BR112020002448A2 - processo para produção de óleos de ácido graxo poli-insaturado concentrado - Google Patents

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Abstract

A presente invenção se refere a composições de óleo que são enriquecidas em ácidos graxos poli-insaturados; composições contendo as composições de óleo; e métodos para produzir e usar as composições de óleo. De preferência, o óleo é um óleo microbiano ou marinho.

Description

"PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ÓLEOS DE ÁCIDO GRAXO POLI- INSATURADO CONCENTRADO" REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisório nº US 62/542.053 depositado em 7 de agosto de 2017, cuja revelação é incorporada no presente documento a título de referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente revelação se refere a composições de óleo que são enriquecidas em ácidos graxos poli- insaturados, particularmente ácido araquidônico; composições contendo as composições de óleo; e métodos para produzir e usar as composições de óleo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] Os ácidos graxos são classificados com base nas características de comprimento e saturação da cadeia de carbono. Os ácidos graxos são denominados ácidos graxos de cadeia curta, de cadeia média ou de cadeia longa com base no número de carbonos presentes na cadeia, são denominados ácidos graxos saturados quando não há ligações duplas ou triplas entre os átomos de carbono e são denominados ácidos graxos insaturados quando estão presentes ligações duplas ou triplas. Os ácidos graxos insaturados de cadeia longa são monoinsaturados quando apenas uma ligação dupla ou tripla está presente e são poli-insaturados quando mais de uma ligação dupla ou tripla está presente.
[0004] Os ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) são classificados com base na posição da primeira ligação dupla da extremidade de metila do ácido graxo; ácidos graxos ômega-3 (n-3) contêm uma primeira ligação dupla no terceiro carbono, contando a partir do terminal metila, enquanto ácidos graxos ômega-6 (n-6) contêm uma primeira ligação dupla no sexto carbono. Por exemplo, o ácido docosa- hexaenoico (“DHA”) é um ácido graxo ômega-3 poli-insaturado de cadeia longa (AGPI-CL), com um comprimento de cadeia de 22 carbonos e 6 ligações duplas, frequentemente designado como “22:6 n-3”. Outros AGPI-CL ômega-3 incluem ácido eicosapentaenoico (“EPA”), designado como “20:5 n-3” e ácido ômega-3 docosapentaenoico (“DPA n-3”), designado como “22:5 n-3”. Os AGPI-CL ômega-6 incluem ácido araquidônico (“ARA”), designado como “20:4 n-6” e ácido ômega-6 docosapentaenoico (“DPA n-6”), designado como “22:5 n-6”.
[0005] O ácido araquidônico (ARA, 20:4 n-6) é um LC-PUFA que pertence à categoria ômega-6. Essa molécula pode ser submetida à mono-oxigenação ou epoxidação por enzimas na família do citocromo P450 (CYP450) e os metabólitos têm diferentes funções biológicas com base em sítios de produção - o endotélio de vasos em muitos órgãos, os pulmões, o epitélio tubular e da córnea, o fígado, etc. Os alvos prováveis são enzimas (Na+-K+-ATPase) ou canais iônicos (canais de potássio ativados por cálcio). O músculo esquelético é um sítio especialmente ativo de retenção de ácido araquidônico. Além de estar envolvido em uma sinalização celular como um segundo mensageiro de lipídio envolvido na regulação de enzimas de sinalização, como isoformas PLC-γ, PLC-δ, e PKC-α, -β, e -γ, o ácido araquidônico é um intermediário inflamatório essencial e age como um vasodilatador.
[0006] Os óleos concentrados de ARA poderiam ser usados individualmente como um bloco de construção para moléculas especializadas de ingrediente farmacêutico ativo (API), por exemplo, aqueles direcionados ao gerenciamento de dor, inflamação, doenças neurológicas e cerebrais e comprometimento cognitivo. Também poderiam ser usados como suplemento alimentar individualmente, em combinação com ômega-3, ômega-7 e outras substâncias adequadas para prevenção ou gerenciamento de dor e inflamação, doenças neurológicas e cerebrais e comprometimento cognitivo. O acesso a esse concentrado de ARA traz possibilidades adicionais, por exemplo, fabricação de outras formas de ARA altamente potentes.
[0007] Os métodos para concentrar ácidos graxos ômega-3, como EPA e DHA, a partir de óleos de partida são conhecidos e são relativamente simples, resultando em mais de 95 % de potência. No entanto, a concentração de ARA representa um desafio significativamente maior, geralmente devido à composição do óleo de partida que é tipicamente obtido da fermentação do fungo do gênero Mortierella.
[0008] Então, permanece uma necessidade de métodos para concentrar ARA a partir de um óleo de partida para obter óleos de ARA de alta potência em um rendimento considerável.
[0009] A solução para esse problema técnico é fornecida pelas modalidades caracterizadas nas reivindicações.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0010] O presente pedido se refere a um processo para a produção de óleo rico em ARA a partir de um óleo de partida, por exemplo, um óleo obtido da fermentação de Mortierella alpina. Geralmente, o processo compreende transesterificação de um óleo de partida para sua forma de éster etílico correspondente, por exemplo, com o uso de etanol seco na presença de etóxido de sódio, sucedida por destilação, por exemplo, evaporação por filme fino, destilação fracionada ou destilação de caminho curto. O destilado é então submetido a uma primeira etapa de complexação de ureia com o uso, por exemplo, de ureia em etanol a 95 %. Após o isolamento do intermediário, o intermediário é adicionalmente fracionado por cromatografia de fase reversa em metanol/água sob condições isocráticas. As frações adequadas são coletadas, concentradas e submetidas a uma segunda etapa de complexação de ureia, com o produto isolado e estabilizado.
[0011] O presente pedido também revela óleos produzidos pelo processo descrito no presente documento.
[0012] O presente pedido revela adicionalmente óleos microbianos que compreendem pelo menos cerca de 70 % em peso de ARA. Em particular, o óleo microbiano pode ser obtido a partir de um ou mais microrganismos, como, por exemplo, microalgas, bactérias, fungos e protistas. Em algumas modalidades, o microrganismo é um fungo. Em uma modalidade preferencial, o fungo é do gênero Mortierella. Em uma modalidade mais preferencial, o microrganismo é da espécie Mortierella alpina.
[0013] Também são fornecidos produtos alimentares, cosméticos ou composições farmacêuticas para um ser não humano ou humano que compreendem os óleos descritos no presente documento. Em algumas modalidades, o produto alimentar é um leite, uma bebida, uma bebida terapêutica, uma bebida nutricional ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferencial, o produto alimentar é uma fórmula infantil ou um suplemento alimentar.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0014] Para uma compreensão adicional da natureza, dos objetivos e das vantagens da presente revelação, deve ser feita referência à descrição detalhada a seguir, lida em conjunto com os desenhos a seguir, nos quais referências numéricas semelhantes denotam elementos semelhantes.
[0015] A FIG. 1 mostra um processo exemplificativo da invenção.
[0016] A FIG. 2 mostra um processo comparativo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0017] Antes que a revelação em questão seja adicionalmente descrita, deve-se compreender que a revelação não é limitada às modalidades particulares da revelação descrita abaixo, já que variações das modalidades particulares podem ser feitas e ainda estarem dentro do escopo das reivindicações anexas. Também deve ser entendido que a terminologia empregada tem uma finalidade de descrever modalidades particulares e não se destina a ser limitativa. Em vez disso, o escopo da presente revelação será estabelecido pelas reivindicações anexas.
[0018] Neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “a” e “o” incluem várias referências a menos que o contexto indique claramente o contrário. A menos que seja definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que aquele comumente entendido por um indivíduo de habilidade comum na técnica a que esta revelação pertence.
[0019] A revelação em questão apresenta, em um aspecto, um processo para a produção de um óleo rico em ácido graxo poli-insaturado de cadeia longa (LC-PUFA). Em uma modalidade preferencial, o LC-PUFA é um ácido graxo ômega-
6. Em uma modalidade mais preferencial, o LC-PUFA é o ácido araquidônico (ARA).
[0020] Composição de Óleo de Partida
[0021] Em algumas modalidades, o óleo de partida é um óleo microbiano ou marinho.
[0022] O óleo produzido por um microrganismo ou obtido a partir de uma célula microbiana é referido como “óleo microbiano”. O óleo produzido por algas e/ou fungos é referido como um óleo de algas e/ou um óleo fúngico, respectivamente.
[0023] Conforme usado neste documento, um “microrganismo” se refere aos organismos como algas, bactérias, fungos, protistas, leveduras e combinações destes, por exemplo, organismos unicelulares. Um microrganismo inclui, porém sem limitação, algas douradas (por exemplo, microrganismos do reino Stramenopiles); algas verdes; diatomáceas; dinoflagelados (por exemplo, microrganismos da ordem Dinophyceae, incluindo membros do gênero Crypthecodinium, como, por exemplo, Crypthecodinium cohnii ou C. cohnii); microalgas da ordem Thraustochytriales; levedura (Ascomycetes ou Basidiomycetes); e fungos dos gêneros Mucor, Mortierella, incluindo, porém sem limitação, Mortierella alpina e Mortierella sect. schmuckeri, e Pythium, incluindo porém sem limitação Pythium insidiosum.
[0024] Em uma modalidade, os microrganismos são do gênero Mortierella, gênero Crypthecodinium, gênero Thraustochytrium, e misturas dos mesmos. Em uma modalidade adicional, os microrganismos são de Crypthecodinium Cohnii. Em uma modalidade adicional, os microrganismos são de Mortierella alpina. Ainda em uma modalidade adicional, os microrganismos são de Schizochytrium sp. Ainda em uma outra modalidade adicional, os microrganismos são selecionados a partir de Crypthecodinium Cohnii, Mortierella alpina, Schizochytrium sp. e misturas dos mesmos.
[0025] Ainda em uma modalidade adicional, os microrganismos incluem, porém sem limitação, microrganismos que pertencem ao gênero Mortierella, gênero Conidiobolus, gênero Pythium, gênero Phytophthora, gênero Penicillium, gênero Cladosporium, gênero Mucor, gênero Fusarium, gênero Aspergillus, gênero Rhodotorula, gênero Entomophthora, gênero Echinosporangium e gênero Saprolegnia.
[0026] Em ainda outra modalidade adicional, os microrganismos são de microalgas da ordem Thraustochytriales, a qual inclui, porém sem limitação, os gêneros Thraustochytrium (as espécies incluem arudimentale, aureum, benthicola, globosum, kinnei, motivum, multirudimentale, pachydermum, proliferum, roseum, striatum); os gêneros Schizochytrium (as espécies incluem aggregatum, limnaceum, mangrovei, minutum, octosporum); os gêneros Ulkenia (as espécies incluem amoeboidea, kerguelensis, minuta, profunda, radiate, sailens, sarkariana, schizochytrops, visurgensis, yorkensis); os gêneros Aurantiacochytrium; os gêneros Oblongichytrium; os gêneros Sicyoidochytium; os gêneros Parientichytrium; os gêneros Botryochytrium; e combinações dos mesmos. As espécies descritas em Ulkenia serão consideradas como membros do gênero Schizochytrium. Em outra modalidade, os microrganismos são da ordem Thraustochytriales. Ainda em outra modalidade, os microrganismos são de Thraustochytrium. Ainda em uma modalidade adicional, os microrganismos são de Schizochytrium sp.
[0027] Em algumas modalidades, o óleo pode compreender um óleo marinho. Exemplos de óleos marinhos adequados incluem, sem limitação, óleo de peixe do Atlântico, óleo de peixe do Pacífico ou óleo de peixe do Mediterrâneo, ou qualquer mistura ou combinação destes. Em exemplos mais específicos, um óleo de peixe adequado pode ser, sem limitação, óleo de pollock, óleo de bonito, óleo de sardinha europeia, óleo de tilápia, óleo de atum, óleo de badejo, óleo de linguado, óleo de peixe-espada, óleo de barracuda, óleo de bacalhau, óleo de savelha, óleo de sardinha, óleo de anchova, óleo de capelin, óleo de arenque, óleo de cavala, óleo de salmonídeo, óleo de atum e óleo de tubarão, incluindo qualquer mistura ou combinação destes. Outros óleos marinhos adequados para uso aqui incluem, sem limitação, óleo de lula, óleo de peixe choco, óleo de polvo, óleo de krill, óleo de foca, óleo de baleia e semelhantes, incluindo qualquer mistura ou combinação destes.
[0028] Esterificação
[0029] Em algumas modalidades, um ácido graxo, conforme descrito aqui, pode ser um éster ou éster de ácido graxo. Em algumas modalidades, um éster de ácido graxo inclui um éster de um ácido graxo ômega-3, ácido graxo ômega-6 e combinações destes. Em algumas modalidades, o éster de ácido graxo é um éster de ARA.
Em algumas modalidades, um óleo ou fração deste, conforme descrito aqui, é esterificado para produzir um óleo ou uma fração deste compreendendo ésteres de ácidos graxos.
O termo “éster” se refere à substituição do hidrogênio no grupo ácido carboxílico da molécula de ácido graxo por outro substituinte.
Exemplos de ésteres incluem éster metílico, etílico, propílico, butílico, pentílico, t-butílico, benzílico, nitrobenzílico, metoxibenzílico, benzidrílico e tricloroetílico.
Em algumas modalidades, o éster é um grupo éster protetor do ácido carboxílico, ésteres com aralquila (por exemplo, benzílico, fenetílico), ésteres com alquenila inferior (por exemplo, alílico, 2-butenílico), ésteres com alcóxi inferior-alquila inferior (por exemplo, metoximetílico, 2-metoxietílico, 2-etoxietílico), ésteres com alcanoilóxi inferior-alquila inferior (por exemplo, acetoximetílico, pivaloiloximetílico, 1- pivaloiloxietílico), ésteres com alcoxicarbonila inferior- alquila inferior (por exemplo, metoxicarbonilmetílico, isopropoxicarbonilmetílico), ésteres com carboxi-alquila inferior (por exemplo, carboximetílico), ésteres com alcoxicarboniloxi inferior-alquila inferior (por exemplo, 1- etoxicarboniloxi)etílico, 1-(ciclo- hexiloxicarboniloxi)etílico, ésteres com carbamoiloxi- alquila inferior (por exemplo, carbamoiloximetílico) e semelhantes.
Em algumas modalidades, o substituinte adicionado é um grupo hidrocarboneto linear ou cíclico, por exemplo, uma C1-C6 alquila, C1-C6 cicloalquila, C1-C6 alquenila ou C1-C6 éster arílico.
Em algumas modalidades, o éster é um éster alquílico, por exemplo, um éster metílico,
éster etílico ou éster propílico. Em algumas modalidades, o substituinte éster é adicionado à molécula de ácido graxo livre quando o ácido graxo está em um estado purificado ou semipurificado.
[0030] Ésteres de ácidos graxos, em especial os ésteres de ácidos graxos poli-insaturados, podem ser fabricados em formas que são conhecidas por técnicos no assunto.
[0031] Por exemplo, tri-acil glicerídeos, di-acil glicerídeos e/ou mono-acil-glicerídeos que contêm ácidos graxos, particularmente ácidos graxos poli-insaturados, podem reagir com um álcool na presença de um ácido ou de uma base para produzir ésteres. A revelação da Publicação nº US 2009/0023808 é incorporada a título de referência no presente documento em sua totalidade.
[0032] A base pode ser, por exemplo, um alquilóxido de metal. Os alquilóxidos de metais incluem etóxido de sódio, metóxido de sódio, n-propóxido de sódio, iso-propóxido de sódio, n-butóxido de sódio, iso-butóxido de sódio, sec- butóxido de sódio, terc-butóxido de sódio, n-pentóxido de sódio, n-hexóxido de sódio, etóxido de lítio, metóxido de lítio, n-propóxido de lítio, iso-propóxido de lítio, n- butóxido de lítio, iso-butóxido de lítio, sec-butóxido de lítio, terc-butóxido de lítio, n-pentóxido de lítio, n- hexóxido de lítio, etóxido de potássio, metóxido de potássio, n-propóxido de potássio, iso-propóxido de potássio, n-butóxido de potássio, iso-butóxido de potássio, sec-butóxido de potássio, terc-butóxido de potássio, n- pentóxido de potássio e/ou n-hexóxido de potássio.
[0033] Em algumas situações, a base pode ser produzida pela adição de sódio metálico, potássio metálico ou lítio metálico a uma solução alcoólica.
[0034] Em algumas situações, a base pode ser produzida pela adição de um hidreto metálico, tal como hidreto de lítio, hidreto de sódio ou hidreto de potássio, a uma solução alcoólica.
[0035] A proporção de base para óleo, em uma base peso para peso pode estar na faixa de, por exemplo, 1:1 a 1000:1, incluindo todos os valores e intervalos entre eles, como se estes fossem explicitamente listados. Por exemplo, a proporção de base para óleo em uma base peso:peso pode ser de 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1, 200:1, 300:1, 400:1, 500;1, 600:1, 700:1, 800:1, ou 900:1.
[0036] A reação de esterificação pode ser realizada a uma temperatura variando de 10 °C a 100 °C, incluindo todos os valores e intervalos entre eles, como se estes fossem explicitamente listados. Por exemplo, a reação de esterificação pode ser executada a 20 °C, 30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C ou 90 °C.
[0037] A reação de esterificação pode ser realizada em atmosfera aberta, ou em uma atmosfera inerte, tal como nitrogênio ou argônio.
[0038] O processamento e o isolamento dos ésteres de ácidos graxos podem ser feitos de maneiras conhecidas por técnicos no assunto, por exemplo, por extração com um solvente, água ou um fluido supercrítico. O solvente orgânico pode ser, por exemplo, pentano, hexano, éter dietílico, acetato de etila ou uma combinação destes. Opcionalmente a água pode conter outras substâncias tais como bicarbonato de sódio, carbonato de sódio, cloreto de amônio e/ou ácido mineral diluído. O fluido supercrítico pode ser, por exemplo, dióxido de carbono.
[0039] Em algumas modalidades, por vezes o óleo é transesterificado de volta para converter pelo menos parte da fração éster no óleo a uma fração triglicerídeo. A transesterificação, em particular a transesterificação dos ésteres de ácidos graxos poli-insaturados, pode ser realizada de maneiras conhecidas por um técnico no assunto.
[0040] Destilação
[0041] Em algumas modalidades, o processo compreende submeter o óleo a pelo menos uma etapa de destilação que compreende fornecer o óleo esterificado a pelo menos um aparelho e submeter o óleo esterificado a condições para remover compostos com baixo ponto de ebulição em um destilado.
[0042] A etapa de destilação pode ser destilação fracionada, destilação de caminho curto, evaporação de filme descendente, evaporador de filme fino, ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferencial, a etapa de destilação é destilação fracionada. Em outra modalidade preferencial, a etapa de destilação é a destilação de caminho curto.
[0043] A destilação pode ser realizada por qualquer meio conhecido por aqueles de habilidade comum na técnica.
[0044] Complexação de ureia
[0045] Em algumas modalidades, o processo compreende submeter o óleo a pelo menos uma etapa de complexação de ureia. Em uma modalidade preferencial, o processo compreende pelo menos duas etapas de complexação de ureia. A complexação de ureia pode ser realizada com o uso de qualquer método conhecido por aqueles que são versados na técnica.
[0046] O termo “complexo de ureia/óleo” é usado de modo análogo no presente documento a “aduto de ureia” ou “clatrato.” O complexo de ureia/óleo pode ser produzido em uma etapa de processamento de óleo comercial ou laboratorial em que os óleos de qualquer uma dentre uma variedade de fontes são colocados em contato com ureia. A ureia forma preferencialmente um complexo com ésteres/ácidos graxos saturados e monoinsaturados no óleo e é denominado complexo de ureia/óleo ou aduto de ureia. Então, o complexo de ureia/óleo é uma composição contendo ureia e ésteres/ácidos graxos saturados e/ou monoinsaturados. Embora a fração remanescente do óleo seja rica em PUFAs, alguns PUFAs podem ser complexados com a ureia e podem se tornar parte do complexo de ureia/óleo. Os solventes também são usados nesse processo e então o solvente residual é frequentemente uma parte do complexo de ureia/óleo. Os métodos revelados começam então com um complexo de ureia/óleo que compreende ureia, ésteres/ácidos graxos saturados e monoinsaturados que são associados à ureia, uma quantidade residual de solvente e opcionalmente uma quantidade residual indesejável de PUFAs.
[0047] A ureia que pode ser usada para formar o complexo de ureia/óleo pode ser obtida a partir de uma variedade de fontes comerciais. Exemplos de fontes adequadas para ureia incluem Acros Organics (Morris Plains, N.J.), Fisher Scientific (Pittsburgh, Pa.) ou Sigma Aldrich (St. Louis, Mo.).
[0048] A ureia e o óleo podem ser combinados na presença de um solvente para formar o complexo de ureia/óleo. Então, como resultado do uso de solvente na produção do complexo de ureia/óleo, o complexo pode compreender, e de fato o faz com frequência, quantidades residuais de solvente. Em algumas modalidades, o solvente é um álcool (por exemplo, etanol). Preferencialmente, o solvente é etanol 190 proof (isto é, etanol a 95 %).
[0049] Em algumas modalidades, o complexo de ureia/óleo é preparado dissolvendo-se ureia em etanol para formar uma solução de ureia/etanol. A proporção de ureia para etanol na mistura de reação pode ser de cerca de 1:0,1 a cerca de 1:10, mais tipicamente cerca de 1:1,5. Para facilitar a dissolução da ureia em etanol, a mistura pode ser aquecida. As temperaturas adequadas nas quais o etanol e a ureia podem ser misturados incluem, porém sem limitação, de cerca de 60 °C a cerca de 100 °C, de cerca de 65 °C a cerca de 95 °C, de cerca de 70 °C a cerca de 90 °C, ou de cerca de 75 °C a cerca de 85 °C. Por exemplo, a mistura pode ser aquecida a cerca de 85 °C a cerca de 90 °C.
[0050] O óleo pode ser combinado com uma solução de ureia/etanol a uma temperatura elevada (isto é, uma solução quente de ureia/etanol) para formar o complexo. Opcionalmente, o óleo é desgaseificado e/ou aquecido antes de combinar o óleo com a solução quente de ureia/etanol. Em alguns exemplos, o óleo é aquecido a uma temperatura a cerca de 15 °C da solução quente de ureia/etanol. Por exemplo, quando a solução de ureia/etanol está a uma temperatura de cerca de 85 °C a cerca de 90 °C, o óleo pode ser aquecido a uma temperatura de cerca de 80 °C antes de combiná-lo à solução de ureia/etanol. O óleo é misturado com a solução de ureia/etanol, e permite-se que a mistura combinada resfrie para formar o complexo sólido de ureia/óleo. Os mesmos procedimentos podem ser usados com outros solventes.
[0051] A proporção da ureia para o óleo na mistura de reação pode ser de cerca de 0,1:1 a cerca de 2:1, mais tipicamente cerca de 0,5:1,5, cerca de 0,85:1, ou cerca de 1,2:1. O complexo de ureia/óleo é então usualmente separado do óleo remanescente, por exemplo, por filtração.
[0052] Os métodos revelados incluem a etapa de obter o complexo de ureia/óleo (aduto de ureia) e remover o solvente residual (por exemplo, etanol) para formar um complexo seco de ureia/óleo (também denominado “torta” de ureia). O complexo seco de ureia/óleo é substancialmente livre de solvente. Por “substancialmente livre de solvente” se quer dizer que o complexo seco de ureia/óleo contém menos de cerca de 1 % em peso, menos de cerca de 0,5 % em peso ou menos de cerca de 0,1 % em peso solvente. O solvente pode ser removido sob vácuo. As temperaturas adequadas para realizar a remoção do solvente incluem, porém sem limitação, de cerca de 4 °C a cerca de 60 °C, preferencialmente de cerca de 10 °C a cerca de 22 °C. Em outros exemplos, o solvente pode ser removido a cerca de 5 °C, cerca de 10 °C, cerca de 15 °C, cerca de 20 °C, cerca de 25 °C, cerca de 30 °C, cerca de 35 °C, cerca de 40 °C, cerca de 45 °C, cerca de 50 °C, cerca de 55 °C ou cerca de 60 °C, em que qualquer um dos valores definidos pode formar um ponto final superior e/ou inferior de uma faixa.
[0053] Após remover o solvente do complexo de ureia/óleo, o complexo seco de ureia/óleo ou torta é combinado à água. O componente de ureia do complexo seco de ureia/óleo se dissolve na água. Essa dissolução de ureia pode ser facilitada adicionalmente a uma temperatura elevada devido, em parte, à solubilidade aumentada da ureia na água em temperaturas elevadas. A solubilidade da ureia em água à temperatura ambiente é de cerca de 108 g de ureia por 100 ml de água. No entanto, a cerca de 60 °C a cerca de 80 °C, a solubilidade da ureia em água aumenta para cerca de 250 – 400 gramas de ureia por 100 ml de água. Então, em modalidade preferenciais, a etapa de combinação de água é realizada a temperaturas que incluem, porém sem limitação, de cerca de 50 °C a cerca de 80 °C, de cerca de 55 °C a cerca de 75 °C, ou de cerca de 60 °C a cerca de 70 °C. Em alguns exemplos, o complexo seco de ureia/óleo pode ser combinado com água a cerca de 50 °C, cerca de 55 °C, cerca de 60 °C, cerca de 65 °C, cerca de 70 °C, cerca de 75 °C, ou cerca de 80 °C, em que qualquer um dos valores definidos pode formar um ponto final superior e/ou inferior de uma faixa. Em alguns exemplos específicos, o complexo seco de ureia/óleo pode ser combinado com água a cerca de 60 °C a cerca de 80 °C, ou mais especificamente, de cerca de 65 °C a cerca de 75 °C ou, ainda mais especificamente, a cerca de 72 °C. Opcionalmente, a água é aquecida até a temperatura elevada e é fornecida ao complexo seco de ureia/óleo na temperatura elevada.
[0054] Devido à solubilidade aumentada da ureia em água a temperaturas elevadas, uma quantidade mínima de água pode ser usada nessa etapa para formar uma solução de ureia concentrada aquosa. A quantidade total de água adicionada dependerá evidentemente de quanta ureia está presente na torta. Em algumas modalidades, a água na etapa de combinação é fornecida a cerca de 30 % em peso a cerca de 50 % em peso do complexo seco de ureia/óleo. Por exemplo, a água pode ser fornecida a cerca de 30 %, cerca de 31 %, cerca de 32 %, cerca de 33 %, cerca de 34 %, cerca de 35 %, cerca de 36 %, cerca de 37 %, cerca de 38 %, cerca de 39 %, cerca de 40 %, cerca de 41 %, cerca de 42 %, cerca de 43 %, cerca de 44 %, cerca de 45 %, cerca de 46 %, cerca de 47 %, cerca de 48 %, cerca de 49 %, ou cerca de 50 % em peso do complexo seco de ureia/óleo, em que qualquer um dos valores definidos pode formar um ponto final superior e/ou inferior de uma faixa. Em alguns exemplos, a água na etapa de combinação é fornecida a cerca de 40 % em peso do complexo seco de ureia/óleo.
[0055] Também é possível realizar essa etapa repetidamente, isto é, combinando-se o complexo seco de ureia/óleo à água, separando-se as camadas aquosas e então combinando o complexo seco de ureia/óleo à água novamente. Adicionalmente, essa etapa pode ser realizada sob uma atmosfera de nitrogênio com agitação.
[0056] Como observado, combinar o complexo seco de ureia/óleo à água forma duas fases: uma solução de areia concentrada aquosa, contendo a ureia dissolvida, e uma fase orgânica, contendo o óleo (ácidos graxos saturados e/ou monossaturados e opcionalmente, PUFAs). Pode-se permitir então que as duas fases sejam separadas adicionalmente em uma camada aquosa e uma camada orgânica. A separação de fase pode ser realizada a uma temperatura de cerca de 50 °C a cerca de 80 °C. Por exemplo, a etapa de separação pode ser realizada a uma temperatura de cerca de 55 °C a cerca de 75 °C ou de cerca de 60 °C a cerca de 70 °C. Em alguns exemplos, pode-se permitir que as duas fases sejam separadas a cerca de 50 °C, cerca de 55 °C, cerca de 60 °C, cerca de 65 °C, cerca de 70 °C, cerca de 75 °C, ou cerca de 80 °C, em que qualquer um dos valores pode formar um ponto final superior e/ou inferior de uma faixa.
[0057] O óleo pode ser recuperado da fase orgânica, por vezes em quantidades significativas, através de lavagem com água e secagem da camada.
[0058] Métodos de Concentração
[0059] Em algumas modalidades, o processo compreende submeter o óleo por pelo menos uma etapa de concentração. Em algumas modalidades, a etapa de concentração compreende cromatografia, destilação, complexação de ureia e combinações dos mesmos.
[0060] Em uma modalidade, a etapa de concentração compreende cromatografia. Em uma modalidade preferencial, a cromatografia é cromatografia de íon de prata. Em uma modalidade mais preferencial, a cromatografia é cromatografia em leito móvel simulado. Em uma modalidade preferencial adicional, a cromatografia é cromatografia de fase reversa.
[0061] Em uma modalidade, a etapa de concentração compreende destilação. Em uma modalidade preferencial, a destilação é destilação fracionada. Em outra modalidade preferencial, a destilação é destilação de caminho curto.
[0062] Em uma modalidade, a etapa de concentração compreende complexação de ureia.
[0063] Cromatografia de fase reversa
[0064] Em algumas modalidades, o processo compreende submeter o óleo a pelo menos uma etapa de cromatografia de fase reversa. A cromatografia de fase reversa pode ser realizada com o uso de qualquer método conhecidos por aqueles que são versados na técnica.
[0065] Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia pode ter um diâmetro interno de aproximadamente 3,8 cm, um comprimento eficaz de aproximadamente 27 cm e/ou um volume de aproximadamente 313 ml.
[0066] Em algumas modalidades, a coluna de cromatografia é empacotada com uma matriz de sílica. Em uma modalidade preferencial, a matriz de sílica é um gel de sílica ligado a C18. Em uma modalidade preferencial, o tamanho de partícula da matriz é de aproximadamente 40 µm a aproximadamente 63 µm.
[0067] Em algumas modalidades, o eluente compreende metanol. Em uma modalidade preferencial, o eluente é uma mistura de metanol e água.
[0068] Em algumas modalidades, o eluente compreende pelo menos cerca de 80 % de metanol, pelo menos cerca de 85 % em peso de metanol, pelo menos cerca de 90 % em peso de metanol, ou pelo menos cerca de 95 % em peso de metanol. Em algumas modalidades, o eluente compreende pelo menos 80 % em peso de metanol, pelo menos 85 % em peso de metanol, pelo menos 90 % em peso de metanol ou pelo menos 95 % em peso de metanol.
[0069] Em algumas modalidades, o eluente compreende menos de cerca de 20 % em peso de água, menos de cerca de 15 % em peso de água, menos de cerca de 10 % em peso de água ou menos de cerca de 5 % em peso de água. Em algumas modalidades, o eluente compreende menos de 20 % em peso de água, menos de 15 % em peso de água, menos de 10 % em peso de água ou menos de 5 % em peso de água.
[0070] Em algumas modalidades, o eluente compreende de cerca de 80 % a cerca de 95 % em peso de metanol. Em uma modalidade preferencial, o eluente compreende de cerca de 90 % a cerca de 95 % em peso de metanol. Em uma modalidade mais preferencial, o eluente compreende cerca de 92 % em peso de metanol.
[0071] Em algumas modalidades, o eluente compreende de cerca de 5 % a cerca de 20 % em peso de água. Em uma modalidade preferencial, o eluente compreende de cerca de 5 % a cerca de 10 % em peso de água. Em uma modalidade mais preferencial, o eluente compreende cerca de 8 % em peso de água.
[0072] Em algumas modalidades, o óleo é eluído da coluna de cromatografia em modo isocrático.
[0073] Cromatografia em Coluna
[0074] Em algumas modalidades, o processo compreende uma cromatografia em coluna. Uma coluna é empacotada com uma fase estacionária, como gel de sílica, alumina, e / ou gel de sílica impregnada com nitrato de prata, e umedecida com um solvente ou uma mistura de solventes. O óleo contendo o produto (ou produtos) desejado é carregado na coluna e eluído com um ou mais solventes de fase móvel, como sulfóxido de dimetila, N,N-dimetil formamida, acetato de etila, hexano, metanol, acetona, etanol, propanol, tetra- hidrofurano, éter dietílico, pentano, diclorometano, clorofórmio e tetra-hidropirano.
[0075] O produto (ou produtos) desejado pode ser coletado em frações (por exemplo, em tubos de teste) e então pode ser concentrado por remoção de solvente, sob pressão reduzida ou alternativamente por sopro de uma atmosfera inerte sobre as frações coletadas para produzir um óleo enriquecido no produto (ou produtos) desejado.
[0076] Destilação Fracionada
[0077] Em algumas modalidades, o processo compreende destilação fracionada. O óleo é colocado em um frasco de aquecimento e o frasco é aquecido, opcionalmente sob pressão reduzida. Em um exemplo, o produto (ou produtos) desejado é convertido em fase de vapor quando seus pontos de ebulição são alcançados e passa por uma coluna de fracionamento, é condensado em um condensador e coletado em um frasco receptor. Em um exemplo alternativo, o produto (ou produtos) desejado permanece no frasco de aquecimento e impurezas são destiladas do produto (ou produtos) desejado.
[0078] A destilação fracionada pode ser realizada a uma temperatura na faixa de, por exemplo, 40 °C a 500 °C, incluindo todos os valores e subfaixas entre os mesmos como se explicitamente escritos. Por exemplo, a destilação fracionada pode ser realizada a 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C, 90 °C, 100 °C, 110 °C, ou 120 °C, 130 °C, 140 °C, 150 °C, 160 °C, 170 °C, 180 °C, 190 °C, 200 °C, 210 °C, 220 °C, 230 °C, ou 240 °C, 250 °C, 260 °C, 270 °C, 280 °C, 290 °C, 300 °C, 310 °C, 320 °C, 330 °C, 340 °C, 350 °C, ou 360 °C, 370 °C, 380 °C, 390 °C, 400 °C, 410 °C, 420 °C, 430 °C, 440 °C, 450 °C, 460 °C, 470 °C, 480 °C ou 490 °C.
[0079] A destilação fracionada é preferencialmente conduzida sob pressão reduzida. A pressão reduzida pode estar na faixa de 0,0001 atmosferas a 0,9 atmosferas, incluindo todos os valores e subfaixas entre os mesmos como se explicitamente escritos. Uma atmosfera é abreviada “atm” e é equivalente a 101,325 Pa. A pressão reduzida pode ser, por exemplo, de 0,001 atm, 0,01 atm, 0,1 atm, 0,2 atm, 0,3 atm, 0,4 atm, 0,5 atm, 0,6 atm, 0,7 atm ou 0,8 atm.
[0080] Extração de fase sólida
[0081] Em algumas modalidades, o processo compreende submeter o óleo a pelo menos uma etapa de extração de fase sólida. A extração de fase sólida (SPE) pode ser realizada com o uso de qualquer método conhecido por aqueles que são versados n a técnica.
[0082] Em algumas modalidades, a etapa de SPE é realizada com o uso de um cartucho de SPE de sílica.
[0083] Na presente invenção, qualquer técnica de concentração, reação e/ou purificação pode ser combinada com qualquer outra técnica de concentração, reação e/ou purificação para produzir óleos microbianos enriquecidos em: ácidos graxos poli-insaturados, seus ésteres, seus sais, aldeídos dos mesmos e/ou álcoois dos mesmos. As técnicas de enriquecimento podem ser usadas em qualquer ordem e combinação.
[0084] Composição de Óleo Resultante
[0085] Em algumas modalidades, o óleo compreende um ou mais LC-PUFAs. Em algumas modalidades, o óleo compreende pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 % ou pelo menos cerca de 99 % LC-PUFA. Em uma modalidade preferencial, o LC-PUFA está em forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferencial, o % em peso do LC-PUFA é o % em peso do óleo. Em uma modalidade mais preferencial, o % em peso do LC-PUFA é o % em peso dos ácidos graxos em uma fração de éster. Em algumas modalidades, o LC-PUFA está na forma de triglicerídeo.
[0086] Em uma modalidade, o óleo compreende pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 % de ARA. Em uma modalidade preferida, o ARA está na forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferida, o % em peso de ARA é o % em peso do óleo. Em uma modalidade mais preferida, o % em peso do ARA é o % em peso dos ácidos graxos em uma fração éster.
[0087] Em algumas modalidades, o óleo compreende cerca de 3 % a cerca de 13 %, cerca de 4 % a cerca de 12 %, cerca de 5 % a cerca de 11 %, cerca de 6 % a cerca de 10 %, ou cerca de 7 % a cerca de 9 % de ácido linoleico (“LA”). Em uma modalidade preferida, o LA está na forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferida, o % em peso do LA é o % em peso do óleo. Em uma modalidade mais preferida, o % em peso do LA é o % em peso dos ácidos graxos na fração éster.
[0088] Em algumas modalidades, o óleo compreende cerca de 0,5 % a cerca de 5 %, cerca de 1 % a cerca de 5 %, ou cerca de 3 % a cerca de 4 % de LA. Em uma modalidade preferida, o LA está na forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferida, o % em peso do LA é o % em peso do óleo. Em uma modalidade mais preferida, o % em peso do LA é o % em peso dos ácidos graxos em uma fração éster.
[0089] Em algumas modalidades, o óleo compreende menos de cerca de 5 %, menos de cerca de 4 %, menos de cerca de 3 %, menos de cerca de 2,5 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 1,5 %, menos de cerca de 1 %, ou menos de cerca de 0,5 % de EPA. Em uma modalidade preferida, o EPA está na forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferida, o % em peso do EPA é o % em peso do óleo. Em uma modalidade mais preferida, o % em peso do EPA é o % em peso dos ácidos graxos em uma fração éster.
[0090] Em algumas modalidades, o óleo compreende cerca de 0,1 % a cerca de 5 %, cerca de 0,5 % a cerca de 3 %, ou cerca de 1 % a cerca de 2 % de EPA. Em uma modalidade preferida, o EPA está na forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferida, o % em peso do EPA é o % em peso do óleo. Em uma modalidade mais preferida, o % em peso do EPA é o % em peso dos ácidos graxos em uma fração éster.
[0091] Em algumas modalidades, o óleo compreende menos de cerca de 5 %, menos de cerca de 4 %, menos de cerca de 3 %, menos de cerca de 2,5 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 1,5 %, menos de cerca de 1 %, ou menos de cerca de 0,5 % de DHA. Em uma modalidade preferida, o DHA está na forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferida, o % em peso do DHA é o % em peso do óleo. Em uma modalidade mais preferida, o % em peso do DHA é o % em peso dos ácidos graxos em uma fração éster.
[0092] Em algumas modalidades, o óleo compreende cerca de 0,1 % a cerca de 5 %, cerca de 0,5 % a cerca de 3 %, ou cerca de 1 % a cerca de 2 % de DHA. Em uma modalidade preferida, o DHA está na forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferida, o % em peso do DHA é o % em peso do óleo. Em uma modalidade mais preferida, o % em peso do DHA é o % em peso dos ácidos graxos em uma fração éster.
[0093] Em algumas modalidades, o óleo compreende menos de cerca de 5 %, menos de cerca de 4 %, menos de cerca de 3 %, menos de cerca de 2,5 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 1,5 %, menos de cerca de 1 %, ou menos de cerca de 0,5 % de ácido gamalinolênico (“GLA”). Em uma modalidade preferida, o GLA está na forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferida, o % em peso do GLA é o % em peso do óleo. Em uma modalidade mais preferida, o % em peso do GLA é o % em peso dos ácidos graxos em uma fração éster.
[0094] Em algumas modalidades, o óleo compreende menos de cerca de 5 %, menos de cerca de 4 %, menos de cerca de 3 %, menos de cerca de 2,5 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 1,5 %, menos de cerca de 1 %, ou menos de cerca de 0,5 % de ácido di- homogamalinolênico (“DGLA”). Em uma modalidade preferida, o
DGLA está na forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferida, o % em peso do DGLA é o % em peso do óleo. Em uma modalidade mais preferida, o % em peso do DGLA é o % em peso dos ácidos graxos em uma fração éster.
[0095] Em algumas modalidades, o óleo compreende menos de cerca de 5 %, menos de cerca de 4 %, menos de cerca de 3 %, menos de cerca de 2,5 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 1,5 %, menos de cerca de 1 %, ou menos de cerca de 0,5 % de ácido estearidônico (“SDA”). Em uma modalidade preferida, o SDA está na forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferida, o % em peso do SDA é o % em peso do óleo. Em uma modalidade mais preferida, o % em peso do SDA é o % em peso dos ácidos graxos em uma fração éster.
[0096] Em algumas modalidades, o compreende menos de cerca de 5 %, menos de cerca de 4 %, menos de cerca de 3 %, menos de cerca de 2,5 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 2 %, menos de cerca de 1,5 %, menos de cerca de 1 %, ou menos de cerca de 0,5 % de um ácido graxo poli- insaturado tendo uma cadeia com mais de 22 carbonos (AGPI de cadeia muito longa). Em algumas modalidades, o AGPI de cadeia muito longa é ácido 7,10,13,16,19,22,25 octacosaoctaenoico (C28:8). Em uma modalidade preferida, o óleo compreende 0 % de ácido 7,10,13,16,19,22,25 octacosaoctaenoico (C28:8). Em uma modalidade preferida, o AGPI de cadeia muito longa está na forma de éster. Em uma modalidade mais preferida, o éster é um éster etílico. Em uma modalidade preferida, o % em peso do AGPI de cadeia muito longa é o % em peso do óleo. Em uma modalidade preferida, o % em peso do AGPI de cadeia muito longa é o % em peso dos ácidos graxos em uma fração éster.
[0097] Em algumas modalidades, o óleo compreende uma fração éster em que pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 % em peso dos ácidos graxos na fração éster é ácido aeraquidônico (ARA) e a quantidade de ARA na fração éster é de pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 % em peso do total de ácidos graxos ômega-6 na fração éster. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 8 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 35 %, pelo menos cerca de 40 % em peso dos ácidos graxos na fração éster é LA. Em algumas modalidades, a quantidade de LA na fração éster é de pelo menos cerca de 2 %, pelo menos cerca de 3 %, pelo menos cerca de 4 %, pelo menos cerca de 5 %, pelo menos cerca de 10 %, pelo menos cerca de 15 %, pelo menos cerca de 20 %, pelo menos cerca de 25 % em peso do total de ácidos graxos ômega-6 na fração éster.
[0098] Em algumas modalidades, o óleo compreende uma fração éster de pelo menos cerca de 50 %, pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 % em peso do óleo. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 % em peso dos ácidos graxos na fração éster é ARA. Em algumas modalidades, de cerca de 0,5 % a cerca de 5 %, de cerca de 1 % a cerca de 5 %, de cerca de 3 % a cerca de 4 % em peso dos ácidos graxos na fração éster é LA.
[0099] Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 % em peso dos ácidos graxos na fração éster é ARA e LA.
[0100] Em algumas modalidades, o teor de ARA dos ácidos graxos na fração éster é de pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, ou pelo menos cerca de 99 % em peso da quantidade do teor de ARA e LA dos ácidos graxos na fração éster.
[0101] Em algumas modalidades, o teor de LA dos ácidos graxos na fração éster é de cerca de 0,5 % a cerca de 5 %, cerca de 1 % a cerca de 5 %, ou cerca de 3 % a cerca de 4 % do teor de ARA e LA dos ácidos graxos na fração de éster.
[0102] Em uma modalidade preferida, a fração éster é um éster etílico.
[0103] Em algumas modalidades, o valor total de isômeros do óleo é menos de 5 %, menos de 4,5 %, menos de 4 %, menos de 3,5 %, menos de 3 %, menos de 2,5 %, menos de 2 %, menos de 1,5 %, menos de 1 %, menos de 0,5 %, menos de 0,1 %, ou 0 %.
[0104] Em algumas modalidades, o valor do isômero ARA do óleo é menos de 5 %, menos de 4,5 %, menos de 4 %, menos de 3,5 %, menos de 3 %, menos de 2,5 %, menos de 2 %, menos de 1,5 %, menos de 1 %, menos de 0,5 %, menos de 0,1 %, ou 0 %.
[0105] Em algumas modalidades, a quantidade de ARA no óleo por grama de óleo é de cerca de 100 mg a cerca de 300 mg, cerca de 100 mg a cerca de 600 mg, cerca de 100 mg a cerca de 800 mg, cerca de 100 mg a cerca de 900 mg, cerca de 100 mg a cerca de 950 mg, cerca de 800 a cerca de 950 mg, ou 0 a cerca de 100 mg.
[0106] Alimento, suplemento e/ou composições farmacêuticas
[0107] Em algumas modalidades, a presente invenção é um alimento, suplemento, ou composição farmacêutica compreendendo um óleo da invenção. A composição farmacêutica pode conter um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0108] Em algumas modalidades, a composição é um produto alimentar. Um produto alimentar é qualquer alimento para animais não humanos ou para consumo humano e inclui composições sólidas e líquidas. Um produto alimentar pode ser um aditivo para alimentos animais e humanos. Alimentos incluem, porém sem limitação, alimentos comuns; produtos líquidos, incluindo leites, bebidas, bebidas terapêuticas, e bebidas nutricionais; alimentos funcionais; suplementos; nutracêuticos; fórmulas infantis, incluindo fórmulas para bebês prematuros; alimentos para mulheres grávidas ou lactantes; alimentos para adultos; alimentos geriátricos; e alimentos para animais.
[0109] Em algumas modalidades, a composição é uma ração animal. Um “animal” inclui organismos não humanos pertencentes ao reino Animalia, e inclui, sem limitação, animais aquáticos e animais terrestres. O termo "ração animal" ou "alimento animal" se refere a qualquer alimento destinado a animais não humanos, seja para peixe; peixe comercial; peixe ornamental; larvas de peixe; bivalves; moluscos; crustáceos; mariscos; camarão; estágio larval do camarão; artêmia; rotíferos; camarão de salmoura; animais filtradores; anfíbios; répteis; mamíferos; animais domésticos; animais de criação; animais de zoológico; animais de competição; animais reprodutores; animais de corrida; animais para entretenimento; animais tipo heirloom; animais raros ou em perigo de extinção; animais domésticos; animais de estimação, como cães, gatos, porquinhos-da-Índia, coelhos, ratos, camundongos, ou cavalos; primatas, como macacos (por exemplo, cebus, rhesus, Macaco do Velho Mundo, patas, cinomolgos e cercopithecus), símios, orangotangos, babuínos, gibões e chimpanzés; canídeos, como cães e lobos; felídeos, como gatos, leões e tigres; equídeos, como cavalos, burros e zebras; animais de abate, como vacas, gado, porquinhos-da- Índia e ovelhas; ungulados, como veado e girafas; ou roedores, como camundongos, ratos, hamsters e porquinhos- da-Índia; e assim por diante. Uma ração animal inclui, sem limitação, uma ração para aquicultura, uma ração para animais domésticos incluindo alimentos para animais de estimação, uma ração para animais de zoológico, uma ração para animais de trabalho, uma ração para gado e suas combinações.
[0110] Em algumas modalidades, a composição é uma ração ou suplemento para ração para qualquer animal cuja carne ou produtos sejam consumidos por seres humanos, tal como qualquer animal do qual a carne, ovos ou leite é derivado para consumo humano. Quando alimentados a tais animais, nutrientes como AGPI-CL podem ser incorporados na carne, leite, ovos ou outros produtos de tais animais, para aumentar o seu teor desses nutrientes.
EXEMPLOS
[0111] Os seguintes exemplos são estabelecidos abaixo para ilustrar os métodos e os resultados de acordo com a matéria revelada. Estes exemplos não se destinam a ser inclusivos de todos os aspectos da matéria revelada no presente documento, mas sim para ilustrar os métodos e os resultados representativos. Estes exemplos não se destinam a excluir equivalentes e variações que são aparentes para um técnico no assunto.
[0112] Métodos analíticos: A determinação da composição de ácidos graxos foi realizada usando cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama (GC/FID) de acordo com a European Pharmacopoeia [Farmacopeia Europeia], método 2.04.29.
[0113] EXEMPLO 1
[0114] Produção de concentrado de éster etílico de ARA
[0115] Etapa 1. Transesterificação
[0116] Estágio 1. A um frasco de fundo redondo de 2 l contendo 500 g de um óleo contendo ARA foram adicionados 24 g de uma solução etanólica a 21 % (base de peso) de etóxido de sódio (Sigma) e 131 g de etanol anidro. A mistura foi aquecida a 75 °C por uma hora durante a agitação sob atmosfera de N2 com o uso de um condensador de refluxo para impedir que o etanol saia da mistura de reação. A mistura de reação foi removida do calor, e permitiu-se que resfriasse a cerca de 40 °C, e então foi transferida para um funil separador de 2 l em que a camada de glicerol inferior foi drenada.
[0117] Estágio 2. A camada de óleo superior foi transferida para um frasco de fundo redondo de 2 l limpo, e carregada com mais 2,4 g da solução etanólica de etóxido de sódio e 13,1 g de etanol anidro. A mistura foi novamente aquecida a 75 °C por uma hora sob atmosfera de N2 e um condensador de refluxo.
[0118] Após o resfriamento a cerca de 40 °C, a mistura de reação foi evaporada sob vácuo para remover o etanol residual. O resíduo foi transferido para um funil separador de 2 l, e lavado com uma solução de ácido cítrico (1 % em p/p) até que o pH das porções de lavagem aquosa não fossem mais básicas. O óleo neutro foi lavado com 1,5 l de água destilada em três porções iguais de 500 ml, e então foi seco sob vácuo a 70 °C por 2h para produzir óleo contendo ARA a 53,88 % por área, com um rendimento de 95 %.
[0119] Etapa 2. Destilação de caminho curto
[0120] Os ésteres etílicos de ARA preparados na etapa 1 foram purificados por destilação de caminho curto. A unidade de destilação de caminho curto foi montada de acordo com protocolos padrão. A temperatura de trabalho no óleo em aquecimento foi ajustada a 130 °C, enquanto a temperatura na unidade de aquecimento que controla o condensador interno foi ajustada a 50 °C. Quando a pressão no sistema se equilibrou em 133,32 mBar (100 mTorr), aproximadamente 475 g do óleo foram destilados na unidade de caminho curto a uma taxa de fluxo de 500 g por hora. Cerca de 445 g de um destilado amarelo claro límpido foram obtidos para purificação adicional contendo ARA a 44,56 % por área, com um rendimento de 93 %. A porção não destilada (resíduo) foi descartada.
[0121] Etapa 3. Complexação de ureia
[0122] Os ésteres etílicos de ARA destilados preparados na etapa 2 foram concentrados por complexação de ureia. Em um frasco de fundo redondo de 500 ml, 50 g de ureia e 75 g de etanol aquoso a 95 % em v/v foram adicionados. A mistura foi colocada em uma manta de aquecimento e levada ao refluxo durante a agitação na presença de um condensador de refluxo. Quando a solução parecia mais clara, o óleo foi adicionado à mistura de ureia/etanol aquoso. O frasco foi removido do calor, e permitiu-se a mistura resfriasse no ar de um dia para o outro durante agitação. No dia seguinte, a mistura foi filtrada a vácuo e o filtrado líquido foi evaporado sob vácuo para remover o etanol residual. O resíduo seco foi transferido para um funil separador de 500 ml e lavados três vezes com três porções iguais de 100 ml de água destilada preaquecida a 60 °C. A camada de óleo superior da última lavagem com água foi seca sob vácuo a 70 °C por 2 h para produzir um óleo contendo ARA a 75,2 % por área, com um rendimento de 52,4 %.
[0123] Etapa 4. Cromatografia de fase reversa
[0124] O óleo preparado na etapa 3 foi adicionalmente concentrado por cromatografia de fase reversa. Os seguintes parâmetros foram empregados:
[0125] Coluna: Diâmetro interno de 3,8 cm Comprimento efetivo: 27 cm Volume: 313 ml
[0126] Matriz de sílica: Silicycle 60A. Gel de sílica C- 18, carregamento de carbono a 17 %, tamanho de partícula de 40-63 um.
[0127] Uma pasta fluida de 206 g de gel de sílica em 500 ml de um eluente que consiste em metanol a 92 % e água a 8 % em uma base em peso foi preparada e usada para empacotar a coluna. Quando a coluna foi empacotada, cerca de 1 l do eluente individualmente foi passado pela coluna para equilibrá-la. Cerca de 8,0 g do concentrado de ARA preparado na etapa 3 foram carregados em forma pura sobre o gel de sílica. A coluna foi então eluída em modo isocrático com mistura 92/8 de metanol/água. Os primeiros 1,5 l de eluente (cerca de 4,8 volumes de coluna) passados pela coluna foram descartados já que não continham nenhum óleo. O eluente restante foi coletado em frações de 15 ml. Um total de 86 frações foi coletado, para mais 1290 ml (4,1 volumes de coluna). Alíquotas dessas frações foram submetidas a análises de perfil de ácido graxo por GC. As frações contendo ARA em 89 % de área ou mais foram combinadas e secas sob vácuo para produzir um óleo contendo ARA de 89,34 % por área, com rendimento de 55 %.
[0128] Etapa 5. Complexação de ureia
[0129] O óleo preparado na etapa 4 foi adicionalmente concentrado por uma segunda etapa de complexação de ureia. Em um frasco de fundo redondo de 250 ml, 9,8 g de ureia e 24,5 g de etanol aquoso a 95 % em v/v foram adicionados. A mistura foi colocada em uma manta de aquecimento e aquecida durante a agitação na presença de um condensador de refluxo. Quando a maior parte da ureia se dissolveu, óleo em temperatura ambiente foi adicionado à mistura de ureia/etanol aquoso. O frasco foi removido do calor, e permitiu-se a mistura resfriasse no ar de um dia para o outro durante agitação. No dia seguinte, a mistura foi filtrada a vácuo e o filtrado líquido foi evaporado sob vácuo para remover o etanol residual. O resíduo seco foi transferido para um funil separador de 125 ml e lavados três vezes com três porções iguais de 50 ml de água destilada preaquecida a 60 °C. A camada de óleo superior da última lavagem com água foi seca sob vácuo a 70 °C por 2 h para produzir um óleo contendo ARA a 97,35 %, com rendimento de 51,1 %.
[0130] Etapa 6. Extração de fase sólida
[0131] O óleo preparado na etapa 5 foi adicionalmente concentrado por extração de fase sólida com o uso de cartucho de SPE de sílica. Cerca de 4,5 g do óleo material foram dissolvidos em 10 ml de uma mistura 90/10 v/v de hexanos/acetato de etila. A solução foi carregada em um cartucho de sílica Hyper Sep SI, o qual foi anteriormente equilibrado com uma mistura de solvente 90/10 de hexano/acetato de etila. O óleo foi eluído do cartucho de sílica com o uso de 200 ml da mistura de solvente. O solvente foi evaporado sob vácuo para produzir um óleo contendo ARA a 90,1 % em peso (ARA a 97,3 % por área), com rendimento de 82,2 %.
[0132] Um diagrama desse processo é fornecido na FIG. 1.
[0133] EXEMPLO 2
[0134] Exemplo Comparativo.
[0135] Nesse exemplo, o processo realizado era idêntico àquele descrito no Exemplo 1, exceto pelo fato de que a etapa de destilação (etapa 2) e a etapa de extração de fase sólida (etapa 6) foram omitidas.
[0136] O óleo resultante final obtido desse processo continha ARA a 74,0 % em peso (ARA a 96,9 % por área), com rendimento de 52,0 %.
[0137] Um diagrama do processo comparativo é fornecido na FIG. 2.
[0138] Todas as referências citadas neste relatório descritivo estão incorporadas no presente documento a título de referência como se cada referência fosse específica e individualmente indicada como incorporada a título de referência. A citação de qualquer referência é para sua revelação anterior à data de depósito e não deve ser interpretada como um reconhecimento de que a presente revelação não está autorizada a anteceder tal referência em virtude de invenção anterior.
[0139] Será compreendido que cada um dos elementos descritos acima, ou dois ou mais juntamente, também pode ter uma aplicação útil em outros tipos de métodos diferentes do tipo descrito acima. Sem análise adicional, o que foi dito acima revelará, então, totalmente a essência da presente revelação que outras pessoas podem, ao aplicar o conhecimento atual, adaptar prontamente para várias aplicações sem omitir recursos que, a partir do ponto de vista da técnica anterior, constituem adequadamente características essenciais dos aspectos genéricos ou específicos desta revelação estabelecida nas reivindicações anexas. As modalidades anteriores são apresentadas com fins exemplificativos apenas; o escopo da presente revelação deve ser limitado apenas pelas reivindicações a seguir.

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES
1. Processo para separação e concentração de um óleo que compreende ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (LC-PUFAs), sendo o processo caracterizado por compreender: a) transesterificação de um óleo de partida para sua forma de éster etílico; b) destilação do óleo de éster etílico; c) complexação de ureia do óleo de éster etílico destilado; d) submeter o óleo obtido na etapa c) a uma etapa de concentração adicional; e) complexação de ureia do óleo obtido na etapa d); e f) filtração do óleo obtido na etapa e) para obter um óleo resultante, em que o óleo resultante é enriquecido em pelo menos um LC-PUFA.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de concentração na etapa d) compreende cromatografia, destilação, complexação de ureia e combinações dos mesmos.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o % em peso do pelo menos um LC-PUFA é aumentada no óleo resultante em pelo menos cerca de 20 % em peso em comparação à % em peso no óleo de partida.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o % em peso do pelo menos um LC-PUFA é aumentada no óleo resultante em pelo menos cerca de 30 % em peso em comparação à % em peso no óleo de partida.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo fato de que o óleo resultante compreende pelo menos cerca de 70 % do pelo menos um LC-PUFA.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que o óleo resultante compreende pelo menos cerca de 80 % do pelo menos um LC-PUFA.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que o óleo resultante compreende pelo menos cerca de 90 % do pelo menos um LC-PUFA.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um LC-PUFA é ácido araquidônico (ARA).
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que a etapa de destilação compreende destilação fracionada, destilação de caminho curto, evaporação de filme descendente, evaporador de filme fino ou combinações dos mesmos.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizado pelo fato de que a etapa de destilação compreende destilação de caminho curto.
11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de que a etapa de destilação compreende destilação fracionada.
12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado pelo fato de que o óleo de partida é um óleo microbiano ou marinho.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o óleo de partida é um óleo microbiano.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o óleo de partida é produzido por um microrganismo, em que o microrganismo é selecionado a partir do grupo que compreende microalgas, bactérias, fungos e protistas.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é um fungo.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o fungo é do gênero Mortierella.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o fungo é da espécie Mortierella alpina.
18. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-17, caracterizado pelo fato de que o óleo resultante é transesterificado de volta para converter pelo menos parte da fração de éster no óleo a uma fração de triglicerídeo.
19. Óleo caracterizado por ser produzido pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-17.
20. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender pelo menos cerca de 70 % em peso de ARA.
21. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender pelo menos cerca de 80 % em peso de ARA.
22. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por compreender pelo menos cerca de 90 % em peso de ARA.
23. Óleo microbiano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-21, caracterizado pelo fato de que o ARA é um éster etílico.
24. Óleo caracterizado por ser produzido pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-18.
25. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por compreender pelo menos cerca de 70 % em peso de ARA.
26. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por compreender pelo menos cerca de 80 % em peso de ARA.
27. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por compreender pelo menos cerca de 90 % em peso de ARA.
28. Óleo microbiano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-27, caracterizado pelo fato de que o ARA é um triglicerídeo.
29. Óleo microbiano caracterizado por compreender pelo menos cerca de 70 % em peso de ARA.
30. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por compreender pelo menos cerca de 80 % de ARA.
31. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por compreender pelo menos cerca de 90 % de ARA.
32. Óleo microbiano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-31, caracterizado pelo fato de que o ARA é um éster etílico.
33. Óleo microbiano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-31, caracterizado pelo fato de que o ARA é um triglicerídeo.
34. Óleo microbiano, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29-33, caracterizado pelo fato de que o óleo microbiano é derivado de um microrganismo, em que o microrganismo é selecionado a partir do grupo que compreende microalgas, bactérias, fungos e protistas.
35. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é um fungo.
36. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é do gênero Mortierella.
37. Óleo microbiano, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é da espécie Mortierella alpina.
38. Produto alimentar, composição cosmética ou farmacêutica para um ser não humano ou humano caracterizado por compreender o óleo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 19-37.
39. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o produto alimentar é um leite, uma bebida, uma bebida terapêutica, uma bebida nutricional, ou uma combinação destes.
40. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que o produto alimentar é uma fórmula infantil.
41. Produto alimentar, de acordo com a reivindicação
38 ou 39, sendo que o produto alimentar é caracterizado por ser um suplemento alimentar.
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