctttct aagatgcgag gccaagaatt attctggacg tttcacctgc 360
tggtggctga cgacaatcag tactgatttg acattcagtg tcaaaagcag cagaggctct 420
tctgaccccc aaggggtgac gtgcggagct gctacactct ctgcagagag agtcagaggg 480
gacaacaagg agtatgagta ctcagtggag tgccaggagg acagtgcctg cccagctgct 540
gaggagagtc tgcccattga ggtcatggtg gatgccgttc acaagctcaa gtatgaaaac 600
tacaccagca gcttcttcat cagggacatc atcaaacctg acccacccaa gaacttgcag 660
ctgaagccat taaagaattc tcggcaggtg gaggtcagct gggagtaccc tgacacctgg 720
agtactccac attcctactt ctccctgaca ttctgcgttc aggtccaggg caagagcaag 780
agagaaaaga aagatagagt cttcacggac aagacctcag ccacggtcat ctgccgcaaa 840
aatgccagca ttagcgtgcg ggcccaggac cgctactata gctcatcttg gagcgaatgg 900
gcatctgtgc cctgcagt 918
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 58
His Asn Lys Thr Lys Ser Phe
1 5
<210> 59
<211> 918
<212> DNA
<213> 智人
<400> 59
atctgggaac tgaaaaagga tgtgtacgtg gtggagctgg actggtatcc cgatgcccct 60
ggcgagatgg tggtgctgac ctgcgacaca cccgaggagg atggcatcac ctggacactg 120
gatcagagct ccgaggtgct gggaagcggc aagaccctga caatccaggt gaaggagttc 180
ggcgacgccg gccagtacac ctgtcacaag ggaggagagg tgctgagcca ctccctgctg 240
ctgctgcaca agaaggagga tggcatctgg tccacagaca tcctgaagga tcagaaggag 300
ccaaagaaca agaccttcct gcggtgcgag gccaagaatt atagcggccg gttcacctgt 360
tggtggctga ccacaatctc caccgatctg acattttctg tgaagtctag caggggatcc 420
tctgacccac agggagtgac atgcggagca gccaccctga gcgccgagag ggtgcgcggc 480
gataacaagg agtacgagta ttccgtggag tgccaggagg actctgcctg tccagcagca 540
gaggagtccc tgcctatcga agtgatggtg gatgccgtgc acaagctgaa gtacgagaat 600
tataccagct ccttctttat ccgggacatc atcaagcccg atccccctaa gaacctgcag 660
ctgaagcctc tgaagaatag cagacaggtg gaggtgtcct gggagtaccc tgacacctgg 720
agcacaccac actcctattt ctctctgacc ttttgcgtgc aggtgcaggg caagtccaag 780
cgggagaaga aggacagagt gttcaccgat aagacatctg ccaccgtgat ctgtagaaag 840
aacgcctcta tcagcgtgag ggcccaggac cgctactatt ctagctcctg gtccgagtgg 900
gcctctgtgc cttgcagc 918
<210> 60
<211> 16824
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 60
accaaacaaa gauuugguga augacgagac uacacucaag aauaauugug cgcaaccuuu 60
uuuuaagaca uuuauuugag uucgaauucg aguccuaagg agucaggguu caacuuuuuu 120
cuaacauaau augauuaaau caacaagaau acaauuggcc aaaaaaggag ccuauuaaua 180
ugugauuuuc guuaagaguc acaguuacug uaauauccuu ugacugcauu gccuauaguu 240
uucauguaga auuuuuguug agcacgaguc aaguacagua cagaaguguc uguaaacauu 300
ucuuugaguu ugguaauacc uaggacagcc uucaaauauu uagggcaggu acuaugcuuc 360
aaguaugucc uuagugggau aagguccucc auggagauca ugccuuuaag cacuaggcug 420
auuauaucgc cuauuuuauu gagauuuucg acucuaagac cuaguauugu aaccucuagg 480
aucugucucg ugcacuguuu aagugauguc cucuuuuucc cgucaguaga gagauuguaa 540
gggguaaaua gaaauacugu gucagcgaga ucacccucag cuuccauaua uaucacagac 600
cggauaacug ugucaaugug acuagcgaug aucuggguua ucugaguuau guucgcuagc 660
gugcucacca gacucuccgc acagaaugga cggacgggcu gucccccggc uucaaucagc 720
gcagugucaa uauucuuccu caaguacuuu auuaaucuug guaaaggacu ggauaggaug 780
ucugucacac gcugccgcug ugaggugaau aaccugguca gugugaucuc aucugauuua 840
gacaaaagcg uaccgugccg cugcaccaga guuuucgcca uccucaccac cucauguaca 900
aauguaggcc cgcccaggua acccaugaca aauaccaggu aacacuccau aucuccucga 960
caugcauaac cauuagagag aauauauccu uuuguggaac acggagcaaa caaguucaug 1020
aguagaugaa aguaguaucc cauugcauac aacacuuuga ugauuacuac cccgcccucc 1080
cuuacagaau gcauggcaau cagagauaaa uugauagcua guugaucuag uaagcuuuga 1140
uuggacccug gaggaauuuc aaugucacaa ugcagcaaug auacagaucu guagggcacu 1200
gcagauguaa uauaccccac uacuuuaucu gaggucaggu cgcuuuccuc uguauuuucu 1260
cuccauaaug gacggaacuc uuggacaaau ccaucuuugc auguuaccuc cgccuguaga 1320
uuccuauaaa caaccgaauu caaaaacuga guuggggucg gcccgaaaug ucguugcggg 1380
ggguucaucu cauuugaaaa gagcguauug uaauagauag uuucaugugg uacaugcagu 1440
ucgagaagac ucaugauggc uccgcucccu ucagcuaagu auaaggaguu cccgugucuu 1500
gcacaucuua ccucggguac agaaaggaga ugagaugccu uauaccaaga ggaagaugca 1560
gucccuaucc cucugaacaa guaucguacu aaguagucuu ccuccggauu uggagaugug 1620
aguucaggau gaaucugacu aagugugaau gcgucauacc uugcuggagc acucaaaucu 1680
aacucuugca aaaaugccgc agguugucgg gugaauggau cuuucacucg agcaccaaua 1740
ucuugcacag aagggaacuc uaauaauggc ucuuggggga acaacaacgc caggauagua 1800
ucccuguccu cccuuucccu gaucaaauug aggcucuucc gagacaugua guacagauua 1860
gcugggaaug uaauuauguu aggagacaug auagagcuca cuugaucggg gcuaaguaau 1920
gguuucacag cauccgacag uaaauacuca gugaguauug aacauuucuc uucugcaguu 1980
aagccucuua uuuucgggau uucucuuguu guagcaaaga guaccgugua cagacagcau 2040
aaccgggaua ucagcugaag caucuucuca uucagguuau caucuaagac agaugggaac 2100
agcagaucau acuuauuucc ugaauauaag ccggagauca cacgucgggu gcaagauacu 2160
aauaguuuug cagacauuuc gauaaaaucc guaucugcaa guugguguga uccgucaugg 2220
uugaccaggc ccacugcaug uaaccuugaa ugaaugacgg gaugagauau uguagcugca 2280
auguuggaaa guagaauucc uggcauauuc uuguauaaau cacccauaua uaagacaaua 2340
uuguccaggc cucuuacucu cagguaauag aguugguaag aacagucgag gagcacuuca 2400
agugcugcau auucaaauag gcggaccaca ucugaauucu gagcuucacu gauccaauuu 2460
cggguauugu cauacacuau uauggcguca uucuuuaugg agguaucuuc aucauaagaa 2520
accacagacu ggccaaucaa cuucccgcug gauauugaaa gaauguucau uagcucuauc 2580
gugggauaug acuccagauu aagcucauaa cucuugaaga uagcuaaguc aagucucgca 2640
aagucucccu ccgauacagg gcuaggauca uacauaaacu uauuugaggu cacuguccuc 2700
aguuccggua ccaccccaag uagcucgaaa ggaaccgcaa caggugcuuc ucugauacag 2760
caacuaaauu uacuauguag gugcagugug aucucaucau auguccuggu uguugucauu 2820
ggaaagaucg auucgauuag agauaaaccc aagagcauga ucuguuggua aaccacauuc 2880
cccucuuuga cuccuucuuc agugaacagc cuuugagaau cauuggauau gugaauguaa 2940
ggugacaccc uguagagaga ugcaggggug aaugucaucu gaguuauacc aucaucuagu 3000
cuauguugaa gauucccagc cguggguaaa ggggacagua accgaagaua cucuaaguuu 3060
acauuacacc gagauuuugc aaucguaaga gcagcagucc aauuuacuuc auuaucccca 3120
uaagcccaga ucaacacgga ugaugcccuu agggcagccu uuacaugugg cgacauauga 3180
gcuauuuuug caagugaggc agcucuccuc uccugugucu uugacccgag auaugguacc 3240
cucaucggag gauucuugcu ggugucaucg gucaauucua uauugcuugg aagauggaac 3300
caaguaaauu guucaucucc gcugucacau cuuguacacc cuccgcuuac acuaagaauc 3360
ucacccucua cgaguucuau cguaucagga uuagauacac ccaguauuuu ccugccuccc 3420
gucaaaggug accagcuucu auuccgugca uagucugcca gugucagaga acacauauua 3480
gaagagacua aggggugguu ggaucuacug gaggaaaaaa caucgucucu aaacagcauu 3540
gcaugcaugc uagaauaauu gacuauccgc aucagccucu ugaugccuaa uggccuccua 3600
guaagcgcaa ucuuaauuac gguguuuguu gugucaacaa gcccuugaau uugcuuucuc 3660
cuaccuacag agcuugccuc caugauggca ugcgcaacgc ggggaugaau caccucuuga 3720
uuaagcaaga auucagccaa ugccuucucu ucugccucau uauccucugu gugcacucca 3780
gacaauaagg gauuugaaca aguuucaaau aggacucuuu gcguauguuu cuuaagaaca 3840
auauuugggc uugcaacagu cucaaaauug aaagaguaug ggucguugca cagacuggcc 3900
caaucuccau ucccaggcgg ccuaguuaag auauuaguca uaauguuagg acucaguaau 3960
cccacugcuu cuagucgcuu gaucucugca aaagcaguag uccccggguc accgauauuu 4020
cuaguguaga gccuugagua uugaagguua cucagucccc cuaauugggc aggagucaga 4080
acauaugagu gcacaaaaga gauguccuca auccacgacu gauuaagauc ggggugcgaa 4140
uuguugguga uggagaacuc agagucaaag uaugucugca cacaacucau uauauaguuu 4200
aaauaguaac agaagucuuu gggaagcccg uucucgcaua gccgugcuac aguagaggca 4260
auguuggcac aggacauuac gguguuuuca cugagaucac cugacacuag cacuaauuua 4320
gaugaauuuu ugaggacuug acugaggauu gcuccaucuu ugaagauucg uuugcuguau 4380
augaagaaug ugucugaccu gaugguuuca cgauccuuca aauuauggcc aaucaaauga 4440
uugacaugaa uuaauuccuu gaagaaauua ucacuggcuu gaugcaacug ugucaacacc 4500
aucuccggag agucgucuga ucuuaccucu cucguuacug cuauuacuug auuaucaccc 4560
uguaccauac aggcaacacg acaaugcgau cuagcugcag caaguuggau ugcagcaauu 4620
gagaucauug uccauagcuu cuggcauaau ccuucgauac ccccucuggc acugacaaua 4680
uauaugucau cauuagggac ucuugagagg ucacagucag uagggucacu uggaggauug 4740
aaagggucuc cuacgaacau cguagugucc aucagucuua ggugaaucca uucgaagaag 4800
ugagguaggc ccaucaacug auugauggca ugagcgaaca auuugauugu cugauaucuc 4860
caauuaagac aguacuuuug caggucaguu guuaugaagg uugcaacucu ccgacgguuc 4920
uugcuuuucg gaucaugauu gcgguuugaa gauacucuuu cuuuacaguc agugauacgu 4980
uucuuauugc uguuaaaaga caguugacuc aucgcuagca uacucuuggu caaggauaug 5040
cuauccugaa ugacuccauu ucccugaaag aaaggugcaa ucugaucggc uaggaucccu 5100
uccgccauca ccugacaguu ccuuaacuuc uuugucagcu uagcgaagau ccguccauua 5160
acuuucacuu ccuucuccuu gagcgaguau gauacugcca cauugucauc ucuaagguac 5220
ucaagggucg ucagauauuc caucucuuua uauggaucaa aaucauuuga cucuaaaaac 5280
ucuaucaaga ggcgauuagu cgaaguugcu ucuuuuacau guuucuucug gucuucggag 5340
agaagguucc gccuaaacga ggcaagccaa uuaucguugg ggugugcgau ugccuugucu 5400
uuuaggaaca ugcucagguu ggugacaggg ucauauucua uacauggcuc aaauucaagu 5460
gcagauaaac ucuuauacuc ucucaacaug auaucgugug aaaucucugc ugaaucugca 5520
uguaguugcc caaugaccuu cccauauauu guauccacuu ugacucgcgg ccacacaccu 5580
gcauucuucu uucuguaccc guugaugauu guucccuuga agaaagacag uaccugaagg 5640
aucauaucaa agucuaccau uuucggugcg cacauuuggc uccugacugc cuuugcugca 5700
auacgggacu caagcagugg gugaccccac agacgcaaca gacacaacau cucagcugcu 5760
ugauucuguu cuaaaccaga gaauacagua gcgauugcau gagucacgga uucugcuaua 5820
ucauugggga ggaggccaau uagaaugucu uuaagcuccu gcagguugaa ugcgaagaaa 5880
ucuccugcaa auguaccuga cggcucgagu agcuggacag cuccguaugc aaaucccucc 5940
auuagugaua caacaucgua gacuugauua cccaagucuu uugccagagc gucuauuaac 6000
cgcaaaaugu caucaauuuu cucugauaag cuucugagau gcaccgccgu gguugauauu 6060
auguugacca uaucucugcc cuccaucaua ucugcauaca ucaauacaag uuccugggua 6120
agacauguga acuuguucuc auucguaugc gucacaacga caaguucagg agugacaaag 6180
acuuggccua ccuuaugggu uagcaucacc aauuuguugg ccgcagaccu uguccuagcu 6240
gccaccauca gaugccucug gaucuguuuu auauggagcc augcaaacuu ggcuguggac 6300
cauuuugagu gaaaccagaa ugccggaucc guacgaaugc ugcugaacuc cucugaccgg 6360
gggacauugu uagaccaaga ugaccccagc aguuucuucu cuauaugcgu acacagccuu 6420
gugaacaguu cuccauaucu cguguuguga auuuggaucu ucuucucaau cuuccgaaau 6480
uuguugguug aaucugggac cucaauauua gccaguucuu cuaaacaccu gggguggagc 6540
acuccgguua uucuggaauu gugguuaaga guuuggugua cugcccuucc gaguuuuauc 6600
auucucucag uaucaggaga ggccgauuca aguauuuuuu uccauugucg gcugagaaug 6660
agguggucga agucacauuc aucaggaagc gguagcccag uuaauuucca guaauagagu 6720
aguuugugcu ugaccaaugg ugaagacagg ugugacucug guaggauaau cugaugcucu 6780
gcccuuucag gaccggagcu cgccaugucc uacccguauu guuaaccaug agcuguuuug 6840
ccuuguaucu cauugccacu uacauuuuuu cuuaaucaag agacuauuga caaggcuuaa 6900
ucugaucgca ugagcacugg cugauugugg ucaacuggca acauggaauu cgagcacgcg 6960
ccggcauucg guuugauucu ugaugucgca gaagauaggu gauacaaugc caucuuucca 7020
acuccuuuau aauugacuca acuagccaga ccuggcuucu cuaaccccgu caucuuugag 7080
gaucucaacu aguaacggga cgauucugaa uucuccgaag agaguauuag auauuucagc 7140
aaugcugaga caauaggucu uauuagucuu gaccacuuua aaacaaguug auguugugua 7200
ugcugcuuug guacugcuug aacucacucg aguaaugcga cugcgggaug ugcuaucgaa 7260
uacugcagac gcaggguuaa gucuugcuug uacaccauca agcauugucc cgaauacccc 7320
ucgcaaggug ugguuucuau agaagauuag gggauaugga ucuguauaga cuccaguaac 7380
acacgaguug gggcaucuug cugaagccug gcaagggaua cuaccuggcc gagugaaggc 7440
auugaaugua uaaggacuau gaagaguggc uguuuuguug cugacuguca uaggauauaa 7500
uaacgcggga gagaaguaug augacccucg uugauacaag aaaugagaug ucccuacugu 7560
gagaauucug ccuucggccc ccaugagugu gacuguguug ggcgguacag ucaguaccgg 7620
gucuucgccu aaggauguug acaccuugau agauaagaua gccugcugua ugcguuuccc 7680
accaaaccgu ccaggcuuau acgaagacuu ggccauucga aucugguagu cuugcucauc 7740
ugggcaugug ucauuguauc gcuuguauau cacauauuuc ccuuccugua cagugucacu 7800
gggugaauug gguuuuaacc cuccguagac ugagaaccau acgcggcugu caauaaaaga 7860
uccacccccu acuccugggu aguuggccac ccaguccccg aauaauguug ugacaucuag 7920
guccuuuucg ugguacuggc cgucgaaccc uaaccuccca uguaccaucc gcguagggac 7980
agcugaguua uaaucuucuu ccucugucuc cgugacuuuc gagcacagca uaucacaacc 8040
caggggaguu gcacucacac ugcaagacuu ccgauuuugg gugucgucca gguugaugga 8100
acgcagagua gaaaagaaua cccucccugu ugcagauguc cggagcacac caagugcuaa 8160
auacugauau gaaugugagu gaucucugca uccagacaau auuacauuau ggguguagca 8220
guaaugggua gcacucaugu caaaugaggg uauucgagug caaccugauc cuguaguagg 8280
cgccgggaua aaauucagau guucuugaaa ugcagaggga uagaaugaug ugacaucacu 8340
agcaucaucu acaaugaguu cuuugccuau ccccccuaua uaaucugggu cauggauagg 8400
ugccccccac ccacuguugu uugcagcucc auuaaucuga uaagagagag auguuauugc 8460
guucauaauu guggucucag uauuuaacaa ugccaacgga gacucaaggg ccacuugcuu 8520
auauauccua ucuacuacau cuugauugga accaagugua gauguaaucu uuucuucugc 8580
ccuggaaauc cuagucggua ugccuacaag aucgcuaggu gugcuagccc ccaugcuaua 8640
uaaaagggag gcuacagaua uagccaaggu cacuacuguu aagaauaaga uugcaauccg 8700
gaauaucaag cgccauguau uuuuugccuc ucuuucauca uucucuaacg caacuuggcu 8760
aacggcgcgg uccaugauug aggacuguug ucggugaagc gguagaacgg agguugugaa 8820
gccuggcucg caauugaggg gcggccucuc uuaccguucu acccguauau cguccuuugg 8880
ucaucuacaa ccgguaguuu uuucuuaacu cucugaacug acagacuacc agaacuuuca 8940
cacaaauuac uauuagggaa accuucguuc cucaucugug uucacauuuu uguaguggcu 9000
cucaucugau cuagaguauu auucccaagc cauaauaagg ucuuuuguug cgccuuuugc 9060
uuguacauua gguagcaugc uagaaucagg cuaaguauac caaaaacaag agauaugaua 9120
gucaaaacga uauagguaau gagagcagau gugcuaguca guuugacauu gacuuugucu 9180
aguuuucugu ugcuuuccuc uaacuuauuc aaagcauuac ugaucgaguu guugacauuc 9240
ccaagcucag uugagauauc aagauugccu guuauuauua cuugagaauc uuguauugag 9300
auauucuucu gauaaguuac aucgaauucc ccacugagcc uuaaaguuau cccgccuaag 9360
gauaaaacau ugcaugauug uuuaucuauu agagacacgg cuucuccaua guuuugcgau 9420
augauacccg ggggguuuac acaucuacau guugucaucu ugcaguuggc gaugacugaa 9480
ccuuugauag ucauguaugg uguaguaagu gcgccuucgg ucuuugagua cauacaggcc 9540
gacguauugc cgcucaagca ggaauaaaua ccaggggaca uagggaacgu uacuauucuu 9600
guacaauaua aaucuaaguc aguuucuaua caguaugagg ugucaaguuc uucuaucaca 9660
gaaccgaccu gugucaccac uuuugggaca agugccgagg caaauccccu gguugugcuu 9720
acggauaagg uuuccaagua gguggcacgc auauuauuua gguucccgac ugaaggggca 9780
guuaccugua uacccaagag uugagucugu gagucguaua gaauaggguu accggugauu 9840
aagccgcuac cgauuaauga gcugaguuga uuguucccua caccuaacuu agucaauaag 9900
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ggugaaguga uuuguggucc gaauacugua gucaauucgg uuagguacag guugagcucu 10020
acaccaacuu gcugugcaau uuugaugcag ucuaauuccu gagcuguuuu auuaaauugg 10080
ucauuaacaa acugcugcau cuucccaacu gccacugcua guugcgauaa uccgucagug 10140
accucaugca cagccucauu gguugcggca augcucucuu uaagucggag gauguuggca 10200
gcauuuuguu uggcuuguau cagagcugcg gccgcuguua uuugugcggc aguugcaacc 10260
ccaagagcca caccgccaau aauggcgccu auaaggcgcc ccugucuccc cccuccagau 10320
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aauguccugu uguaugcauc caagggggcu uucgcacaug ccuccuuauc cuugggcaga 10440
uucgggagga gcuuaacuau gauugauccu gucugggaug agguguauau guugacggcu 10500
uugucuccug uaaccacaau uccugcagcu gcaagaggcc ugccaucaau ggaguuugcc 10560
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ucuacccgug uuuuuucuaa cuugauagac agguaaacua acuguaaaua aucaagacag 10740
auuaguuuuu ugugucauga ugaucugggu gagugggcgg agcgcaaucu cagagacgca 10800
gcuuauuucu uaaaaggauu guauuuggca agggugugcc ccuucuccag cuuaguagag 10860
guaaccucgu ggucggcggu cacugcgaca gcgcguuggg uaccugcuug gauaaugauu 10920
uuaacgcucc gcaggcacgc gguuugacuc cagaguaucu uggccaccug aggagaagca 10980
uuugcuaugg gauagcaggc ugucccacug cuagagaaga aaggugccaa aagcuuaguc 11040
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uuagacagag auuuaaccaa aggacuccuc gggucuaccu ccacauuaau agugacauug 11280
agcgcaagau uguacagacu cgagccagaa accuucaaua cugcagcugg gaucuuguag 11340
acaucccucu ucgguaccac agucaaggag acaaaguuca ccuuguauuc uaggguucca 11400
cucccgggaa ucuucucugg cgcuuucacg ugcuugacug cauucacuga ugaguauuug 11460
uuugccacaa cccuacagcu uugcagcacu uggggugccu gcacuacuga gaaaaccauu 11520
cucucaguau uaguugcacu cuucuugcau gugacuauca uagugagaca ggcccuugcc 11580
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aggcgcugga uccuauauug cggggcgauu ugcuucuucc caucuccugu gucuuguagg 11820
acgaucggaa augcuaacag guugcuagaa gaaugggcag aaucaaagua cagcccaauu 11880
guccuagaug aguccaucuu ggcacaauug gggcacucca auucuacccg uauuuuuucu 11940
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aucuagaaag aucugccucu uaggauccau cagaagcuuu gcauucaugg ucuugaacuc 12300
caccugguac aucuucaagu cuucauaaau acuacuaagg cacagggcca ucauaaaaga 12360
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<210> 61
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 61
atatgggaac tgaagaaaga tgtttatgtc gtagaattgg attggtatcc ggatgcccct 60
ggagaaatgg tggtcctcac ctgtgacacc cctgaagaag atggtatcac ctggaccttg 120
gaccagagca gtgaggtctt aggctctggc aaaaccctga ccatccaagt caaagagttt 180
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ctgcttcaca aaaaggaaga tggaatttgg tccactgata ttttaaagga ccagaaagaa 300
cccaaaaata agacctttct aagatgcgag gccaagaatt attctggacg tttcacctgc 360
tggtggctga cgacaatcag tactgatttg acattcagtg tcaaaagcag cagaggctct 420
tctgaccccc aaggggtgac gtgcggagct gctacactct ctgcagagag agtcagaggg 480
gacaacaagg agtatgagta ctcagtggag tgccaggagg acagtgcctg cccagctgct 540
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ctgaagccat taaagaattc tcggcaggtg gaggtcagct gggagtaccc tgacacctgg 720
agtactccac attcctactt ctccctgaca ttctgcgttc aggtccaggg caagagcaag 780
agagaaaaga aagatagagt cttcacggac aagacctcag ccacggtcat ctgccgcaaa 840
aatgccagca ttagcgtgcg ggcccaggac cgctactata gctcatcttg gagcgaatgg 900
gcatctgtgc cctgcagtgg tggcggtggc ggcggatcta gaaacctccc cgtggccact 960
ccagacccag gaatgttccc atgccttcac cactcccaaa acctgctgag ggccgtcagc 1020
aacatgctcc agaaggccag acaaactcta gaattttacc cttgcacttc tgaagagatt 1080
gatcatgaag atatcacaaa agataaaacc agcacagtgg aggcctgttt accattggaa 1140
ttaaccaaga atgagagttg cctaaattcc agagagacct ctttcataac taatgggagt 1200
tgcctggcct ccagaaagac ctcttttatg atggccctgt gccttagtag tatttatgaa 1260
gactcgaaga tgtaccaggt ggagttcaag accatgaatg caaagcttct gatggatcct 1320
aagaggcaga tctttctaga tcaaaacatg ctggcagtta ttgatgagct gatgcaggcc 1380
ctgaatttca acagtgagac tgtgccacaa aaatcctccc ttgaagaacc ggatttttat 1440
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gatagagtga tgagctatct gaatgcttcc taa 1533
<210> 62
<211> 16824
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 62
accaaacaga gaatccgtga gttacgataa aaggcgaagg agcaattgaa gtcgcacggg 60
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cctctacctg atagaccagg acaaacatgg ccacctttac agatgcagag atcgacgagc 1920
tatttgagac aagtggaact gtcattgaca acataattac agcccagggt aaaccagcag 1980
agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaagaccaa ggtgctgagc gcagcatggg 2040
agaagcatgg gagcatccag ccaccggcca gtcaagacaa ccccgatcga caggacagat 2100
ctgacaaaca accatccaca cccgagcaaa cgaccccgca tgacagcccg ccggccacat 2160
ccgccgacca gccccccacc caggccacag acgaagccgt cgacacacag ctcaggaccg 2220
gagcaagcaa ctctctgctg ttgatgcttg acaagctcag caataaatcg tccaatgcta 2280
aaaagggccc atggtcgagc ccccaagagg ggaatcacca acgtccgact caacagcagg 2340
ggagtcaacc cagtcgcgga aacagtcagg aaagaccgca gaaccaagtc aaggccgccc 2400
ctggaaacca gggcacagac gtgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac 2460
tatcagctgg tgcaacccct catgctctcc gatcaaggca gagccaagac aatacccttg 2520
tatctgcgga tcatgtccag ccacctgtag actttgtgca agcgatgatg tctatgatgg 2580
aggcgatatc acagagagta agtaaggttg actatcagct agatcttgtc ttgaaacaga 2640
catcctccat ccctatgatg cggtccgaaa tccaacagct gaaaacatct gttgcagtca 2700
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ctgctgctgc acaagaagga ggatggcatc tggtccacag acatcctgaa ggatcagaag 3540
gagccaaaga acaagacctt cctgcggtgc gaggccaaga attatagcgg ccggttcacc 3600
tgttggtggc tgaccacaat ctccaccgat ctgacatttt ctgtgaagtc tagcagggga 3660
tcctctgacc cacagggagt gacatgcgga gcagccaccc tgagcgccga gagggtgcgc 3720
ggcgataaca aggagtacga gtattccgtg gagtgccagg aggactctgc ctgtccagca 3780
gcagaggagt ccctgcctat cgaagtgatg gtggatgccg tgcacaagct gaagtacgag 3840
aattatacca gctccttctt tatccgggac atcatcaagc ccgatccccc taagaacctg 3900
cagctgaagc ctctgaagaa tagcagacag gtggaggtgt cctgggagta ccctgacacc 3960
tggagcacac cacactccta tttctctctg accttttgcg tgcaggtgca gggcaagtcc 4020
aagcgggaga agaaggacag agtgttcacc gataagacat ctgccaccgt gatctgtaga 4080
aagaacgcct ctatcagcgt gagggcccag gaccgctact attctagctc ctggtccgag 4140
tgggcctctg tgccttgcag cggcggagga ggaggaggat ctaggaatct gccagtggca 4200
acccctgacc caggcatgtt cccctgcctg caccacagcc agaacctgct gagggccgtg 4260
tccaatatgc tgcagaaggc ccgccagaca ctggagtttt acccttgtac cagcgaggag 4320
atcgaccacg aggacatcac aaaggataag acctccacag tggaggcctg cctgccactg 4380
gagctgacca agaacgagtc ctgtctgaac agccgggaga caagcttcat caccaacggc 4440
tcctgcctgg cctctagaaa gacaagcttt atgatggccc tgtgcctgtc tagcatctac 4500
gaggacctga agatgtatca ggtggagttc aagaccatga acgccaagct gctgatggac 4560
cccaagaggc agatctttct ggatcagaat atgctggccg tgatcgacga gctgatgcag 4620
gccctgaact tcaatagcga gacagtgcct cagaagtcct ctctggagga gccagatttc 4680
tacaagacca agatcaagct gtgcatcctg ctgcacgcct ttcggatcag agccgtgaca 4740
atcgaccgcg tgatgtccta tctgaatgct tcctaatgat ccgcggaccc aaggtccaac 4800
tctccaagcg gcaatcctct ctcgcttcct cagccccact gaatgatcgc gtaaccgtaa 4860
ttaatctagc tacatttaag attaagaaaa aatacgggta gaattggagt gccccaattg 4920
tgccaagatg gactcatcta ggacaattgg gctgtacttt gattctgccc attcttctag 4980
caacctgtta gcatttccga tcgtcctaca agacacagga gatgggaaga agcaaatcgc 5040
cccgcaatat aggatccagc gccttgactt gtggactgat agtaaggagg actcagtatt 5100
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gaagagtgca actaatactg agagaatggt tttctcagta gtgcaggcac cccaagtgct 5340
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gactgtggta ccgaagaggg atgtctacaa gatcccagct gcagtattga aggtttctgg 5520
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tattggactt atgaccactg tagataggaa ggggaagaaa gtgacatttg acaagctgga 5700
aaagaaaata aggagccttg atctatctgt cgggctcagt gatgtgctcg ggccttccgt 5760
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gacagcctgc tatcccatag caaatgcttc tcctcaggtg gccaagatac tctggagtca 5880
aaccgcgtgc ctgcggagcg ttaaaatcat tatccaagca ggtacccaac gcgctgtcgc 5940
agtgaccgcc gaccacgagg ttacctctac taagctggag aaggggcaca cccttgccaa 6000
atacaatcct tttaagaaat aagctgcgtc tctgagattg cgctccgccc actcacccag 6060
atcatcatga cacaaaaaac taatctgtct tgattattta cagttagttt acctgtctat 6120
caagttagaa aaaacacggg tagaagattc tggatcccgg ttggcgccct ccaggtgcaa 6180
gatgggctcc agaccttcta ccaagaaccc agcacctatg atgctgacta tccgggttgc 6240
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aggaattgtg gttacaggag acaaagccgt caacatatac acctcatccc agacaggatc 6360
aatcatagtt aagctcctcc cgaatctgcc caaggataag gaggcatgtg cgaaagcccc 6420
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cattattggc ggtgtggctc ttggggttgc aactgccgca caaataacag cggccgcagc 6600
tctgatacaa gccaaacaaa atgctgccaa catcctccga cttaaagaga gcattgccgc 6660
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gaagatgcag cagtttgtta atgaccaatt taataaaaca gctcaggaat tagactgcat 6780
caaaattgca cagcaagttg gtgtagagct caacctgtac ctaaccgaat tgactacagt 6840
attcggacca caaatcactt cacctgcttt aaacaagctg actattcagg cactttacaa 6900
tctagctggt ggaaatatgg attacttatt gactaagtta ggtgtaggga acaatcaact 6960
cagctcatta atcggtagcg gcttaatcac cggtaaccct attctatacg actcacagac 7020
tcaactcttg ggtatacagg taactgcccc ttcagtcggg aacctaaata atatgcgtgc 7080
cacctacttg gaaaccttat ccgtaagcac aaccagggga tttgcctcgg cacttgtccc 7140
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ttcctgcttg agcggcaata cgtcggcctg tatgtactca aagaccgaag gcgcacttac 7320
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taaacaatca tgcaatgttt tatccttagg cgggataact ttaaggctca gtggggaatt 7500
cgatgtaact tatcagaaga atatctcaat acaagattct caagtaataa taacaggcaa 7560
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tctcattacc tatatcgttt tgactatcat atctcttgtt tttggtatac ttagcctgat 7740
tctagcatgc tacctaatgt acaagcaaaa ggcgcaacaa aagaccttat tatggcttgg 7800
gaataatact ctagatcaga tgagagccac tacaaaaatg tgaacacaga tgaggaacga 7860
aggtttccct aatagtaatt tgtgtgaaag ttctggtagt ctgtcagttc agagagttaa 7920
gaaaaaacta ccggttgtag atgaccaaag gacgatatac gggtagaacg gtaagagagg 7980
ccgcccctca attgcgagcc aggcttcaca acctccgttc taccgcttca ccgacaacag 8040
tcctcaatca tggaccgcgc cgttagccaa gttgcgttag agaatgatga aagagaggca 8100
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ggcataccga ctaggatttc cagggcagaa gaaaagatta catctacact tggttccaat 8280
caagatgtag tagataggat atataagcaa gtggcccttg agtctccgtt ggcattgtta 8340
aatactgaga ccacaattat gaacgcaata acatctctct cttatcagat taatggagct 8400
gcaaacaaca gtgggtgggg ggcacctatc catgacccag attatatagg ggggataggc 8460
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gaacatctga attttatccc ggcgcctact acaggatcag gttgcactcg aataccctca 8580
tttgacatga gtgctaccca ttactgctac acccataatg taatattgtc tggatgcaga 8640
gatcactcac attcatatca gtatttagca cttggtgtgc tccggacatc tgcaacaggg 8700
agggtattct tttctactct gcgttccatc aacctggacg acacccaaaa tcggaagtct 8760
tgcagtgtga gtgcaactcc cctgggttgt gatatgctgt gctcgaaagt cacggagaca 8820
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gacggccagt accacgaaaa ggacctagat gtcacaacat tattcgggga ctgggtggcc 8940
aactacccag gagtaggggg tggatctttt attgacagcc gcgtatggtt ctcagtctac 9000
ggagggttaa aacccaattc acccagtgac actgtacagg aagggaaata tgtgatatac 9060
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ttctatagaa accacacctt gcgaggggta ttcgggacaa tgcttgatgg tgtacaagca 9540
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aataagacct attgtctcag cattgctgaa atatctaata ctctcttcgg agaattcaga 9720
atcgtcccgt tactagttga gatcctcaaa gatgacgggg ttagagaagc caggtctggc 9780
tagttgagtc aattataaag gagttggaaa gatggcattg tatcacctat cttctgcgac 9840
atcaagaatc aaaccgaatg ccggcgcgtg ctcgaattcc atgttgccag ttgaccacaa 9900
tcagccagtg ctcatgcgat cagattaagc cttgtcaata gtctcttgat taagaaaaaa 9960
tgtaagtggc aatgagatac aaggcaaaac agctcatggt taacaatacg ggtaggacat 10020
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tgatgaatgt gacttcgacc acctcattct cagccgacaa tggaaaaaaa tacttgaatc 10200
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gaatgagaac aagttcacat gtcttaccca ggaacttgta ttgatgtatg cagatatgat 10740
ggagggcaga gatatggtca acataatatc aaccacggcg gtgcatctca gaagcttatc 10800
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gccgtcaggt acatttgcag gagatttctt cgcattcaac ctgcaggagc ttaaagacat 10980
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attctctggt ttagaacaga atcaagcagc tgagatgttg tgtctgttgc gtctgtgggg 11100
tcacccactg cttgagtccc gtattgcagc aaaggcagtc aggagccaaa tgtgcgcacc 11160
gaaaatggta gactttgata tgatccttca ggtactgtct ttcttcaagg gaacaatcat 11220
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gagagagtat aagagtttat ctgcacttga atttgagcca tgtatagaat atgaccctgt 11400
caccaacctg agcatgttcc taaaagacaa ggcaatcgca caccccaacg ataattggct 11460
tgcctcgttt aggcggaacc ttctctccga agaccagaag aaacatgtaa aagaagcaac 11520
ttcgactaat cgcctcttga tagagttttt agagtcaaat gattttgatc catataaaga 11580
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gctcaaggag aaggaagtga aagttaatgg acggatcttc gctaagctga caaagaagtt 11700
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ccgcaatcat gatccgaaaa gcaagaaccg tcggagagtt gcaaccttca taacaactga 11940
cctgcaaaag tactgtctta attggagata tcagacaatc aaattgttcg ctcatgccat 12000
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cttcaaggaa ttaattcatg tcaatcattt gattggccat aatttgaagg atcgtgaaac 12420
catcaggtca gacacattct tcatatacag caaacgaatc ttcaaagatg gagcaatcct 12480
cagtcaagtc ctcaaaaatt catctaaatt agtgctagtg tcaggtgatc tcagtgaaaa 12540
caccgtaatg tcctgtgcca acattgcctc tactgtagca cggctatgcg agaacgggct 12600
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tcaatactca aggctctaca ctagaaatat cggtgacccg gggactactg cttttgcaga 12840
gatcaagcga ctagaagcag tgggattact gagtcctaac attatgacta atatcttaac 12900
taggccgcct gggaatggag attgggccag tctgtgcaac gacccatact ctttcaattt 12960
tgagactgtt gcaagcccaa atattgttct taagaaacat acgcaaagag tcctatttga 13020
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ggcattggct gaattcttgc ttaatcaaga ggtgattcat ccccgcgttg cgcatgccat 13140
catggaggca agctctgtag gtaggagaaa gcaaattcaa gggcttgttg acacaacaaa 13200
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cagcggagat gaacaattta cttggttcca tcttccaagc aatatagaat tgaccgatga 13560
caccagcaag aatcctccga tgagggtacc atatctcggg tcaaagacac aggagaggag 13620
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tttactgtcg gatgctgtga aaccattact tagccccgat caagtgagct ctatcatgtc 14940
tcctaacata attacattcc cagctaatct gtactacatg tctcggaaga gcctcaattt 15000
gatcagggaa agggaggaca gggatactat cctggcgttg ttgttccccc aagagccatt 15060
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ctcacagcgg cagcgtgtga cagacatcct atccagtcct ttaccaagat taataaagta 16080
cttgaggaag aatattgaca ctgcgctgat tgaagccggg ggacagcccg tccgtccatt 16140
ctgtgcggag agtctggtga gcacgctagc gaacataact cagataaccc agatcatcgc 16200
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ctgtgactct taacgaaaat cacatattaa taggctcctt ttttggccaa ttgtattctt 16680
gttgatttaa tcatattatg ttagaaaaaa gttgaaccct gactccttag gactcgaatt 16740
cgaactcaaa taaatgtctt aaaaaaaggt tgcgcacaat tattcttgag tgtagtctcg 16800
tcattcacca aatctttgtt tggt 16824
<210> 63
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 63
atctgggaac tgaaaaagga tgtgtacgtg gtggagctgg actggtatcc cgatgcccct 60
ggcgagatgg tggtgctgac ctgcgacaca cccgaggagg atggcatcac ctggacactg 120
gatcagagct ccgaggtgct gggaagcggc aagaccctga caatccaggt gaaggagttc 180
ggcgacgccg gccagtacac ctgtcacaag ggaggagagg tgctgagcca ctccctgctg 240
ctgctgcaca agaaggagga tggcatctgg tccacagaca tcctgaagga tcagaaggag 300
ccaaagaaca agaccttcct gcggtgcgag gccaagaatt atagcggccg gttcacctgt 360
tggtggctga ccacaatctc caccgatctg acattttctg tgaagtctag caggggatcc 420
tctgacccac agggagtgac atgcggagca gccaccctga gcgccgagag ggtgcgcggc 480
gataacaagg agtacgagta ttccgtggag tgccaggagg actctgcctg tccagcagca 540
gaggagtccc tgcctatcga agtgatggtg gatgccgtgc acaagctgaa gtacgagaat 600
tataccagct ccttctttat ccgggacatc atcaagcccg atccccctaa gaacctgcag 660
ctgaagcctc tgaagaatag cagacaggtg gaggtgtcct gggagtaccc tgacacctgg 720
agcacaccac actcctattt ctctctgacc ttttgcgtgc aggtgcaggg caagtccaag 780
cgggagaaga aggacagagt gttcaccgat aagacatctg ccaccgtgat ctgtagaaag 840
aacgcctcta tcagcgtgag ggcccaggac cgctactatt ctagctcctg gtccgagtgg 900
gcctctgtgc cttgcagcgg cggaggagga ggaggatcta ggaatctgcc agtggcaacc 960
cctgacccag gcatgttccc ctgcctgcac cacagccaga acctgctgag ggccgtgtcc 1020
aatatgctgc agaaggcccg ccagacactg gagttttacc cttgtaccag cgaggagatc 1080
gaccacgagg acatcacaaa ggataagacc tccacagtgg aggcctgcct gccactggag 1140
ctgaccaaga acgagtcctg tctgaacagc cgggagacaa gcttcatcac caacggctcc 1200
tgcctggcct ctagaaagac aagctttatg atggccctgt gcctgtctag catctacgag 1260
gacctgaaga tgtatcaggt ggagttcaag accatgaacg ccaagctgct gatggacccc 1320
aagaggcaga tctttctgga tcagaatatg ctggccgtga tcgacgagct gatgcaggcc 1380
ctgaacttca atagcgagac agtgcctcag aagtcctctc tggaggagcc agatttctac 1440
aagaccaaga tcaagctgtg catcctgctg cacgcctttc ggatcagagc cgtgacaatc 1500
gaccgcgtga tgtcctatct gaatgcttcc taa 1533
<210> 64
<211> 984
<212> DNA
<213> 智人
<400> 64
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
gctgctgagg agagtctgcc cattgaggtc atggtggatg ccgttcacaa gctcaagtat 660
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ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagt 984
<210> 65
<211> 594
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
agaaacctcc ccgtggccac tccagaccca ggaatgttcc catgccttca ccactcccaa 60
aacctgctga gggccgtcag caacatgctc cagaaggcca gacaaactct agaattttac 120
ccttgcactt ctgaagagat tgatcatgaa gatatcacaa aagataaaac cagcacagtg 180
gaggcctgtt taccattgga attaaccaag aatgagagtt gcctaaattc cagagagacc 240
tctttcataa ctaatgggag ttgcctggcc tccagaaaga cctcttttat gatggccctg 300
tgccttagta gtatttatga agacttgaag atgtaccagg tggagttcaa gaccatgaat 360
gcaaagcttc tgatggatcc taagaggcag atctttctag atcaaaacat gctggcagtt 420
attgatgagc tgatgcaggc cctgaatttc aacagtgaga ctgtgccaca aaaatcctcc 480
cttgaagaac cggattttta taaaactaaa atcaagctct gcatacttct tcatgctttc 540
agaattcggg cagtgactat tgatagagtg atgagctatc tgaatgcttc ctaa 594
<210> 66
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 66
atgtgtcacc agcagttggt catctcttgg ttttccctgg tttttctggc atctcccctc 60
gtggccatat gggaactgaa gaaagatgtt tatgtcgtag aattggattg gtatccggat 120
gcccctggag aaatggtggt cctcacctgt gacacccctg aagaagatgg tatcacctgg 180
accttggacc agagcagtga ggtcttaggc tctggcaaaa ccctgaccat ccaagtcaaa 240
gagtttggag atgctggcca gtacacctgt cacaaaggag gcgaggttct aagccattcg 300
ctcctgctgc ttcacaaaaa ggaagatgga atttggtcca ctgatatttt aaaggaccag 360
aaagaaccca aaaataagac ctttctaaga tgcgaggcca agaattattc tggacgtttc 420
acctgctggt ggctgacgac aatcagtact gatttgacat tcagtgtcaa aagcagcaga 480
ggctcttctg acccccaagg ggtgacgtgc ggagctgcta cactctctgc agagagagtc 540
agaggggaca acaaggagta tgagtactca gtggagtgcc aggaggacag tgcctgccca 600
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ttgcagctga agccattaaa gaattctcgg caggtggagg tcagctggga gtaccctgac 780
acctggagta ctccacattc ctacttctcc ctgacattct gcgttcaggt ccagggcaag 840
agcaagagag aaaagaaaga tagagtcttc acggacaaga cctcagccac ggtcatctgc 900
cgcaaaaatg ccagcattag cgtgcgggcc caggaccgct actatagctc atcttggagc 960
gaatgggcat ctgtgccctg cagtggtggc ggtggcggcg gatctagaaa cctccccgtg 1020
gccactccag acccaggaat gttcccatgc cttcaccact cccaaaacct gctgagggcc 1080
gtcagcaaca tgctccagaa ggccagacaa actctagaat tttacccttg cacttctgaa 1140
gagattgatc atgaagatat cacaaaagat aaaaccagca cagtggaggc ctgtttacca 1200
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caggccctga atttcaacag tgagactgtg ccacaaaaat cctcccttga agaaccggat 1500
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<210> 67
<211> 16824
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 67
accaaacaga gaatccgtga gttacgataa aaggcgaagg agcaattgaa gtcgcacggg 60
tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagcacaaac tcgagaaagc cttctgccaa 120
catgtcttcc gtatttgatg agtacgaaca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg 180
agctcatgga gggggagaaa aagggagtac cttaaaagta gacgtcccgg tattcactct 240
taacagtgat gacccagaag atagatggag ctttgtggta ttctgcctcc ggattgctgt 300
tagcgaagat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctc atatctcttt tatgctccca 360
ctcacaggta atgaggaacc atgttgccct tgcagggaaa cagaatgaag ccacattggc 420
cgtgcttgag attgatggct ttgccaacgg cacgccccag ttcaacaata ggagtggagt 480
gtctgaagag agagcacaga gatttgcgat gatagcagga tctctccctc gggcatgcag 540
caacggaacc ccgttcgtca cagccggggc cgaagatgat gcaccagaag acatcaccga 600
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gactgcgtat gagactgcag atgagtcgga aacaaggcga atcaataagt atatgcagca 720
aggcagggtc caaaagaaat acatcctcta ccccgtatgc aggagcacaa tccaactcac 780
gatcagacag tctcttgcag tccgcatctt tttggttagc gagctcaaga gaggccgcaa 840
cacggcaggt ggtacctcta cttattataa cctggtaggg gacgtagact catacatcag 900
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agaagcatgg gagcatccag ccaccggcca gtcaagacaa ccccgatcga caggacagat 2100
ctgacaaaca accatccaca cccgagcaaa cgaccccgca tgacagcccg ccggccacat 2160
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ggagtcaacc cagtcgcgga aacagtcagg aaagaccgca gaaccaagtc aaggccgccc 2400
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tatcagctgg tgcaacccct catgctctcc gatcaaggca gagccaagac aatacccttg 2520
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tggaagccaa cttgggaatg atgaagattc tggatcccgg ttgtgccaac atttcatctc 2760
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cacatccatc tgaattgatt aaacccgcca ctgcatgcgg gcctgatata ggagtggaaa 2940
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tgtcaccagc agttggtcat ctcttggttt tccctggttt ttctggcatc tcccctcgtg 3240
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cctggagaaa tggtggtcct cacctgtgac acccctgaag aagatggtat cacctggacc 3360
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gaattaacca agaatgagag ttgcctaaat tccagagaga cctctttcat aactaatggg 4440
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gatgggctcc agaccttcta ccaagaaccc agcacctatg atgctgacta tccgggttgc 6240
gctggtactg agttgcatct gtccggcaaa ctccattgat ggcaggcctc ttgcagctgc 6300
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tcttgatatc tcaactgagc ttgggaatgt caacaactcg atcagtaatg ctttgaataa 7620
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tctagcatgc tacctaatgt acaagcaaaa ggcgcaacaa aagaccttat tatggcttgg 7800
gaataatact ctagatcaga tgagagccac tacaaaaatg tgaacacaga tgaggaacga 7860
aggtttccct aatagtaatt tgtgtgaaag ttctggtagt ctgtcagttc agagagttaa 7920
gaaaaaacta ccggttgtag atgaccaaag gacgatatac gggtagaacg gtaagagagg 7980
ccgcccctca attgcgagcc aggcttcaca acctccgttc taccgcttca ccgacaacag 8040
tcctcaatca tggaccgcgc cgttagccaa gttgcgttag agaatgatga aagagaggca 8100
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gctatatctg tagcctccct tttatatagc atgggggcta gcacacctag cgatcttgta 8220
ggcataccga ctaggatttc cagggcagaa gaaaagatta catctacact tggttccaat 8280
caagatgtag tagataggat atataagcaa gtggcccttg agtctccgtt ggcattgtta 8340
aatactgaga ccacaattat gaacgcaata acatctctct cttatcagat taatggagct 8400
gcaaacaaca gtgggtgggg ggcacctatc catgacccag attatatagg ggggataggc 8460
aaagaactca ttgtagatga tgctagtgat gtcacatcat tctatccctc tgcatttcaa 8520
gaacatctga attttatccc ggcgcctact acaggatcag gttgcactcg aataccctca 8580
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gatcactcac attcatatca gtatttagca cttggtgtgc tccggacatc tgcaacaggg 8700
agggtattct tttctactct gcgttccatc aacctggacg acacccaaaa tcggaagtct 8760
tgcagtgtga gtgcaactcc cctgggttgt gatatgctgt gctcgaaagt cacggagaca 8820
gaggaagaag attataactc agctgtccct acgcggatgg tacatgggag gttagggttc 8880
gacggccagt accacgaaaa ggacctagat gtcacaacat tattcgggga ctgggtggcc 8940
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ggagggttaa aacccaattc acccagtgac actgtacagg aagggaaata tgtgatatac 9060
aagcgataca atgacacatg cccagatgag caagactacc agattcgaat ggccaagtct 9120
tcgtataagc ctggacggtt tggtgggaaa cgcatacagc aggctatctt atctatcaag 9180
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atgggggccg aaggcagaat tctcacagta gggacatctc atttcttgta tcaacgaggg 9300
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agacttaacc ctgcgtctgc agtattcgat agcacatccc gcagtcgcat tactcgagtg 9600
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atcgtcccgt tactagttga gatcctcaaa gatgacgggg ttagagaagc caggtctggc 9780
tagttgagtc aattataaag gagttggaaa gatggcattg tatcacctat cttctgcgac 9840
atcaagaatc aaaccgaatg ccggcgcgtg ctcgaattcc atgttgccag ttgaccacaa 9900
tcagccagtg ctcatgcgat cagattaagc cttgtcaata gtctcttgat taagaaaaaa 9960
tgtaagtggc aatgagatac aaggcaaaac agctcatggt taacaatacg ggtaggacat 10020
ggcgagctcc ggtcctgaaa gggcagagca tcagattatc ctaccagagt cacacctgtc 10080
ttcaccattg gtcaagcaca aactactcta ttactggaaa ttaactgggc taccgcttcc 10140
tgatgaatgt gacttcgacc acctcattct cagccgacaa tggaaaaaaa tacttgaatc 10200
ggcctctcct gatactgaga gaatgataaa actcggaagg gcagtacacc aaactcttaa 10260
ccacaattcc agaataaccg gagtgctcca ccccaggtgt ttagaagaac tggctaatat 10320
tgaggtccca gattcaacca acaaatttcg gaagattgag aagaagatcc aaattcacaa 10380
cacgagatat ggagaactgt tcacaaggct gtgtacgcat atagagaaga aactgctggg 10440
gtcatcttgg tctaacaatg tcccccggtc agaggagttc agcagcattc gtacggatcc 10500
ggcattctgg tttcactcaa aatggtccac agccaagttt gcatggctcc atataaaaca 10560
gatccagagg catctgatgg tggcagctag gacaaggtct gcggccaaca aattggtgat 10620
gctaacccat aaggtaggcc aagtctttgt cactcctgaa cttgtcgttg tgacgcatac 10680
gaatgagaac aagttcacat gtcttaccca ggaacttgta ttgatgtatg cagatatgat 10740
ggagggcaga gatatggtca acataatatc aaccacggcg gtgcatctca gaagcttatc 10800
agagaaaatt gatgacattt tgcggttaat agacgctctg gcaaaagact tgggtaatca 10860
agtctacgat gttgtatcac taatggaggg atttgcatac ggagctgtcc agctactcga 10920
gccgtcaggt acatttgcag gagatttctt cgcattcaac ctgcaggagc ttaaagacat 10980
tctaattggc ctcctcccca atgatatagc agaatccgtg actcatgcaa tcgctactgt 11040
attctctggt ttagaacaga atcaagcagc tgagatgttg tgtctgttgc gtctgtgggg 11100
tcacccactg cttgagtccc gtattgcagc aaaggcagtc aggagccaaa tgtgcgcacc 11160
gaaaatggta gactttgata tgatccttca ggtactgtct ttcttcaagg gaacaatcat 11220
caacgggtac agaaagaaga atgcaggtgt gtggccgcga gtcaaagtgg atacaatata 11280
tgggaaggtc attgggcaac tacatgcaga ttcagcagag atttcacacg atatcatgtt 11340
gagagagtat aagagtttat ctgcacttga atttgagcca tgtatagaat atgaccctgt 11400
caccaacctg agcatgttcc taaaagacaa ggcaatcgca caccccaacg ataattggct 11460
tgcctcgttt aggcggaacc ttctctccga agaccagaag aaacatgtaa aagaagcaac 11520
ttcgactaat cgcctcttga tagagttttt agagtcaaat gattttgatc catataaaga 11580
gatggaatat ctgacgaccc ttgagtacct tagagatgac aatgtggcag tatcatactc 11640
gctcaaggag aaggaagtga aagttaatgg acggatcttc gctaagctga caaagaagtt 11700
aaggaactgt caggtgatgg cggaagggat cctagccgat cagattgcac ctttctttca 11760
gggaaatgga gtcattcagg atagcatatc cttgaccaag agtatgctag cgatgagtca 11820
actgtctttt aacagcaata agaaacgtat cactgactgt aaagaaagag tatcttcaaa 11880
ccgcaatcat gatccgaaaa gcaagaaccg tcggagagtt gcaaccttca taacaactga 11940
cctgcaaaag tactgtctta attggagata tcagacaatc aaattgttcg ctcatgccat 12000
caatcagttg atgggcctac ctcacttctt cgaatggatt cacctaagac tgatggacac 12060
tacgatgttc gtaggagacc ctttcaatcc tccaagtgac cctactgact gtgacctctc 12120
aagagtccct aatgatgaca tatatattgt cagtgccaga gggggtatcg aaggattatg 12180
ccagaagcta tggacaatga tctcaattgc tgcaatccaa cttgctgcag ctagatcgca 12240
ttgtcgtgtt gcctgtatgg tacagggtga taatcaagta atagcagtaa cgagagaggt 12300
aagatcagac gactctccgg agatggtgtt gacacagttg catcaagcca gtgataattt 12360
cttcaaggaa ttaattcatg tcaatcattt gattggccat aatttgaagg atcgtgaaac 12420
catcaggtca gacacattct tcatatacag caaacgaatc ttcaaagatg gagcaatcct 12480
cagtcaagtc ctcaaaaatt catctaaatt agtgctagtg tcaggtgatc tcagtgaaaa 12540
caccgtaatg tcctgtgcca acattgcctc tactgtagca cggctatgcg agaacgggct 12600
tcccaaagac ttctgttact atttaaacta tataatgagt tgtgtgcaga catactttga 12660
ctctgagttc tccatcacca acaattcgca ccccgatctt aatcagtcgt ggattgagga 12720
catctctttt gtgcactcat atgttctgac tcctgcccaa ttagggggac tgagtaacct 12780
tcaatactca aggctctaca ctagaaatat cggtgacccg gggactactg cttttgcaga 12840
gatcaagcga ctagaagcag tgggattact gagtcctaac attatgacta atatcttaac 12900
taggccgcct gggaatggag attgggccag tctgtgcaac gacccatact ctttcaattt 12960
tgagactgtt gcaagcccaa atattgttct taagaaacat acgcaaagag tcctatttga 13020
aacttgttca aatcccttat tgtctggagt gcacacagag gataatgagg cagaagagaa 13080
ggcattggct gaattcttgc ttaatcaaga ggtgattcat ccccgcgttg cgcatgccat 13140
catggaggca agctctgtag gtaggagaaa gcaaattcaa gggcttgttg acacaacaaa 13200
caccgtaatt aagattgcgc ttactaggag gccattaggc atcaagaggc tgatgcggat 13260
agtcaattat tctagcatgc atgcaatgct gtttagagac gatgtttttt cctccagtag 13320
atccaaccac cccttagtct cttctaatat gtgttctctg acactggcag actatgcacg 13380
gaatagaagc tggtcacctt tgacgggagg caggaaaata ctgggtgtat ctaatcctga 13440
tacgatagaa ctcgtagagg gtgagattct tagtgtaagc ggagggtgta caagatgtga 13500
cagcggagat gaacaattta cttggttcca tcttccaagc aatatagaat tgaccgatga 13560
caccagcaag aatcctccga tgagggtacc atatctcggg tcaaagacac aggagaggag 13620
agctgcctca cttgcaaaaa tagctcatat gtcgccacat gtaaaggctg ccctaagggc 13680
atcatccgtg ttgatctggg cttatgggga taatgaagta aattggactg ctgctcttac 13740
gattgcaaaa tctcggtgta atgtaaactt agagtatctt cggttactgt cccctttacc 13800
cacggctggg aatcttcaac atagactaga tgatggtata actcagatga cattcacccc 13860
tgcatctctc tacagggtgt caccttacat tcacatatcc aatgattctc aaaggctgtt 13920
cactgaagaa ggagtcaaag aggggaatgt ggtttaccaa cagatcatgc tcttgggttt 13980
atctctaatc gaatcgatct ttccaatgac aacaaccagg acatatgatg agatcacact 14040
gcacctacat agtaaattta gttgctgtat cagagaagca cctgttgcgg ttcctttcga 14100
gctacttggg gtggtaccgg aactgaggac agtgacctca aataagttta tgtatgatcc 14160
tagccctgta tcggagggag actttgcgag acttgactta gctatcttca agagttatga 14220
gcttaatctg gagtcatatc ccacgataga gctaatgaac attctttcaa tatccagcgg 14280
gaagttgatt ggccagtctg tggtttctta tgatgaagat acctccataa agaatgacgc 14340
cataatagtg tatgacaata cccgaaattg gatcagtgaa gctcagaatt cagatgtggt 14400
ccgcctattt gaatatgcag cacttgaagt gctcctcgac tgttcttacc aactctatta 14460
cctgagagta agaggcctgg acaatattgt cttatatatg ggtgatttat acaagaatat 14520
gccaggaatt ctactttcca acattgcagc tacaatatct catcccgtca ttcattcaag 14580
gttacatgca gtgggcctgg tcaaccatga cggatcacac caacttgcag atacggattt 14640
tatcgaaatg tctgcaaaac tattagtatc ttgcacccga cgtgtgatct ccggcttata 14700
ttcaggaaat aagtatgatc tgctgttccc atctgtctta gatgataacc tgaatgagaa 14760
gatgcttcag ctgatatccc ggttatgctg tctgtacacg gtactctttg ctacaacaag 14820
agaaatcccg aaaataagag gcttaactgc agaagagaaa tgttcaatac tcactgagta 14880
tttactgtcg gatgctgtga aaccattact tagccccgat caagtgagct ctatcatgtc 14940
tcctaacata attacattcc cagctaatct gtactacatg tctcggaaga gcctcaattt 15000
gatcagggaa agggaggaca gggatactat cctggcgttg ttgttccccc aagagccatt 15060
attagagttc ccttctgtgc aagatattgg tgctcgagtg aaagatccat tcacccgaca 15120
acctgcggca tttttgcaag agttagattt gagtgctcca gcaaggtatg acgcattcac 15180
acttagtcag attcatcctg aactcacatc tccaaatccg gaggaagact acttagtacg 15240
atacttgttc agagggatag ggactgcatc ttcctcttgg tataaggcat ctcatctcct 15300
ttctgtaccc gaggtaagat gtgcaagaca cgggaactcc ttatacttag ctgaagggag 15360
cggagccatc atgagtcttc tcgaactgca tgtaccacat gaaactatct attacaatac 15420
gctcttttca aatgagatga accccccgca acgacatttc gggccgaccc caactcagtt 15480
tttgaattcg gttgtttata ggaatctaca ggcggaggta acatgcaaag atggatttgt 15540
ccaagagttc cgtccattat ggagagaaaa tacagaggaa agcgacctga cctcagataa 15600
agtagtgggg tatattacat ctgcagtgcc ctacagatct gtatcattgc tgcattgtga 15660
cattgaaatt cctccagggt ccaatcaaag cttactagat caactagcta tcaatttatc 15720
tctgattgcc atgcattctg taagggaggg cggggtagta atcatcaaag tgttgtatgc 15780
aatgggatac tactttcatc tactcatgaa cttgtttgct ccgtgttcca caaaaggata 15840
tattctctct aatggttatg catgtcgagg agatatggag tgttacctgg tatttgtcat 15900
gggttacctg ggcgggccta catttgtaca tgaggtggtg aggatggcga aaactctggt 15960
gcagcggcac ggtacgcttt tgtctaaatc agatgagatc acactgacca ggttattcac 16020
ctcacagcgg cagcgtgtga cagacatcct atccagtcct ttaccaagat taataaagta 16080
cttgaggaag aatattgaca ctgcgctgat tgaagccggg ggacagcccg tccgtccatt 16140
ctgtgcggag agtctggtga gcacgctagc gaacataact cagataaccc agatcatcgc 16200
tagtcacatt gacacagtta tccggtctgt gatatatatg gaagctgagg gtgatctcgc 16260
tgacacagta tttctattta ccccttacaa tctctctact gacgggaaaa agaggacatc 16320
acttaaacag tgcacgagac agatcctaga ggttacaata ctaggtctta gagtcgaaaa 16380
tctcaataaa ataggcgata taatcagcct agtgcttaaa ggcatgatct ccatggagga 16440
ccttatccca ctaaggacat acttgaagca tagtacctgc cctaaatatt tgaaggctgt 16500
cctaggtatt accaaactca aagaaatgtt tacagacact tctgtactgt acttgactcg 16560
tgctcaacaa aaattctaca tgaaaactat aggcaatgca gtcaaaggat attacagtaa 16620
ctgtgactct taacgaaaat cacatattaa taggctcctt ttttggccaa ttgtattctt 16680
gttgatttaa tcatattatg ttagaaaaaa gttgaaccct gactccttag gactcgaatt 16740
cgaactcaaa taaatgtctt aaaaaaaggt tgcgcacaat tattcttgag tgtagtctcg 16800
tcattcacca aatctttgtt tggt 16824
<210> 68
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的多核苷酸"
<400> 68
atatgggaac tgaagaaaga tgtttatgtc gtagaattgg attggtatcc ggatgcccct 60
ggagaaatgg tggtcctcac ctgtgacacc cctgaagaag atggtatcac ctggaccttg 120
gaccagagca gtgaggtctt aggctctggc aaaaccctga ccatccaagt caaagagttt 180
ggagatgctg gccagtacac ctgtcacaaa ggaggcgagg ttctaagcca ttcgctcctg 240
ctgcttcaca aaaaggaaga tggaatttgg tccactgata ttttaaagga ccagaaagaa 300
cccaaaaata agacctttct aagatgcgag gccaagaatt attctggacg tttcacctgc 360
tggtggctga cgacaatcag tactgatttg acattcagtg tcaaaagcag cagaggctct 420
tctgaccccc aaggggtgac gtgcggagct gctacactct ctgcagagag agtcagaggg 480
gacaacaagg agtatgagta ctcagtggag tgccaggagg acagtgcctg cccagctgct 540
gaggagagtc tgcccattga ggtcatggtg gatgccgttc acaagctcaa gtatgaaaac 600
tacaccagca gcttcttcat cagggacatc atcaaacctg acccacccaa gaacttgcag 660
ctgaagccat taaagaattc tcggcaggtg gaggtcagct gggagtaccc tgacacctgg 720
agtactccac attcctactt ctccctgaca ttctgcgttc aggtccaggg caagagcaag 780
agagaaaaga aagatagagt cttcacggac aagacctcag ccacggtcat ctgccgcaaa 840
aatgccagca ttagcgtgcg ggcccaggac cgctactata gctcatcttg gagcgaatgg 900
gcatctgtgc cctgcagtgg tggcggtggc ggcggatcta gaaacctccc cgtggccact 960
ccagacccag gaatgttccc atgccttcac cactcccaaa acctgctgag ggccgtcagc 1020
aacatgctcc agaaggccag acaaactcta gaattttacc cttgcacttc tgaagagatt 1080
gatcatgaag atatcacaaa agataaaacc agcacagtgg aggcctgttt accattggaa 1140
ttaaccaaga atgagagttg cctaaattcc agagagacct ctttcataac taatgggagt 1200
tgcctggcct ccagaaagac ctcttttatg atggccctgt gccttagtag tatttatgaa 1260
gacttgaaga tgtaccaggt ggagttcaag accatgaatg caaagcttct gatggatcct 1320
aagaggcaga tctttctaga tcaaaacatg ctggcagtta ttgatgagct gatgcaggcc 1380
ctgaatttca acagtgagac tgtgccacaa aaatcctccc ttgaagaacc ggatttttat 1440
aaaactaaaa tcaagctctg catacttctt catgctttca gaattcgggc agtgactatt 1500
gatagagtga tgagctatct gaatgcttcc taa 1533
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 69
His Asn Arg Met Lys Ser Phe
1 5
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 70
His Asn Lys Met Ser Phe Ile
1 5
<210> 71
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述: 合成的肽"
<400> 71
His Asn Arg Thr Lys Arg Phe Ile
1 5
<210> 72
<211> 6
<212> PRT
<213> 新城疫病毒
<400> 72
Gly Arg Gln Gly Arg Leu
1 5

Claims (42)

1.第一组合物，其应用于治疗人类对象的癌症的方法，其中所述第一组合物包含嵌合新城疫病毒(NDV)，其中所述嵌合NDV包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类白细胞介素-12(“IL-12”)的转基因，其中所述转基因编码人类IL-12p40亚基和人类IL-12p35亚基，以及其中所述方法进一步包括施用第二组合物，其中所述第二组合物包含结合人类PD-1并阻止人类PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用的抗体。
2.权利要求1所述的应用的第一组合物，其中所述嵌合NDV包含LaSota毒株的NDV主干。
3.权利要求1所述的应用的第一组合物，其中所述嵌合NDV包含La Sota毒株的NDV主干，以及所述包装基因组包含编码具有氨基酸突变L289A的突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中。
4.权利要求1到3的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:39中列出的氨基酸序列。
5.权利要求4所述的应用的第一组合物，其中所述转基因包含SEQ ID NO:61中列出的核苷酸序列。
6.权利要求1到3的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列。
7.权利要求6所述的应用的第一组合物，其中所述转基因包含SEQ ID NO:26中列出的核苷酸序列。
8.权利要求1到3的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:43或42中列出的氨基酸序列。
9.权利要求8所述的应用的第一组合物，其中所述转基因包含SEQ ID NO:63、68、53或66中列出的核苷酸序列。
10.权利要求1到3的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述IL-12p40亚基包含SEQID NO:38或23中列出的氨基酸序列，以及所述IL-12p35亚基包含SEQ ID NO:41或25中列出的氨基酸序列。
11.权利要求1到10的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述包装基因组包含NDVNP基因的转录单元、NDV P基因的转录单元、NDV M基因的转录单元、NDV F基因的转录单元、NDV HN基因的转录单元、以及NDV L基因的转录单元，以及其中所述转基因被插入所述包装基因组的所述NDV P基因和所述NDV M基因之间。
12.权利要求1所述的应用的第一组合物，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:51中列出的核苷酸序列。
13.权利要求1所述的应用的第一组合物，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:52或60中列出的核苷酸序列。
14.权利要求1到13的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述抗体是派姆单抗。
15.权利要求1到13的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述抗体是纳武单抗。
16.权利要求1到13的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述抗体是MEDI0680。
17.权利要求1到13的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述抗体包含:
(a)VLCR，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:4)；和
(b)VHCR，其包含氨基酸序列
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFD MGFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:9)。
18.权利要求1到13的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述抗体包含:
(a)轻链，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:5)；和
(b)重链，其包含氨基酸序列
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQID NO:10)。
19.权利要求1到13的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述抗体包含:
(a)VLCR，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:14)；和
(b)VHCR，其包含氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQ GTLVTVSS(SEQ ID NO:19)。
20.权利要求1到13的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述抗体包含:
(a)轻链，其包含氨基酸序列
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:15)；和
(b)重链，其包含氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:20)。
21.权利要求1到20的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述第一组合物肿瘤内地或结节内地被施用给所述对象，以及所述第二组合物静脉内地被施用给所述对象。
22.权利要求21所述的应用的第一组合物，其中所述对象表现出皮肤的或皮下的肿瘤或淋巴结内的肿瘤。
23.权利要求1到22的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述癌症是黑素瘤、肾癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、肝细胞癌、胰腺癌、肾脏癌症、结肠直肠癌症、乳腺癌、头颈癌、非霍奇金淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤，或选自以下构成的组的实体肿瘤：黑素瘤、肉瘤、子宫癌、胃癌、食道癌、肝癌、脑癌、头颈部鳞状细胞癌和乳腺癌。
24.权利要求23所述的应用的第一组合物，其中所述肺癌是非小细胞肺癌，所述头颈癌是头颈部鳞状细胞癌，所述肾脏癌症是肾细胞癌，所述结肠直肠癌症是结肠直肠癌，或所述乳腺癌症是乳腺癌。
25.权利要求1到22的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述癌症是黑素瘤、非小细胞肺癌、头颈癌(HNSCC头颈部鳞状细胞癌)、尿路上皮癌、三阴性乳腺癌、胃癌、胃食管接点腺癌、经典的霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、间皮瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、食道癌、鼻咽癌、肛门癌、胆道癌、结肠直肠癌症、ER+/HER2-乳腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、唾液癌、子宫内膜癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、高度微卫星不稳定性的(MSI-H)或错配修复缺陷的癌症(组织无关)、或高肿瘤突变负担的肿瘤(组织无关)。
26.权利要求1到25的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述癌症是不可切除的。
27.权利要求1到25的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述癌症包含真皮的、皮下的或结节的转移。
28.权利要求1到27的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述癌症的活检物是PD-L1阳性的。
29.权利要求28所述的应用的第一组合物，其中所述活检物具有至少1％的肿瘤比例评分。
30.权利要求28所述的应用的第一组合物，其中所述活检物具有至少1的联合阳性评分。
31.权利要求1到30的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述对象对于抗体的单一治疗是难治性的或复发的，所述抗体结合PD-1并阻断PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用。
32.权利要求1到30的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述对象对于抗体的单一治疗是难治性的，所述抗体结合PD-1并阻断PD-1与它的配体PD-L1和PD-L2之间的相互作用。
33.权利要求31或32所述的应用的第一组合物，其中所述结合PD-1的抗体是派姆单抗。
34.权利要求1到30的任一项所述的应用的第一组合物，其中所述对象对于PDL-1的抗体的单一治疗是难治性的或复发的。
35.一种嵌合NDV，其包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:39或22中列出的氨基酸序列。
36.权利要求35所述的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:61中列出的核苷酸序列。
37.一种嵌合NDV，其包含包装基因组，所述包装基因组包含编码人类IL-12的转基因，其中所述IL-12包含SEQ ID NO:43或42中列出的氨基酸序列。
38.权利要求37所述的嵌合NDV，其中所述转基因包含SEQ ID NO:63、68、53或66中列出的核苷酸序列。
39.权利要求35到38的任一项所述的嵌合NDV，其中所述嵌合NDV包含La Sota毒株的NDV主干，以及所述包装基因组包含编码具有氨基酸突变L289A的突变F蛋白的核苷酸序列，其中所述突变F蛋白被掺入所述嵌合NDV的病毒粒中。
40.权利要求35到39的任一项所述的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含NDV NP基因的转录单元、NDV P基因的转录单元、NDV M基因的转录单元、NDV F基因的转录单元、NDV HN基因的转录单元、以及NDV L基因的转录单元，以及其中所述转基因被插入所述包装基因组的所述NDV P基因和所述NDV M基因之间。
41.权利要求35所述的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:51中列出的核苷酸序列。
42.权利要求37所述的嵌合NDV，其中所述包装基因组包含SEQ ID NO:52或60中列出的核苷酸序列。
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