CN110945086B

CN110945086B - 用于清除醛的涂层及其制备方法

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Publication number: CN110945086B
Application number: CN201880042360.4A
Authority: CN
Inventors: J·A·罗珀三世; S·布莱杰帕里; P·多尔; A·S·博马吕斯; C·W·琼斯; C·R·默多克; J·M·罗宾斯; 野村明宏; B·R·博马吕斯; A·霍列文斯基; G·加达
Original assignee: Georgia Tech Research Corp; Georgia State University Research Foundation Inc; Dow Global Technologies LLC; Rohm and Haas Co
Current assignee: Georgia Tech Research Corp; Georgia State University Research Foundation Inc; Dow Global Technologies LLC; Rohm and Haas Co
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: US11597845B2; KR102596200B1; EP3645635A1; AU2018291000B2; EP3645635B1; CN110945086A; AU2018291000A1; KR20200047515A; US20200165463A1; WO2019006263A1; CA3068611A1; BR112019027591A2

Abstract

一种用于将甲醛转化成二氧化碳的涂层包括固定于固体颗粒载体上的醇/醛氧化酶和甲酸盐氧化酶；以及乳胶粘合剂。

Description

用于清除醛的涂层及其制备方法

背景技术

本发明涉及甲醛的清除，确切地说，使用固定的酶的组合来清除甲醛。

固定的生物试剂，确切地说是固定的酶，已被用于从废水中去除有机化合物到用于生物传感器、生物柴油和抗生素生产以及食品行业等广泛多种应用。然而，适当酶的识别、这些酶的固定和使这些酶发挥作用的特定条件的确定是很难预测的。因此，使用固定的酶来实现特定目的是本领域中所面临的持续挑战。例如，尚无可商购的用于清除甲醛的酶系统。甲醛可被视为环境污染物，尤其是在建筑物内部。由于消费者对在建筑物中居住的舒适度和身心健康需求的意识增加，室内空气质量(IAQ)成为一个新兴的领域。因此，从环境，如在建筑物内部清除甲醛的新方法将是极合乎需要的。

发明内容

在一个方面，用于将甲醛转化成二氧化碳的涂层包含醇/醛氧化酶(AOX)和甲酸盐氧化酶(FOX)，其中醇/醛氧化酶和甲酸盐氧化酶都被固定于固体颗粒载体上；以及乳胶粘合剂。

在另一方面，用于形成前述涂层的液体涂层组合物包含固定于固体颗粒载体上的醛氧化酶和甲酸盐氧化酶；以及液体乳胶粘合剂组合物。

在又一方面，一种用于形成涂层的方法包含：将前述液体涂层组合物涂布到衬底上；以及干燥液体涂层组合物，以形成涂层。

在另一方面，一种用于将大气甲醛转化成二氧化碳的方法包含：使前述涂层与包含甲醛的大气接触；以及将所述甲醛的至少一部分转化成二氧化碳。

在另一方面，一种醇/醛氧化酶具有含R241K突变或N218D突变的SEQ ID NO:1。

上述特征和其它特征将通过以下图式和具体实施方式举例说明。

附图说明

以下图式是例示性实施例，其中相同的元件以相同方式编号。

图1是所提出的用于酶促分解甲醛的机制的示意图。

图2展示，野生型FOX因非共价结合的8-甲酰基黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)代替存在于大部分葡萄糖-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶中的典型FAD辅因子而呈现出异常UV吸收光谱。

图3展示在纯化程序期间AOX的纯度增加。

图4展示通过AOX和FOX酶将经¹³C标记的甲醛转化成经¹³C标记的CO₂，所述AOX和FOX酶负载于介孔结构的二氧化硅泡沫(MCF)二氧化硅粒子上，分散在乳胶介质中，随后在表面上干燥为涂层形式。

具体实施方式

本发明人已出人意料地发现，包含固定于固体颗粒载体上且与乳胶粘合剂组合的酶醇/醛氧化酶(AOX)和甲酸盐氧化酶(FOD或FOX)的组合物可用于形成生物活性涂层。可将包含固定于固体颗粒载体上的AOX和FOX且另外包含乳胶粘合剂的液体组合物涂布到衬底上并进行干燥，以形成涂层。生物活性涂层可在24小时内催化甲醛转化成二氧化碳。提出的用于酶促分解甲醛的机制展示于图1中。

所述组合物包括醇/醛氧化酶(AOX)。例如，来自甲基营养型酵母的醇氧化酶是一种具有80kD亚基的八聚体酶。其功能是通过醛将如甲醇和乙醇之类醇氧化成其酸及通过消耗分子氧等摩尔产生过氧化氢的能力的一部分。甲醇极敏感地诱导并大量产生AOX，随后将其储存于过氧化物酶体中。AOX是含黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的酶，且每个亚基具有1单位黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD。其启动子受甲醇诱导的能力使其成为异源酵母表达的早期目标，所述异源酵母表达使得将毕赤酵母(Pichia pastoris)确定为异源表达系统。

已从毕赤酵母属物种(现称为Komatagaella)、汉森酵母属物种(现称为Ogataea)和假丝酵母属物种(Candida species)中分离AOX。每种具有多种菌株，每种菌株均具有AOX基因。不与之紧密相关但仍具有活性且可用于本文所述的组合物和方法中的其它物质包括来自以下的AOX：曲霉属物种、镰孢菌属物种和炭疽菌属物种，所述物种与毕赤酵母AOX具有约60％到70％的一致性。

在一个方面，AOX是来自具有SEQ ID NO:1的毕赤酵母(诸如毕赤酵母)的野生型AOX，或与其具有超过70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同源性的变异体。

MAIPEEFDILVLGGGSSGSCIAGRLANLDHSLKVGLIEAGENNLNNPWVYLPGIYPRNMKLDSKTASFYTSNPSPHLNGRRAIVPCANVLGGGSSINFMMYTRGSASDYDDFQAEGWKTKDLLPLMKKTETYQRACNNPDIHGFEGPIKVSFGNYTYPVCQDFLRASESQGIPYVDDLEDLVTAHGAEHWLKWINRDTGRRSDSAHAFVHSTMRNHDNLYLICNTKVDKIIVEDGRAAAVRTVPSKPLNPKKPSHKIYRARKQIVLSCGTISSPLVLQRSGFGDPIKLRAAGVKPLVNLPGVGRNFQDHYCFFSPYRIKPQYESFDDFVRGDAEIQKRVFDQWYANGTGPLATNGIEAGVKIRPTPEELSQMDESFQEGYREYFEDKPDKPVMHYSIIAGFFGDHTKIPPGKYMTMFHFLEYPFSRGSIHITSPDPYAAPDFDPGFMNDERDMAPMVWAYKKSRETARRMDHFAGEVTSHHPLFPYSSEARALEMDLETSNAYGGPLNLSAGLAHGSWTQPLKKPTAKNEGHVTSNQVELHPDIEYDEEDDKAIENYIREHTETTWHCLGTCSIGPREGSKIVKWGGVLDHRSNVYGVKGLKVGDLSVCPDNVGCNTYTTALLIGEKTATLVGEDLGYSGEALDMTVPQFKLGTYEKTGLARF(SEQ ID NO:1)

在一个方面，AOX是SEQ ID NO:1所示的新颖R241K变异体。在另一方面，AOX是SEQID NO:1所示的N218D变异体。

组合物还包括甲酸盐氧化酶。来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的甲酸盐氧化酶(FOX；E.C.1.2.3.1)已被鉴别为葡糖-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶超家族的第一和唯一成员，以使碳酸氧化。另外，已表明野生型FOX呈现出异常UV吸收光谱，其归因于非共价结合的8-甲酰基黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)代替存在于大部分GMC氧化还原酶中的典型FAD辅因子。(图2)

尽管因对乳酸氧化酶(LOX)进行定点突变研究，先前报道了与酶结合的8-甲酰基黄素单核苷酸(FMN)的存在，但FOX是存在于野生型酶中的第一个报道的8-甲酰基FAD。由于先前已表明在LOX中形成8-甲酰基FMN导致酶完全失活，因此FOX中所存在8-甲酰基FAD被认为是一种伪像。因此，通过使用稳态动力学、快速反应动力学、动力学同位素效应、定点突变诱发、ICP分析、UV和荧光光谱测定法、LCMS、电子顺磁共振(EPR)光谱法、分析超速离心(AUC)和曝光研究，对8-甲酰基FAD辅因子在甲酸盐氧化酶中的形成和作用进行研究。出人意料地，这些研究的结果不仅表明8-甲酰基-FAD以FOX的活性形式存在，而且其自催化形成对活性来说是至关重要的。结果，甲酸盐氧化酶充当报道具有作为辅因子的活性8-甲酰基FAD的第一酶。结合8-甲酰基FAD的FOX也表明当暴露于光时，其形成极稳定的阴离子半醌。

在几种生物体中已鉴别出甲酸盐氧化酶，生物体包括红绶曲霉(Aspergillusnomius)IRI013、德巴利酵母(Debaryomyces vanrijiae)MH201和米曲霉RIB40。

在一个方面，甲酸盐氧化酶是来自具有SEQ ID NO:2的米曲霉RIB40的FOX。

MATDGSHFDFVIVGGGTAGNTVAGRLAENPNVTVLIVEAGIGNPEDIPEITTPSSAMDLRNSKYDWAYKTTMVRRDDYERIEKPNTRGKTLGGSSSLNYFTWVPGHKATFDQWEEFGGKEWTWDPLVPYLRKSATYHDDPRLYSPELEKIGGGGPIPISHAELIDEMAPFRENLTKAWKSMGQPLIENIYDGEMDGLTHCCDTIYRGQRSGSFLFVKNKPNITIVPEVHSKRLIINEADRTCKGVTVVTAAGNELNFFADREVILSQGVFETPKLLMLSGIGPTRELSRHGINTIVDSRHVGQNLMDHPGVPFVLRVKDGFGMDDVLLRHGPKRDAVVSAYNKNRSGPVGSGLLELVGFPRIDKYLEKDAEYRKAKAANGGKDPFSPLGQPHFELDFVCMFGTAFQWHFPTPKTGDHLTVVVDLVRPISDPGEVTLNSADPFQQPNINLNFFANDLDIIAMREGIRFSYDLLFKGEGFKDLVESEYPWEMPLDSDKEMHRAVLDRCQTAFHPTGTARLSKNIDQGVVDPKLKVHGIKKLRVADASVIPIIPDCRIQNSVYAVGEKCADMIKAEHKDLY(SEQ ID NO:2)

醇/醛氧化酶和甲酸盐氧化酶通常以FOX活性与AOX活性的活性比是1:1到1:5存在于涂层中。

醇/醛氧化酶和甲酸盐氧化酶固定于固体颗粒载体上。例示性固体颗粒载体包括能够固定酶的碳水化合物、无机材料、有机材料、合成有机材料或上述材料的组合。有机材料包括(但不限于)琼脂糖；含有氨基、羧基、环氧基或酰肼官能团的琼脂糖衍生物；聚丙烯酰胺；含有氨基、羧基、环氧基或酰肼官能团的聚丙烯酰胺衍生物等等。无机固体颗粒载体包括二氧化硅；铝硅酸盐(例如沸石)；氧化铝；碳或石墨粒子；吸附有铂族金属(如铂、钯或铑)的碳或石墨粒子；吸附有铂族金属氧化物的碳或石墨粒子；已吸附有伯胺、仲胺或叔胺官能聚合物的无机材料；已吸附有季铵聚合物(如

(季铵盐-40))的无机材料等等。此外，可选择来自固体颗粒载体的无机材料与有机材料的组合，其包括(但不打算限于)吸附有金属卟啉(如例如钴原卟啉)的碳或石墨粒子。

在一个方面，固体颗粒载体包含二氧化硅粒子，如介孔二氧化硅泡沫、多孔二氧化硅微球、多孔核-壳粒子、多孔二氧化硅纳米粒子、具有多孔二氧化硅层的粒子或包含前述至少一种的组合。

在一个方面，固体颗粒载体(例如无机颗粒载体)的粒径是0.1到800微米，优选地是0.5到100微米，并且其孔径是50埃到200纳米，优选地是100埃到50纳米。

可根据所属领域众所周知的方法将酶连接到固体颗粒载体上。这种方法包括(但不限于)吸附、离子结合、共价结合等。

可通过将酶吸附到固体颗粒载体上以将酶固定于固体颗粒载体上，来形成固体颗粒载体/酶复合物。通常，根据所属领域众所周知的方法将酶吸附到固体颗粒载体上。当然，应理解酶对固体颗粒载体表现出的吸附特性是包含这两种实体的缓冲液的pH值与离子强度的函数。为了达成适当的吸附，包含酶和固体颗粒载体的缓冲液的pH与离子强度可因所使用的特定酶或特定固体颗粒载体而变。在一个方面，将酶溶解于固体颗粒载体混合物中，使得其在溶液中的浓度将使特定固体颗粒载体表面的非特异性结合位点饱和。因此，缓冲液的pH与离子强度优选是将酶最大程度地吸附到固体颗粒载体上的pH与离子强度。

通常可通过利用与带电酶和带相反电荷的固体颗粒载体相关的吸引力，将酶固定于固体颗粒载体上，从而形成固体颗粒载体/酶复合物。例如，使带正电荷的化合物吸附或共价结合到固体颗粒载体上的阳离子固体颗粒载体与阴离子酶反应，以获得酶/固体载体复合物。适用于在固体颗粒载体上赋予正电荷的化合物包括(但不打算限于)季铵聚合物，例如

(季铵盐-40)；胺官能聚合物，例如聚乙烯亚胺等等。通过将溶解于合适溶剂中的过量化合物添加到固体颗粒载体中，使这些化合物容易吸附到固体颗粒载体上。经过足够的时间后，可例如通过过滤或离心收集固体颗粒载体。通过用合适的溶剂冲洗固体颗粒载体随后再收集固相，可从固体颗粒载体中分离任何残留的化合物。随后可将冲洗的固体颗粒载体湿润使用，或在将酶以离子形式结合到其上之前进行干燥。

尽管一些阴离子酶和蛋白会固有地以离子形式结合阳离子固体颗粒载体，但可对酶进行阴离子修饰，以使得在酶与固体颗粒载体之间形成更多的离子键。

一种向例如酶提供负电荷的方法是通过使其与例如脂肪族或芳香族羧酸酐反应。这种羧酸酐包括但不打算限于均苯四甲酸二酐、丁二酸酐、顺丁烯二酸酐等等。

通过使均苯四甲酸二酐与带正电荷的氨基反应(其中存在于酶上的氨基可转化成具有三个负电荷的芳香族三羧酸盐)，从而可为酶提供负电荷。可通过将均苯四甲酸二酐的水性悬浮液添加到酶溶液中，以进行转化。酶或蛋白可溶解于pH是约6.5到约8.0，如约7.0到约7.5的适当缓冲液中。均苯四甲酸二酐的量可比酶的量多约0.05到约0.5倍，例如比酶的量多约0.05到约0.15倍。尽管氨基到芳香族三羧酸酯的转化通常在约5分钟内完成，但可允许反应在环境温度下培育持续约10分钟到约20分钟。随后可将反应混合物直接添加到阳离子固体载体上或在与阳离子固体颗粒载体反应之前纯化。

由于酶和固体颗粒载体携载相反的电荷，因此两个实体之间将易于形成离子键。通常，带电荷的固体颗粒载体将具有结合阴离子带电酶的高能力。酶的浓度可使固体颗粒载体上的阳离子结合位点饱和。当将阳离子带电固体颗粒载体的悬浮液添加到阴离子带电酶的溶液中以形成反应混合物时，优选酶与固体颗粒载体的比例是约1:1.5到约1:5。反应可在pH为约6.5到约7.5的低离子强度缓冲液中进行，持续约1分钟到约30分钟，并且温度是约2℃到约25℃。可通过所属领域的技术人员熟知的方法将未结合的酶从因此形成的酶/固体颗粒载体复合物中分离，且添加到结合试剂中或留在反应混合物中，随后直接添加到乳胶粘合剂中。在从反应混合物中分离复合物的情况下，可使用孔径小到足以捕获酶/固体颗粒载体复合物，但又大到足以使未结合的酶流过过滤器的过滤器来过滤反应混合物。或者，可将复合物离心，以形成湿球粒。为了确保从复合物中去除所有未结合的酶，可用pH为约6.0到约7.5之间的低离子强度缓冲液洗涤经捕获的复合物。

或者，酶与固体颗粒载体可以离子形式结合且在单个步骤中由溶液中共沉淀。通常，通过以下来完成沉淀：首先制备酶与固体颗粒载体的单一溶液，用均苯四甲酸二酐处理溶液，随后将溶液用一种上述带正电荷的聚合物来处理。酶与固体颗粒载体的比例可以是约1:1到约1:5，溶液中均苯四甲酸二酐的量可以是溶液中酶的量的约0.05到0.15倍。

酶可以离子形式与固体颗粒载体结合的方式并不打算限于本文所述的方法，也可采用所属领域已知的其它方法。

在另一方面，可通过在酶与固体颗粒载体之间形成的共价键将酶固定于固体颗粒载体上，以形成酶/固体颗粒载体复合物。为了形成这种共价键，可对固体颗粒载体进行修饰，以使得其能够与酶形成共价键。这种对固体颗粒载体的修饰包括(但不限于)将官能度(如氨基、羧酸酯基、环氧基等等)添加到固体颗粒载体。例如，可使用所属领域的技术人员众所周知的方法用氨基丙基三乙氧基硅烷或聚乙烯亚胺将二氧化硅衍生化。在完成这种修饰之后，可通过所属领域众所周知的方法将胺化的固体颗粒载体进一步衍生，以引入其它官能团。随后可使用所属领域众所周知的方法将酶共价结合到衍生的固体颗粒载体。例如，可将水溶性碳化二亚胺(如3-乙基1-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺)或类似的羧酸盐活化剂的使用添加到含有经修饰的固体颗粒载体与酶的适当缓冲液中，以产生共价结合的酶/固体颗粒载体复合物，其通过羧酸盐与氨基之间的酰胺键形成。

或者，可使经修饰的固体颗粒载体如上所述与经修饰的酶反应。这种经修饰的酶包括(但不打算限于)使用所属领域众所周知的方法用如先前所述的均苯四甲酸二酐或其它单酸酐或聚酸酐(如N-羧基-α-氨基酸酐)等等修饰的酶。

在将酶与固体颗粒载体共价结合的另一种方法中，可使用所属领域众所周知的异型双官能耦合化合物。这种化合物包括(但不打算限于)：m-马来酰亚氨基苯基-N-羟基丁二酰亚胺酯(MBS)、磺基琥珀酰亚氨基4-(p-马来酰亚氨基苯基)丁酸酯(S-SMPB)、m-马来酰亚氨基甲硫基琥珀酰亚胺酯(S-MBS)、N-γ-马来酰亚氨基丁氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、丁二酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷1-甲酸酯(SMCC)、发现于美国专利第4,994,385号的化合物等等。使用这种化合物共价耦合两种化合物的方法是所属领域众所周知的。

以涂层的总重量计，甲酸盐氧化酶可以约0.08到约8重量％，且更具体来说约0.2到约5重量％的涂层的干重量存在于涂层中。以涂层的总重量计，醇/醛氧化酶可以约0.1到约10重量％，且更具体来说约0.5到约8重量％的涂层的干重量存在于涂层组合物中。以涂层的总重量计，固体颗粒载体可以约2到约45重量％，且更具体来说约10到约40重量％的涂层的干重量存在于涂层中。

以液体涂层组合物的总重量计，甲酸盐氧化酶可以约0.01到约5重量％，且更具体来说约0.1到约3重量％的液体涂层组合物的干重量存在于液体涂层组合物中。以液体涂层组合物的总重量计，醇/醛氧化酶可以约0.05到约5重量％，且更具体来说约0.2到约4重量％的液体涂层组合物的干重量存在于液体涂层组合物中。以液体涂层组合物的总重量计，固体颗粒载体可以约1到约25重量％，且更具体来说约5到约20重量％的液体涂层组合物的干重量存在于液体涂层组合物中。

在将酶固定于固体颗粒载体上以形成酶/固体颗粒载体复合物之后，将所述复合物与液体乳胶粘合剂组合，以形成用于形成涂层的液体涂层组合物。当形成涂层时，一个或多个不同种类的酶/固体颗粒载体复合物可分散于整个乳胶粘合剂中。例如，可将固定于固体颗粒载体上的一类酶添加到含有固定于固体颗粒载体上的第二类酶的固定介质中。

酶/固体颗粒载体复合物的悬浮液可直接添加到乳胶粘合剂中，或在添加到乳胶粘合剂之前收集起来并洗涤。使酶/固体颗粒载体材料分散于乳胶粘合剂中的物理分散方法会影响涂层的特性。因此，优选将酶/固体颗粒载体复合物充分地分散于乳胶粘合剂中，以形成均质混合物。用于分散所述复合物的方法包括但不打算限于高剪切均质化、球磨等等。

优选地，液体乳胶粘合剂是水性的，并且呈液体或流体形式，其中酶/固体颗粒载体复合物均匀地分散于或可分散于液体乳胶粘合剂中。选择的乳胶粘合剂使得酶/固体颗粒载体复合物在表面上干燥时能够粘附到表面。在一个实施例中，选择的乳胶粘合剂在表面上干燥时可不可逆地粘附到表面。选择的乳胶粘合剂还会干燥成物理上持久的涂层，优选干燥成防水涂层，该涂层保留了酶的生物活性。在一个优选实施例中，选择的乳胶粘合剂可粘附到多种表面，包括但不打算限于光滑或无孔表面以及多孔表面。

乳胶粘合剂可由包含乙酸乙烯酯或至少一种丙烯酸单体的单体得到，所述单体诸如是丙烯酸、丙烯酸C_1-10烷基酯、甲基丙烯酸或甲基丙烯酸C_1-10烷基酯，任选地与以下各物中的一种或多种共聚合：苯乙烯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、α-甲基苯乙烯、氯乙烯、丙烯腈、甲基丙烯腈、甲基丙烯酸脲酯、乙酸乙烯酯、支链叔单羧酸乙烯酯(例如叔碳酸的乙烯酯(称为叔碳酸乙烯酯)，其以商标

购自Shell化学公司或以

VinylEsters售自ExxonMobil化学公司)、衣康酸、巴豆酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸以及乙烯。还可包括C_4-8共轭二烯，诸如1,3-丁二烯、异戊二烯和氯丁二烯。在一个实施例中，所述单体包括丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯和丙烯酸2-乙基己酯中的一种或多种。

可使用纯丙烯酸树脂(包含丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯作为主要单体)；苯乙烯-丙烯酸树脂(包含苯乙烯和丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯作为主要单体)；乙烯基-丙烯酸酯(包含乙酸乙烯酯和丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯作为主要单体)；以及丙烯酸化乙烯乙酸乙烯酯共聚物(包含乙烯、乙酸乙烯酯和丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯作为主要单体)。单体还可包括其它主要单体，如丙烯酰胺和丙烯腈，任选地具有一种或多种单体，如衣康酸和甲基丙烯酸脲基酯。

可用于液体涂层组合物(及因此涂层)的乳胶粘合剂的特定实例包括(但不限于)丙烯酸乳胶(包括羧酸酯丙烯酸乳胶)、丙烯腈-丁二烯乳胶、醇酸树脂树脂乳胶、乙烯-乙酸乙烯酯乳胶、氯丁橡胶乳胶、聚酰胺乳胶、聚丁二烯乳胶、聚丁烯乳胶、聚氯丁烯乳胶、聚酯乳胶、聚异戊二烯乳胶、聚丙烯乳胶、聚氨基甲酸酯乳胶、聚乙酸乙烯酯乳胶、聚乙烯醇乳胶、聚乙烯醇缩丁醛乳胶、聚氯乙烯乳胶、聚偏二氯乙烯乳胶、有机硅乳胶、苯乙烯-丙烯酸乳胶、苯乙烯-丙烯腈乳胶、苯乙烯-丁二烯橡胶乳胶、苯乙烯-异戊二烯乳胶等等，或包含前述至少一种的组合。优选地，乳胶粘合剂包含丙烯酸乳胶、苯乙烯-丙烯酸乳胶、乙烯基-丙烯酰基乳胶、乙酸乙烯酯乳胶或包含前述至少一种的组合。

以液体涂层组合物的总重量计，乳胶粘合剂可以约5到约80重量％，且更具体来说约8到约60重量％的液体涂层组合物的干重量存在于液体涂层组合物中。

在一种有利特征中，已发现使用特定类别的多羟基化合物(确切地说，某些碳水化合物)可显著增加固定酶复合物的稳定性。任选地，在稳定剂存在下，将一种或多种酶冷冻干燥，尽管不需要冷冻干燥。碳水化合物可以是单糖、二糖或含有3到10个单糖单元的低聚糖。例示性酶稳定剂包括蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖、木糖醇、甘露糖、棉籽糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖或包含前述至少一种的组合。在一个优选实施例中，稳定剂是蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇或包含前述至少一种的组合。

选择碳水化合物稳定剂的量以改善酶在液体涂层组合物中以及任选地在涂层中的稳定性，同时不会显著不利地影响液体涂层组合物和涂层的所期望性能。在一个方面，可将酶稳定剂以液体涂层组合物中二氧化硅载体的约1到约15重量％，具体来说约1到约5重量％的量用于液体涂层组合物中。

液体涂层组合物还可含有补充组分，其可为涂层提供所期望性能，增强固定酶的稳定性或改善将涂层干燥成大体上防水或不溶层的能力。选择补充组分以便不会显著不利地影响液体涂层组合物和涂层的所期望性能，特别是酶的稳定性。这种补充组分包括(但不限于)乳胶配制物稳定剂、聚结溶剂、塑化剂、流变改性剂、增稠剂、成膜剂、表面活性剂、防腐剂、杀生物剂、防霉剂、分散剂、消泡剂、缓干剂、着色剂、增量剂、pH调节剂、蜡或包含前述至少一种的组合。补充组分通常以用于液体乳胶涂层组合物，及尤其用于乳胶涂料组合物的量存在。

在优选实施例中，涂层包括如本文所用的着色剂，其包括染料和颜料。如本文所用，术语「颜料」包括非成膜固体，如增量剂和填充剂，例如无机颜料TiO₂(呈锐钛矿或金红石形式)、粘土(硅酸铝)、CaCO₃(呈研磨和沉淀形式)、氧化铝、二氧化硅、氧化镁、滑石(硅酸镁)、重晶石(硫酸钡)、氧化锌、硫化锌、氧化钠、氧化钾、固体(高Tg)有机乳胶粒子(添加到来改变硬度或表面粗糙度或(如在中空乳胶粒子的情况下)置换TiO₂)或包含前述至少一种的组合。代表性组合包括金属氧化物的掺合物，如使用以下商标出售的金属氧化物的掺合物：

(硅、铝、钠和钾的氧化物，可购自Unimin Specialty Minerals)、

(可购自硅藻土公司的氧化铝和二氧化硅)、

(可购自Imerys)和

(可购自BASF)。具体来说，颜料包括TiO₂、CaCO₃或粘土。通常，颜料的平均粒度可以是约0.01到约50微米。例如，用于水性涂层组合物中的TiO₂粒子的平均粒度通常是约0.15到约0.40微米。可将颜料以粉末或浆料形式添加到液体涂层组合物中。将颜料以液体涂层组合物中总固体的约5到约75重量％，具体来说约10到约55重量％的量用于液体涂层组合物中。

尽管许多水存在于乳胶粘合剂中及液体涂层组合物的其它组分中，但可将水单独添加到液体涂层组合物中。通常，液体涂层组合物包括约10到约85重量％，且更具体来说约20到约80重量％的水，即液体涂层组合物的总固体含量是总组合物的约15到约90重量％，更具体来说约20到约80重量％。液体涂层组合物通常经配制以使得硬化(干燥)涂层组成至少约5体积％(体积％)的干式聚合物固体，并且当存在时，约5体积％到约90体积％呈颜料形式的非聚合固体。

塑化剂可用于改善膜形成或防止涂层开裂。例示性塑化剂包括邻苯二甲酸二丁酯和癸二酸二辛酯等塑化剂。增稠剂可用于防止悬浮固体沉淀，并且可以是增稠剂，如羟乙基纤维素、二氧化硅和ACRYSOL^TM SCT 200。成膜剂(通常是有机溶剂(也称作聚结溶剂))可溶解增塑剂且控制干燥速率，以得到光滑涂层。可使用成膜剂，如2-乙氧基乙醇、乙二醇单丙基醚和2-(2-丁氧基乙氧基)醇。分散剂可防止聚合物凝集，且包括例如TRITON^TM X-100清洁剂。消泡剂可在混合期间降低发泡，且包括例如消泡剂，如2-辛醇。

在另一方面，一种用于形成涂层的方法包含：将液体涂层组合物施加到衬底上，所述液体涂层组合物包含固定于固体颗粒载体上的醛氧化酶和甲酸盐氧化酶；以及液体乳胶粘合剂；以及干燥液体组合物以形成涂层。

液体涂层组合物可通过各种方法容易地施配或施加到表面。因此，例如，液体涂层组合物可通过刷涂、泵送、液体计量、丝网印刷、喷涂、喷射或将表面浸渍到液体涂层组合物中而施配或施加到表面。

干燥可通过在涂布之后暴露于环境条件来进行。可使用其它技术，例如强制空气流或热量流，但应控制热量而不会显著不利地影响酶活性。此外，由于可在环境温度下干燥乳胶粘合剂，因此不使酶/固相复合物暴露于可能使酶组分变性的苛刻温度下。再者，由于乳胶粘合剂干燥成防水粘合层，因此可重复使用已施加乳胶粘合剂且干燥的表面。此外，乳胶粘合剂不受其所施加的表面类型的限制。

在一个方面，涂层是用于建筑物内部的涂料。

在一个方面，涂层呈现出色彩稳定性。例如，在一个实施例中，如根据ASTM D2244所测量，相较于不含酶的对照，涂层具有由CIELAB度量DE定量的小于5，优选小于2的色差。

在另一方面，如根据测试方法JC/T 1074-2008以分光光度法测定，涂层是以去除空气中甲醛起始水平的至少75％定义的消除效率消除空气中的甲醛。

在一个方面，当保持在约40到80°F的温度范围内时，涂层有效地将甲醛转化成二氧化碳持续至少26周，104周或60个月。

一种用于将大气甲醛转化成二氧化碳的方法包含：使如本文所述的涂层与包含甲醛的大气接触及将甲醛的至少一部分转化成二氧化碳。

对于核酸和多肽，术语“大体上同源”表示当对两种核酸或两种多肽或其指定序列进行最优地对准和比较时，在至少约80％的核苷酸或氨基酸中，通常至少约85％，优选是约90％、91％、92％、93％、94％或95％，更优选至少约96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％或99.5％的核苷酸或氨基酸，两种核酸或两种多肽或其指定序列与适当核苷酸或氨基酸插入或缺失一致。或者，当片段将在选择性杂交条件下与股的互补序列杂交时，存在大体上同源性。核酸序列和多肽序列可与本文所述的特定核酸序列和氨基酸序列具有大体上同源性。

本文所述的酶包括具有“保守性序列修饰”的酶，其是不影响或改变上述酶的特征的氨基酸序列修饰。

通过以下非限制性实例进一步说明本揭示。

实例

实例1：制备甲酸盐氧化酶(FOX)

his标记的FOX的克隆、表达和纯化来自米曲霉RIB40的FOX的以下合成cDNA序列购自

(纽约，格兰德岛，生命技术公司)。

ATGGCAACCGATGGTAGCCATTTTGATTTTGTTATTGTTGGTGGTGGCACCGCAGGTAATACCGTTGCAGGTCGTCTGGCAGAAAATCCGAATGTTACCGTTCTGATTGTTGAAGCCGGTATTGGTAATCCGGAAGATATCCCGGAAATTACCACCCCGAGCAGCGCAATGGATCTGCGTAATAGCAAATATGATTGGGCCTATAAAACCACCATGGTTCGTCGTGATGATTATGAACGTATTGAAAAACCGAATACCCGTGGTAAAACCCTGGGTGGTAGCAGCAGCCTGAACTATTTTACCTGGGTTCCGGGTCATAAAGCAACCTTTGATCAGTGGGAAGAATTTGGTGGTAAAGAATGGACCTGGGATCCGCTGGTTCCGTATCTGCGCAAAAGCGCAACCTATCATGATGATCCGCGTCTGTATAGTCCGGAACTGGAAAAAATTGGTGGCGGTGGTCCGATTCCGATTAGCCATGCAGAACTGATTGATGAAATGGCACCGTTTCGTGAAAATCTGACCAAAGCATGGAAAAGCATGGGTCAGCCGCTGATTGAAAACATTTATGATGGTGAAATGGATGGCCTGACCCATTGTTGTGATACCATTTATCGTGGTCAGCGTAGCGGTAGCTTTCTGTTTGTTAAAAACAAACCGAACATTACCATTGTGCCGGAAGTTCATAGCAAACGCCTGATTATTAACGAAGCAGATCGTACCTGTAAAGGTGTTACCGTGGTTACCGCAGCAGGTAATGAACTGAACTTTTTTGCAGATCGTGAAGTGATTCTGAGCCAGGGTGTTTTTGAAACCCCGAAACTGCTGATGCTGAGTGGTATTGGTCCGACCCGTGAACTGAGCCGTCATGGCATTAATACCATTGTTGATAGTCGTCATGTTGGCCAGAATCTGATGGATCATCCGGGTGTTCCGTTTGTTCTGCGTGTTAAAGATGGTTTTGGTATGGATGATGTTCTGCTGCGTCATGGTCCGAAACGTGATGCAGTTGTTAGCGCATATAACAAAAATCGTAGCGGTCCGGTTGGTAGCGGTCTGCTGGAACTGGTTGGTTTTCCGCGTATTGATAAATACCTGGAAAAAGATGCCGAATATCGTAAAGCAAAAGCAGCAAATGGTGGCAAAGATCCGTTTAGTCCGCTGGGCCAGCCGCATTTTGAACTGGATTTTGTTTGTATGTTTGGCACCGCCTTTCAGTGGCATTTTCCGACCCCGAAAACCGGTGATCATCTGACCGTTGTTGTTGATCTGGTTCGTCCGATTAGTGATCCGGGTGAAGTTACCCTGAATAGTGCCGATCCGTTTCAGCAGCCGAATATTAACCTGAATTTTTTCGCCAACGATCTGGACATTATTGCAATGCGTGAAGGTATTCGCTTTAGCTATGATCTGCTGTTTAAAGGCGAAGGCTTTAAAGATCTGGTTGAAAGTGAATATCCGTGGGAAATGCCGCTGGATAGCGATAAAGAAATGCATCGTGCAGTTCTGGATCGTTGTCAGACCGCATTTCATCCGACCGGCACCGCACGTCTGAGCAAAAACATTGATCAGGGTGTTGTGGATCCGAAACTGAAAGTTCATGGTATCAAAAAACTGCGTGTTGCAGATGCAAGCGTTATTCCGATCATTCCGGATTGTCGTATTCAGAATAGCGTTTATGCAGTGGGTGAAAAATGTGCCGATATGATTAAAGCCGAACACAAAGACCTGTAT.(SEQID NO:3)

将包括用于大肠杆菌中表达的优化密码子的合成基因插入到pET21c(+)表达载体的NdeI-NotI限制位点中(德国，达姆施塔特，EMD生物科学)并且转换到大肠杆菌Novablue^TM细胞中(EMD生物科学)。在从大肠杆菌Novablue^TM分离质体DNA并测序以验证重组FOX_AO基因的存在之后，将所得的pET21-FOX_AO转换到大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主菌株中(EMD生命科学)。随后如前所述用以下修饰对his标记的FOX_AO进行表达和纯化：将收集的细胞悬浮于pH为7.5的25mM磷酸钾缓冲液(补充有20mM咪唑、100mM NaCl和10％甘油)中，随后超声处理。随后将这一上清液施加到用上述悬浮缓冲液平衡的HisPur^TM Ni-NTA树脂的柱上，随后如前所述进行洗涤、洗脱、透析和储存，对其进行修饰，以使得所有步骤在无光的情况下进行。

不具有His标记的FOX的构建表达和纯化使用含有FOX基因序列的重组pET21C(+)质体来构建不具有His标记的FOX酶，其使用定点突变诱发。非His标记的FOX的引物经设计为具有以下序列的33个基础寡核苷酸：CACAAAGACCTGTATTA AGCCGCACTGGAGCAC(SEQ IDNO:4)和GTGCTCGAGTGCGGCTTAATACAGGTCTTTGTG(SEQ ID NO:5)。使用这些引物进行定点突变诱发，将pET21C(+)质体中包含的FOX基因序列C端氨基酸紧接的GCG密码子用TAA终止密码子置换，从而消除在所表达的蛋白中C端His标记氨基酸序列。通过Eurofins MWG OperonLLC(Huntsville，AL)的DNA测序分析确定非His标记的FOX基因的序列。具有确定序列的质体经转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行蛋白表达，并在-80℃下储存。将来自含有适当过度表达质体的冷冻储备液的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含有100μg/mL安比西林的LB琼脂培养盘(LB-AMP)上分离。使用含有适当表达质体的单菌落大肠杆菌BL21(DE3)来接种5mL LB-Amp培养基，将其在37℃下培育过夜。使用5mL培养物的1％接种物来接种100mLLB-Amp培养基中，将其在37℃下培育持续8小时，并接种四个含有1000ml LB-Amp培养基的2.8L锥形瓶。将培养物在30℃和130rpm下培育，直至其OD600达到0.6与0.8之间，此时通过添加异丙基-b-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷到最终浓度是25μM，并在恒定震荡下(130rpm)在30℃下再培养12小时。通过在5000g和4℃下离心15分钟来收集细胞，且以冷冻球粒形式在储存-80℃下1小时。从每1000ml培养物中收集约8g湿细胞。

为了纯化非His标记的FOX，将来自4L生长的细胞再悬浮于pH为7.5的100mL 25mM磷酸钾缓冲液(补充有100mM NaCl、10％甘油及4μg/mL溶菌酶)中。通过超声处理进行细胞裂解，接着添加1.5％硫酸链霉素以沉淀核酸。硫酸铵沉淀是50％到70％。将来自70％硫酸铵沉淀的球粒状蛋白质再悬浮于补充有100mM NaCl的10mL的25mM磷酸钾缓冲液pH 7.5中，并针对补充有100mM NaCl的10mM乙酸钠缓冲液pH 4.0透析两次。透析后，将样品在10,000g下离心以去除残渣，且储存在4℃下直至需要。

测定FOX浓度使用考马斯(Coomassie)蛋白质分析试剂，以牛血清白蛋白为标准，通过布拉德福(Bradford)分析来测定纯化FOX酶储备液的总蛋白浓度。通过以下测定8-fFAD与FOX的摩尔比：在100℃下通过热变性10分钟从FOX中提取8-fFAD，离心沉淀，且使用如所属领域所述的450nm下9000M^-1cm^-1的摩尔消光系数估算溶解物的8-fFAD总浓度。根据这些测量，与黄素结合的活性FOX的摩尔消光系数在472nm下测定为10,200M^-1cm^-1。

FOX活性分析使用配备有DW1电极腔室和S1电极的Hansatech Oxygraph进行FOX活性分析，以测定在采用0.2μM与黄素结合的FOX、在50mM乙酸盐(pH 4.0)中溶解氧(0.22mM)和甲酸钠(100mM)的溶液中消耗O₂量的初始速率。所有分析均在25℃下进行三次。

技术中使用的纯化FOX的实例：使四(4)升含有重组his标记的WT FOX_AO基因的BL21(DE3)培养物生长，且如上文所述对his标记的WT FOX进行表达和纯化。纯化产生含有14mg/mL FOX酶溶液的3mL亮黄色溶液。这一酶储备液用于如下文所述的二氧化硅负载。

实例2：制备醇/醛氧化酶(AOX)

正在生长的野生型GS113毕赤酵母菌株在甲醇诱导下在过氧化物酶体中过度产生AOX。收集含有AOX的细胞团并在-80℃下储存。使用珠磨器和玻璃珠破坏细胞以释放AOX，并使用分级硫酸铵沉淀使可溶性AOX纯化，随后再缓冲并进行PEG 4000沉淀以浓缩AOX。AOX可在PEG 4000处理后再溶解，其它蛋白质则不能。为了进一步增强AOX能力，可使用45％蔗糖或45％海藻糖作为赋形剂使AOX稳定。已显示增强AOX稳定性的不同配制物。所述酶可以呈其液体形式使用，或被冷冻干燥，随后以其干燥形式再溶解或施加。随后，可使用本文所述的分析法，使用这些制剂中的任一种来消除醇或醛，特别是消除甲醛。

实例3：来自毕赤酵母(Komagataella pastoris)的新AOX变异体的发酵、纯化和克隆

使用如先前所述的经典毕赤酵母实验方案，使用毕赤酵母菌株GS113进行6L发酵。使用半合成培养基使菌株发酵并产生AOX。培养基由补充有甘油、磷酸和痕量盐的基础盐培养基组成，参见表1。用200ml过夜培养物接种发酵液，并在48小时后，以18ml/hr/L施加甘油进料50％甘油储备液，持续8小时，直至毕赤酵母达到对数中期至末期，并停止高速耗氧。在整个发酵中，使用浓氨水进料(28％NH3)将pH值调至4.5。通过pO₂比率调节进料，通过甲醇进料以递增的控制方式(使进料自1ml/h/L增加到3ml/h/L)起始AOX的诱导，且再持续48小时。随后收集细胞并在-80℃下储存。

表1：发酵基础盐培养基，用28％氨水溶液将pH调到4.5

组分	g/L(对于1L发酵培养基)
		85％磷酸	26.7
硫酸钙	0.93
		硫酸钾	18.2
硫酸镁×7H<sub>2</sub>O	14.9
		氢氧化钾	4.13
甘油	40
		自来水，未蒸馏	补足至1升

在50mM HEPES(pH 6.5)+10mM KCl+5mM MgCl₂+50mM NaCl+5％甘油于珠粒与细胞悬浮液(50/50)的混合物中，使用珠磨器(Hamilton Beach)和玻璃珠Zirkon 0.5mm(Biospec)在4℃下使毕赤酵母细胞分解。使用离心从残渣分离所得的粗提取物，随后施加一系列硫酸铵沉淀，首先达到35％，随后达到45％，最后达到60％。AOX主要沉淀45％，其中一些与过氧化氢酶一起沉淀60％。

将盐析出的蛋白针对pH 8.0的10mM Na₂HPO₄/柠檬酸缓冲并添加10％PEG 4000，其将所有蛋白质沉淀出。离心后，将AOX溶解于pH为8.0的10mM Na₂HPO₄/柠檬酸中，接着离心未溶解的沉淀污染物，从而回收AOX。这一制剂对于进一步实验来说是足够纯的。

为了获得甚至更纯的AOX，使用这一制剂进行柱色谱法，其涉及在pH为8.0的50mMTEA中用1.5M(NH₄)₂SO₄进行苯基琼脂糖柱色谱且降低盐梯度。在0.6M(NH₄)₂SO₄下洗脱AOX。图1中突出显示了不同步骤。图3从左到右展示了从粗制剂(1道)到苯基琼脂糖色谱法(5道)的AOX(80kD的主带)的纯度增加。在最终步骤之后达成完全纯度。1道：粗提取物，2道：蛋白标记物(Novagen)，3道：45％(NH₄)₂SO₄沉淀，4道：60％(NH₄)₂SO₄沉淀，5道：苯基琼脂糖。

以牛血清白蛋白为标准，使用具有Coomassie G250的布拉德福方法测定AOX蛋白浓度。通过测定过氧化氢形成来测量AOX活性，过氧化氢是在醇/醛氧化期间以化学计量形成的。将10mM甲醛添加到0.6mM 4-氨基安替比林和7mM苯酚于pH为8.0的0.2M Na₂HPO₄/柠檬酸和0.14mg辣根过氧化物酶(24U/mg)的衬底溶液中。添加10μl的AOX使反应开始，如所属领域所述在500nm下通过分光光度观察到醌亚胺染料的形成。

流程1：基于醌亚胺染料形成，AOX的活性分析

AOX变异体的克隆：可产生新的AOX变异体，具体地说改善热稳定性的变异体，例如AOX序列内的R241K，以改善甲醛消除。使用与重叠PCR组合的标准定点突变诱发产生变异体，随后在大肠杆菌中克隆和筛选。随后选择已并入突变的阳性突变体，将其转换到AOX缺失型毕赤酵母菌株(如KM71H)中，随后测试活性。对于每种可能的突变，对来自毕赤酵母转换的3种不同克隆进行表达且比较活性。选择活性最高的一者并测试热稳定性。

使用RNA制剂和cDNA转化方案，从毕赤酵母分离AOx1基因。简而言之，从毕赤酵母的过夜培养物中分离RNA，用0.5％甲醇诱导。使用

纯化试剂盒(Qiagen)分离RNA。使用MMLV转录酶和Advantage^TM RT的PCR试剂盒(Clontech)，随即将RNA用于逆转录反应。将所得的cDNA用于具有AOX特异性引物的常规PCR中，以从cDNA库中获得AOX基因。随后使用Electra^TM克隆试剂盒(DNA2.0)将基因克隆到Electra^TM载体p902中，并将所得的阳性克隆转换到感受态毕赤酵母KM71H细胞(AOX1缺陷型)中。随后测试克隆的AOX活性。使用基因特异性突变引物和重叠PCR方案产生AOX变异体。将所得的突变型AOX基因再次克隆到p902中，随后在大肠杆菌中选择阳性克隆后，将所得的变异体AOX质体转换到感受态毕赤酵母中。

实例4：R241K AOX的热稳定性

本发明人将R241K AOX鉴别为热稳定AOX变异体。尽管WT和R241K变异体AOX在冻干之后具有活性，但在50℃下储存24小时后，相较于WT，R241K呈现出更好的活性。通过流程1中描绘的分析法来测定活性。

为了测定糖稳定剂的效应，将AOX变异体进行部分纯化，在35重量％稳定剂的存在下冷冻干燥，并在50℃下培育干燥持续指定时间。如表2所示，尤其在糖稳定剂存在下，相较于WT和N218D变异体，R241K变异体呈现出稳定性改善。

表2：在糖稳定剂存在下，50℃下的AOX的残留的活性

AOX	稳定剂	24小时(％)	4天(％)	4周(％)
					WT	无	0	0	0
R241K	无	25	0	0
					WT	蔗糖	100	100	22
WT	海藻糖	75	21	0
					N281D	蔗糖	80	67	10
N281D	海藻糖	15	10	7
					R241K	蔗糖	100	100	25
R241K	海藻糖	53	10	0

％＝残留的活性

震荡生长瓶并部分纯化后，对R241K突变体重复稳定性实验，在稳定剂存在下冷冻干燥，并在室温下与乳胶(70％剥离的Rhoplex^TM)于液体中培育持续指定时间。.具体来说，将冻干的AOX-R241K溶解于45％的蔗糖溶液中，随后在30℃下与剥离的Rhoplex^TM以每体积1:4体积混合。定期测量残留的活性。结果在表3中给出。

表3：在糖稳定剂存在下，50℃下于乳胶粘合剂中的AOX的残留活性

样品	稳定剂	24小时(％)	48小时(％)	3周(％)
					WT	无	0	0	-
R241K	无	25	13	0
					R241K	蔗糖	50	46	0

在相同生长和纯化条件下，相较于WT AOX，R241K是更具活性及稳定性的变异体。碳水化合物稳定剂可提高在较高温度下和于80％乳胶中(但不以组合形式)的稳定性。在长期研究中，45％蔗糖提供最佳结果。

实例5：制备二氧化硅载体和固定酶

介孔泡沫(MCF)二氧化硅根据所属领域已知的方案合成。将

123(16g)溶解于去离子水(260g)和HCl(48g)的溶液中，并在P123溶解时，添加1,3,5-三甲基苯(16g)。使溶液的温度升高到40℃且剧烈搅拌2小时。将原硅酸四乙酯(34.7g)添加到溶液中，再搅拌5分钟，并在40℃下静置过夜。以矿化剂形式添加NH₄F(184mg)于20mL去离子水的溶液，搅拌五分钟，并在100℃下静置过夜。将所得的固体过滤并用大量去离子水洗涤，接着在75℃下加热过夜，且在550℃下在空气中以1.2℃min^-1的升温速率煅烧。

将FOX负载到二氧化硅上将MCF二氧化硅在1.7mL微量离心管中称出50mg部分，直至达成所期望总量的二氧化硅。通过首先用pH为7的0.1M磷酸钾缓冲液稀释，将FOX负载到二氧化硅载体上，直至浓度接近4mg/mL。向每个离心管中添加1mL FOX溶液，并将管置于管旋转器(VWR)中过夜。在从旋转器取出后，使所有管离心并收集过量缓冲溶液。随后将负载酶的二氧化硅再分散于缓冲溶液中，离心，并收集洗涤。将这一过程再重复两次。

制备2mg/mL的FOX标准溶液，总共1mL，使用UV-Vis光谱法测定FOX负载。已知当负载到二氧化硅上时FOX的初始浓度，将洗涤稀释，直至获得理论2mg/ml溶液。相较于已知2mg/ml浓度，对洗涤的UV-Vis分析可测定酶的负载。如先前FOX所提及，使用配备有DW1电极腔室和S1电极的Hansatech Oxygraph进行活性分析，以测定消耗O₂的初始速率。分析溶液含有pH为4的980μL的0.1M乙酸盐缓冲液、10μL的5M甲酸钠水溶液和10μL的FOX溶液(来自洗涤、标准或二氧化硅浆料)。

将AOX负载到二氧化硅上类似于FOX，首先将AOX用pH为7的0.1M磷酸钾缓冲液稀释，直至浓度接近8mg/mL。使用1mL的AOX溶液对两个离心管进行组合，并将管置于前述管旋转器中过夜。随后如先前所提及用FOX洗涤和分析负载有酶的二氧化硅。用含有pH为7的980μL 0.1M磷酸钾缓冲液、10μL的1M甲醛水溶液和10μL的AOX溶液(来自洗涤、标准或二氧化硅浆料)的溶液进行AOX活性分析。使用二氧化硅浆料再次测试FOX活性分析，以确保FOX在AOX负载之后保持固定和活性。

实例6：制备生物活性涂层和检测来自¹³C标记的甲醛的¹³C标记的CO₂

将生物活性涂层(400mg的AOX+负载有FOD的MCF二氧化硅，其悬浮于pH为7的1mL0.1M磷酸钾缓冲液中，随后与1mL未剥离的Rhoplex^TM丙烯酸粘合剂混合扩散到表面上，直至其厚度是约0.1mm且允许干燥)封闭于气体取样袋(Tedlar 10L，Restek公司)中。将酶负载到不具有胺的裸MCF上。将取样袋切开，以施加涂层并热密封。为了制备生物活性涂层，使用pH为7的1mL 0.1M磷酸钾缓冲液和1mL的Rhoplex^TM丙烯酸粘合剂，使所期望量的负载有酶的二氧化硅混合。混合后，使用厚度是0.1mm的塑料涂药器(Thomas Scientific)，使500μL等分试样沿取样袋的内部散布。使涂层干燥，且在完全热封之前，添加两个0.65mL微量离心管，每个离心管中装有30μL的20％经¹³C标记的甲醛水溶液(剑桥同位素)。还制备了对照袋进行分析，且对照袋包括仅具有含有¹³C甲醛溶液的瓶的取样袋和具有¹³C甲醛溶液和1mL的乳胶+pH为7的1mL 0.1M磷酸钾缓冲液(未负载有酶的二氧化硅)的取样袋。

将样品袋密封后，将其转移到用不含CO₂的加湿空气吹扫的手套箱中，以免干扰样品分析。用不含CO₂的空气吹扫样品袋多次，且使用LI-840A IR气体分析仪(Li-Cor)分析，以确保袋中CO₂量低于5ppm。随后使用气体取样泵(Grab Air取样泵，SKC公司)和质量流量计(FMA1814，Omega Engineering公司)，用8L空气填充样品袋，并打开经¹³C标记的甲醛溶液的瓶，以达成最优1,000ppm。

24小时后，将样品袋从手套箱中取出，并使用气体取样泵(Grab Air取样泵，SKC公司)通过质谱法(OmniStar^TM气体分析系统，Pfeiffer Vacuum)进行分析，以提取气体含量。在24小时和48小时之后监测经¹³C标记的甲醛量和经¹³C标记的CO₂量。

质谱结果(图4)展示了通过AOX酶和FOX酶将经¹³C标记的甲醛转化成经¹³C标记的CO₂，所述AOX酶和FOX酶被负载于MCF二氧化硅粒子上，分散于乳胶介质中，随后在表面上干燥为涂层形式。参考数字401、403、405、407、409和411均为环境条件。402是¹³C甲醛，404是¹³C甲醛加Rhoplex^TM，406是¹³C甲醛加Rhoplex^TM加200mg MCF(具有AOX/FOD)，408是¹³C甲醛加Rhoplex^TM加400mg MCF(具有AOX/FOD)，且210是¹³C甲醛加Rhoplex^TM(不具有AOX/FOD)，质量45峰(经CO₂标记峰；底部痕迹)超过对照的峰，同时质量31峰(经甲醛标记；顶部痕迹)降低表明转化。最后一次测试(乳胶中的不含酶)表明需要MCF二氧化硅组分进行可检测的转化。

通过以下实施例进一步说明本揭示。

实施例1一种用于将甲醛转化成二氧化碳的涂层，所述涂层包含：醇/醛氧化酶和甲酸盐氧化酶，其中所述醇/醛氧化酶和所述甲酸盐氧化酶都被固定于固体颗粒载体上；以及乳胶粘合剂。

实施例2根据实施例1所述的涂层，其中所述醇/醛氧化酶与SEQ ID NO:1所示醇/醛氧化酶具有超过95％的序列同源性，具体来说与SEQ ID NO:1具有超过99％的序列同源性。

实施例3根据实施例1所述的涂层，其中所述醇/醛氧化酶具有含R241K突变或N218D突变的SEQ ID NO:1。

实施例4根据实施例1所述的涂层，其中甲酸盐氧化酶具有SEQ ID NO:2。

实施例5根据实施例1到4中任一项或多项所述的涂层，其中所述固体颗粒载体是无机载体，优选地是多孔无机载体。

实施例6根据实施例5所述的涂层，其中所述无机颗粒载体的粒径是0.1到800微米，优选地是0.5到100微米，且其孔径是50埃到200纳米，优选地是100埃到50纳米。

实施例7根据实施例1到6中任一项或多项所述的涂层，其中所述固体颗粒载体包含二氧化硅，优选地，其中所述二氧化硅是介孔泡沫、多孔微球、多孔核-壳粒子、多孔纳米粒子、具有多孔二氧化硅层的粒子或包含前述至少一种的组合。

实施例8根据实施例1到7中任一项或多项所述的涂层，其中所述乳胶粘合剂是丙烯酸乳胶、丙烯腈-丁二烯乳胶、醇酸树脂乳胶、乙烯-乙酸乙烯酯乳胶、天然橡胶乳胶、氯丁橡胶乳胶、聚酰胺乳胶、聚丁二烯乳胶、聚丁烯乳胶、聚氯丁二烯乳胶、聚酯乳胶、聚异戊二烯乳胶、聚丙烯乳胶、聚氨酯乳胶、聚乙烯醇乳胶、聚乙烯醇缩丁醛乳胶、聚氯乙烯乳胶、聚偏二氯乙烯乳胶、有机硅乳液乳胶、苯乙烯-丙烯酸乳胶、苯乙烯-丙烯腈乳胶、苯乙烯-丁二烯橡胶乳胶、苯乙烯-异戊二烯乳胶、乙酸乙烯酯乳胶、乙烯-丙烯酰基乳胶或包含前述至少一种的组合，优选地，其中所述乳胶粘合剂包含丙烯酸乳胶、苯乙烯-丙烯酸乳胶、乙酸乙烯酯乳胶或包含前述至少一种的组合。

实施例9根据实施例1到8中任一项或多项所述的涂层，其中所述涂层还包含酶稳定剂、塑化剂、流变改性剂、增稠剂、成膜剂、表面活性剂、防腐剂、杀生物剂、防霉剂、着色剂、消泡剂、分散剂、缓干剂、增量剂、pH调节剂、蜡或包含前述至少一种的组合。

实施例10根据实施例1到9中任一项或多项所述的涂层，其中所述酶稳定剂包含单糖、二糖或含有3到10个单糖单元的低聚糖，优选地，其中所述酶稳定剂包括蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖、木糖醇、甘露糖、棉籽糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖或包含前述至少一种的组合，更优选地，其中所述酶稳定剂是蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇或包含前述至少一种的组合。

实施例11根据实施例1到10中任一项或多项所述的涂层，其中所述涂层是用于建筑物内部的涂料。

实施例12根据实施例1到11中任一项或多项所述的涂层，其中如根据ASTM D2244测量，相较于不含酶的对照，所述涂层具有由CIELAB度量DE定量的小于5，优选小于2的色差。

实施例13根据实施例1到12中任一项或多项所述的涂层，其中如根据测试方法JC/T 1074-2008以分光光度法测定，空气中的甲醛是以去除空气中甲醛起始水平的至少75％定义的消除效率来消除。

实施例14一种用于形成根据实施例1到13中任一项或多项所述的涂层的液体涂层组合物，其包含：固定于固体颗粒载体上的醛氧化酶和甲酸盐氧化酶；以及液体乳胶粘合剂组合物。

实施例15一种用于形成涂层的方法，所述方法包含：将根据实施例14所述的液体涂层组合物涂布到衬底上；以及干燥液体涂层组合物，以形成涂层。

实施例16一种用于将大气甲醛转化成二氧化碳的方法，所述方法包含：使根据实施例1到13中任一项或多项所述的涂层与包含甲醛的大气接触；以及将所述甲醛的至少一部分转化成二氧化碳。

实施例17根据实施例16所述的方法，其中所述大气是在建筑物内部。

实施例18一种醇/醛氧化酶，其具有含R241K突变或N218D突变的SEQ ID NO:1。

组合物、方法和制品可替代地包含本文所公开的任何适当组件或步骤、由本文所公开的任何适当组件或步骤组成或主要由本文所公开的任何适当组件或步骤组成。组合物、方法和制品可另外或替代地配制，以便不含或大体上不含实现组合物、方法和制品的功能或目标原本不需要的任何步骤、组分、材料、成分、佐剂或物质。

本文所公开的所有范围均包括端点，并且端点可彼此独立地组合在一起。“组合”包括掺合物、混合物、合金、反应产物等等。术语“第一”、“第二”等等并不表示任何顺序、数量或重要性，而是用来表示将一种元素与另一种区别。除非本文中另有说明或与上下文清楚地相矛盾，否则本文中的术语“一(a/an)”和“所述”不表示数量的局限性，且应理解为覆盖单数和复数两者。除非另有明确说明，否则“或”表示“和/或”。

除非另外规定，否则本文中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解相同的含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用整体并入。然而，如果本申请案中的术语与所并入的参考文献中的术语矛盾或冲突，那么来自本申请案的术语优先于来自所并入的参考文献的冲突术语。

尽管已经描述特定实施例，但申请人或其它所属领域的技术人员可产生当前未预见到或可能当前未预见到的替代物、修饰、变化、改善和基本上等效物。因此，如提交并且如其可以被修正的所附权利要求书旨在涵盖所有所述替代方案、修改、变化、改善和实质性等同方案。

序列表

<110> 陶氏环球技术有限责任公司

罗门哈斯公司

乔治亚技术研究公司

Roper, III, John A.

Bommarius, Andreas S.

Bommarius, Bettina R.

Holewinski, Adam

Jones, Christopher W.

Murdock, Christopher R.

Nomura, Akihiro

Robbins, John M.

Balijepalli, Sudhakar

Doll, Paul

<120> 用于清除醛的涂层及其制备方法

<130> DC60036PCT

<160> 5

<170> 3.5版PatentIn

<210> 1

<211> 663

<212> PRT

<213> 毕赤酵母

<400> 1

Met Ala Ile Pro Glu Glu Phe Asp Ile Leu Val Leu Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Ser Gly Ser Cys Ile Ala Gly Arg Leu Ala Asn Leu Asp His Ser Leu

20 25 30

Lys Val Gly Leu Ile Glu Ala Gly Glu Asn Asn Leu Asn Asn Pro Trp

35 40 45

Val Tyr Leu Pro Gly Ile Tyr Pro Arg Asn Met Lys Leu Asp Ser Lys

50 55 60

Thr Ala Ser Phe Tyr Thr Ser Asn Pro Ser Pro His Leu Asn Gly Arg

65 70 75 80

Arg Ala Ile Val Pro Cys Ala Asn Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Ile

85 90 95

Asn Phe Met Met Tyr Thr Arg Gly Ser Ala Ser Asp Tyr Asp Asp Phe

100 105 110

Gln Ala Glu Gly Trp Lys Thr Lys Asp Leu Leu Pro Leu Met Lys Lys

115 120 125

Thr Glu Thr Tyr Gln Arg Ala Cys Asn Asn Pro Asp Ile His Gly Phe

130 135 140

Glu Gly Pro Ile Lys Val Ser Phe Gly Asn Tyr Thr Tyr Pro Val Cys

145 150 155 160

Gln Asp Phe Leu Arg Ala Ser Glu Ser Gln Gly Ile Pro Tyr Val Asp

165 170 175

Asp Leu Glu Asp Leu Val Thr Ala His Gly Ala Glu His Trp Leu Lys

180 185 190

Trp Ile Asn Arg Asp Thr Gly Arg Arg Ser Asp Ser Ala His Ala Phe

195 200 205

Val His Ser Thr Met Arg Asn His Asp Asn Leu Tyr Leu Ile Cys Asn

210 215 220

Thr Lys Val Asp Lys Ile Ile Val Glu Asp Gly Arg Ala Ala Ala Val

225 230 235 240

Arg Thr Val Pro Ser Lys Pro Leu Asn Pro Lys Lys Pro Ser His Lys

245 250 255

Ile Tyr Arg Ala Arg Lys Gln Ile Val Leu Ser Cys Gly Thr Ile Ser

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Arg Ala Ala Gly Val Lys Pro Leu Val Asn Leu Pro Gly Val Gly Arg

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Asn Phe Gln Asp His Tyr Cys Phe Phe Ser Pro Tyr Arg Ile Lys Pro

305 310 315 320

Gln Tyr Glu Ser Phe Asp Asp Phe Val Arg Gly Asp Ala Glu Ile Gln

325 330 335

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340 345 350

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Phe His Phe Leu Glu Tyr Pro Phe Ser Arg Gly Ser Ile His Ile Thr

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His Pro Leu Phe Pro Tyr Ser Ser Glu Ala Arg Ala Leu Glu Met Asp

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<212> PRT

<213> 米曲霉

<400> 2

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Leu Asn Phe Phe Ala Asn Asp Leu Asp Ile Ile Ala Met Arg Glu Gly

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Leu Val Glu Ser Glu Tyr Pro Trp Glu Met Pro Leu Asp Ser Asp Lys

485 490 495

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Leu Tyr

<210> 3

<211> 1734

<212> DNA

<213> 米曲霉

<400> 3

atggcaaccg atggtagcca ttttgatttt gttattgttg gtggtggcac cgcaggtaat 60

accgttgcag gtcgtctggc agaaaatccg aatgttaccg ttctgattgt tgaagccggt 120

attggtaatc cggaagatat cccggaaatt accaccccga gcagcgcaat ggatctgcgt 180

aatagcaaat atgattgggc ctataaaacc accatggttc gtcgtgatga ttatgaacgt 240

attgaaaaac cgaatacccg tggtaaaacc ctgggtggta gcagcagcct gaactatttt 300

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gcagtgggtg aaaaatgtgc cgatatgatt aaagccgaac acaaagacct gtat 1734

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 4

cacaaagacc tgtattaagc cgcactggag cac 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 引物

<400> 5

gtgctcgagt gcggcttaat acaggtcttt gtg 33

Claims

1.一种用于将甲醛转化成二氧化碳的涂层，所述涂层包含：

醇/醛氧化酶和甲酸盐氧化酶，其中所述醇/醛氧化酶和所述甲酸盐氧化酶都被固定于固体颗粒载体上；以及

乳胶粘合剂;

其中所述醇/醛氧化酶是通过醛将醇氧化成其酸及通过消耗分子氧等摩尔产生过氧化氢。

2.根据权利要求1所述的涂层，其中所述醇/醛氧化酶由SEQ ID NO: 1组成。

3.根据权利要求1所述的涂层，其中所述醇/醛氧化酶由含R241K突变或N218D突变的SEQ ID NO: 1组成。

4.根据权利要求1所述的涂层，其中所述甲酸盐氧化酶由SEQ ID NO: 2组成。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的涂层，其中所述固体颗粒载体是无机载体。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的涂层，其中所述固体颗粒载体是多孔无机载体。

7.根据权利要求5所述的涂层，其中无机颗粒载体的粒径是0.1到800微米，且其孔径是50埃到200纳米。

8.根据权利要求5所述的涂层，其中无机颗粒载体的粒径是0.5到100微米，且其孔径是100埃到50纳米。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的涂层，

其中所述固体颗粒载体包含二氧化硅。

10.根据权利要求9所述的涂层，其中所述二氧化硅是介孔泡沫、多孔微球、多孔核-壳粒子、多孔纳米粒子、具有多孔二氧化硅层的粒子或包含前述至少两种的组合。

11.根据权利要求1至4中任一项所述的涂层，

其中所述乳胶粘合剂是丙烯酸乳胶、丙烯腈-丁二烯乳胶、醇酸树脂乳胶、乙烯-乙酸乙烯酯乳胶、天然橡胶乳胶、氯丁橡胶乳胶、聚酰胺乳胶、聚丁二烯乳胶、聚丁烯乳胶、聚氯丁二烯乳胶、聚酯乳胶、聚异戊二烯乳胶、聚丙烯乳胶、聚氨酯乳胶、聚乙烯醇乳胶、聚乙烯醇缩丁醛乳胶、聚氯乙烯乳胶、聚偏二氯乙烯乳胶、有机硅乳液乳胶、苯乙烯-丙烯酸乳胶、苯乙烯-丙烯腈乳胶、苯乙烯-丁二烯橡胶乳胶、苯乙烯-异戊二烯乳胶、乙酸乙烯酯乳胶、乙烯-丙烯酰基乳胶或包含前述至少两种的组合。

12.根据权利要求1至4中任一项所述的涂层，其中所述乳胶粘合剂包含丙烯酸乳胶、苯乙烯-丙烯酸乳胶、乙酸乙烯酯乳胶或包含前述至少两种的组合。

13.根据权利要求1至4中任一项所述的涂层，其中所述涂层还包含酶稳定剂、塑化剂、流变改性剂、增稠剂、成膜剂、表面活性剂、防腐剂、杀生物剂、防霉剂、着色剂、消泡剂、分散剂、缓干剂、增量剂、pH调节剂、蜡或包含前述至少两种的组合。

14.根据权利要求13所述的涂层，

其中所述酶稳定剂包含单糖、二糖或含有3到10个单糖单元的低聚糖。

15.根据权利要求13所述的涂层，其中所述酶稳定剂包括蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖、木糖醇、甘露糖、棉籽糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖或包含前述至少两种的组合。

16.根据权利要求1至4中任一项所述的涂层，其中根据ASTM D2244测量，相较于不含酶的对照，所述涂层具有由CIELAB度量DE定量的小于5的色差。

17.根据权利要求1至4中任一项所述的涂层，其中根据ASTM D2244测量，相较于不含酶的对照，所述涂层具有由CIELAB度量DE定量的小于2的色差。

18.根据权利要求1至4中任一项所述的涂层，其中根据测试方法JC/T 1074-2008以分光光度法测定，空气中的甲醛是以去除空气中甲醛起始水平的至少75%所定义的消除效率来消除。

19.一种用于形成根据权利要求1至18中任一项所述的涂层的液体涂层组合物，其包含：

固定于固体颗粒载体上的醇/醛氧化酶和甲酸盐氧化酶；以及

液体乳胶粘合剂组合物。

20.一种用于形成涂层的方法，所述方法包含：

将根据权利要求19所述的液体涂层组合物涂布到衬底上；以及

干燥所述液体涂层组合物，以形成所述涂层。

21.一种用于将大气甲醛转化成二氧化碳的方法，所述方法包含：

使根据权利要求1至18中任一项所述的涂层与包含甲醛的大气接触；以及

将所述甲醛的至少一部分转化成二氧化碳。