CN111053756A - 5-甲基四氢叶酸的分离及提高稳定性的方法和所用壁材 - Google Patents

5-甲基四氢叶酸的分离及提高稳定性的方法和所用壁材 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于提高5‑甲基四氢叶酸稳定性的壁材的制备方法，包括以下步骤：酪蛋白与壳寡糖溶解于pH7.0～10.0的磷酸盐缓冲溶液中进行合成；所得产物在去离子水中透析后干燥，再进行糖基化反应；所得的糖基化反应产物可作为用于提高5‑甲基四氢叶酸稳定性的壁材。本发明还同时提供了一种提高5‑甲基四氢叶酸的稳定性的方法，利用壁材包埋5‑甲基四氢叶酸。本发明还同时提供了一种从清酒乳杆菌发酵液中分离5‑甲基四氢叶酸的方法：将发酵液过C18固相萃取柱，用超纯水洗脱；从而实现从发酵液中分离5‑甲基四氢叶酸。

Description

5-甲基四氢叶酸的分离及提高稳定性的方法和所用壁材
技术领域
本发明属于食品工程领域，具体涉及一种提高5-甲基四氢叶酸稳定性的方法和所用壁材，还涉及从发酵液中分离5-甲基四氢叶酸的方法。
背景技术
叶酸属于水溶性维生素，在人体中主要是5-甲基四氢叶酸；其性质不稳定，见光易分解，常温保藏会极大地破坏叶酸，而叶酸对于生物生命活动，特别是孕妇有着重要作用。所以需要对叶酸进行微胶囊化。
目前对于叶酸的分离大多采用硅胶柱进行分离，但由于硅胶柱需要进行硅胶活化，然后进行填料等操作，基于叶酸的不稳定性，采用硅胶进行分离不可避免的要受光照影响，且分离速度慢。
因此，需要对现有技术进行改进。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种5-甲基四氢叶酸的分离及提高其稳定性的方法和所用壁材。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于提高5-甲基四氢叶酸稳定性的壁材的制备方法，包括以下步骤：
1)、将酪蛋白与壳寡糖按照2～1:1～2的重量比混合后，溶解于pH7.0～10.0的磷酸盐缓冲溶液中，所得的混合溶液中酪蛋白浓度为(2±0.5)mg/mL；
将混合溶液(约50～100ml)于(300±50)w的超声波功率、(450±50)w的微波功率、80～100℃的温度下合成20～50min；
2)、步骤1)所得产物装入透析袋(Mr＝8,000～14,000D)中，于去离子水中透析(24±2)h，将截留液冷冻干燥(-60℃干燥24h)；
说明：于去离子水中透析的目的是除去未结合的产物，可隔12h换透析液(去离子水)；
3)、将步骤2)所得物于70～85％(优选79％)的相对湿度、(60±10)℃反应(24±2)h，反应结束后将产物真空干燥，得糖基化反应产物(干湿法联用制备的糖基化反应产物)，该糖基化反应产物可作为用于提高5-甲基四氢叶酸稳定性的壁材。
作为本发明的用于提高5-甲基四氢叶酸稳定性的壁材的制备方法的改进，步骤1)中：
酪蛋白与壳寡糖的重量比为1:1；选用pH8.0的磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L)；
温度为100℃，反应时间(合成时间)为20min。
说明：此步骤可利用双频超声波微波紫外光组合催化合成仪进行。
本发明还同时提供了利用上述壁材进行的提高5-甲基四氢叶酸的稳定性的方法：利用壁材包埋5-甲基四氢叶酸。
作为本发明的提高5-甲基四氢叶酸的稳定性的方法的改进：将糖基化反应产物溶解在 pH7.0～8.0磷酸盐缓冲溶液中，使得糖基化产物的浓度为(1±0.1)mg/mL，取4mL的溶液加入50～250μg的5-甲基四氢叶酸，于惰性气体(N2)的保护下，(25±10)℃条件下密封避光混匀；得5-甲基四氢叶酸微胶囊。
本发明还同时提供了一种从清酒乳杆菌发酵液中分离5-甲基四氢叶酸的方法，包括发酵液的制备，将发酵液过C18固相萃取柱，用超纯水洗脱；从而实现从发酵液中分离5-甲基四氢叶酸。
本发明具有如下技术优势：
1、采用C18固相萃取柱分离发酵液中的5-甲基四氢叶酸，通过有机溶剂进行简单的活化，而且能够在很好避光条件下进行多次吸附洗脱分离。
2、制备出一种新的壁材(糖基化反应产物)，利用该壁材对5-甲基四氢叶酸进行包埋，包埋效果优异，能很好地对5-甲基四氢叶酸进行保护，提高5-甲基四氢叶酸的生物利用度。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为复溶液的色谱图；
图2为二次洗脱液的色谱图；
图3为对比液的色谱图；
图4不同水浴温度对发酵液中5-甲基四氢叶酸含量的影响；
图5不同水浴时间对发酵液中5-甲基四氢叶酸含量的影响；
图6为不同糖基化改性后酪蛋白共聚物的红外光谱图；
图7为不同糖基化改性后酪蛋白共聚物的XRD谱图；
图8为不同糖基化改性后酪蛋白共聚物的TGA曲线；
图9为扫描电子显微镜(SEM)结果；
(a)酪蛋白(b)干湿法联用制备的糖基化反应产物；
图10为糖基化产物平均粒径及PDI的测定图；
图11为反应温度对酪蛋白接枝度的影响；
图12为反应时间对酪蛋白接枝度的影响；
图13为缓冲溶液pH对酪蛋白接枝度的影响；
图14为壁材质量比对糖基化产物的影响；
图15不同5-甲基四氢叶酸添加量下酪蛋白糖基化产物复合5-甲基四氢叶酸的紫外扫描图谱；从下至上分别为50μg、100μg、150μg、200μg、250μg；
图16为不同5-甲基四氢叶酸添加量下在280nm(a)和295nm(b)的荧光发射图谱；
从上至下分别为50μg、100μg、150μg、200μg、250μg。
图17为不同5-甲基四氢叶酸添加量对酪蛋白复合物复合物包埋效率的影响；
图18为5-甲基四氢叶酸添加量对Cas-COS-5-Methyltetrahydrofolate(5-甲基四氢叶酸微胶囊)的平均粒径和PDI的影响
图19为缓冲溶液pH对包埋5-甲基四氢叶酸复合物合成的影响；
图20为5-甲基四氢叶酸微胶囊在模拟肠胃液中的平均粒径稳定性；
图21为5-甲基四氢叶酸微胶囊在模拟肠胃液中的PDI稳定性；
图22为5-甲基四氢叶酸微胶囊在模拟肠胃液中的释放速率；
图23为5-甲基四氢叶酸微胶囊不同贮藏温度下对5-甲基四氢叶酸的影响；
图24为5-甲基四氢叶酸微胶囊不同光照时间下对5-甲基四氢叶酸的影响；
图25为加工方式对5-甲基四氢叶酸的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
冷冻干燥，一般为于-60℃干燥24h。
实施例1、一种从清酒乳杆菌发酵液中分离5-甲基四氢叶酸的方法，依次进行如下步骤：
1)、菌泥的制备：
取一环活化后的清酒乳杆菌(L-sakei)于MRS液体培养基、37℃培养24h；取所得的培养液按照3％(体积％)的接种量接种到MRS液体培养基中于37℃培养24h；然后离心(转速10000转/分钟离心10min)，去除上清液，得菌泥；
MRS液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二胺2g，Tween-80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，pH7.0，去离子水定容至1L。高压灭菌，121℃，15min。
MRS固体培养基制备：在MRS液体培养基的基础上添加2％琼脂；即为：
蛋白胨10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二胺2g，Tween-80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂20g，pH7.0，去离子水定容至1L。高压灭菌，121℃，15min。
清酒乳杆菌(L-sakei)选用文献《产胞外多糖乳酸菌的筛选及其分子特性的研究》中告知的清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)。
2)、将步骤1)所得的菌泥，用0.9％的生理盐水清洗(可清洗三次)，然后在清洗下来所得的菌液中加入叶酸缓冲液(0.1g/L抗坏血酸，0.1M的磷酸盐缓冲液，pH＝7)，叶酸缓冲液：菌液＝1:3的体积比；于100℃水浴加热10min，对细胞进行破碎处理；
所得的破碎后菌液冷却至37℃，加入2.5％的鸡胰酶(即，加入鸡胰酶至浓度为2.5g/100ml)，于37℃反应2h，使5-甲基四氢叶酸从蛋白质上释放并水解为谷氨酸残基，离心，取上清(即，发酵液)。
叶酸缓冲液的制备方法为：在0.1M的磷酸盐缓冲液(pH＝7)中加入抗坏血酸至抗坏血酸的浓度为0.1g/L。
3)、C18固相萃取柱，固相萃取柱先用甲醇(约3ml)进行活化，然后超纯水(约3ml)进行平衡；
取10ml的上清(即，发酵液)过平衡后的C18固相萃取柱(避光)，用超纯水洗柱子3次，每次超纯水用量为3mL；收集所有的洗脱液冷冻干燥(于-60℃干燥24h)，用1ml的叶酸缓冲液液进行复溶，得复溶液；
将复溶液过平衡后的C18固相萃取柱(避光)，用超纯水洗柱子3次，每次超纯水用量为3mL；得二次洗脱液；
在上清(发酵液)人工添加5-甲基四氢叶酸作为对比液；
将上述复溶液、二次洗脱液、对比液分别过0.22μm滤膜后，进行高效液相色谱测定：以甲醇：0.1M的磷酸盐缓冲液(pH＝7)为16:84的体积比作为流动相，流速1mL/min，柱温25℃。
所得结果为：图1为复溶液的色谱图；图2为二次洗脱液的色谱图；图3为对比液的色谱图。根据上图的对比，可得知：经过C18固相萃取柱，所分离的确实为5-甲基四氢叶酸，经过两次C18固相萃取柱对5-甲基四氢叶酸的吸附，分离效果好。
对比例1-1、
将实施例1步骤2)中的水浴温度由100℃分别改成80℃、85℃、90℃、95℃，其余等同于实施例1。
所得发酵液中5-甲基四氢叶酸含量的对比如图4所示。
根据图4，可得知：温度达到100℃后，5-甲基四氢叶酸含量增加迅速，此时体系温度较高，细胞运动加快，细胞破碎更为完全，此时5-甲基四氢叶酸含量达到最高。
对比例1-2、将实施例1步骤2)中的水浴加热时间10min分别改成5min、15min、20min、 25min；其余等同于实施例1。
所得发酵液中5-甲基四氢叶酸含量的对比如图5所示。
根据图5，可得知：随着水浴时间的延长，菌体中的5-甲基四氢叶酸含量快速增长，在水浴时间达到15min后，菌体中5-甲基四氢叶酸含量基本保持不变并出现轻微的下降。
实施例2、糖基化反应产物(壁材)的制备，依次进行以下步骤：
1)、酪蛋白与壳寡糖(1:1w/w)，溶解在磷酸盐缓冲溶液中(0.2mol/L,pH8.0)，使得酪蛋白浓度为2mg/mL；
将混合溶液约50ml放置于磁力搅拌器上搅拌均匀，利用双频超声波微波紫外光组合催化合成仪进行合成；超声功率300w，微波功率450w，时间20min，温度100℃。
酪蛋白的接枝度为26.21％。接枝度的检测法按照常规的OPA检测法。
2)、所得产物装入透析袋(Mr＝8,000～14,000D)中，于去离子水中透析(24±2)h，从而除去未结合的产物，隔12h换透析液(去离子水)，将位于透析袋中的截留液冷冻干燥(-60℃干燥24h)；
3)、将步骤2)所得物放入相对湿度79％、温度60℃的装置内反应1d，反应结束后将产物真空干燥24h，即得干湿法联用制备的糖基化反应产物。
该糖基化反应产物的接枝度为70.09％。
将实施例2所述的干湿法联用制备的糖基化反应产物(wet+Dry)、以及湿法制备的糖基化反应产物(wet)、干法制备的糖基化反应产物(Dry)，一起进行了如下的各项分析检测；
说明：
湿法制备的糖基化反应产物：即实施例2步骤1)的所得物；
干法制备的糖基化反应产物，即为：酪蛋白与壳寡糖(1:1w/w)冷冻干燥(-60℃干燥 24h)；然后放入相对湿度79％、温度60℃的装置内反应1d，反应结束后将产物真空干燥24h，得干法制备的糖基化反应产物。
具体结果如下：
1、红外光谱图如图6所述；
wet+Dry heating代表实施例2的干湿法联用制备的糖基化反应产物，casein代表酪蛋白； wet heating代表湿法制备的糖基化反应产物；Dry heating代表干法制备的糖基化反应产物。
2、X-射线衍射(XRD)分析结果如图7所示；
图7中，Cas+COS代表酪蛋白与壳寡糖(1:1w/w)、Cas+COS Dry代表干法制备的糖基化反应产物、Cas+COS wet代表湿法制备的糖基化反应产物，Cas+COS Dry+wet代表实施例2的干湿法联用制备的糖基化反应产物。
3、热重分析(TGA)结果如图8所示；
图8中，Cas代表，Cas+COS Dry代表干法制备的糖基化反应产物，Cas+COS Dry+wet代表实施例2的干湿法联用制备的糖基化反应产物。
4、扫描电子显微镜(SEM)结果如图9所示；
图9中，(a)为酪蛋白(b)为干湿法联用制备的糖基化反应产物；
5、糖基化产物平均粒径及PDI的测定如图10所示；
图10中，MiX代表cas+cos(1:1w/w)；wet代表湿法制备的糖基化反应产物，Dry代表干法制备的糖基化反应产物、Dry+wet代表实施例2的干湿法联用制备的糖基化反应产物。
通过上述表征可得出本发明的酪蛋白与壳寡糖之间发生了反应，酪蛋白与壳寡糖通过共价键结合。且，从上图中看出，本发明的干湿法联用制备的糖基化反应产物相对于湿法制备的糖基化反应产物、干法制备的糖基化反应产物接枝度更高，有利用进行对5-甲基四氢叶酸的包埋。
对比例2-1、反应温度对糖基化产物的影响
在pH＝7.0，反应时间30min，蛋白质与多糖(即，酪蛋白与壳寡糖)质量比1:1，微波功率450W，超声功率300W条件下，研究了不同反应温度(80℃、85℃、90℃、95℃、100℃) 对酪蛋白糖基化反应的影响。其余参照实施例1的步骤1)。
酪蛋白接枝度的对比如图11所述。
对比例2-2、反应时间对糖基化产物的影响
在pH＝7.0，反应温度100℃，蛋白质与糖质量比1:1，微波功率450W，超声功率300W条件下，研究不同反应时间对酪蛋白糖基化反应的影响。其余参照实施例1的步骤1)。
酪蛋白接枝度的对比如图12所述。
对比例2-3、缓冲溶液pH对糖基化产物的影响
在反应温度100℃，反应时间20min，蛋白与糖的质量比1:1，微波功率450W，超声功率300W条件下，探究不同pH对酪蛋白糖基化反应的影响。其余参照实施例1的步骤1)。
酪蛋白接枝度的对比如图13所述。
对比例2-4、壁材质量比对糖基化产物的影响
在反应温度100℃，反应时间20min，pH＝8.0，微波功率450W，超声功率300W条件下，探究不同质量比对酪蛋白糖基化反应的影响。其余参照实施例1的步骤1)。
酪蛋白接枝度的对比如图14所述。
实施例3、提高5-甲基四氢叶酸的稳定性的方法，包括以下步骤：
将糖基化反应产物(实施例2所得)溶解在0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7)中，糖基化产物的浓度为1mg/mL，将其置于磁力搅拌器上搅拌均匀，然后过滤，从滤液中取4mL置于5mL样品瓶中，然后加入100μg的5-甲基四氢叶酸，于N2的保护下，25℃条件下密封避光混匀；得5-甲基四氢叶酸微胶囊。
酪蛋白糖基化复合物对5-甲基四氢叶酸的包埋率达到75.29％。
Figure RE-GDA0002394206660000071
对比例3-1、将实施例3中的加入5-甲基四氢叶酸的量由100μg分别改成50μg、150μg、 200μg、250μg，其余等同于实施例3。
分别进行如下的实验：
实验1、糖基化包埋5-甲基四氢叶酸复合物的紫外全谱分析
于UV-2600紫外可见分光光度计进行全谱扫描。扫描速度：高速，扫描范围：200～800nm。所得结果如图15所述。图15中，从下至上分别为50μg、100μg、150μg、200μg、250μg。
根据该图15可得知：在300nm附近出现明显的紫外吸收峰，吸收峰的强度随着5-甲基四氢叶酸含量的增加而增加，并且伴随着蓝移，说明5-甲基四氢叶酸可以与蛋白质相互作用，改变蛋白质的基团微环境和空间结构。
实验2、糖基化包埋5-甲基四氢叶酸复合物的荧光分析
采用荧光光谱仪进行测定。酪蛋白复合物：a、扫描范围290～450nm，固定激发波长λEx＝280nm，激发狭缝(Ex band)和发射狭缝(Em band)分别为5nm、5nm，扫描速度300 nm/min。b、扫描范围310～450nm，固定激发波长λEx＝295nm，Ex band和Em band分别为5 nm、5nm，扫描速度300nm/min。所得结果如图16所述。
根据图16，可得知：随着5-甲基四氢含量添加，其荧光性是逐渐减弱的，从而说明蛋白、糖及5-甲基四氢叶酸三者之间发生了反应，促进了蛋白质的氨基残基猝灭。
实验3、添加不同质量的5-甲基四氢叶酸，酪蛋白糖基化产物对其包埋率的影响；如图17所述。
实验4、5-甲基四氢叶酸添加量对包埋有5-甲基四氢叶酸糖基化复合物平均粒径和PDI 的影响。如图18所述；随着5-甲基四氢叶酸含量的增加，平均粒径都成下降趋势，而PDI 较为稳定，在0.3～0.4之间上下浮动。5-甲基四氢叶酸添加后的平均粒径较未添加5-甲基四氢叶酸平均粒径大。
对比例3-2、缓冲溶液pH对包埋5-甲基四氢叶酸复合物合成的影响：
将实施例3中的磷酸盐缓冲溶液的pH由7.0分别改为6.0、6.5、7.5、8.0，其余等同于实施例3。所述结果如图19所述。包埋有5-甲基四氢叶酸的酪蛋白复合物平均粒径变化不是很大，PDI变化也相对较小，PDI基本保持不变说明溶液体系较稳定。
实验5、
将实施例3中的5-甲基四氢叶酸的用量由100μg改成150μg，所得的5-甲基四氢叶酸微胶囊分别进行如下实验：
1)、5-甲基四氢叶酸在模拟人工肠胃液中的稳定性分析
5-甲基四氢叶酸微胶囊与模拟人工肠胃液1:1混合均匀，不同时间取样测定过滤后的样品的平均粒径和PDI；空白采用等体积的磷酸盐缓冲液(pH7.0)代替。
人工模拟胃液的配制：将7mL浓HCl，2.0g NaCl，3.2g胃蛋白酶溶于250mL超纯水，然后用1.0mol/L HCl调整pH至1.2，用超纯水定容至1000mL。
模拟人工肠液的配制：将6.8g磷酸二氢钾溶于250mL超纯水，完全溶解后加190mL0.2 mol/L NaOH和400mL的超纯水，加入复合胰酶10g，混匀，用0.2mol/L NaOH将体系pH 值调至7.0，然后定容至1000mL。充分搅拌后，在4000rpm下高速离心15min，取上清液为最终模拟肠液。
平均粒径稳定性如图20所述；PDI稳定性如图21所述；在模拟肠胃液中的释放速率如图22所述；
图20～22中：pbs：磷酸盐缓冲液；sif是肠液；sgf胃液。
通过对微胶囊在模拟人工肠胃液中的稳定性及释放速率分析可以看出微胶囊的稳定性有较大的提高。
2)、强化面粉中贮藏条件对5-甲基四氢叶酸的影响
不同贮藏温度对5-甲基四氢叶酸保留率的的影响：取微胶囊与面粉按照1:10质量比混合均匀，将混合后的强化面粉贮藏在-4℃、0℃、10℃、20℃、30℃条件下，每隔1d测定5-甲基四氢叶酸的保留率。所得结果如图23所示。
不同光照时间对5-甲基四氢叶酸保留率的的影响：取微胶囊与面粉按照1:10质量比混合均匀，将混合均匀的面粉放在光下照射1h、3h、5h、7h、9h条件下，测定5-甲基四氢叶酸的保留率。所得结果如图24所示。
通过对不同贮藏条件下(贮藏温度及光照)5-甲基四氢叶酸保留率的探究，得出强化面粉在低温贮藏条件下保留率较高，光照添加下9h之内能够保持较高的保留率，因此本发明的微胶囊对5-甲基四氢叶酸具有一定的保护作用，提高5-甲基四氢叶酸的稳定性。
3)、强化面粉中加工过程中对5-甲基四氢叶酸的影响：
将微胶囊与面粉按照1:10的质量比混合，作为强化面粉；
将强化面粉按照常规方式制做馒头；
强化面粉按照常规方式制做面包(烘烤的炉温，上火是180℃，下火是220℃)；
测定馒头、面包中的5-甲基四氢叶酸保留率(称取一定量的强化馒头及强化面包溶于水，用打浆机将其破碎均匀，测定叶酸的保留率)，所得结果如图25所述。说明本发明的5-甲基四氢叶酸微胶囊的稳定性提高。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.用于提高5-甲基四氢叶酸稳定性的壁材的制备方法，其特征是包括以下步骤：
1)、将酪蛋白与壳寡糖按照2～1:1～2的重量比混合后，溶解于pH7.0～10.0的磷酸盐缓冲溶液中，所得的混合溶液中酪蛋白浓度为(2±0.5)mg/mL；
将混合溶液于(300±50)w的超声波功率、(450±50)w的微波功率、80～100℃的温度下合成20～50min；
2)、步骤1)所得产物装入透析袋(Mr＝8,000～14,000D)中，于去离子水中透析(24±2)h，将截留液冷冻干燥；
3)、将步骤2)所得物于70～85％的相对湿度、(60±10)℃反应(24±2)h，反应结束后将产物真空干燥，得糖基化反应产物，该糖基化反应产物可作为用于提高5-甲基四氢叶酸稳定性的壁材。
2.根据权利要求1所述的用于提高5-甲基四氢叶酸稳定性的壁材的制备方法，其特征是所述步骤1)中：
酪蛋白与壳寡糖的重量比为1:1；选用pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液；
温度为100℃，反应时间为20min。
3.利用如权利要求1或2所得的壁材进行的提高5-甲基四氢叶酸的稳定性的方法，其特征是：利用壁材包埋5-甲基四氢叶酸。
4.根据权利要求3所述的提高5-甲基四氢叶酸的稳定性的方法，其特征是：
将糖基化反应产物溶解在pH7.0～8.0磷酸盐缓冲溶液中，使得糖基化产物的浓度为(1±0.1)mg/mL，取4mL的溶液加入50～250μg的5-甲基四氢叶酸，于惰性气体的保护下，(25±10)℃条件下密封避光混匀；得5-甲基四氢叶酸微胶囊。
5.一种从清酒乳杆菌发酵液中分离5-甲基四氢叶酸的方法，包括发酵液的制备，其特征是：将发酵液过C18固相萃取柱，用超纯水洗脱；从而实现从发酵液中分离5-甲基四氢叶酸。
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