CN110433189A - 金银花三萜类化合物及挥发油的提取工艺 - Google Patents

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Abstract

金银花三萜类化合物及挥发油的提取工艺，利用超声波法提取金银花中挥发油和三萜类成分，分别考虑温度、料液比、超声时间、提取剂浓度因素的影响，结果表明，超声波辅助提取法提取金银花中的挥发油的最优条件范围：温度45‑65℃，超声时间60‑120min，乙醇浓度65‑85%；提取三萜类化合物的最优条件范围：温度55‑75℃、超声时间30‑50min、乙醇浓度70‑90%，为进一步的实验建立了基础。通过响应面分析优化结果表明，超声波法提取金银花中的挥发油的最佳工艺为：料液比1/25g/mL，乙醇浓度为84.7%，超声时间为91.0min，超声温度为52.7℃，超声功率300W，提取率为2.787%。超声波法提取三萜类化合物的最佳工艺为:超声提取法，料液比1/30g/mL,乙醇浓度为87.3%，超声时间为48.7min，超声温度为71.71℃,超声功率400W，提取率为0.301%。

Description

金银花三萜类化合物及挥发油的提取工艺
技术领域
本发明涉及金银花产物提取领域，尤其涉及金银花三萜类化合物及挥发油的提取工艺。
背景技术
金银花是一种忍冬科植物，是我国的传统中药。在夏初时花开放前采收，干燥，金银花呈棒状，上粗下细，略弯曲。花蕾呈黄色或白色，花萼绿色，密被短柔毛。气清香，味淡、微苦。
金银花拥有较好的清热解毒、保肝利胆功效，一直以来备受人们喜爱。金银花也能宣散风热，用于各种热性病，如身热、发疹、咽喉肿痛等症状效果显著。金银花是一种直接使用的食用植物，结合了营养，保健和药物特性。目前对金银花有效成分的研究主要集中在药理活性成分的提取，分离，结构鉴定和一些生物活性方面，且在中医药方面的研究较多。近年来，人们自我护理意识逐渐增强，许多研究人员开始将金银花有效成分应用到食品中，开发和研究以金银花为原料的健康食品。而研究健康食品中的具体作用和影响尤为重要。这对于提高金银花深加工水平和扩大其应用方法具有重要的经济和社会意义。
金银花中可提取的有效成分有黄酮类、有机酸类、挥发油类、多糖类、三萜皂苷类等。大量药理实验表明挥发油在临床上具有多方面的药理活性，如解热镇痛、抗病毒、抗菌消炎、抗突变、止咳平喘、抗肿瘤和抗过敏等药理作用。此外，挥发油还被广泛应用于香料、食品与化妆品等的生产。通过对三萜类化合物的生物活性及毒性研究，结果显示其具有抗病毒、抗炎、抗菌、溶血、抗癌、杀软体动物等活性。因此，挥发油和萜类资源的开发利用具有很大的社会效益和经济效益。作为金银花药材中的主要有效成分之一，研究其高效提取工艺变得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种金银花三萜类化合物及挥发油的提取工艺。
为了实现上述目的，金银花三萜类化合物的提取工艺，提取工艺包括以下步骤：向金银花粉末中按料液比1/50 ～1/20 g/mL 的比例加入70%-90%乙醇，超声温度为40~75℃，超声波功率200W-400W的条件下，超声提取30~50min，获得三萜类化合物提取液。
优选的，所述的提取工艺中的料液比为1/30g/mL 。
优选的，所述的提取工艺中的超声波功率为400W。
优选的，所述的提取工艺中的超声萃取时间为48.7min。
优选的，所述的提取工艺中的提取温度为71.71℃。
金银花挥发油的提取工艺，其特征在于，提取工艺包括以下步骤：
S1、向金银花花蕾粉末中按料液比1/30-1/10 g/mL加入55%-95%乙醇，于75℃恒温水浴锅中水浴加热12±2h，超声温度45~65℃、超声波功率200W-400W的条件下，超声提取60~120min获得提取液I；
S2、将步骤S1所得提取液I过滤，获得滤液Ⅰ；
S3、将步骤S2所得滤液Ⅰ蒸馏至无乙醇析出，获得浓缩液；
S4、向步骤S3所得浓缩液中加入正己烷进行萃取，获得萃取液；
S5、向步骤S4所得萃取液蒸馏至正己烷完全蒸发，获得金银花挥发油。
优选的，所述的提取工艺中的将干燥、干净金银花花蕾用粉碎机粉碎，过40目筛，于80℃烘干4-5h，获得金银花花蕾粉末。
优选的，S3、S5中的蒸馏设备为短程蒸馏器，通过分子蒸馏在混合液端分别获得浓缩液和金银花挥发油。
优选的，S3、S5中的蒸馏设备为旋转蒸发仪。
优选的，S4中浓缩液与正己烷的体积比为1mL∶20mL。
本发明的有益效果是：
利用紫外-可见分光光度计通过测定熊果酸标准品供试样不同波长下吸光值的大小，确定其最大吸收波长为548nm。
金银花提取工艺优化。利用超声波法提取金银花中挥发油和三萜类成分。分别考虑温度、料液比、超声时间、提取剂浓度因素的影响，通过实验结果表明，超声波辅助提取法提取金银花中的挥发油的最优条件范围：温度45-65℃，超声时间60-120min，乙醇浓度65-85% ；提取三萜类化合物的最优条件范围：温度55-75℃、超声时间30-50min、乙醇浓度70-90% ，为进一步的实验建立了基础。
通过响应面分析优化结果表明，超声波法提取金银花中的挥发油的最佳工艺为：料液比1/25g/mL，乙醇浓度为84.7%，超声时间为91.0min，超声温度为52.7℃，超声功率300W，提取率为2.787%。超声波法提取三萜类化合物的最佳工艺为:超声提取法，料液比1/30g/mL, 乙醇浓度为87.3%，超声时间为48.7min ，超声温度为71.71℃,超声功率400W，提取率为0.301%。
附图说明
图1为金银花三萜类化合物的提取工艺的熊果酸紫外吸收光谱图；
图2为金银花三萜类化合物的提取工艺的熊果酸标准曲线图；
图3为金银花三萜类化合物的提取工艺的不同提取方法下金银花三萜化合物的提取率；
图4为金银花三萜类化合物的提取工艺的不同乙醇浓度下三萜类化合物的提取率；
图5为金银花三萜类化合物的提取工艺的不同料液比下三萜类化合物的提取率；
图6为金银花三萜类化合物的提取工艺的不同提取时间下三萜类化合物的提取率；
图7为金银花三萜类化合物的提取工艺的不同提取温度下三萜类化合物的提取率；
图8为金银花三萜类化合物的提取工艺的不同超声功率下三萜类化合物的提取率；
图9为金银花三萜类化合物的提取工艺的乙醇浓度和时间对三萜类化合物提取率影响结果的二次回归方程的响应面及其等高线图；
图10为金银花三萜类化合物的提取工艺的乙醇浓度和温度对三萜类化合物提取率影响结果的二次回归方程的响应面及其等高线图；
图11为金银花三萜类化合物的提取工艺的时间和温度对三萜类化合物提取率影响结果的二次回归方程的响应面及其等高线图；
图12为金银花挥发油的提取工艺的不同提取方法下金银花中挥发油的提取率；
图13为金银花挥发油的提取工艺的不同乙醇浓度下挥发油的提取率；
图14为金银花挥发油的提取工艺的不同料液比下挥发油的提取率；
图15为金银花挥发油的提取工艺的不同提取时间下挥发油的提取率；
图16为金银花挥发油的提取工艺的不同提取温度下挥发油的提取率；
图17为金银花挥发油的提取工艺的不同超声功率下挥发油的提取率；
图18为金银花挥发油的提取工艺的乙醇浓度和时间对挥发油提取率影响结果的二次回归方程的响应面及其等高线图；
图19为金银花挥发油的提取工艺的乙醇浓度和温度对挥发油提取率影响结果的二次回归方程的响应面及其等高线图；
图20为金银花挥发油的提取工艺的时间和温度对挥发油提取率影响结果的二次回归方程的响应面及其等高线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
金银花三萜类化合物的提取工艺，提取工艺包括以下步骤：向金银花粉末中按料液比1/50 ～ 1/20 g/mL 的比例加入70%-90%乙醇，超声温度为40~75℃，超声波功率200W-400W的条件下，超声提取30~50min，获得三萜类化合物提取液。
金银花三萜类化合物的提取工艺，所述的提取工艺中的料液比为30g/mL 。
金银花三萜类化合物的提取工艺，所述的提取工艺中的超声波功率为400W。
金银花三萜类化合物的提取工艺，所述的提取工艺中的超声萃取时间为48.7min。
金银花三萜类化合物的提取工艺，所述的提取工艺中的提取温度为71.71℃。
金银花挥发油的提取工艺，提取工艺包括以下步骤：
S1、向金银花花蕾粉末中按料液比1/30-1/20 g/mL加入55%-95%乙醇，于75℃恒温水浴锅中水浴加热12±2h，超声温度45~65℃、超声波功率200W-400W的条件下，超声提取60~120min获得提取液I；
S2、将步骤S1所得提取液I过滤，获得滤液Ⅰ；
S3、将步骤S2所得滤液Ⅰ蒸馏至无乙醇析出，获得浓缩液；
S4、向步骤S3所得浓缩液中加入正己烷进行萃取，获得萃取液；
S5、向步骤S4所得萃取液蒸馏至正己烷完全蒸发，获得金银花挥发油。
金银花挥发油的提取工艺，所述的提取工艺中的将干燥、干净金银花花蕾用粉碎机粉碎，过40目筛，于80℃烘干4-5h，获得金银花花蕾粉末。
金银花挥发油的提取工艺，S3、S5中的蒸馏设备为短程蒸馏器，通过分子蒸馏在混合液端分别获得浓缩液和金银花挥发油。
金银花挥发油的提取工艺，S3、S5中的蒸馏设备为旋转蒸发仪。
金银花挥发油的提取工艺，S4中浓缩液与正己烷的体积比为1mL∶20mL。
1实验原料、仪器及试剂
实验原料
金银花药材，购于杭州药店。
主要仪器
FW 177型中草药粉碎机，HWS12型恒温水浴锅，JY96-ⅡN超声波细胞粉碎机，R-501型旋转蒸发器（上海一科仪器有限公司），DLSB-5/20型低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循环水氏真空泵（上海一科仪器有限公司生产），G2X-9076MBE电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），FA1604N 型电子天平（丹佛仪器有限公司），UV-1100 型紫外-可见分光光度计。
主要试剂
无水乙醇(AR)，正己烷(AR)，95%乙醇，5%香草醛-冰醋酸，高氯酸（AR），冰醋酸（AR），熊果酸标准品（北京世纪奥科生物技术有限公司提供）。
2金银花三萜类化合物的提取工艺优化
2.1最大吸收波长
2.11最大吸收波长试验
利用三萜类化合物与高氯酸反应在显色剂作用下生成有色化合物，在一定的波长下有吸收进行测定。金银花中三萜类化合物的主要成分是熊果酸。熊果酸的英文名为Ursolicacid，分子式C30H48O3，分子量456.70，是存在于许多天然植物中的一种典型的三萜类化合物。故本试验以熊果酸标准品为供试品，采用具有扫描功能的分光光度计在400-800nm的波长下测定吸光度，确定其最大吸收波长。
准确称取熊果酸标准品10.00mg至100mL容量瓶中，用无水乙醇配成浓度为100.00μg/mL的供试品溶液。吸取1.0mL供试品溶液，在100℃水浴中挥干乙醇，另取一支空白试管作为空白对照，分别加 5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，高氯酸1.0mL，60℃水浴10min，冰浴冷却，加冰醋酸5.0mL，摇匀，在400-800nm的波长下扫描测定吸光度，扫描间隔为1.0nm。
在一定波长范围内测定熊果酸标准溶液的吸光度, 结果如图1，表明波长548 nm时吸光度值最大, 故选择548 nm作为实验波长。
2.12标准曲线的制作
分别精确吸取100.00 μg/ mL的熊果酸标准溶液0.2、0.4 、0.6 、0.8、1.00 mL 于试管中，100℃水浴挥干溶剂，再分别加入0.3 mL5%香草醛-冰醋酸溶液和1.0 mL的高氯酸溶液，60℃水浴反应10 min，冰水浴冷却，继续加入冰醋酸5.0mL，摇匀，以试剂空白作对照，在548nm处分别测吸光度。并以熊果酸标准溶液的浓度为横坐标，对应吸光度为纵坐标作图，即得熊果酸标准曲线如图2。其回归方程为：Y=0.0367X-0.0189， R2=0.9994。本品在5.00-20.00μg/mL线性良好。
2.13实验结果
利用熊果酸作为标准品探究最大吸收波长，得出金银花中三萜类化合物的最大吸收波长为548nm。以熊果酸标准溶液的浓度为横坐标，测定的吸光度为纵坐标，作图得到熊果酸标准曲线。其回归方程为：Y=0.0367X-0.0189， R2=0.9994。在5.00-20.00μg/mL线性良好。
2.2金银花三萜类化合物的不同提取方法比较
2.2.1水浴回流提取法
准确称取若干份金银花粉末，每份 2.00 g，分别按料液比1/30，乙醇溶液75%，水浴温度60℃, 提取3h，平均分为两次进行水浴回流提取后，过滤，定容至50mL，作为供试液I备用。
2.2.2超声提取法
准确称取若干份金银花粉末，每份2.00 g，分别置于大试管中，加入75%乙醇，料液比1/30,置于超声波细胞粉碎器（超声频率20-25kHz，超声功率400W）中提取40min，过滤得滤液；在旋转蒸发仪中将滤液60℃水浴浓缩至蒸干所有溶剂。然后加适量无水乙醇超声复溶，并加入活性炭，置于60℃水浴中加热10 min脱色，趁热过滤至25mL容量瓶中，加无水乙醇定容，再移取5mL于50mL容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，作为供试液II备用。
2.2.2实验结果
采用分光光度法对供试液I、供试液II测定其提取率，结果如图3所示。金银花中总三萜的得率：超声提取法＞水浴回流提取。超声提取法操作工艺简单，成本低廉且提取率较高。
2.3三萜类化合物提取单因素实验
步骤1：将干燥、干净金银花用粉碎机粉碎，过40目筛，于80℃烘干4-5h，获得金银花粉末备用。
步骤2：取步骤1中的金银花粉末中分别按料液比1/10g/mL、1/20g/mL 、1/30g/mL、1/40g/mL、1/50g/mL 的比例分别加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，超声温度分别为55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，超声频率20-25kHz，超声波功率250W、300W、350W、400W、450W的条件下，超声分别提取20min、30min、40min、50min、60min，获得三萜类化合物提取液。
步骤3，将步骤2 初步优选出的各个挥发油提取的影响因素：以70%、80%、90%乙醇为提取剂，在料液比为1/30g/mL，提取温度为60℃、65℃、70℃，超声波功率为400W 的条件下，超声频率20-25kHz，超声提取30 min、40 min、50min ；利用这些3水平的不同影响因子，采用响应面设计优化金银花三萜类化合物的提取工艺。
步骤4，在单因素试验基础上，根据Box-Behnken 的中心组合设计原理，以提取剂浓度、超声提取时间和超声提取温度三个因素为自变量( 分别以A/%、B/min、C/℃表示)，以三萜类化合物得率为响应值设计了三因素三水平共17个实验点的响应面分析实验，其中分为12 个析因点和5 个零点。
2.3.1单因素实验
（1）不同提取液浓度比较
准确称取2.00 g金银花粉末5份，料液比1/30，提取温度60℃，超声频率20-25kHz，超声功率400W，提取40min，乙醇浓度分别为50%，60%，70%，80%，90%提取，所得金银花三萜化合物提取率见图4。
随乙醇浓度增加，总三萜提取率逐渐增大。这是因为提取剂浓度增大，会使其极性减小，从而增大总三萜的溶解度，选择 70%、80%、90%的乙醇溶度进行响应面优化。
（2）不同料液比比较
准确称取2.00 g金银花粉末5份，料液比分别为1/10,1/20,1/30,1/40,1/50,提取温度60℃，乙醇浓度80%，超声频率20-25kHz，超声功率400W，提取40min，即得，所得金银花三萜化合物提取率见图5。
三萜类化合物的提取率随料液比的增加而增大，而增大到一定程度，提取率几乎不发生变化。选择料液比为1/30g/mL较为适宜。
（3）不同提取时间比较
准确称取2.00 g金银花粉末5份，料液比1/30,提取温度60℃，乙醇浓度80%，，超声功率400W，超声频率20-25kH，分别提取20,30,40,50,60min,即得，所得金银花三萜化合物提取率见图6。
提取时间的延长会增大三萜类化合物的提取率。在提取40-60min时，提取率增加较少。为了节约时间,缩短提取周期,选择 选择30、40、50min进行响应面分析。
（4）不同提取温度比较
准确称取2.00g金银花粉末5份，料液比1/30，乙醇浓度80%，超声频率20-25kHz,超声功率400W，分别在55，60，65，70，75℃提取40min，即得，所得金银花三萜化合物提取率见图7。
温度升高，三萜化合物的提取率总体增大，但当温度从70℃增加到最大，提取率略有减小。究其原因可能是温度升高增大了三萜类化合物溶解度，从而增大提取率，但当温度升高至超过一临界值，有可能会破坏萜类成分的结构而使其活性成分发生变化，且会增加杂质的溶出量，所以反而使提取率降低。因此取超声提取温度65、70、75℃进行响应面分析。
（5）不同超声功率比较
准确称取2.00g金银花粉末5份，料液比1/30，乙醇浓度 80%，提取温度60℃、超声频率20-25kHz，超声功率为250，300，350，400，450W，提取40min，即得，所得金银花三萜化合物提取率见图8
随着超声功率的加大，三萜化合物的提取率增加，200W到400W时增加趋势较大，选择超声功率400W比较合适。
2.3.2响应面优化
（1）响应面试验设计表
中心组合试验方案中的因素及水平如表1所示。采用Design－Expert 8. 0. 6统计软件对实验结果进行响应面回归分析。
表1 三萜类化合物提取响应面试验设计
以三萜类化合物提取率为响应值，试验方案及结果见表5。
表2三萜类化合物响应面试验设计方案及试验结果
（2）回归模型建立及方差分析
利用Design Expert 8.05软件对表3实验数据进行分析，获得三萜类化合物提取率对乙醇浓度、超声时间、超声温度的多元二次回归方程：
三萜类化合物提取率(Y)=0.28+0.024A+0.014B+2.625×10-3C-7.725×10-3 A2-1.975×10-3B2-1.475×10-3C2-3.500×10-3AB-5.000×10-4AC+2.250×10-3BC
表3回归模型方差分析
注：“*”为显著（P<0.05）；“**”为极显著（P<0.01）。
由表3可知，P值基本大于0.1，说明回归方程的回归效果不显著；模型的决定系数R2 = 0.9717，说明模型与实际实验拟合较好；校正决定系数AdjR2 = 0.9353，说明该模型能解释97.17％响应值的变化。
表6中模型失拟项的P值为0.0850，大于0.05，表明模型的失拟项不显著；说明模型拟合度良好，模型的残差可能是随机误差产生。
根据表6的显著性分析结果，因素一次项A对三萜类提取率的影响极显著（P<0.01），一次项B和二次项A2的影响显著（p＜0.05）。由此可知，各影响因素对金银花中三萜类化合物提取率的影响不是简单的线性关系。综合以上表明这个模型建立的回归方程能运用于超声提取法提取金银花三萜类化合物提取条件优化的理论预测。
（2）响应面图形分析
分别将模型中的乙醇浓度，超声时间，超声温度的其中一个因素固定在0水平，得到另外两个因素的交互影响结果，二次回归方程的响应面及其等高线如图9，图10，图11所示。
由图9-11可以看出，影响三萜类化合物提取率的最显著因素为乙醇浓度（A），表现为响应面变化弧度较大。超声时间（B）的影响其次，超声温度（C）的影响最小，表现为响应面弧度变化平缓，说明对响应值影响相对较小。乙醇浓度（A）>超声时间（B）>超声温度（C）。此外，从等高线的形状从图17至图19可以看出，B与C之间交互作用相对更显著。
（3） 验证试验
利用Design Expert 8.05分析，得到三萜类化合物最佳提取条件为：乙醇浓度为87.26%，超声时间为48.73min，超声温度为71.71℃。此条件下的提取预测值为0.30064%。
为检验模型的可靠性，进行实验验证。实验中乙醇浓度、超声时间和超声温度分别控制为优化值：87.3%，48.7min，71.7℃，三次平行实验，测得三萜类提取率分别为0.292%,0.295%,0.293%，平均值为0.29333%，达到了回归模型预测理论值的97.57%，实验结果与模型符合良好，说明该模型能较好地模拟和预测金银花三萜类提取率。
2.3.3实验结果
利用单因素实验的实验结果，确定了较优的实验条件范围，再进行响应面分析优化，综合考虑，最后得出超声提取法提取金银花三萜类化合物的最佳工艺：超声提取法，料液比1/30g/mL,乙醇浓度为87.3%，超声时间为48.7min，超声温度为71.71℃，超声功率400W。
3金银花挥发油的提取工艺优化
3.1金银花挥发油的检测方法
重量分析法是通过称量物质的质量并以一定的计算公式得到被测物质组分含量的一种分析方法。分析时，一般是先采用适当方法将被测组分从原料中提取分离出来，转化为一定的称量形式并称重，通过计算得出被测组分的含量。
金银花挥发油得率=金银花挥发油的质量/金银花粗粉的质量×100%
3.2金银花挥发油不同提取方法比较
3.2.1共水蒸馏法
准确称取粉碎后金银花粉末2.00g于烧瓶中，加入500mL水，浸泡2h，加入玻璃珠数粒，振摇均匀，连接挥发油测定器与回流冷凝管。从冷凝管上端通冷凝水，使其充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流出烧瓶为止。在垫有石棉网的电炉上缓慢加热至微沸，保持微沸状态7个小时。停止加热，放置1h，开启测定器下端的活塞，用干燥的小烧杯接取油层，隔夜干燥除去水分，称重。计算重量差，计算其提取率。
3.2.2超声辅助提取法
将金银花花蕾烘干并粉碎,过30目筛。取2.00g加入到75%的乙醇溶液中,料液比1/30g/mL,,于恒温水浴锅中12h。设定超声时间60min，超声功率300W进行提取,过滤得滤液，在旋转蒸发仪中将滤液浓缩至无乙醇析出，所得浓缩液加入正己烷萃取,然后再将萃取液旋转浓缩至正己烷全部蒸发,剩余的为金银花挥发油。称重。计算重量差，计算其提取率。
3.2.3实验结果
超声辅助提取法和共水蒸馏法的提取率如图12所示，金银花挥发油的提取率：超声波辅助提取法＞共水蒸馏法。同时考虑实验成本、操作简便性，超声波辅助提取法操作流程简便。
3.3金银花挥发油提取单因素实验
S0：将干燥、干净金银花花蕾用粉碎机粉碎，过40目筛，于80℃烘干4-5h，获得金银花粉末备用。
S1：取S0中的金银花花蕾粉末中分别按料液比1/10g/mL、1/15g/mL 、1/20g/mL、1/25g/mL、1/30g/mL 的比例分别加入55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，于75℃恒温水浴锅中水浴加热12±2h，超声温度分别为55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，超声波功率200W、250W、300W、350W、400W的条件下，超声频率20-25kHz，超声分别提取30min、60min、90min、120min、150min，获得提取液I；
S2、将步骤S1所得提取液I过滤，获得滤液Ⅰ；
S3、将步骤S2所得滤液Ⅰ蒸馏至无乙醇析出，获得浓缩液；
S4、向步骤S3所得浓缩液中加入正己烷进行萃取，获得萃取液；
S5、向步骤S4所得萃取液蒸馏至正己烷完全蒸发，获得金银花挥发油。
步骤3，将步骤2 初步优选出的各个挥发油提取的影响因素：以70%、80%、90%乙醇为提取剂，在料液比为1/30g/mL，提取温度为60℃、65℃、70℃，超声波功率为400W 的条件下，超声提取30 min、40 min、50min ；利用这些3水平的不同影响因子，采用响应面设计优化金银挥发油的提取工艺。
步骤4，在单因素试验基础上，根据Box-Behnken 的中心组合设计原理，以提取剂浓度、超声提取时间和超声提取温度三个因素为自变量( 分别以A/%、B/min、C/℃表示)，以挥发油得率为响应值设计了三因素三水平共17个实验点的响应面分析实验，其中分为12个析因点和5 个零点。
3.3.1单因素实验
（1）不同提取液浓度比较
设定超声时间60min,超声温度60℃，料液比1∶20，超声功率300W,超声频率20-25kHz的条件下,分别用55%，65%，75%，85%，95%乙醇提取金银花挥发油,即得，所得金银花挥发油提取率见图13。
当乙醇浓度自45%增加到95%时,金银花挥发油提取率随之增大。但乙醇浓度从85%增大到95%时,提取率变化不太明显。考虑到乙醇浓度提高会促使一些色素、亲脂性强的成分和醇溶性杂质的溶出量增加,以及增加成本,故选择65%、75%、85%的乙醇浓度进行响应面优化。
（2）不同料液比比较
设定乙醇浓度75%，超声时间60min，超声温度60℃，超声功率300W，超声频率20-25kHz的条件下，将料液比分别设定为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1:30进行试验，即得，所得金银花挥发油提取率见图14。
金银花挥发油提取率随料液比的提高而提高,当料液比达到1/30g/mL时,得率达到最高值。当料液比从1/25g/mL提高到1/3g/mL的过程时,提取率提高不明显。而料液比越大,所需乙醇越多，旋转蒸发浓缩时间越长,萃取时所用的正己烷越多,选择料液比为1/25g/mL左右较为合适。
（3）不同提取时间比较
设定乙醇浓度75%,超声温度60℃,料液比1∶20,超声功率300W,超声频率20-25kHz的条件下,分别超声提取30，60，90，120，150min进行试验,即得，所得金银花挥发油提取率见图15。
超声时间从30min延长到120min时,得率逐渐升高,由于超声时间送90增加到150min,提取率升高并不明显,为了节约提取时间,缩短提取周期,选择时间为60、90、120min进行响应面优化。
（4）不同提取温度比较
设定乙醇浓度75%,超声时间60min,料液比1∶20,超声功率300W,超声频率20-25kHz的条件下,设定提取温度分别为45，55，65，75，85℃进行试验,即得，所得金银花挥发油提取率见图16。
超声温度自45℃提高到65℃时,金银花挥发油提取率上升趋势明显,但当超声温度自65℃提高到85℃时,提取率呈减小趋势。所以选择超声温度55、65、75℃进行响应面优化。
（5）不同超声功率比较
设定乙醇浓度75%，超声温度60℃，超声时间60min,料液比1∶20,超声频率20-25kHz的条件下,设定超声功率分别为200，250，300，350，400W进行试验,即得，所得金银花挥发油提取率见图17。
超声功率在200-300W是挥发油得率有所上升，而之后则下降，但从整体得率大小来看，得率的起伏并不太大，考虑到超声功率过大可能会增加其他物质的溶出，且对仪器的消耗更大，选择超声功率在300W左右较为适宜。
3.3.2响应面优化
（4）响应面试验设计表
中心组合试验方案中的因素及水平如表1所示。采用Design－Expert 8. 0. 6统计软件对实验结果进行响应面回归分析。
表4挥发油提取响应面试验设计
以挥发油提取率为响应值，试验方案及结果见表5。
表5挥发油提取响应面试验设计方案及试验结果
（4）回归模型建立及方差分析
利用Design Expert 8.05软件对表5实验数据进行分析，获得挥发油提取率对乙醇浓度、超声时间、超声温度的多元二次回归方程：
挥发油提取率（Y）=2.37+0.86A+0.12B+0.11C-0.44A2-0.098B2-0.063C2-0.039A B-0.11AC+0.013BC
表6回归模型方差分析
注：“*”为显著（P<0.05）；“**”为极显著（P<0.01）。
对所得模型进行方差分析和模型系数的显著性检验，结果见表6。由表6可知，回归模型极显著( P <0.0001)，说明所建立的模型有意义；失拟项P = 0. 1124＞0. 05，无显著性差异，说明模型拟合度较好，可用此模型和方程来分析和预测挥发油的提取率。
从方差分析的结果可得，校正决定系数Adj R2为0.9530，说明该模型能解释95.30%响应值的变化，该模型与数据的拟合度较高，实验误差较小。从显著性检验结果可知，模型一次项中A（乙醇浓度）影响为极显著；B，C，A2，B2，C2，AC的影响显著。
（5）响应面图形分析
根据回归方程可绘制出对应的响应面图，响应面图是在各实验因素交互作用下所得到的响应值结果所构成的三维空间曲面，该图可用来预测和检验变量的响应值以及确定变量之间的相互关系。挥发油提取的响应曲面和对应等高线见图18-20。
由几组图可以看出，对挥发油提取率的影响：乙醇浓度（A）>超声时间（B）>超声温度（C）。
由响应曲面图可以看出，随着乙醇浓度增大，挥发油的提取率逐渐增加；提取时间延长，挥发油提取率增加，但这种影响后期的趋势不明显，其原因可能是一定的乙醇浓度和温度下所能提取出的挥发油是有限的；随着温度升高，挥发油提取率随之增加，但当温度增大到一定程度后，提取率有下降的趋势。
等高线的形状反映了各因素交互效应的强弱，椭圆形表示二因素交互作用显著，而圆形则与之相反。从图18至图20可以看出，B与C之间交互作用相对更显著。
（6） 验证试验
根据 Box-Behnken 试验所得的结果和二次多项回归方程，利用Design Expert 8.05分析，得到最佳提取条件为：乙醇浓度为84.71%，超声时间为90.98min，超声温度为52.72℃。此条件下的提取预测值为2.78719%。
为检验模型的可靠性，进行实验验证。实验中乙醇浓度、超声时间和超声温度分别控制为优化值：84.7%，91.0min，52.7℃，进行三组平行实验，测得挥发油提取率分别为2.67%,2.69%,2.72%，实际挥发油提取率平均值为2.69333%，达到了回归模型预测理论值的96.63%，实验结果与模型符合良好。
3.3.2实验结果
利用单因素实验的实验结果，确定了较优的实验条件范围，再进行响应面分析优化，综合考虑，最后得出超声波辅助提取法提取金银花中的挥发油的最佳工艺：料液比1/25g/mL,，乙醇浓度为84.7%，超声时间为91.0min，超声温度为52.7℃，超声功率300W。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.金银花三萜类化合物的提取工艺，其特征在于，提取工艺包括以下步骤：向金银花粉末中按料液比1/20 ～ 1/50 g/mL 的比例加入70%-90%乙醇，超声温度为40~75℃，超声波功率200W-400W的条件下，超声提取30~50min，获得三萜类化合物提取液。
2.根据权利要求1所述的金银花三萜类化合物的提取工艺，其特征在于，所述的提取工艺中的料液比为1/30g/mL 。
3.根据权利要求1所述的金银花三萜类化合物的提取工艺，其特征在于，所述的提取工艺中的超声波功率为400W。
4.根据权利要求1所述的金银花三萜类化合物的提取工艺，其特征在于，所述的提取工艺中的超声萃取时间为48.7min。
5.根据权利要求1所述的金银花三萜类化合物的提取工艺，其特征在于，所述的提取工艺中的提取温度为71.71℃。
6.金银花挥发油的提取工艺，其特征在于，提取工艺包括以下步骤：
S1、向金银花花蕾粉末中按料液比1/30-1/10 g/mL加入55%-95%乙醇，于75℃恒温水浴锅中水浴加热12±2h，超声温度45~65℃、超声波功率200W-400W的条件下，超声提取60~120min获得提取液I；
S2、将步骤S1所得提取液I过滤，获得滤液Ⅰ；
S3、将步骤S2所得滤液Ⅰ蒸馏至无乙醇析出，获得浓缩液；
S4、向步骤S3所得浓缩液中加入正己烷进行萃取，获得萃取液；
S5、向步骤S4所得萃取液蒸馏至正己烷完全蒸发，获得金银花挥发油。
7.根据权利要求7所述的金银花挥发油的提取工艺，其特征在于，所述的提取工艺中的将干燥、干净金银花花蕾用粉碎机粉碎，过40目筛，于80℃烘干4-5h，获得金银花花蕾粉末。
8.根据权利要求7所述的金银花挥发油的提取工艺，其特征在于，S3、S5中的蒸馏设备为短程蒸馏器，通过分子蒸馏在混合液端分别获得浓缩液和金银花挥发油。
9.根据权利要求7所述的金银花挥发油的提取工艺，其特征在于，S3、S5中的蒸馏设备为旋转蒸发仪。
10.根据权利要求7所述的金银花挥发油的提取工艺，其特征在于，S4中浓缩液与正己烷的体积比为1mL∶20mL。
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