CN111032045B - 用于治疗血液病症的丙酮酸激酶激活剂 - Google Patents

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Abstract

本文描述了激活丙酮酸激酶的化合物、药物组合物及其使用方法。这些化合物由式(I)表示，其中R1、R2、Ra、Rb、Rj、Rk和Q如本文所定义。

Description

用于治疗血液病症的丙酮酸激酶激活剂
相关申请的交叉引用
本申请要求均于2018年5月18日提交的美国临时专利申请第62/673,526号和第62/673,533号的优先权权益。本申请还要求于2017年8月15日提交的国际专利申请第PCT/CN2017/097496号的优先权权益。上述优先权申请中每个通过引用以其整体并入本文。
背景技术
丙酮酸激酶缺乏症(PKD)是由因PKLR基因隐性突变所致的丙酮酸激酶R(PKR)酶缺乏症引起的红细胞疾病(Wijk等人Human Mutation,2008,30(3)446-453)。PKR激活剂可有益于治疗PKD、地中海贫血(例如，β-地中海贫血)、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症或Bassen-Kornzweig综合征、镰状细胞病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、贫血(例如，先天性贫血(例如，酶病)、溶血性贫血(例如，遗传性和/或先天性溶血性贫血、获得性溶血性贫血、由磷酸甘油酸激酶缺乏症引起的慢性溶血性贫血、慢性病性贫血、非球形红细胞溶血性贫血或遗传性球形红细胞增多症)。
发明内容
本文描述了激活丙酮酸激酶R(PKR)野生型和/或突变体酶(诸如，本文所述的那些)的式(I)、(II)、(III)、(IV)和(V)(在本文中统称为“式(I)-(V)”)的化合物及其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，本发明提供了式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R1、R2、Ra、Rb、Rj、Rk和Q如本文所定义。
在一个实施方案中，化合物或其药学上可接受的盐选自表1或图1中的化合物。
还提供了包含式(I)-(V)的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。
本公开还提供了治疗受试者的贫血的方法，包括向受试者给药有效量的(1)本文所述化合物或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物。在某些实施方案中，贫血是红细胞生成异常性贫血，诸如，I、II、III或IV型先天性红细胞生成异常性贫血。
本公开还提供了治疗受试者的镰状细胞病的方法，包括向受试者给药有效量的(1)本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。
本公开还提供了治疗受试者的溶血性贫血(例如，由磷酸甘油酸激酶缺乏症引起的慢性溶血性贫血，Blood Cells Mol Dis,2011；46(3)：206)的方法，包括向受试者给药有效量的(1)本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，该溶血性贫血是遗传性和/或先天性溶血性贫血、获得性溶血性贫血或作为多系统疾病的一部分的贫血。在某些实施方案中，该溶血性贫血是先天性贫血。在某些实施方案中，该溶血性贫血是遗传性(例如，非球形红细胞溶血性贫血或遗传性球形红细胞增多症)。
本公开还提供了治疗受试者的地中海贫血(例如，β-地中海贫血)、遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症(或Bassen-Kornzweig综合征)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、获得性溶血性贫血(例如，先天性贫血(例如，酶病))、镰状细胞病或慢性病性贫血的方法，包括向受试者给药有效量的(1)本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。在一个实施方案中，获得性溶血性贫血包括先天性贫血。在某些实施方案中，所提供的方法用于治疗地中海贫血。在某些实施方案中，地中海贫血是β-地中海贫血。
本公开还提供了治疗受试者的丙酮酸激酶缺乏症(PKD)的方法，所述方法包括向受试者给药有效量的(1)本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，该PKD是PKR缺乏症。在某些实施方案中，该PKR缺乏症与丙酮酸激酶R突变相关。
本文所述化合物和药物组合物是与野生型相比具有较低活性的PKR激活剂，因此可用于本公开的方法。在某些实施方案中，该PKR是野生型。在某些实施方案中，该PKR是突变体。这种PKR中的突变可影响酶活性(催化效率)、调节特性(通过二磷酸果糖(FBP)/ATP调控)和/或酶的热稳定性。这种突变的实例在Valentini等人,JBC 2002中描述。被本文所述化合物激活的突变体的一些实例包括G332S、G364D、T384M、R479H、R479K、R486W、R532W、K410E、R510Q和R490W。不受理论所限，在某些实施方案中，本文所述化合物通过如下方式影响PKR突变体的活性：激活FBP非响应性PKR突变体、恢复稳定性降低的突变体的热稳定性或恢复受损突变体的催化效率。本发明化合物对于PKR突变体的激活活性可遵照实施例中所述方法来测试。在某些实施方案中，本文所述化合物也是野生型PKR的激活剂。
在一个实施方案中，本公开提供了一种在有此需要的受试者中激活红细胞中PKR的方法，包括向受试者给药有效量的(1)本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所公开的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，该PKR是野生型。在某些实施方案中，该PKR是突变体。
在一个实施方案中，突变体PKR选自G332S、G364D、T384M、K410E、R479H、R479K、R486W、R532W、R510Q和R490W。在某些实施方案中，突变体PKR选自A468V、A495V、I90N、T408I和Q421K和R498H。在某些实施方案中，该突变体PKR是R532W、K410E或R510Q。
附图说明
图1是本发明的示例性化合物结构的列表。
图2示出了实施例1-10中所用的示例性中间体的合成。
发明详述
在以下描述中阐述或在附图中示出的构造细节和部件的布置并不意味着是限制性的。可以各种方式来实践或实施实施方案。本文中使用的短语和术语是出于描述的目的，并且不应视为限制性的。
定义
本文所述的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且因此可以多种立体异构形式存在，例如，对映异构体和/或非对映异构体。例如，本文所述化合物可为单个对映异构体、非对映异构体或几何异构体形式，或者可为立体异构体的混合物形式，包括外消旋混合物和富含一种或多种立体异构体的混合物。可通过本领域技术人员已知的方法将异构体从混合物中分离，包括手性高压液相色谱(HPLC)以及手性盐的形成和结晶；或者可通过不对称合成来制备优选的异构体。参见，例如，Jacques等人.,Enantiomers,Racemates andResolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Wilen等人.,Tetrahedron 33:2725(1977)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；和Wilen,S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions第268页(E.L.Eliel,Ed.,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN 1972)。
本文所述化合物还可以多种互变异构形式存在，在这种情况下，显然包括本文所述化合物的所有互变异构形式，即使可能仅表示为单一的互变异构形式(例如，环体系烷基化可能导致多个位点处的烷基化；所有这样的反应产物显然都包含在内)。这样的化合物的所有这样的异构形式显然都包含在内。如果化合物的互变异构体是芳香性的，则该化合物是芳香性的。类似地，如果取代基的互变异构体是杂芳基，则该取代基是杂芳基。
术语“烷基”是指具有1-10个碳原子的直链或支链饱和烃基团(“C1-10烷基”)。C1-6烷基的实例包括甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)(例如，正丙基、异丙基)、丁基(C4)(例如，正丁基、叔丁基、仲丁基、异丁基)、戊基(C5)(例如，正戊基、3-戊基、戊烷基(amyl)、新戊基、3-甲基-2-丁烷基、叔戊烷基)和己基(C6)(例如，正己基)。除非另有说明，每个烷基独立地未取代(“未取代的烷基”)或被一个或多个取代基(例如，卤素诸如F)所取代(“取代的烷基”)。在某些实施方案中，该烷基是未取代的-C1-10烷基。在某些实施方案中，该烷基是取代的-C1-10烷基。
术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢原子独立被卤素(例如，氟、氯、溴或碘)替换的取代烷基，并且包括其中全部氢被卤素替换的烷基(例如，全氟烷基)。在一些实施方案中，该卤代烷基具有1至8个碳原子(“C1-8卤代烷基”)。
术语“烷氧基(alkoxy或alkoxyl)”是指-O-烷基。例如，具有1-6个碳原子的-O-烷基。
术语“芳氧基”是指-O-芳基。在一些实施方案中，该芳氧基是苯氧基。
术语“烯基”是指具有2-10个碳原子以及一个或多个碳-碳双键(例如，1、2、3或4个双键)的直链或支链烃基团。所述一个或多个碳-碳双键可为内部的(诸如，在2-丁烯基中)或末端的(诸如，在1-丁烯基中)。-C2-4烯基的实例包括乙烯基(C2)、1-丙烯基(C3)、2-丙烯基(C3)、1-丁烯基(C4)、2-丁烯基(C4)、丁二烯基(C4)、戊烯基(C5)、戊二烯基(C5)、己烯基(C6)、庚烯基(C7)、辛烯基(C8)、辛三烯基(C8)等。除非另有说明，每个烯基独立地未取代(“未取代的烯基”)或被一个或多个取代基所取代(“取代的烯基”)。在某些实施方案中，该烯基是未取代的-C2-10烯基。在某些实施方案中，该烯基是取代的-C2-10烯基。在烯基中，C＝C双键可为(E)-或(Z)-双键。
术语“炔基”是指具有2-10个碳原子以及一个或多个碳-碳三键(例如，1、2、3或4个三键)的直链或支链烃基团(“C2-10炔基”)。炔基的实例包括乙炔基(C2)、1-丙炔基(C3)、2-丙炔基(C3)、1-丁炔基(C4)、2-丁炔基(C4)、戊炔基(C5)、己炔基(C6)、庚炔基(C7)、辛炔基(C8)等。除非另有说明，每个炔基独立地未取代(“未取代的炔基”)或被一个或多个取代基所取代(“取代的炔基”)。在某些实施方案中，该炔基是未取代的-C2-10炔基。在某些实施方案中，该炔基是取代的-C2-10炔基。
术语“碳环基”或“碳环的”是指在非芳环体系中具有3-14个环碳原子("C3-14碳环基")和0个杂原子的非芳香性单环、二环或三环或多环烃环体系的基团。碳环基包括完全饱和环体系(例如，环烷基)和部分饱和环体系。在一些实施方案中，碳环基具有3至10个环碳原子(“C3-10碳环基”)。
如本文所用，术语“环烷基”包括具有3-14个碳原子的饱和的环、二环、三环或多环烃基团，其包含指定数目的环和碳原子(例如，C3-C14单环、C4-C14二环、C5-C14三环或C6-C14多环环烷基)。在一些实施方案中，“环烷基”是单环环烷基。单环环烷基的实例包括环戊基(C5)、环己基(C5)。环丙基(C3)、环丁基(C4)、环庚基(C7)和环辛基(C8)。在一些实施方案中，“环烷基”是二环环烷基。二环环烷基的实例包括二环[1.1.0]丁烷(C4)、二环[1.1.1]戊烷(C5)、螺[2.2]戊烷(C5)、二环[2.1.0]戊烷(C5)、二环[2.1.1]己烷(C6)、二环[3.3.3]十一烷(C11)、十氢化萘(C10)、二环[4.3.2]十一烷(C11)、螺[5.5]十一烷(C11)和二环[4.3.3]十二烷(C12)。在一些实施方案中，“环烷基”是三环环烷基。三环环烷基的实例包括金刚烷基(C12)。除非另有说明，每个环烷基独立地未取代(“未取代的环烷基”)或被一个或多个取代基所取代(“取代的环烷基”)。在某些实施方案中，该环烷基是未取代的C3-14环烷基。在某些实施方案中，该环烷基是取代的C3-14环烷基。
术语“杂环基”或“杂环的”是指具有环碳原子和1-4个环杂原子的3至14元非芳香性环体系的基团，其中每个杂原子独立选自氮、氧和硫(“3-14元杂环基”)。在包含一个或多个氮原子的杂环基中，当价态允许时，连接点可为碳或氮原子。杂环基可为单环的(“单环杂环基”)或多环的(例如，稠环、桥环或螺环体系，诸如，二环体系(“二环杂环基”)或三环体系(“三环杂环基”))，并且可以是饱和的或可包含一个或多个碳-碳双键或三键。杂环基多环环体系可包含在一个或两个环中的一个或多个杂原子。“杂环基”还包含如下的环体系：其中如上所定义的杂环基环与一个或多个碳环基团稠合，其中连接点是在碳环上或杂环上；或如下的环体系：其中如上所定义的杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合，其中连接点在杂环上，在这样的情况下，环成员数继续表示杂环基环体系中的环成员数。除非另有说明，每个杂环基独立地未取代(“未取代的杂环基”)或被一个或多个取代基所取代(“取代的杂环基”)。在某些实施方案中，该杂环基是未取代的3-14元杂环基。在某些实施方案中，该杂环基是取代的3-14元杂环基。在一些实施方案中，杂环基是具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-10元非芳香性环体系，其中每个杂原子独立选自氮、氧和硫(“5-10元杂环基”)。示例性的杂环基包括氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基、吡咯烷-2,5-二基(pyrrolyl-2,5-dine)、二氧戊环基、氧杂硫杂戊环基、二硫杂戊环基、三唑啉基、噁二唑啉基、噻二唑啉基、哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基、硫杂环己基、哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己基、二氧杂环己基、三嗪烷基、氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氮杂环辛烷基、氧杂环辛烷基、硫杂环辛烷基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、四氢苯并噻吩基、四氢苯并呋喃基、四氢吲哚基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、八氢色烯基、八氢异色烯基、十氢萘啶基、十氢-1,8-萘啶基、八氢吡咯并[3,2-b]吡咯、二氢吲哚基、邻苯二甲酰亚胺基、萘二甲酰亚胺基、色满基、色烯基、1H-苯并[e][1,4]二氮杂基、1,4,5,7-四氢吡喃并[3,4-b]吡咯基、5,6-二氢-4H-呋喃并[3,2-b]吡咯基、6,7-二氢-5H-呋喃并[3,2-b]吡喃基、5,7-二氢-4H-噻吩并[2,3-c]吡喃基、2,3-二氢-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、2,3-二氢呋喃并[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氢-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、4,5,6,7-四氢呋喃并[3,2-c]吡啶基、4,5,6,7-四氢噻吩并[3,2-b]吡啶基、1,2,3,4-四氢-1,6-萘啶基等。
术语“芳基”是指具有在芳香性环体系中提供的6-14个环碳原子和0个杂原子的单环或多环(例如，二环或三环)4n+2芳香性环体系(例如，具有以环状排列共享的6、10或14个π电子)的基团(“C6-14芳基”)。在一些实施方案中，芳基具有6个环碳原子(“C6芳基”；例如，苯基)。在一些实施方案中，芳基具有10个环碳原子(“C10芳基”；例如，萘基，诸如，1-萘基和2-萘基)。在一些实施方案中，芳基具有14个环碳原子(“C14芳基”；例如，蒽基)。“芳基”还包括其中如上所定义的芳基环与一个或多个碳环基或杂环基稠合的环体系，其中连接基或连接点在芳基环上，在这样的情况下，碳原子数继续表示芳基环体系中的碳原子数。除非另有说明，每个芳基独立地未取代(“未取代的芳基”)或被一个或多个取代基所取代(“取代的芳基”)。在某些实施方案中，该芳基是未取代的C6-14芳基。在某些实施方案中，该芳基是取代的C6-14芳基。
术语“杂芳基”是指具有在芳香性环体系中提供的环碳原子和1-4个环杂原子的5-14元单环或多环(例如，二环、三环)4n+2芳香性环体系(例如，具有以环状排列共享的6个π电子)的基团，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-14元杂芳基”)。在一些实施方案中，该杂芳基可为含有1-4个杂原子的5-或6-元单环杂芳基。在一些实施方案中，该杂芳基可为具有1-6个杂原子的8-12元二环杂芳基。“5-或6-元单环杂芳基”或“5-元或6-元单环杂芳基”是指具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-或6-元单环和非稠合的4n+2芳香性环体系。示例性的单环5-或6-元杂芳基包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基和四嗪基。如本文所用，如果基团的互变异构体是杂芳基，则该基团是杂芳基。术语“互变异构体”或“互变异构”是指因氢原子的至少一个正式迁移和至少一个价态改变(例如，单键至双键，三键至单键，反之亦然)所致的两种或更多种可互相转化的化合物/取代基。互变异构体的精确比取决于若干因素，包括温度、溶剂和pH。互变异构化(即，提供互变异构对的反应)可由酸或碱催化。示例性的互变异构化包括酮至烯醇，酰胺至亚胺，内酰胺至内酰亚胺，烯胺至亚胺，以及烯胺至(不同的烯胺)的互变异构化。
术语“饱和的”是指不含双键或三键的部分，即，所述部分仅含单键。
术语“任选取代的”是指取代或未取代的。通常，术语“取代的”表示基团上存在的至少一个氢被可允许的取代基替换，所述可允许的取代基例如为在取代时得到稳定化合物的取代基，所述稳定化合物例如不会通过诸如重拍、环化、消除或其他反应自发地经历转化的化合物。除非另有说明，否则“取代的”基团在该基团的一个或多个可取代位置处具有取代基(例如，C1-6烷基、卤素、硝基、氰基、羟基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基、C1-6酰基、C3-6环烷基、C6-10芳基、单环或二环杂芳基以及单环或二环杂环基)，当指定结构中多于一个位置被取代时，该取代基在每个位置处可为相同或不同的。术语“取代的”预期包含用所有可允许的有机化合物取代基取代，并且包含本文所述的任何导致形成稳定化合物的取代基。本发明考虑了任何和所有这样的组合以得到稳定化合物。为了本发明的目的，杂原子(诸如，氮)可具有氢取代基和/或满足该杂原子价态并导致形成稳定部分的如本文所述的任何合适的取代基。本发明并非旨在以任何方式受限于本文所述的示例性取代基。
“可取代的环碳原子”是指在芳基/杂芳基/碳环基/杂环基环上的碳原子，该碳原子上存在至少一个被如上所定义的可允许的取代基替换的氢。“可取代的环氮原子”是指杂芳基-杂环基环上的氮原子，该氮原子上存在至少一个被可允许的取代基替换的氢。
除非另有说明，“取代的”基团具有位于该基团的一个或多个可取代位置处的取代基，当指定结构中多于一个位置被取代时，每个位置处的取代基是相同或不同的。术语“取代的”预期包括被有机化合物的所有可允许的取代基取代，并且包括导致形成稳定化合物的任何本文所述的取代基。本发明考虑了任何和所有这样的组合以得到稳定化合物。为了本发明的目的，杂原子(诸如，氮)可具有氢取代基和/或满足该杂原子价态并导致形成稳定部分的任何合适的本文所述的取代基。本发明并非意图以任何方式受限于本文所述的示例性取代基。
术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
术语“酰基”是指具有如下通式的基团：-C(＝O)RX1、-C(＝O)ORX1、-C(＝O)-O-C(＝O)RX1、-C(＝O)SRX1、-C(＝O)N(RX1)2、-C(＝S)RX1、-C(＝S)N(RX1)2和-C(＝S)S(RX1)、-C(＝NRX1)RX1、-C(＝NRX1)ORX1、-C(＝NRX1)SRX1和-C(＝NRX1)N(RX1)2，其中，当价态允许时，RX1是氢；卤素；取代或未取代的羟基；取代或未取代的硫醇基(thiol)；取代或未取代的氨基；取代或未取代的酰基，环状或无环的、取代或未取代的、支链或直链的C1-10烷基；环状或无环的、取代或未取代的、支链或直链的C2-10烯基；取代或未取代的C2-10炔基；取代或未取代的C6-12芳基，取代或未取代的杂芳基。示例性的酰基包括醛(-CHO)、羧酸(-CO2H)、酮、酰卤、酯、酰胺、亚胺、碳酸酯、氨基甲酸酯和脲。
在某些实施方案中，存在于氮原子上、氧原子上或硫原子上的取代基分别是氮保护基团、氧保护基团或硫保护基团。氮、氧和硫保护基团是本领域公知的，并且包括在以下详细描述的那些：Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene和P.G.M.Wuts,3rd edition,John Wiley&Sons,1999，其通过引用并入本文。例如，氮保护基团包括但不限于甲酰胺、乙酰胺、氯乙酰胺、三氯乙酰胺、三氟乙酰胺、苯乙酰胺、氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、氨基甲酸9-芴基甲酯(Fmoc)、氨基甲酸叔丁酯(BOC或Boc)、氨基甲酸1-金刚烷基酯(Adoc)、氨基甲酸乙烯酯(Voc)、氨基甲酸烯丙酯(Alloc)、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基(SEM)、对甲苯磺酰胺(Ts)、苯磺酰胺、2,3,6-三甲基-4-甲氧基苯磺酰胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺酰胺(Mtb)、吩噻嗪基-(10)-酰基衍生物、N’-对甲苯磺酰基氨基酰基衍生物等。示例性的氧保护基团包括但不限于甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲硫基甲基(MTM)、叔丁硫基甲基、(苯基二甲基甲硅烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苄氧基甲基(BOM)、对甲氧基苄氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(p-AOM)、四氢吡喃基(THP)、甲磺酸基(mesylate)、苄基磺酸基和甲苯磺酸基(Ts)。
术语“离去基团”以其在合成有机化学领域中的普通含义给出，其是指能够被亲核基团置换的原子或基团。合适的离去基团的实例包括但不限于卤素(诸如，F、Cl、Br或I(碘))、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、烷磺酰氧基、芳磺酰氧基、烷基-羰氧基(例如，乙酰氧基)、磺酸酯，诸如甲苯磺酸酯(tosylate，-OTs)、甲磺酸酯(mesylate，-OMs)、对溴苯磺酰氧基(对溴苯磺酸酯，-OBs)、-OS(＝O)2(CF2)3CF3(全氟丁磺酸酯，-ONf)或三氟甲磺酸酯(triflate，-OTf)。
术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适合与人类和低等动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应等并且具有合理的获益/风险比的那些盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，Berge等人.在J.Pharmaceutical Sciences,1977,66,1-19中详细描述了药学上可接受的盐，其通过引用并入本文。本发明化合物的药学上可接受的盐包括源于合适的无机和有机酸和碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是使用无机酸或有机酸形成的或者使用本领域中已知的其他方法如离子交换形成的氨基的盐，所述无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，所述有机酸诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐(digluconate)、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。衍生自合适的碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和N+(C1-4烷基)4 -盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。当合适时，其他药学上可接受的盐包括使用抗衡离子形成的无毒铵、季铵和胺阳离子的盐，所述抗衡离子例如卤离子、氢氧根离子、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根和芳基磺酸根。
术语“组合物”和“制剂”可互换使用。
预期会对其进行给药的“受试者”是指人(即，任何年龄组的男性或女性，例如，未成年受试者(例如，婴儿、儿童或青少年)或成年受试者(例如，年轻人、中年人或老年人))或非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，灵长类动物(例如，食蟹猴或恒河猴)、商业相关的哺乳动物(例如，牛、猪、马、绵羊、山羊、猫或狗)或禽类(例如，商业相关的禽类，诸如，鸡、鸭、鹅或火鸡))。在某些实施方案中，该非人动物是鱼类、爬行动物类或两栖动物类。该非人动物可为任何发育阶段的雄性或雌性。该非人动物可为转基因动物或基因工程化动物。在某些实施方案中，受试者是患者。术语“患者”是指需要治疗疾病的人类受试者。在某些实施方案中，术语“患者”是需要治疗疾病的超过18岁大的人类成年人。在某些实施方案中，术语“患者”是需要治疗疾病的不超过18岁大的人类儿童。在某些实施方案中，患者没有在定期输液(例如，在12个月时间内有不多于4次的输液事件)。在某些实施方案中，患者有在定期输液(例如，在12个月时间内有至少4次输液事件)。在某些实施方案中，受试者经历了脾切除术。在某些实施方案中，受试者经历了脾切除术并且没有在定期输液。
术语“施用”、“给予”或“给药”是指将本文所述化合物或其组合物植入、吸收到、摄入、注入、吸入或以其他方式引入到受试者中或受试者上。
术语“治疗(treatment,treat,and treating)”是指逆转、减轻、延迟本文所述疾病的发作或抑制本文所述疾病的进展。在一些实施方案中，治疗可在已发展出或已观察到疾病的一种或多种迹象或症状之后施用(即，治疗性治疗)。在其他实施方案中，治疗可在没有疾病的迹象或症状的情况下施用。例如，可在症状发作前对易感受试者施用治疗(即，预防性治疗)(例如，考虑到症状史和/或根据对病原的暴露)。还可在已解决症状之后继续进行治疗，以例如延迟或防止复发。在某些实施方案中，治疗包括将病症的至少一种症状的发作延迟一定时间。
术语“病症”、“疾病”和“障碍”可互换使用。
本文所述化合物的“有效量”是指足以引起所需生物反应的量。本文所述化合物的有效量可取决于诸如以下因素而变：所需的生物学终点，化合物的药代动力学，要治疗的病症，给药方式，以及受试者的年龄和健康。在某些实施方案中，有效量是治疗有效量。在某些实施方案中，该有效量将会产生如下的受试者血红蛋白反应：Hb浓度相对于基线增加≥1.5g/dL。受试者的基线Hb浓度是在用化合物治疗之前所有可得Hb浓度的平均值。在某些实施方案中，该有效量将会产生如下的受试者血红蛋白反应：Hb浓度相对于基线增加≥1.0g/dL。在某些实施方案中，该有效量将会产生如下的受试者血红蛋白反应：Hb浓度相对于基线增加≥2.0g/dL。在某些实施方案中，有效量是本文所述化合物在单一剂量中的量。在某些实施方案中，有效量是本文所述化合物在多个剂量中的组合量。在某些实施方案中，该有效量是治疗有效量。
本文所述化合物的“治疗有效量”是足以在病症的治疗中提供治疗益处或者足以延迟或最小化与病症相关的一种或多种症状的量。化合物的治疗有效量表示单独或与其他治疗剂组合的治疗剂的量，其在病症的治疗中提供了治疗益处。术语“治疗有效量”可包含改善整体治疗，减少或避免病症的症状、迹象或病因，和/或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。在某些实施方案中，治疗有效量是足以引起野生型或突变型PKR的可测量激活的量。在某些实施方案中，治疗有效量是如下的量：其足以调节有此需要的血液中的2,3-二磷酸甘油酸酯和/或ATP水平或者用于治疗丙酮酸激酶缺乏症(PKD)、溶血性贫血(例如，慢性溶血性贫血、遗传性非球形红细胞性贫血)、镰状细胞病、地中海贫血(例如，β-地中海贫血)、遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症(或Bassen-Kornzweig综合征)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、获得性溶血性贫血(例如，先天性贫血(例如，酶病))、慢性病性贫血或用于治疗与2,3-二磷酸甘油酸酯水平升高相关的疾病或病症(例如，肝病)。在某些实施方案中，治疗有效量是如下的量：其足以引起野生型或突变型PKR的可测量的激活，并且用于调节有此需要的血液中的2,3-二磷酸甘油酸酯水平或用于治疗丙酮酸激酶缺乏症(PKD)、溶血性贫血(例如，慢性溶血性贫血、遗传性非球形红细胞性贫血)、镰状细胞病、地中海贫血(例如，β-地中海贫血)、遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症(或Bassen-Kornzweig综合征)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、获得性溶血性贫血(例如，先天性贫血(例如，酶病))、慢性病性贫血或治疗与2,3-二磷酸甘油酸酯水平升高相关的疾病或病症(例如，肝病)。在一个方面，该治疗有效量是产生如下的受试者血红蛋白反应所需的量：Hb浓度相对于基线增加≥1.0g/dL(诸如，≥1.5g/dL或≥2.0g/dL)。受试者的基线Hb浓度是在用本文所述化合物治疗之前至少2周(例如，3周、4周、5周或6周)内所有可得Hb浓度的平均值。在某些方面，该治疗有效量是减轻患者输液负担所需的量。在一个方面，该治疗有效量是0.01-100mg/kg体重/天的所提供的化合物，诸如，例如，0.1-100mg/kg体重/天。在某些实施方案中，该治疗有效量将会减少患者的输液负担。
如本文所用，减轻输液负担表示在至少5周治疗中输注的RBC单位数量减少至少20％。在某些实施方案中，减轻输液负担是在至少5周治疗中输注的RBC单位数量减少≥33％。在某些实施方案中，在至少10周(例如，至少20周或至少24周)中观察到减轻输液负担。
如本文所用，镰状细胞病(SCD)、血红蛋白SS病和镰状细胞贫血可互换使用。镰状细胞病(SCD)描述了一组遗传性红细胞疾病。在某些实施方案中，患SCD的受试者在其红细胞中具有被称为血红蛋白S或镰状血红蛋白的异常血红蛋白。在某些实施方案中，患SCD的人们具有至少一个导致身体产生血红蛋白S的异常基因。在某些实施方案中，患SCD的人们具有两个血红蛋白S基因，血红蛋白SS。
地中海贫血是一种其中身体制造异常形式的血红蛋白的遗传血液病症。在某些实施方案中，异常形式的血红蛋白导致α或β球蛋白缺乏症。在某些实施方案中，该病症导致大量红细胞被破坏，这引起贫血。在某些实施方案中，地中海贫血是α型地中海贫血。在某些实施方案中，地中海贫血是β型地中海贫血。
如本文所用，术语“激活剂”表示(可测量地)增加野生型丙酮酸激酶R(wt PKR)的活性或导致野生型丙酮酸激酶R(wt PKR)的活性增加到高于wt PKR的基础活性水平的水平的药剂，或者(可测量地)增加突变型丙酮酸激酶R(mPKR)的活性或导致突变型丙酮酸激酶R(mPKR)的活性增加到高于突变型PKR的基础活性水平的水平的药剂，例如，增加到野生型PKR活性的20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
如本文所用，术语“压积红细胞”或PRBC是指通过离心和去除大部分血浆而从全血单位制得的红细胞。在某些实施方案中，PRBC单位具有至少约95％的血细胞比容。在某些实施方案中，PRBC单位具有至少约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的血细胞比容。
如本文所用，涉及方法的术语“离体”表示所述方法发生在生物体之外。例如，任选在人工控制条件(例如，温度)下，可从要与本文提供的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物接触的生物体中提取细胞(例如，红细胞)、组织或血液(至少包含红细胞、血浆和血红蛋白)。
如本文所用，涉及方法的术语“体外”表示所述方法发生在生物体外部并且被包含在人工环境中。例如，可在封闭的人工环境(例如，培养系统)中，诸如在试管中、在培养基中、在烧瓶中、在微量滴定板中、在Petri培养皿中等，从要与本文提供的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐或其药物组合物接触的生物体中提取细胞(例如，红细胞)、组织或血液(至少包含红细胞、血浆和血红蛋白)。
化合物
本文描述了激活野生型PKR和/或突变型PKR的化合物和组合物，诸如，本文所述的那些。在一个实施方案中，提供了式(I)-(V)的化合物或其药学上可接受的盐或者包含式(I)-(V)的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
在本发明的第一实施方案中，提供了式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是氢、任选取代的烷基、任选取代的卤代烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基、-ORo1、-C(＝O)Rc1或氮保护基团；其中：
Ro1是氢、任选取代的烷基或氧保护基团；
Rc1是任选取代的烷基或-N(Rcn)2，其中每个Rcn独立地为氢、-C1-6烷基或氮保护基团；
R2和Q各自独立地是任选取代的5-或6-元单环杂芳基；
Ra和Rb各自独立地是氢、卤素、-CN、-NO2、-N3、任选取代的烷基、-ORo3、-N(Rn1)2、-C(＝O)N(Rn1)2或-C(＝O)Rc2；或者可选择地Ra和Rb可与它们所连接的碳原子共同形成任选取代的环烷基或任选取代的杂环基；其中：
每个Rn1独立地为氢、任选取代的-C1-C6烷基或氮保护基团；
Ro3是氢、任选取代的-C1-C6烷基或氧保护基团；和
Rc2是任选取代的-C1-C6烷基；和
Rj和Rk各自独立地是氢、卤素、-CN、-ORo7、-N(Rn5)2、-N(Rn5)C(＝O)Rc5、-C(＝O)N(Rn5)2、-C(＝O)Rc5、-C(＝O)ORo7、-SRjs、-S(＝O)2Rjs、-S(＝O)Rjs或任选取代的-C1-C6烷基；或者可选择地Rj和Rk可与它们所连接的碳原子共同形成C＝O、任选取代的C1-C6单环环烷基环或任选取代的C3-C6单环杂环基环；其中：
每个Rn5独立地为氢、任选取代的-C1-C6烷基、-ORo8或氮保护基团，其中Ro8是氢、任选取代的-C1-C6烷基或氧保护基团；
每个Ro7独立地为氢、任选取代的-C1-C6烷基或氧保护基团；
每个Rc5独立地为任选取代的-C1-C6烷基；和
每个Rjs独立地为任选取代的-C1-C6烷基、任选取代的C6-12芳基、任选取代的杂芳基或硫保护基团。
在本发明的第二实施方案中，提供了式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2所代表的5-或6-元单环杂芳基在每个可取代的环碳原子处被Rp任选取代和在每个可取代的环氮原子处被Rn6任选取代；其中：
每个Rp独立地为氢、卤素、-CN、-NO2、-N3、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环基、任选取代的杂芳基、-ORo6、-SRs2、-N(Rn3)2、-C(＝O)N(Rn3)2、-N(Rn3)C(＝O)Rc4、-C(＝O)Rc4、-C(＝O)ORo6、-OC(＝O)Rc4、-S(＝O)Rs2、-S(＝O)2Rs2、-S(＝O)ORo6、-OS(＝O)Rc4、-S(＝O)2ORo6、-OS(＝O)2Rc4、-S(＝O)N(Rn3)2、-S(＝O)2N(Rn3)2、-N(Rn3)S(＝O)Rs2、-N(Rn3)S(＝O)2Rs2、-N(Rn3)C(＝O)ORo6、-OC(＝O)N(Rn3)2、-N(Rn3)C(＝O)N(Rn3)2、-N(Rn3)S(＝O)N(Rn3)2、-N(Rn3)S(＝O)2N(Rn3)2、-N(Rn3)S(＝O)ORo6、-N(Rn3)S(＝O)2ORo6、-OS(＝O)N(Rn3)2或-OS(＝O)2N(Rn3)2；或者可选择地连接到相同或相邻的碳原子的两个Rp可与它们所连接的碳原子共同形成任选取代的环烷基或杂环烷基；其中：
每个Rn3独立地为氢、任选取代的-C1-C6烷基或氮保护基团；
每个Ro6独立地为氢、任选取代的-C1-C6烷基或氧保护基团；和
每个Rc4是任选取代的-C1-C6烷基；
每个Rs2独立地为任选取代的-C1-C6烷基或硫保护基团；和
Rn6是氢、任选取代的-C1-C6烷基或氮保护基团；
其中其余变量如第一实施方案中所定义。
在本发明的第三实施方案中，提供了式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2所代表的5-或6-元单环杂芳基是选自以下之一：
/>
其中：
每个Rnc和Rnd独立地为氢、任选取代的-C1-C6烷基或氮保护基团；
p是0、1、2、3或4，当价态允许时；
其中其余变量如第一或第二实施方案中所定义。
在本发明的第四实施方案中，提供了式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2所代表的5-或6-元单环杂芳基是选自以下之一：
其中其余变量如第一、第二或第三实施方案中所定义。
在本发明的第五实施方案中，提供了式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2所代表的5-或6-元单环杂芳基是选自以下之一：
其中其余变量如第一、第二、第三或第四实施方案中所定义。
在本发明的第六实施方案中，提供了式(II)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中q是0、1、2或3；其中其余变量如第一、第二、第三、第四或第五实施方案中所定义。在某些实施方案中，提供了下式之一所示的化合物或其药学上可接受的盐：
在本发明的第七实施方案中，提供了式(III)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中q是0、1、2或3；其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五或第六实施方案中所定义。
在本发明的第八实施方案中，提供了式(IV)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中q是0、1、2或3；其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七实施方案中所定义。
在本发明的第九实施方案中，提供了式(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中q是0、1、2或3；其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八实施方案中所定义。
在本发明的第十实施方案中，提供了式(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Rn6是氢或-C1-4烷基；其中其余变量如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九实施方案中所定义。
在本发明的第十一实施方案中，提供了式(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个Rp独立地为氢、卤素、任选取代的C1-4烷基、-CN、-NO2、-N3、-ORo4、-N(Rn2)2、-C(＝O)N(Rn2)2、-C(＝O)Rc3或-C(＝O)ORo4；其中其余变量如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十实施方案中所定义。
在本发明的第十二实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q所代表的5-或6-元单环杂芳基选自以下：
其中：
每个Rn独立地为氢、卤素、-CN、-NO2、-N3、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的芳基、任选取代的杂环基、任选取代的杂芳基、-ORo4、-SRs1、-N(Rn2)2、-C(＝O)N(Rn2)2、-N(Rn2)C(＝O)Rc3、-C(＝O)Rc3、-C(＝O)ORo4、-OC(＝O)Rc3、-S(＝O)Rs1、-S(＝O)2Rs1、-S(＝O)ORo4、-OS(＝O)Rc3、-S(＝O)2ORo4、-OS(＝O)2Rc3、-S(＝O)N(Rn2)2、-S(＝O)2N(Rn2)2,-N(Rn2)S(＝O)Rs1、-N(Rn2)S(＝O)2Rs1、-N(Rn2)C(＝O)ORo4、-OC(＝O)N(Rn2)2、-N(Rn2)C(＝O)N(Rn2)2、-N(Rn2)S(＝O)N(Rn2)2、-N(Rn2)S(＝O)2N(Rn2)2、-N(Rn2)S(＝O)ORo4、-N(Rn2)S(＝O)2ORo4、-OS(＝O)N(Rn2)2或-OS(＝O)2N(Rn2)2；或连接到相同或相邻碳原子的两个Rn与它们所连接的碳原子共同形成任选取代的环烷基或杂环烷基；其中：
每个Rn2独立地为氢、任选取代的-C1-C6烷基或氮保护基团；
每个Ro4独立地为氢、任选取代的-C1-C6烷基或氧保护基团；
每个Rc3独立地为任选取代的-C1-C6烷基；
每个Rs1独立地为任选取代的-C1-C6烷基或硫保护基团；
当价态允许时，n是0、1、2或3；和
Rna、Rnb和Rnd中的每个独立地为氢、任选取代的-C1-C6烷基或氮保护基团。
其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一实施方案中所定义。
在本发明的第十三实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q所代表的5-或6-元单环杂芳基选自以下：
其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一或第十二实施方案。
在本发明的第十四实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q所表示的5-或6-元单环杂芳基选自以下：
其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二或第十三实施方案中所定义。
在本发明的第十五实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q是或/>其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四实施方案中所定义。在进一步的实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q是/>其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四实施方案中所定义。
在本发明的第十六实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q是其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四实施方案中所定义。在进一步的实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q是/>其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三或第十四实施方案中所定义。在某些实施方案中，R2和Q是相同的。在某些实施方案中，R2和Q是不同的。
在本发明的第十七实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Rna是氢或-C1-4烷基；其中其余变量如第十二、第十三、第十四或第十五实施方案中所定义。
在本发明的第十七实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Rnb是氢或-C1-4烷基；其中其余变量如第十二、第十三、第十四或第十五实施方案中所定义。
在本发明的第十七实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Rnd是氢或-C1-4烷基；其中其余变量如第十二、第十三、第十四或第十五实施方案中所定义。
在本发明的第十八实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中每个Rn独立地为氢、卤素、任选取代的C1-4烷基、-CN、-NO2、-N3、-ORo4、-N(Rn2)2、-C(＝O)N(Rn2)2、-C(＝O)Rc3或-C(＝O)ORo4；其中其余变量如第十二、第十三、第十四、第十五、第十六或第十七实施方案中所定义。
在本发明的第十九实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是氢或-C1-C4烷基；其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七或第十八实施方案中所定义。
在本发明的第二十实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是甲基；其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七或第十八实施方案中所定义。
在本发明的第二十一实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Rj和Rk各自独立地是氢、卤素、-ORo7或-C1-C4烷基；或者可选择地Rj和Rk结合在一起形成＝O，其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九或第二十实施方案中所定义。
在本发明的第二十二实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Rj和Rk各自是氢；其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十或第二十一实施方案中所定义。
在本发明的第二十三实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中Ra和Rb各自是氢；其中其余变量如第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一或第二十二实施方案中所定义。
在本发明的第二十四实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中q是0或1；其中其余变量如第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二或第二十三实施方案中所定义。
在本发明的第二十五实施方案中，提供了式(I)、(II)、(III)、(IV)或(V)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中n是0或1；其中其余变量如第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十、第二十一、第二十二、第二十三或第二十四实施方案中所定义。
在一个实施方案中，化合物或其药学上可接受的盐是选自实施例1中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物。
本文所述的化合物可用作与野生型相比具有较低活性的PKR突变体的激活剂，因此可用于本发明的方法。PKR中的这种突变能影响酶的酶活性(催化效率)、调节特性(通过二磷酸果糖(FBP)/ATP调节)和/或热稳定性。这种突变的实例在Valentini等人,JBC 2002中描述。通过本文所述化合物激活的突变体的一些实例包括G332S、G364D、T384M、R479H、R479K、R486W、R532W、K410E、R510Q和R490W。不受理论所限，本文所述化合物通过如下方式影响PKR突变体的活性：激活FBP非响应性PKR突变体，恢复稳定性降低的突变体的热稳定性或恢复受损突变体的催化效率。本发明化合物针对PKR突变体的激活活性可遵照实施例11-17中所述方法检测。本文所述化合物也可用作野生型PKR的激活剂。
在一个实施方案中，为增加红细胞的寿命，可将本文所述的化合物、组合物或药物组合物直接体外添加到全血或压积红细胞中或直接提供给患者(例如，通过腹膜内注射、静脉注射、肌内注射、口服、吸入(气溶胶递送)、透皮、舌下和其他递送途径)。不受理论所限，本文所述化合物增加RBC的寿命，因此通过影响血液中2,3-DPG和/或ATP的水平来对抗贮藏血液的老化。2,3-DPG浓度的降低引发了氧-血红蛋白解离曲线的左移并将变构平衡向R或氧化态偏移，因此通过增加由于2,3-DPG耗尽引起的氧亲和力来对镰状细胞化所致的细胞内聚合产生治疗性抑制，从而稳定了更易溶的氧合血红蛋白。因此，在一个实施方案中，本文所述的化合物和药物组合物可用作抗镰状细胞化剂。在另一个实施方案中，为调节2,3-二磷酸甘油酸酯，可将本文所述的化合物、组合物或药物组合物直接体外添加至全血或压积红细胞中或直接提供给患者(例如，通过腹膜内注射、静脉注射、肌内注射、口服、吸入(气溶胶递送)、透皮、舌下和其他递送途径)。在另一个实施方案中，本文所述的化合物、组合物或药物组合物可增加ATP水平并有助于保护细胞免受活性氧的影响(Mol Cell.2012Oct26；48(2)：158-167)。
在表1中，本文所述化合物可具有野生型PKR、PKR K410E或PKR 510Q的AC50。“A”是指AC50小于0.300μM；“B”是指AC50为0.301μM至0.800μM；和“C”是指AC50大于0.800μM。对于某些化合物，野生型PKR的AC50还可以在基于细胞的ATP检测中测定。“AA”是指AC50小于或等于1μM，“BB”是指AC50大于1μM。
表1.通过实施例化合物激活野生型和突变型PKR
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“*”表示该值是基于多个测试结果的平均值。
可使用实施例中所阐述的多种合成技术来制备本文所述化合物。可用于合成本文所述化合物的合成化学转化和基团保护方法(保护和脱保护)是本领域已知的，并且包括例如诸如以下中所述的那些：R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCHPublishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，2d.Ed.，John Wiley和Sons(1991)；L.Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis，John Wiley和Sons(1994)；和L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley和Sons(1995)及它们的后续版本。
可用作野生型和/或突变型PKR激活剂的某些激活剂化合物是如下那些：其验证了在不存在FBP的情况下PKR酶(野生型和/或突变型酶)的特异性和激活程度大于在存在FBP的情况下的10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％的水平。
本发明化合物的合成
方案1
在一些实施方案中，可使用方案1中所述的方法制备式(I)的化合物。式S1的噻唑基醛与叠氮乙酸乙酯在亲核加成条件(例如，碱)下在合适溶剂(例如，乙醇)中反应得到式S2的中间体。式S2的羟基可被转化为离去基团并经历消除，得到式S3。氨基的环化和后续的官能化提供了式S5的二环化合物，其与甲硫醇钠进行亲核取代，随后氧化，得到式S7。式S7在肼存在下进一步环化，随后在碱存在下用LG1-CH2-Q1亲核取代，提供了式S9的中间体。式S9中的硫基团可被氧化为亚磺酰基或磺酰基以提供式S10或S11，其是进一步亲核取代以产生通式S12的底物。如本文所用，X1是如本文所定义的离去基团。在某些实施方案中，X1是卤素、烷磺酰氧基、芳磺酰氧基、重氮化合物、烷基二氮烯(alkyl diazenes)、芳基二氮烯、烷基三氮烯、芳基三氮烯、硝基、硝酸烷基酯、硝酸芳基酯、磷酸烷基酯、磷酸芳基酯、烷基羰氧基、芳基羰氧基、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、氨、烷基胺、芳基胺、羟基、烷氧基、芳氧基；LG1是如本文所定义的离去基团；Q1是任选取代的环烷基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基(例如，任选取代的5-或6-元单环杂芳基)；和Nu1是如本文所定义的亲核基团(例如，任选取代的5-或6-元单环杂芳基亚烷基(alkylene))。式S12的化合物的Nu1可使用标准化学转化而进一步转化为其他官能团。R1如第一实施方案所定义。在某些实施方案中，Q1是任选取代的杂芳基。
方案2
在一些实施方案中，可使用方案2中所示的方法制备式(I)的化合物。类似于方案1，可由式S13的噻唑醛制备式S21。式S21的卤化得到了式S22，其可与烷基金属、烯基金属、炔基金属、芳基金属、杂芳基金属、杂环基金属或环烷基金属进行有机偶联反应，得到式S23的化合物。如本文所用，X3是卤素；R1如本发明的第一实施方案所定义；LG2是如本文所定义的离去基团；Q2是任选取代的环烷基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基(例如，任选取代的5-或6-元单环杂芳基)；M1是金属(例如，Li、Na、K、Mg、Zn、Sn、B、Pd、Si、Cu等)，X4是卤素或烷基磺酸酯或芳基磺酸酯；Rr1是任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。在某些实施方案中，该有机偶联反应是Negishi反应；X3是I；和M1是Zn。
式S22和S23的化合物是在X3和/或Rr1位置处引入更多官能团的有用的中间体(方案3)。在某些实施方案中，式23-i的化合物可被进一步氧化以形成式S24。S24与合适的亲核试剂的亲核加成产生S25的化合物。在另一个实施方案中，式S22的化合物可与乙烯基金属偶联以将乙烯基引入到噻唑环上。乙烯基氧化然后进行亲核加成提供了式S28的化合物。如本文所用，Nu2是亲核试剂。在某些实施方案中，Rr1是任选取代的5-或6-元单环杂芳基亚烷基，Q2是任选取代的5-或6-元单环杂芳基。
方案3
如本文所用，Rr2是任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基；和Q2如方案2中所定义。在某些实施方案中，Rr2和Q2各自独立地是任选取代的5-或6-元单环杂芳基。
如本文所用，亲核试剂是向亲电试剂贡献电子对以形成与反应相关的化学键的化学物质。所有具有游离电子对或至少一个π键的分子或离子可用作亲核试剂。示例性的亲核试剂包括至少一种具有亲核官能团的基团，例如，α碳(例如，邻近羰基、磺酰基、亚磺酰基、芳基或杂芳基的碳)、硫醇基(thiol)、羟基、伯胺基团、仲胺基团、卤化物、氰化物、叠氮化物、烃氧基金属(alcoxide)、有机金属或无机碱。
在一些实施方案中，可使用方案4中所示的方法制备如本文所述的化合物。用仲环胺对式S30和S33进行亲核取代分别提供了式S31和S34。化合物S35的有机偶联反应(例如，Suzuki偶联、Stille偶联等)提供了式S36(i)-(ii)的化合物。
方案4
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如本文所用，表示具有作为环原子的氮的5-或6-元单环杂芳基环A。如本文所用，/>表示连接点在碳环原子上的5-或6-元单环杂芳基环B。
R1如第一实施方案所定义。X4是卤素或-OTf。M4是有机金属，当价态允许时，其根据需要具有合适的配体(有机或无机)。示例性的M4包括但不限于有机Li、Sn、B(例如，硼酸和硼酸酯)、Zn、Mg、Si、Pd和Cu。
治疗方法
在一个实施方案中，提供了一种治疗如本文所述的疾病、病症或障碍的方法(例如，治疗)，其包括给药本文所述的化合物、该化合物的药学上可接受的盐或包含该化合物的药物组合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)。
本文所述的化合物和组合物可被施用给培养细胞(例如体外或离体)或施用给受试者(例如，体内)以治疗和/或诊断多种病症，包括本文下面所述的那些。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种增加有此需要的红细胞(RBC)的寿命的方法，包括将血液与有效量的(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物接触。
在进一步的实施方案中，将该化合物或药物组合物直接添加到全血或压积红细胞中(例如，体外的)。在另一个实施方案中，将该化合物或药物组合物给药于有此需要的受试者。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种用于在有此需要的血液中调节2,3-二磷酸甘油酸酯水平的方法，包括将血液与有效量的(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物接触。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种治疗镰状细胞病的方法，包括向有此需要的受试者给药有效量的(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物。
如这里所用，镰状细胞病(SCD)、血红蛋白SS病和镰状细胞贫血可互换使用。镰状细胞病(SCD)描述了一组遗传性红细胞疾病。在某些实施方案中，患有SCD的受试者在它们的红细胞中具有被称为血红蛋白S或镰状血红蛋白的异常血红蛋白。在某些实施方案中，患有SCD的受试者具有至少一个导致身体产生血红蛋白S的异常基因。在某些实施方案中，患有SCD的受试者具有两个血红蛋白S基因，血红蛋白SS。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种治疗受试者的丙酮酸激酶缺乏症(PKD)的方法，包括向受试者给药有效量的(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物。
如本文所述，PKD是PKR缺乏症。在某些实施方案中，该PKR缺乏症与PKR突变体相关。在某些实施方案中，PKD是指在PKLR基因中存在至少两个突变等位基因。在某些实施方案中，PKLR基因中的至少两个突变等位基因中的至少1个是错义突变。在某些实施方案中，PKD患者的Hb浓度小于或等于10.0g/dL。在某些实施方案中，患者没有定期输液(例如，在12个月内不超过4次输液事件)。在某些实施方案中，患者有在定期输液(例如，在12个月内有至少4次输液事件)。在某些实施方案中，患者有在定期输液，在12个月内有至少6次输液事件。在某些实施方案中，有在定期输液的患者的血红蛋白(Hb)≤12.0g/dL(如果为男性)或≤11.0g/dL(如果为女性)。在某些实施方案中，患者经历过脾切除术。
在一个实施方案中，PKR突变体选自：A31V、A36G、G37Q、R40W、R40Q、L73P、S80P、P82H、R86P、I90N、T93I、G95R、M107T、G111R、A115P、S120F、H121Q、S130P、S130Y、V134D、R135D、A137T、G143S、I153T、A154T、L155P、G159V、R163C、R163L、T164N、G165V、L167M、G169G、E172Q、W201R、I219T、A221Y、D221N、G222A、I224T、G232C、N253D、G263R、G263W、E266K、V269F、L272V、L272P、G275R、G275R、E277K、V280G、D281N、F287V、F287L、V288L、D293N、D293V、A295I、A295V、I310N、I314T、E315K、N316K、V320L、V320M、S330R、D331N、D331G、D331E、G332S、V335M、A336S、R337W、R337P、R337Q、D339N、D339Q、G341A、G341D、I342F、K348N、A352D、I357T、G358R、G358E、R359C、R359H、C360Y、N361D、G364D、K365M、V368F、T371I、L374P、S376I、T384M、R385W、R385K、E387G、D390N、A392T、N393D、N393S、N393K、A394S、A394D、A394V、V395L、D397V、G398A、M403I、G406R、E407K、E407G、T408P、T408A、T408I、K410E、G411S、G411A、Q421K、A423A、A423A、R426W、R426Q、E427A、E427N、A431T、R449C、I457V、G458D、A459V、V460M、A468V、A468G、A470D、T477A、R479C、R479H、S485F、R486W、R486L、R488Q、R490W、I494T、A495T、A495V、R498C、R498H、A503V、R504L、Q505E、V506I、R510Q、G511R、G511E、R518S、R531C、R532W、R532Q、E538D、G540R、D550V、V552M、G557A、R559G、R559P、N566K、M568V、R569Q、R569L、Q58X、E174X、W201X、E241X、R270X、E440X、R486X、Q501X、L508X、R510X、E538X、R559X。这些突变体如Canu等人，Blood Cells，Molecules and Diseases 2016，57，第100-109页中所述。在一个实施方案中，突变型PKR选自G332S、G364D、T384M、K410E、R479H、R479K、R486W、R532W、R510Q和R490W。在某些实施方案中，突变型PKR选自A468V、A495V、I90N、T408I和Q421K和R498H。在某些实施方案中，突变型PKR是R532W、K410E或R510Q。
在本发明的一个实施方案中，提供了治疗受试者的贫血的方法，包括向受试者给药有效量的(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物。在某些实施方案中，贫血是红细胞生成异常性贫血，诸如，先天性红细胞生成异常性贫血I、II、III或IV型。在某些实施方案中，贫血是溶血性贫血。在某些实施方案中，溶血性贫血是先天性和/或遗传性形式的溶血性贫血，诸如，PKD、镰状细胞病、地中海贫血(例如，α或β型)、遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、无β脂蛋白血症(Bassen-Kornzweig综合征)。在某些实施方案中，溶血性贫血是获得性溶血性贫血，诸如，自身免疫性溶血性贫血、药物诱导型溶血性贫血。在某些实施方案中，溶血性贫血是作为多系统疾病的一部分的贫血，诸如，先天性红细胞性紫癜贫血、范可尼(Fanconi)贫血、Diamond-Blackfan贫血。
如本文所用，术语“贫血”是指红细胞(RBC)和/或血红蛋白缺乏症。如本文所用，贫血包括所有类型的临床贫血，例如，(但不限于)：小红细胞性贫血、缺铁性贫血、血红蛋白病、血红素合成缺陷、球蛋白合成缺陷、铁粒幼细胞性缺陷、正常红细胞性贫血、慢性病性贫血、再生障碍性贫血、溶血性贫血、大细胞性贫血、巨幼细胞贫血、恶性贫血、二形性贫血、早产儿贫血、范可尼贫血、遗传性球形红细胞增多症、镰状细胞病、温抗体型自体免疫性溶血性贫血、冷凝集素溶血性贫血、骨硬化症、地中海贫血和骨髓增生异常综合征。
在某些实施方案中，贫血可基于全血细胞计数来诊断。在某些实施方案中，贫血可基于以下来诊断：一种或多种溶血标记物(例如，RBC计数、血红蛋白、网织红细胞、裂细胞、乳酸脱氢酶(LDH)、触珠蛋白、胆红素和铁蛋白)的测量结果和/或含铁血黄素尿平均红细胞容积(MCV)和/或红细胞分布宽度(RDW)。在本发明的上下文中，如果个体的血红蛋白(Hb)小于理想水平，例如，Hb浓度小于14g/dL，更优选小于13g/dL，更优选小于12g/dL，更优选小于11g/dL，或最优选小于10g/dL，则存在贫血。
在某些实施方案中，本文提供了通过给药有效量的如本文所述的化合物或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的组合物而增加有此需要的受试者的血红蛋白的量的方法。在某些实施方案中，所提供的方法增加了受试者的血红蛋白浓度。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加到理想水平，例如，高于10g/dL，更优选高于11g/dL，更优选高于12g/dL，更优选高于13g/dL，或最优选高于14g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约0.5g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约1.0g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约1.5g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约2.0g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约2.5g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约3.0g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约3.5g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约4.0g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约4.5g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约5.0g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约5.5g/dL。在某些实施方案中，所提供的方法将Hb浓度增加至少约6.0g/dL。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种治疗溶血性贫血的方法，包括向受试者给药有效量的(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物。
在进一步的实施方案中，溶血性贫血是遗传性和/或先天性溶血性贫血、获得性溶血性贫血或作为多系统疾病的一部分的贫血。在某些实施方案中，该溶血性贫血是先天性贫血。在某些实施方案中，该溶血性贫血是遗传性的(例如，非球形红细胞性溶血性贫血或遗传性球形红细胞增多症)。
在本发明的一个实施方案中，提供了治疗下列疾病的方法：地中海贫血；遗传性球形红细胞增多症；遗传性椭圆形红细胞增多症；无β脂蛋白血症或Bassen-Kornzweig综合征；阵发性睡眠性血红蛋白尿症；获得性溶血性贫血(例如，先天性贫血(例如，酶病))；镰状细胞病；或慢性病性贫血，包括向受试者给药有效量的(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物。在一个实施方案中，该获得性溶血性贫血包括先天性贫血。在某些实施方案中，所提供的方法用于治疗地中海贫血。在某些实施方案中，该地中海贫血是β-地中海贫血。
如本文所用，地中海贫血是遗传性血液疾病，其中身体产生异常形式的血红蛋白。在某些实施方案中，该疾病导致大量红细胞被破坏，这导致贫血。在某些实施方案中，地中海贫血是α型地中海贫血。在某些实施方案中，地中海贫血是β型地中海贫血。
在本发明的一个实施方案中，提供了用于激活红细胞中的突变型PKR的方法，包括向有此需要的受试者给药有效量的(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物。在一个实施方案中，该方法是离体方法。在另一个实施方案中，该方法是体外方法。在一些实施方案中，该血液或红细胞来源于或得自患有或易患选自以下的疾病或病症的受试者：丙酮酸激酶缺乏症(PKD)，地中海贫血(例如，β型地中海贫血)，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症或Bassen-Kornzweig综合征、镰状细胞病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、贫血(例如，红细胞生成异常性贫血(dyserythropoetic anemia))、溶血性贫血和慢性病性贫血。在一些实施方案中，溶血性贫血是遗传性和/或先天性溶血性贫血、获得性溶血性贫血或作为多系统疾病的一部分的贫血。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种用于激活红细胞中的激活野生型PKR的方法，包括向有此需要的受试者施用有效量的(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物。在一个实施方案中，该方法是离体方法。在另一个实施方案中，该方法是体外方法。在一些实施方案中，血液或红细胞来源于或得自患有或易患选自下组的疾病或病症的受试者：丙酮酸激酶缺乏症(PKD)，地中海贫血(例如，β型地中海贫血)，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症或Bassen-Kornzweig综合征、镰状细胞病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、贫血(例如，缺血性贫血)、溶血性贫血和慢性病性贫血。在一些实施方案中，该溶血性贫血是遗传性和/或先天性溶血性贫血、获得性溶血性贫血或作为多系统疾病的一部分的贫血。
在本发明的一个实施方案中，提供了(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物用于制备增加有此需要的红细胞(RBC)的寿命的药物的用途。
在进一步的实施方案中，将该化合物或药物组合物配制为直接体外添加到全血或压积红细胞中。在另一个实施方案中，该化合物或药物组合物配制为被施用给有此需要的受试者。
在本发明的一个实施方案中，提供了(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物在制备用于调节有此需要的血液中的2,3-二磷酸甘油酸酯水平的药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，提供了(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物在制备用于治疗贫血的药物中的用途。在某些实施方案中，该贫血是红细胞生成异常性贫血，诸如，先天性红细胞生成异常性贫血I、II、III或IV型。在某些实施方案中，该贫血是溶血性贫血。在某些实施方案中，该溶血性贫血是先天性和/或遗传性形式的溶血性贫血，诸如，PKD、镰状细胞病、地中海贫血(例如，α型或β型)，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症)，阵发性睡眠性血红蛋白尿症、无β脂蛋白血症(Bassen-Kornzweig综合征)。在某些实施方案中，该溶血性贫血是获得性溶血性贫血，诸如，自身免疫性溶血性贫血、药物诱导型溶血性贫血。在某些实施方案中，该溶血性贫血是作为多系统疾病的一部分的贫血，诸如，先天性红细胞性紫癜贫血、范可尼贫血、Diamond-Blackfan贫血。
在本发明的一个实施方案中，提供了(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物在制备用于治疗溶血性贫血的药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，提供了(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物在制备用于治疗镰状细胞病的药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，提供了(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物在制备用于治疗受试者的丙酮酸激酶缺乏症(PKD)的药物中的用途。
如本文所述，PKD是PKR缺乏症。在某些实施方案中，该PKR缺乏症与PKR突变体相关。
在本发明的一个实施方案中，提供了(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物在制备用于治疗以下疾病的药物中的用途：地中海贫血；遗传性球形红细胞增多症；遗传性椭圆形红细胞增多症；无β脂蛋白血症或Bassen-Kornzweig综合征；阵发性睡眠性血红蛋白尿症；获得性溶血性贫血；或慢性病性贫血。
在本发明的一个实施方案中，提供了(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物在制备用于激活红细胞中的突变型PKR的药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，提供了(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物在制备用于激活红细胞中的野生型PKR的药物中的用途。
在本发明的一个实施方案中，提供了激活丙酮酸激酶R(PKR)的方法，包括将PKR与有效量的(1)本文所述化合物(例如，实施例中以及表1和图1中的式(I)-(V)的化合物)或其药学上可接受的盐；或(2)包含本文所述化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物接触。在一个实施方案中，该PKR是野生型PKR。在另一个实施方案中，该PKR是突变型PKR。在一些实施方案中，该PKR在红细胞中表达。在一个实施方案中，该方法是离体方法。在另一个实施方案中，该方法是体外方法。在一些实施方案中，该血液或红细胞来源于或得自患有或易患选自下列疾病或病症的受试者：丙酮酸激酶缺乏症(PKD)，地中海贫血(例如，β型地中海贫血)，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、无β脂蛋白血症或Bassen-Kornzweig综合征、镰状细胞病、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、贫血(例如，红细胞生成异常性贫血(dyserythropoetic anemia))、溶血性贫血和慢性病性贫血。在一些实施方案中，该溶血性贫血是遗传性和/或先天性溶血性贫血、获得性溶血性贫血或作为多系统疾病的一部分的贫血。
由于本文所述的化合物和组合物与WO2012/151451中所述的化合物作用于相同生物途径并且具有相似的作用模式，本文所阐述的化合物和组合物能激活如WO2012/151451中所述的PKR突变体。
组合物和给药途径
本文描述的组合物包含本文描述的化合物(例如，本文所述化合物)以及其他治疗剂(如果存在)，其量可有效实现对疾病或疾病症状(包括本文所述的那些)的调节。
术语“药学上可接受的载体或佐剂”是指如下的载体或佐剂：所述载体或佐剂可与随其提供的化合物一起被给药于患者，并且当以足以递送有效量化合物的剂量给药时，其不会破坏其药理学活性并且是无毒的。
可用于本文所提供的药物组合物中的药学上可接受的载体、佐剂和介质包括但不限于离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，自乳化药物递送系统(SEDDS)诸如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，用于药物剂型中的表面活性剂诸如吐温或其他类似聚合物递送基质，血清蛋白质诸如人血清白蛋白，缓冲物质诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐，或电解质诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。还可有利地使用环糊精诸如，α-、β-和γ-环糊精或化学修饰的衍生物，诸如羟烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精或其他增溶衍生物以增强本文所述式的化合物的递送。
本文提供的药物组合物可通过如下方式给药：口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入型储器，优选通过口服给药或通过注射给药。本文提供的药物组合物可包含任何常规的无毒药学上可接受的载体、佐剂或介质。
本文提供的药物组合物可以任何口服可接受的剂型口服给药，包括但不限于胶囊剂、片剂、乳液剂和水悬浮剂、分散剂和溶液剂。在用于口服用途的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，诸如，硬脂酸镁。对于胶囊剂形式的口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服给药水悬浮剂和/或乳液时，活性成分可与乳化剂和/或悬浮剂结合悬浮或溶解在油相中。
当本文提供的组合物包含本文所述式的化合物与一种或多种其他治疗或预防剂的组合时，该化合物和其他药剂二者均应以通常在单一治疗方案中给药的剂量的约1至100％、更优选约5-95％的剂量水平给药。其他药剂可与本文所提供的化合物分开作为多剂量方案的一部分施用。可选择地，那些药剂可作为单一剂型的一部分，与本文所提供的化合物在单一组合物中混合。
本文所述化合物可例如通过以下方式施用：注射、静脉内，动脉内，真皮下(subdermally)，腹膜内，肌内，或皮下(subcutaneously)；或者口服，经颊，经鼻，经粘膜，局部，以眼部制剂或通过吸入给药，剂量在约0.5至约100mg/kg体重范围内，可选择地，每4-120小时一次或根据具体药物的要求，剂量为1mg至1000mg/剂。可与载体物质组合以制备单一剂型的活性成分的量将取决于所治疗的主体和具体给药方式而变。典型的制剂将包含约5％至约95％活性化合物(w/w)。可选择地，这样的制剂包含约20％至约80％活性化合物。
实验
缩写表：
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一般试验
在以下实施例中，化学试剂购自商业来源(诸如，Alfa、Acros、Sigma Aldrich、TCI和上海化学试剂公司)，并且不经进一步纯化而使用。快速色谱在Ez Purifier III上通过含有200-300目硅胶颗粒的柱进行。分析型和制备型薄层色谱板(TLC)为HSGF 254(0.15-0.2mm厚，Shanghai Anbang Company，China)。核磁共振(NMR)谱使用Brucker AMX-300或AMX-400NMR(Brucker，Switzerland)记录。化学位移以百万分之几(ppm，δ)eterO(ESI)报告，来自Waters LCT TOF质谱仪(Waters，USA)。HPLC色谱记录在Agilent1200液相色谱(Agilent，USA，柱：Ultimate 4.6m x 50mm，5M，流动相A：0.1％甲酸的水溶液；流动相B：乙腈)。微波反应在Initiator 2.5微波合成器(Biotage，Sweden)上进行。
本文所述试验中使用的HPLC条件如下：
方法1：
仪器：Shimadzu LC-2010AHT
柱：YMC-Triart C18，50×4.6mm，5μm
流动相：溶剂A：H2O/CH3OH/TFA＝90/10/0.1，
溶剂B：H2O/CH3OH/TFA＝90/10/0.1
流速：2.5mL/min；柱温：35℃；波长：220nm/254nm
方法2：
仪器：Shimadzu LC-2010AHT
柱：YMC-Triart C18，50×4.6mm，5μm
流动相：溶剂A：H2O/CH3OH/TFA＝90/10/0.1，
溶剂B：H2O/CH3OH/TFA＝90/10/0.1
流速：2.5mL/min；柱温：35℃；波长：220nm/254nm
本文所述试验中使用的制备型HPLC条件如下：
仪器：Waters 2545B/2767
柱：YMC-Triart C18，50×4.6mm，5μm
流动相：溶剂A：H2O(01.％FA)
溶剂B：CH3OH或CH3CN
流速：20mL/min；柱温：35℃；波长：220nm/254nm
实施例1.合成6-(3-甲氧基苄基)-2,4-二甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮.
步骤A.(Z)-2-叠氮基-3-(2-甲基噻唑-5-基)丙烯酸乙酯.向约-10℃到约-5℃的NaOEt(803mg，11.79mmol)的EtOH(10mL)溶液中逐滴添加2-甲基噻唑-5-甲醛(500mg，3.93mmol)和2-叠氮基乙酸乙酯(1.53g，11.79mmol)的无水EtOH(3mL)溶液。将反应混合物搅拌约1小时，同时将温度保持在0℃以下，随后温热至室温并再搅拌2小时。所得的混合物于0℃倒入饱和NH4Cl水溶液(50mL)，用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到所需产物(500mg)，其不经任何纯化直接用于下一步骤。LCMS:m/z 239(M+H)+.
步骤B.2-甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯.(Z)-2-叠氮基-3-(2-甲基噻唑-5-基)丙烯酸乙酯(500mg，2.1mmol)在邻二甲苯(5mL)中的混合物于140℃搅拌2小时，随后冷却至室温，随后通过硅胶柱色谱(洗脱剂：戊烷/EtOAc＝6/1)直接纯化，得到所需产物(220mg，49.8％产率)。LCMS:m/z 211(M+H)+.
步骤C.2,4-二甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯.在0℃下，向2-甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯(160mg，0.76mmol)的DMF(3mL)溶液中添加NaH(36.5mg，1.52mmol)。反应混合物于室温搅拌0.5小时，随后添加CH3I(47μL，0.76mmol)。所得的混合物于室温搅拌0.5小时，随后倒入0℃的饱和NH4Cl水溶液中，用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(洗脱剂：戊烷/乙酸乙酯＝6/1)纯化，得到所需产物(124mg，72.6％产率)。LCMS:m/z 225(M+H)+.
步骤D.6-甲酰基-2,4-二甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯.在0℃下，向2,4-二甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯(100mg，0.446mmol)在DMF(1mL)中的混合物中添加POCl3(122.5μL，1.338mmol)。反应混合物于100℃搅拌2小时，随后倒入0℃的饱和NaHCO3水溶液，用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(洗脱剂：戊烷/乙酸乙酯＝5/1)纯化，得到所需产物(57mg，50.7％产率)。LCMS:m/z 253(M+H)+.
步骤E.2,4-二甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮.向6-甲酰基-2,4-二甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯(57mg，0.226mmol)在2-乙氧基乙醇(2mL)中的混合物中添加N2H4.H2O(53.7μL，1.130mmol)。反应混合物于100℃搅拌1小时，随后倒入H2O中，用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(洗脱剂：戊烷/乙酸乙酯＝5/1)纯化，得到所需产物(49mg，98.4％产率)。LCMS:m/z 221(M+H)+.
步骤F.6-(3-甲氧基苄基)-2,4-二甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮.在0℃下，向2,4-二甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮(49mg，0.223mmol)在DMF(1mL)中的混合物中添加t-BuOK(50.8mg，0.454mmol)。反应混合物于室温搅拌0.5小时，随后添加1-(氯甲基)-3-甲氧基苯(34.9mg，0.223mmol)。所得的混合物于室温搅拌1小时，随后倒入0℃的饱和NH4Cl水溶液中，用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(洗脱剂：戊烷/乙酸乙酯＝3/1)纯化，得到所需产物。LCMS:m/z 341(M+H)+.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.56(s,1H)，7.23(t，1H)，6.92-6.72(m,3H)，5.32(s,2H)，4.26(s,3H)，3.72(s,3H)，2.85(s,3H)。
实施例1提供了化合物E1-3的示例性合成。应理解可使用合适的杂芳基-CH2-卤化物合成不同的化合物。
实施例2.使用方案2制备式E2-vii的化合物
方案E2
其中X是离去基团(例如，Cl、Br或I、OMs或OTs)；M是有机金属复合物(例如，有机硼复合物，如，硼酸或频哪醇硼复合物，有机锡复合物，诸如，-Sn(But)3；有机锌复合物，诸如，-Zn(卤素))；Q和R2各自独立地是任选取代的5-元或6-元杂芳基。类似于实施例1中式E1-v化合物的合成，化合物E2-iv可经过若干修饰由噻唑醛E2-i合成(例如，化合物E2-ii与MsCl反应，然后消除，得到化合物E2-iii；三环体系可用催化量的(cat.)AcOH在2-甲氧基乙醇中形成)。化合物E2-iv的取代和碘化提供了化合物E2-vi。化合物E2-vi与有机金属在催化剂存在下进行偶联得到了化合物E2-vii。
实施例2A.合成4-甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并-[2,3-d]哒嗪-5-酮
步骤A.2-叠氮基-3-羟基-3-(噻唑-5-基)丙酸乙酯.将钠(12.2g，0.531mol)于室温缓慢添加到干EtOH(300mL)的搅拌溶液中。反应混合物随后冷却至-20℃，随后逐滴添加2-叠氮基乙酸乙酯(68.5g，0.531mol)和噻唑-5-甲醛(20.0g，0.177mol)的无水EtOH(100mL)溶液，同时将温度保持在-20℃至-15℃。在添加之后，反应混合物于-20℃再搅拌1小时，随后倒入饱和NH4Cl水溶液(1L)中。所得的混合物用NaCl饱和，用EtOAc萃取。合并的有机相用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(使用洗脱剂：PE/EtOAc＝6/1至5/1至1/1)纯化，得到灰白色的所需产物(34g)。LCMS:m/z＝243(M+H)+.
步骤B.(Z)-2-叠氮基-3-(噻唑-5-基)丙烯酸乙酯.在-35℃下，向2-叠氮基-3-羟基-3-(噻唑-5-基)丙酸乙酯(103g，0.426mol)在干DCM(1.5L)的搅拌混合物中添加MsCl(146g，1.28mol)，随后逐滴添加TEA(301g，2.98mol)，同时将温度保持在-35℃至-30℃。在添加之后，反应混合物于-30℃再搅拌15min，随后倒入饱和的NH4Cl水溶液(1.5L)中。所得的混合物用NaCl饱和，用DCM萃取两次。合并的有机层依次用HCl水溶液(1M)和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(使用洗脱剂：PE/EtOAc＝5/1)纯化，得到所需产物(82.0g，86.3％产率)。LCMS:m/z＝225(M+H)+。
用于合成4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯、4-甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯和6-甲酰基-4-甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯的步骤C-E类似于实施例1中的方法。
步骤F.(E)-6-(亚肼基甲基)-4-甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯.在室温下，向N2H4.H2O(2.0g，98％，40mmol)在2-甲氧基乙醇(50mL)中的搅拌混合物中添加6-甲酰基-4-甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯(4.8g，20mmol)，随后添加20滴AcOH。反应混合物于室温搅拌约30分钟，直到混合物变透明。将所得的混合物边搅拌边倒入水(100mL)中，用DCM萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到所需产物，其不经进一步纯化用于下一步骤。LCMS:m/z＝253(M+H)+.
步骤G.4-甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮.在室温下，向(E)-6-(亚肼基甲基)-4-甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯(4.8g，0.19mol)在2-甲氧基乙醇(50mL)中的搅拌悬浮液中添加AcOH(20滴)。反应悬浮液于105℃搅拌3小时，随后过滤。滤饼用水洗涤并在高真空下干燥，得到第一批所需产物。滤液用水稀释，用DCM萃取两次。有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到第二批所需产物。合并的两批所需产物(2.5g)不经进一步纯化直接用于下一步骤。LCMS:m/z＝207(M+H)+.1HNMR(400MHz，DMSO)δ12.68(s,1H)，9.35(s,1H)，8.55(s,1H)，4.30(s,3H)
实施例3.合成化合物E3-vii和E3-viii
方案E3
其中Hal是卤素(例如Cl，Br或I)；LG是离去基团(例如Cl，Br，I，OMs或OTs)；Q是任选取代的5-元或6-元杂芳基；和Q'是进一步官能化的5-元或6-元杂芳基。用甲硫醇钠对化合物E3-i进行芳族取代反应提供了化合物E3-ii，其可使用化合物E1-iii到E1-vi的合成而被转化为化合物E3-v。用mCPBA氧化化合物E3-v分别得到了化合物E3-vi和E3-vii。
实施例3A.合成4-甲基-2-(甲硫基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮
步骤A：4-甲基-2-(甲硫基)-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯.向2-溴-4-甲基-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯(500.0mg，1.73mmol)在EtOH(10.0mL)中的混合物中添加NaSMe(240.0mg,3.5mmol)。反应混合物于25℃搅拌3小时，随后用冰水猝灭，用DCM萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到所需产物(460mg)，其不经任何纯化直接用于下一步骤。LC-MS:m/z 257(M+H)+.
步骤B：6-甲酰基-4-甲基-2-(甲硫基)-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯.向4-甲基-2-(甲硫基)-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯(460.0mg，1.8mmol)和N-甲基-N-苯甲酰胺(490mg,3.6mmol)的DCE(10mL)溶液中添加POCl3(550.0mg,3.6mmol)。所得的混合物于130℃搅拌3小时，随后用冰水猝灭，用DCM萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(洗脱剂：PE/EtOAc＝8/1)纯化，得到所需产物(320.0mg，63％产率)。LC-MS:m/z 285(M+H)+.
步骤C：4-甲基-2-(甲硫基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮.向6-甲酰基-4-甲基-2-(甲硫基)-4H-吡咯并[2,3-d]噻唑-5-甲酸乙酯(300.0mg，1.06mmol)的EtOH(5.0mL)溶液中添加N2H4.H2O(2mL，98％wt)。反应混合物于室温搅拌1小时，随后加热至60℃并保持过夜，随后冷却。通过过滤收集固体，在高真空下干燥，得到所需产物(180.0mg，67％产率)。LC-MS:m/z 253(M+H)+.1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.61(s,1H)，8.48(s,1H)，4.22(s,3H)，2.81(s,3H)。
实施例3B.合成6-((2-氨基吡啶-4-基)甲基)-4-甲基-2-(甲基亚磺酰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮
步骤A.2-溴-4-(溴甲基)吡啶.将2-溴-4-甲基吡啶(1g，5.81mmol)、NBS(1.1g，6.39mmol)和催化量的AIBN(100mg)在CCl4(10mL)中的混合物于80℃搅拌过夜。所得的混合物减压浓缩，残余物通过硅胶柱色谱(洗脱剂：PE/EtOAc＝200/1)纯化，得到所需产物E3-4(500mg，34.28％产率)。
步骤B.6-((2-溴吡啶-4-基)甲基)-4-甲基-2-(甲硫基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮.将4-甲基-2-(甲硫基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(100mg，0.40mmol)和K2CO3(164mg，1.19mmol)在DMF(8mL)中的混合物于60℃搅拌2小时，随后添加2-溴-4-(溴甲基)吡啶(199mg，0.80mmol)的DMF(2mL)溶液和催化量的TBAB(13mg)。混合物于60℃搅拌过夜，随后用水(20mL)猝灭，用EtOAc萃取。合并的有机层用饱和NH4Cl水溶液洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(洗脱剂：PE/EtOAc＝10/1)纯化，得到所需产物(150mg，89.62％产率)。LCMS:m/z 423(M+H)+.
步骤C.(4-((4-甲基-2-(甲硫基)-5-氧代-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯.将6-((2-溴吡啶-4-基)甲基)-4-甲基-2-(甲硫基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(100mg，0.24mmol)、氨基甲酸叔丁酯(83mg，0.71mmol)、K3PO4(201mg，0.95mmol)、Pd2(dba)3(18mg，0.02mmol)和Xantphos(4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽)(11mg，0.02mmol)在二氧六环(10mL)中的混合物在氮气下于100℃搅拌过夜。所得的混合物用水猝灭，用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(洗脱剂：PE/EtOAc＝3/1)纯化，得到所需产物(100mg，92.10％产率)。LCMS:m/z 459(M+H)+.
步骤D.(4-((4-甲基-2-(甲基亚磺酰基)-5-氧代-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯.在0℃下，向(4-((4-甲基-2-(甲硫基)-5-氧代-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(100mg，0.22mmol)在DCM(5mL)中的混合物中添加3-氯过氧苯甲酸(38mg，0.22mmol)。反应混合物于0℃搅拌1小时，随后用水猝灭，用DCM萃取。合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到所需产物(100mg，96.63％产率)，其不经任何纯化直接用于下一步骤。LCMS:m/z 475(M+H)+.
步骤E.6-((2-氨基吡啶-4-基)甲基)-4-甲基-2-(甲基亚磺酰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮.将(4-((4-甲基-2-(甲基亚磺酰基)-5-氧代-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(100mg，0.21mmol)在TFA(1mL)和DCM(3mL)中的混合物于室温搅拌1小时，随后减压浓缩。残余物通过制备型HPLC纯化，得到所需产物(20mg，25.35％产率)。LCMS:m/z 375(M+H)+。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.67(s,1H)，7.73(d,1H)，6.30(d,1H)，6.12(s,1H)，5.89(s,2H)，5.24-5.03(m,2H)，4.29(s,3H)，3.03(s,3H)。
使用合适的起始物，使用如上所述的方法制备以下化合物。当必要时，可使用标准的保护和脱保护。
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实施例3C.合成6-((2-氨基噻唑-5-基)甲基)-4-甲基-2-(甲基亚磺酰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮
步骤A-B.类似于实施例3B，合成2-溴-5-(溴甲基)噻唑和6-((2-溴噻唑-5-基)甲基)-4-甲基-2-(甲硫基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。
步骤C.6-((2-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)噻唑-5-基)甲基)-4-甲基-2-(甲硫基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮.将6-((2-溴噻唑-5-基)甲基)-4-甲基-2-(甲硫基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(130mg，0.30mmol)和DIPEA(0.1mL)在NMP(0.1mL)和(2,4-二甲氧基苯基)甲胺(0.1mL)中的混合物于150℃搅拌4小时。随后将反应混合物用水(10mL)猝灭，用EtOAc萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过硅胶柱色谱(用PE/EtOAc＝5/1洗脱)纯化，得到所需产物(60mg，38.4％产率)。LC-MS:m/z 515(M+H)+.
步骤D.6-((2-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)噻唑-5-基)甲基)-4-甲基-2-(甲基亚磺酰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮.在0℃下，向6-((2-((2,4-二甲氧基苄基)氨基)噻唑-5-基)甲基)-4-甲基-2-(甲硫基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(50mg，0.10mmol)在THF(3mL)中的混合物中添加单过硫酸氢钾(oxone)(61mg，0.10mmol)。混合物于0℃搅拌1小时，随后用饱和Na2S2O3水溶液(5mL)猝灭，用DCM萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到所需产物(30mg，50.1％产率)，其不经进一步纯化直接用于下一步骤。LC-MS:m/z 531(M+H)+.
步骤E.类似于实施例3B来合成6-((2-氨基噻唑-5-基)甲基)-4-甲基-2-(甲基亚磺酰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。LC-MS:m/z 381(M+H)+。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.70(s,1H)，6.97(s,1H)，6.87(s,2H)，5.28(s,2H)，4.29(s,3H)，3.11(s,3H)。
使用合适的起始物，使用如上所阐述的方法制备以下化合物。当必要时，可使用标准的保护和脱保护。
实施例4.合成6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-((1H-吡唑-5-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮
实施例4A.合成3-((苯磺酰基)甲基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑
步骤A.1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-甲酸甲酯于0℃，在氮气氛下，向搅拌下的1H-吡唑-3-甲酸甲酯(90g，0.72mol)的THF(1L)溶液中添加NaH(20.7g，0.864mol，60％)。所得的混合物缓慢温热至室温并搅拌1小时。反应混合物随后冷却至0℃，逐滴添加SEMCl(151.5mL，0.842mol)。继续再搅拌2小时，随后用饱和NH4Cl猝灭，用乙酸乙酯(3x)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥。真空去除溶剂以提供粗产物210g，其不经纯化用于下一步骤。
步骤B.(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲醇.于0℃，在氮气氛下，向LAH(16.9g，0.44mol)在THF(760mL)中的悬浮液中添加粗1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-甲酸甲酯(76g)。所得的混合物缓慢温热至室温，搅拌1小时。反应混合物冷却回0℃，依次添加H2O(15.6mL)、10％NaOH(15.6mL)、H2O(15.6mL)。所得的混合物通过硅藻土垫过滤，用MTBE(4x)洗涤。合并的有机级分经Na2SO4干燥。减压去除溶剂，以提供粗产物69.4g，其不经纯化用于下一步骤。LC-MS:m/z229(M+H)+.
步骤C.3-(碘甲基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑.于0℃，在氮气氛下，向搅拌下的(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲醇(61.5g，理论上为0.262mol)在THF(310mL)中的溶液中添加TEA(55.42mL，0.393mol)，随后添加MsCl(24mL，0.314mol)。反应温热至室温并搅拌1小时，随后引入NaI(196.5g，1.31mol，在310mL DMF中)。所得的混合物再搅拌1小时，用冰水猝灭，用MTBE(3x)萃取。合并的有机层用饱和Na2S2O3和盐水洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，以提供77.5g粗产物，用于下一步骤。LC-MS:m/z 339(M+H)+.
步骤D.3-((苯磺酰基)甲基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑.于0℃，在氮气氛下，向搅拌下的(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲醇(77.5g，理论上为0.229mol)在DMF(600mL)中的溶液中添加苯亚磺酸钠(53.5g，0.32mol)，并于0℃搅拌1小时。在温热到室温之后，反应混合物用冰水和饱和Na2S2O3猝灭，用乙酸乙酯(3x)萃取。合并的有机层依次用饱和NaHCO3和盐水洗涤，经Na2SO4干燥。真空去除溶剂，残余物通过快速色谱(硅胶，20％～70％乙酸乙酯的石油醚溶液)纯化，以提供56.7g，其是浅黄色的油。LCMS:[M+H]+353。1H NMR(400MHz，DMSO)δ7.85-7.77(m,4H)，7.62(dd，2H)，6.19(d,1H)，5.35(d,2H)，4.70(d,2H)，3.44-3.38(m,2H)，0.88-0.77(m,2H)，-0.01(s,9H)。
实施例4B.合成6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-((1H-吡唑-5-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮
步骤A.4-甲基-2-((苯磺酰基)(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。在-40℃下，向3-((苯磺酰基)甲基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑(1.8g，5.1mmol)的干THF(30mL)溶液中逐滴添加LiHMDS(7.5mL，7.5mmol)。混合物于室温搅拌30min，随后于室温添加4-甲基-2-(甲基亚磺酰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(580mg，2.7mmol)在干THF(30mL)中的悬浮液。混合物于室温再搅拌1小时，倒入冰冷却的饱和NH4Cl水溶液(20mL)中，用EtOAc(3 x 100mL)萃取。合并的有机层用水(60mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶，0～2.5％甲醇的二氯甲烷溶液)纯化，得到所需产物(800mg，66％)。LC-MS(ESI)实测值：557(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.78(s,1H)，8.65(s,1H)，8.03(d,1H)，7.84-7.78(m,3H)，7.67-7.59(m,2H)，6.94(s,1H)，6.72(d,1H)，5.48(d,2H)，4.29(s,3H)，3.56(dd，2H)，0.88(dd，2H)，0.00(s,9H)。
步骤B.4-甲基-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。在N2下，在冰浴下向4-甲基-2-((苯磺酰基)(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(0.8g，1.41mmol)在THF(5mL)和MeOH(10mL)中的混合物中逐滴添加SmI2(0.1M/THF，45mL)。在搅拌10min后，反应用饱和NH4Cl水溶液(50mL)猝灭，用EAOAc(50mL x 3)萃取。合并的有机层用水(60mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶，0～3％甲醇的二氯甲烷溶液)纯化，得到所需产物(310mg，51.0％)。LC-MS实测值：417(M+H)+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.31(s,1H)，7.60(d,1H)，6.39(d,1H)，5.49(s,2H)，4.58(s,2H)，4.43(s,3H)，3.62(t，2H)，0.95(t，2H)，0.0(s,9H)。
步骤C.3-((4-甲基-5-氧代-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁基酯。向4-甲基-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(30mg，0.07mmol)和K2CO3(25mg，0.18mmol)在DMF(5.0mL)中的混合物中充入氩气，于50℃搅拌1小时，随后添加3-(溴甲基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁基酯(37mg，0.14mmol)。在氩气下于50℃搅拌过夜之后，反应混合物冷却到室温，用饱和NH4Cl水溶液(20mL)猝灭，用EAOAC(30mL x 3)萃取。合并的有机层用水(40mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过制备型TLC(DCM：MeOH＝15：1)纯化，得到所需产物(15mg，35.0％)。LC-MS(ESI)实测值：597(M+H)+.
步骤D.6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-((1H-吡唑-5-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。向3-((4-甲基-5-氧代-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-5-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁基酯(15mg，0.025mmol)的DCM(5mL)溶液中添加TFA(1mL)。反应混合物于室温搅拌过夜，随后浓缩并通过制备型TLC(DCM：MeOH＝15：1)纯化，得到所需产物(5mg，50％)。LC-MS实测值：367(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.80(s,1H)，12.65(s,1H)，8.50(s,1H)，7.71(brs，1H)，7.60(brs，1H)，6.26(d,1H)，6.11(d,1H)，5.32(s,2H)，4.49(s,2H)，4.27(s,3H)。
实施例5.合成4-甲基-2-(甲基亚磺酰基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮
在室温下，向搅拌下的4-甲基-2-(甲硫基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮(1.01g，4.0mmol)在DCM(20mL)中的悬浮液中添加3-氯-过氧苯甲酸(benzoperoxoic acid)(0.77g，3.8mmol)。该混合物于室温搅拌2小时。随后混合物过滤，用EtOAc洗涤，用MeOH研磨。将固体真空干燥，得到4-甲基-2-(甲基亚磺酰基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮(600mg)。LCMS:m/z 269(M+H)+.1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.78(s,1H)，8.64(s,1H)，4.28(s,3H)，3.11(s,3H)。
实施例6.合成4-甲基-2-(甲磺酰基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮
在20℃下，向装有4-甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮(30g，0.119mol，1.0当量)的DCM(600mL)溶液的三颈烧瓶中分三次添加m-CPBA(61.5g，3当量)。混合物于30℃搅拌过夜，LC-MS表明起始物100％消耗，形成了20％E4-2和80％E6-1。混合物冷却至室温，添加另一部分m-CPBA(1.0当量)。反应混合物于30℃搅拌2小时，LC-MS表明E4-2(LCMS:m/z 269(M+H)+.)<8％。混合物冷却至室温并过滤。将滤饼悬浮在MeOH(500mL)中，于室温搅拌1小时。过滤收集固体，用乙酸乙酯洗涤，真空干燥，得到28g的5％E4-2和95％E6-1的混合物。将该混合物(28g)悬浮于DMSO(600mL)中，加热至120℃～130℃以形成澄清溶液。随后冷却至室温，固体沉淀。混合物过滤并干燥，以提供23g纯的E6-1，LCMS:m/z285(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.87(s,1H)，8.69(s,1H)，4.32(s,3H)，3.56(s,3H)。
实施例7.合成化合物E7-v和E7-viii
方案E7
化合物E7-i与化合物E4-2和/或化合物E6-1之间的亲核芳族取代得到了中间体E7-ii。还原化合物E7-ii的苯磺酰基基团得到了中间体E7-iii。使用E7-iv和化合物E7-iii，在碱(例如，K2CO3、K3PO4、t-BuOK或Cs2CO3)存在下进行标准烷基化反应得到了化合物E7-vi，其中Xa是离去基团，诸如，Cl、Br、I、OMs、OTs；Ar1和Ar2各自独立地是任选取代的5-元或6-元单环杂芳基。化合物E7-vi还可使用在甲苯中的氰基亚甲基三丁基膦烷由化合物E7-iii与E7-v的Mitsunobu反应合成。
实施例7A.合成4-甲基-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮
步骤A.4-甲基-2-((苯磺酰基)(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮在-40℃下，向3-((苯磺酰基)甲基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑(26g，78.86mmol，2.1当量)的无水THF(700mL)的溶液中添加LiHMDS(81.2mL，81.2mmol，1M的THF溶液，2.31当量)。将该反应温热到室温，搅拌1小时。随后在室温下，将4-甲基-2-(甲磺酰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(10g，35.17mmol，1当量)添加到混合物中。反应于室温再搅拌0.5小时。将该反应于0℃倒入到饱和氯化铵溶液(500mL)中，并用乙酸乙酯萃取两次。合并的有机层用水和盐水洗涤，干燥并浓缩，得到黄色残余物。残余物通过硅胶色谱(二氯甲烷：甲醇＝100：1至30：1)纯化，得到4-甲基-2-((苯磺酰基)(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(13g)。LC-MS ESI M/Z＝557(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO)δ12.81(s,1H)，8.65(s,1H)，8.03(d,1H)，7.84-7.78(m,3H)，7.66(t，2H)，6.94(s,1H)，6.72(d,1H)，5.50(d,2H)，4.29(s,3H)，3.56(dd，2H)，0.91(dd，2H)，0.02(s,9H)。
步骤B.4-甲基-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮。在室温下，向4-甲基-2-((苯磺酰基)(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(8g,14.37mmol,1当量)的THF(500mL)和MeOH(500mL)溶液中添加SmI2(503mL,50.29mmol,0.1M的THF溶液，3.5当量)。反应搅拌0.5小时，并浓缩。残余物通过硅胶色谱(石油醚：乙酸乙酯：甲醇＝75：25：0至20：20：1)纯化，得到4-甲基-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(4.3g)。LC-MS ESI M/Z＝417(M+H)+。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.31(s,1H)，7.60(d,1H)，7.28(s,1H)，6.39(d,1H)，5.49(s,2H)，4.58(s,2H)，4.43(s,3H)，3.62(t,2H)，0.95(t,2H)，0.0(s,9H)。
实施例7B.合成6-((1H-咪唑-2-基)甲基)-2-((1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮
步骤A.1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-2-甲醛：在N2下，将NaH样品用己烷(2 x 10mL)洗涤。向烧瓶中装入干DMF(20mL)，分小份添加1H-咪唑-2-甲醛(500mg，5.2mmol)。于室温搅拌1.5小时之后，逐滴添加SEMCl(864mg，5.2mmol)。反应混合物于室温搅拌30min。反应混合物倒入水中，用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，减压浓缩，得到粗1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-2-甲醛(800mg)。LCMS:227(M+H)+.
步骤B.(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-2-基)甲醇：在0℃下，向搅拌下的1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-2-甲醛(1.6g，7mmol)在THF(20mL)中的混合物中添加NaBH4(1.34g，35mmol)。反应混合物于室温搅拌30min。将反应混合物倒入到NH4Cl水溶液中，用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，减压浓缩，得到粗(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-2-基)甲醇(1.3g)。
步骤C.2-(氯甲基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑：在室温下，向搅拌下的(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-2-基)甲醇(400mg,1.75mmol)在DCM(20mL)中的混合物中添加NCS(466mg,3.5mmol)和PPh3(920mg,3.5mmol)。混合物于室温搅拌2小时。反应混合物倒入水中，用DCM萃取。混合物用水洗涤，有机层减压浓缩。残余物通过制备型TLC(PE：EtOAc＝1：1)纯化，得到2-(氯甲基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑。LCMS:247(M+H)+。在60℃下，在N2下，向搅拌下的4-甲基-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(50mg,0.12mmol)在干DMF(5mL)中的混合物中添加K2CO3(66mg,0.48mmol)。20分钟后，在60℃下，在N2下，添加在干DMF(2mL)中的化合物E7-2(60mg,0.24mmol)。混合物在N2下于60℃搅拌1.5小时。反应混合物冷却至室温，并用0.5N盐酸水溶液调节到pH＝5～6。随后混合物用EtOAc萃取，用水和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥，减压浓缩，并通过制备型TLC(PE：EtOAc＝1：1.5)纯化，得到4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(25mg)。LCMS:627(M+H)+。将4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(25mg,0.04mmol)在DCM/TFA(2mL/2mL)中的混合物于室温搅拌1小时。反应混合物浓缩。残余物通过制备型HPLC纯化，得到所需产物(1.3mg)。LCMS:367(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51(s,1H)，7.66(d,1H)，6.9(s,2H)，6.27(d,1H)，5.34(s,2H)，4.51(s,2H)，4.27(s,3H)。
根据方案E7和实施例7A-7B的方法，使用合适的起始物，合成以下化合物。当必要时使用标准保护和脱保护方法。
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实施例8.合成化合物E8-v、E8-vi和E8-viii
方案E8
可通过类似于实施例E7-iii至E7-vi的烷基化反应或Mitsunobu反应将化合物E8-i转化为中间体E8-ii(参见方案E8中的路线(i))。用mCPBA或单过硫酸氢钾氧化E8-ii生成化合物E8-v和/或E8-vi。还可通过先氧化然后进行烷基化或Mitsumobu反应，由E8-i生成E8-v和E8-vi的化合物(参见方案E8中的路线(ii))。其中Xa是离去基团(例如Cl、Br、I、OMs、OTs)；可通过与化合物E8-xi的亲核芳族取代反应使用碱诸如LiHMDS或t-BuOK，将化合物E8-v和/或E8-vi转化为中间体E8-vii。可使用在AcOH中的SmI2或Zn或者在AlCl3中的TES由化合物E8-vii合成化合物E8-viii。如本文所用，Ar1和Ar2各自独立地是任选取代的5-元或6-元杂芳基。
实施例8A.合成2-((1H-吡唑-3-基)甲基)-6-((6-氨基吡啶-2-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮和6-((6-氨基吡啶-2-基)甲基)-4-甲基-2-(1H-吡唑-3-羰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮
步骤A N-[(叔丁氧基)羰基]-N-[6-({4-甲烷磺酰基-7-甲基-9-氧代-3-硫杂5,7,10,11-四氮杂三环[6.4.0.0{2,6}]十二碳-1(8),2(6),4,11-四烯-10-基}甲基)吡啶-2-基]氨基甲酸叔丁基酯在N2下，在70℃下，将4-甲基-2-(甲磺酰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(7.5g，26.4mmol)和K3PO4(8.3g，39.3mmol)在无水MeCN(300mL)中的混合物搅拌1小时，随后添加N-[(叔丁氧基)羰基]-N-[6-(溴甲基)吡啶-2-基]氨基甲酸叔丁基酯(11.2g，29.0mmol)的MeCN(30mL)溶液。在N2下于70℃搅拌2.5小时之后，反应混合物用饱和NH4Cl猝灭，用EA(300mL X 3)萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，将有机相浓缩。粗产物通过快速色谱(硅胶，0～50％乙酸乙酯的石油醚溶液)纯化，得到N-[(叔丁氧基)羰基]-N-[6-({4-甲烷磺酰基-7-甲基-9-氧代-3硫杂-5,7,10,11-四氮杂三环[6.4.0.0{2,6}]十二碳-1(8),2(6),4,11-四烯-10-基}甲基)吡啶-2-基]氨基甲酸叔丁基酯(5.5g)。LC-MS(ESI)实测值：591.1(M+H)+.
步骤B.(6-((4-甲基-5-氧代-2-((苯磺酰基)(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁基酯.在-40℃下，在氩气下，向搅拌下的3-((苯磺酰基)甲基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑(11.9g，33.8mmol)在无水THF(200mL)中的混合物中添加LiHMDS(50mL，1M的THF溶液)。10min后，混合物温热至10℃并搅拌1小时，随后添加N-[(叔丁氧基)羰基]-N-[6-({4-甲烷磺酰基-7-甲基-9-氧代-3-硫杂-5,7,10,11-四氮杂三环[6.4.0.0{2,6}]十二碳-1(8),2(6),4,11-四烯-10-基}甲基)吡啶-2-基]氨基甲酸叔丁基酯(9.1g，15.4mmol，在35mL THF中)。反应于10℃再搅拌30min。反应混合物倒入NH4Cl水溶液中，用EtOAc(200mL X 3)萃取。合并的有机层用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。粗产物通过快速色谱(硅胶，0～50％乙酸乙酯的石油醚溶液)纯化，得到(6-((4-甲基-5-氧代-2-((苯磺酰基)(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁基酯(6.6g)。LC-MS(ESI)实测值：763.2(M+H)+.
步骤C.(6-((4-甲基-5-氧代-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁基酯将(6-((4-甲基-5-氧代-2-((苯磺酰基)(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁基酯(6.0g，7.86mmol)的EtOH/AcOH(35mL/50mL)溶液加热至50℃，并在Zn(2.55g，117.9mmol)存在下剧烈搅拌40min。每40min添加额外的锌(2.55g，两次,通过TLC/LC-MS监控反应以避免副产品和过度还原产物)。溶液过滤，滤饼用DCM洗涤。滤液部分蒸发，用饱和NaHCO3溶液中和，经MgSO4干燥，真空去除溶剂。粗产物通过快速色谱(硅胶，DCM：MeOH＝40：1)纯化，得到(6-((4-甲基-5-氧代-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁基酯(3.1g)。LC-MS(ESI)实测值：623.3(M+H)+.
步骤D.2-((1H-吡唑-3-基)甲基)-6-((6-氨基吡啶-2-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮向(6-((4-甲基-5-氧代-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁基酯(3.0g，4.8mmol)在乙醇(30mL)中的混合物中添加HCl(30mL，4M的二氧六环溶液)。反应混合物于80℃搅拌40min。反应混合物冷却到室温，过滤，收集固体，悬浮在水中，并于10℃用NaHCO3水溶液中和。过滤，得到所需的化合物2-((1H-吡唑-3-基)甲基)-6-((6-氨基吡啶-2-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(1.5g)。LC-MS(ESI)实测值：393.2(M+H)+。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.78(s,1H)，8.53(s,1H)，7.72(s,1H)，7.25(dd，1H)，6.33-6.24(m,2H)，6.08(d,1H)，5.90(s,2H)，5.19(s,2H)，4.49(s,2H)，4.26(s,3H)。
步骤E.合成(6-((4-甲基-5-氧代-2-(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-羰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁基酯向(6-((4-甲基-5-氧代-2-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁基酯(100mg，0.16mmol)的DMF(2mL)溶液中添加K2CO3(88mg，0.64mmol)。混合物于70℃搅拌8小时。混合物倒入水中，过滤收集沉淀，并通过制备型TLC(2％MeOH的DCM溶液)纯化，得到(6-((4-甲基-5-氧代-2-(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-羰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁基酯(20mg)。LC-MS(ESI)：m/z 637(M+H)+.
步骤F.合成6-((6-氨基吡啶-2-基)甲基)-4-甲基-2-(1H-吡唑-3-羰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮向(6-((4-甲基-5-氧代-2-(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-羰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6(5H)-基)甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁基酯(20mg，0.03mmol)的EtOH(1mL)溶液中添加HCl(1mL，4mol/L在二氧六环中)。混合物于80℃搅拌1小时并冷却。过滤收集沉淀，并用饱和NaHCO3中和，用水洗涤并干燥，得到5mg 6-((6-氨基吡啶-2-基)甲基)-4-甲基-2-(1H-吡唑-3-羰基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。LC-MS(ESI)：m/z 407(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ：8.75(s,1H)，7.96(s,1H)，7.50(s,1H)，7.31-7.22(m,1H)，6.31(d,1H)，6.14(d,1H)，5.91(s,2H)，5.23(s,2H)，4.38(s,3H)。
实施例8B.合成6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-((6-(二甲基氨基)吡啶-2-基)甲基)-4-甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮
步骤A.(6-(二甲基氨基)吡啶-2-基)甲醇。向(6-氯吡啶-2-基)甲醇(500mg，2.67mmol)在二甲胺的THF溶液(35mL)中的溶液中添加Pd(OAc)2(78mg，0.35mmol)、Xantphos(4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽)(170mg，0.29mmol)和t-BuONa(385mg，4.01mmol)。反应混合物于100℃搅拌18小时。反应混合物过滤并减压浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶，0～35％乙酸乙酯的石油醚溶液)纯化，得到(6-(二甲基氨基)吡啶-2-基)甲醇(180mg)。LCMS:153(M+H)+.
步骤B.6-(氯甲基)-N,N-二甲基吡啶-2-胺。在0℃下，向搅拌下的(6-(二甲基氨基)吡啶-2-基)甲醇(170mg，1.1mmol)在DCM(10mL)中的混合物中添加SOCl2(665mg，5.6mmol)。反应混合物于室温搅拌1小时。反应混合物用NaHCO3水溶液调节到pH＝7～8。随后混合物用DCM萃取，用水和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥，减压浓缩，得到6-(氯甲基)-N,N-二甲基吡啶-2-胺(70mg)。LCMS:171(M+H)+.
步骤C.N,N-二甲基-6-((苯磺酰基)甲基)吡啶-2-胺。在室温下，向搅拌下的6-(氯甲基)-N,N-二甲基吡啶-2-胺(500mg，2.94mmol)在DMSO(10mL)中的混合物中添加PhSO2Na(1.44g，8.82mmol)。混合物于室温搅拌18小时。反应混合物倒入水中，用DCM萃取。混合物用水洗涤和有机层减压浓缩。残余物通过快速色谱纯化(硅胶，0～20％乙酸乙酯的石油醚溶液)，得到N,N-二甲基-6-((苯磺酰基)甲基)吡啶-2-胺(380mg)。LCMS:277(M+H)+.
步骤D.2-((6-(二甲基氨基)吡啶-2-基)(苯磺酰基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。在N2下，在60℃下，向搅拌下的4-甲基-2-(甲磺酰基)-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(180mg，0.36mmol)(其合成类似于实施例8A中的化合物E8-1)在干THF(10mL)中的混合物中添加N,N-二甲基-6-((苯磺酰基)甲基)吡啶-2-胺(120mg，0.44mmol)和t-BuOK(122mg，1.1mmol)。混合物在N2下于60℃搅拌2小时。随后混合物倒入水中，用EtOAc萃取，用水和盐水洗涤。有机层经Na2SO4干燥，减压浓缩，并通过制备型TLC(PE：EtOAc＝1：1.5)纯化，得到2-((6-(二甲基氨基)吡啶-2-基)(苯磺酰基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(50mg)。LCMS:691(M+H)+.
步骤E.2-((6-(二甲基氨基)吡啶-2-基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。在室温下，在N2下，向2-((6-(二甲基氨基)吡啶-2-基)(苯磺酰基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(50mg，0.07mmol)在THF(5mL)和MeOH(5mL)中的混合物中添加-40℃的SmI2(5mL，0.1M的THF溶液)。反应混合物于-40℃搅拌10min，随后用水猝灭。随后的混合物用EtOAc萃取两次。合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。残余物通过制备型TLC(PE/EtOAc＝1/1.5)纯化，得到所需产物(10mg)。LCMS:m/z 551(M+H)+.
步骤F.6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-((6-(二甲基氨基)吡啶-2-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。将2-((6-(二甲基氨基)吡啶-2-基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(10mg，0.018mmol)在DCM/TFA(2mL/2mL)中的混合物于室温搅拌1小时。反应混合物浓缩。残余物通过制备型HPLC纯化，得到所需产物(1.4mg)。LCMS:421(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO)δ8.51(s,1H)，7.55(s,1H)，7.48(dd，1H)，6.64(d,1H)，6.54(d,1H)，6.11(d,1H)，5.32(s,2H)，4.44(s,2H)，4.26(s,3H)，3.05(s,6H)。
根据方案E8和实施例8C，使用合适的起始物合成以下化合物。当必要时，可使用标准保护和脱保护。
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实施例9.合成化合物E9-vi和E9-vii
方案E9
可通过方案9的两种方法(i)和(ii)合成化合物E9-iv。对于方法(i)，可通过如实施例7或实施例8所示的烷基化反应由化合物E9-i合成化合物E9-ii。如本文所用，Xa是离去基团。化合物E9-ii与LiHMDS和DMF的甲酰化反应提供了中间体E9-iii。E9-iii与还原剂(例如，NaBH4)反应以提供化合物E9-iv。可选择地，在方法(ii)中，卤化化合物E9-i生成了化合物E9-ix。化合物E9-ix经历Stille反应、臭氧分解和还原以修饰化合物E9-x。化合物E9-x可用E9-viii烷基化以提供化合物E9-iv。在方案9(iii)中，化合物E9-iv经历卤化，得到中间体E9-v(Xb是卤素，诸如，Cl或Br)。E9-v与有机锡、硼、锌或镁的金属(例如，Pd或Cu)催化偶联提供了化合物E9-vi。如本文所用，M是有机金属复合物(例如，有机硼复合物，诸如，硼酸或频哪醇硼复合物；有机锡复合物，诸如，-SN(But)3；有机锌复合物，诸如，-Zn(卤素))；化合物E9-v还可与一些亲核试剂(诸如，杂环中的氮)反应，得到产物E9-vii。如本文所用，Ar1和Ar2各自独立地是任选取代的5-元或6-元杂芳基、Xa是离去基团(例如，Br，I，OMs或OTs)；和Xb是卤素。
实施例9A.合成6-((1H-吲唑-4-基)甲基)-4-甲基-2-(噻唑-4-基甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮
步骤A.合成4-甲基-5-氧代-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吲唑-4-基)甲基)-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-甲醛。在-78℃下，向4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吲唑-4-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(2.6g,5.57mmol,1当量)在干THF(30mL)中的混合物中添加LiHMDS(1M,11.14mL,2.0当量)。混合物于-78℃搅拌2小时。随后将DMF(2.04g,27.86mmol,2.14mL,5.0当量)逐滴添加至上述混合物。混合物于-78℃搅拌2小时。TLC(PE：EA＝2：1,UV＝254nm)显示形成一个新的主要斑点。混合物倒入冷的饱和NH4Cl(20mL)中。随后混合物温热至室温。混合物用EtOAc(40mL x 3)萃取。有机层用水(20mL x3)洗涤并真空浓缩，得到所需产物(2.6g，粗品)。LCMS:m/z 495.2[M+H]+
步骤B.合成2-(羟甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吲唑-4-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。向粗的4-甲基-5-氧代-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吲唑-4-基)甲基)-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-甲醛(1.0g，2.02mmol，1当量)在THF(10mL)和MeOH(10mL)中的混合物中添加NaBH4(152.97mg，4.04mmol，2当量)。混合物于30℃搅拌14小时。TLC(DCM：MeOH＝10：1，UV＝254nm)表明起始物完全消耗并形成一个新的主要斑点。反应通过加入水(20mL)猝灭，用EtOAc(30mL x 3)萃取。合并的有机层用盐水(20mL)洗涤。有机相真空浓缩。残余物通过快速硅胶色谱(40g/>硅胶快速柱，洗脱剂0～5％MeOH/DCM@30mL/min)纯化。洗脱剂真空浓缩，得到所需产物(382mg)。LCMS:m/z 497.1[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.61(s,1H)，8.25(s,1H)，7.66(d,1H)，7.38(t，1H)，7.05(d,1H)，6.36(t，1H)，5.74(s,2H)，5.68(s,2H)，4.89(d,2H)，4.26(s,3H)，3.50(t，2H)，0.78(t，2H)，-0.12(s,9H)。
步骤C.合成2-(氯甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吲唑-4-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。向2-(羟甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吲唑-4-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(150.0mg，302.02μmol，1当量)和Et3N(61.12mg，604.04μmol，84.08μL，2.0当量)在DCM(5mL)中的混合物中添加4-甲基苯磺酰氯(75.0mg，393.40μmol，1.30当量)。混合物于30℃搅拌5小时。TLC(PE：EA＝4：1，UV＝254nm)表明起始物完全消耗。将水(10mL)和DCM(20mL)添加到混合物中。有机层真空浓缩，得到黄色胶状物(0.1g)。残余物通过快速硅胶色谱(4g/>硅胶快速柱，洗脱剂0～20％乙酸乙酯的石油醚梯度溶液@30mL/min)纯化。所需级分真空浓缩，得到所需产物(40.0mg，76.88μmol)。LCMS:m/z 515.1[M+H]+。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 8.27(d,1H)，8.26(s,1H)，7.52(d,1H)，7.39(dd，1H)，7.25(s,1H)，5.76(s,2H)，5.72(s,2H)，4.96(s,2H)，4.40(s,3H)，3.50-3.57(m,2H)，0.84-0.90(m,2H)，-0.09至-0.06(m,9H)。
步骤D.合成4-甲基-2-(噻唑-4-基甲基)-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吲唑-4-基)甲基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮。向2-(氯甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吲唑-4-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(50mg，0.97mmol)和4-(三丁基甲锡烷基)噻唑(114mg，2.91mmol)的甲苯(4mL)溶液中添加Pd(PPh3)4(402mg，2.91mmol)。随后将混合物在MW反应器中在N2下于120℃加热30min。溶液倒入水中，用EtOAc萃取，经无水Na2SO4干燥。有机层减压浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶，0～50％乙酸乙酯的石油醚溶液)纯化，得到4-甲基-2-(噻唑-4-基甲基)-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吲唑-4-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(30mg)。LCMS:564(M+H)+。、
步骤E.合成6-((1H-吲唑-4-基)甲基)-4-甲基-2-(噻唑-4-基甲基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮.在室温下，在N2下，向化合物E9-4(30mg，0.05mmol)在DCM(3mL)中的混合物中添加TFA(3mL)。反应混合物于室温搅拌1小时。混合物减压浓缩。残余物通过制备型HPLC(C18，0～90％乙腈的H2O溶液，含有0.1％甲酸)纯化，得到所需产物(3.9mg)。LCMS:434(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO)δ13.12(s,1H)，9.12(d,1H)，8.56(s,1H)，8.14(s,1H)，7.71(d,1H)，7.45(d,1H)，7.35-7.24(m,1H)，6.96(d,1H)，5.65(s,2H)，4.70(s,2H)，4.27(s,3H)。
实施例9B.合成4-甲基-2-(吡啶-2-基甲基)-6-(吡啶-3-基甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮
步骤A.合成2-(羟甲基)-4-甲基-6-(吡啶-3-基甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮于-78℃，向4-甲基-6-(吡啶-3-基甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(640mg，2.15mmol)在THF(10mL)中的混合物中添加LiHMDS(4.3mL，1M的THF溶液)。在30min后，将干DMF(0.84mL，10.8mmol)添加到混合物。在起始物完全消耗之后，添加NaBH4(164mg，4.3mmol)在EtOH(4mL)中的混合物，并搅拌5min。随后混合物倒入饱和NH4Cl中，用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶，0～5％MeOH的DCM溶液)纯化，得到2-(羟甲基)-4-甲基-6-(吡啶-3-基甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(220mg)。LC-MS(ESI)：m/z 328(M+H)+.
步骤B.合成2-(氯甲基)-4-甲基-6-(吡啶-3-基甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮向2-(羟甲基)-4-甲基-6-(吡啶-3-基甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(100mg，0.31mmol)在DCM(5mL)中的混合物中添加Et3N(0.43mL，3.1mmol)和MsCl(0.12mL，1.5mmol)。反应于室温搅拌6小时。随后混合物用饱和NH4Cl(水溶液)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶，0～50％EtOAc的PE溶液)纯化，得到65mg的2-(氯甲基)-4-甲基-6-(吡啶-3-基甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。LC-MS(ESI)：m/z 346(M+H)+.
步骤C.合成4-甲基-2-(吡啶-2-基甲基)-6-(吡啶-3-基甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮在氮气下，向2-(氯甲基)-4-甲基-6-(吡啶-3-基甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(50mg，0.14mmol)和2-(三丁基甲锡烷基)吡啶(0.14mL，0.43mmol)在甲苯(3mL)中的混合物中添加Pd(PPh3)4(17mg，0.014mmol)。反应混合物于100℃搅拌过夜。随后混合物冷却，减压浓缩。残余物通过制备型TLC(洗脱剂：10％MeOH的DCM溶液)纯化，得到2mg 4-甲基-2-(吡啶-2-基甲基)-6-(吡啶-3-基甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。LC-MS(ESI)：m/z 389(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.56(m,3H)，8.48(dd，1H)，7.81(td，1H)，7.71(d,1H)，7.50(d,1H)，7.37-7.30(m,2H)，5.38(s,2H)，4.67(s,2H)，4.25(s,3H)。
实施例9C.合成2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮和6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-((4H-1,2,4-三唑-4-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮
步骤A.合成1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-甲醛。在-40℃下，向1H-吡唑-3-甲醛(10.0g，104.07mmol，1当量)和DIPEA(33.63g，260.18mmol，45.32mL，2.5当量)在DCM(500mL)中的悬浮液中逐滴添加2-(氯甲氧基)乙基-三甲基-甲硅烷(26.03g，156.11mmol，27.63mL，1.5当量)。随后反应混合物温热至室温，并搅拌16小时。TLC(石油醚：EtOAc＝5：1)表明起始物完全消耗，并形成两个新的斑点。反应混合物真空浓缩。残余物与另两个批次(各10.0g)合并，通过Combiflash(由100％石油醚至40％EtOAc的石油醚溶液)纯化，得到所需产物60.0g。(注：两种位置异构体的混合物，比率为约5/4)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 10.06(s,1H)，10.00(s,1H)，7.68(d,1H)，7.67(d,1H)，7.03(d,1H)，6.92(d,1H)，5.87(s,2H)，5.56(s,2H)，3.61-3.67(m,4H)，0.91-1.01(m,4H)，-0.09-0.05(m,18H)。
步骤B.合成(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲醇。在0℃下，向1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-甲醛(30g，132.54mmol，1当量，2种位置异构体的混合物，比率为约5/4)的THF(200mL)/MeOH(100mL)溶液中分批添加NaBH4(7.52g，198.81mmol，1.50当量)，反应混合物于0℃至室温搅拌18小时。TLC(石油醚：EtOAc＝2：1)表明起始物完全消耗，并且形成两个新的斑点。将溶剂真空浓缩。残余物通过Combiflash(100％石油醚至100％EtOAc)纯化，得到25g所需产物。(注：两种位置异构体的混合物，比率为约3/2)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm7.55(d,1H)，7.47(brs，1H)，6.36(d,1H)，6.34(d,1H)，5.57(s,2H)，5.42(s,2H)，4.74-4.76(m,4H)，3.55-3.60(m,4H)，0.85-0.96(m,4H)，0.00-0.06(m,18H)。
步骤C.合成3-(溴甲基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑。在0℃下，向(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲醇(23g，100.72mmol，1当量，两种位置异构体的混合物，比率为约3/2)和PPh3(36.98g，141.00mmol，1.4当量)的DCM(200mL)溶液中添加CBr4(46.76g，141.00mmol，1.4当量)。反应混合物于0℃搅拌3小时。TLC(石油醚：EtOAc＝5：1)表明起始物完全消耗，并且形成一个新的斑点。反应混合物真空浓缩。残余物与另一批次(2.0g)合并，并且通过Combiflash(由100％石油醚至50％EtOAc的石油醚溶液)纯化，得到所需产物22.0g(75.53mmol)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 7.51(d,1H)，6.39(d,1H)，5.38(s,2H)，4.50(s,2H)，3.52-3.57(m,2H)，0.86-0.96(m,2H)，-0.03-0.02(m,9H)。
步骤D.合成4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮.将4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(1.0g，4.85mmol，1当量)、3-(溴甲基)-1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑(2.12g，7.27mmol，1.5当量)、K3PO4(2.57g，12.12mmol，2.5当量)和NaI(218.05mg，1.45mmol，0.3当量)在DMF(15mL)中的悬浮液于60℃在N2下搅拌18小时。TLC(石油醚：EtOAc＝1：1)表明起始物完全消耗，并且形成一个新的斑点。反应混合物与另外3个批次(各1.0g)合并，倒入冰水(250mL)中。混合物用EtOAc(150mL x 3)萃取。合并的有机层用水(120mL x 2)、盐水(120mL)洗涤，并经Na2SO4干燥。将溶剂真空浓缩。粗产物通过Combiflash(由100％石油醚至80％EtOA的石油醚溶液)纯化，得到所需产物(3.6g)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 8.91(s,1H)，8.27(s,1H)，7.49(d,1H)，6.36(d,1H)，5.51(s,2H)，5.40(m,2H)，4.45(s,3H)，3.52-3.58(m,2H)，0.85-0.90(m,2H)，-0.05(s,9H)。
步骤E.合成4-甲基-5-氧代-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-甲醛。在氩气下，在-78℃下，向4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(1.7g，4.09mmol，1当量)的THF(30mL)溶液中缓慢添加LiHMDS(1.0M，8.18mL，2当量)，反应混合物于-70℃搅拌1小时。随后将DMF(1.49g，20.45mmol，1.57mL，5当量)的THF(3mL)溶液逐滴添加至混合物。所得的混合物于-70℃搅拌1小时。TLC(石油醚：EtOAc＝1：1)表明形成一个新的斑点。反应混合物于0℃逐滴添加到NH4Cl水溶液(50mL)中，随后混合物用EtOAc(30mL x 3)萃取。合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，并经Na2SO4干燥。真空去除溶剂，得到所需产物粗品(1.8g)，其不经进一步纯化用于下一步骤。
步骤F.合成2-(羟甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。在0℃下，向4-甲基-5-氧代-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-甲醛(1.8g，3.24mmol，1当量)的THF(20mL)/MeOH(10mL)溶液中添加NaBH4(245.08mg，6.48mmol，2当量)，反应混合物于室温搅拌18小时。TLC(石油醚：EtOAc＝1：2)表明起始物完全消耗，并且形成一个新的斑点。反应混合物真空浓缩，残余物通过Combiflash(由100％DCM至5％MeOH的DCM溶液)纯化。获得所需产物(1.1g)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 8.63(s,1H)，7.86(d,1H)，6.44(t，1H)，6.27(d,1H)，5.40-5.42(m,4H)，4.98(d,2H)，4.34(s,3H)，3.55-3.61(m,2H)，0.86-0.91(m,2H)，0.00(s,9H)。
步骤G.合成(4-甲基-5-氧代-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-基)甲基甲磺酸酯。在0℃下，向2-(羟甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(700mg，1.57mmol，1当量)和Et3N(317.21mg，3.13mmol，436.33μL，2.0当量)的DCM(15mL)溶液中逐滴添加MsCl(269.32mg，2.35mmol，181.97μL，1.5当量)，反应混合物于室温搅拌1小时。TLC(石油醚：EtOAc＝1：1)表明起始物完全消耗，并且形成一个新的斑点。反应混合物用EtOAc(80mL)稀释，并用水(30mL x 4)、盐水(40mL)洗涤，经Na2SO4干燥。真空去除溶剂，得到粗产物(700mg)。LCMS:(m/z)525.5(M+H)。
步骤H.合成2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮和2-((4H-1,2,4-三唑-4-基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。在60℃下，在N2下，将(4-甲基-5-氧代-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-基)甲基甲磺酸酯(150mg，285.88μmol，1当量)、1H-1,2,4-三唑(197.45mg，2.86mmol，10当量)和CsF(86.85mg，571.77μmol，21.08μL，2当量)在MeCN(8mL)中的混合物搅拌18小时。LCMS显示起始物完全消耗，并且形成两个新的峰。反应混合物真空浓缩，残余物通过Combiflash(由100％DCM至8％MeOH的DCM溶液)纯化。获得产物2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(55mg)和2-((4H-1,2,4-三唑-4-基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(30mg)。
步骤I.合成2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。向2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(55mg，110.52μmol，1当量)和HCl/二氧六环(4M，1mL，36.19当量)在DCM(3mL)中的悬浮液中添加H2O(1.99mg，110.52μmol，0.05mL，1当量)，反应混合物于室温搅拌18小时。LCMS显示起始物完全消耗，并发现84％的所需产物。反应混合物真空浓缩，残余物通过制备型HPLC纯化，得到所需产物(24.1mg，65.60μmol，59.35％产率)。柱：Xtimate C18 150*25mm*5um，流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：13％-43％，11.2min。LCMS:m/z 367.9(M+H)+1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 8.72(s,1H)，8.35(s,1H)，8.05(s,1H)，7.52(brs，1H)，6.26(d,1H)，5.92(s,2H)，5.43(s,2H)，4.30(s,3H)。
步骤J.合成6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-((4H-1,2,4-三唑-4-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。向2-((4H-1,2,4-三唑-4-基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(30mg，60.28μmol，1当量)和HCl/二氧六环(4M，1mL，66.35当量)在DCM(3mL)中的悬浮液中添加H2O(50.00mg，2.78mmol，0.05mL，46.04当量)，反应混合物于室温搅拌18小时。LCMS显示起始物完全消耗，发现所需产物。反应混合物真空浓缩，残余物通过制备型HPLC纯化，得到所需产物(2.1mg，5.72μmol)。柱：XtimateC18 150*25mm*5um；流动相：[水(0.225％FA)-ACN]；B％：13％-43％,11.2min。LCMS:m/z368.0(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 8.74(s,2H)，8.38(s,1H)，7.52(d,1H)，6.26(d,1H)，5.84(s,2H)，5.44(s,2H)，4.31(s,3H)。
根据方案E9和实施例9A-9B的方法，使用合适的起始物，合成以下化合物。在必要时，使用标准保护和脱保护。
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实施例9D合成2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-6-((2-氨基嘧啶-4-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮
步骤A.合成2-氯-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。在-65℃下，向4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(3g，14.5mmol)在干THF(80mL)中的混合物中逐滴添加LiHMDS(30.5mL，)。在搅拌1小时之后，添加六氯乙烷(1.8mL，16mmol)的干THF(20mL)溶液。反应混合物在3小时之内升温到-20℃。随后混合物用饱和NH4Cl猝灭，并于室温搅拌20min。过滤收集沉淀，用EtOAc洗涤，得到3.5g2-氯-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。LC-MS(ESI)：m/z 241(M+H)+.
步骤B.合成4-甲基-2-乙烯基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。在氮气下，向2-氯-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(1.5g，6.2mmol)和三丁基(乙烯基)锡烷(5.5mL,18.7mmol)在DMF(30mL)中的混合物中添加Pd(PPh3)4(0.36g，0.31mmol)。反应混合物于100℃搅拌2小时。随后混合物冷却并用EtOAc稀释，用水和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶，0～10％MeOH的DCM溶液)纯化，得到1.4g 4-甲基-2-乙烯基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。LC-MS(ESI)：m/z 233(M+H)+.
步骤C.合成4-甲基-5-氧代-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-甲醛。在-60℃下，将4-甲基-2-乙烯基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(500mg，2.15mmol)在DCM/MeCN(500mL，1：1体积)中的混合物用O3吹扫20min。随后反应用二甲基硫烷(dimethylsolfane)猝灭并浓缩，得到500mg 4-甲基-5-氧代-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-甲醛。LC-MS(ESI)：m/z 235(M+H)+.
步骤D.合成2-(羟甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。在0℃下，向4-甲基-5-氧代-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-甲醛(500mg，2.13mmol)在EtOH(3mL)中的混合物中添加NaBH4(81mg，2.13mmol)。反应于室温搅拌5min。随后混合物倒入饱和NH4Cl，用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，并浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶，0～8％MeOH的DCM溶液)纯化，得到120mg2-(羟甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。LC-MS(ESI)：m/z237(M+H)+.
步骤E.合成6-((2-氯嘧啶-4-基)甲基)-2-(羟甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。向2-(羟甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(200mg，0.85mmol)在DMF(8mL)中的混合物中添加K2CO3(351mg，2.54mmol)。于60℃搅拌30min之后，添加2-氯-4-(氯甲基)嘧啶(276mg，1.7mmol)的DMF(2mL)溶液。将反应混合物再搅拌4小时，倒入饱和NH4Cl中，用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，并浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶，0～8％MeOH的DCM溶液)纯化，得到160mg 6-((2-氯嘧啶-4-基)甲基)-2-(羟甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。LC-MS(ESI)：m/z 363(M+H)+.
步骤F.合成6-((2-(双(2,4-二甲氧基苄基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-2-(羟甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。向6-((2-氯嘧啶-4-基)甲基)-2-(羟甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(160mg，0.44mmol)在MeCN(5mL)中的混合物中添加双(2,4-二甲氧基苄基)胺(280mg，0.88mmol)和AcOH(1滴)。反应混合物于80℃搅拌过夜。蒸发反应混合物，残余物通过制备型TLC(洗脱剂：5％MeOH的DCM溶液)纯化，得到75mg 6-((2-(双(2,4-二甲氧基苄基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-2-(羟甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。LC-MS(ESI)：m/z 644(M+H)+.
步骤G.合成6-((2-(双(2,4-二甲氧基苄基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-2-(氯甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。在0℃下，向6-((2-(双(2,4-二甲氧基苄基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-2-(羟甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(75mg，0.12mmol)的DCM(5mL)溶液中添加Et3N(0.16mL，1.16mmol)和MsCl(0.05mL，0.58mmol)。混合物于室温搅拌过夜。反应混合物用DCM稀释，用饱和NH4Cl和盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，并浓缩，得到70mg 6-((2-(双(2,4-二甲氧基苄基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-2-(氯甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮粗产物。LC-MS(ESI)：m/z 662(M+H)+.
步骤H.合成2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-6-((2-(双(2,4-二甲氧基苄基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮将4H-1,2,4-三唑(39mg，0.57mmol)和K2CO3(78mg，0.57mmol)在DMF(3mL)中的混合物于60℃搅拌30min。添加6-((2-(双(2,4-二甲氧基苄基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-2-(氯甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(75mg，0.11mmol)并再搅拌30min。悬浮液倒入饱和NH4Cl，用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。残余物通过快速色谱(硅胶，0～10％DCM的MeOH溶液)纯化，得到60mg 2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-6-((2-(双(2,4-二甲氧基苄基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。LC-MS(ESI)：m/z 695(M+H)+.
步骤G.合成2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-6-((2-氨基嘧啶-4-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮向2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-6-((2-(双(2,4-二甲氧基苄基)氨基)嘧啶-4-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(30mg，0.043mmol)在EtOH(2mL)中的混合物中添加HCl(0.5mL，4M的二氧六环溶液)。反应混合物于80℃搅拌过夜。随后混合物冷却，倒入饱和NaHCO3，用EtOAc萃取。有机层用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥并浓缩。残余物通过制备型HPLC纯化，得到8mg 2-((1H-1,2,4-三唑-1-基)甲基)-6-((2-氨基嘧啶-4-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。LC-MS(ESI)：m/z 395(M+H)+.1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.80(s,1H)，8.62(s,1H)，8.12-8.10(m,2H)，6.60(s,2H)，6.19(d,1H)，6.01(s,2H)，5.19(s,2H)，4.26(s,3H)。
实施例10.合成化合物E10-ii
方案E10
E10-i与LiHMDS和醛的反应生成化合物E10-ii，其可用手性HPLC或SFC分离，得到两种对映异构体。如本文所用，Ar1和Ar2各自独立地是任选取代的5-或6-元单环杂芳基。
实施例10A.合成(R)-6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-(羟基(1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮和(S)-6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-(羟基(1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮
步骤A.合成2-(羟基(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。在氩气下，于-78℃向4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(0.5g，1.20mmol，1当量)的THF(10mL)溶液中缓慢添加LiHMDS(1.0M，2.41mL，2当量)，反应混合物于-70℃搅拌1小时。随后将1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基甲基)吡唑-3-甲醛(816.97mg，3.61mmol，3当量)的THF(1mL)溶液添加到反应混合物中。所得的混合物于-70℃搅拌1小时。TLC(石油醚：EtOAc＝1：1)显示形成两个新的斑点。反应混合物通过NH4Cl水溶液(5mL)于-70℃猝灭，随后温热至室温。混合物用水(10mL)稀释，用EtOAc(8mLx 3)萃取。合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，用Na2SO4干燥。将溶剂真空浓缩。残余物通过Combiflash(由100％石油醚至100％EtOAc)纯化，得到浅棕色胶状物的粗产物(130mg)，其不经进一步纯化用于下一步骤。LCMS:m/z 643.2[M+H]+
步骤B.合成6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-(羟基(1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。向2-(羟基(1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-6-((1-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮(0.13g，202.20μmol，1当量)的DCM(8mL)溶液中添加TFA(4.62g，40.52mmol，3mL，200.38当量)，随后添加H2O(500.00mg，27.75mmol，0.5mL，137.26当量)，然后反应混合物于室温搅拌18小时，随后加热至40℃并保持18小时，LCMS显示起始物完全消耗。反应混合物真空浓缩，残余物通过制备型HPLC纯化，得到所需产物(20.5mg)。LCMS:m/z 382.9[M+H]+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 12.72(brs，1H)，12.61(brs，1H)，8.52(s,1H)，7.56-7.62(m,2H)，6.82(brs，1H)，6.18(d,1H)，5.99-6.09(m,2H)，5.24-5.32(m,2H)，4.19(s,3H)。
步骤C.合成(R)-6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-(羟基(1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮和(S)-6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-(羟基(1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。通过SFC分离化合物6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-(羟基(1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5(6H)-酮。SFC条件：柱是DAICELCHIRALCEL OJ-H(250mm*30mm,5um)；流动相：A：55％CO2；B：45％[0.1％NH3H2O的EtOH溶液]/min。SFC分离得到了2-[(R)-羟基(1H-吡唑-3-基)甲基]-4-甲基-6-(1H-吡唑-3-基甲基)噻唑并[3,4]吡咯并[1,3-d]哒嗪-5-酮和2-[(S)-羟基(1H-吡唑-3-基)甲基]-4-甲基-6-(1H-吡唑-3-基甲基)噻唑并[3,4]吡咯并[1,3-d]哒嗪-5-酮。一种异构体(4.4mg)：LCMS:m/z383[M+H]+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 8.39(s,1H)，7.61(brs，1H)，7.55(brs，1H)，6.34(brs，1H)，6.25(brs，1H)，6.18(brs，1H)，5.44(s,2H)，4.29(s,3H)。另一种异构体(4.1mg)：LCMS:m/z 383(M+H)+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 8.40(s,1H)，7.59(brs，1H)，7.54(brs，1H)，6.34(brs，1H)，6.26(brs，1H)，6.19(brs，1H)，5.44(s,2H)，4.29(s,3H)。
实施例10B：合成6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-(二氟(1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮
步骤A.3-(6-((1-(N,N-二甲基氨磺酰基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-5-氧代-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-羰基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-1-磺酰胺。向3-((2-((1-(N,N-二甲基氨磺酰基)-1H-吡唑-3-基)(羟基)甲基)-4-甲基-5-氧代-4,5-二氢-6H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6-基)甲基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-1-磺酰胺(50mg，83.80μmol，类似于E10-1制备)在DCM(1.5mL)中的混合物中添加MnO2(72.85mg，838.00μmol)，混合物于15℃搅拌1.5小时。反应混合物过滤，减压浓缩，得到粗产物(60mg，粗品)。LCMS:m/z 595.1(M+H)+。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.34(s,1H)，8.12(d,1H)，7.90(d,1H)，7.41(d,1H)，6.38(d,1H)，5.54(s,2H)，4.49(s,3H)，3.10(s,6H)2.93(s,6H)。
步骤B.3-((2-((1-(N,N-二甲基氨磺酰基)-1H-吡唑-3-基)二氟甲基)-4-甲基-5-氧代-4,5-二氢-6H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6-基)甲基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-1-磺酰胺。向3-(6-((1-(N,N-二甲基氨磺酰基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-5-氧代-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-羰基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-1-磺酰胺(240mg，403.60μmol)的DCE(4mL)溶液中添加BAST(1.34g，6.05mmol，1.33mL)，混合物于50℃搅拌12小时。反应混合物用二氯甲烷(20mL)稀释，用饱和NaHCO3(10mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩，得到粗产物(300mg，粗品)，其不经进一步纯化用于下一步骤。LCMS:m/z 617.1(M+H)+。
步骤C.6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-2-(二氟(1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮。向3-((2-((1-(N,N-二甲基氨磺酰基)-1H-吡唑-3-基)二氟甲基)-4-甲基-5-氧代-4,5-二氢-6H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6-基)甲基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-1-磺酰胺(240mg，163.47μmol)在DCM(2mL)中的混合物中添加TFA(2.07g，18.15mmol，1.34mL)，混合物温热至50℃并保持5小时。反应混合物减压浓缩。残余物通过制备型HPLC(柱：Agela ASB 150*25mm*5um；流动相：[水(0.05％HCl)-ACN]；B％：30％-60％，8min)纯化，得到所需产物(3.9mg，5.45％产率，92％纯度)，其是白色固体。LCMS:m/z 403.1(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.67(s,1H)，7.95(s,1H)，7.61(s,1H)，6.72(s,1H)，6.16(s,1H)，5.36(s,2H)，4.28(s,3H)。
实施例10C：合成2-(1-(1H-吡唑-3-基)乙基)-6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮
步骤A：3-((2-(1-(1-(N,N-二甲基氨磺酰基)-1H-吡唑-3-基)-1-羟乙基)-4-甲基-5-氧代-4,5-二氢-6H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6-基)甲基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-1-磺酰胺。向3-(6-((1-(N,N-二甲基氨磺酰基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-5-氧代-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-羰基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-1-磺酰胺(160mg，269.07μmol)的THF(3mL)溶液中添加CH3MgBr(3M，179.38μL)，反应混合物于0℃搅拌3小时。反应混合物于0℃倒入饱和NH4Cl(10mL)中，用乙酸乙酯(20mL*3)萃取。合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。残余物通过快速硅胶色谱(12g />硅胶快速柱，洗脱剂0～90％乙酸乙酯/石油醚梯度@40mL/min)纯化，得到所需产物(50mg，81.87μmol)。LCMS:m/z 611.1(M+H)+.
步骤B：2-(1-(1H-吡唑-3-基)乙基)-6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮。在0℃下，向3-((2-(1-(1-(N,N-二甲基氨磺酰基)-1H-吡唑-3-基)-1-羟乙基)-4-甲基-5-氧代-4,5-二氢-6H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-6-基)甲基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-1-磺酰胺(50mg，81.87μmol)在DCE(0.5mL)中的混合物中添加Et3SiH(19.04mg，163.75μmol，26.15μL)，随后添加TFA(1.54g，13.51mmol，1mL,164.96当量)，于0℃搅拌1小时。混合物温热至50℃，再保持1小时。反应混合物减压浓缩。残余物通过制备型HPLC(柱：Agela ASB150*25mm*5um；流动相：[水(0.05％HCl)-ACN]；B％：25％-55％,7min)纯化，得到7.0mg所需产物。LCMS:m/z 381.2(M+H)+。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.46(s,1H)，8.15(d,2H)，6.78(d,1H)，6.74(d,1H)，5.60(s,2H)，5.00(q，1H)，4.33(s,3H)，1.94(d,3H)。
实施例10D：合成6-((1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-2-(1H-吡唑-3-羰基)-4,6-二氢-5H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-5-酮
步骤A.4-甲基-2-(1H-吡唑-3-羰基)-6-(1H-吡唑-3-基甲基)噻唑并[3,4]吡咯并[1,3-d]哒嗪-5-酮。向3-(6-((1-(N,N-二甲基氨磺酰基)-1H-吡唑-3-基)甲基)-4-甲基-5-氧代-5,6-二氢-4H-噻唑并[5',4':4,5]吡咯并[2,3-d]哒嗪-2-羰基)-N,N-二甲基-1H-吡唑-1-磺酰胺(50mg，84.08μmol)的DCE(1.5mL)溶液中添加TFA(2.31g，20.26mmol，1.5mL)，反应混合物温热至50℃并保持12小时。反应混合物真空浓缩。残余物通过制备型HPLC纯化，得到6.0mg所需产物。LCMS:m/z 381.1(M+H)+。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.72(s,1H)，7.96(d,1H)，7.64(d,1H)，7.49(d,1H)，6.19(d,1H)，5.37(s,2H)，4.38(s,3H)。
实施例11.PKR突变体检测
方法：
将PKR或PKR突变酶溶液稀释到反应混合物中，其包含1x缓冲液(100mM KCl、50mMTris pH 7.5、5mM MgCl2)以及PEP(浓度取决于酶)、180μM NADH、0.5单位LDH、1mM DTT、0.03％BSA；显示1.11倍稀释之后的最终检测浓度。
首先将2μL测试化合物添加到孔中，随后添加180μL反应混合物。
收集除了ADP之外的含有测试化合物的反应混合物，将板于室温存储60分钟。
于室温添加20μL ADP以启动反应，在室温下，以340nm波长的吸光度变化来测量反应进程。
测试化合物制备：
在100％DMSO中制备100x浓度的测试化合物储备溶液(10mM)。
对于11个点进行1至3倍稀释(即，将50μl的第一浓度添加到100μl100％DMSO中，得到3.33mM，将50μl的该浓度物质添加到100μl DMSO中，得到1.11mM，以此类推)。
·将1至100倍稀释到检测中(2μl在200μl中)，得到100μM的起始浓度，对于11个点，减少3倍。
检测缓冲液：100mM KCl、50mM Tris 7.5、5mM MgCl2、1mM DTT、0.03％BSA
反应混合物：PKR突变酶：40-400ng/孔；ADP：0.2-1.65mM；PEP：0.1-0.5mM；NADH：180μM；LDH：0.5单位(Sigma#59023)；DTT：1mM；BSA：0.03％.
实施例12.PKR野生型单点激活百分比检测
将本文所述的化合物用DMSO稀释，并以1μM浓度测试。将该酶在酶溶液中稀释，所述酶溶液包含1x缓冲液(100mM KCl、50mM Tris pH 7.5、5mM MgCl2)以及PEP(浓度取决于酶)、180μM NADH、0.5单位LDH、1mM DTT、0.03％BSA；显示1.11倍稀释后的最终检测浓度。
首先将2μL化合物溶液添加到孔中，随后添加180μL酶溶液。收集除ADP之外的检测物，并将板于室温存储60分钟。添加20μL ADP以启动检测，使用OD340评估检测输出。该检测于室温进行。
最终浓度：PKR野生型(100ng/孔)、Tris pH 7.5(50mM)、KCl(100mM)、MgCl2(5mM)、ADP(0.48mM)、PEP(0.15mM)、NADH(180μM)、LDH(0.5单位，Sigma 59023)、DTT(1mM)和BSA(0.03％)。
实施例13.PKR R510Q单点激活百分比检测
将本文所述的化合物用DMSO稀释并以1μM浓度检测。将该酶稀释到酶溶液中，所述酶溶液包含1x缓冲液(100mM KCl、50mM Tris pH 7.5、5mM MgCl2)以及PEP(浓度取决于酶)、180μM NADH、0.5单位LDH、1mM DTT、0.03％BSA；显示1.11倍稀释之后的最终检测浓度。
首先将2μL化合物溶液添加到孔中，随后添加180μL酶溶液。收集除ADP之外的检测物，并将板于室温存储60分钟。添加20μL ADP以启动检测，使用OD340评估检测输出。该检测于室温进行。
最终浓度：PKR R510Q(40ng/孔)、Tris pH 7.5(50mM)、KCl(100mM)、MgCl2(5mM)、ADP(0.2mM)、PEP(0.11mM)、NADH(180μM)、LDH(0.5单位，Sigma 59023)、DTT(1mM)和BSA(0.03％)。
实施例14.PKR R532W单点激活百分比检测
本文所述的化合物用DMSO稀释并以1μM浓度测试。将该酶用酶溶液稀释，所述酶溶液包含1x缓冲液(100mM KCl、50mM Tris pH 7.5、5mM MgCl2)以及PEP(浓度取决于酶)、180μM NADH、0.5单位LDH、1mM DTT、0.03％BSA；显示1.11倍稀释之后的最终检测浓度。
首先将2μL化合物溶液添加到孔中，随后添加180μL酶溶液。收集除ADP之外的检测物，并将板于室温存储60分钟。添加20μL ADP以启动检测，使用OD340评估检测输出。该检测于室温进行。
最终浓度：PKR R532W(100ng/孔)，Tris pH 7.5(50mM)，KCl(100mM)，MgCl2(5mM)，ADP(0.36mM)，PEP(0.1mM)，NADH(180μM)，LDH(0.5单位，Sigma 59023)，DTT(1mM)和BSA(0.03％)。
实施例15.PKR T384M单点激活百分比检测
本文所述的化合物用DMSO稀释并以1μM浓度测试。将该酶稀释到酶溶液中，所述酶溶液包含1x缓冲液(100mM KCl、50mM Tris pH 7.5、5mM MgCl2)以及PEP(浓度取决于酶)、180μM NADH、0.5单位LDH、1mM DTT、0.03％BSA；显示1.11倍稀释之后的最终检测浓度。
首先将2μL化合物溶液添加到孔中，随后添加180μL酶溶液。收集除ADP之外的检测物，并将板于室温存储60分钟。添加20μL ADP以启动检测，使用OD340评估检测输出。该检测于室温进行。
最终浓度：可溶性PKR T384M(300ng/孔)，Tris pH 7.5(50mM)，KCl(100mM)，MgCl2(5mM)，ADP(0.08mM)，PEP(0.23mM)，NADH(180μM)，LDH(0.5单位，Sigma 59023)，DTT(1mM)和BSA(0.03％)。
实施例16.红细胞(RBC)纯化
收集从健康志愿者抽取的新鲜血液到K2EDTA管中。通过以500g旋转10分钟来沉淀全血。从过滤器上方一(1)英寸处切开Purecell去除白细胞neofilter(Fisher NC0267633)的输液袋端口。将10毫升注射器筒连接到与neofilter相连的剩余切割管上。从全血沉淀中除去血浆层，并将沉淀重悬于2x体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将9毫升重悬的血细胞沉淀转移到准备好的与neofilter相连的10毫升注射器中。使全血在重力作用下流过过滤器，直到所有流体都通过上管进入过滤盘。向注射器中添加柱塞，从夹具上卸下注射器并倒置过滤器，然后将空气注入注射器过滤器系统。使用新的5ml注射器，通过注射器端口从袋中取出过滤后的RBC，然后将纯化的RBC转移到已在冰上温育的5ml卡扣盖管中。将5ml卡扣盖管于15℃以500g旋转10分钟，吸出上清液，并以4 x 109细胞/mL的密度重悬于AGAM(1 xPBS，1％葡萄糖，170mg/L腺嘌呤，5.25g/L甘露醇)中。
实施例17.基于细胞的ATP检测
对于基于细胞的ATP检测，在100％DMSO中制备如本文所述的化合物的10mM储备溶液。在96孔V型底存储板中进行连续稀释(1：4)，随后将1：100添加至包含AGAM的96孔V型底板中。将RBC在AGAM培养基中稀释至密度为1 x 107细胞/mL，随后将90μL/孔添加至黑色透明底检测板(最终化合物浓度为0.1％DMSO浓度)。检测板使用铝箔密封物密封，并于37℃在加湿室中温育过夜。使用Cell-Titer-Glo(Promega)读取ATP水平。
因此已描述了若干实施方案的若干方面，应当理解本领域技术人员将容易想到各种改变、修改和改进。这样的改变、修改和改进旨在成为本公开的一部分，并且旨在落入本发明的精神和范围内。因此，前面的描述和附图仅作为示例。

Claims (35)

1.由以下结构式表示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中：
R1是-C1-C6烷基；
R2是具有选自氮、氧或硫的1-4个环杂原子的5-或6-元单环杂芳基；
Q是具有选自氮、氧或硫的1-4个环杂原子的6-元单环杂芳基；
Ra和Rb各自是氢；和
Rj和Rk各自独立地是氢、卤素、-ORo7或-C1-C6烷基；或者可选择地Rj和Rk可与它们所连接的碳原子共同形成C＝O；
每个Ro7独立地为氢或-C1-C6烷基,
其中R2和Q各自独立地任选被选自以下的一个或多个基团取代：-C1-6烷基、-N(–C1-C6烷基)2、卤素、硝基、氰基、羟基、-C1-6卤代烷基、-C1-6卤代烷氧基、-C1-6酰基、-C3-6环烷基、-C6-10芳基、单环或二环杂芳基以及单环或二环杂环基，其中所述杂芳基和杂环基具有选自氮、氧或硫的1-4个环杂原子。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2所表示的5-或6-元单环杂芳基在每个可取代的环碳原子处任选地被Rp取代，并在每个可取代的环氮原子处任选被Rn6取代；其中：
每个Rp独立地为氢、卤素、-NO2、-C1-C6烷基、-C1-C6烷基-OH、-ORo6、-N(Rn3)2；其中：
每个Rn3独立地为氢或-C1-C6烷基；
每个Ro6独立地为-C1-C6烷基；和
Rn6是氢或-C1-C6烷基。
3.根据权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2所表示的5-或6-元单环杂芳基为选自以下之一：
其中：
Rnc是氢或-C1-C6烷基；
Rnd是氢；和
当价态允许时，p是0、1或2。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
其中q是0、1或2。
5.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
其中q是0、1或2。
6.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
其中q是0、1或2。
7.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
其中q是0、1或2。
8.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q所表示的6-元单环杂芳基选自以下：
其中：
每个Rn独立地为卤素、-CN、-C1-C6烷基、-OH、-NH2、-C1-C6卤代烷基、-O-C1-C6烷基、-C(＝O)NH2、-C(＝O)OH、-C1-C6卤代烷氧基、-N(-C1-C6烷基)2、-NHOH、-NHC(＝O)-C1-C6烷基、–NH-C1-C6烷基或被-OH、-C(＝O)NH2、-NH2或-O-C1-C6烷基取代的-C1-C6烷基；
当价态允许时，n是0、1或2；和
Rna为氢或-C1-C6烷基。
9.根据权利要求8所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q所表示的6-元单环杂芳基是
10.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是氢或-C1-C4烷基。
11.根据权利要求10所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1是甲基。
12.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Rj和Rk各自是氢。
13.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自以下化合物：
14.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
15.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
16.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
17.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
18.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
19.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
20.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
21.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
22.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
23.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
24.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
25.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
26.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
27.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
28.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
29.根据权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物由以下结构式表示：
30.药物组合物，其包含有效量的如权利要求1-29中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
31.包含如权利要求1-29中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐的组合物在制备用于治疗丙酮酸激酶缺乏症(PKD)的药物中的用途。
32.包含如权利要求1-29中任一项所述的化合物的组合物在制备用于治疗镰状细胞病的药物中的用途。
33.包含如权利要求1-29中任一项所述的化合物的组合物在制备用于治疗溶血性贫血的药物中的用途。
34.包含如权利要求1-29中任一项所述的化合物的组合物在制备用于治疗地中海贫血的药物中的用途。
35.根据权利要求34所述的用途，其中所述地中海贫血是α-地中海贫血或β-地中海贫血。
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