CN114315629A

CN114315629A - 从豆类植物中分离纯化三七素的方法

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Publication number: CN114315629A
Application number: CN202210022586.6A
Authority: CN
Inventors: 杨玲娟; 焦成瑾; 赵菲佚; 张小寒; 徐全乐; 蒋景龙; 成伟
Original assignee: Tianshui Normal University
Current assignee: Tianshui Normal University
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明涉从豆类植物中分离纯化三七素的方法。具体地，本发明涉及用无机盐制备出初步除杂的含三七素的提取液，然后调节pH值并用阳离子树脂交换吸附，以去离子水洗脱分离，洗脱液减压蒸发浓缩，用喷雾干燥法得到白色粉末。经液相色谱法、红外光谱法、核磁共振光谱法鉴定所得白色粉末为三七素，且有优良的止血效果。本提取方法操作简单、安全环保。

Description

从豆类植物中分离纯化三七素的方法

技术领域

本发明属于医药领域中有效成分提纯的工艺或方法，具体涉及从含有三七素的豆类植物中提取具有药用价值的三七素的工艺。

背景技术

三七素是日本小菅卓夫从三七中分离出的止血活性成分，被命名为Dencichine^[4]，并进一步证实三七素的止血效果优于止血环酸^[5]。赵国强等^[6]发现三七素及其对映体β-N-草酰基-D-α,β-二氨基丙酸均能使血小板数量显著增加。

刘贺之^[7]、郑璐^[8]、张玉萍等^[9]对三七素的止血作用和止血机制进行了研究。郑毅男等^[10]发现三七素还具有抗脂解与促进脂肪合成的作用。另一方面，三七素β-ODAP的存在也是山黧豆等作物具有极强抗逆性的物质基础^[11]，不少学者将植物本身含有的毒素视为植物用于抵御和抑制外来入侵者的化感类物质^[12]。

目前，三七素可以用于各种终端产品中，例如CN102379827B公开了一种含有三七素的牙膏，该牙膏是在牙膏基质中加入三七皂甙和三七素制备而成，三七皂甙和三七素的重量百分比为0.2-1.2％和0.01-1.0％；所制备的牙膏能杀灭口腔内引起牙龈炎、牙周炎、口腔溃疡、口臭、牙龈出血、龋齿等症状的化脓性球菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、厌氧菌等致病菌，消除口腔异味，且对牙龈炎和牙龈出血以及口腔溃疡疗效显著。

CN102579418B涉及了三七素的药物应用，即，小剂量三七素作为制备治疗慢性神经疾病的药物中的应用。该专利文献记载了，用细胞学方法，通过建立细胞慢性缺氧模型等，采用细胞形态观察、细胞染色等方法证实，小剂量的三七素可对慢性缺氧作用引起的神经源性细胞损伤具有保护作用，说明小剂量三七素对慢性神经疾病有保护作用。

CN104771387B公开了三七素及其可药用盐或含三七素的植物提取物在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物或保健品中的用途,其首次发现三七素可以明显改善实验性溃疡性结肠炎小鼠的体重减轻、血便、结肠缩短以及组织病理损伤等症状。

然而，目前制备或提纯三七素的成本居高不下、生产环节中环境友好性不佳或纯度较低，因此，需要进一步探索其分离纯化方法，或寻找价格低廉的原料，降低生产成本、提高纯度，唯有此，才能切实扩大其应用并满足对三七素药理方面的研究，使其临床应用更为广泛。

目前提取分离三七素的方法主要有两种，第一种以有机溶剂萃取，离子交换分离得到较纯三七素^[13-16]，第二种是重金属沉淀法^[17]。前者是将原料粉碎后用乙醇、乙醚和氯仿等有机溶剂萃取，通过阴阳离子交换树脂洗脱得到提取液，用有机溶剂沉淀得到产品；后者是在山黧豆粉中加入50％乙醇抽提，静置过滤后，在滤液中加入CuSO₄,得到β-ODAP与Cu2+的绿色络合沉淀。

除了从天然的植物中提取分离三七素外，化学合成法也是获取三七素的重要来源。例如，CN105439883A公开了一种D-三七素的制备方法及其用途，包括对D-天冬酰胺的氨基进行Fmoc保护，得到第一中间体；对所述第一中间体进行Hoffman降解反应，得到第二中间体；在有机碱的作用下，将所述第二中间体脱去Fmoc保护，得到第三中间体；在强碱条件下，将所述第三中间体与草酸单钾酯进行缩合反应，得到所述D-三七素。同时，该专利申请文件也公开了三七素具有较好的治疗血小板减少症作用，优于临床用药白介素-11，可以成为治疗血小板减少症的候选药物。

但是，上述方法都需要使用大量的有机溶剂，有的还涉及到重金属盐，对环境造成了很大的污染，且有的反应步骤繁多，费时费力，影响了所提三七素的进一步利用。

发明内容

为了更加环境友好性地制备三七素，或为三七素的制备工艺提供另一种可行的选择，本发明的发明人经过大量、坚持不懈的筛选，可在不使用任何有机溶剂，且排放的废水也无任何有害成分情况下从含有三七素的豆类植物种子中提取三七素，实现了副产品(杂蛋白等)有效回收，排放物绿色环保。

本发明一方面提供了一种从豆类植物种子中分离和纯化三七素的方法，其包括如下步骤：

a.制备包含粉碎的含三七素的豆类植物种子的水溶液；

b.向所述水溶液中添加一种或两种以上无机盐，静置或离心后获富含三七素的上清液；

c.调节所述上清液的pH至小于等于2；和

d.在上述上清液中添加阳离子交换树脂吸附三七素，并洗脱吸附后的阳离子交换树脂，获得富含三七素的洗脱液。

本发明还提供了一种从豆类植物种子中分离三七素的方法，其包括如下步骤：

a.制备包含粉碎的含三七素植物材料的水溶液；和

b.向所述水溶液中添加一种或两种以上无机盐，静置后获得富含三七素的上清液。

本发明还提供了一种从豆类植物种子中获得富含三七素的溶液的方法，其包括如下步骤：

a.制备包含粉碎的含三七素的豆类植物种子的水溶液；和

任选地，在向水溶液中添加一种或两种以上无机盐之前，将水溶液加热，例如加热至40-120℃,例如45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、120℃，只要不破坏三七素的活性即可。并且，优先地，在加热的同时进行搅拌，以免局部过热导致的焦化或者糊化。

本发明还提供了纯化三七素的方法，其包括如下步骤：

c.调节富含三七素的水溶液的pH至小于等于2(例如1.5-2.0)；和

d.在上述水溶液中添加阳离子交换树脂吸附三七素，并洗脱吸附后的阳离子交换树脂，获得富含三七素的洗脱液。

任选地，在本发明的方法中，可对富含三七素的洗脱液进行冷冻干燥或喷雾干燥，获得三七素粉末。进一步地，可以对三七素粉末进行水溶解和重结晶操作，以获得纯度更高的三七素，如三七素晶体。如有必要，可以反复进行水溶解和重结晶操作，例如2-5次，以获得近乎100％的高纯三七素。

示例性地，对富含三七素的洗脱液进行冷冻干燥或喷雾干燥之前进行浓缩，然后将浓缩液进一步用喷雾干燥器进行干燥后或冷冻干燥后可得到ODAP粉末。为了进一步获得更纯的三七素，可将ODAP粉末重新溶于少量水中，调pH大约至2－3使其充分溶解(例如用盐酸(例如1M的盐酸溶液)调节pH)，随后通过离心或静置(例如置于4℃下)后让其晶体析出。析出的晶体可用去离子水(例如在4℃左右下)冲洗(例如2-5次)，然后干燥并研磨封装。

进一步任选地，可以对步骤b中所获得的上清液或水溶液进行浓缩，例如通过旋蒸而减压浓缩。

示例性地，本发明所述的植物材料选自猪屎豆、金合欢豆和山黧豆，优选为上述植物的种子，例如猪屎豆、金合欢豆和山黧豆到种子。

示例性地，在本发明方法的步骤a中，为了更容易制备包含粉碎的含三七素植物材料的水溶液，可以将含三七素的豆类植物种子浸泡后粉碎所述种子，或者先将所述植物种子粉碎，然后浸泡。例如，对于山黧豆种子、猪屎豆、或者金合欢豆，可以先将其用自来水搓洗，除去种子表面的灰尘及其他杂质；再用去离子水用同样的方法洗涤1-5次，然后用去离子水浸泡(例如浸泡6h)；用制浆机将浸泡好的山黧豆、猪屎豆、或者金合欢豆种子粉碎成浆液或打浆，以得到富含三七素的液体。任选地，可以将浆液静置(例如1-10h)，以使其溶液中的大部分淀粉和粗纤维充分沉降，并获取上清液待用。所沉降出的淀粉和粗纤维可作为豆渣用于饲料或有机肥，做到资源的全部利用。

示例性地，在本发明方法的步骤b中，所添加的无机盐可为，例如钠盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、硫酸盐、醋酸盐、磷酸盐、铵盐、氯盐等。具体地，本发明方法的步骤b中可以添加硫酸钙、氯化镁、硫酸钠、醋酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸铁、氯化铁等，或其组合，例如硫酸钙和氯化钠；硫酸钙和氯化镁；硫酸钙和硫酸镁等。进一步地，所述添加的无机盐的组合中各无机盐的质量比可以为1：3-3：1，如1:1。示例性地，可添加质量比为1：1的硫酸钙和氯化钠、质量比为1：1的硫酸钙和氯化镁、质量比为1：1的硫酸钙和硫酸镁等。优选地，将无机盐用水溶解后添加至步骤a中的水溶液中，更优选地，所述步骤a中的水溶液是加热的或者煮沸的。无机盐的添加的目的之一在于沉淀溶液中非三七素杂质，因此可添加至无明显的进一步的杂质沉淀的程度，也可考虑过量添加。更进一步地，过滤和/或静置后获得的所述富含三七素的上清液，以获得更加澄清的上清液或含有更少固体颗粒的上清液。

示例性地，在本发明方法的步骤c中，用无机酸将所述上清液的pH调整为小于等于2.0，例如用盐酸或者硫酸调整上清液的pH至1.5-2.0。

示例性地，在本发明方法的步骤d中，所述阳离子交换树脂可以为Na型阳离子交换树脂；所用洗涤液为去离子水。进一步地，在使用所述Na型阳离子交换树脂之前进行如下步骤的预处理：

1)浸泡

将强酸性阳离子交换树脂(Na型)1000g用食盐水(例如饱和的食盐水)浸泡(例如12h)以使树脂软化，去除树脂颗粒表面的杂质，防止树脂颗粒破裂；

2)酸化转型

将已软化的树脂浸泡于酸溶液(例如2mol/L的HCl)中，以使树脂从Na型转化为H型；

3)清洗至中性

转型完毕的树脂用去离子水分洗涤，直至用洗涤树脂后的去离子水呈中性为止。

示例性地，上述步骤中所加入的阳离子交换树脂在使用前进行预处理，其中预处理步骤包括：

(1)浸泡

取强酸性阳离子交换树脂(Na型)1000g，倒入2L锥形瓶中，加入1L饱和食盐水浸泡12h以使树脂软化，去除树脂颗粒表面的杂质，防止树脂颗粒破裂；

(2)酸化转型

将已软化的树脂浸泡于新配的2mol/L的HCl溶液中，酸化至少12h，以至使树脂从Na型转化为H型；

(3)清洗至中性

转型完毕的树脂用去离子水分多次搅拌洗涤，直至用pH试纸检测洗涤树脂后的去离子水呈中性为止。

本发明的方法改变了以往有机溶剂除去蛋白、有机溶剂萃取、用稀盐酸洗脱阳离子交换柱提取ODAP等弊端之一、之二或更多，简化了工艺、省掉了大量有机溶剂和酸的使用。如此以来，本发明的工艺或者方法，优选不含有有机溶剂除去蛋白、有机溶剂萃取、用稀盐酸洗脱阳离子交换柱提取ODAP等弊端之一、之二或之三。这样，一方面大大降低了提取成本，另一方面使下脚料可作为饲料能有效利用。整个工艺流程简单、低成本、环保，产率和纯度极高。因此，本发明对于三七素的进一步推广和利用有重要意义。

需要强调的是，由于本工艺过程前后配合，紧密相关，使得整个工艺过程中不使用或基本不使用任何有机溶剂。这一点在现有的三七素纯化工艺无法企及的。

在本发明中，豆类植物是指豆科植物，也可以指代豆科植物的部分，例如指豆科植物的种子或荚果。示例性地，豆类植物包括大豆、菜豆、绿豆、黄豆、蚕豆、红花菜豆、印度菜豆、猪屎豆、金合欢豆、和山黧豆等。豆类植物是重要粮食作物之一，是一种其种子含有丰富植物蛋白质的作物，豆类植物最常用来做各种豆制品、榨取豆油、酿造酱油和提取蛋白质，其营养丰富。本发明中用于提取三七素的植物，只要其含有可提取量的三七素，理论上都是可行的。实践中，为了提高三七素的提取效率，通常会选择三七素含量相对较高豆类植物，例如猪屎豆、金合欢豆和山黧豆等。

本文已采用的术语和表述用作描述性而不是限制性术语，并且在此种术语和表述的使用中不预期排除所示和所述特征或其部分的任何等价物，但应认识到各种修饰在请求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当理解尽管本发明已通过优选实施方案和任选特征具体公开，但本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修饰和变化，并且此类修饰和变化被视为在如由附加权利要求定义的本发明的范围内。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

附图说明

图1.ODAP标准品高效液相色谱图；

图2.本发明方法所提取分离的ODAP高效液相色谱图；

图3.本发明方法所提取分离的三七素的1-C图；

图4.本发明方法所提取分离的三七素的1-H图；

图5.本发明方法所提取分离的三七素的2-C图；

图6.本发明方法所提取分离的三七素的2-H图；

图7.本发明方法所提取分离的三七素的3-H图；

图8.本发明方法所提取分离的三七素的4-H图。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

下述实施例所用仪器和试剂如下：

DM-Z100A自分渣磨浆机(沧州德鑫机械设备有限公司)；Agilent1100高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；Luna-C₁₈色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)；FTIR-850红外光谱仪(天津港东科技有限公司)；PicoSpin-45核磁共振波谱仪(赛默飞公司)；RE 52-99旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；S210pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司)；DDL6落地式冷冻离心机(长沙英泰仪器有限公司)；UW6200H电子天平(日本岛津)。

强酸性阳离子交换树脂(Na型)(生工生物工程(上海)股份有限公司)；0.5mol/LNaHCO₃水溶液；10mg/mL FDNB乙腈溶液；PBS缓冲溶液；pH4.5的HAc-NaAc缓冲溶液；茚三酮溶液(ACS，上海生工生物，称取1.0g茚三酮固体，将其溶解在100mL95％的乙醇中并加入2mL冰乙酸保持弱酸性环境)；乙腈(色谱纯)；硫酸钙，氯化镁，浓盐酸，氯化钠和碳酸氢钠均为分析纯。

实施例1-1：三七素的提取与纯化

1、浸泡

挑选颗粒饱满无损伤的山黧豆种子，准确称取500g(m₁)，先用自来水搓洗，除去种子表面的灰尘及其他杂质；再用去离子水用同样的方法洗涤三次，用1L去离子水浸泡6h。

2、制浆

称量浸泡好的山黧豆种子，记为m₂，则500g山黧豆种子在6h时间段内吸收水分的量为m₂-m₁。粉碎山黧豆种子，分离残渣后获得浆液，静置3h，以使其浆液中的淀粉和粗纤维沉降，保留上清液待用。所有分离出的种子残渣可做饲料或有机肥，做到有用资源的全部利用。

3、凝固及过滤

取上述上清液3L并加热至近沸，然后加7.5gCaSO₄和7.5gMgCl₂比例配制的50mL盐溶液至加热的浆液中。充分静置至冷却得到凝固物，用致密白布过滤所得凝固物，得黄浆水(内含ODAP)。过滤后的凝固物做有机肥，或动物饲料，提高资源利用率。

4、黄浆水离心

过滤后的黄浆水均分为质量相等的四等份，分装于1L的离心瓶中，在落地式冷冻离心机中以转速4000r/min，温度4℃离心20min，打开瓶盖，缓慢地将离心后的上清液倾倒于2L烧杯中。

5、调节上清液pH值

测出上清液原始pH值，用1000μL移液枪移取新配6mol/L HCl溶液加入上清液中(每次3mL)，边加边搅，充分混匀后测其pH值。重复操作直到上清液pH＝2，保存待用。

6、阳离子交换分散吸附、洗脱及蒸发浓缩

向上述上清液中分步加入阳离子交换树脂，边加边搅，每加一定量的树脂后，用茚三酮溶液检验直至上清液不出现氨基酸特征的蓝紫色为止。将树脂装柱，控制1d/s的速度以去离子水进行洗脱，以酸性茚三酮溶液进行检验，洗脱液若出现蓝紫色，即开始收集洗脱液，直至洗脱液用茚三酮检验3次仍不出现蓝紫色为止，合并洗脱液，在旋转蒸发仪上减压浓缩(真空度0.08MP，85℃)至体积约为50mL，置4℃冷柜中保存。

上述步骤中所加入的阳离子交换树脂在使用前进行预处理，其中预处理步骤包括：

(1)浸泡

(2)酸化转型

(3)清洗至中性

7、ODAP结晶

第6步骤得到的浓缩液进一步用喷雾干燥器进行干燥后可得到ODAP白色粉末，收率约90％。若要得到结晶，可将粉末状产物重新溶于少量热水中，用1M的盐酸调pH大约至2－3使其充分溶解。随后置于4℃下让其晶体析出。析出的晶体用冷去离子水(4℃左右)快速冲洗2次，然后室温干燥，研磨封装。

实施例1-2：三七素的提取与纯化

1、浸泡

挑选颗粒饱满无损伤的猪屎豆种子，准确称取500g(m₁)，先用自来水搓洗，除去种子表面的灰尘及其他杂质；再用去离子水用同样的方法洗涤三次，用1L去离子水浸泡6h。

2、制浆

称量浸泡好的猪屎豆种子，记为m₂，则500g猪屎豆种子在6h时间段内吸收水分的量为m₂-m₁。粉碎猪屎豆种子，分离残渣后获得浆液，静置3h，以使其浆液中的淀粉和粗纤维沉降，保留上清液待用。所有分离出的种子残渣可做饲料或有机肥，做到有用资源的全部利用。

3、凝固及过滤

取上述上清液3L并加热至80℃，然后加15gCaSO₄的50mL盐溶液至加热的浆液中。充分静置至冷却得到凝固物，用致密白布过滤所得凝固物，得浆水(内含ODAP)。过滤后的凝固物做有机肥，或动物饲料，提高资源利用率。

4、滤液离心

将滤液均分为质量相等的四等份，分装于1L的离心瓶中，在落地式冷冻离心机中以转速4000r/min，温度4℃离心20min，打开瓶盖，缓慢地将离心后的上清液倾倒于2L烧杯中。

5、调节上清液pH值并获得高纯度三七素

测出上清液原始pH值，并用6mol/L HCl调节上清液pH＝1.8。如实施例1-1所示进行吸附和结晶，得到高纯度三七素。

实施例1-3：三七素的提取与纯化

1、浸泡

挑选颗粒饱满无损伤的金合欢豆种子，准确称取500g(m₁)，先用自来水搓洗，除去种子表面的灰尘及其他杂质；再用去离子水用同样的方法洗涤三次，用1L去离子水浸泡6h。

2、制浆

称量浸泡好的金合欢豆种子，记为m₂，则500g金合欢豆种子在6h时间段内吸收水分的量为m₂-m₁。粉碎金合欢豆种子，分离残渣后获得浆液，静置3h，以使其浆液中的淀粉和粗纤维沉降，保留上清液待用。所有分离出的种子残渣可做饲料或有机肥，做到有用资源的全部利用。

3、凝固及过滤

取上述上清液3L并加热至90℃，然后加15g MgCl₂的50mL盐溶液至加热的浆液中。充分静置至冷却得到凝固物，用致密白布过滤所得凝固物，得黄浆水(内含ODAP)。过滤后的凝固物做有机肥，或动物饲料，提高资源利用率。

4、滤液离心

5、调节上清液pH值并获得高纯度三七素

测出上清液原始pH值，并用6mol/L HCl调节上清液pH＝1.6。如实施例1-1所示进行吸附和结晶，得到高纯度三七素。

实施例1-4：三七素的提取与纯化

1、浸泡

2、制浆

3、凝固及过滤

取上述上清液3L并加热至70℃，然后加6.5g硫酸钙和8.0g硫酸镁的50mL盐溶液至加热的浆液中。充分静置至冷却得到凝固物，用致密白布过滤所得凝固物，得黄浆水(内含ODAP)。过滤后的凝固物做有机肥，或动物饲料，提高资源利用率。

4、滤液离心

5、调节上清液pH值并获得高纯度三七素

测出上清液原始pH值，并用6mol/L HCl调节上清液pH＝1.5。如实施例1-1所示进行吸附和结晶，得到高纯度三七素。

实施例1-5：三七素的提取与纯化

1、浸泡

2、制浆

3、凝固及过滤

取上述上清液3L并加热至60℃，然后加6.5g硫酸钙和8.0g硫酸镁的50mL盐溶液至加热的浆液中。充分静置至冷却得到凝固物，用致密白布过滤所得凝固物，得黄浆水(内含ODAP)。过滤后的凝固物做有机肥，或动物饲料，提高资源利用率。

4、滤液离心

5、调节上清液pH值并获得高纯度三七素

实施例2：ODAP分离产品鉴定(对实施例1-1中所制备的ODAP产品进行鉴定)

1、高效液相色谱(HPLC)鉴定

按文献^[18]方法，采用FDNB柱前衍生进行HPLC检测。标准三七素HPLC色谱如图1所示；按照本发明方法分离的ODAP高效液相色谱图如图2所示。结果表明，本方法纯化得到ODAP与三七素β-ODAP的峰形及色谱柱保留时间一致。图1与图2中，均出现了少量的α-ODAP，这是由于FDNB方法中加热导致两同分异体之间互变造成的，也就是说，α-ODAP是检测过程造成的。图1与图2的HPLC谱图一致初步表明，本方法纯化的产品就是三七素β-ODAP，并且纯度达到色谱纯。

2、红外光谱检测结果

本方法分离产品分子的红外光谱有如下特征峰：3423.03cm-1(NH与OH伸展)，3050cm-1(NH+伸展)，1670.05cm-1(COOH中C＝O伸展)，1633.41cm-1(仲酰胺中C＝O伸展)，1590cm-1(-CO-中C＝O伸展)，1542.77cm-1(氨基酸NH3变形)，1403.92cm-1(-CO2-离子振动)，1259.28cm-1(-C-O振动)，761.74cm-1(氢键缔合仲酰胺NH变形)。这些结果与三七素β-ODAP标准品的红外光谱结果一致，进一步说明本方法纯化的产品就是三七素β-ODAP。

3、核磁共振波谱检测结果

对实施例1-1中所制备的样品进行核磁共振波谱检测，结果见图3-图8，其中：图3是三七素的1-C图；图4是三七素的1-H图；图5是三七素的2-C图；图6是三七素的2-H图；图7是三七素的3-H图；和图8是三七素的4-H图。

图3-图8中共振谱峰归属见式(I)及表1，其中是式(I)是β-ODAP的分子结构简图(对C进行了编号)。

以上本方法纯化的产品核磁共振波谱数据与标准品三七素的相关数据一致。说明纯化的产品为三七素。

表1.β-ODAP的¹H NMR和¹³C NMR共振谱

4、对纯化的β-ODAP进行质谱分析，分子离子峰位置为175。测得熔点为205-209℃，文献值为206℃。红外光谱及核磁共振谱(¹H NMR和¹³C NMR)与标准品的一致^[14]。

以上色谱图、红外光谱图、核磁共振谱以及质谱数据与标准品三七素的相应数据相比，均表明利用本方法纯化的产品为三七素。

对实施例1-2、1-3、1-4和1-5中所制备的ODAP产品进行鉴定，均取得类似的结果。

实施例3：活性验证

三七素是重要的止血成份，医药行业需求量大，目前，三七素主要从中药三七中提取，成本高，产量少。本发明用去离子水提取豆类植物中的ODAP(三七素)，基本未用到有机物，绿色环保，成本低廉。提取出的三七素可用于医疗上止血化瘀病症。剩余的豆类植物的有机组分如豆渣或沉淀物可作为食品、饲料喂养动物或是作为植物的有机肥料，甚至作为食品。本文所阐述的方法在开发和利用豆类植物的有效组分的同时，能达到资源的可循环利用，保护环境的目的。

为验证本发明方法或工艺制备的三七素的止血活性，对实施例1-3中获得的三七素进行如下试验。取20只小鼠(10只/组)，腹腔分别注射0.5mL的生理盐水和0.1mg/mL三七素。15分钟后在小鼠尾部中间静脉处，用手术刀片划破血管使出血，每隔30s，用白色餐巾纸擦拭伤口，至餐巾纸不能附着血为止，记录划破血管至止血时间。结果实验组的止血时间显著短于对照组，且平均止血时间比对照组缩短了至少6分钟。

虽然用上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不背离本发明的精神的前提下，本发明可进行进一步的修饰和变动，且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之内。

参考文献

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Claims

1.一种从豆科植物材料中分离和纯化三七素的方法，其包括如下步骤：

a.制备包含粉碎的含三七素豆科植物材料的水溶液；

b.向所述水溶液中添加一种或两种以上无机盐，静置后获富含三七素的上清液；

c.调节所述上清液的pH至小于等于2；和

2.一种从豆科植物材料中分离三七素的方法，其包括如下步骤：

a.制备包含粉碎的含三七素豆科植物材料的水溶液；和

3.一种从豆科植物材料中获得富含三七素的溶液的方法，其包括如下步骤：

a.制备包含粉碎的含三七素豆科植物材料的水溶液；和

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，对富含三七素的洗脱液进行干燥(例如冷冻干燥或喷雾干燥)，获得干燥的三七素；任选地，对干燥的三七素进行水溶解和重结晶操作，以获得纯度更高的三七素，如三七素晶体。

5.根据权利要求4的方法，对富含三七素的洗脱液进行干燥之前进行浓缩，然后将浓缩液进一步用喷雾干燥器进行干燥后或冷冻干燥后可得到ODAP粉末；任选地，为了进一步获得更纯的三七素，将ODAP粉末重新溶于水中使其充分溶解，随后静置并使晶体析出；进一步任选地，将所述析出的晶体用去离子水冲洗，然后干燥。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，对步骤b中所获得的上清液或水溶液进行浓缩，例如通过旋蒸而减压浓缩；和/或

所述的豆科植物材料选自猪屎豆、金合欢豆和山黧豆，优选为上述植物的种子；和/或

在步骤a中，为了更容易制备包含粉碎的含三七素豆科植物材料的水溶液，将含三七素豆科植物材料浸泡后粉碎所述豆科植物材料，或者先将所述豆科植物材料粉碎，然后浸泡,例如，对于山黧豆、猪屎豆、或者金合欢豆的种子，可以先将其用自来水搓洗，除去种子表面的灰尘及其他杂质；再用去离子水用同样的方法洗涤1-5次，然后用去离子水浸泡(例如浸泡6h)；将浸泡好的种子粉碎成浆液或打浆，以得到富含三七素的液体；任选地，可以将浆液静置(例如1-10h)，以使其溶液中的大部分淀粉和粗纤维充分沉降，并获取上清液待用；和/或

在步骤b中，所添加的无机盐可以为，例如钠盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、硫酸盐、醋酸盐、磷酸盐、铵盐、氯盐等，例如在步骤b中添加硫酸钙、氯化镁、硫酸钠、醋酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸铁、氯化铁等，或其组合，例如硫酸钙和氯化钠；硫酸钙和氯化镁；硫酸钙和硫酸镁等；任选地，所述添加的无机盐的组合中各无机盐的质量比可以为1：3-3：1，如1:1，示例性地，可添加质量比为1：1的硫酸钙和氯化钠、质量比为1：1的硫酸钙和氯化镁、质量比为1：1的硫酸钙和硫酸镁；优选地，将无机盐用水溶解后添加至步骤a中的水溶液中，更优选地，所述步骤a中的水溶液是加热的(40-120摄氏度)或者煮沸的；更进一步优选地，过滤和/或静置后获得的所述富含三七素的上清液，以获得更加澄清的上清液或含有更少固体颗粒的上清液；和/或

在步骤c中，将所述上清液的pH调整为小于等于2.0，例如用无机酸(如盐酸或者硫酸)调整上清液的pH至1.5-2.0；和/或

在步骤d中，所述阳离子交换树脂可以为Na型阳离子交换树脂；和/或，所用洗涤液为去离子水。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在使用所述Na型阳离子交换树脂之前进行如下步骤的预处理：

1)浸泡

将强酸性阳离子交换树脂(Na型)用食盐水(例如饱和的食盐水)浸泡以使树脂软化，去除树脂颗粒表面的杂质，防止树脂颗粒破裂；

2)酸化转型

将已软化的树脂浸泡于酸溶液中，以使树脂从Na型转化为H型；

3)清洗至中性

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将已软化的树脂浸泡于盐酸溶液中。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所加入的阳离子交换树脂在使用前进行预处理，其中预处理步骤包括：

(1)浸泡

取Na型强酸性阳离子交换树脂，加入饱和食盐水浸泡以使树脂软化，去除树脂颗粒表面的杂质，防止树脂颗粒破裂；

(2)酸化转型

将已软化的树脂浸泡于盐酸溶液中酸化，以至使树脂从Na型转化为H型；

(3)清洗至中性

转型完毕的树脂用去离子水分搅拌洗涤，直至洗涤树脂后的去离子水呈中性。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中用去离子水洗脱吸附后的阳离子交换树脂，获得富含三七素的洗脱液。