CN110747239A - 富含Sn-2位ARA的微生物油脂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种富含Sn‑2位ARA的微生物油脂及其制备方法和应用。所述微生物油脂中甘油三酯Sn‑2位上ARA的比例不低于23％，所述微生物油脂的制备方法包括将高山被孢霉菌株接种到发酵培养基中发酵制得，所述高山被孢霉菌株为保藏编号为GDMCC No.60734的高山被孢霉(Mortierella alpina)。该微生物油脂中甘油三酯Sn‑2位上ARA的比例显著高于甘油三酯Sn‑1、Sn‑3位上ARA的比例，从而使该微生物油脂中ARA的人体吸收率明显高于常规菌株生产的微生物油脂，促进人体对功能性脂肪酸ARA的吸收与利用。

Description

富含Sn-2位ARA的微生物油脂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种富含Sn-2位ARA的微生物油脂及其制备方法和应用
背景技术
脂类是人体不可缺少的营养素之一，它不但供给身体能量，还是构成细胞、组织不可或缺的原料，也能提供脂溶性维生素。但是要在体内发挥这些重要作用，首先要被肠道消化、吸收，脂类的消化、吸收主要在小肠中进行，参与消化、吸收的有胰腺与小肠的脂肪酶类、胆汁中的胆酸盐，而胰腺与胆汁分泌碳酸氢盐形成的碱性环境，也是不可缺少的环境条件。脂类被人体吸收的效率取决于参与消化的各种酶及其作用机制、以及脂类的结构形式。大量的研究表明，脂类的结构形式很大程度上影响了人体对脂类的吸收率。甘油三酯结构的脂类，根据脂类在甘油骨架中的结合位置，分为Sn-1、Sn-2、Sn-3位脂肪酸，胰腺脂肪酶这一主要的脂肪消化酶，通过吸附在油水界面来发挥作用，同时它具有专一的酯键分解作用，即只专注水解Sn-1、Sn-3的酯键，因此，甘油三酯结构的油脂经胰腺脂肪酶分解后，Sn-1、Sn-3位脂肪酸形成游离的脂肪酸、Sn-2位脂肪酸形成单甘油酯，而呈游离态的脂肪酸难以渗入胆盐微胶粒被人体吸收，从而容易与肠道中钙、镁离子结合形成不溶性的皂盐损失掉，而Sn-2位脂肪酸形成单甘油酯易渗入胆盐微胶粒被人体吸收，所以Sn-2位脂肪酸比Sn-1、Sn-3位脂肪酸具有更高的人体吸收率。
微生物油脂作为脂类的一种，含有丰富的多不饱和脂肪酸，随着人们保健意识的加强，已被广泛应用于婴幼儿食品、保健食品中，其营养功效愈来愈得到公众的认识、认可，而微生物油脂中功能因子-多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸(ARA)、二十二碳六烯酸(DHA)的吸收率也愈来愈为公众所关注。微生物油脂中90％以上的脂肪酸是甘油三酯结构形式，而目前的微生物油脂中脂肪酸在甘油骨架上的分布比例是Sn-2位脂肪酸的比例远远低于Sn-1、Sn-3位脂肪酸的比例，大量Sn-1、Sn-3位脂肪酸在人体消化过程中因形成皂盐而损失，使微生物油脂的保健功效受到了限制。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的微生物油脂中甘油三酯Sn-1、Sn-3位脂肪酸的比例高导致人体对脂肪酸的吸收率低的问题，提供一种富含Sn-2位ARA的微生物油脂及其制备方法和应用，该微生物油脂通过高山被孢霉发酵生产，且油脂中甘油三酯Sn-2位上ARA的比例不低于23％，有效提高ARA的人体吸收率。
为了实现上述目的，本发明提供了一种富含Sn-2位ARA的微生物油脂，所述微生物油脂中甘油三酯Sn-2位上ARA的比例不低于23％，且甘油三酯型ARA含量不低于38％。
本发明进一步提供了上述微生物油脂的制备方法，该方法包括将高山被孢霉菌株接种到发酵培养基中发酵制得，所述高山被孢霉菌株为保藏编号为GDMCC No.60734的高山被孢霉(Mortierella alpina)。
优选地，所述发酵培养基包括碳源、氮源，发酵的条件包括温度为27-31℃、时间为4-8天，通气比为0.5-1.1VVM、碳氮比为(3-18)：1、接种量为5-10％。
优选地，所述高山被孢霉菌株经活化、扩培成种子液后，接种到发酵培养基中发酵。
优选地，所述活化、扩培包括如下步骤：
(1)将所述高山被孢霉菌株接种到PDA斜面上培养至孢子生成并成熟，用无菌水洗脱获得孢子悬浮液；
(2)将步骤(1)所得的孢子悬浮液接种于摇瓶种子培养基中进行培养扩大，得到摇瓶种子液；
(3)将步骤(2)所得的摇瓶种子接入第一级种子罐中培养，培养1-2天后接入第二级种子罐中培养1-2天，形成所述种子液。
优选地，所述步骤(1)包括：将所述高山被孢霉接种于PDA试管斜面上在25-30℃培养5-7天，将生成的孢子转接至PDA茄子瓶斜面上在25-30℃培养4-6天至生成成熟的孢子，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水配制成所述孢子悬浮液。
优选地，所述步骤(2)包括：将步骤(1)所得的孢子悬浮液接种到摇瓶种子培养基中进行培养，培养温度为27-31℃、培养时间为3-6天，摇床振荡速度为180-200r/min，所述摇瓶种子培养基中碳源为50-70g/L、氮源为15-25g/L、pH为7.5-8.5。
优选地，所述步骤(3)中，所述第一级种子罐和所述第二级种子罐的培养条件包括：温度为27-31℃、时间为1-2天、通气比为0.5-0.8VVM、碳氮比为(3-8):1。
优选地，所述碳源为葡萄糖或/和淀粉，所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆粉中的一种或多种。
优选地，该方法还包括对所述发酵的产物进行萃取得到所述发酵的产物中的油脂产物。
本发明进一步提供了由上述方法制备的甘油三酯型微生物油脂，其甘油骨架上Sn2位ARA的含量不低于23％,且甘油三酯型ARA含量不低于38％。
本发明进一步提供了由上述方法制备的甘油三酯型微生物油脂在食品中的应用，所述食品优选为婴幼儿配方食品、保健食品以及健康食品。
通过上述技术方案，本发明提供的利用高山被孢霉菌株发酵生产的微生物油脂不仅富含ARA，而且甘油三酯Sn-2位上ARA的比例显著高于甘油三酯Sn-1、Sn-3位上ARA的比例，提高人体对该微生物油脂中ARA的吸收率，从而有效促进人体对功能脂肪酸ARA的吸收与利用。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明的菌株如下：
高山被孢霉(Mortierella alpina)，于2019年8月8日被保藏在广东省微生物菌种保藏中心(地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮政编码：510070)(保藏单位的缩写为GDMCC)，保藏编号为GDMCC No.60734。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种富含Sn-2位ARA的微生物油脂，所述微生物油脂中甘油三酯Sn-2位上ARA的比例不低于23％。
本发明进一步提供了上述微生物油脂的制备方法，该方法包括将高山被孢霉菌株接种到发酵培养基中发酵制得，所述高山被孢霉菌株为保藏编号为GDMCC No.60734的高山被孢霉(Mortierella alpina)。
本发明提供的高山被孢霉经过发酵产生富含ARA的微生物油脂，所述发酵的方法没有特别的要求，只要是能使所述高山被孢霉增殖即可。
其中，所述高山被孢霉发酵的温度、时间、通气量和碳氮比没有特别的要求，可以是获得高山被孢霉发酵产物常用的选择，为了获得较多的发酵产物，优选地，所述发酵培养基包括碳源、氮源，发酵的条件包括温度为27-31℃、时间为4-8天、通气比为0.5-1.1VVM、碳氮比为(3-18)：1、接种量为5-10％。
其中，所述高山被孢霉接种到发酵培养基中发酵的过程中，在发酵培养基中一次性投入配方所需的氮源；碳源除发酵培养基中的基础投加量以外，还可以在发酵过程中根据碳氮比的要求不断补充碳源，在接近发酵终点时不再补充碳源直至培养基中残糖含量为0，以此来调控碳氮比形成营养缺陷型营养条件，以确保高山被孢霉发酵产油量的水平。
为了获得较多的发酵产物，所述高山被孢霉菌株经活化、扩培成种子液后，接种到发酵培养基中发酵。
优选地，所述活化、扩培包括如下步骤：
(1)将所述高山被孢霉菌株接种到PDA斜面上培养至孢子生成并成熟，获得孢子悬浮液；
(2)将步骤(1)所得的孢子悬浮液接种于摇瓶种子培养基中培养获得摇瓶种子液；
(3)将步骤(2)所得的摇瓶种子液接入第一级种子罐中培养1-2天后，接入第二级种子罐中培养1-2天，形成所述种子液。
进一步优选地，所述步骤(1)包括：将所述高山被孢霉接种于PDA试管斜面上在25-30℃培养5-7天，将生成的孢子转接至PDA茄子瓶斜面上在25-30℃培养4-6天至生成成熟的孢子，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水配制成所述孢子悬浮液。
进一步优选地，所述步骤(2)包括：将步骤(1)所得的孢子悬浮液接种到摇瓶种子培养基中进行培养，培养温度为25-30℃、培养时间为3-6天，摇床振荡速度为180-200r/min，所述摇瓶种子培养基中碳源为50-70g/L、氮源为15-25g/L、pH为6.8-7.2。具体地，摇瓶种子培养基中的接种量按每支茄子瓶种子接2-3个三角瓶的方式，其中，茄子瓶和三角瓶的规格均为500mL。
具体地，所述步骤(3)中，所述第一级种子罐和所述第二级种子罐的培养条件包括：温度为27-31℃、时间为1-2天、通气比为0.5-0.8VVM、碳氮比为(3-8):1。
本发明中所述碳源可以为葡萄糖、淀粉或其他任何可以提供碳源的物质，氮源可以为蛋白胨、酵母粉、玉米浆粉或其他任何可以提供氮源的物质。优选地，所述碳源为葡萄糖或/和淀粉，所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆粉中的一种或多种。
本发明可以进一步对上述发酵的产物进行处理，以获得微生物油脂，所述处理的方法没有特别的限制，只要是能从所述发酵的产物中将微生物油脂分离即可，为了获得较高的微生物油脂收率，所述处理包括对所述发酵的产物进行萃取得到所述发酵的产物中的油脂产物。
本发明进一步提供了由上述的方法制备得到的甘油三酯型微生物油脂，其甘油骨架上Sn-2位ARA的含量不低于23％。
本发明进一步提供了由上述方法制备的甘油三酯型微生物油脂在食品中的应用，所述食品优选为婴幼儿配方食品、保健食品或健康食品。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，微生物油脂中ARA的含量及脂肪酸组分测定通过采用“GB5009.168-2016食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定”的方法测定；Sn2位脂肪酸含量采用“GB/T24984-2010/ISO6800：1997动植物油脂甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定”的方法测定；甘油三酯Sn-1、Sn-3位上ARA的比例是在全样脂肪酸、Sn-2位脂肪酸分析测定的基础上采用1，3-随机-2-随机分布学说计算而成；人体对ARA的吸收率测定方法为人体功效试验的方法：征集男女志愿者食用本专利方法生产的ARA油脂和常规菌株生产的ARA油脂，然后抽取血液测定ARA脂肪酸含量来计算吸收率；高山被孢霉常规菌株来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌株编号为CICC 11092s；葡萄糖、淀粉、酵母粉、酵母浸膏、蛋白胨、玉米浆粉、马铃薯、琼脂均为市售品。
本发明实施例中PDA培养基的配方为：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂15-17g、水1000mL。
实施例1-实施例3用于说明本发明的高山被孢霉发酵所得微生物油脂的制备方法。
实施例1
(1)分别将高山被孢霉常规菌株和本发明所使用的高山被孢霉菌株(保藏编号为GDMCC No.60734)接种到PDA试管斜面上在27℃培养5天，将生成的孢子转接至PDA培养基茄子瓶斜面上在27℃培养4天至生成成熟的孢子，取下培养基上的菌丝和孢子，用20mL无菌水配制成孢子悬浮液。
(2)将步骤(1)所得的孢子悬浮液接种到放有种子培养基的摇瓶中进行培养获得种子液，接种量按每支PDA茄子瓶种子接2-3个三角瓶的方式，置于温度为27℃、振荡速度为180r/min的摇床上培养4天，种子培养基中碳源为葡萄糖50g/L、氮源为酵母粉15g/L、pH为7.2。
(3)1M3第一级种子罐中装有500L种子罐培养基，种子罐培养基中碳源为葡萄糖为30g/L、氮源为酵母浸膏15g/L、pH为7.2，将1L步骤(2)中所得的种子液接入第一级种子罐中，以温度为29℃、搅拌速度为180r/min、通气量为0.65vvm的条件培养2天后，转接入第二级种子罐中。
(4)10M3第二级种子罐中装有7M3种子培养基，培养基中碳源为葡萄糖30g/L、氮源为酵母浸膏15g/L、pH为7.2，将500L步骤(3)中所得的第一级种子罐培养液接入第二级种子罐中，以温度为29℃、搅拌速度为120r/min、通气量为0.65vvm的条件培养2天、待菌丝浓度≥3.5％后，转接入主发酵罐中。
(5)45M3主发酵罐中装有22M3发酵培养基，发酵罐培养基中碳源为蔗糖50g/L、氮源为酵母浸膏15g/L、pH为7.5，将2M3步骤(4)中所得的第二级种子罐培养液接入主发酵罐中，以温度为29℃、搅拌速度为90r/min、通气量为0.9vvm、碳氮比为(8-16):1的条件发酵培养6天，发酵过程中流加葡萄糖浓度为250g/L的无菌糖液以控制碳氮比，最终获得发酵液；
(6)将步骤(5)所得的发酵液分离，得到湿菌体，烘干得到干菌体，利用正己烷作为萃取剂萃取干菌体中的油脂，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取4-7次，控制萃取后的残渣中残油含量＜7％，萃取时溶剂与干菌体的比例为1.5:1，将每次萃取后过滤分离得到的混合油脱溶，得到微生物油酯。
(7)将步骤(6)所得的微生物油脂进行ARA含量、脂肪酸组分和油脂中甘油三酯Sn-2位ARA的比例分析测定，结果见表1。
表1实施例1中微生物油脂中各参数的数据
Figure BDA0002289899270000081
实施例2
(1)分别将高山被孢霉常规菌株和本发明所使用的高山被孢霉菌株(保藏编号为GDMCC No.60734)接种到PDA试管斜面上在28℃培养6天，将生成的孢子转接至PDA培养基茄子瓶斜面上在28℃培养5天至生成成熟的孢子，取下培养基上的菌丝和孢子，用20mL无菌水配制成孢子悬浮液。
(2)将步骤(1)所得的孢子悬浮液接种到放有种子培养基的摇瓶中进行培养获得种子液，接种量按按每支茄子瓶种子接2-3个三角瓶的方式，置于温度为28℃、振荡速度为200r/min的摇床上培养5天，种子培养基中碳源为葡萄糖60g/L、氮源为酵母粉10g/L、蛋白胨10g/L，pH为7.0。
(3)5L种子罐中装有3L种子罐培养基，种子罐培养基中碳源为葡萄糖35g/L、氮源为酵母粉20g/L、pH为7.2，将200mL步骤(2)中所得的种子液接入种子罐中，以温度为28℃、搅拌速度为200r/min、通气量为0.6vvm的条件培养1天后，转接入发酵罐中；
(4)30L发酵罐中装有15L发酵培养基，发酵培养基中碳源为葡萄糖50g/L、淀粉10g/L、氮源为酵母浸膏20g/L、pH为8，将1.5L步骤(3)中所得的种子罐培养液接入发酵罐中，以温度为28℃、搅拌速度为220r/min、通气量为0.8vvm、碳氮比为(5-12):1的条件培养7天，发酵过程中流加葡萄糖浓度为250g/L的无菌糖液以控制碳氮比，最终获得发酵液；
(5)将步骤(4)所得的发酵液分离，得到湿菌体，烘干得到干菌体，利用正己烷作为萃取剂萃取干菌体中的油脂，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取4-7次，控制萃取后残渣中残油含量＜7％，萃取时溶剂与干菌体的比例为1.5:1，将每次萃取后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油酯。
(6)将步骤(5)所得的微生物油脂进行ARA含量、脂肪酸组分和油脂中甘油三酯Sn-2位ARA的比例分析测定，结果见表2。
表2实施例2中微生物油脂中各参数的数据
Figure BDA0002289899270000101
实施例3
(1)分别将高山被孢霉常规菌株和本发明所使用的高山被孢霉菌株(保藏编号为GDMCC No.60734)接种到PDA试管斜面上在29℃培养7天，将生成的孢子转接至PDA培养基茄子瓶斜面上在29℃培养6天至生成成熟的孢子，取下培养基上的菌丝和孢子，用20mL无菌水配制成孢子悬浮液。
(2)将步骤(1)所得的孢子悬浮液接种到放有摇瓶种子培养基的摇瓶中进行培养获得种子液，接种量按按每支PDA茄子瓶种子接2-3个三角瓶的方式，置于温度为29℃、振荡速度为190r/min的摇床上培养6天，种子培养基中碳源为葡萄糖60g/L、淀粉10g/L、氮源为酵母粉25g/L、pH为7.2。
(3)10L种子罐中装有6L种子罐培养基，种子罐培养基中碳源为葡萄糖40g/L、氮源为酵母粉25g/L、pH为6.8，将300mL步骤(2)中所得的种子液接入种子罐中，以温度为30℃、搅拌速度为220r/min、通气量为0.75vvm的条件培养2天后，转接入发酵罐中。
(4)100L发酵罐中装有55L发酵罐培养基，发酵罐培养基中碳源为葡萄糖45g/L，氮源为玉米浆粉10g/L、蛋白胨10g/L、pH为7.0，将2.75L步骤(3)中所得的种子罐培养液接入发酵罐中，以温度为30℃、搅拌速度为200r/min、通气量为0.85vvm、碳氮比为(3-10):1的条件培养5天，发酵过程中流加葡萄糖浓度为250g/L的无菌糖液以控制碳氮比，最终获得发酵液；
(5)将步骤(4)所得的发酵液分离，得到湿菌体，烘干得到干菌体，利用正己烷作为萃取剂萃取干菌体中的油脂，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取4-7次，萃取时溶剂与干菌体的比例为1.5:1，控制萃取后残渣中残油含量＜7％，将每次萃取后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油酯。
(6)将步骤(5)所得的微生物油脂进行ARA含量、脂肪酸组分和油脂中甘油三酯Sn-2位ARA的比例分析测定，结果见表3。
表3实施例3中微生物油脂中各参数的数据
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种富含Sn-2位ARA的微生物油脂，其特征在于，所述微生物油脂中甘油三酯Sn-2位上ARA的比例不低于23％。
2.权利要求1所述的微生物油脂的制备方法，其特征在于，该方法包括将高山被孢霉菌株接种到发酵培养基中发酵制得，所述高山被孢霉菌株为保藏编号为GDMCC No.60734的高山被孢霉(Mortierella alpina)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括碳源、氮源，发酵的条件包括温度为27-31℃、时间为4-8天、通气比为0.5-1.1VVM、碳氮比为(3-18)：1、接种量为5-10％。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述高山被孢霉菌株经活化、扩培成种子液后，接种到所述发酵培养基中发酵。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述活化、扩培包括如下步骤：
(1)将所述高山被孢霉菌株接种到PDA斜面上培养至孢子生成并成熟，用无菌水洗脱获得孢子悬浮液；
(2)将步骤(1)所得的孢子悬浮液接种于摇瓶种子培养基中进行培养扩大，得到摇瓶种子液；
(3)将步骤(2)所得的摇瓶种子液接入第一级种子罐中培养1-2天后，接入第二级种子罐中培养1-2天，形成所述种子液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：将所述高山被孢霉接种于PDA试管斜面上在25-30℃培养5-7天，将生成的孢子转接至PDA茄子瓶斜面上在25-30℃培养4-6天至生成成熟的孢子，取下培养基上的菌丝和孢子，用无菌水配制成所述孢子悬浮液。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：将步骤(1)所得的孢子悬浮液接种到摇瓶种子培养基中进行培养，培养温度为25-30℃、培养时间为5-8天，摇床振荡速度为180-200r/min，所述摇瓶种子培养基中碳源为50-70g/L、氮源为15-25g/L、pH为6.5-7.2。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述第一级种子罐和所述第二级种子罐的培养条件包括：温度为27-31℃、时间为1-2天、通气比为0.5-0.8VVM、碳氮比为(3-8):1。
9.根据权利要求3、7或8所述的方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖或/和淀粉，所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆粉中的一种或多种。
10.根据权利要求2所述的方法，该方法还包括对所述发酵的产物进行萃取得到所述发酵的产物中的油脂产物。
11.由权利要求2-10中任意一项所述的方法制备的甘油三酯型微生物油脂，其甘油骨架上Sn-2位ARA的含量不低于23％，且甘油三酯型ARA含量不低于38％。
12.权利要求11所述的甘油三酯型微生物油脂在食品中的应用，所述食品优选为婴幼儿配方食品、保健食品以及健康食品。
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