CN110548057A - 一种三七茎叶成分提取工艺 - Google Patents
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Abstract
三七茎叶中的主要功效成分包括三七茎叶总皂苷、三七总黄酮和三七素。三七茎叶每年的存量可达8000‑1万吨，但是现有技术中，对于三七茎叶仅用了存量的5％左右，剩余的被废弃，造成了浪费。究其原因，三七茎叶成分的提取，大部分都是单项成分提纯，目前没有见过同时提取三项成分的技术，导致提取的效率不高。本发明针对上述问题提出一种三七茎叶成分提取工艺，可同时提取三种成分，而且各个成分的得率和含量都比现有技术更高，可促进三七茎叶利用。
Description
【技术领域】
本发明属于中药提取制造领域，具体地，其设计一种三七茎叶成分提取工艺。
【背景技术】
三七茎叶中的主要功效成分包括三七茎叶总皂苷、三七总黄酮和三七素。与三七根皂苷的活化细胞，抗氧化功效不同，三七茎叶总皂苷的功效主要在于镇静安神、镇痛、降脂。三七总黄酮具有增加冠状动脉血流、降低心肌耗氧量、抗心律失常的功效。三七素具有止血凝血功效。因此实际上，针对不同的药用需求，有必要提取三七茎叶中的上述三种成分。而且在三七茎叶中，根据不同的产地和品种，三七茎叶总皂苷的含量约为6％-12％，黄酮的含量约1-2％，三七素的含量约0.4-0.8％。三七茎叶每年的存量可达8000-1万吨，如果能用于提纯上述成分，经济效益可观。但是现有技术中，对于三七茎叶的利用和开发与根部相差甚远，仅用了存量的5％左右，剩余的被废弃，造成了浪费。究其原因，三七茎叶成分的提取，大部分都是单项成分提纯，目前没有见过同时提取三项成分的技术，导致提取的效率不高。
【发明内容】
基于上述提出的现有技术中存在的问题，本发明特提出一种三七茎叶提取工艺，该工艺可以同时提取三种成分，提高了提取效率，对于合理利用三七茎叶具有很大的帮助，进一步避免了三七茎叶被浪费。
本发明的技术方案具体如下：
S1、将三七茎叶清洗干净后，经真空冷冻干燥后粉碎至40-60目；
S2、将茎叶粉末中以1:4的体积比加入50°的纯净水浸泡24h，期间通过恒温装置保持浸泡液为50°，浸泡完成后加入15倍50°的纯净水超声提取2次，每次15min，过滤得到滤液，减压浓缩至30％体积得三七素粗提液，滤渣中加入10倍体积的80％乙醇超声提取3次，每次20min，合并滤液备用；
S3、将S2中得到的三七素粗提液上到732型阳离子层析柱中，流速2ml/min，用纯净水洗涤至流出液无色之后，用0.1％氨水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，即得三七素提取物；
S4、将S2中乙醇提取后的滤液减压浓缩至30％体积后，将该浓缩液上到具有D101树脂的层析柱中，用4倍体积纯净水洗，水洗的流速为2ml/min，洗至基本无色后，分别用4倍体积的含量为30、50、80、95％乙醇依次洗脱层析柱，醇洗的流速为2ml/min，分别收集洗脱液；
S5、合并S4中分别收集到的30、50、80％乙醇洗脱液；将S4中收集到的95％乙醇洗脱液，减压浓缩并冷冻干燥，为95％乙醇洗脱物；
S6、将S5中合并的乙醇洗脱液过D941柱，收集流出液并且减压浓缩并干燥，得到三七茎叶总皂苷提取物；
S7、分别用1％盐酸和1％氢氧化钠洗脱D941柱，将盐酸洗脱液和氢氧化钠洗脱液合并且调节至PH3-4，将调节PH值后的洗脱液上活化的D101柱层析，用95％乙醇洗涤D101柱，收集乙醇洗脱液并减压浓缩冷冻干燥；
S8、将S7中的减压浓缩冷冻干燥所得物与S5中95％乙醇洗脱物合并，得到三七黄酮提取物。
常规的中药干燥处理是自然晒干或者烘干，但是一来时间长，二来三七的有效成分不适合用高温处理，因此采用真空冷冻干燥是更合适的方式。
与现有技术不同的地方在于，本发明将三七素的提取放在第一步，因为本来三七素的含量在三者中是最少的，需要提高三七素的收率。
三七素非常易溶于水，但是不易溶于乙醇等有机溶剂。现有方法的三七素的提取率低的重要原因在于三七成分的提取第一步是皂苷类的提取，皂苷类的提取通常要用到乙醇之类的有机溶剂，经过溶解后上层析柱水洗脱，收集的水洗脱液作为三七素的提取来源，这导致三七素很难充分溶解到溶剂中，从而导致含量较低。而且之所以采用先提皂苷再提三七素的方法也与提取的原料有关系。三七根块中含有大量的淀粉和糖，如果用水浸泡容易导致材料膨胀，加热提取的时候容易产生大量的泡沫导致提取困难，同时淀粉类多也在加热的时候容易发生糊化反应。基于上述原因，现有的根块提取更倾向于醇提。而本发明的提取原材料是三七茎叶，其淀粉含量少，再结合三七素易溶于水的特性，首先采取水提法来提取三七素以提高其提取率。
为了增加水提的效率，还通过超声波来增加三七素溶解的效率。而在提取过程中的各项参数也影响到了提取率。通过考察提取温度、提取次数、提取时间、提取溶剂量这些参数对于三七素提取含量的影响，经过实验得出最适合的参数，具体如下：
| 三七素得率(％) | 提取温度(摄氏度) |
| 0.42 | 30 |
| 0.48 | 40 |
| 0.54 | 50 |
| 0.49 | 60 |
| 0.45 | 80 |
表1
表2
| 三七素得率(％) | 提取时间(分钟) |
| 0.36 | 5 |
| 0.41 | 10 |
| 0.5 | 15 |
| 0.51 | 20 |
表3
| 三七素得率(％) | 纯净水体积比 |
| 0.3 | 5 |
| 0.32 | 10 |
| 0.53 | 15 |
| 0.3 | 20 |
| 0.22 | 25 |
表4
根据上述表1-4的实验结果，结合成本来考虑，除去效果提升不明显的参数，对于三七茎叶中三七素的提取，适宜的采用提取温度为50°，提取次数为2次，提取时间为15min,提取的纯净水体积比为15倍。
为了进一步证明本发明的提取方法确实有效提高了三七素的提取率，特地与现有技术的方案进行对比，现有技术的三七素提取方案通常包括如下步骤：
S1、三七茎叶粉末以15倍体积的50％乙醇超声提取2次，每次15min，合并每次的滤液，减压浓缩至30％体积；
S2、将S1中的浓缩液上D101树脂柱，先用蒸馏水洗脱至无色，收集水洗液，然后用75％的乙醇洗脱，收集醇洗液；
S3、将S2中的水洗液上到732型阳离子层析柱中，流速2ml/min，用纯净水洗涤至流出液无色之后，用0.1％氨水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，即得三七素提取物。
分别称取600g三七茎叶粉末，均分成6份，其中3份按照本发明的方案提取，另3份按照现有技术的方案提取，最终提出的三七素得率(％)结果如下：
| 本发明(％) | 现有技术(％) |
| 0.53 | 0.35 |
| 0.49 | 0.37 |
| 0.50 | 0.34 |
表5
可以看出，本发明的方案比现有技术的收率提高了0.2％左右，提高幅度达到了60％。
三七茎叶总皂苷主要为原人参二醇型皂苷，其难溶于常温水，需要加热到80-100度左右才能溶解，易溶于乙醇等有机溶剂。而且在乙醇中的溶解最佳浓度与三七根皂苷不同。三七根皂苷主要为原人参三醇型皂苷，其最佳溶度在70％的乙醇中获得。在等量茎叶粉末和溶剂的情况下，经过检测浓度为30、40、50、60、70、80、95％乙醇中皂苷溶解的量，发现80％的乙醇中溶解三七茎叶总皂苷含量最多，因此滤渣采用80％的乙醇进行提取，同样为了增加溶解效率，采用超声提取。
在进行洗脱的时候，为了尽可能将皂苷从树脂上脱离下来，可以采用不同浓度的乙醇依次洗脱，从而提高总皂苷得率，原因是三七茎叶中还含有其他种类的皂苷，这些皂苷要在不同浓度的乙醇中才能获得比较好的溶解度。针对茎叶皂苷中主要以原人参二醇为主，其又在80％乙醇溶解最大，所以乙醇浓度选择了4梯次，分别是30、50、80、95％。
上述步骤中，通过S7进一步提高了黄酮的得率。此前，经过实验化验发现，仅一次的D101大孔树脂层析无法完全的分离三七茎叶总皂苷和黄酮，实验具体如下：
取s4中的三七茎叶浓缩液100ml，加入含湿树脂(D101)60g的层析柱中，先用4倍量水洗(2ml/min)，至基本无色，分别用4倍体积30、50、80、95％乙醇依次洗脱(2ml/min)，分别收集上述不同乙醇比例的洗脱液，并且分别分析其中的三七茎叶总皂苷和三七总黄酮成分，具体的：
三七茎叶总皂苷：取溶液适量，点于硅胶G板上，以水饱和正丁醇展开，香兰素-硫酸-冰醋酸-乙醇(2:10:20:380)显色，即可。
总黄酮：FeCl3乙醇溶液(1％FeCl3+50％乙醇水溶液)呈现颜色反应。
结果如表6所示：
| 洗脱溶剂 | 30 | 50 | 80 | 95 |
| 总皂苷 | + | +++++ | ++++++ | + |
| 总黄酮 | - | + | ++ | +++++ |
表6
从上述结果可看出来，基本的趋势是，无论是皂苷还是黄酮都需要较高的乙醇浓度才可以渗出。而对于两者而言，渗出量达到最大化时的乙醇洗脱液中都存在对方的影子，没有办法完全的分化出来。所以在保证提取率这一前提下，无法仅仅通过一次的洗脱就达到理想的提取分离状态。
而进一步的，通过测量洗脱物的皂苷和黄酮含量，从另一个角度证明提取率还有进步的空间，具体如下：
分别收集并合并30、50、80％乙醇洗脱液，得到80％乙醇洗脱物，减压浓缩并冷冻干燥，为80％乙醇洗脱物；收集95％乙醇洗脱液，减压浓缩并冷冻干燥，为95％乙醇洗脱物。分别检测总皂苷和总黄酮含量，结果如表7所示：
| 样品 | 80％乙醇洗脱物 | 95％乙醇洗脱物 |
| 得率 | 5.8％ | 2.0％ |
| 总皂苷含量 | 93％ | 2.7％ |
| 总黄酮含量 | 4.5％ | 77.3％ |
表7
从表7中可以看出，经过30％、50％、80％乙醇洗脱后，皂苷的含量非常高，而且得率达到了5.39％，提取效率已经很高，因此基本上仅靠这一步就已经达到了皂苷的提取目标。但是，两种乙醇洗脱物中黄酮的提取率和含量就不那么理想，因此有必要进行进一步的提取以提高黄酮的得率和含量。
从上一实验中看出，合并的80％乙醇洗脱液中既有皂苷又有黄酮，因此需要将两者进行分离，所以将该洗脱液过含有D941树脂的层析柱以吸附黄酮，皂苷随流出液流出，收集流出液，减压干燥分别用1％盐酸和1％氢氧化钠洗柱，洗涤液合并且调节PH3-4，将调解PH后的洗涤液上D101柱层析进一步提纯，用95％乙醇洗涤，收集乙醇洗脱液。取此次洗脱液适量分成两等份，一份点于硅胶G板上，以水饱和正丁醇展开，香兰素-硫酸-冰醋酸-乙醇(2:10:20:380)，发现不显色，另一份加入FeCl3乙醇溶液(1％FeCl3+50％乙醇水溶液)呈现颜色反应。可以确认，第一次洗脱后，皂苷成分基本已经达到最大提取量，而且黄酮的成分还有继续渗出，所以证明确实需要第二次洗脱。
经检测，此次洗脱液的皂苷和黄酮的含量分别如下表8所示：
| 样品 | 95％乙醇洗脱物 |
| 得率 | 0.5％ |
| 总皂苷 | 0 |
| 总黄酮 | 85.7％ |
表8
最终合并两次的95％乙醇洗脱物的话，黄酮的得率能提高到2.5％。
为了验证本发明的提取效果，进行了如下对比实验：
待证组：称取经真空冷冻干燥的三七茎叶粉末1500g，平均分为3份，分别为样品1，样品2，样品3,3份样品依次按照本发明技术方案进行三种成分的提取，方法中层析柱每种填料仅用一根，样品1用完后，活化，样品2、3再依次使用，活化可参考前述D101树脂的活化。
参照组：称取经真空冷冻干燥的三七茎叶粉末1500g，平均分为3份，分别为参照样品1，参照样品2，参照样品3,3份样品借鉴现有的三七根中的皂苷、三七素、黄酮成分提取方式进行提取(粉末50％乙醇超声波提取—D101树脂层析--水洗+70％乙醇醇洗—70％醇洗液干燥得皂苷，95％醇洗液干燥得黄酮—水洗液上732阳离子树脂—水洗+0.1％氨水洗脱—洗脱液干燥得三七素)，其他的流速、时间、次数等操作参数与待证组对应相同。层析柱也同样是每种填料用一根，活化后重复利用。
实验结果如下：
| 样品1 | 样品2 | 样品3 | |
| 药材量 | 500g | 500g | 500g |
| 茎叶总皂苷收率 | 5.54％ | 5.62％ | 5.60％ |
| 茎叶总皂苷含量 | 98.3％ | 97.8％ | 98.0％ |
| 茎叶总黄酮收率 | 2.53％ | 2.44％ | 2.37％ |
| 茎叶总黄酮含量 | 84.6％ | 85.1％ | 85.3％ |
| 三七素收率 | 0.49％ | 0.53％ | 0.47％ |
| 三七素含量 | 57.2％ | 55.4％ | 55.7％ |
表9
| 参照样品1 | 参照样品2 | 参照样品3 | |
| 药材量 | 500g | 500g | 500g |
| 茎叶总皂苷收率 | 4.9％ | 5.02％ | 5.05％ |
| 茎叶总皂苷含量 | 92.3％ | 91.8％ | 92.4％ |
| 茎叶总黄酮收率 | 1.97％ | 2.04％ | 1.95％ |
| 茎叶总黄酮含量 | 79.2％ | 78.1％ | 78.8％ |
| 三七素收率 | 0.35％ | 0.34％ | 0.37％ |
| 三七素含量 | 45.5％ | 44.2％ | 46.0％ |
表10
结合表9-10来看，相比用现有技术的方式提取三七茎叶中的有效成分，本发明无论是得率还是含量都得到了较大提高，其中尤其以三七素的提高最为明显，得率提高了0.1％左右,含量提高了12％。
进一步的，所述真空冷冻干燥具体包括：预冷冻：将洗净的茎叶放入真空冷冻干燥机中，温度降到-30℃～-20℃，并维持3～4小时；真空干燥：打开冷阱制冷模式，冷阱装置的制冷温度控制在-40℃～-60℃，真空度维持在10～30Pa进行干燥处理。经过上述真空冷冻干燥能有效的保持三七茎叶中的有效成分，避免高温晒干对有效成分的破坏。
进一步的，所述恒温装置为隔水电热式培养箱。
进一步的，所述减压浓缩具体包括：温度保持在60～80℃、真空度为-0.02MPa～-0.06MPa。
进一步的，S7中的D101柱活化具体包括:将之前用过的D101树脂取出倒入容器中，用蒸馏水清洗三遍，加入3-5％的盐酸浸泡2h,再用5％的氢氧化钠和5％的盐酸交替清洗,最后用纯净水清洗至PH为中性，用95％的乙醇浸泡1h后再用水清洗至流出液无色。
本发明具有如下有效效果：
根据三七茎叶各个成分特性，针对性的提出了合适的提取方法，有效提高了各种成分的得率和含量，促进了三七茎叶的利用和开发，避免三七茎叶被浪费。
【具体实施例】
S1、将三七茎叶清洗干净后，放入真空冷冻干燥机中，温度降到-30℃～-20℃，并维持3～4小时；真空干燥：打开冷阱制冷模式，冷阱装置的制冷温度控制在-40℃～-60℃，真空度维持在10～30Pa进行干燥处理，干燥后粉碎至40目；
S2、将茎叶粉末中以1:4的体积比加入50°的纯净水浸泡24h，期间将容器放入隔水电热恒温培养箱中保持浸泡液为50°，浸泡完成后加入15倍50°的纯净水超声提取2次，每次15min，过滤得到滤液，将滤液在60～80℃、真空度为-0.02MPa～-0.06MPa条件下减压浓缩至30％体积得三七素粗提液，滤渣中加入10倍体积的80％乙醇超声提取3次，每次20min，合并滤液备用；
S3、将s2中得到的三七素粗提液上到732型阳离子层析柱中，流速2ml/min，用纯净水洗涤至流出液无色之后，用0.1％氨水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，即得三七素提取物；
S4、将s2中乙醇提取后的滤液减压浓缩至30％体积后，将该浓缩液上到具有D101树脂的层析柱中，用4倍体积纯净水洗，水洗的流速为2ml/min，洗至基本无色后，分别用4倍体积的含量为30、50、80、95％乙醇依次洗脱层析柱，醇洗的流速为2ml/min，分别收集洗脱液；
S5、合并S4中分别收集到的30、50、80％乙醇洗脱液；将S4中收集到的95％乙醇洗脱液，减压浓缩并冷冻干燥，为95％乙醇洗脱物；
S6、将S5中合并的乙醇洗脱液过D941柱，收集流出液并且减压浓缩并干燥，得到三茎叶总皂苷提取物；
S7、将之前用过的D101树脂取出倒入容器中，用蒸馏水清洗三遍，加入3-5％的盐酸浸泡2h,再用5％的氢氧化钠和5％的盐酸交替清洗,最后用纯净水清洗至PH为中性，用95％的乙醇浸泡1h后再用水清洗至流出液无色；分别用1％盐酸和1％氢氧化钠洗脱D941柱，将盐酸洗脱液和氢氧化钠洗脱液合并且调节至PH3-4，将调节PH值后的洗脱液上活化的D101柱层析，用95％乙醇洗涤D101柱，收集乙醇洗脱液并减压浓缩冷冻干燥；
S8、将S7中的减压浓缩冷冻干燥所得物与S5中95％乙醇洗脱物合并，得到三七黄酮提取物。
上述实施例仅用于对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变更或改进，均属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种三七茎叶成分提取工艺，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将三七茎叶清洗干净后，经真空冷冻干燥后粉碎至40-60目；
S2、将茎叶粉末中以1:4的体积比加入50°的纯净水浸泡24h，期间通过恒温装置保持浸泡液为50°，浸泡完成后加入15倍50°的纯净水超声提取2次，每次15min，过滤得到滤液，减压浓缩至30％体积得三七素粗提液，滤渣中加入10倍体积的80％乙醇超声提取3次，每次20min，合并经乙醇提取的滤液备用；
S3、将s2中得到的三七素粗提液上到732型阳离子层析柱中，流速2ml/min，用纯净水洗涤至流出液无色之后，用0.1％氨水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，即得三七素提取物；
S4、将s2中乙醇提取后的滤液减压浓缩至30％体积后，将该浓缩液上到具有D101树脂的层析柱中，用4倍体积纯净水洗，水洗的流速为2ml/min，洗至基本无色后，分别用4倍体积的含量为30、50、80、95％乙醇依次洗脱层析柱，醇洗的流速为2ml/min，分别收集洗脱液；
S5、合并S4中分别收集到的30、50、80％乙醇洗脱液；将S4中收集到的95％乙醇洗脱液，减压浓缩并冷冻干燥，为95％乙醇洗脱物；
S6、将S5中合并的乙醇洗脱液过D941柱，收集流出液并且减压浓缩并干燥，得到三七茎叶总皂苷提取物；
S7、分别用1％盐酸和1％氢氧化钠洗脱D941柱，将盐酸洗脱液和氢氧化钠洗脱液合并且调节至PH3-4，将调节PH值后的洗脱液上活化的D101柱层析，用95％乙醇洗涤D101柱，收集乙醇洗脱液并减压浓缩冷冻干燥；
S8、将S7中的减压浓缩冷冻干燥所得物与S5中95％乙醇洗脱物合并，得到三七黄酮提取物。
2.如权利要求1所述的三七茎叶成分提取工艺，其特征在于：所述真空冷冻干燥具体包括：预冷冻：将洗净的茎叶放入真空冷冻干燥机中，温度降到-30℃～-20℃，并维持3～4小时；真空干燥：打开冷阱制冷模式，冷阱装置的制冷温度控制在-40℃～-60℃，真空度维持在10～30Pa进行干燥处理。
3.如权利要求1所述的三七茎叶成分提取工艺，其特征在于：所述恒温装置为隔水电热式培养箱。
4.如权利要求1所述的三七茎叶成分提取工艺，其特征在于：所述减压浓缩具体包括：温度保持在60～80℃、真空度为-0.02MPa～-0.06MPa。
5.如权利要求1所述的三七茎叶成分提取工艺，其特征在于：S7中的D101柱活化具体包括:将之前用过的D101树脂取出倒入容器中，用蒸馏水清洗三遍，加入3-5％的盐酸浸泡2h,再用5％的氢氧化钠和5％的盐酸交替清洗,最后用纯净水清洗至PH为中性，用95％的乙醇浸泡1h后再用水清洗至流出液无色。
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