CN110408581A - 一种o24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法 - Google Patents

一种o24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110408581A
CN110408581A CN201910623938.1A CN201910623938A CN110408581A CN 110408581 A CN110408581 A CN 110408581A CN 201910623938 A CN201910623938 A CN 201910623938A CN 110408581 A CN110408581 A CN 110408581A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ghost
coli
preparation
enteropathogenic
pbv221
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910623938.1A
Other languages
English (en)
Inventor
袁橙
郭长明
张步彩
郝福星
蔡丙严
唐炳红
刘剑华
唐晨晨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Original Assignee
Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College filed Critical Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Priority to CN201910623938.1A priority Critical patent/CN110408581A/zh
Publication of CN110408581A publication Critical patent/CN110408581A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，该方法包括分离菌株、血清型鉴定、溶菌质粒的构建、菌蜕的制备及灭活处理步骤；其中，在溶菌质粒的构建时使用pBV221载体对血清型为O24的大肠杆菌菌株进行溶菌质粒的构建；灭活处理时采用β‑丙内酯。制备过程简单且无需使用诱导剂、甲醛和冷冻干燥设备，降低成本，填补了行业中O24型大肠杆菌菌蜕制备领域的空白，解决了需要加入诱导剂IPTG，成本较高，步骤繁琐，甲醛灭活菌蜕中残留甲醛影响动物健康的技术问题。

Description

一种O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法
技术领域
本发明涉及菌蜕领域，更具体地，涉及一种O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法。
背景技术
菌蜕是利用裂解基因制成的革兰氏阴性细菌的菌壳，是不包含核酸及细胞质等细胞内容物的细菌空壳，这种细菌空壳保持了原细菌完整的内外膜结构，包括膜表面的各种抗原成分和一些粘附特性，因此可以刺激机体产生良好的体液、细胞和黏膜免疫，被认为是一种新型的候选疫苗。在上世纪80年代奥地利学者W.Lubitz等首先研发出这种独特的灭活疫苗：革兰氏阴性菌表达噬菌体的裂解蛋白E后，革兰氏阴性菌在该裂解蛋白和渗透压的作用下在细胞膜上形成一个跨膜通道结构，细菌内的细胞质内容物通过这个通道排出，这种灭活方式是非变性的，所以细菌表面结构的化学性质和物理性质不会发生任何改变，制备的菌蜕使细菌表面的各种免疫黏附成分和抗原分子都完整地保存下来。研究发现，菌蜕在不同种的血清型之间能诱导交叉免疫保护作用，在牛、兔和禽类等动物的免疫结果也表明，菌蜕免疫动物可以起到很好的免疫保护作用。同时，菌蜕具有免疫佐剂性质以及递送系统功能，可以将其它抗原锚定于菌蜕表面制备成重组疫苗，或者将药物装载于菌蜕用于疾病的靶向治疗。菌蜕疫苗和载体还具备制备工艺简单，保存与运输方便等优势，因此有较为广阔的应用前景。
目前，对牛、猪、鸡和渔用革兰阴性菌菌蜕疫苗研制的报道较多，但对水禽致病性大肠杆菌菌蜕疫苗制备的报道较少。但是，这些报道的水禽致病性大肠杆菌菌蜕在制备过程中存在以下缺点：(1)所用的抗性的原核表达载体通常为pET系列载体，在溶菌质粒构建时，需要加入诱导剂IPTG，成本较高，步骤繁琐；(2)灭活通常采用甲醛灭活的方法或冻干灭活的方法，但是，甲醛毒性较强，对动物健康危害较大，而冻干法需要专业的冻干设备且耗时较长；(3)采用的大肠杆菌菌株通常为血清型O78菌株，因为不同血清型的菌蜕之间没有交叉保护力，因此只能用于O78菌株感染的免疫预防。
发明内容
本发明的目的是针对上述的不足，提出一种鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法。本发明采用O24型大肠杆菌菌株和pBV221载体进行溶菌质粒的构建和菌蜕的制备，并使用可快速水解、无毒的β-丙内脂对菌蜕进行灭活，得到O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕。制备过程简单且无需使用诱导剂、甲醛和冷冻干燥设备，降低成本，填补了行业中O24型大肠杆菌菌蜕制备领域的空白，解决了其它载体需要加入诱导剂IPTG，成本较高，步骤繁琐，甲醛灭活菌蜕中残留甲醛影响动物健康的技术问题。本发明制备得到的O24 型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的裂解率高达99.99％，血清抗体水平显著提高，为进一步研制禽致病性大肠杆菌菌蜕疫苗和可用于禽类细菌病、病毒病和寄生虫病的新型疫苗载体或佐剂奠定了研究基础。
本发明的技术方案是：
本发明提供一种O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，该方法包括分离菌株、血清型鉴定、溶菌质粒的构建、菌蜕的制备及灭活处理步骤；其中，在溶菌质粒的构建时使用pBV221载体对血清型为O24的大肠杆菌菌株进行溶菌质粒的构建；灭活处理时采用β-丙内酯。
所述的用pBV221载体对血清型为O24的大肠杆菌菌株进行溶菌质粒的构建的方法为：将E基因连接至pUC57载体，得到pUC57-E；再用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切重组质粒pUC57-E和表达载体pBV221，利用T4DNA连接酶将E基因片段连接至载体pBV221，连接产物转化至DH5 α感受态细胞，在氨苄抗性平板上筛选阳性克隆并扩大培养，从菌液中提取质粒并进行双酶切鉴定和测序鉴定，构建pBV221-E溶菌质粒。
所述的E基因序列为：
ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGA GTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAA CGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTA ATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCT TGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAA AACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAGGAGTGA。
E基因的合成方法为：先将E基因分为多条交替的引物，用固相亚磷酰胺三酯法合成这些引物；再用PCR引物搭桥的方式拼接出E基因片段。
所述的菌蜕的制备方法为：将构建的pBV221-E溶菌质粒转化至上述分离菌株，用氨苄抗性平板筛选阳性克隆，通过筛选鉴定得到pBV221-E/D阳性克隆，将pBV221-E/D菌液在28℃-35℃振荡培养(温度低于28℃造成生长过于缓慢，高于35℃时会造成质粒的提前诱导表达)至OD600为0.5，将 OD600为0.5的菌液置于40℃-42℃诱导表达(诱导表达中如温度低于40℃热诱导作用不够强，高于42℃又会降低细菌的活力)，每隔30min取样测量菌液的OD600值；诱导表达培养至pBV221-E/D菌液的OD600值不变时，即为菌蜕的菌液。
采用β-丙内酯两次对制备的菌蜕进行灭活处理。所述的灭活处理步骤为：将制备得到的菌蜕的菌液中加入β-丙内酯至终浓度为0.025％，静置作用后，离心，收集沉淀；先在沉淀中加与原始菌液等体积的PBS溶液重悬，离心并收集沉淀；再在前述沉淀中加原始菌液1/2体积的PBS溶液重悬，离心并收集沉淀；最后再在前述沉淀中加原始菌液1/5体积的PBS溶液重悬，然后加入β-丙内酯至终浓度为0.05％，再次静置作用，得到O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕。所述的第一次静置作用的反应条件为37～42℃下作用 1～2h，再次静置作用的反应条件为37～42℃作用2～3h。
所述的血清型鉴定是通过玻板凝集试验和/或试管凝集试验对鸭致病性大肠杆菌进行血清型鉴定，分离鉴定出血清型为O24的大肠杆菌菌株。所述的血清型鉴定的具体步骤为：将鸭致病性大肠杆菌菌株接种于2mL LB 液体培养基，先在37℃下150～200rpm震荡培养10-20h，再在121℃、 103.4kPa高压下培养2h，然后高压后的菌液离心弃上清液，用400μL0.5％的石炭酸生理盐水重悬菌体并制成浓稠悬液，作为大肠杆菌菌体抗原；取7 μL大肠杆菌菌体抗原与2μL大肠杆菌O抗原血清置于玻板上混匀至出现凝集，确定血清型。
所述的分离菌株包括麦康凯培养基筛选、生化鉴定和PCR检测步骤。
所述的pBV221载体是氨苄青霉素抗性的pBV221载体。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用O24型大肠杆菌菌株和pBV221载体进行溶菌质粒的构建和菌蜕的制备，并使用可快速水解、无毒的β-丙内脂对菌蜕进行灭活，得到O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕。制备过程简单且无需使用诱导剂、甲醛和冷冻干燥设备，降低成本，填补了行业中O24型大肠杆菌菌蜕制备领域的空白，解决了需要加入诱导剂IPTG，成本较高，步骤繁琐，甲醛灭活菌蜕中残留甲醛影响动物健康的技术问题。本发明制备得到的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的裂解率高达99.99％，血清抗体水平显著提高，为进一步研制禽致病性大肠杆菌菌蜕疫苗和可用于禽类细菌病、病毒病和寄生虫病的新型疫苗载体或佐剂奠定了研究基础。
(3)本发明采用pBV221载体进行溶菌质粒的构建，菌蜕制备中提高细菌培养温度，通过热诱导使E蛋白表达，使制备步骤得到简化，使蛋白诱导表达成本下降。
(4)本发明采用无毒且易水解的β-丙内酯两次对制备的菌蜕进行灭活处理，既避免了获得的菌蜕产品中无甲醛等有害物质，又效保证了菌蜕溶液中无活菌存在。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中chuA、yjaA和TSPE4.C2基因扩增产物电泳图。
图2示出了本发明实施例1中毒力基因扩增产物电泳图。
图3示出了本发明实施例1中pBV221-E质粒EcoR I和Sal I双酶切鉴定图。
图4示出了本发明实施例1中大肠杆菌诱导培养后的生长曲线图。
图5示出了本发明实施例2中大肠杆菌透射电镜检测。
图6示出了本发明实施例3中两组鸭血清IgG的检测结果图。
具体实施方式
实施例1 O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备
O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的具体制备步骤为：
(1)鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定：无菌采集江苏省某水禽场的病死鸭的心血、肝脏等病料，在麦康凯琼脂培养基上划线接种，将琼脂平板倒置于37℃恒温培养箱内培养过夜，次日取出进行菌落形态观察，挑取麦康凯平板上的典型菌落进行革兰氏染色和镜检，并将镜检结果为革兰阴性的细菌转接于葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、吲哚、MR、枸橼酸盐、 VP、硫化氢等细菌生化微量鉴定管及三糖铁琼脂培养基，进行生化鉴定。参考表1中大肠杆菌16s RNA基因保守区引物序列，对所分离的临床菌株进行PCR检测，根据检测结果确定分离菌株为鸭致病性大肠杆菌菌株。其中，大肠杆菌16s RNA基因保守区引物及PCR条件见表1所示：
表1大肠杆菌16s RNA基因保守区引物及PCR条件
检测过程中，PCR反应体系为：2×PCR Master Mix 12.5μL，上下游引物各20pmol，模板DNA 2μL，加双蒸水至总体积25μL；PCR反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，退火温度30s，72℃30s，30 个循环；72℃延伸10min。
(2)O血清型鉴定：将鸭致病性大肠杆菌菌株接种于2mL LB液体培养基，先在37℃下200rpm震荡培养12h，再在121℃、103.4kPa高压下培养2h，高压后的菌液12000rpm离心10min，弃上清液，用400μL 0.5％的石炭酸生理盐水重悬菌体并制成浓稠悬液，作为大肠杆菌菌体抗原备用；先取7μL大肠杆菌菌体抗原与2μL大肠杆菌O抗原血清置于玻板上混匀至出现凝集，初步确定血清型，再通过试管凝集试验进一步确定血清型 (参照：江苏、山东部分地区禽致病性大肠杆菌流行病学调查[J].中国家禽, 2017,39(06)：74-76)，结果显示，该菌株血清型为O24。
(3)分群分析和毒力基因检测：合成chuA、yiaA和DNA片段TspE4.C2 扩增引物[1]，将上述鸭致病性大肠杆菌菌株分为A、B1、B2和D群。参照毒力基因fimC、kpsM、csgA、papC、felA、tsh、irp-2、iroN、iutA、cvaC和iss引物序列合成检测引物[2]-[4]，制备模板DNA，分装后置于-20℃保存。
其中，合成chuA、yiaA和DNA片段TspE4.C2扩增引物，以及毒力基因fimC、kpsM、csgA、papC、felA、tsh、irp-2、iroN、iutA、cvaC和iss引物序列合成方法均为固相亚磷酰胺三酯法。分群分析和毒力基因检测引物序列及PCR条件如表2所示：
表2分群分析和毒力基因检测引物序列及PCR条件
分群分析结果显示，chuA和yiaA的检测结果均为阴性，TspE4.C2为阳性，据此确定上述鸭致病性大肠杆菌菌株为B1型，如图1所示。取步骤(1) 的PCR反应产物5μL，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果，毒力基因扩增后的电泳结果显示，fimC、csgA和iroN这3个基因的检测结果为阳性，如图2所示，kpsM、papC、felA、tsh、irp-2、iutA、cvaC和iss这8个基因为阴性。
(4)分离鸭致病性大肠杆菌菌株的耐药性检测：参照美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)方法手册(2007年版)规定的标准进行该菌株的耐药性检测，检测的抗生素包括氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素和四环素。耐药性检测结果表明：分离株对氨苄青霉素敏感。因此，选择氨苄青霉素抗性的pBV221载体进行溶菌质粒的构建。
(5)溶菌质粒的构建：根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布的E基因序列合成E基因并连接至pUC57载体，得到pUC57-E；再用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切重组质粒pUC57-E和表达载体pBV221，利用T4DNA连接酶将E基因片段连接至载体pBV221，连接产物转化至DH5 α感受态细胞，在氨苄抗性平板上筛选阳性克隆并扩大培养，从菌液中提取质粒并进行双酶切鉴定和测序鉴定，构建pBV221-E溶菌质粒。双酶切鉴定和测序鉴定均为常规实验。
其中，所述的E基因序列为：
ATGGTACGCTGGACTTTGTGGGATACCCTCGCTTTCCTGCTCCTGTTGA GTTTATTGCTGCCGTCATTGCTTATTATGTTCATCCCGTCAACATTCAAA CGGCCTGTCTCATCATGGAAGGCGCTGAATTTACGGAAAACATTATTA ATGGCGTCGAGCGTCCGGTTAAAGCCGCTGAATTGTTCGCGTTTACCT TGCGTGTACGCGCAGGAAACACTGACGTTCTTACTGACGCAGAAGAA AACGTGCGTCAAAAATTACGTGCGGAAGGAGTGA。
E基因的合成方法为：先将E基因分为多条交替的引物，用固相亚磷酰胺三酯法合成这些引物；再用PCR引物搭桥的方式拼接出E基因片段。
结果显示，用EcoR I和Sal I双酶切重组质粒pBV221-E可获得目的基因E和线性化pBV221，条带大小与预测一致，如图3所示。重组质粒测序结果显示E基因片段序列正确。
(6)菌蜕的制备：将上述pBV221-E转化至分离菌株，用氨苄抗性平板筛选阳性克隆，通过筛选鉴定得到pBV221-E/D阳性克隆，将pBV221-E/D 菌液在28℃振荡培养至OD600为0.5时，取pBV221-E/D菌液样品作为诱导前对照，将取出菌液样品后的OD600为0.5的菌液等分的分为两瓶，一瓶置于42℃诱导表达培养，另一瓶继续置于28℃振荡培养作为对照组实验，每隔30min分别取样测量两瓶菌液的OD600值；诱导表达培养至 pBV221-E/D菌液的OD600值不变时，即为菌蜕的菌液。
将上述pBV221转化至分离菌株，用氨苄抗性平板筛选阳性克隆，通过筛选鉴定得到pBV221/D阳性克隆，将pBV221/D菌液在28℃振荡培养至 OD600为0.5时，将其置于42℃诱导培养，每隔30min取样测量菌液的 OD600值，作为对照组实验。
经检测发现，对于42℃诱导表达的菌液，在诱导30min后pBV221-E/D 菌液OD600开始下降，诱导120min后OD600数值趋于稳定，约为0.3，如图 4所示。而诱导培养后的pBV221/D对照组菌液和继续置于28℃振荡培养的 pBV221-E/D对照组菌液的OD600值均一直保持上升趋势。
取制备得到的菌蜕溶液作为诱导后菌液样品；将前述诱导前对照的菌液样品用生理盐水稀释至浓度为10-4～10-6，诱导后菌液样品用生理盐水稀释至浓度为10-1～10-3，再分别对前述两种稀释后的样品各涂3块无抗LB平板， 37℃恒温培养12h，分别选取合适稀释度(平板上菌落数量为30～300个) 的平板进行计数，取CFU平均值计算裂解率。
其中，裂解率＝(1-诱导后CFU/诱导前CFU)×100％
经检测计算，pBV221-E/D裂解率＝(1-17×103/39×106)×100％＝99.9564％。(7)对制备的菌蜕进行灭活处理：将制备得到的菌蜕溶液中加入β-丙内酯至终浓度为0.025％，后将菌液置于42℃静置作用1h(第一次灭活处理)， 4000g离心菌液15min，收集沉淀，先在沉淀中加与原始菌液等体积的PBS 溶液(PH＝7.4)重悬；4000g再次离心菌液15min，收集沉淀，再在前述沉淀中加原始菌液1/2体积的PBS溶液重悬。4000g再次离心菌液15min，收集沉淀，最后再在前述沉淀中加原始菌液1/5体积的PBS溶液重悬；然后加入β-丙内酯至终浓度为0.05％，再置于42℃静置作用2h(第二次灭活处理)，得到O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕。其中，PBS溶液(PH＝7.4)为常规方法配制。
取少量悬浊液涂布LB固体平板进行无菌检验。经检测，大量制备的O24 型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的裂解率达99.99％，经β-丙内酯两次灭活处理后的菌蜕溶液涂布LB固体平板后未见菌落长出，说明菌蜕溶液中无活菌存在。
本发明中，大肠杆菌单因子血清购自中国兽医药品监察所。麦康凯琼脂干粉购自索莱宝生物科技有限公司。氨苄青霉素购自于Sigma-Aldrich公司，按常规方法制备LB液体和固体培养基。抗性选择培养基中氨苄青霉素的工作浓度为100mg/L。PCR试剂盒、UltraGelRed Nucleic Acid Stain、DL2000 Plus DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司。限制性内切酶和连接酶购自于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。质粒提取试剂盒购自于爱思进生物技术(杭州)有限公司。Anti-Duck IgG(H+L)-Peroxidase抗体购自KPL公司。可溶型单组分TMB底物溶液购自天根生化科技(北京)有限公司。温控表达质粒pBV221购自于北京六合华大基因科技有限公司； DH5α菌株购自于北京全式金生物技术有限公司，并由江苏农牧科技职业学院动物流行病学研究中心保存。β-丙内酯购自于北京索莱宝科技有限公司，LB液体和固体培养基按常规方法制备，其它原料均为市售所得。
实施例2透射电镜检测
用负染色方法对实施例1中的诱导表达2.5h的大肠杆菌pBV221-E/D和 pBV221/D菌液样品分别进行染色，具体方法为：将铜网置于不干胶底纸上，向铜网上滴加一滴大肠杆菌菌液，静置10分钟后用滤纸吸取菌液，再向铜网上滴加一滴2％磷钨酸染液，染色1分钟后吸去染液，置于红外烘灯下处理10分钟。使用philips透射电子显微镜(Tecnai 12)观察菌体结构。
透射电镜检测结果如图5所示，诱导培养2.5h后的pBV221/D对照菌呈现完整的细菌结构(图5-A)，电子密度较高且分布均匀。而诱导后的 pBV221-E/D菌体电子密度降低且分布不均匀(图5-B)，菌膜上有孔道形成，孔道宽度约为150nm(图5-C箭头所指)。细胞质通过孔道外泄，细胞膜有较为明显的皱缩变形，诱导前后菌体的鞭毛均清晰可见。
实施例3 O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的免疫原性检测
对实施例1制备得到的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕进行免疫原性检测。选取体重接近的7日龄櫻桃谷鸭40只，随机分成菌蜕免疫组和PBS对照组两组，每组20只。在菌蜕免疫组的櫻桃谷鸭颈部皮下接种菌蜕200μL 疫苗(1×109CFU/只)，在PBS对照组的櫻桃谷鸭颈部皮下接种等体积(200 μL)无菌PBS溶液；两周后以相同剂量再免疫一次，分别于首免和二免后两周采集血液，分离血清。用鸭致病性大肠杆菌分离株全菌抗原(1× 109CFU/mL)包被酶标板，将血清样品稀释500倍后用间接ELISA法检测血清抗体效价。
对两组鸭血清IgG的检测结果显示，菌蜕免疫组(BG)的血清抗体水平在二免后明显提高，并显著高于PBS对照组，如图6所示。以PBS对照组为阴性值(N)，BG组为阳性值(P)，求得一免后2周和二免后2周的 P/N值分别为1.903(0.371/0.195)和4.918(0.954/0.194)，二免后2周的 P/N值大于2.1，判定为阳性血清。
对比例1
选择氨苄青霉素抗性的pET-32a(+)载体，利用pET-32a(+)载体，根据实施例1的制备方法制备得到大肠杆菌菌蜕，对pET-32a(+)载体制备大肠杆菌菌蜕的效率进行检测。
制备过程为：将pET-32a(+)-E和pET-32a(+)分别转化至分离菌株，用氨苄抗性平板筛选阳性克隆，通过筛选鉴定得到pET-32a(+)-E和pET-32a(+) 阳性克隆，将pET-32a(+)-E/D和pET-32a(+)/D菌液在37℃振荡培养至 OD600为0.5时，取pET-32a(+)-E/D菌液样品作为诱导前对照，将取出菌液样品后的OD600为0.5的菌液等分为两瓶，一瓶置于37℃加IPTG至终浓度为0.5mM诱导表达，另一瓶继续置于37℃振荡培养，每隔30min分别取样测量两瓶菌液的OD600值；振荡培养至pET-32a(+)-E/D菌液的 OD600值不变时，得到pET-32a(+)载体菌蜕溶液。取出前述pET-32a(+)载体菌蜕溶液样品作为诱导后菌液样品；将前述诱导前对照的菌液样品用生理盐水稀释至浓度为10-4～10-6，诱导后菌液样品用生理盐水稀释至浓度为 10-1～10-4，每个稀释度涂3块无抗LB平板，37℃恒温培养12h，分别选取合适稀释度(平板上菌落数量为30～300个)的平板进行计数，取CFU平均值计算裂解率。
其中，裂解率＝(1-诱导后CFU/诱导前CFU)×100％
经检测发现，在诱导1h后pET-32a(+)-E/D菌液OD600开始下降，诱导 3h后OD600数值趋于稳定，约为0.25。而诱导培养的pET-32a(+)/D和未加 IPTG诱导的pBV221-E/D对照菌液OD600值一直保持上升趋势。经检测， pBV221-E/D裂解率＝(1-32×105/45×106)×100％＝92.89％。
其中，pET-32a(+)载体购自于Novagen公司，由江苏农牧科技职业学院动物流行病学研究中心保存。
与本发明的菌蜕制备效率对比，这种方法的细菌裂解率显著低于本发明，说明本发明使用pBV221载体通过升温诱导E蛋白表达、且无需使用诱导剂制备O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的方法，比pET-32a(+)载体使用诱导剂的制备方法的效率更高。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
参考文献
[1]Rapid and simple determination of the Escherichia coliphylogenetic group[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(10)：4555-4558.
[2]Rapid and simple determination of the Escherichia coliphylogenetic group[J].Appl Environ Microbiol,2000,66(10)：4555-4558.
[3]禽病原性大肠杆菌部分毒力相关基因的克隆及序列分析[J].中国家禽,2007(10)：12-15.
[4]鸭致病性大肠杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析[J].中国动物传染病学报,2010,18(2)：34-40。

Claims (10)

1.一种O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，该方法包括分离菌株、血清型鉴定、溶菌质粒的构建、菌蜕的制备及灭活处理步骤；其中，在溶菌质粒的构建时使用pBV221载体对血清型为O24的大肠杆菌菌株进行溶菌质粒的构建；灭活处理时采用β-丙内酯。
2.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的用pBV221载体对血清型为O24的大肠杆菌菌株进行溶菌质粒的构建的方法为：将E基因连接至pUC57载体，得到pUC57-E；再用限制性内切酶EcoR I和Sal I双酶切重组质粒pUC57-E和表达载体pBV221，利用T4 DNA连接酶将E基因片段连接至载体pBV221，连接产物转化至DH5α感受态细胞，在氨苄抗性平板上筛选阳性克隆并扩大培养，从菌液中提取质粒并进行双酶切鉴定和测序鉴定，构建pBV221-E溶菌质粒。
3.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的菌蜕的制备方法为：将构建的pBV221-E溶菌质粒转化至上述分离菌株，用氨苄抗性平板筛选阳性克隆，通过筛选鉴定得到pBV221-E/D阳性克隆，将pBV221-E/D菌液在28℃-35℃振荡培养至OD600为0.5，将OD600为0.5的菌液置于40℃-42℃诱导表达，每隔30min取样测量菌液的OD600值；诱导表达培养至pBV221-E/D菌液的OD600值不变时，即为菌蜕的菌液。
4.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，采用β-丙内酯两次对制备的菌蜕进行灭活处理。
5.根据权利要求4所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的灭活处理步骤为：将制备得到的菌蜕的菌液中加入β-丙内酯至终浓度为0.025％，静置作用后，离心，收集沉淀；先在沉淀中加与原始菌液等体积的PBS溶液重悬，离心并收集沉淀；再在前述沉淀中加原始菌液1/2体积的PBS溶液重悬，离心并收集沉淀；最后再在前述沉淀中加原始菌液1/5体积的PBS溶液重悬，然后加入β-丙内酯至终浓度为0.05％，再次静置作用，得到O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕。
6.根据权利要求5所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的第一次静置作用的反应条件为37～42℃下作用1～2h，再次静置作用的反应条件为37～42℃作用2～3h。
7.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的血清型鉴定是通过玻板凝集试验和/或试管凝集试验对鸭致病性大肠杆菌进行血清型鉴定，分离鉴定出血清型为O24的大肠杆菌菌株。
8.根据权利要求7所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的血清型鉴定的具体步骤为：将鸭致病性大肠杆菌菌株接种于2mL LB液体培养基，先在37℃下150～200rpm震荡培养10-20h，再在121℃、103.4kPa高压下培养2h，然后高压后的菌液离心弃上清液，用400μL 0.5％的石炭酸生理盐水重悬菌体并制成浓稠悬液，作为大肠杆菌菌体抗原；取7μL大肠杆菌菌体抗原与2μL大肠杆菌O抗原血清置于玻板上混匀至出现凝集，确定血清型。
9.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的分离菌株包括麦康凯培养基筛选、生化鉴定和PCR检测步骤。
10.根据权利要求1所述的O24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法，其特征在于，所述的pBV221载体是氨苄青霉素抗性的pBV221载体。
CN201910623938.1A 2019-07-11 2019-07-11 一种o24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法 Pending CN110408581A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910623938.1A CN110408581A (zh) 2019-07-11 2019-07-11 一种o24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910623938.1A CN110408581A (zh) 2019-07-11 2019-07-11 一种o24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110408581A true CN110408581A (zh) 2019-11-05

Family

ID=68361037

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910623938.1A Pending CN110408581A (zh) 2019-07-11 2019-07-11 一种o24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110408581A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101182538A (zh) * 2007-11-26 2008-05-21 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 大肠杆菌打孔质粒载体、其构建方法及在制备菌蜕中的应用
CN102586307A (zh) * 2012-03-02 2012-07-18 山东师范大学 氯霉素抗性温控裂解质粒及其构建与在菌蜕制备中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101182538A (zh) * 2007-11-26 2008-05-21 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 大肠杆菌打孔质粒载体、其构建方法及在制备菌蜕中的应用
CN102586307A (zh) * 2012-03-02 2012-07-18 山东师范大学 氯霉素抗性温控裂解质粒及其构建与在菌蜕制备中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王丽哲: "裂解基因E和SN基因原核表达载体构建及大肠杆菌O138菌影的研制", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102329746B (zh) 猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗及制备方法
CN104450556A (zh) 一种血清 12 型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用
CN102344892B (zh) Leachii支原体中国分离株及其分离培养基和用途
CN104258386B (zh) 一种水貂病毒性肠炎灭活疫苗-犬瘟热活疫苗组合
Zahran et al. Prevalence, molecular identification and virulence attributes of Salmonella serovars isolated from feces of diarrheic cow and buffalo-calves
CN100419073C (zh) 猪喘气病活疫苗及其生产方法
CN104450555A (zh) 一种血清 13 型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用
CN106834168B (zh) 一种猪链球菌2型弱毒株及其应用
CN112063566B (zh) 一株屎肠球菌及其应用
CN109678968A (zh) 猪肺炎支原体亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN106389475B (zh) 脆弱拟杆菌在预防和/或治疗脑膜炎中的应用
CN104099269B (zh) 猪肺炎支原体强毒株及其应用
CN114752532B (zh) 一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株及其应用
CN103194412A (zh) 一株血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株
CN110295134A (zh) 一种表面展示C型产气荚膜梭菌α、β毒素蛋白重组植物乳杆菌的构建及其应用
CN115887631A (zh) 一种副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联疫苗
CN106387314A (zh) 脆弱拟杆菌在动物养殖中的应用
CN110408581A (zh) 一种o24型鸭致病性大肠杆菌菌蜕的制备方法
CN113957007B (zh) 一种鸡滑液囊支原体灭活疫苗
CN104450557A (zh) 一种血清 5 型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用
CN110448690B (zh) 一种鸡传染性鼻炎(a型+b型+c型)、鼻气管鸟疫杆菌病(a型)二联灭活疫苗
CN103509838B (zh) 仔猪大肠杆菌k88、k99、987p纤毛抗原的高表达生产工艺及其提取方法
CN104388340A (zh) 一株血清5型副猪嗜血杆菌及其应用
CN109939225A (zh) 一株重组鹦鹉热衣原体外膜蛋白momp基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法
CN104789499A (zh) 一种鸡白痢琼扩抗原及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20191105

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication