CN110366557A

CN110366557A - 结合多肽及其制备方法

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Publication number: CN110366557A
Application number: CN201780086589.3A
Authority: CN
Inventors: Z·西里瓦; G·巴布考克; L·罗宾森
Original assignee: Visterra Inc
Current assignee: Visterra Inc
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2019-10-22
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: MX2019007356A; JP2023169422A; EP3559028A1; US11820979B2; BR112019013096A2; AU2017382367A1; JP2020511117A; JP7360324B2; CO2019006663A2; IL267565A; KR20190111036A; CL2019001757A1; WO2018119402A1; CL2022000454A1; CN110366557B; CA3045696A1; RU2019123063A; US20180201926A1; RU2019123063A3

Abstract

公开了多肽，例如抗体分子和TCR分子，及其制备方法。所述多肽可用于治疗、预防和/或诊断病症。

Description

结合多肽及其制备方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年12月23日提交的美国临时申请62/438,712的优先权。上述申请的内容通过引用的方式全文纳入本文。

背景

单克隆抗体疗法是一类涉及单克隆抗体(mAb)的免疫疗法，所述mAb能够与疾病相关生物分子特异性相互作用。近年来，能用治疗性抗体靶向的疾病范围已显著扩大，许多单克隆抗体和抗体衍生产品已在美国和许多其他国家获批用于治疗。目前，单克隆抗体疗法被用于各种疾病或病症的治疗或研究，这些疾病或病症包括例如感染性疾病、癌症、免疫性疾病、器官移植、心血管疾病和代谢疾病。

由于单克隆抗体和抗体衍生产品在调节各种生物功能中的能力，需要开发用于产生适于治疗、预防和诊断病症的抗体的新途径。

发明内容

本公开至少一部分提供了结合多肽(例如抗体分子或T细胞受体(TCR)分子)，其包含一或多种本文所述的结构或功能性质。在一个实施方式中，还提供了结合多肽文库，制备多肽或文库的方法，编码结合多肽的核酸分子，表达载体，宿主细胞，组合物(例如药物组合物)，试剂盒和容器。本文所述的多肽(例如抗体分子或TCR分子)可用于(单独或与其他试剂或治疗模式组合)治疗、预防和/或诊断病症，例如本文所公开的病症和状况。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的生产反应位点(production reaction site)，例如生产微室，包含：

i)重链(HC)链，其中HC链是重链双链cDNA(HC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的HCVR的HC元件(例如重链可变区序列(HCVRS))的区段；和

ii)轻链(LC)链，其中LC链是轻链双链cDNA(LC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的LCVR的LC元件(例如轻链可变区序列(LCVRS))的区段；和

b)共价联接(covalent linking)，例如连接(ligation)HC链与LC链，

其中分离的生产反应位点例如生产微室不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞，例如如不同的B细胞)的HCVR或LCVR的核酸，

如此产生一种核酸，其包含编码HCVR的HC元件和LCVR的LC元件的序列，其中HCVR和LCVR匹配。

在一个实施方式中，HC元件包含或由HCVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。在一个实施方式中，LC元件包含或由LCVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。

在一个实施方式中，HC ds cDNA包含编码HCVRS的区段。在一个实施方式中，LC dscDNA包含编码LCVRS的区段。在一个实施方式中，HC ds cDNA包含编码HCVRS的区段，且LCds cDNA包含编码LCVRS的区段。

在一个实施方式中，细胞是免疫细胞，例如B细胞，例如人B细胞。在一个实施方式中，细胞是哺乳动物细胞或禽细胞。

在一个实施方式中，核酸序列配置成当表达时HC元件和LC元件(例如HCVRS和LCVRS)形成功能性抗原结合分子，例如scFv、Fab或scFab。在一个实施方式中，抗原结合分子例如scFv在体外、离体或体内是功能性的，如用本文所述的方法或实验所测定。

在一个实施方式中，获得分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：

a)获得结合至以下物质的捕获基质：(i)第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自细胞的HCVR的第一mRNA互补的链；和(ii)第二ds cDNA，其包含与编码来自该细胞的LCVR的第二mRNA互补的链(载有cDNA的捕获基质)，和

b)将分离的生产反应位点(例如生产微室)维持在允许第一和第二ds cDNA扩增的条件下，以产生：多条HC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的HCVR的HC元件的区段，例如HCVRS；和多条LC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的LCVR的LC元件的区段，例如LCVRS。

在一个实施方式中，HC ds cDNA与第一ds cDNA相同或基本相同。例如，HC dscDNA的正义链与第一ds cDNA的正义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸，和/或HC ds cDNA的反义链与第一ds cDNA的反义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸。

在一个实施方式中，LC ds cDNA与第二ds cDNA相同或基本相同。例如，LC dscDNA的正义链与第二ds cDNA的正义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸，和/或LC ds cDNA的反义链与第二ds cDNA的反义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸。

在一个实施方式中，HC链是正义链。在一个实施方式中，LC链是正义链。在一个实施方式中，HC链是反义链。在一个实施方式中，LC链是反义链。在一个实施方式中，HC链和LC链都是正义链。在一个实施方式中，HC链和LC链都是反义链。

在一个实施方式中，捕获基质包含珠，如磁珠。在一个实施方式中，捕获基质包含与cDNA结合的部分(例如寡核苷酸)，如(i)与HC链结合的部分；(ii)与LC链结合的部分；或(iii)(i)和(ii)两者。在一个实施方式中，与HC链结合的部分和与LC链结合的部分不同，如利于建立对捕获相似水平的每种DNA分子类型有利的条件。在一个实施方式中，与HC链结合的部分和与LC链结合的部分相同。

在一个实施方式中，第一mRNA和第二mRNA置于载有mRNA的捕获基质上。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：适于从第一和第二mRNA产生第一ds cDNA和第二ds cDNA的试剂混合物(例如，在第一和第二mRNA从载有mRNA的捕获基质上释放入溶液后)，第一ds cDNA包含编码细胞的HCVR的HC元件(例如HCVRS)的区段，第二ds cDNA包含编码细胞的LCVR的LC元件(例如LCVRS)的区段。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室包含介导第一ds cDNA的生产的引物。在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室包含介导第二dscDNA的生产的引物。

在一个实施方式中，通过逆转录第一mRNA产生与编码来自细胞的HCVR的第一mRNA互补的cDNA链。在一个实施方式中，通过逆转录第二mRNA产生与编码来自细胞的LCVR的第二mRNA互补的cDNA链。

在一个实施方式中，逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室中发生。在一个实施方式中，逆转录在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室中发生。在一个实施方式中，逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室之外发生，或在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室外发生。在一个实施方式中，逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室之外发生，且在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室外发生。在一个实施方式中，逆转录在分离的反应位点(例如微室)外发生。

在一个实施方式中，扩增包括30轮或更少的循环，例如20或更少轮循环，例如，15或更少，14或更少，13或更少，12或更少，11或更少，10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，或5或更少轮循环。

在一个实施方式中，逆转录和/或扩增使用一个或多个引物，例如包含对HCVRS和/或LCVRS特异性的序列。

在一个实施方式中，逆转录和/或扩增包括使用介导HC ds cDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。在一个实施方式中，扩增包括使用介导LC ds cDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。

在一个实施方式中，至少一种引物包含核苷酸修饰，该核苷酸修饰例如减少(例如抑制)例如通过DNA聚合酶的DNA合成。在一个实施方式中，至少一种引物不包含例如减少(例如抑制)例如通过DNA聚合酶的DNA合成的核苷酸修饰。

在一个实施方式中，核苷酸修饰抑制DNA聚合酶延伸DNA。不希望被理论限制，据信在一个实施方式中，在本文所述的方法中可使用减少(例如阻遏)DNA聚合酶延伸的任何化学实体。

在一个实施方式中，核苷酸修饰是在引物中插入间隔子，例如在引物内的两个相邻核苷酸之间。在一个实施方式中，间隔子是柔性间隔子。在一个实施方式中，间隔子是碳间隔子(例如.,-(CH2)n-,其中n＝3,4,5,6,7,8,9,10,或更大),两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多)脱碱基核苷酸，或聚乙二醇(PEG)间隔子。在一个实施方式中，间隔子是PEG间隔子。在一个实施方式中，核苷酸修饰是例如对核糖的2’-O-甲基,2’-OH,2’-NH₂,或尿嘧啶修饰。

在一个实施方式中，核苷酸修饰位于引物内部或3’末端。在一个实施方式中，至少一个引物包括(i)第一组成部分(member)；(ii)第二组成部分，和任选的(iii)第三组成部分，例如包含本文所述的核苷酸修饰，例如位于(i)和(ii)之间。

在一个实施方式中，第一组成部分能够与第二组成部分退火。在一个实施方式中，第一组成部分能够与同一引物中的第二组成部分退火，例如通过分子内杂交，例如形成具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域的发夹结构。在另一个实施方式中，第一组成部分能够与不同引物中的第二组成部分退火杂交，例如通过分子间杂交，例如形成具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域的双链结构。不受理论所限，据信在一个实施方式中，有至少两个二级结构，其中修饰的引物能够形成和实现减少(例如防止)对于基质(例如珠)捕获的竞争。例如，二级结构可以是发夹样结构，通过分子内杂交(在相同引物内)形成，或二级结构可以是双链体结构，通过分子间杂交(两种不同引物之间)形成。

在一个实施方式中，第一组成部分包括与附连至捕获基质的寡核苷酸序列互补的序列。在一个实施方式中，第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(如HCVRS和/或LCVRS)互补的序列。在一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列相同或基本相同。在另一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列不同。在一个实施方式中，第二组成部分包括用于同源重组(例如在酵母或哺乳动物细胞中)的序列。

在一个实施方式中，至少一种引物包含编码接头序列的至少部分的序列，或其互补序列。在一个实施方式中，包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列的引物被磷酸化，例如被5’磷酸化。不受理论限制，据信在一个实施方式中，任何具有一般柔性(例如甘氨酸带来的)和亲水性的序列在本文所述的方法中都可有效发挥作用。示范性接头一般可具有一个或多个Gly、Ser、Thr、或Ala的过度展示(overrepresentation)和疏水残基例如一个或多个Trp,Tyr,Phe,Cys,Met,Leu,或Ile的过低展示(underrepresentation)。引物长度可以变化，例如为3-50个氨基酸残基(例如5-45、10-40、15-35、20-30、10-20、10-30、20-40、或30-40个氨基酸残基)。在一个实施方式中，接头序列包含或由((Gly)m-Ser))n组成，其中n＝1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更大。在一个实施方式中，接头序列包含或由(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n组成，其中n＝1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更大。

在一个实施方式中，引物是在本文例如实施例中所述的引物。

在一个实施方式中，逆转录、扩增或两者在分离的生产反应位点，例如生产微室中的溶液中发生。在一个实施方式中，逆转录、扩增或两者不在基质(例如珠)上发生。例如，逆转录、扩增或两者可以在液滴内的溶液中发生。

在一个实施方式中，HC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。在一个实施方式中，HC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。在一个实施方式中，LC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。在一个实施方式中，LC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。在一个实施方式中，HC ds cDNA和LC ds cDNA包含粘性末端，例如都具有5’突出端。

在一个实施方式中，HC链和LC链共价联接(covalently linked)，例如连接(ligated)，以产生单链核酸序列，其中HC和LC链都是正义链或都是反义链。在一个实施方式中，HC ds cDNA的变性HC链与LC ds cDNA的变性LC链共价联接，例如连接，其中HC链和LC链都是正义链或都是反义链。在一个实施方式中，HC链存在于HC ds cDNA中，LC链存在于LCds cDNA中，其中HC ds cDNA和LC ds cDNA共价联接，例如连接，以产生双链核酸序列。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接，在分离的生产反应位点发生。在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，或分离的联接反应位点，例如联接微室包含能够共价联接例如连接HC和LC链或HC和LC ds cDNA。在一个实施方式中，分离的生产反应位点例如生产微室包含共价偶联HC和LC链或HC和LC ds cDNA的酶。在实施方式中，酶是连接酶，例如热稳定连接酶。在一个实施方式中，共价联接包括连接酶热循环。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接，在与分离的生产反应位点不同的位点发生，例如在分离的联接反应位点，例如联接微室中发生。在一个实施方式中，HC链和LC链从分离的生产位点转移到分离的联接反应位点，例如联接微室，共价连接发生在分离的联接反应位点例如联接微室。在一个实施方式中，分离的联接反应位点例如联接微室包含能够共价联接，例如连接HC和LC链或HC和LC ds cDNA的试剂。在一个实施方式中，分离的联接反应位点例如联接微室包含共价偶联HC和LC链或HC和LC ds cDNA的酶。在实施方式中，酶是连接酶，例如热稳定连接酶。在一个实施方式中，共价联接包括连接酶热循环。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接，包括：(a)在允许HC链和LC链变性的条件下(例如在95℃)加热分离的联接反应位点，例如联接微室；(b)在允许夹板寡核苷酸与HC链和LC链杂交的条件下(例如在50-65℃)冷却分离的联接反应位点，例如联接微室；(c)在允许HC链和LC链连接(例如在HC链和LC链之间形成磷酸二酯键)的条件下(例如在45-65℃)维持分离的联接反应位点，例如联接微室；和(d)依次重复步骤(a)、(b)和(c)2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或更多轮循环。

在一个实施方式中，HC链和LC链在夹板寡核苷酸的存在下共价联接，例如连接。在一个实施方式中，夹板寡核苷酸与包含HC链和LC链接合区(junction)的序列或其互补序列杂交，在连接位点形成双链区域。在一个实施方式中，夹板寡核苷酸包含抑制例如DNA聚合酶的DNA合成的修饰(例如NH₂基团)。在一个实施方式中，修饰在夹板寡核苷酸3’末端。

在一个实施方式中，扩增产生与共价联接，例如连接的HC和LC链互补的链。

在一个实施方式中，方法(例如共价联接的步骤)不包括重叠延伸聚合酶链反应(OE-PCR)步骤，也被称作重叠延伸剪接或突出端延伸(SOE)PCR剪接的步骤。

在一个实施方式中，方法还包括在获得分离的生产反应位点，例如生产微室，获得载有mRNA的捕获基质。

在一个实施方式中，获得载有mRNA的捕获基质包含：a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：i)细胞；和ii)捕获基质，其能结合编码来自细胞的HCVR的第一mRNA和编码来自细胞的LCVR的第二mRNA；和b)将分离的细胞反应位点(例如，细胞分离微室)维持在允许细胞裂解和捕获基质与第一和第二mRNA结合的条件，以形成载有mRNA的捕获基质，其中分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的HCVR或LCVR的核酸。

在一个实施方式中，分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括裂解剂，例如去污剂。在一个实施方式中，热或酶裂解细胞。在一个实施方式中，捕获基质包括结合mRNA的部分(例如寡核苷酸)，如寡(dT)。

在一个实施方式中，方法还包括从分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室释放载有mRNA的捕获基质。在一个实施方式中，释放步骤在聚(dA)或聚(dT)寡核苷酸的存在下进行，例如以减少非捕获mRNA的交叉结合。

在一个实施方式中，载有mRNA的捕获基质从分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室转移到分离的生产反应位点，例如生产微室。

在一个实施方式中，方法还包括从分离的生产反应位点，例如生产微室释放核酸序列。在一个实施方式中，方法还包括扩增核酸序列。在一个实施方式中，核酸序列的扩增发生在分离的生产反应位点(例如生产微室)之外，例如在核酸从分离的生产反应位点(例如生产微室)释放后。在一个实施方式中，核酸序列的扩增发生在分离的生产反应位点，例如生产微室。

在一个实施方式中，方法还包括对全部或部分核酸序列进行测序。

在一个实施方式中，方法还包括将全部或部分核酸序列插入载体。在一个实施方式中，载体提供未包括在核酸序列内的额外HC元件或LC元件。在一个实施方式中，载体提供了HC CDR1、HC CDR2或两者。在一个实施方式中，方法还包括表达该载体。

在一个实施方式中，该方法还包括表达核酸序列以产生包含编码HCVR的HC元件(例如HCVRS)的区段和编码LCVR的LC元件(例如LCVRS)的区段的多肽。在一个实施方式中，LC元件在多肽内在HC元件的N-末端。在一个实施方式中，HC元件在多肽内在LC元件的C-末端。

在一个实施方式中，方法还包括使多肽接触抗原。在一个实施方式中，该方法还包括确定多肽在体外、离体或体内是否结合抗原，例如通过本文所述的方法或实验。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，所述方法包括：

a)获得分离的细胞反应位点(例如本文所述的分离的细胞反应位点)，如细胞分离微室，包括：i)细胞(例如本文所述的细胞)；和ii)捕获基质(例如本文所述的捕获基质)，其能结合编码来自细胞的HCVR的第一mRNA和编码来自细胞的LCVR的第二mRNA；

b)将分离的细胞反应位点(例如细胞分离微室)维持在允许细胞裂解和捕获基质与第一mRNA和第二mRNA结合的条件下，以形成载有mRNA的捕获基质，

其中分离的细胞反应位点(例如细胞分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的HCVR或LCVR的核酸。

c)使载有mRNA的捕获基质与反应混合物接触，例如含有逆转录酶的反应混合物，其用负载mRNA作为模板产生cDNA(这可以在例如分离的细胞反应位点，分离的生产反应位点中发生，或不在其任一者中发生，例如不在分离的反应位点中发生)。

d)获得分离的生产反应位点(例如本文所述的分离的生产反应位点)，如生产微室，包括：i)重链(HC)链，其中HC链是重链双链cDNA(HC ds cDNA)的链，其包括编码来自细胞的HCVR的HC元件(例如重链可变区序列(HCVRS))的区段；和ii)轻链(LC)链，其中LC链是轻链双链cDNA(LC ds cDNA)的链，其包括编码来自细胞的LCVR的LC元件(例如轻链可变区序列(LCVRS))的区段，

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的HCVR或LCVR的核酸；和

e)共价联接，例如连接HC链与LC链。

在一个实施方式中，根据本文所述的方法进行步骤a)-e)中的一个或多个步骤(例如2、3、4或全部)。在一个实施方式中，步骤a)-e)中的每一个根据本文所述的方法进行。

c)获得分离的生产反应位点(例如本文所述的分离的生产反应位点)，如生产微室，包括：使载有mRNA的捕获基质与反应混合物接触，例如含有逆转录酶的反应混合物，其用负载mRNA作为模板，产生：第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自所述细胞的HCVR的第一mRNA互补的链；和第二ds cDNA，其包含与编码来自所述细胞的LCVR的第二mRNA互补的链(cDNA负载的捕获基质)；

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的HCVR或LCVR的核酸。

d)将分离的生产反应位点(例如生产微室)维持在允许第一和第二ds cDNA扩增的条件下，以产生：多条HC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的HCVR的HC元件(例如HCVRS)的区段；和多条LC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的LCVR的LC元件(例如LCVRS)的区段；

e)获得分离的联接反应位点(例如本文所述的分离的联接反应位点)，如联接微室，包括：共价联接(例如连接)HC ds cDNA链的链(HC链)和LC ds cDNA的链(LC链)，其中HC和LC链都是正义链或都是反义链；和

f)扩增共价联接的，例如连接的HC和LC链。

在一个实施方式中，根据本文所述的方法进行步骤a)-f)中的一个或多个步骤(例如2、3、4、5或全部)。在一个实施方式中，步骤a)-f)中的每一个根据本文所述的方法进行。

在一个方面，本公开提供了一种产生包括多个独特组成部分的文库的方法，该方法包括：

产生多个组成部分，其中每个组成部分包含编码重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，和其中HCVR和LCVR匹配，由本文所述的方法产生，

其中所述多个中的每一个独特核酸序列包含来自不同独特细胞(例如本文所述的细胞)的HC元件和LC元件，

从而产生包含多个独特组成部分的文库。

在一个实施方式中，多个独特组成部分包括至少10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个独特组成部分。在一个实施方式中，多个独特组成部分包括10⁴至10⁹、10⁴至10⁸、10⁴至10⁷、10⁴至10⁶、10⁴至10⁵、10⁸至10⁹、10⁷至10⁹、10⁶至10⁹、10⁵至10⁹、10⁵至10⁸、10⁶至10⁷、10⁴至10⁵、10⁵至10⁶、10⁶至10⁷、10⁷至10⁸、或10⁸至10⁹个独特组成部分。在一个实施方式中，所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的HC元件和LC元件序列)。在一个实施方式中，所述文库中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的HC元件和LC元件序列)。

在一个方面，本文提供了包含多个独特组成部分的文库，其中

i)所述多个中的每一个独特组成部分包含编码HC元件(例如HCVRS)的区段和编码LC元件(例如LCVRS)的区段，其中每个独特组成部分中的HC元件和LC元件互相匹配；

ii)所述多个中的每一个独特组成部分包括来自不同独特细胞的编码HC元件(例如HCVRS)的区段和编码LC元件(例如LCVRS)的区段；和

iii)文库包括以下特征中的一个或多个(例如2、3、4个或全部)：

a)文库用本文所述方法产生；

b)多个独特组成部分包括至少10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个独特核酸序列；

c)多个独特组成部分包括10⁴至10⁹、10⁴至10⁸、10⁴至10⁷、10⁴至10⁶、10⁴至10⁵、10⁸至10⁹、10⁷至10⁹、10⁶至10⁹、10⁵至10⁹、10⁵至10⁸、10⁶至10⁷、10⁴至10⁵、10⁵至10⁶、10⁶至10⁷、10⁷至10⁸、或10⁸至10⁹个独特组成部分；

d)所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的HC元件和LC元件序列)；或

e)所述文库中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的HC元件和LC元件序列)。

在一个实施方式中，多个独特组成部分中的每一个配置成当表达时HC元件(例如HCVRS)和LC元件(例如LCVRS)形成功能性抗原结合分子，例如scFv、Fab或scFab。

在一个实施方式中，文库是展示文库。在一个实施方式中，多个组成部分中的每一个还编码多肽，其导致组成部分展示在展示实体表面。在一个实施方式中，文库是噬菌体展示文库。在一个实施方式中，文库是酵母展示文库。在一个实施方式中，文库是哺乳动物展示文库。

在一个方面，本文提供了产生结合多肽(例如包含HC元件和LC元件的多肽)的方法，该方法包括：a)获得本文所述的文库(例如用本文所述的方法)；和b)表达文库的独特核酸编码的多肽。

在一个实施方式中，方法还包括使多肽接触抗原。在一个实施方式中，方法还包括回收(例如分离或纯化)编码结合抗原的多肽的核酸。

在一个方面，本文提供了分离的生产反应位点，例如生产微室，其是本文所述的分离的生产反应位点(例如包含编码HCVR的核酸和编码LCVR的核酸，其中HCVR与LCVR匹配)。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点(例如生产微室)不包括编码来自不同细胞的HCVR或LCVR的核酸。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，包括以下特征中一个、两个或全部：(i)对HC和LC的V基因序列特异性的一个或多个引物；(ii)对引入HC和LC cDNA的突出端特异性的一个或多个引物；或(iii)一个或多个引物，其包含第一组成部分、第二组成部分和第三组成部分，其中含位于第一组成部分和第二组成部分之间的核苷酸修饰(例如间隔子)，其中第一组成部分能与相同引物或不同引物的第二组成部分退火，例如形成含有具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域的结构。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点(例如生产微室)不包含能够共价联接核酸的试剂，如连接酶，例如热稳定连接酶。在另一个实施方式中，分离的生产反应位点(例如生产微室)包含能够共价联接核酸的试剂，如连接酶，例如热稳定连接酶。

在一方面，本文提供了自退火寡核苷酸，其包括第一组成部分、第二组成部分和第三组成部分，所述第三组成部分包含位于第一和第二组成部分之间的核苷酸修饰(例如间隔子)，其中第一组成部分能与相同的寡核苷酸的第二组成部分退火(例如用于产生包含编码HCVR的HC元件和LCVR的LC元件的核酸序列的方法，其中HCVR和LCVR相匹配)。

在一个实施方式中，第一和第二组成部分能形成发夹结构，其包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域。在一个实施方式中，第一组成部分的长度是5-40个核苷酸，例如长度为5-10、5-20、5-30、30-40、20-40、10-30、10-30、或15-25个核苷酸。在一个实施方式中，第二组成部分的长度是5-40个核苷酸，例如长度为5-10、5-20、5-30、30-40、20-40、10-30、10-30、或15-25个核苷酸。

在一个实施方式中，间隔子是本文所述的间隔子，例如柔性间隔子或PEG间隔子。

在一个实施方式中，第一组成部分包括与附连至捕获基质的寡核苷酸序列互补的序列。

在一个实施方式中，第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(例如HCVRS和/或LCVRS)互补的序列。在一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列相同或基本相同。在另一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列不同。在一个实施方式中，第二组成部分包括用于同源重组(例如在酵母或哺乳动物细胞中)的序列。

在一个方面，本文提供了分离的联接反应位点，例如联接微室，其是本文所述的分离的联接反应位点(例如包含编码HCVR的核酸和编码LCVR的核酸，其中HCVR与LCVR匹配)。

在一个实施方式中，分离的联接反应位点(例如联接微室)不包括编码来自不同细胞的HCVR或LCVR的核酸。

在一个实施方式中，分离的联接反应位点(例如联接微室)包括剪接寡核苷酸(例如本文所述的夹板寡核苷酸)，其能催化与含有HC链和LC链的接合区的序列或其互补序列的杂交，在连接位点形成双链区域。

在一个实施方式中，分离的联接反应位点(例如联接微室)包含能够共价联接核酸的试剂，如连接酶，例如热稳定连接酶。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRα链可变区(ACVR)的α链元件(AC元件)和TCRβ链可变区(BCVR)的β链元件(BC元件)的序列，其中ACVR和BCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：

i)α链(AC)链，其中AC链是α链双链cDNA(AC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的ACVR的AC元件(例如α链可变区序列(ACVRS))的区段；和

ii)β链(BC)链，其中BC链是β链cDNA(BC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的BCVR的BC元件(例如β链可变区序列(BCVRS))的区段；和

b)共价联接，例如连接第一链与第二链，

其中分离的生产反应位点例如生产微室不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞，例如如不同的T细胞)的ACVR或BCVR的核酸，

由此产生一种核酸，其包含编码ACVR的AC元件和BCVR的BC元件的序列，其中ACVR和BCVR匹配。

在一个实施方式中，AC元件包含或由ACVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。在一个实施方式中，BC元件包含或由BCVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。

在一个实施方式中，AC ds cDNA包含编码ACVRS的区段。在一个实施方式中，BC dscDNA包含编码BCVRS的区段。在一个实施方式中，AC ds cDNA包含编码ACVRS的区段，且BCds cDNA包含编码BCVRS的区段。

在一个实施方式中，细胞是免疫细胞，例如T细胞，例如人T细胞。在一个实施方式中，细胞是哺乳动物细胞或禽细胞。

在一个实施方式中，核酸序列配置成当表达时AC元件和BC元件(例如ACVRS和BCVRS)形成功能性抗原结合分子，例如TCRα链和β链的单链或复合物。在一个实施方式中，抗原结合分子例如TCRα链和/或β链在体外、离体或体内是功能性的，如用本文所述的方法或实验所测定。

a)获得结合至以下物质的捕获基质：(i)第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自一种细胞的ACVR的第一mRNA互补的链；和(ii)第二ds cDNA，其包含与编码来自一种细胞的BCVR的第二mRNA互补的链(cDNA负载的捕获基质)，和

b)将分离的生产反应位点(例如生产微室)维持在允许第一和第二ds cDNA扩增的条件下，以产生：多条AC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的ACVR的AC元件(例如ACVRS)的区段；和多条BC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的BCVR的BC元件(例如BCVRS)的区段。

在一个实施方式中，AC ds cDNA与第一ds cDNA相同或基本相同。例如，AC dscDNA的正义链与第一ds cDNA的正义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸，和/或AC ds cDNA的反义链与第一ds cDNA的反义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸。

在一个实施方式中，BC ds cDNA与第二ds cDNA相同或基本相同。例如，BC dscDNA的正义链与第二ds cDNA的正义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸，和/或BC ds cDNA的反义链与第二ds cDNA的反义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸。

在一个实施方式中，AC链是正义链。在一个实施方式中，BC链是正义链。在一个实施方式中，AC链是反义链。在一个实施方式中，BC链是反义链。在一个实施方式中，AC链和BC链都是正义链。在一个实施方式中，AC链和BC链都是反义链。

在一个实施方式中，捕获基质包含珠，如磁珠。在一个实施方式中，捕获基质包含与cDNA结合的部分(例如寡核苷酸)，如(i)与AC链结合的部分；(ii)与BC链结合的部分；或(iii)(i)和(ii)两者。在一个实施方式中，与AC链结合的部分和与BC链结合的部分不同，如利于建立对捕获相似水平的每种DNA分子类型有利的条件。在一个实施方式中，与AC链结合的部分和与BC链结合的部分相同。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：适于从第一和第二mRNA产生第一ds cDNA和第二ds cDNA的试剂混合物(例如，在第一和第二mRNA从载有mRNA的捕获基质上释放入溶液后)，第一ds cDNA包含编码细胞的ACVR的AC元件(例如ACVRS)的区段，第二ds cDNA包含编码细胞的BCVR的BC元件(例如BCVRS)的区段。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室包含介导第一ds cDNA生产的引物。在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室包含介导第二ds cDNA生产的引物。

在一个实施方式中，通过逆转录第一mRNA产生与编码来自细胞的ACVR的第一mRNA互补的cDNA链。在一个实施方式中，通过逆转录第二mRNA产生与编码来自细胞的BCVR的第二mRNA互补的cDNA链。

在一个实施方式中，扩增包括20或更少轮循环，例如，15或更少，14或更少，13或更少，12或更少，11或更少，10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，或5或更少轮循环。

在一个实施方式中，逆转录和/或扩增使用一个或多个引物，其例如包含对ACVRS和/或BCVRS特异性的序列。

在一个实施方式中，逆转录和/或扩增包括使用介导AC ds cDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。在一个实施方式中，扩增包括使用介导BC ds cDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。

在一个实施方式中，至少一种引物包含例如减少，例如抑制DNA聚合酶的DNA合成的核苷酸修饰。在一个实施方式中，至少一种引物不包含例如减少，例如抑制DNA聚合酶的DNA合成的核苷酸修饰。

在一个实施方式中，核苷酸修饰是在引物中插入间隔子，例如在引物内的两个相邻核苷酸之间。在一个实施方式中，间隔子是柔性间隔子。在一个实施方式中，间隔子是碳间隔子(例如,-(CH2)n-,其中n＝3,4,5,6,7,8,9,10,或更大),两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多)脱碱基核苷酸，或聚乙二醇(PEG)间隔子。在一个实施方式中，间隔子是PEG间隔子。在一个实施方式中，核苷酸修饰是例如对核糖的2’-O-甲基,2’-OH,2’-NH₂,或尿嘧啶修饰。

在一个实施方式中，核苷酸修饰位于引物内部或3’末端。在一个实施方式中，至少一个引物包括(i)第一组成部分；(ii)第二组成部分，和任选的(iii)第三组成部分，例如包含本文所述的核苷酸修饰，例如位于(i)和(ii)之间。

在一个实施方式中，第一组成部分包括与附连至捕获基质的寡核苷酸序列互补的序列。在一个实施方式中，第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(例如ACVRS和/或BCVRS)互补的序列。在一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列相同或基本相同。在另一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列不同。在一个实施方式中，第二组成部分包括用于同源重组(例如在酵母或哺乳动物细胞中)的序列。

在一个实施方式中，至少一种引物包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列。在一个实施方式中，包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列的引物被磷酸化，例如被5’磷酸化。不受理论限制，据信在一个实施方式中，任何具有一般柔性(例如甘氨酸带来的)和亲水性的序列在本文所述的方法中都可有效发挥作用。示范性接头一般可具有一个或多个Gly、Ser、Thr、或Ala的过度展示(overrepresentation)和疏水残基例如一个或多个Trp,Tyr,Phe,Cys,Met,Leu,或Ile的过低展示(underrepresentation)。引物长度可以变化，例如为3-50个氨基酸残基(例如5-45、10-40、15-35、20-30、10-20、10-30、20-40、或30-40个氨基酸残基)。在一个实施方式中，接头序列包含或由((Gly)m-Ser))n组成，其中n＝1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更大。在一个实施方式中，接头序列包含或由(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n组成，其中n＝1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更大。

在一个实施方式中，AC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与附连于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。在一个实施方式中，AC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。在一个实施方式中，BC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与附连于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。在一个实施方式中，BC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。在一个实施方式中，AC ds cDNA和BC ds cDNA包含粘性末端，例如都具有5’突出端。

在一个实施方式中，AC链和BC链共价联接，例如连接产生单链核酸序列，其中AC和BC链都是正义链或都是反义链。在一个实施方式中，AC ds cDNA的变性AC链与BC ds cDNA的变性BC链共价联接，例如连接，其中AC链和BC链都是正义链或都是反义链。在一个实施方式中，AC链存在于AC ds cDNA中，BC链存在于BC ds cDNA中，其中AC ds cDNA和BC ds cDNA共价联接，例如连接，以产生双链核酸序列。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接在分离的生产反应位点发生。在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，或分离的联接反应位点，例如联接微室包含能够共价联接例如连接AC和BC链或AC和BC ds cDNA。在一个实施方式中，分离的生产反应位点例如生产微室包含共价偶联AC和BC链或AC和BC ds cDNA的酶。在实施方式中，酶是连接酶，例如热稳定连接酶。在一个实施方式中，共价联接包括连接酶热循环。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接，在与分离的生产反应位点不同的位点发生，例如在分离的联接反应位点，例如联接微室中发生。在一个实施方式中，AC链和BC链从分离的生产位点转移到分离的联接反应位点，例如联接微室，共价连接发生在分离的联接反应位点例如联接微室。在一个实施方式中，分离的联接反应位点例如联接微室包含能够共价联接，例如连接AC和BC链或AC和BC ds cDNA的试剂。在一个实施方式中，分离的联接反应位点例如联接微室包含共价偶联AC和BC链或AC和BC ds cDNA的酶。在实施方式中，酶是连接酶，例如热稳定连接酶。在一个实施方式中，共价联接包括连接酶热循环。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接，包括：(a)在允许AC链和BC链变性的条件下(例如在95℃)加热分离的联接反应位点，例如联接微室；(b)在允许夹板寡核苷酸与AC链和BC链杂交的条件下(例如在50-65℃)冷却分离的联接反应位点，例如联接微室；(c)在允许AC链和BC链连接(例如在AC链和BC链之间形成磷酸二酯键)的条件下(例如在45-65℃)维持分离的联接反应位点，例如联接微室；和(d)依次重复步骤(a)、(b)和(c)2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或更多轮循环。

在一个实施方式中，AC链和BC链在夹板寡核苷酸的存在下共价联接，例如连接。在一个实施方式中，夹板寡核苷酸与包含AC链和BC链接合区(junction)的序列，或其互补序列杂交，在连接位点形成双链区域。在一个实施方式中，夹板寡核苷酸包含抑制例如DNA聚合酶的DNA合成的修饰(例如NH₂基团)。在一个实施方式中，修饰在夹板寡核苷酸3’末端。

在一个实施方式中，扩增产生与共价联接的，例如连接的AC和BC链互补的链。

在一个实施方式中，方法(例如共价连接的步骤)不包括重叠延伸聚合酶链反应(OE-PCR)步骤，也被称作重叠延伸剪接或突出端延伸(SOE)PCR剪接的步骤。

在一个实施方式中，获得载有mRNA的捕获基质包括：a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：i)细胞；和ii)捕获基质，其能结合编码来自细胞的ACVR的第一mRNA和编码来自细胞的BCVR的第二mRNA；和b)将分离的细胞反应位点(例如，细胞分离微室)维持在允许细胞裂解和捕获基质与第一和第二mRNA结合的条件下，以形成载有mRNA的捕获基质，其中分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的ACVR或BCVR的核酸。

在一个实施方式中，方法还包括从分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室释放载有mRNA的捕获基质。在一个实施方式中，释放步骤在聚(dA)或聚(dT)寡核苷酸的存在下进行，例如以减少非捕获mRNA的交叉结合(cross-binding)。

在一个实施方式中，方法还包括将全部或部分核酸序列插入载体。在一个实施方式中，载体提供未包括在核酸序列内的其它AC元件或BC元件。在一个实施方式中，方法还包括表达该载体。

在一个实施方式中，该方法还包括表达核酸序列以产生包含编码ACVR的AC元件(例如ACVRS)的区段和编码BCVR的BC元件(例如BCVRS)的区段的多肽。在一个实施方式中，BC元件在多肽内在AC元件的N-末端。在一个实施方式中，AC元件在多肽内在BC元件的C-末端。

在一个实施方式，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRα链可变区(ACVR)的TCRα链元件(AC元件)和编码TCRβ链可变区(BCVR)的TCRβ链元件(BC元件)的序列，其中ACVR和BCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的细胞反应位点(例如本文所述的分离的细胞反应位点)，如细胞分离微室，包括：i)细胞(例如本文所述的细胞)；和ii)捕获基质(例如本文所述的捕获基质)，其能结合编码来自细胞的ACVR的第一mRNA和编码来自细胞的BCVR的第二mRNA；

其中分离的细胞反应位点(例如细胞分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的ACVR或BCVR的核酸。

c)使载有mRNA的捕获基质与反应混合物接触，例如含有逆转录酶的反应混合物，其用负载mRNA作为模板产生cDNA(这可以在例如分离的细胞反应位点，分离的生产反应位点中发生，或不在其任一者中发生，例如不在分离的反应位点中发生)；

d)获得分离的生产反应位点(例如本文所述的分离的生产反应位点)，如生产微室，包括：i)TCRα链(AC)链，其中AC链是TCRα链双链cDNA(AC ds cDNA)的链，其包括编码来自所述细胞的ACVR的AC元件(例如TCRα链可变区序列(ACVRS))的区段；和ii)TCRβ链(BC)链，其中BC链是TCRβ链双链cDNA(BC ds cDNA)的链，其包括编码来自所述细胞的BCVR的BC元件(例如TCRβ链可变区序列(BCVRS))的区段，

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的ACVR或BCVR的核酸；和

e)共价联接，例如连接AC链与BC链。

在一个实施方式中，根据本文所述的方法进行步骤a)-e)中的一个或多个步骤(例如2、3、4个或全部)。在一个实施方式中，步骤a)-e)中的每一个根据本文所述的方法进行。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRα链可变区(ACVR)的TCRα链元件(AC元件)和TCRβ链可变区(BCVR)的TCRβ链元件(BC元件)的序列，其中ACVR和BCVR相匹配，该方法包括：

c)获得分离的生产反应位点(例如本文所述的分离的生产反应位点)，如生产微室，包括：使载有mRNA的捕获基质与反应混合物接触，例如含有逆转录酶的反应混合物，其用负载mRNA作为模板，产生：第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自一种细胞的ACVR的第一mRNA互补的链；和第二ds cDNA，其包含与编码来自一种细胞的BCVR的第二mRNA互补的链(cDNA负载的捕获基质)；

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的ACVR或BCVR的核酸。

d)将分离的生产反应位点(例如生产微室)维持在允许第一和第二ds cDNA扩增的条件下，以产生：多条AC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的ACVR的AC元件(例如ACVRS)的区段；和多条BC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的BCVR的BC元件(例如BCVRS)的区段；

e)获得分离的联接反应位点(例如本文所述的分离的联接反应位点)，如联接微室，包括：共价联接(例如连接)AC ds cDNA链的链(AC链)和BC ds cDNA的链(BC链)，其中AC和BC链都是正义链或都是反义链；和

f)扩增共价联接的，例如连接的AC和BC链。

在一个实施方式中，根据本文所述的方法进行步骤a)-f)中的一个或多个步骤(例如2、3、4、5个或全部)。在一个实施方式中，步骤a)-f)中的每一个根据本文所述的方法进行。

用本发明的方法产生多个组成部分，其中每个组成部分包含编码TCRα链可变区(ACVR)的TCRα链元件(AC元件)和TCRβ链可变区(BCVR)的TCRβ链元件(BC元件)的序列，和其中ACVR和BCVR相匹配，

其中所述多个中的每一个独特核酸序列包含来自不同独特细胞(例如本文所述的细胞)的AC元件和BC元件，

从而产生包含多个独特组成部分的文库。

在一个实施方式中，多个独特组成部分包括至少10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个独特组成部分。在一个实施方式中，多个独特组成部分包括10⁴至10⁹、10⁴至10⁸、10⁴至10⁷、10⁴至10⁶、10⁴至10⁵、10⁸至10⁹、10⁷至10⁹、10⁶至10⁹、10⁵至10⁹、10⁵至10⁸、10⁶至10⁷、10⁴至10⁵、10⁵至10⁶、10⁶至10⁷、10⁷至10⁸、或10⁸至10⁹个独特组成部分。在一个实施方式中，所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的AC元件和BC元件序列)。在一个实施方式中，所述文库中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的AC元件和BC元件序列)。

i)所述多个中的每一个独特组成部分包含编码AC元件(例如ACVRS)的区段和编码BC元件(例如BCVRS)的区段，其中每个独特组成部分中的AC元件和BC元件互相匹配；

ii)所述多个中的每一个独特组成部分包括来自不同独特细胞的编码AC元件(例如ACVRS)的区段和编码BC元件(例如BCVRS)的区段；和

a)文库用本文所述方法产生；

d)所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的AC元件和BC元件序列)；或

e)所述文库中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的AC元件和BC元件序列)。

在一个实施方式中，多个独特组成部分中的每一个配置成当表达时AC元件(例如ACVRS)和BC元件(例如BCVRS)形成功能性抗原结合分子，例如TCRα链和β链的单链或复合物。

在一个方面，本文提供了产生结合多肽(例如包含AC元件和BC元件的多肽)的方法，该方法包括：a)获得本文所述的文库(例如用本文所述的方法)；和b)表达文库的独特核酸编码的多肽。

在一个方面，本文提供了分离的生产反应位点，例如生产微室，其是本文所述的分离的生产反应位点(例如包含编码ACVR的核酸和编码BCVR的核酸，其中ACVR与BCVR匹配)。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点(例如生产微室)不包括编码来自不同细胞的ACVR或BCVR的核酸。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，包括一个、两个、或全部以下特征：(i)对AC和BC的V基因序列特异性的一个或多个引物；(ii)对引入AC和BC cDNA的突出端特异性的一个或多个引物；或(iii)一个或多个引物，其包含第一组成部分、第二组成部分和第三组成部分，所述第三组成部分含位于第一组成部分和第二组成部分之间的核苷酸修饰(例如间隔子)，其中第一组成部分能与相同引物或不同引物的第二组成部分退火，例如形成含有具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域的结构。

在一方面，本文提供了自退火寡核苷酸，其包括第一组成部分、第二组成部分和第三组成部分，所述第三组成部分包含位于第一和第二组成部分之间的核苷酸修饰(例如间隔子)，其中第一组成部分能与相同的寡核苷酸的第二组成部分退火(例如用于产生包含编码ACVR的AC元件和BCVR的BC元件的核酸序列的方法，其中ACVR和BCVR相匹配)。

在一个实施方式中，第一和第二组成部分能形成发夹结构，其包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域。在一个实施方式中，第一组成部分是5-40个核苷酸，例如长度为5-10、5-20、5-30、30-40、20-40、10-30、10-30、或15-25个核苷酸。在一个实施方式中，第二组成部分是5-40个核苷酸，例如长度为5-10、5-20、5-30、30-40、20-40、10-30、10-30、或15-25个核苷酸。

在一个实施方式中，第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(例如ACVRS和/或BCVRS)互补的序列。在一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列相同或基本相同。在另一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列不同。在一个实施方式中，第二组成部分包括用于同源重组(例如在酵母或哺乳动物细胞中)的序列。

在一个方面，本文提供了分离的联接反应位点，例如联接微室，其是本文所述的分离的联接反应位点(例如包含编码ACVR的核酸和编码BCVR的核酸，其中ACVR与BCVR匹配)。

在一个实施方式中，分离的联接反应位点(例如联接微室)不包括编码来自不同细胞的ACVR或BCVR的核酸。

在一个实施方式中，分离的联接反应位点(例如联接微室)包括剪接寡核苷酸(例如本文所述的夹板寡核苷酸)，其能催化与含有AC链和BC链的接合区的序列或其互补序列的杂交，在连接位点形成双链区域。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRγ链可变区(GCVR)的TCRγ链元件(GC元件)和TCRδ链可变区(DCVR)的TCRδ链元件(DC元件)的序列，其中GCVR和DCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：

i)γ链(GC)链，其中GC链是γ链双链cDNA(GC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的GCVR的GC元件(例如γ链可变区序列(GCVRS))的区段；和

ii)δ链(DC)链，其中DC链是δ链cDNA(DC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的DCVR的DC元件(例如δ链可变区序列(DCVRS))的区段；和

b)共价联接，例如连接第一链与第二链，

其中分离的生产反应位点例如生产微室不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞，例如如不同的T细胞)的GCVR或DCVR的核酸，

如此产生一种核酸，其包含编码GCVR的GC元件和DCVR的DC元件的序列，其中GCVR和DCVR匹配。

在一个实施方式中，GC元件包含或由GCVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。在一个实施方式中，DC元件包含或由DCVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。

在一个实施方式中，GC ds cDNA包含编码GCVRS的区段。在一个实施方式中，DC dscDNA包含编码DCVRS的区段。在一个实施方式中，GC ds cDNA包含编码GCVRS的区段，且DCds cDNA包含编码DCVRS的区段。

在一个实施方式中，核酸序列配置成当表达时GC元件和DC元件(例如GCVRS和DCVRS)形成功能性抗原结合分子，例如TCRγ链和δ链的单链或复合物。在一个实施方式中，抗原结合分子例如TCRγ链和/或δ链在体外、离体或体内是功能性的，如用本文所述的方法或实验所测定。

a)获得结合至以下物质的捕获基质：(i)第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自细胞的GCVR的第一mRNA互补的链；和(ii)第二ds cDNA，其包含与编码来自所述细胞的DCVR的第二mRNA互补的链(cDNA负载的捕获基质)，和

b)将分离的生产反应位点(例如生产微室)维持在允许第一和第二ds cDNA扩增的条件下，以产生：多条GC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的GCVR的GC元件(例如GCVRS)的区段；和多条DC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的DCVR的DC元件(例如DCVRS)的区段；

在一个实施方式中，GC ds cDNA与第一ds cDNA相同或基本相同。例如，GC dscDNA的正义链与第一ds cDNA的正义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸，和/或GC ds cDNA的反义链与第一ds cDNA的反义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸。

在一个实施方式中，DC ds cDNA与第二ds cDNA相同或基本相同。例如，DC dscDNA的正义链与第二ds cDNA的正义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸，和/或DC ds cDNA的反义链与第二ds cDNA的反义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸。

在一个实施方式中，GC链是正义链。在一个实施方式中，DC链是正义链。在一个实施方式中，GC链是反义链。在一个实施方式中，DC链是反义链。在一个实施方式中，GC链和DC链都是正义链。在一个实施方式中，GC链和DC链都是反义链。

在一个实施方式中，捕获基质包含珠，如磁珠。在一个实施方式中，捕获基质包含与cDNA结合的部分(例如寡核苷酸)，如(i)与GC链结合的部分；(ii)与DC链结合的部分；或(iii)(i)和(ii)两者。在一个实施方式中，与GC链结合的部分和与DC链结合的部分不同，如利于建立对捕获相似水平的每种DNA分子类型有利的条件。在一个实施方式中，与GC链结合的部分和与DC链结合的部分相同。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：适于从第一和第二mRNA产生第一ds cDNA和第二ds cDNA的试剂混合物(例如，在第一和第二mRNA从载有mRNA的捕获基质上释放入溶液后)，第一ds cDNA包含编码细胞的GCVR的AC元件(例如GCVRS)的区段，第二ds cDNA包含编码细胞的DCVR的DC元件(例如DCVRS)的区段。

在一个实施方式中，通过逆转录第一mRNA产生与编码来自细胞的GCVR的第一mRNA互补的cDNA链。在一个实施方式中，通过逆转录第二mRNA产生与编码来自细胞的DCVR的第二mRNA互补的cDNA链。

在一个实施方式中，逆转录和/或扩增使用一个或多个引物，例如包含对GCVRS和/或DCVRS特异性的序列。

在一个实施方式中，逆转录和/或扩增包括使用介导GC ds cDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。在一个实施方式中，扩增包括使用介导DC ds cDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。

在一个实施方式中，核苷酸修饰位于引物内部或3’末端。在一个实施方式中，至少一个引物包括(i)第一组成部分；(ii)第二组成部分，和可任选的(iii)第三组成部分，例如包含本文所述的核苷酸修饰，例如位于(i)和(ii)之间。

在一个实施方式中，第一组成部分包括与附连至捕获基质的寡核苷酸序列互补的序列。在一个实施方式中，第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(例如GCVRS和/或DCVRS)互补的序列。在一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列相同或基本相同。在另一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列不同。在一个实施方式中，第二组成部分包括用于同源重组(例如在酵母或哺乳动物细胞中)的序列。

在一个实施方式中，GC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。在一个实施方式中，GC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。在一个实施方式中，DC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。在一个实施方式中，DC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。在一个实施方式中，GC ds cDNA和DC ds cDNA包含粘性末端，例如都具有5’突出端。

在一个实施方式中，GC链和DC链共价联接，例如连接产生单链核酸序列，其中GC和DC链都是正义链或都是反义链。在一个实施方式中，GC ds cDNA的变性GC链与DC ds cDNA的变性DC链共价联接，例如连接，其中GC链和DC链都是正义链或都是反义链。在一个实施方式中，GC链存在于GC ds cDNA中，DC链存在于DC ds cDNA中，其中GC ds cDNA和DC ds cDNA共价联接，例如连接，以产生双链核酸序列。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接在分离的生产反应位点发生。在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，或分离的联接反应位点，例如联接微室包含能够共价联接例如连接GC和DC链或GC和DC ds cDNA。在一个实施方式中，分离的生产反应位点例如生产微室包含共价偶联GC和DC链或GC和DC ds cDNA的酶。在实施方式中，酶是连接酶，例如热稳定连接酶。在一个实施方式中，共价联接包括连接酶热循环。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接，在与分离的生产反应位点不同的位点发生，例如在分离的联接反应位点，例如联接微室中发生。在一个实施方式中，GC链和DC链从分离的生产位点转移到分离的联接反应位点，例如联接微室，共价连接发生在分离的联接反应位点例如联接微室。在一个实施方式中，分离的联接反应位点例如联接微室包含能够共价联接，例如连接GC和DC链或GC和DC ds cDNA的试剂。在一个实施方式中，分离的联接反应位点例如联接微室包含共价偶联GC和DC链或GC和DC ds cDNA的酶。在实施方式中，酶是连接酶，例如热稳定连接酶。在一个实施方式中，共价联接包括连接酶热循环。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接，包括：(a)在允许GC链和DC链变性的条件下(例如在95℃)加热分离的联接反应位点，例如联接微室；(b)在允许夹板寡核苷酸与GC链和DC链杂交的条件下(例如在50-65℃)冷却分离的联接反应位点，例如联接微室；(c)在允许GC链和DC链连接(例如在GC链和DC链之间形成磷酸二酯键)的条件下(例如在45-65℃)维持分离的联接反应位点，例如联接微室；和(d)依次重复步骤(a)、(b)和(c)2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或更多轮循环。

在一个实施方式中，GC链和DC链在夹板寡核苷酸的存在下共价联接，例如连接。在一个实施方式中，夹板寡核苷酸与包含GC链和DC链接合区(junction)的序列，或其互补序列杂交，在连接位点形成双链区域。在一个实施方式中，夹板寡核苷酸包含抑制例如DNA聚合酶的DNA合成的修饰(例如NH₂基团)。在一个实施方式中，修饰在夹板寡核苷酸3’末端。

在一个实施方式中，扩增产生与共价联接，例如连接的GC和DC链互补的链。

在一个实施方式中，获得载有mRNA的捕获基质包括：a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：i)细胞；和ii)捕获基质，其能结合编码来自细胞的GCVR的第一mRNA和编码来自细胞的DCVR的第二mRNA；和b)将分离的细胞反应位点(例如，细胞分离微室)维持在允许细胞裂解和捕获基质与第一和第二mRNA结合的条件下，以形成载有mRNA的捕获基质，其中分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的GCVR或DCVR的核酸。

在一个实施方式中，方法还包括将全部或部分核酸序列插入载体。在一个实施方式中，载体提供未包括在核酸序列内的额外GC元件或DC元件。在一个实施方式中，方法还包括表达该载体。

在一个实施方式中，该方法还包括表达核酸序列以产生包含编码GCVR的GC元件(例如GCVRS)的区段和编码DCVR的DC元件(例如DCVRS)的区段的多肽。在一个实施方式中，DC元件在多肽内在GC元件的N-末端。在一个实施方式中，GC元件在多肽内在DC元件的N-末端。

在一个实施方式中，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRγ链可变区(GCVR)的TCRγ链元件(GC元件)和TCRδ链可变区(DCVR)的TCRδ链元件(DC元件)的序列，其中GCVR和DCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的细胞反应位点(例如本文所述的分离的细胞反应位点)，如细胞分离微室，包括：i)细胞(例如本文所述的细胞)；和ii)捕获基质(例如本文所述的捕获基质)，其能结合编码来自细胞的GCVR的第一mRNA和编码来自细胞的DCVR的第二mRNA；

其中分离的细胞反应位点(例如细胞分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的GCVR或DCVR的核酸。

d)获得分离的生产反应位点(例如本文所述的分离的生产反应位点)，如生产微室，包括：i)TCRγ链(GC)链，其中GC链是TCRγ链双链cDNA(GC ds cDNA)的链，其包括编码来自细胞的GCVR的GC元件(例如TCRγ链可变区序列(GCVRS))的区段；和ii)TCRδ链(DC)链，其中DC链是TCRδ链双链cDNA(DC ds cDNA)的链，其包括编码来自细胞的DCVR的DC元件(例如TCRδ链可变区序列(DCVRS))的区段，

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的GCVR或DCVR的核酸；和

e)共价联接，例如连接GC链与DC链。

c)获得分离的生产反应位点(例如本文所述的分离的生产反应位点)，如生产微室，包括：使载有mRNA的捕获基质与反应混合物接触，例如含有逆转录酶的反应混合物，其用负载mRNA作为模板，产生：第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自一种细胞的GCVR的第一mRNA互补的链；和第二ds cDNA，其包含与编码来自一种细胞的DCVR的第二mRNA互补的链(载有cDNA的捕获基质)；

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的GCVR或DCVR的核酸。

d)将分离的生产反应位点(例如生产微室)维持在允许第一和第二ds cDNA扩增的条件下，以产生：多条GC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的GCVR的GC元件(例如GCVRS)的区段；和多条DC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的DCVR的DC元件(例如DCVRS)的区段。

e)获得分离的联接反应位点(例如本文所述的分离的联接反应位点)，如联接微室，包括：共价联接(例如连接)GC ds cDNA链的链(GC链)和DC ds cDNA的链(DC链)，其中GC和DC链都是正义链或都是反义链；和

f)扩增共价联接的，例如连接的GC和DC链。

用本发明的方法产生多个组成部分，其中每个组成部分包含编码TCRγ链可变区(GCVR)的TCRγ链元件(GC元件)和TCRδ链可变区(DCVR)的TCRδ链元件(DC元件)的序列，和其中GCVR和DCVR相匹配，

其中所述多个中的每一个独特核酸序列中包含来自不同独特细胞(例如本文所述的细胞)的GC元件和DC元件，

从而产生包含多个独特组成部分的文库。

在一个实施方式中，多个独特组成部分包括至少10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个独特组成部分。在一个实施方式中，多个独特组成部分包括10⁴至10⁹、10⁴至10⁸、10⁴至10⁷、10⁴至10⁶、10⁴至10⁵、10⁸至10⁹、10⁷至10⁹、10⁶至10⁹、10⁵至10⁹、10⁵至10⁸、10⁶至10⁷、10⁴至10⁵、10⁵至10⁶、10⁶至10⁷、10⁷至10⁸、或10⁸至10⁹个独特组成部分。在一个实施方式中，所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的GC元件和DC元件序列)。在一个实施方式中，所述文库中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的GC元件和DC元件序列)。

i)所述多个中的每一个独特组成部分包含编码GC元件(例如GCVRS)的区段和编码DC元件(例如DCVRS)的区段，其中每个独特组成部分中的GC元件和DC元件互相匹配；

ii)所述多个中的每一个独特组成部分包括来自不同独特细胞的编码GC元件(例如GCVRS)的区段和编码DC元件(例如DCVRS)的区段；和

所述文库包括以下特征中的一个或多个：

a)文库用本文所述方法产生；

d)所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的GC元件和DC元件序列)；或

e)所述文库中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的GC元件和DC元件序列)。

在一个实施方式中，多个独特组成部分中的每一个配置成当表达时GC元件(例如GCVRS)和DC元件(例如DCVRS)形成功能性抗原结合分子，例如TCRγ链和δ链的单链或复合物。

在一个方面，本文提供了产生结合多肽(例如包含GC元件和DC元件的多肽)的方法，该方法包括：a)获得本文所述的文库(例如用本文所述的方法)；和b)表达文库的独特核酸编码的多肽。

在一个方面，本文提供了分离的生产反应位点，例如生产微室，其是本文所述的分离的生产反应位点(例如包含编码GCVR的核酸和编码DCVR的核酸，其中GCVR与DCVR匹配)。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点(例如生产微室)不包括编码来自不同细胞的GCVR或DCVR的核酸。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，包括一个、两个、或全部以下特征：(i)对GC和DC的V基因序列特异性的一个或多个引物；(ii)对引入GC和DC cDNA的突出端特异性的一个或多个引物；或(iii)一个或多个引物，其包含第一组成部分、第二组成部分和第三组成部分，所述第三组成部分含位于第一组成部分和第二组成部分之间的核苷酸修饰(例如间隔子)，其中第一组成部分能与相同引物或不同引物的第二组成部分退火，例如形成含有具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域的结构。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点(例如生产微室)不包含能够共价连接核酸的试剂，如连接酶，例如热稳定连接酶。在另一个实施方式中，分离的生产反应位点(例如生产微室)包含能够共价联接核酸的试剂，如连接酶，例如热稳定连接酶。

在一方面，本文提供了自退火寡核苷酸，其包括第一组成部分、第二组成部分和第三组成部分，所述第三组成部分包含位于第一和第二组成部分之间的核苷酸修饰(例如间隔子)，其中第一组成部分能与相同的寡核苷酸的第二组成部分退火(例如用于产生包含编码GCVR的GC元件和DCVR的DC元件的核酸序列的方法，其中GCVR和DCVR相匹配)。

在一个实施方式中，第一和第二组成部分能形成发夹结构，其包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域。在一个实施方式中，第一组成部分长度是5-40个核苷酸，例如长度为5-10、5-20、5-30、30-40、20-40、10-30、10-30、或15-25个核苷酸。在一个实施方式中，第二组成部分长度是5-40个核苷酸，例如长度为5-10、5-20、5-30、30-40、20-40、10-30、10-30、或15-25个核苷酸。

在一个实施方式中，第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(例如GCVRS和/或DCVRS)互补的序列。在一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列相同或基本相同。在另一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列不同。在一个实施方式中，第二组成部分包括用于同源重组(例如在酵母或哺乳动物细胞中)的序列。

在一个方面，本文提供了分离的联接反应位点，例如联接微室，其是本文所述的分离的联接反应位点(例如包含编码GCVR的核酸和编码DCVR的核酸，其中GCVR与DCVR匹配)。

在一个实施方式中，分离的联接反应位点(例如联接微室)不包括编码来自不同细胞的GCVR或DCVR的核酸。

在一个实施方式中，分离的联接反应位点(例如联接微室)包括剪接寡核苷酸(例如本文所述的夹板寡核苷酸)，其能催化与含有GC链和DC链的接合区的序列或其互补序列的杂交，在连接位点形成双链区域。

附图说明

图1描述了许多制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，所述方法包括：A1、B1和C2框表示在分离反应位点，尤其是分离的细胞反应位点发生的步骤。C3、D1、D2、D3、D4、D5和D6框表示在分离的反应位点，特别是分离的生产反应位点发生的步骤。E1、E1和E2框表示在分离的反应位点，尤其是分离的联接反应位点发生的步骤。C1框表示不需要在分离的反应位点发生的步骤。如文字部分所述，分离的反应位点没有导致HC和LC元件错配的核酸。

图2A-2D是一系列图表，显示了制备核酸序列的示范性方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配。在图2A中，细胞(例如免疫细胞，如B细胞)被裂解，在珠上捕获编码HCVR的mRNA和匹配的LCVR。在图2B中，捕获的mRNA由逆转录转换成cDNA，然后由DNA聚合酶扩增(PCR)，产生包含HCVR和LCVR cDNA匹配配对的cDNA珠。自退火引物(例如包含第一组成部分和能与第一组成部分杂交的第二组成部分的引物，其中第一和第二组成部分由间隔子(如PEG间隔子)隔开，还包含能够与HCVR或LCVR序列杂交的序列)可用于逆转录反应和/或DNA聚合酶扩增。在图2C中，可用连接酶循环反应融合匹配的LCVR和HCVR cDNA，其中用夹板寡核苷酸使LCVR和HCVR的匹配对合在一起，该夹板寡核苷酸包含能够与LCVR或HCVR序列各自的一个末端(例如LCVR的3’末端和HCVR的5’末端)杂交的序列。在图2D中，可通过例如PCR扩增融合的LCVR/HCVR产物。

图3是聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图像，显示Taq连接酶和扩增酶热稳定连接酶(Amp；Lucigen)能有效连接VH和VL产物。

图4A-4B是凝胶电泳图，显示连接酶循环成功产生抗体4G2和9E10每一种的天然配对的、联接的VH+VL产物。在图4A中，连接酶循环产物的变性PAGE显示含连接酶的反应得到4G2和9E10每一种的联接的VH+VL产物，以及独立的VH和VL多核苷酸。在缺乏连接酶的反应中未检测到联接的VH+VL产物。在图4B中，批量PCR再扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显示当4G2和9E10的VH-VL联接的多核苷酸在PCR反应中混合时，保留天然配对。

图5A-5B是图表，显示采用自退火引物的有效和特异性PCR产物捕获。在图5A中，测试了一系列的正向PCR引物设计捕获PCR产物的能力，包括(1)包含间隔子，具有与珠上的寡核苷酸互补的5’序列和与VL模板序列互补的3’序列的VL引物，(2)缺少间隔子，但具有与珠上的寡核苷酸互补的5’序列和与VL模板序列互补的3’序列的VL引物，(3)缺少与珠上的寡核苷酸互补的5’序列和与VL模板序列互补的3’序列的VL引物，和(4)与(1)具有相似设计但具有与VH模板互补的序列的3’末端的VH引物(用于DNA聚合酶延伸)。在图5B中，用包含间隔子的VL引物进行VL寡核苷酸、VH寡核苷酸和VH+VL寡核苷酸的有效和特异性PCR捕获。剩余的引物中，仅VH引物能够捕获任何寡核苷酸(特别是VH寡核苷酸和VH+VL寡核苷酸)。

图6是琼脂糖凝胶电泳图，显示能够在液滴中从表达4G2抗体的细胞获得的核酸生产天然配对的VH-VL产物。NTC＝其中进行了整个液滴工作流但不包括任何细胞的样品；PCTNTC＝无模板对照。

图7A-7B是一系列图，显示自退火引物(在图7A中)可防止在高水平的未使用引物下的PCR产物捕获竞争，而非自退火引物(在图7B中)仅在低水平未使用引物下能有该状况。

具体实施方式

本文公开了以高亲和力和特异性结合目标分子或细胞(例如人蛋白质或细胞)的多肽(例如抗体分子或T细胞受体分子)。在一个实施方式中，多肽是结合多肽。在一个实施方式中，结合多肽是抗体分子。在一个实施方式中，结合多肽是TCR分子(例如可溶性TCR分子)。在一个实施方式中，还提供了多肽文库，制备多肽或文库的方法，编码多肽的核酸分子，表达载体，宿主细胞，组合物(例如药物组合物)，试剂盒和容器。本文所述的方法能用于产生或筛选含有两条或更多条天然匹配或配对的链的功能性多肽。本文所述的多肽(例如抗体分子或T细胞受体分子)可用于(单独或与其他试剂或治疗模式组合)治疗、预防和/或诊断病症，例如本文所公开的病症和状况。

不希望受理论所限，据信本文所述的方法可实现例如高通量表型(例如结合)筛选百万计的B细胞/浆细胞抗体，从衍生自不同物种，包括但不限于人、小鼠、大鼠、家兔或鸡的B细胞抗体回收。例如，唯一的要求是对合适扩增来自该物种的VH和VL序列的引物的了解。

由于本文所述的工作流可以适用于任何物种，其能显著改善发现多样的结合多肽(例如抗体)以靶向抗原(免疫/接种后)，因为每种物种都发展出对一种抗原不同类型的结合多肽(例如抗体)。使用缺乏靶抗原或与靶抗原具有显著氨基酸差异的物种能够更好克服免疫耐受问题(例如对靶表位)，例如鸡比起人或小鼠能够减少对人抗原/表位的耐受。

本文所述的方法可实现在药物处理(rugged)并可重新生长的酵母中抗体储库的“表型复制”。这实现了抗体储库的严格和重复的测试，而不像使用敏感的原代B细胞，后者不能在体外长期存活，也不能经受剧烈的抗体/BCR结合定性。

其他在液滴中产生天然配对的VH-VL序列的方法能用DNA聚合酶(PCR)重叠延伸剪接连接DNA，其可能具有特异性限制，可导致由于不精确的联接而产生不同大小的异源产物。本文所述的连接方法不会有这样的问题。

此外，通过重叠延伸PCR剪接的液滴法有一个固有限制问题，即液滴内任何不融合的PCR产物有可能在非液滴PCR扩增过程中融合，由于VH和VL之间的共有的附加序列。在液滴外发生的融合导致非天然配对，因为链不可区分。而对于本文所述的示范性连接工作流，不需要对VH和VL添加共有序列，因此排除了该问题发生的可能。

这样的PCR扩增可导致不同序列的显著偏向性的递呈，因为一些序列比起其他扩增更有效，因此导致PCR中发生指数扩增后有显著的差异。本文所述的工作流通过将PCR产物捕获在珠上减少了这种问题。例如，如果细胞的VH和VL序列扩增非常好或非常差，在珠上将捕获相似量的产物。因此，相对于那些忽略该步骤而通过重叠延伸PCR剪接进行联接的方法而言，最终文库中的抗体序列有更均匀的表现。

定义

本文所用的术语“HC可变区”指包含重链CDR1、2和3以及重链FW区1、2、3和4的多肽。

本文所用的术语“LC可变区”指包含轻链CDR1、2和3以及轻链FW区1、2、3和4的多肽。

本文所用的术语“重链可变区序列”或“HCVRS”指包含重链CDR的足够序列和重链FW区的足够序列以结合抗原的多肽。在实施方式中，HCVR可与轻链可变区装配，和例如结合抗原。在一个实施方式中，HCVR包含来自重链CDR1、2、和3的足够序列以及来自重链FW区(例如重链FW区1、2、3和4)的足够序列以允许结合抗原。在一个实施方式中，HCVR包含来自重链CDR1、2、和3的足够序列以及来自重链FW区(例如重链FW区1、2、3和4)的足够序列以与轻链可变区复合并允许结合抗原。

本文所用的术语“轻链可变区序列”或“LCVRS”指包含轻链CDR的足够序列和轻链FW区的足够序列以结合抗原的多肽。在实施方式中，LCVR可与重链可变区装配，和例如结合抗原。在一个实施方式中，LCVRS包含来自轻链CDR1、2、和3的足够序列以及来自轻链FW区(例如轻链FW区1、2、3和4)的足够序列以允许结合抗原。在一个实施方式中，LCVRS包含来自轻链CDR1、2、和3的足够序列以及来自轻链FW区(例如轻链FW区1、2、3和4)的足够序列以与重链可变区复合并允许结合抗原。

如本文所用的术语LC或HC可变区的“元件”指编码至少一个氨基酸的序列。在一个实施方式中，元件包括CDR。在一个实施方式中，元件包括FW区。在一个实施方式中，元件包括CDR和FW区。在一个实施方式中，元件包括HCVRS或LCVRS。在一个实施方式中，元件包括至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个氨基酸残基。

本文所用的术语“微室”指具有限定尺寸的区室，例如足够小，例如形成后其含有一个细胞，或来自一个细胞的内容物。在一个实施方式中，微室的体积比所含的细胞大10-10,000倍。在一个实施方式中，微室体积为20pL。在一个实施方式中，微室最大尺寸为100nL。在一个实施方式中，微室包含液滴。在一个实施方式中，微室包含置于不混溶的介质，例如气体或第二液体中的第一液体液滴。在一个实施方式中，微室包含第一液体(例如裂解缓冲液或PCR反应缓冲液)的液滴，其通过将第一液滴分散于不混溶的第二液体(例如氟化油)形成。在一个实施方式中，微室包括一种物质和除了该物质以外的物质，例如溶液。在一个实施方式中，液滴包括基质(例如捕获基质，例如珠)和除了该基质外的另一种基质(例如溶液)。

本文所用的术语“获得”指拥有(或)提供实体，例如物理实体或数据。获得物理实体包括生产和制造物理实体(直接获得)和从他方或来源接受物理实体(间接获得)。获得数据或值包括产生数据或值(直接获得)和从他方或来源接受数据或值(间接获得)。

本文所用的术语“匹配”当用于重链可变区和轻链可变区时，意味着它们来自同一细胞。对于轻链可变区的元件和重链可变区的元件，其意味着衍生出元件的轻链可变区和重链可变区来自同一细胞。

本文所用的术语“分离的反应位点”指位点(例如基质上的位置)微室、或基质上的孔，其能充分分离第一装载的捕获基质和第二装载的捕获基质，或通常从来自另一种细胞的编码HC或LC(或α链或β链，或γ链或δ链)的核酸，从而第一装载捕获基质不被来自另一个细胞的编码HC或LC(或α链或β链，或γ链或δ链)的核酸污染。在一个实施方式中，分离的反应位点提供载有第一mRNA的捕获基质和载有第二mRNA的捕获基质之间，或从编码另一细胞的LC或HC的核酸的充分分离，使得载有第一mRNA的捕获基质不被来自另一个细胞的编码HC或LC(或α链或β链，或γ链或δ链)核酸，例如mRNA污染。在一个实施方式中，分离的反应位点提供载有第一cDNA的捕获基质和载有第二cDNA的捕获基质之间，或从编码另一细胞的HC或LC(或α链或β链，或γ链或δ链)的核酸的充分分离，使得载有第一cDNA的捕获基质不被来自另一个细胞的编码HC或LC(或α链或β链，或γ链或δ链)核酸，例如cDNA污染。例如可通过分离的反应位点在基质上的充分距离；通过配置分离的反应位点从而使其不液体连通，或在体积或室与环境之间形成不混溶屏障，提供分离。在一个实施方式中，分离的反应位点包括一种物质和除了该物质以外的物质，例如溶液。

本文所用的术语“互补性”指可以形成华生-克里克配对的序列。当第一序列与第二序列互补时，其可与整条第二序列互补，或可以与少于全部的第二序列互补。

本文所用的术语“展示实体”指包括编码多肽的基因的实体，例如噬菌体或细胞，例如酵母细胞。

本文所用的术语“AC可变区”指包含TCRα链CDR1、2和3以及α链FW区1、2、3和4的多肽。

本文所用的术语“BC可变区”指包含β链CDR1、2和3以及β链FW区1、2、3和4的多肽。

本文所用的术语“GC可变区”指包含TCRγ链CDR1、2和3以及γ链FW区1、2、3和4的多肽。

本文所用的术语“DC可变区”指包含δ链CDR1、2和3以及δ链FW区1、2、3和4的多肽。

本文所用的术语“α链可变区序列”或“ACVRS”指包含α链CDR的足够序列和α链FW区的足够序列以结合抗原的多肽。在实施方式中，ACVR可与β链可变区装配，和例如结合抗原。在一个实施方式中，ACVR包含来自α链CDR1、2、和3的足够序列以及来自α链FW区(例如α链FW区1、2、3和4)的足够序列以允许结合抗原。在一个实施方式中，ACVR包含来自α链CDR1、2、和3的足够序列以及来自α链FW区(例如α链FW区1、2、3和4)的足够序列以与β链可变区复合并允许结合抗原。

本文所用的术语“β链可变区序列”或“BCVRS”指包含β链CDR的足够序列和β链FW区的足够序列以结合抗原的多肽。在实施方式中，BCVR可与α链可变区装配，和例如结合抗原。在一个实施方式中，BCVR包含来自β链CDR1、2、和3的足够序列以及来自β链FW区(例如β链FW区1、2、3和4)的足够序列以允许结合抗原。在一个实施方式中，BCVR包含来自β链CDR1、2、和3的足够序列以及来自β链FW区(例如β链FW区1、2、3和4)的足够序列以与α链可变区复合并允许结合抗原。

本文所用的术语“γ链可变区序列”或“GCVRS”指包含γ链CDR的足够序列和γ链FW区的足够序列以结合抗原的多肽。在实施方式中，GCVR可与δ链可变区装配，和例如结合抗原。在一个实施方式中，GCVR包含来自γ链CDR1、2、和3的足够序列以及来自γ链FW区(例如γ链FW区1、2、3和4)的足够序列以允许结合抗原。在一个实施方式中，GCVRS包含来自γ链CDR1、2、和3的足够序列以及来自γ链FW区(例如γ链FW区1、2、3和4)的足够序列以与δ链可变区复合并允许结合抗原。

本文所用的术语“δ链可变区序列”或“DCVRS”指包含δ链CDR的足够序列和δ链FW区的足够序列以结合抗原的多肽。在实施方式中，DCVR可与γ链可变区装配，和例如结合抗原。在一个实施方式中，DCVRS包含来自δ链CDR1、2、和3的足够序列以及来自δ链FW区(例如δ链FW区1、2、3和4)的足够序列以允许结合抗原。在一个实施方式中，DCVRS包含来自δ链CDR1、2、和3的足够序列以及来自δ链FW区(例如δ链FW区1、2、3和4)的足够序列以与α链可变区复合并允许结合抗原。

如本文所用的术语α链或β链可变区的“元件”指编码至少一个氨基酸的序列。在一个实施方式中，元件包括CDR。在一个实施方式中，元件包括FW区。在一个实施方式中，元件包括CDR和FW区。在一个实施方式中，元件包括ACVRS或BCVRS。在一个实施方式中，元件包括至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个氨基酸残基。

如本文所用的术语γ链或δ链可变区的“元件”指编码至少一个氨基酸的序列。在一个实施方式中，元件包括CDR。在一个实施方式中，元件包括FW区。在一个实施方式中，元件包括CDR和FW区。在一个实施方式中，元件包括GCVRS或DCVRS。在一个实施方式中，元件包括至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100个氨基酸残基。

本文所用的术语“匹配”当用于α链可变区和β链可变区时，意味着它们来自同一细胞。对于α链可变区的元件和β链可变区的元件，其意味着衍生出元件的α链可变区和β链可变区来自同一细胞。

本文所用的术语“匹配”当用于γ链可变区和δ链可变区时，意味着它们来自同一细胞。对于γ链可变区的元件和δ链可变区的元件，其意味着衍生出元件的γ链可变区和δ链可变区来自同一细胞。

本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个/种或一个/种以上的(即至少一个/种)该冠词语法上的宾语。

除非上下文明确作出不同指示，本文所用术语“或/或者”是指“和/或”，并可与其互换使用。

“约”和“近似”应通常表示在考虑测量的性质或精度的情况下测得量的可接受的误差度。示例性误差度在给定值或数值范围的20％以内，通常在10％以内，更通常在5％以内。

本文所述的组合物和方法包括具有指定序列的多肽和核酸，或具有与指定序列基本相同或与其相似(例如与指定序列至少85％、90％、95％或更高相同性)的序列的多肽和核酸。

在描述氨基酸序列的情况下，用于本文的术语“基本相同”是指第一氨基酸含有足够或最少数量的如下氨基酸残基：i)与第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基相同，或ii)第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基的保守取代，从而第一和第二氨基酸序列可具有共有的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含与参比序列(例如本文所提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的共有结构域的氨基酸序列。

在描述核苷酸序列的情况下，本文所用术语“基本相同”是指第一核酸序列包含足够或最少数量的与第二核酸序列中的比对核苷酸相同的核苷酸，从而第一和第二核苷酸序列编码具有相同功能活性的多肽、或编码相同结构多肽结构域或相同功能性多肽活性。例如，包含与参比序列(例如本文所提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列。

术语“功能性变体”是指与天然序列具有基本相同氨基酸序列或由基本相同的核苷酸序列编码、且能够具有天然序列一种或多种活性的多肽。

序列间的同源性或序列相同性(这些术语在本文中可互换使用)的计算如下进行。

为了确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比相同性，可以为了最佳比较目的而对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的之一或两条中引入缺口以达到最佳对齐，并且出于比较目的可以不考虑非同源序列)。在一个典型的实施方式中，用于比较目的比对的参比序列长度为该参比序列长度的至少30％，例如至少40％、50％、60％，例如至少70％、80％、90％、100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中某位置上占据的氨基酸残基或核苷酸与第二序列中相应位置上的相同时，则这些分子在该位置是相同的。

考虑到用于两个序列的最佳比对而需要引入的缺口数和每个缺口的长度，两条序列之间的百分比相同性与序列共有相同位置的数目相关。

可采用数学算法进行两条序列间的序列比较以及确定其百分比相同性。在一些实施方式中，两条氨基酸序列之间的百分比相同性可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法确定，该算法已经结合到GCG软件包中的GAP程序中(可从http://www.gcg.com获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。在某些实施方式中，两条核苷酸序列之间的相同性百分比使用GCG软件包中的GAP程序(可从http://www.gcg.com获得)，采用NWSgapdna.CMP矩阵和缺口权重40、50、60、70或80，长度权重1、2、3、4、5或6进行计算。一组合适的参数(以及除非另有说明而应采用的参数组)为Blossum 62评分矩阵，其缺口罚分为12，缺口延伸罚分为4，译码缺口罚分为5。

两条氨基酸或核苷酸序列之间的相同性百分比也可以使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))的算法确定，该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。

本文公开的核酸和蛋白质序列还可以用作“查询序列”来对公共数据库进行搜索，以例如鉴定其他家族组成部分或相关序列。这类搜索可使用Altschul等，1990，J.Mol.Biol.，215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)来运行。可以使用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，评分＝100，字长＝12，以获得与本文所述核酸同源的核苷酸序列。可利用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索，评分＝50，字长＝3，以获得与本文所述蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的缺口比对结果，可如Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述利用缺口BLAST。利用BLAST和缺口BLAST程序时，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

如本文所用，术语“在低严谨性、中等严谨性、高严谨性或极高严谨性条件下杂交”是指杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指导可见于Current Protocols in MolecularBiology(《新编分子生物学实验指南》，John Wiley&Sons公司,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6)，纳入本文作为参考。该参考文献中描述了水性和非水性方法，可采用这两种方法中的任一种。本文涉及的特定杂交条件如下：1)低严谨性杂交条件为在约45℃的6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中于至少50℃下洗涤2次(对于低严谨性条件，洗涤温度可提高至55℃)；2)中等严谨性杂交条件为在约45℃的6×SSC中杂交，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中于60℃洗涤一次或多次；3)高严谨性杂交条件为在约45℃的6×SSC中杂交，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中于65℃洗涤一次或多次；以及优选地，4)极高严谨性杂交条件为在65℃的0.5M磷酸钠、7％SDS中杂交，然后在0.2×SSC、1％SDS中于65℃洗涤一次或多次。极高严谨性条件4)是合适的条件，且为应采用的条件(除非另有说明)。

应理解，本文所述分子可具有额外的保守或非必需的氨基酸取代，其不对分子功能产生实质性影响。

术语“氨基酸”涵盖了包含氨基官能团和酸官能团且能够被包含于天然存在氨基酸形成的聚合物的所有分子，不论其为天然或合成分子。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物及同类物；具有变体侧链的氨基酸类似物；以及前述中任意的所有立体异构体。如本文所用，术语“氨基酸”包括D-和L-镜像异构体和模拟肽。

“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基替代的情况。本领域已定义具有带相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(若为单链)在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是线形或分支聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，可间插有非氨基酸。该术语也包括修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记组分偶联。多肽可从天然来源分离，可采用重组技术由原核或真核宿主产生，或者可为合成方法的产品。在一个实施方式中，多肽是抗体分子。在另一个实施方式中，结合多肽是TCR分子(例如可溶性TCR分子)。

术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸聚合形式，不论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。多核苷酸可以是单链或双链，并且如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸聚合后可以被进一步修饰，如通过与标记组分结合。核酸可为重组多核苷酸、或基因组多核苷酸、cDNA、半合成或合成来源，即非天然存在或以非天然排列方式与另一多核苷酸联接。

本文所用术语“分离的”指，某一物质是从其原生或天然环境(例如，若其是天然产生的，则从天然环境)脱离。例如，活体动物中存在的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但与天然系统中的某些或所有共存物质分离的该多核苷酸或多肽则是分离的。此类多核苷酸可为载体的部分和/或此类多核苷酸或多肽可为组合物的部分，但其仍为分离的，这是因为该载体或组合物不是该多核苷酸或多肽天然存在环境的一部分。

如本文所用，术语“治疗”例如本文所述的“治疗”病症是指实施方式之一中，与未被给予抗体分子相比，被给予该抗体分子的患有病症(例如本文所述的病症)和/或经受病症(例如本文所述的病症)症状的对象(例如人)其症状严重度较轻和/或恢复更快。治疗可为例如部分或完全减轻、改善、缓解、抑制或降低病症的严重性和/或减少发病率，以及可任选地延迟病症的一种或多种后果或症状、特征和/或病因的显现或发作。在一个实施方式中，治疗针对未显示病症某些迹象的对象进行和/或仅显示病症初期迹象的对象进行。在一个实施方式中，治疗针对具有一种或多种已确定病症迹象的对象进行。在一个实施方式中，治疗针对被诊断为罹患某种病症的对象进行。

如本文所用，术语“预防/防止”病症是指如果对象(例如人)接受了多肽(例如抗体分子)，该对象不易罹患该病症。

下文中进一步详细描述了本文所述组合物和方法的各个方面。在整个说明书中提供了其他定义。

结合多肽文库

本文公开了结合多肽(如抗体分子或T细胞受体分子)的文库(例如展示文库)，以及制备结合多肽(例如抗体分子或T细胞受体分子)文库的方法。

在一个实施方式中，本文所述的方法采用连接酶介导的方法联接两个DNA片段，例如编码抗体重链可变区(或其部分)和抗体轻链可变区(或其部分)，TCRα链(或其部分)和TCRβ链(或其部分)，或TCRγ链(或其部分)和TCRδ链(或其部分)。

例如，抗体由两类多肽链，轻链和重链组成，其中每一种都由独立的mRNA分子翻译而来。为了能从B细胞拷贝特定抗体(或B细胞受体)的功能性单位，必需获得特定重链及其关联轻链的知识。这通常用独立克隆在微孔板的孔中的方法进行，这些孔保持克隆分离，因此已知得到的重链和轻链序列是配对的。这种克隆方法的规模对于B细胞数量适应良好，相容96或384孔板。然而，人和动物中的B细胞储库范围可以达到10⁶-10¹¹个B细胞，许多都是不同的克隆(即不同的BCR或抗体)。因此，需要能够以有效方式制造百万计至亿万计的B细胞拷贝，其(1)维持链的天然配对，和(2)能功能性调查如此大数量的独特克隆。该方法能够实现制备抗体储库的可更新拷贝，其可用各种方法功能性调查。

在一个实施方式中，本文所述的方法使用以下一种或多种(例如2、3或全部)：(1)单个细胞(例如B细胞或T细胞的)在液滴(pL到nL体积的液滴)中的小型区室化,(2)裂解和PCR扩增两条链(例如抗体VH和VL,TCRα和β链，或TCRγ和δ链),(3)特异性联接两条链，从而维持天然配对，用热稳定连接酶催化所述联接，和(4)以能够允许通过表面展示技术(例如酵母或噬菌体展示)对克隆进行高通量表型调查的方式扩增联接的DNA。

本文所述的方法可得到当表达时编码功能性多肽，例如功能性抗原结合多肽的核酸序列。例如，HC元件和LC元件(或AC和BC元件，或GC和DC元件)不以头对头或尾对尾朝向配置。在一个实施方式中，HC元件和LC元件(或AC和BC元件，或GC和DC元件)以头对尾朝向配置。例如，LC元件(或LCVRS)的C-末端直接或间接与HC元件(或HCVRS)的N-末端联接，或HC元件(HCVRS)的C-末端直接或间接与LC元件(或LCVRS)的C-末端联接。

示例性工作流

细胞(例如免疫细胞，如B细胞或T细胞)以个体形式包装入液滴。在液滴中，裂解细胞，mRNA被捕获到珠上，该珠含有寡核苷酸以与mRNA杂交。珠有利于维持天然配对信息(例如两条链之间的天然配对，如一个B细胞中的重链和轻链；一个T细胞中的α链和β链；或一个T细胞中的γ链和δ链之间的天然配对)。然后，用逆转录酶(RT)将mRNA逆转录成cDNA。逆转录可以在裂解的液滴内，液滴外，或在随后的液滴(“PCR”液滴)中进行。从最初的液滴回收捕获了mRNA或cDNA的珠。然后将珠包封入新的液滴内，其中通过RT-PCR(当mRNA为模板)或PCR(当cDNA为模板)扩增核酸。在液滴中扩增编码两条链的cDNA。扩增产物重新通过特异互补的核酸杂交捕获到珠上。从液滴回收具有捕获产物的珠，随后包封入新的液滴。在液滴内用热稳定连接酶联接编码一条链(例如VH)的扩增产物与编码另一条链(例如VL)的扩增产物。在一方法(“连接粘性产物”)中，产生粘性(或“粘性末端”)PCR产物，用热稳定连接酶进行杂交的粘性PCR产物的共价连接。在另一方法(“连接酶循环反应”)中，不产生粘性PCR产物。相反在液滴中，DNA彼此通过使用热稳定性连接酶和夹板(或桥联)寡核苷酸联接。虽然不希望被理论限制，据信在一个实施方式中，本文所述的方法减少或排除重叠延伸PCR法的不期望融合的可能性(Turchaninova等.Eur J Immunol.2013；43(9):2507-2515)。进一步扩增代表天然配对链的连接产物，产生足够的物质以建立展示文库，例如在酵母或噬菌体内。将以scFv、scFab、Fab或全长IgG形式编码天然配对链(例如抗体重链和轻链，TCRα和β链，或TCRγ链和δ链)的扩增产物引入合适的表达或展示载体，例如酵母或噬菌体展示。构建的文库，例如具有>10⁴至10⁹或更多组成部分，能用已建立的方法迅速调查所需的结合和/或其他表型特征。

作为连接酶的合适底物的粘性PCR产物的产生

在一个实施方式中，产生了作为连接酶的合适底物的具有粘性末端的扩增(例如PCR)产物。不希望被理论限制，据信在一个实施方式中，DNA聚合酶延伸可在确定位置提早终止，例如通过使用化学修饰(例如破坏的)核苷酸或碱基，或其他对扩增使用的引物的改变。这些化学修饰的核苷酸或碱基(或其他引物改变)随即掺入扩增产物的一条链。随着DNA聚合酶沿着含有修饰的核苷酸的模板链阅读，其在修饰的核苷酸处(或附近)提早停止延伸，因为无法阅读通过。这种由于修饰的早期聚合酶终止可导致具有粘性末端的扩增产物的产生。扩增产物可与另一种具有互补粘性末端的扩增产物(可以相似方式产生)有效杂交(或退火)。例如，彼此具有互补粘性末端的编码一条链(例如VH)的PCR产物和编码另一条链(例如VL)的PCR产物可彼此高效杂交(或退火)。接着，与DNA聚合酶一起存在于液滴内的(例如在热循环中)热稳定连接酶催化杂交(或退火的)DNA分子的连接(共价连接)。

在一个实施方式中，在扩增和连接过程中维持天然配对信息。在一个实施方式中，扩增和连接都在同一液滴中发生，例如在不打碎液滴的情况下。在一个实施方式中，连接酶在95℃或更高(例如96℃或更高，97℃或更高，或98℃或更高)在一个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多)的热循环中维持至少50％,例如至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％活性。在一个实施方式中，连接酶在95℃或更高(例如96℃或更高，97℃或更高，或98℃或更高)在一个或多个(例如10、15、20、5、30、45、60、9、10、15、20、25或更多)的热循环中维持至少50％,例如至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％活性至少5分钟(例如至少10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、或60分钟)。在一个实施方式中，连接酶在允许DNA聚合酶活性的缓冲条件下在95℃或更高(例如96℃或更高，97℃或更高，或98℃或更高)维持至少50％,例如至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、或99％活性。

在一个实施方式中，修饰抑制或封闭DNA聚合酶活性，并保留底物供于连接。在一个实施方式中，修饰不抑制或防止扩增产物与连接酶结合。在一个实施方式中，修饰不抑制或预防磷酸二酯键的形成。在一个实施方式中，修饰不包括大体积的化学基团。示范性修饰包括但不限于核糖2’-C(第二碳)修饰(例如OH(即核糖核苷酸，而不是脱氧核糖核苷酸),O-甲基(O-CH₃),或胺(NH₂))；核糖4’-C(第四碳)修饰；碱基修饰(例如非天然碱基，尿嘧啶或其他)；脱碱基位点(例如AP位点或脱嘧啶/脱嘌呤)；或交错引物(例如不同长度的突出端)。在一个实施方式中，修饰包括尿嘧啶，用被尿嘧啶抑制的DNA聚合酶(例如古细菌DNA聚合酶)进行扩增。

下文说明了在液滴内进行粘性末端PCR-连接实验的示范性步骤。

细胞包封

可将细胞以个体形式包封入液滴内。在一个实施方式中，细胞是免疫细胞。在一个实施方式中，细胞是B细胞。在一个实施方式中，细胞是T细胞。在一个实施方式中，细胞是抗体产生细胞。在一个实施方式中，细胞是分离的细胞或纯化的细胞。在一个实施方式中，细胞获自个体，例如人、小鼠、家兔、大鼠、山羊、绵羊或鸡。

在一个实施方式中，液滴体积为从10pL至100nL,例如从10pL至100pL,从10pL至1000pL,从10pL至10nL,从10nL至100nL,从1000pL至100nL,从100pL至100nL,从100pL至10nL,从100pL至1000pL,从1000pL至10nL,或从100pL至1000pL。在一个实施方式中，液滴体积是从100pL到1000pL。

在一个实施方式中，液滴是油包水液滴。在一个实施方式中，液滴存在于运载体(例如油)相中，例如包含约1％氟化表面活性剂(RAN Biotechnologies)的3M^TMHFE-7500的运载体相。

可用例如微流体芯片(例如Dolomite的2R 100)通过针筒或压力泵控制流体相流动来形成液滴。在一个实施方式中，液滴的水相包含缓冲液，辅助细胞裂解的试剂和珠。在一个实施方式中，缓冲液含有pH7.5的Tris。在一个实施方式中，辅助细胞裂解的试剂包含去污剂。可用于辅助细胞裂解的示范性去污剂包括但不限于吐温-20、曲通X、IGEPAL或月桂酰肌氨酸钠(Sarkosyl)。在一个实施方式中，该珠是磁性珠。在一个实施方式中，珠包含或与，例如与mRNA(例如编码重链或轻链的mRNA)退火的寡核苷酸(例如引物)偶联。

在一个实施方式中，液滴在包封后含有不多于一个细胞。在一个实施方式中，液滴含有多个珠。在一个实施方式中，获得多个珠，至少80％，例如至少85％、90％、95％、98％、99％或100％的多个中每个液滴含不多于一个细胞。在一个实施方式中，获得多个珠，至少80％，例如至少85％、90％、95％、98％、99％或100％的多个中每个液滴至少含一个珠。通常液滴的占有率每个液滴不多于一个细胞，和每个液滴至少一个珠。

细胞裂解

包封后，可孵育液滴以促进细胞裂解。在一个实施方式中，加热乳液(例如含聚结的不同溶液相)，例如以减少mRNA二级结构从而使其能更有效被珠捕获和/或在去污剂(例如吐温20)存在下促进裂解效率。在一个实施方式中，乳液在如下温度孵育：40℃-80℃,例如40℃-60℃、50℃-70℃、或60℃-80℃,例如在40℃、50℃、60℃、70℃、或80℃。在一个实施方式中，乳液孵育5-60分钟，例如10-45分钟，15-30分钟，5-30分钟，或30-50分钟。在一个实施方式中，热裂解细胞。在一个实施方式中，酶裂解细胞。通常在细胞裂解后，释放mRNA并通过与珠上的寡核苷酸退火被捕获到珠上。

珠回收

可用液滴去稳定剂，例如全氟辛醇(PFO)破碎乳液(例如含有聚结的不同溶液相)。在一个实施方式中，回收含珠水相。在一个实施方式中，该珠是磁性珠，用磁铁分离。在一个实施方式中，洗涤珠并重悬浮在缓冲液(例如Tris，pH7.5)中。

逆转录

可用标准方法进行逆转录。在一个实施方式中，用非乳液反应进行逆转录。在一个实施方式中，在乳液反应进行逆转录。在一个实施方式中，捕获mRNA的珠可重悬浮于缓冲液-酶混合物(例如Superscript II RT)中，在35℃-45℃(例如在40℃)孵育10-60分钟(例如15分钟)以实现逆转录。在一个实施方式中，与珠偶联的寡核苷酸用作第一链cDNA的合成的引物。在一个实施方式中，在逆转录后用缓冲液(例如Tris，pH7.5)洗涤珠。

珠包封

可将珠以个体形式包封入液滴内。在一个实施方式中，液滴体积为从5pL至500pL,例如从5pL至400pL,从5pL至300pL,从5pL至200pL,从5pL至100pL,从5pL至50pL,从5pL至25pL,从400pL至500pL,从300pL至500pL,从200pL至500pL,从100pL至500pL,从50pL至500pL,从25pL至500pL,从10pL至500pL,从10pL至400pL,从25pL至300pL,从50pL至200pL或从10pL至50pL。在一个实施方式中，液滴体积是从10pL到50pL。

在一个实施方式中，包封后液滴含有一个珠。在一个实施方式中，获得多个珠，且至少80％，例如至少85％、90％、95％、98％、99％或100％的多个中每个液滴含不多于一个珠。

PCR-连接反应

在一个实施方式中，进行PCR连接反应。在一个实施方式中，PCR连接反应产生连接产物(例如双链DNA)，该产物包含编码抗体重链可变区(或其部分)和抗体轻链可变区(或其部分)的核苷酸序列。在一个实施方式中，PCR连接反应产生连接产物(例如双链DNA)，该产物包含编码TCRα链(或其部分)和TCRβ链(或其部分)的核苷酸序列。在一个实施方式中，PCR连接反应产生连接产物(例如双链DNA)，该产物包含编码TCRγ链(或其部分)和TCRδ链(或其部分)的核苷酸序列。在一个实施方式中，PCR连接反应在包含与cDNA偶联的珠、DNA聚合酶、寡核苷酸(例如用于扩增cDNA)、连接酶(例如热稳定连接酶)和缓冲液的液滴中进行。

可用于反应的示范性DNA聚合酶包括但不限于高保真DNA聚合酶(NEB)，高保真DNA聚合酶(NEB)、Pfu DNA聚合酶、KAPA DNA聚合酶、DNA聚合酶或TaqDNA聚合酶。

在一个实施方式中，连接产物包含scFv、Fab或scFab盒。在一个实施方式中，盒(scFv盒)构建成VL-接头-VH。不受理论限制，据信在一个实施方式中，顺序可切换成VH-接头-VL，对于表达或功能无显著影响。在一个实施方式中，盒(例如scFv盒)构建成VH-接头-VL。在一个实施方式中，盒含有稳定区序列(例如CH1结构域和/或CL结构域)，如与VL-CL偶联的VH1-CH1。

类似的，连接产物可含有作为α链-接头-β链或β链-接头-α链或γ链-接头-δ链或δ链-接头-γ链构建的盒。

在一个实施方式中，VL序列的反向引物含有以下一种、两种或全部：(a)编码接头序列的突出端；(b)至少一个修饰的核苷酸(例如具有2’-O-甲基修饰的3个连续核苷酸)，例如在突出端内；(c)5’磷酸。在一个实施方式中，VH序列的正向引物含有以下一种、两种或全部：(a)编码接头序列的突出端；(b)至少一个修饰的核苷酸(例如具有2’-O-甲基修饰的3个连续核苷酸)，例如在突出端内；(c)5’磷酸。

在一个实施方式中，VH序列的反向引物含有以下一种、两种或全部：(a)编码接头序列的突出端；(b)至少一个修饰的核苷酸(例如具有2’-O-甲基修饰的3个连续核苷酸)，例如在突出端内；(c)5’磷酸。在一个实施方式中，VL序列的正向引物含有以下一种、两种或全部：(a)编码接头序列的突出端；(b)至少一个修饰的核苷酸(例如具有2’-O-甲基修饰的3个连续核苷酸)，例如在突出端内；(c)5’磷酸。

类似地，在一个实施方式中，α链(或γ链)序列的反向引物含有以下一种、两种或全部：(a)编码接头序列的突出端；(b)至少一个修饰的核苷酸(例如具有2’-O-甲基修饰的3个连续核苷酸)，例如在突出端内；(c)5’磷酸。在一个实施方式中，β链(或δ链)序列的正向引物含有以下一种、两种或全部：(a)编码接头序列的突出端；(b)至少一个修饰的核苷酸(例如具有2’-O-甲基修饰的3个连续核苷酸)，例如在突出端内；(c)5’磷酸。

类似地，在一个实施方式中，β链(或δ链)序列的反向引物含有以下一种、两种或全部：(a)编码接头序列的突出端；(b)至少一个修饰的核苷酸(例如具有2’-O-甲基修饰的3个连续核苷酸)，例如在突出端内；(c)5’磷酸。在一个实施方式中，α链(或γ链)序列的正向引物含有以下一种、两种或全部：(a)编码接头序列的突出端；(b)至少一个修饰的核苷酸(例如具有2’-O-甲基修饰的3个连续核苷酸)，例如在突出端内；(c)5’磷酸。

可用于反应的示范性连接酶(例如热稳定连接酶)包括但不限于Taq DNA连接酶、Pfu DNA连接酶，热稳定DNA连接酶、Tsc DNA连接酶、Rma DNA连接酶、Tfi DNA连接酶或Tth DNA连接酶。

在一个实施方式中，缓冲液同时支持DNA聚合酶和连接酶活性。

在一个实施方式中，热循环和乳化一起进行(例如在PCR管中)。在一个实施方式中，热循环用以下条件进行：最初变性为95-98℃30秒-2分钟；10-30轮的：95-98℃变性10-30秒，最初退火50-60℃下10-30秒，聚合酶延伸72℃30秒，和粘性产物退火和连接在45-55℃3分钟。反应物可维持在4℃。

水相部分回收

可用液滴去稳定剂，例如全氟辛醇(PFO)破碎乳液(例如含有聚结的不同溶液相)。在一个实施方式中，回收水相部分(例如含连接产物，任选非联接的产物)。在一个实施方式中，弃去珠。

连接产物的纯化

可从非联接产物(例如非联接的VH和VL)纯化联接(例如代表性的天然联接的VL-接头-VH)。从非连接产物通过尺寸分离分离连接产物。例如，可使用变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)或变性HPLC-SEC。从非联接产物(约350-500bp)分离联接产物(约800-900bp)。对于变性PAGE纯化，从凝胶上切下连接的条带，进行电洗脱从凝胶切片提取DNA(Bio-Rad电洗脱仪)。

纯化的联接产物的扩增

可通过例如PCR扩增纯化的联接产物。例如，在能够中度通读含有修饰的核苷酸的DNA的条件下用DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)扩增纯化的联接产物。

用标准方法(例如用表达载体电穿孔)将最终PCR产物引入酵母，建立衍生自生物来源的天然配对文库。

连接酶循环

在一个实施方式中，以不掺入与两条链共同的DNA序列的方式扩增不同的链(例如VH和VL)，否则会促使粘性末端产物直接彼此退火。在一个实施方式中，在cDNA扩增后，但在热稳定连接酶的存在下引入桥联(或夹板)寡核苷酸。桥联寡核苷酸可促使两条链彼此紧密靠近，从而使其形成连接酶底物。相应地，连接酶催化DNA链之间形成共价键。由于该机制不能导致与两条链共有的序列掺入每条链(例如与VH和VL都具有共同序列的突出端DNA)，没有通过重叠延伸PCR剪接的机会。

该方法的步骤基本同上，除了从乳化PCR步骤开始。可在液滴中进行cDNA的PCR扩增。引物可添加突出端序列，但一般不加入与两条链(例如VH和VL)的共有序列(与以上的策略不一样)。液滴中的珠通过其缀合的寡核苷酸逐渐被两条链(例如VH和VL)的dsDNA产物填满或饱和，每个产物都具有特异性突出端序列。打碎液滴，洗去任何未联接或未退火的PCR产物。含有两条链(例如VH和VL)的dsDNA的珠在热稳定连接酶和夹板寡核苷酸的存在下包封在新液滴中。在该乳液形式中，进行热循环，实现3-DNA片段复合物的形成。该复合物是催化共价键形成，连接两条链的连接酶底物。在一个实施方式中，热循环帮助所有“上链(topstrand)”DNA转化成联接产物，直到一个底物变为限制性。在另一个实施方式中，两条链都被连接。例如，一旦“上链”连接，其可作为相对链的“夹板”，可被连接酶认作底物。不希望被理论所限，据信该部分特别使得反应有效，即最初连接产物可作为更多的模板(夹板)来产生甚至更多的连接产物。打碎液滴，用标准PCR法扩增连接产物。

进行连接酶循环实验的示范性步骤如下所示。

细胞包封

在一个实施方式中，液滴是油包水液滴。在一个实施方式中，液滴存在于运载体(例如油)相中，例如包含约1％氟化表面活性剂(RAN Biotechnologies)的3M^TM HFE-7500的载体相。

细胞裂解

包封后，可孵育液滴以促进细胞裂解。在一个实施方式中，加热乳液(例如含聚结的不同溶液相)，以促进在去污剂(例如吐温20)存在下的裂解效率。在一个实施方式中，乳液在如下温度孵育：40℃-80℃,例如40℃-60℃、50℃-70℃、或60℃-80℃,例如在40℃、50℃、60℃、70℃、或80℃。在一个实施方式中，乳液孵育5-60分钟，例如10-45分钟，15-30分钟，5-30分钟，或30-50分钟。在一个实施方式中，热裂解细胞。在一个实施方式中，酶裂解细胞。通常在细胞裂解后，释放mRNA并通过与珠上的寡核苷酸退火被捕获到珠上。

珠回收

可用液滴去稳定剂，例如全氟辛醇(PFO)破碎乳液(例如含有聚结的不同溶液相)。在一个实施方式中，回收含珠水相。在一个实施方式中，该珠是磁性珠，用磁铁分离。在一个实施方式中，洗涤珠并重悬浮在缓冲液(例如Tris，pH7.5)中。在一个实施方式中，保持珠冷却，以减少mRNA从珠上解离。

逆转录

可用标准方法进行逆转录。在一个实施方式中，用非乳液反应进行逆转录。在一个实施方式中，在乳液反应进行逆转录。在典型的实施方式中，逆转录步骤在PCR液滴内进行。例如，mRNA-珠包封入同时包含逆转录酶和DNA酶的液滴，以促进cDNA形成和dsDNA扩增。在一个实施方式中，捕获mRNA的珠可重悬浮于缓冲液-酶混合物(例如Superscript II RT)中，在35℃-45℃(例如在40℃)孵育10-60分钟(例如15分钟)以实现逆转录。在一个实施方式中，与珠偶联的寡核苷酸用作第一链cDNA的合成的引物。在一个实施方式中，在逆转录后用缓冲液(例如Tris，pH7.5)洗涤珠。

PCR的珠包封

在一个实施方式中，液滴是油包水液滴。在一个实施方式中，液滴存在于运载体(例如油)相中，例如包含约1％氟化表面活性剂(RAN Biotechnologies)的3M^TM HFE-7500的运载体相。

PCR反应

在一个实施方式中，进行PCR反应。在一个实施方式中，PCR反应在包含与cDNA偶联的珠、DNA聚合酶、寡核苷酸(例如用于扩增cDNA)和缓冲液的液滴中进行。

在一个实施方式中，PCR产物含有scFv盒。在一个实施方式中，scFv盒构建成VL-接头-VH。不受理论限制，据信在一个实施方式中，顺序可切换成VH-接头-VL，对于表达或功能无显著影响。在一个实施方式中，scFv盒构建成VH-接头-VL。

类似的，PCR产物可含有作为α链-接头-β链或β链-接头-α链或γ链-接头-δ链或δ链-接头-γ链构建的盒。

在一个实施方式中，本文所述的目标可变区序列的引物可包含(例如从5’到3’)：第一序列，其与结合于捕获底物的寡核苷酸序列互补，间隔子(例如本文所述的间隔子，例如PEG间隔子)，与第一序列的至少一部分互补的序列，通用引发序列，和与目标可变区序列互补的序列。

在一个实施方式中，热循环和乳化一起进行(例如在PCR管中)。在一个实施方式中，热循环用以下条件进行：最初变性为95-98℃30秒-2分钟；10-30轮的：95-98℃变性10-30秒，最初退火50-60℃下10-30秒，聚合酶延伸72℃30秒。在一个实施方式中，反应缓慢冷却，以使PCR产物捕获到珠上。可在4℃维持反应。

珠回收

连接酶循环的珠包封

连接酶循环反应

在一个实施方式中，进行连接酶循环反应。在一个实施方式中，连接酶循环在液滴中进行，该液滴包含与PCR产物偶联的珠，夹板寡核苷酸(例如与一条链(例如“上”VL链)的3’末端和另一条链(例如“上”VL链)的5’末端互补并退火)，热稳定连接酶，和支持连接酶活性的一种或多种反应组分(例如NAD)。

在一个实施方式中，热循环和乳化一起进行(例如在PCR管中)。在一个实施方式中，热循环用以下条件进行：3-15轮的：90-95℃变性30秒，50-60℃退火和连接1-3分钟。可在4℃维持反应。

水相部分回收

可用液滴去稳定剂，例如全氟辛醇(PFO)破碎乳液(例如含有聚结的不同溶液相)。在一个实施方式中，回收水相部分(例如含联接产物，任选非联接产物)。在一个实施方式中，弃去珠。

联接产物的纯化

可从非联接产物(例如非联接的VH和VL)纯化联接产物(例如代表性的天然联接的VL-接头-VH)。从非连接产物通过尺寸分离分离连接产物。例如，可使用变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)或变性HPLC-SEC。从非联接产物(约350-500bp)分离联接产物(约800-900bp)。对于变性PAGE纯化，从凝胶上切下连接的条带，进行电洗脱从凝胶切片提取DNA(Bio-Rad电洗脱仪)。

纯化的联接产物的扩增

可通过例如PCR扩增纯化的联接产物。例如，用DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)在标准条件下，使用与连接产物的外侧末端退火的寡核苷酸PCR扩增纯化的连接产物。

用标准方法(例如用表达载体电穿孔)将最终PCR产物引入酵母或哺乳动物细胞，建立衍生自生物来源的天然配对文库。

制备核酸序列的方法的示范性步骤如图2A-2D所示，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配。

其他示范性方法

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，该方法包括进行图1：A1、B1、C1和D1的步骤，从而产生一种核酸序列，其包含编码HCVR的HC元件和LCVR的LC元件的序列，其中HCVR和LCVR匹配。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，该方法包括进行图1：A1、B1、C1、D2和E1的步骤，从而产生一种核酸序列，其包含编码HCVR的HC元件和LCVR的LC元件的序列，其中HCVR和LCVR匹配。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，该方法包括进行图1：A1、B1、C2和D3的步骤，从而产生一种核酸序列，其包含编码HCVR的HC元件和LCVR的LC元件的序列，其中HCVR和LCVR匹配。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，该方法包括进行图1：A1、B1、C2、D4和E2的步骤，从而产生一种核酸序列，其包含编码HCVR的HC元件和LCVR的LC元件的序列，其中HCVR和LCVR匹配。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，该方法包括进行图1：A1、B1、C3和D5的步骤，从而产生一种核酸序列，其包含编码HCVR的HC元件和LCVR的LC元件的序列，其中HCVR和LCVR匹配。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，该方法包括进行图1：A1、B1、C3、D6和E3的步骤，从而产生一种核酸序列，其包含编码HCVR的HC元件和LCVR的LC元件的序列，其中HCVR和LCVR匹配。

在上述示范性方法中，在该工作流概念中通常cDNA不被捕获在基质(例如珠)上。例如，mRNA从基质(例如珠)上解离，然后在分离的反应位点(例如微室)，例如液滴中产生cDNA，然后从作为模板的cDNA在分离反应位点(例如微室)的溶液，例如液滴中产生PCR产物。在一个实施方式中，方法包括RT-PCR反应，其中在溶液的液滴中发生两个酶步骤。在上述示范性方法中，一般扩增产物捕获到基质(例如珠)上，促使配对产物转移到接下来的分离反应位点(例如微室)，例如下一个液滴中。

抗体分子

本文公开了抗体分子和抗体分子文库。在一个实施方式中，抗体分子或抗体分子文库用本文所述方法产生。

如本文所用术语“抗体分子”是指包含至少一种免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“抗体分子”包括例如全长、成熟抗体以及抗体的抗原结合片段。例如，抗体分子可包含重(H)链可变区序列(本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区序列(本文中缩写为VL)。在另一个实例中，抗体分子包两条重(H)链可变结构域序列和两条轻(L)链可变结构域序列，从而形成两个抗原结合位点，如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fd、Fd’、Fv、单链抗体(如scFv)、单可变结构域抗体、双抗体(Dab)(二价且双特异性)以及嵌合(如人源化)抗体，且可通过修饰完整抗体或采用重组DNA技术从头合成的那些产生。这些功能性抗体片段保留了选择性结合其相应抗原或受体的能力。抗体和抗体片段可来自任何抗体类型(包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE)，并来自任何抗体亚型(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗体分子可以是单克隆或多克隆的。抗体分子还可为人、人源化、CDR移植或体外产生的抗体。抗体分子可具有选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。抗体分子还可具有选自κ或λ的轻链。术语“免疫球蛋白(Ig)”与本文中的术语“抗体”可互换使用。

抗原结合片段的例子包括：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫桥联接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)双抗体(diabody，dAb)片段，其由VH结构域组成；(vi)骆驼或骆驼源化可变结构域；(vii)单链Fv(scFv)，参见例如Bird等，(1988)Science 242:423-426；以及Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)；(viii)单域抗体。这些抗体片段可通过任何合适的方法(包括本领域普通技术人员所知的多种常规技术)获得，并且筛选与完整抗体具有相同应用的片段。

术语“抗体”包括完整分子及其功能性片段。可改变(例如突变)抗体恒定区以修饰该抗体的性能，例如增加或提高或减少或降低如下一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能或补体功能。

抗体分子可为单链抗体。可对单链抗体(scFV)进行工程化改造(参见例如Colcher,D.等，(1999)Ann N Y Acad Sci 880:263-80；以及Reiter,Y.(1996)Clin CancerRes 2:245-52)。单链抗体可二聚化或多聚化以产生对相同目标蛋白上不同表位具有特异性的多价抗体。

本文所述的抗体分子还可为单域抗体。单域抗体可包括其互补决定区为单域多肽一部分的抗体。实例包括但不限于：重链抗体、天然缺失轻链的抗体、衍生自常规4链抗体的单域抗体、工程化抗体和非衍生自抗体的单结构域骨架。单域抗体可为本领域中任何单域抗体或任何未来的单域抗体。单域抗体可衍生自任何物种，包括但不限于：小鼠、人、骆驼、大羊驼、鱼、鲨鱼、羊、兔和牛。根据有些方面，单域抗体是已知为缺失轻链的重链抗体的天然存在单域抗体。此类单域抗体公开于例如WO94/04678。清楚起见，衍生自天然缺失轻链的重链抗体的该可变结构域在本文中称为VHH或纳米抗体以区别于四链免疫球蛋白的常规VH。该VHH分子可衍生自骆驼科(Camelidae)物种的抗体，例如衍生自骆驼、大羊驼、单峰驼、羊驼和驮马。除了骆驼科，其他物种也可产生天然缺失轻链的重链抗体；本文也包括了这些VHH。

VH和VL区可进一步细分为超变区，称为“互补决定区(CDR)”，其间间插更保守的被称为“框架区(FR或FW)”的区。本文所用术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和性的氨基酸序列。本文所用术语“框架”、“FW”和“FR”可以互换使用。

已采用多种方法精确来划定框架区和CDR的范围(参见Kabat,E.A.,等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(《热门免疫学蛋白质序列》，第5版，美国公共卫生署，国立卫生研究院，公开号91-3242；Chothia,C.等，(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；以及采用牛津分子AbM抗体造模软件(Oxford Molecular’s AbMantibody modeling software)所用的AbM定义。总体上参见例如《抗体工程化改造实验室手册》(“Antibody Engineering Lab Manual”，Duebel,S.和Kontermann,R.编，Springer-Verlag公司，海德堡)中的“抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析”(“ProteinSequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”)。在一个实施方式中，使用以下定义：重链可变结构域CDR1的AbM定义以及对其他CDR的Kabat定义。在一个实施方式中，将Kabat定义用于所有CDR。此外，用Kabat或AbM CDR描述的实施方式也可采用Chothia超变环来实施。每一VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按照以下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3和FR4。

如本文所用，“免疫球蛋白可变结构域序列”是指能形成免疫球蛋白可变结构域结构的氨基酸序列。例如，该序列可包括天然存在可变结构域氨基酸序列的全部或部分。例如，该序列可包含或不包含一个、两个或更多给N-或C-末端氨基酸，或可包含与蛋白质结构形成相容的其他改变。

术语“抗原结合区”是指包含形成与抗原或其表位结合界面的决定簇的抗体分子部分。就蛋白质(或蛋白质模拟物)而言，抗原结合区通常包含形成抗原结合界面的一个或多个环(例如至少4个氨基酸或氨基酸模拟物的环)。通常，抗体分子的抗原结合区包含至少一个或两个CDR和/或超变环，或更通常为至少三个、四个、五个或六个CDR和/或超变环。

术语“竞争”或“交叉竞争”在本文中可互换使用，是指抗体分子干扰另一抗体分子与目标结合的能力。对结合的干扰可以是直接的或间接的(例如通过抗体分子或目标的变构调控)。抗体分子干扰其他抗体分子与目标结合的程度且由此其是否能被称为竞争，可采用竞争性结合测试(例如FACS测试、ELISA或BIACORE测试)确定。在一个实施方式中，竞争性结合测试是定量竞争性测试。在一个实施方式中，在竞争性结合测试(例如本文所述的竞争性测试)中，第一抗体分子与目标的结合有如下减少时，认为该第一抗体分子与第二抗体分子竞争性结合所述目标：减少10％或更多，例如20％或更多，30％或更多，40％或更多，50％或更多，55％或更多，60％或更多，65％或更多，70％或更多，75％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，95％或更多，98％或更多，99％或更多。

本文所用术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指具有单一分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物针对具体表位具有单一的结合特异性和亲和力。单克隆抗体的制备可采用杂交瘤技术或不采用杂交瘤技术的方法(例如重组法)。

“有效/效果上的人(effectively human)”蛋白是不引发中和性抗体应答(例如人抗鼠抗体(HAMA)应答)的蛋白质。HAMA在许多情况下(例如若抗体分子在例如治疗慢性或复发性疾病症状时被反复施用的情况下)会造成问题。HAMA应答可造成反复给予抗体因血清抗体清除率提高(参见例如Saleh等，Cancer Immunol.Immunother.32:180-190(1990))以及潜在的过敏反应(参见例如LoBuglio等，Hybridoma,5:5117-5123(1986))而可能失去效果。

抗体分子可为多克隆或单克隆抗体。在一些实施方式中，可重组产生抗体，例如通过任何合适的噬菌体展示或重组方法来产生。

各种用于生成抗体的噬菌体展示和组合方法是本领域已知的(如下所述，例如，Ladner等，美国专利号5,223,409；Kang等，国际出版号WO 92/18619；Dower等，国际出版号WO 91/17271；Winter等，国际出版号WO 92/20791；Markland等，国际出版号WO 92/15679；Breitling等，国际出版号WO 93/01288；McCafferty等，国际出版号WO 92/01047；Garrard等，国际出版号WO 92/09690；Ladner等，国际出版号WO 90/02809；Fuchs等，(1991)Bio/Technology 9:1370 1372；Hay等，(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85；Huse等，(1989)Science 246:1275-1281；Griffths等，(1993)同上；Hawkins等，(1992)J Mol Biol226:889；Clackson等，(1991)Nature352:624；Gram等，(1992)PNAS 89:3576-3580；Garrad等，(1991)Bio/Technology9:1373 1377；Hoogenboom等，(1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137；和Barbas等，(1991)PNAS 88:7978-7982，其内容在此全部引入以供参考)。

在一个实施方式中，抗体分子是完全人抗体(例如由小鼠产生的抗体，该小鼠在已通过基因工程化改造以产生源自人免疫球蛋白序列的抗体)、或非人抗体，例如啮齿类(小鼠或大鼠)、羊、灵长类(例如猴)、骆驼抗体。在一个实施方式中，非人抗体是啮齿类抗体(小鼠或大鼠抗体)。制备啮齿类抗体的方法是本领域已知的。

人单克隆抗体可采用携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠而不是小鼠体系产生。来自用感兴趣抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞被用于产生分泌人mAb的杂交瘤，这些人mAb对来自人蛋白质的表位具有结合特异性(参见例如，Wood等，国际申请号WO 91/00906,Kucherlapati等，PCT公开号WO 91/10741；Lonberg等，国际申请号WO 92/03918；Kay等，国际申请号92/03917；Lonberg等，1994Nature368:856-859；Green,L.L.等，1994NatureGenet.7:13-21；Morrison,S.L.等，1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855；Bruggeman等，1993Year Immunol 7:33-40；Tuaillon等，1993PNAS 90:3720-3724；Bruggeman等，1991Eur J Immunol21:1323-1326)。

抗体可为其中的可变区或其部分(例如CDR)在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生的抗体。嵌合、CDR移植以及人源化抗体均包含在本发明中。本发明包括在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生并随后(例如在可变框架或恒定区中)进行修饰以降低人体内抗原性的抗体。

可采用任何合适的重组DNA技术产生嵌合抗体。本领域中已知数种方法(参见Robinson等，国际专利公开号PCT/US86/02269；Akira,等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi,M.,欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际申请WO 86/01533；Cabilly等，美国专利号4,816,567；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等，(1988Science 240:1041-1043)；Liu等，(1987)PNAS 84:3439-3443；Liu等，1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等，(1987)PNAS84:214-218；Nishimura等，1987,Canc.Res.47:999-1005；Wood等，(1985)Nature314:446-449；和Shaw等，1988,J.NatlCancer Inst.80:1553-1559)。

人源化或CDR移植抗体中(免疫球蛋白重链或轻链的)至少一个或两个但通常为全部三个受者CDR被供者CDR替代。可在抗体中用至少部分非人CDR进行替换，或用非人CDR替换仅部分CDR。仅需要替换人源化抗体结合抗原所需的CDR数。在一个实施方式中，供者可为啮齿类抗体，例如大鼠或小鼠抗体，而受者可为人框架或人共有框架。通常，提供CDR的免疫球蛋白被称“供者”，而提供框架区的免疫球蛋白被称作“受者”。在一些实施方式中，供者免疫球蛋白是非人的(例如，啮齿类)。受者框架通常为天然存在(例如人)的框架或共有框架，或与其约85％或更高例如90％、95％、99％或更高相同性的序列。

如本文所用，术语“共有序列”是指由相关序列家族中最高频存在氨基酸(或核苷酸)组成的序列(参见例如，Winnaker,From Genes to Clones(“从基因到克隆”)Verlagsgesellschaft出版公司，德国威因海姆(Weinheim,Germany)，1987)。在某一蛋白家族中，共有序列中的各位置上是该家族中该位置处出现频率最高的氨基酸。如果两种氨基酸出现频率相同，可将其中任一种包含于共有序列中。“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。

可采用任何合适的方法将抗体人源化，本领域中已知许多此类方法(参见例如，Morrison,S.L.,1985,Science 229:1202-1207,Oi等，1986,BioTechniques 4:214,以及Queen等，US 5,585,089、US 5,693,761和US 5,693,762，其全部内容作为参考纳入本文)。

可采用CDR移植或CDR取代来产生人源化或CDR移植抗体，可替换免疫球蛋白链中的一个、两个或全部CDR。参见例如美国专利号5,225,539；Jones等，1986Nature 321:552-525；Verhoeyan等，1988Science 239:1534；Beidler等，1988J.Immunol.141:4053-4060；Winter US 5,225,539，其全部内容作为参考纳入本文。Winter描述了可用于制备人源化抗体的CDR移植方法(英国专利申请GB2188638A，提交于1987年3月26日；Winter US 5,225,539)，其全部内容作为参考纳入本文。

还提供了其中特定氨基酸被取代、缺失或插入的人源化抗体。从供者中选择氨基酸的标准描述于例如US 5,585,089，例如US 5,585,089的第12-16栏，其内容通过参考纳入本文。使抗体人源化的其他技术描述于Padlan等EP519596A1(公开于1992年12月23日)。

在一个实施方式中，抗体分子所具有的重链恒定区选自例如：IgG1、IgG2(例如IgG2a)、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；具体而言，选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如人的)重链恒定区。在另一个实施方式中，抗体分子所具有的轻链恒定区选自例如κ或λ(例如人的)轻链恒定区。可改变(例如突变)恒定区以修饰该抗体分子的性能(例如以增加或减少如下一项或多项：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基数、效应细胞功能和/或补体功能)。在一个实施方式中，抗体分子具有效应功能且能够固定补体。在另一个实施方式中，抗体分子不募集效应细胞或固定补体。在某些实施方式中，抗体分子结合Fc受体的能力降低或不具备该能力。例如，抗体可以是不支持与Fc受体结合的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如其具有经诱变的Fc受体结合区或缺失Fc受体结合区。

在一个实施方式中，抗体分子的恒定区被改变。改变抗体恒定区的方法是本领域中已知的。具有改变的功能(例如对效应体配体(如细胞上的FcR)或补体的C1组分的亲和力改变)的抗体分子可通过将该抗体恒定部分中的至少一个氨基酸残基替换为不同的残基来产生(参见例如EP388,151A1、美国专利号5,624,821和美国专利号5,648,260，其全部内容通过引用纳入本文)。还包括了使抗体结构稳定的氨基酸突变，例如人IgG4中的S228P(EU命名法，Kabat命名法中的S241P)。可描述相似类型的改变，其若应用于鼠或其他物种的免疫球蛋白将减弱或消除这些功能。

在一个实施方式中，抗体分子中的氨基酸仅为标准氨基酸。在一个实施方式中，抗体分子包含天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物及同类物；具有变体侧链的氨基酸类似物；和/或前述中任意的所有立体异构体。抗体分子可包含肽模拟物和氨基酸的D-或L-光学异构体。

本文所述抗体分子的多肽可为线性或分支型，其可包含经修饰的氨基酸，且可间插有非氨基酸。还可修饰抗体分子；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记组分偶联来修饰。多肽可从天然来源分离，可采用重组技术由原核或真核宿主产生，或者可为合成方法的产品。

本文所述的抗体分子可以非偶联形式单独使用，或可与某些物质结合，所述物质为例如毒素或部分(例如治疗药物；发出辐射的化合物；植物、真菌或细菌源性分子；或生物蛋白(例如蛋白毒素)或颗粒(例如重组病毒颗粒，例如通过病毒包被蛋白))。例如，抗体分子可与放射性同位素(如α-、β-或γ-放射物或β-和γ-放射物)偶联。

抗体分子可衍生化为或联接其他功能性分子(例如另一肽或蛋白质)。如本文所用，“衍生化”抗体分子是已被修饰的抗体分子。衍生化的方法包括但不限于：添加荧光部分、放射性核苷酸、毒素、酶或亲和配体(如生物素)。因此，抗体分子包括本文所述抗体的衍生化和其他修饰形式，包括免疫粘附分子。例如，抗体分子可与一个或多个其他分子实体功能性联接(通过化学偶联、遗传融合、非共价关联或其他)，所述其他分子实体为例如另一抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、检测剂、毒素、药剂和/或能介导该抗体或抗体部分与其他分子(如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)关联的蛋白质或肽。

某些类型的衍生化抗体分子可通过交联两个或多个抗体(相同类型或不同类型，例如用以产生双特异性抗体)来产生。合适的交联剂包括具有通过合适间隔子分隔的两个不同反应基团的异双官能性交联剂(例如间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双官能性(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)交联剂。此类交联剂可获自Pierce化学品公司(伊利诺斯州罗克福德)。

可用于衍生化(或标记)抗体分子的有用的可检测剂包括荧光化合物、各种酶、辅基、发光材料、生物发光材料、荧光发射金属原子(例如铕(Eu)和其他镧系原子)以及放射性材料(如下文所述)。示例性荧光检测剂包括荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酸氯、藻红蛋白等。还可用可检测酶衍生化抗体，所述酶可为例如碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等。用可检测酶衍生抗体时，可采用加入该酶用来产生可检测反应产物的其他试剂来检测该抗体。例如，当存在检测剂辣根过氧化酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺产生可检测的颜色反应产物。也可用辅基(例如链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)来衍生抗体分子。例如，可用生物素衍生抗体，并通过亲和素或链霉亲和素结合的间接测定来检测该抗体。合适荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白。

可例如诊断性和/或试验性地应用标记的抗体分子，包括(i)用于通过标准技术(如亲和层析或免疫沉淀)分离预定抗原；(ii)用于检测(例如细胞裂解物或细胞上清液中的)预定抗原以评估蛋白质的表达模式和丰度；(iii)用于监测组织中蛋白水平作为临床试验的一部分来例如用于测定给定治疗方案的效力。

抗体分子可与其他分子实体偶联，所述分子实体通常为标记物或治疗剂(例如抗微生物剂(例如抗菌剂或杀菌剂)、免疫调节剂、免疫刺激剂、细胞毒剂或细胞抑制剂)或部分。可将放射性同位素用于检测或治疗应用中。可与抗体分子偶联的放射性同位素包括但不限于α-、β-或γ-放射体，或者β-和γ-放射体。此类放射性同位素包括但不限于：碘(¹³¹I或¹²⁵I)、钇(⁹⁰Y)、镥(¹⁷⁷Lu)、锕(²²⁵Ac)、镨、砹(²¹¹At)、铼(¹⁸⁶Re)、铋(²¹²Bi或²¹³Bi)、铟(¹¹¹In)、锝(⁹⁹mTc)、磷(³²P)、铑(¹⁸⁸Rh)、硫(³⁵S)、碳(¹⁴C)、氚(³H)、铬(⁵¹Cr)、氯(³⁶Cl)、钴(⁵⁷Co或⁵⁸Co)、铁(⁵⁹Fe)、硒(⁷⁵Se)或镓(⁶⁷Ga)。可用作治疗剂的放射性同位素包括：钇(⁹⁰Y)、镥(¹⁷⁷Lu)、锕(²²⁵Ac)、镨、砹(²¹¹At)、铼(¹⁸⁶Re)、铋(²¹²Bi或²¹³Bi)和铑(¹⁸⁸Rh)。可用作标记物例如用于诊断的放射性同位素包括：碘(¹³¹I或¹²⁵I)、铟(¹¹¹In)、锝(⁹⁹mTc)、磷(³²P)、碳(¹⁴C)和氚(³H)，或以上所列治疗用同位素中的一种或多种。

本公开提供了放射性标记的抗体分子及其标记方法。在一个实施方式中，公开了标记抗体分子的方法。该方法包括使抗体分子接触螯合剂从而产生偶联抗体。该偶联抗体被放射性同位素(例如¹¹¹铟、⁹⁰钇和¹⁷⁷镥)放射性标记从而产生标记的抗体分子。

在一些方面中，本公开提供了制备本文所公开抗体分子的方法。所述方法包括：提供抗原或其片段；获得特异性结合该抗原的抗体分子；评估该抗体分子在调控该抗原活性和/或生物表达该抗原中的效力。该方法还可进一步包括给予对象(例如人)该抗体分子，包括其衍生物(例如人源化抗体分子)。

本公开提供了编码上述抗体分子的分离的核酸分子、及其载体和宿主细胞。核酸分子包括但不限于RNA、基因组DNA和cDNA。

其他结合多肽

本公开不意在限于抗体分子。本文所述的方法能更广泛地适用于任何具有两条或更多条链(例如至少两条配对或匹配的链)的结合多肽。

在一个实施方式中，结合分子包含X链可变区和Y链可变区。例如，在本文的任何方面、实施方式和定义中，抗体重链(或可变区)可被X链(或可变区)取代，抗体轻链(或可变区)可被Y链(或可变区)取代。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(XCVR)的X链元件(XC元件)和抗体轻链可变区(YCVR)的Y链元件(YC元件)的序列，其中XCVR和YCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：

i)X链(XC)链，其中XC链是X链双链cDNA(XC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的XCVR的XC元件(例如X链可变区序列(XCVRS))的区段；和

ii)Y链(YC)链，其中YC链是轻链双链cDNA(YC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的YCVR的YC元件(例如轻链可变区序列(YCVRS))的区段；和

b)共价联接，例如连接XC链与YC链，

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的XCVR或YCVR的核酸，

如此产生一种核酸，其包含编码XCVR的XC元件和YCVR的YC元件的序列，其中XCVR和XCVR匹配。

本文所用的术语“匹配”当用于X链可变区和Y链可变区时，意味着它们来自同一细胞。在一个实施方式中，X链可变区和Y链可变区可形成多聚体蛋白或多聚体蛋白的部分。对于X链可变区的元件和Y链可变区的元件，其意味着衍生出元件的X链可变区和Y链可变区来自同一细胞。

本文所用的术语“X链可变区序列”或“XCVRS”指含有足够序列的多肽，其能与另一多肽(例如抗原)结合。在实施方式中，XCVRS可与Y链可变区装配，和例如结合抗原。本文所用的术语“Y链可变区序列”或“YCVRS”指含有足够序列的多肽，其能与另一多肽(例如抗原)结合。在实施方式中，YCVR可与X链可变区装配，和例如结合抗原。

如本文所用的术语XC或YC可变区的“元件”指编码至少一个氨基酸的序列。在一个实施方式中，元件包括CDR。在一个实施方式中，元件包括FW区。

在一个实施方式中，XC元件包含或由XCVRS组成。在一个实施方式中，YC元件包含或由YCVRS组成。

在一个实施方式中，XC ds cDNA包含编码XCVRS的区段。在一个实施方式中，YC dscDNA包含编码YCVRS的区段。在一个实施方式中，XC ds cDNA包含编码XCVRS的区段，且YCds cDNA包含编码YCVRS的区段。

在一个实施方式中，核酸序列配置成当表达时XC元件和YC元件(例如XCVRS和TCVRS)形成功能性抗原结合分子，例如XC和YC的单链或复合物。在一个实施方式中，抗原结合分子在体外、离体或体内是功能性的，如用本文所述的方法或实验所测定。

a)获得结合至以下物质的捕获基质：(i)第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自一种细胞的XCVR的第一mRNA互补的链；和(ii)第二ds cDNA，其包含与编码来自一种细胞的YCVR的第二mRNA互补的链(cDNA负载的捕获基质)，和

b)将分离的生产反应位点(例如生产微室)维持在允许第一和第二ds cDNA扩增的条件下，以产生：多条XC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的XCVR的XC元件(例如XCVRS)的区段；和多条YC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的YCVR的YC元件(例如YCVRS)的区段；

在一个实施方式中，XC ds cDNA与第一ds cDNA相同或基本相同。例如，XC dscDNA的正义链与第一ds cDNA的正义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸，和/或XC ds cDNA的反义链与第一ds cDNA的反义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸。

在一个实施方式中，YC ds cDNA与第二ds cDNA相同或基本相同。例如，YC dscDNA的正义链与第二ds cDNA的正义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸，和/或YC ds cDNA的反义链与第二ds cDNA的反义链至少有80％,85％,90％,95％,98％,99％,或100％相同，或差异不大于1,2,5,10,15,20,25,30,35,40,45,或50个核苷酸。

在一个实施方式中，XC链是正义链。在一个实施方式中，YC链是正义链。在一个实施方式中，XC链是反义链。在一个实施方式中，YC链是反义链。在一个实施方式中，XC链和YC链都是正义链。在一个实施方式中，XC链和YC链都是反义链。

在一个实施方式中，捕获基质包含珠，如磁珠。在一个实施方式中，捕获基质包含与cDNA结合的部分(例如寡核苷酸)，如(i)与XC链结合的部分；(ii)与YC链结合的部分；或(iii)(i)和(ii)两者。在一个实施方式中，与XC链结合的部分和与YC链结合的部分不同，如利于建立对捕获相似水平的每种DNA分子类型有利的条件。在一个实施方式中，与XC链结合的部分和与YC链结合的部分相同。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：适于从第一和第二mRNA产生第一ds cDNA和第二ds cDNA的试剂混合物(例如，在第一和第二mRNA从载有mRNA的捕获基质上释放入溶液后)，第一ds cDNA包含编码细胞的XCVR的XC元件(例如XCVRS)的区段，第二ds cDNA包含编码细胞的YCVR的YC元件(例如YCVRS)的区段。

在一个实施方式中，通过逆转录第一mRNA产生与编码来自细胞的XCVR的第一mRNA互补的cDNA链。在一个实施方式中，通过逆转录第二mRNA产生与编码来自细胞的YCVR的第二mRNA互补的cDNA链。

在一个实施方式中，逆转录和/或扩增使用一个或多个引物，例如包含对XCVRS和/或YCVRS特异性的序列。

在一个实施方式中，逆转录和/或扩增包括使用介导XC ds cDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。在一个实施方式中，扩增包括使用介导YC ds cDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。

在一个实施方式中，核苷酸修饰是在引物中插入间隔子，例如在引物内的两个相邻核苷酸之间。在一个实施方式中，间隔子是柔性间隔子。在一个实施方式中，间隔子是碳间隔子(例如.,-(CH2)n-,其中n＝3,4,5,6,7,8,9,10,或更多),两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多)脱碱基核苷酸，或聚乙二醇(PEG)间隔子。在一个实施方式中，间隔子是PEG间隔子。在一个实施方式中，核苷酸修饰是例如对核糖的2’-O-甲基,2’-OH,2’-NH₂,或尿嘧啶修饰。

在一个实施方式中，第一组成部分包括与附连至捕获基质的寡核苷酸序列互补的序列。在一个实施方式中，第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(例如XCVRS和/或YCVRS)互补的序列。在一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列相同或基本相同。在另一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少部分互补的序列不同。在一个实施方式中，第二组成部分包括用于同源重组(例如在酵母或哺乳动物细胞中)的序列。

在一个实施方式中，至少一种引物包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列。在一个实施方式中，包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列的引物被磷酸化，例如被5’磷酸化。不受理论限制，据信在一个实施方式中，任何具有一般柔性(例如甘氨酸带来的)和亲水性的的序列在本文所述的方法中都可有效发挥作用。示范性接头一般可具有一个或多个Gly、Ser、Thr、或Ala的过度展示(overrepresentation)和疏水残基例如一个或多个Trp,Tyr,Phe,Cys,Met,Leu,或Ile的过低展示(underrepresentation)。引物长度可以变化，例如为3-50个氨基酸残基(例如5-45、10-40、15-35、20-30、10-20、10-30、20-40、或30-40个氨基酸残基)。在一个实施方式中，接头序列包含或由((Gly)m-Ser))n组成，其中n＝1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更大。在一个实施方式中，接头序列包含或由(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n组成，其中n＝1,2,3,4,5,6,7,8,9,10或更大。

在一个实施方式中，XC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。在一个实施方式中，XC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。在一个实施方式中，YC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。在一个实施方式中，YC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。在一个实施方式中，XC ds cDNA和YC ds cDNA包含粘性末端，例如都具有5’突出端。

在一个实施方式中，XC链和YC链共价联接，例如连接产生单链核酸序列，其中XC和YC链都是正义链或都是反义链。在一个实施方式中，XC ds cDNA的变性XC链与YC ds cDNA的变性YC链共价联接，例如连接，其中XC链和YC链都是正义链或都是反义链。在一个实施方式中，XC链存在于XC ds cDNA中，YC链存在于YC ds cDNA中，其中XC ds cDNA和YC ds cDNA共价联接，例如连接，以产生双链核酸序列。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接在分离的生产反应位点发生。在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，或分离的联接反应位点，例如联接微室包含能够共价联接例如连接XC和YC链或XC和YC ds cDNA。在一个实施方式中，分离的生产反应位点例如生产微室包含共价偶联XC和YC链或XC和YC ds cDNA的酶。在实施方式中，酶是连接酶，例如热稳定连接酶。在一个实施方式中，共价联接包括连接酶热循环。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接，在与分离的生产反应位点不同的位点发生，例如在分离的联接反应位点，例如联接微室中发生。在一个实施方式中，XC链和YC链从分离的生产位点转移到分离的联接反应位点，例如联接微室，共价连接发生在分离的联接反应位点例如联接微室。在一个实施方式中，分离的联接反应位点例如联接微室包含能够共价联接，例如连接XC和YC链或XC和YC ds cDNA的试剂。在一个实施方式中，分离的联接反应位点例如联接微室包含共价偶联XC和YC链或XC和YC ds cDNA的酶。在实施方式中，酶是连接酶，例如热稳定连接酶。在一个实施方式中，共价联接包括连接酶热循环。

在一个实施方式中，共价联接，例如连接，包括：(a)在允许XC链和YC链变性的条件下(例如在95℃)加热分离的联接反应位点，例如联接微室；(b)在允许夹板寡核苷酸与XC链和YC链杂交的条件下(例如在50-65℃)冷却分离的联接反应位点，例如联接微室；(c)在允许XC链和YC链连接(例如在XC链和YC链之间形成磷酸二酯键)的条件下(例如在45-65℃)维持分离的联接反应位点，例如联接微室；和(d)依次重复步骤(a)、(b)和(c)2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或更多轮循环。

在一个实施方式中，XC链和YC链在夹板寡核苷酸的存在下共价联接，例如连接。在一个实施方式中，夹板寡核苷酸与包含XC链和YC链接合区(junction)的序列，或其互补序列杂交，在连接位点形成双链区域。在一个实施方式中，夹板寡核苷酸包含抑制例如DNA聚合酶的DNA合成的修饰(例如NH₂基团)。在一个实施方式中，修饰在夹板寡核苷酸3’末端。

在一个实施方式中，扩增产生与共价联接，例如连接的XC和YC链互补的链。

在一个实施方式中，获得载有mRNA的捕获基质包括：a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：i)细胞；和ii)捕获基质，其能结合编码来自细胞的XCVR的第一mRNA和编码来自细胞的YCVR的第二mRNA；和b)将分离的细胞反应位点(例如，细胞分离微室)维持在允许细胞裂解和捕获基质与第一和第二mRNA结合的条件下，以形成载有mRNA的捕获基质，其中分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的XCVR或YCVR的核酸。

在一个实施方式中，方法还包括将全部或部分核酸序列插入载体。在一个实施方式中，载体提供未包括在核酸序列内的额外XC元件或YC元件。在一个实施方式中，载体提供了XC CDR1、XC CDR2或两者。在一个实施方式中，方法还包括表达该载体。

在一个实施方式中，该方法还包括表达核酸序列以产生包含编码XCVR的XC元件(例如XCVRS)的区段和编码YCVR的YC元件(例如YCVRS)的区段的多肽。在一个实施方式中，YC元件在多肽内在XC元件的N-末端。在一个实施方式中，XC元件在多肽内在YC元件的C-末端。

在一个方面，本公开特征之一是一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(XCVR)的X链元件(XC元件)和抗体轻链可变区(YCVR)的Y链元件(YC元件)的序列，其中XCVR和YCVR相匹配，所述方法包括：

a)获得分离的细胞反应位点(例如本文所述的分离的细胞反应位点)，如细胞分离微室，包括：i)细胞(例如本文所述的细胞)；和ii)捕获基质(例如本文所述的捕获基质)，其能结合编码来自细胞的XCVR的第一mRNA和编码来自细胞的YCVR的第二mRNA；

其中分离的细胞反应位点(例如细胞分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的XCVR或YCVR的核酸。

d)获得分离的生产反应位点(例如本文所述的分离的生产反应位点)，如生产微室，包括：I)X链(XC)链，其中XC链是X链双链cDNA(XC ds cDNA)的链，其包括编码来自细胞的XCVR的XC元件(例如X链可变区序列(XCVRS))的区段；和ii)轻链(YC)链，其中YC链是轻链双链cDNA(YC ds cDNA)的链，其包括编码来自细胞的YCVR的YC元件(例如轻链可变区序列(YCVRS))的区段，

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的YCVR或XCVR的核酸；和

e)共价联接，例如连接XC链与YC链。

c)获得分离的生产反应位点(例如本文所述的分离的生产反应位点)，如生产微室，包括：使载有mRNA的捕获基质与反应混合物接触，例如含有逆转录酶的反应混合物，其用负载mRNA作为模板，产生：第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自一种细胞的XCVR的第一mRNA互补的链；和第二ds cDNA，其包含与编码来自一种细胞的YCVR的第二mRNA互补的链(cDNA负载的捕获基质)；

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞(例如不同的细胞)的YCVR或XCVR的核酸。

d)将分离的生产反应位点(例如生产微室)维持在允许第一和第二ds cDNA扩增的条件下，以产生：多条XC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的XCVR的XC元件(例如XCVRS)的区段；和多条YC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的YCVR的YC元件(例如YCVRS)的区段；

e)获得分离的联接反应位点(例如本文所述的分离的联接反应位点)，如联接微室，包括：共价联接(例如连接)XC ds cDNA链的链(XC链)和YC ds cDNA的链(YC链)，其中XC和YC链都是正义链或都是反义链；和

f)扩增共价联接的，例如连接的XC和YC链。

产生多个组成部分，其中每个组成部分包含编码X链可变区(XCVR)的X链元件(XC元件)和Y链可变区(YCVR)的Y链元件(YC元件)的序列，和其中XCVR和YCVR匹配，由本文所述的方法产生，

其中所述多个中的每一个独特核酸序列包含来自不同独特细胞(例如本文所述的细胞)的XC元件和YC元件，

从而产生包含多个独特组成部分的文库。

在一个实施方式中，多个独特组成部分包括至少10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个独特组成部分。在一个实施方式中，多个独特组成部分包括10⁴至10⁹、10⁴至10⁸、10⁴至10⁷、10⁴至10⁶、10⁴至10⁵、10⁸至10⁹、10⁷至10⁹、10⁶至10⁹、10⁵至10⁹、10⁵至10⁸、10⁶至10⁷、10⁴至10⁵、10⁵至10⁶、10⁶至10⁷、10⁷至10⁸、或10⁸至10⁹个独特组成部分。在一个实施方式中，所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的XC元件和YC元件序列)。在一个实施方式中，所述文库中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的XC元件和YC元件序列)。

i)所述多个中的每一个独特组成部分包含编码XC元件(例如XCVRS)的区段和编码YC元件(例如YCVRS)的区段，其中每个独特组成部分中的XC元件和YC元件互相匹配；

ii)所述多个中的每一个独特组成部分包括来自不同独特细胞的编码XC元件(例如XCVRS)的区段和编码YC元件(例如YCVRS)的区段；和

iii)文库包括以下特征中的一个或多个(例如2、3、4或全部)：

a)文库用本文所述方法产生；

d)所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的XC元件和YC元件序列)；或

e)所述文库中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的XC元件和YC元件序列)。

在一个实施方式中，多个独特组成部分中的每一个配置成当表达时XC元件(例如XCVRS)和YC元件(例如YCVRS)形成功能性抗原结合分子，例如scFv。

在一个方面，本文提供了产生结合多肽(例如包含XC元件和YC元件的多肽)的方法，该方法包括：a)获得本文所述的文库(例如用本文所述的方法)；和b)表达文库的独特核酸编码的多肽。

在一个方面，本文提供了分离的生产反应位点，例如生产微室，其是本文所述的分离的生产反应位点(例如包含编码XCVR的核酸和编码YCVR的核酸，其中XCVR与YCVR匹配)。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点(例如生产微室)不包括编码来自不同细胞的XCVR或YCVR的核酸。

在一个实施方式中，分离的生产反应位点，例如生产微室，包括以下特征中的一个、两个、或全部：(i)对XC和YC的V基因序列特异性的一个或多个引物；(ii)对引入XC和YCcDNA的突出端特异性的一个或多个引物；或(iii)一个或多个引物，其包含第一组成部分、第二组成部分和第三组成部分，所述第三组成部分位于第一组成部分和第二组成部分之间的核苷酸修饰(例如间隔子)，其中第一组成部分能与相同引物或不同引物的第二组成部分退火，例如形成含有具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域的结构。

在一方面，本文提供了自退火寡核苷酸，其包括第一组成部分、第二组成部分和第三组成部分，所述第三组成部分包含位于第一和第二组成部分之间的核苷酸修饰(例如间隔子)，其中第一组成部分能与相同的寡核苷酸的第二组成部分退火(例如用于产生包含编码XCVR的XC元件和YCVR的YC元件的核酸序列的方法，其中XCVR和YCVR相匹配)。

在一个实施方式中，第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(例如XCVRS和/或YCVRS)互补的序列。在一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少一部分互补的序列相同或基本相同。在另一个实施方式中，通用引物序列和与第一组成部分的至少一部分互补的序列不同。在一个实施方式中，第二组成部分包括用于同源重组(例如在酵母或哺乳动物细胞中)的序列。

在一个方面，本文提供了分离的联接反应位点，例如联接微室，其是本文所述的分离的联接反应位点(例如包含编码XCVR的核酸和编码YCVR的核酸，其中XCVR与YCVR匹配)。

在一个实施方式中，分离的联接反应位点(例如联接微室)不包括编码来自不同细胞的XCVR或YCVR的核酸。

在一个实施方式中，分离的联接反应位点(例如联接微室)包括剪接寡核苷酸(例如本文所述的夹板寡核苷酸)，其能催化与含有XC链和YC链的接合区的序列或其互补序列的杂交，在连接位点形成双链区域。

T细胞受体分子

本公开不打算限于抗体分子。在一个实施方式中，结合分子是TCR分子(例如可溶性TCR分子)。在一个实施方式中，结合分子包含TCRα链可变区和TCRβ链可变区。在一个实施方式中，结合分子包含TCRγ链可变区和TCRδ链可变区。例如，在本文的任何方面、实施方式和定义中，抗体重链(或可变区)可被TCRα链(或可变区)取代，抗体轻链(或可变区)可被TCRβ链(或可变区)取代；或抗体重链(或可变区)可被TCRγ链(或可变区)取代，抗体轻链(或可变区)可被TCRδ链(或可变区)取代。

本文公开了T细胞受体(TCR)分子和TCR分子文库。在一个实施方式中，TCR分子或TCR分子文库用本文所述方法产生。

如本文所用的术语“TCR分子”也称作“T-细胞受体分子”或“T细胞受体分子”，指一种蛋白例如TCR链或其部分，其包含至少一个TCR可变结构域序列。术语“TCR分子”包括例如全长、成熟TCR以及TCR的抗原结合片段。例如，TCR分子可包含α链可变区序列和β链可变区序列。在另一个例子中，TCR分子可包含γ链可变区序列和δ链可变区序列。在一些实施方式中，TCR分子是可溶性TCR分子。

可在T细胞表面发现T细胞受体，其负责识别作为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽的抗原片段。TCR通常包括两种不同蛋白链。在人中，约95％的T细胞中TCR包括α链和β链(分别由TRA和TRB编码)，而在5％的T细胞中TCR包括γ(gamma)和δ(delta)链(分别由TRG和TRD编码)。该比率可在癌症发生和疾病状态(例如白血病)时改变。当TCR与抗原肽和MHC(肽/MHC)结合时，通过信号转导，例如一系列的相关酶、辅助受体，特异性适体分子和转录因子的激活或释放活化T淋巴细胞。

例如，天然存在的TCR通常是二硫键联接的锚定在膜上的异二聚体蛋白，包括例如高度可变的α和β链，其作为与非变异CD3链分子的复合物的一部分表达。表达该受体的T细胞有时称作α:β(或αβ)T细胞，尽管少部分T细胞表达另一种受体，其由可变的γ和δ链形成，有时称作(γδ)T细胞。

TCR的每条链可包括两个胞外域：可变(V)区和稳定(C)区。恒定区接近细胞膜，其后跟随着跨膜区域和短胞质尾，而可变区可结合肽/MHC复合物。

TCRα链或β链的可变区各自具有三个高变区或互补决定区(CDR)。在β链上还有一个额外的高变区域(HV4)，其通常不接触抗原，不被认为是CDR。这些可变区中的残基位于TCR的两个区域内，在α和β链的界面上和接近CD3信号转导复合物的β链框架区内。不希望被理论限制，CD3是负责识别经加工抗原的主要CDR。α链的CDR1可与抗原肽的N-末端部分作用，而β链的CDR1可与肽的C-末端部分作用。CDR2可识别MHC。通常不认为链的CDR4参与抗原识别，但其可与超抗原作用。

TCR的稳定区包括例如短连接序列，其在两条链之间形成连接，例如通过二硫键。

TCR多样性的产生主要是通过DNA编码区段在独立的体细胞T细胞中通过体V(D)J重组的基因重组。每个重组的TCR可拥有独特的抗原特异性，其由抗原结合位点(例如在αβT细胞中由α和β链，在γδT细胞中由γ和δ链)的结构决定。例如，TCRα和γ链可通过VJ重组产生，而β和δ链可通过VDJ重组产生。这些特异性区域(例如α和γ链的V和J，β和δ链的V、D和J)的相交处对应于CDR3区域，其通常对于肽/MHC识别是重要的。

TCR受体可形成可变TCR链的复合物(例如α和β链，其具有三个二聚信号传导分子CD3δ/ε,CD3γ/ε和CD247ζ/ζ或ζ/η)。T细胞可表达克隆的TCR，其在T细胞与抗原递呈细胞APC(MHC II类)或任何其他细胞类型(MHC I类)物理接触时识别特异性肽/MHC复合物。可通过特异性辅助受体同时结合MHC分子增强T细胞复合物的信号。例如，在辅助T细胞和调节性T细胞上，辅助受体是对MHC II类特异性的CD4，而在细胞毒性T细胞上，辅助受体是对MHC I类特异性的CD8。

术语“TCR”包括完整分子及其功能性片段。TCR片段可通过任何合适的方法(包括本领域普通技术人员所知的多种常规技术)获得，并且筛选与完整TCR具有相同应用的片段。可改变，例如突变TCR恒定区，以改变TCR性质。

TCR分子可为单链TCR。单链TCR可二聚化或多聚化以产生对相同目标蛋白上不同表位具有特异性的多价TCR。

本文所述的TCR分子还可为单域TCR。单域TCR可包括其互补决定区为单域多肽一部分的TCR。例子包括但不限于α、β、γ、或δ链TCR，缺乏一个α、β、γ、或δ链的TCR，衍生自常规两条链的TCR的单域TCR，工程改造的TCR和除了衍生自TCR的以外的单结构域支架。单域TCR可为本领域中任何单域抗体或任何未来的单域TCR。单域TCR可衍生自任何物种，包括但不限于：小鼠、人、骆驼、大羊驼、鱼、鲨鱼、羊、兔和牛。

可变区可进一步细分为超变区，称为“互补决定区(CDR)”，其间间插更保守的被称为“框架区(FR或FW)”的区。本文所用的有关于TCR分子的术语“互补决定区”和“CDR”是指TCR可变区内赋予抗原特异性和结合亲和性的氨基酸序列。本文所用术语“框架”、“FW”和“FR”可以互换使用。

如本文所用，“TCR可变结构域序列”是指能形成TCR可变结构域结构的氨基酸序列。例如，该序列可包括天然存在可变结构域氨基酸序列的全部或部分。例如，该序列可包含或不包含一个、两个或更多给N-或C-末端氨基酸，或可包含与蛋白质结构形成相容的其他改变。

术语“抗原结合区”是指包含形成与抗原或其表位结合界面的决定簇的TCR分子部分。就蛋白质(或蛋白质模拟物)而言，抗原结合区通常包含形成抗原结合界面的一个或多个环(例如至少4个氨基酸或氨基酸模拟物的环)。通常，TCR分子的抗原结合区包含至少一个或两个CDR和/或超变环，或更通常为至少三个、四个、五个或六个CDR和/或超变环。

术语“竞争”或“交叉竞争”在本文中可互换使用，是指TCR分子干扰另一TCR分子与目标结合的能力。对结合的干扰可以是直接的或间接的(例如通过TCR分子或目标的变构调控)。TCR分子干扰其他TCR分子与目标结合的程度且由此其是否能被称为竞争，可采用竞争性结合测试(例如FACS测试、ELISA或BIACORE测试)确定。在一个实施方式中，竞争性结合测试是定量竞争性测试。在一个实施方式中，在竞争性结合测试(例如本文所述的竞争性测试)中，第一TCR分子与目标的结合有如下减少时，认为该第一TCR分子与第二TCR分子竞争性结合所述目标：减少10％或更多，例如20％或更多，30％或更多，40％或更多，50％或更多，55％或更多，60％或更多，65％或更多，70％或更多，75％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，95％或更多，98％或更多，99％或更多。

TCR分子可为多克隆或单克隆的。在一些实施方式中，可重组产生TCR，例如通过任何合适的噬菌体展示或重组方法来产生。噬菌体展示和组合方法是本领域已知的。

在一个实施方式中，TCR分子是完全人TCR(例如由小鼠产生的TCR，该小鼠在已通过基因工程化改造以产生源自人TCR序列的TCR)、或非人TCR，例如啮齿类(小鼠或大鼠)、羊、灵长类(例如猴)、骆驼TCR。在一个实施方式中，非人TCR是啮齿类(小鼠或大鼠TCR)。例如，人TCR可采用携带人TCR基因的转基因小鼠而不是小鼠体系产生。

TCR可为其中的可变区或其部分(例如CDR)在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生的TCR。嵌合、CDR移植以及人源化TCR均包含在本发明中。本发明包括在非人生物(例如大鼠或小鼠)中产生并随后(例如在可变框架或恒定区中)进行修饰以降低人体内抗原性的TCR。

可采用任何合适的重组DNA技术产生嵌合TCR。

人源化或CDR移植TCR中(TCR链的)至少一个或两个但通常为全部三个受者CDR被供者CDR替代。可在TCR中用至少部分非人CDR进行替换，或用非人CDR替换仅部分CDR。仅需要替换人源化TCR结合抗原所需的CDR数。在一个实施方式中，供者可为啮齿类TCR，例如大鼠或小鼠TCR，而受者可为人框架或人共有框架。通常，提供CDR的TCR被称“供者”，而提供框架区的TCR被称作“受者”。在一些实施方式中，供者TCR是非人的(例如，啮齿类)。受者框架通常为天然存在(例如人)的框架或共有框架，或与其约85％或更高例如90％、95％、99％或更高相同性的序列。

如本文所用，术语“共有序列”是指由相关序列家族中最高频存在氨基酸(或核苷酸)组成的序列(参见例如，Winnaker,From Genes to Clones(“从基因到克隆”Verlagsgesellschaft出版公司，德国威因海姆(Weinheim,Germany)，1987)。在某一蛋白家族中，共有序列中的各位置上是该家族中该位置处出现频率最高的氨基酸。如果两种氨基酸出现频率相同，可将其中任一种包含于共有序列中。“共有框架”是指共有TCR序列中的框架区。

可用任何合适的方法人源化TCR。可采用CDR移植或CDR取代来产生人源化或CDR移植TCR，可替换免疫球蛋白链中的一个、两个或全部CDR。还提供了其中特定氨基酸被取代、缺失或插入的人源化TCR。

在一个实施方式中，TCR分子具有恒定区。可改变，例如突变恒定区，以改变TCR分子的性质。在一个实施方式中，TCR分子的恒定区被改变。改变恒定区的方法是本领域中已知的。

在一个实施方式中，TCR分子中的氨基酸仅为标准氨基酸。在一个实施方式中，TCR分子包含天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物及同类物；具有变体侧链的氨基酸类似物；和/或前述中任意的所有立体异构体。TCR分子可包含肽模拟物和氨基酸的D-或L-光学异构体。

本文所述TCR分子的多肽可为线性或支化的，其可包含经修饰的氨基酸，且可间插有非氨基酸。还可修饰TCR分子；例如，通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记组分偶联来修饰。多肽可从天然来源分离，可采用重组技术由原核或真核宿主产生，或者可为合成方法的产品。

本文所述的TCR分子可以非偶联形式单独使用，或可与某些物质结合，所述物质为例如毒素或部分(例如治疗药物；发出辐射的化合物；植物、真菌或细菌源性分子；或生物蛋白(例如蛋白毒素)或颗粒(例如重组病毒颗粒(例如通过病毒包被蛋白))。例如，TCR分子可与放射性同位素(如α-、β-或γ-放射物或β-和γ-放射物)偶联。

TCR分子可衍生化为或联接其他功能性分子(例如另一肽或蛋白质)。如本文所用，“衍生化”TCR分子是已被修饰的TCR分子。衍生化的方法包括但不限于：添加荧光部分、放射性核苷酸、毒素、酶或亲和配体(如生物素)。因此，TCR分子包括本文所述抗体的衍生化和其他修饰形式，包括免疫粘附分子。例如，TCR分子可与一个或多个其他分子实体功能性联接(通过化学偶联、遗传融合、非共价关联或其他)，所述其他分子实体为例如另一TCR(例如双特异性TCR)、检测剂、毒素、药剂和/或能介导该TCR或TCR部分与其他分子(如链霉亲和素核心区或多聚组氨酸标签)关联的蛋白质或肽。

某些类型的衍生化TCR分子可通过交联两个或多个TCR(相同类型或不同类型，例如用以产生双特异性TCR)来产生。合适的交联剂包括具有通过合适间隔子分隔的两个不同反应基团的异双官能性交联剂(例如间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双官能性(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)交联剂。此类交联剂可获自Pierce化学品公司(伊利诺斯州罗克福德)。

可用于衍生化(或标记)TCR分子的有用的可检测剂包括荧光化合物、各种酶、辅基、发光材料、生物发光材料、荧光发射金属原子(例如铕(Eu)和其他镧系原子)以及放射性材料(如下文所述)。示例性荧光检测剂包括荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酸氯、藻红蛋白等。还可用可检测酶衍生化TCR，所述酶可为例如碱性磷酸酶、辣根过氧化酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等。用可检测酶衍生TCR时，可采用加入该酶用来产生可检测反应产物的其他试剂来检测该TCR。例如，当存在检测剂辣根过氧化酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺产生可检测的颜色反应产物。也可用辅基(例如链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)来衍生TCR分子。例如，可用生物素衍生TCR，并通过亲和素或链霉亲和素结合的间接测定来检测。合适荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；生物发光材料的例子包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白。

可例如诊断性和/或试验性地应用标记的TCR分子，包括(i)用于通过标准技术(如亲和层析或免疫沉淀)分离预定抗原；(ii)用于检测(例如细胞裂解物或细胞上清液中的)预定抗原以评估蛋白质的表达模式和丰度；(iii)用于监测组织中蛋白水平作为临床试验的一部分来例如用于测定给定治疗方案的效力。

TCR分子可与其他分子实体偶联，所述分子实体通常为标记物或治疗剂(例如抗微生物剂(例如抗菌剂或杀菌剂)、免疫调节剂、免疫刺激剂、细胞毒剂或细胞抑制剂)或部分。可将放射性同位素用于检测或治疗应用中。可与抗体分子偶联的放射性同位素包括但不限于α-、β-或γ-放射体，或者β-和γ-放射体。此类放射性同位素包括但不限于：碘(¹³¹I或¹²⁵I)、钇(⁹⁰Y)、镥(¹⁷⁷Lu)、锕(²²⁵Ac)、镨、砹(²¹¹At)、铼(¹⁸⁶Re)、铋(²¹²Bi或²¹³Bi)、铟(¹¹¹In)、锝(⁹⁹mTc)、磷(³²P)、铑(¹⁸⁸Rh)、硫(³⁵S)、碳(¹⁴C)、氚(³H)、铬(⁵¹Cr)、氯(³⁶Cl)、钴(⁵⁷Co或⁵⁸Co)、铁(⁵⁹Fe)、硒(⁷⁵Se)或镓(⁶⁷Ga)。可用作治疗剂的放射性同位素包括：钇(⁹⁰Y)、镥(¹⁷⁷Lu)、锕(²²⁵Ac)、镨、砹(²¹¹At)、铼(¹⁸⁶Re)、铋(²¹²Bi或²¹³Bi)和铑(¹⁸⁸Rh)。可用作标记物例如用于诊断的放射性同位素包括：碘(¹³¹I或¹²⁵I)、铟(¹¹¹In)、锝(⁹⁹mTc)、磷(³²P)、碳(¹⁴C)和氚(³H)，或以上所列治疗用同位素中的一种或多种。

本公开提供了放射性标记的TCR分子及其标记方法。在一个实施方式中，公开了标记TCR分子的方法。该方法包括使TCR分子接触螯合剂从而产生偶联TCR。该偶联抗体被放射性同位素(例如¹¹¹铟、⁹⁰钇和¹⁷⁷镥)放射性标记从而产生标记的TCR分子。

在一些方面中，本公开提供了制备本文所公开TCR分子的方法。所述方法包括：提供抗原或其片段；获得特异性结合该抗原的TCR分子；评估该TCR分子在调控该抗原活性和/或生物表达该抗原中的效力。该方法还可进一步包括给予对象(例如人)该TCR分子，包括其衍生物(例如人源化TCR分子)。

本公开提供了编码上述TCR分子的分离的核酸分子、及其载体和宿主细胞。核酸分子包括但不限于RNA、基因组DNA和cDNA。

动物模型

可在体内(例如采用各种动物模型)评估本文所述的多肽(例如结合多肽，如抗体分子或TCR分子)。例如，动物模型可用于测试本文所述结合多肽(例如抗体分子或TCR分子)在调控目标分子或细胞生物功能中的效力。作为另一个实例，动物模型还可用于测试本文的结合多肽(例如抗体分子或TCR分子)在治疗、预防或诊断本文所述病症中的效力。动物模型还可用于，例如研究副作用、原位测定结合多肽(例如抗体分子或TCR分子)浓度、证明目标分子或细胞与本文所述病症间的相关性。

用于本文所述其他病症的示例性动物模型在本领域中也是已知的。可用于评估本文所述结合多肽(例如抗体分子或TCR分子)的示例性动物类型包括但不限于：小鼠、大鼠、兔、豚鼠以及猴。

药物组合物和试剂盒

在一些方面中，本公开提供了组合物，例如药学上可接受的组合物，其包含本文所述的多肽(例如结合多肽，如抗体分子或TCR分子)，所述多肽与药学上可接受的运载剂配制在一起。

如本文所用，“药学上可接受的运载剂”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等等。优选地，运载体可适于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮给予(例如，通过注射或输注)。在某些实施方式中，药物组合物中少于约5％(例如少于约4％、3％、2％或1％)的结合多肽以聚集物形式存在。在另一些实施方式中，药物组合物中至少约95％(例如至少约96％、97％、98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％或更多)的结合多肽以单体形式存在。在一些实施方式中，聚集物或单体水平通过色谱法(例如高效尺寸排阻色谱(HP-SEC))测定。

本文所述组合物可为各种形式。这些包括例如，液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮体、脂质体以及栓剂。合适的形式取决于目标给药模式以及治疗应用。通常合适的组合物为可注射或可输注溶液形式。合适的给药模式之一是胃肠道外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)。在一个实施方式中，结合多肽通过静脉内灌注或注射施用。在另一个实施方式中，结合多肽通过肌肉内或皮下注射施用。

本文所用术语“胃肠道外给药”和“经胃肠道外给予”表示除肠道和局部给药外的给药形式，通常通过注射，例如但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下(subcapsular)、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注给药。

在制备和储存条件下，治疗性组合物通常应无菌和稳定。可将组合物配制成溶液、微乳剂、分散体、脂质体或适合高抗体结合多肽(例如抗体分子或TCR分子)的其他有序结构。可将所需量的活性化合物(例如结合多肽)和一种上述组分或其组合根据需要掺入合适溶剂后过滤灭菌，从而制备无菌注射液。通常，将活性活化物掺入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中制备分散剂。在制备无菌注射液的无菌粉剂时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。可维持溶液的合适流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂层、在分散剂情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶可延长可注射组合物的吸收。

本文所述结合多肽(例如抗体分子或TCR受体)可通过各种方法给药。本领域中已知数种，并且对于许多治疗性、预防性或诊断性应用，适当的给药途径/模式是静脉内注射或输注。例如，结合多肽通过静脉内输注给药的速度可小于10毫克/分钟；优选小于或等于5毫克/分钟来达到约1～100毫克/平方米的剂量，优选约5～50毫克/平方米，约7～25毫克/平方米，更优选约10毫克/平方米。本领域熟练技术人员应当理解，给药的途径和/或方式根据所需结果而有所不同。在某些实施方式中，活性化合物可与运载体一起制备，该运载体将保护该化合物不被迅速释放，如控释制剂，包括植入体、透皮贴片和微包封递送系统。可利用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的许多方法已获得专利或为本领域技术人员熟知。参见例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(《缓控释药物递送系统》)，J.R.Robinson编,Marcel Dekker公司，纽约，1978。

在某些实施方式中，可口服给予(例如与惰性稀释剂或可吸收食用运载体一起)结合多肽(例如抗体分子或TCR分子)。结合多肽(以及按需的其他组分)也可容纳在硬或软壳明胶胶囊里、压缩成片剂、或直接掺混入对象的膳食中。对于口服治疗性给药，可将结合多肽与赋形剂混合，并以可摄取的片剂、口颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、薄片等形式使用。为了通过非胃肠道外给药途径的其他形式来给予结合多肽(例如抗体分子)，可能需要用材料包覆化合物或将某种材料与该化合物共同给药，以防止该化合物失活。还可采用医疗装置来给予治疗性、预防性或诊断性组合物，本领域中已知数种此类装置。

给药方案经调整能提供所需反应(例如治疗、预防或诊断反应)。例如，可以是一次推注，按时间分次给药或根据治疗情况的紧急性成比例地降低或增加剂量。尤其有利的是配制成单位剂型的胃肠道外组合物以便于给药和剂量均一性。本文中单位剂型指作为单个剂量用于待治疗对象的物理上离散的单位，每个单位包含预定量的活性化合物与所需药物运载体，该预定量经测算能够产生所需治疗效果。本发明中剂量单位形式的规格取决于或直接依赖于(a)抗体的独特特性和待实现的具体治疗、预防或诊断效果，以及(b)此结合多肽配制相关领域关于应对个体敏感性的固有限制。

结合多肽(例如抗体分子或TCR分子)的治疗、预防或诊断有效量的示例性非限制性范围为约0.1～50mg/kg，例如，约0.1～30mg/kg，例如，约1～30、1～15、1～10、1～5、5～10或1～3mg/kg，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50mg/kg。例如，结合多肽通过静脉内输注给药，速度可小于10毫克/分钟，例如小于或等于5毫克/分钟来达到约1～100毫克/平方米的剂量，例如约5～50毫克/平方米，约7～25毫克/平方米，约10毫克/平方米。需要注意的是，剂量值可能会根据待缓解病症的种类和严重程度而不同。需要理解，对于每个具体对象，应当随着时间根据个体需求以及给予组合物或监管组合物给予的人的专业判断来调节具体剂量方案，本文所列的剂量范围仅仅是示例性的，并不意在对所要求权利的组合物的范围或实施方式构成限制。

本文的药物组合物可包含“治疗有效量”、“预防有效量”或“诊断有效量”的本文所述结合多肽(例如抗体分子或TCR分子)。

“治疗有效量”指按照一定剂量和必要时程能够实现所需治疗效果的量。多肽(例如抗体分子或TCR分子)的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重等因素以及抗体或抗体部分在个体中引起所需反应的能力而不同。治疗有效量，抗体分子的治疗有益效果胜过任何毒性或有害效果。

相对于未治疗对象，“治疗有效剂量”通常使可测参数被抑制至少约20％，例如至少约40％，至少约60％或至少约80％。可测参数可为例如：血尿、有色尿、起泡尿、疼痛、手部和脚部肿胀(水肿)或高血压。可在能够预测治疗或预防本文所述病症效力的动物模型系统中评估结合多肽(例如抗体分子)抑制可测参数的能力。或者，可通过检测结合多肽(例如抗体分子或TCR分子)调控目标分子或细胞生物功能的能力(例如通过体外测试)来评估组合物的该性能。

“预防有效量”是指按照一定剂量和必要时程能够有效实现所需预防效果的量。一般而言，由于预防剂量在疾病的早期或患病之前用于对象，预防有效量将小于治疗有效量。

“诊断有效量”指按照一定剂量和必要时程能够实现所需诊断效果的量。通常，诊断有效量是可体外、离体或体内诊断病症(例如本文所述的病症)的量。

本公开中还包括试剂盒/药盒，其包含本文所述的结合多肽(例如抗体分子或TCR分子)。试剂盒可包括一种或多种其他元件，包括：使用说明；其他试剂，例如标记物、治疗剂、可用于将抗体分子螯合或偶联于标记物或治疗剂的试剂、辐射防护组合物/组分；用于制备用于给药的结合多肽(例如抗体分子或TCR分子)的装置或其他材料；药学上可接受的运载体；以及用于向对象给药的装置或其他材料。

核酸

本公开还描述了包含核苷酸序列的核酸，所述序列编码多肽(例如结合多肽，例如抗体分子或T细胞受体分子)，如本文所述。

在一个实施方式中，核酸可进一步包含编码本文所述多肽(例如抗体分子或TCR分子)的重链可变区的核苷酸序列，或者与其基本同源的核苷酸序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更同源的序列，和/或能够在本文所述的严谨条件下杂交的序列)。在另一个实施方式中，核酸可进一步包含编码本文所述多肽(例如抗体分子或TCR分子)的轻链可变区的核苷酸序列，或者与其基本同源的核苷酸序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更同源的序列，和/或能够在本文所述的严谨条件下杂交的序列)。在另一个实施方式中，核酸可进一步包含编码本文所述多肽(例如抗体分子或TCR分子)的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列，或者与其基本同源的核苷酸序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更同源的序列，和/或能够在本文所述的严谨条件下杂交的序列)。

在一个实施方式中，核酸可进一步包含编码来自本文所述多肽(例如抗体分子或TCR分子)重链可变区的至少一个、两个或三个CDR的核苷酸序列，或者与其基本同源的核苷酸序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更相同的序列，和/或能够在本文所述的严谨条件下杂交的序列)。在另一个实施方式中，核酸可进一步包含编码来自本文所述多肽(例如抗体分子或TCR分子)轻链可变区的至少一个、两个或三个CDR的核苷酸序列，或者与其基本同源的核苷酸序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更相同的序列，和/或能够在本文所述的严谨条件下杂交的序列)。在另一个实施方式中，核酸可进一步包含编码来自本文所述多肽(例如抗体分子或TCR分子)重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个CDR的核苷酸序列，或者与其基本同源的核苷酸序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更相同的序列，和/或能够在本文所述的严谨条件下杂交的序列)。

在一个实施方式中，核酸包含本文所述的核苷酸序列的一部分。该部分可编码例如可变区(例如VH或VL)；一个、两个或三个或更多个(例如四个、五个或六个)CDR；或一个、两个、三个、四个或更多个框架区，任选地，恒定区或Fc区。

本文所述的核酸包括脱氧核糖核酸或核糖核酸或其类似物。多核苷酸可以是单链或双链，并且如果是单链，可以是编码链或非编码(反义)链。多核苷酸可包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸聚合后可以被进一步修饰，如通过与标记组分偶联。核酸可为重组多核苷酸、或基因组多核苷酸、cDNA、半合成或合成来源，即非天然存在或以非天然排列方式与另一多核苷酸相联。

在某些方面中，本申请的特征包括包含本文所述核酸的宿主细胞和载体。核酸可存在于同一宿主细胞或非同一宿主细胞中的单个载体中或独立的多个载体中，详见下文。

载体

本公开提供了包含编码多肽(例如结合多肽，如抗体分子或TCR分子)的核苷酸序列的载体。

载体包括但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。

可采用许多种载体系统。例如，一类载体利用DNA元件，这些元件衍生自动物病毒例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(劳斯氏肉瘤病毒、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。另一类载体利用衍生自RNA病毒的RNA元件，所述RNA病毒为例如塞姆利基森林病毒、东部马脑炎病毒和黄病毒。

此外，通过引入能够选择已转染宿主细胞的一种或多种标记物，可选择已将DNA稳定整合入其染色体中的细胞。该标记物可向营养缺陷型宿主提供例如原养型、杀生物剂(如抗生素)抗性或对重金属如铜等的抗性。选择性标记基因可直接联接于待表达的DNA序列，或者通过共同转化引入同一细胞内。mRNA的优化合成也可能需要其它元件。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。

一旦制得用于表达的含构建体表达载体或DNA序列，可将表达载体转染或导入合适的宿主细胞。可用各种技术实现之，例如原生质体融合、磷酸钙沉淀、电致孔、逆转录病毒转导、病毒转染、基因枪、脂质转染或其他常规技术。在原生质体融合的情形下，可在培养基中使细胞生长，并筛选适当的活性。

培养所得转染细胞以及回收所产生多肽(例如抗体分子)的方法和条件是本领域技术人员已知的，且可基于本文的描述，根据所用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞进行改变或优化。

细胞

本公开还提供了包含本文所述多肽(例如抗体分子或TCR分子)编码核酸的宿主细胞。可根据本文所述的方法工程化改造多肽(例如抗体分子或TCR分子)。例如，宿主细胞可包含编码本文所述多肽(例如本文所述的抗体分子或TCR分子)的核苷酸序列的核酸，或者与其基本同源的核苷酸序列(例如与其至少约85％、90％、95％、99％或更相同的序列，和/或能够在本文所述的严谨条件下杂交的序列)，或所述核酸之一的一部分。

在一些实施方式中，宿主细胞经遗传工程化改造而包含本文所述多肽(例如抗体分子或TCR分子)的编码核酸。

在某些实施方式中，采用表达盒对宿主细胞进行遗传工程化改造。术语“表达盒”是指能够影响与此类序列相容的宿主中基因表达的核苷酸序列。此类表达盒可包括启动子、含或不含内含子的开放阅读框、以及终止信号。还可以采用实现表达所必需或有帮助的其他因子，例如诱导型启动子。

本公开还提供了包含本文所述载体的宿主细胞。

细胞可为但不限于：真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人细胞。合适的真核细胞包括但不限于：Vero细胞、HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞和MDCKII细胞。合适的昆虫细胞包括但不限于：Sf9细胞。

多肽的应用

本文所述的多肽(例如抗体分子或TCR分子)以及本文所述的药物组合物具有体外、离体和体内治疗、预防和/或诊断用途。

在一个实施方式中，本文所述的多肽(例如抗体分子或TCR分子)调控(例如降低(例如抑制、阻断或中和)或提高(例如活化、引发或增强))目标分子(例如蛋白质)或细胞的一种或多种生物活性。例如，可将这些多肽(例如抗体分子或TCR分子)给予培养中的体外或离体细胞、或给予对象，例如人对象(例如体内)，从而调控目标分子或细胞的一种或多种生物活性。因此，在一方面中，本公开提供了治疗、预防或诊断对象中病症(例如本文所述病症)的方法，所述方法包括给予该对象本文所述的多肽(例如抗体分子或TCR分子)，所述病症由此得以治疗、预防或诊断。例如，本公开提供了一种方法，其包括：使本文所述的多肽(例如抗体分子或TCR分子)接触培养中的细胞(例如体外或离体)，或将本文所述的多肽(例如抗体分子或TCR分子)给予对象(例如体内)，以治疗、预防或诊断病症，例如与目标分子或细胞相关的病症(例如本文所述的病症)。

本文所用术语“对象”旨在包括人和非人动物。在一些实施方式中，对象是人对象，例如患有本文所述病症或有罹患本文所述病症风险的人类患者。术语“非人动物”包括哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物。在一个实施方式中，对象是人。本文所述方法和组合物适于治疗人类患者的本文所述病症。患有本文所述病症的患者包括：已发生本文所述病症但(至少暂时)无症状，表现出本文所述病症症状的患者，或患有涉及本文所述病症或与之相关的病症的患者。

治疗或预防病症的方法

本文所述的多肽(例如抗体分子或TCR分子)可用于治疗或预防病症或状况。在一个实施方式中，多肽具有优化或改善的半衰期，这对于治疗或预防病症或状况来说是有利的。虽然不希望囿于理论，但据信在一个实施方式中，本文所述的多肽(例如具有优化或改善半衰期的多肽)可提供优于具有相同或相似结合亲和力和/或特异性的其他多肽(例如未经工程化改造以具有优化或改善半衰期的多肽)的一种或多种益处。这些益处可包括但不限于：提高的治疗或预防效力、降低或减少的剂量方案、或改善的药代动力学特性。在一个实施方式中，多肽包括如本文所述的突变Fc区。

可用本文所述多肽治疗或预防的示例性病症或状况包括但不限于：癌症(例如实体肿瘤或血液癌症)、感染性疾病(例如细菌感染或病毒感染)、免疫病症(例如自身免疫性病症)、炎性病症、代谢病症(例如糖尿病)、心血管病症、器官移植排异。

可用本文所述多肽治疗或预防的示例性癌症包括但不限于：极性成淋巴细胞性白血病(ALL)、极性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、卡波西肉瘤、AIDS相关淋巴瘤、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌(如尤文肉瘤或骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑肿瘤(如星形细胞瘤、脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤或室管膜瘤)、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌(例如、胃肠道类癌、心脏(心脏)肿瘤、胚胎肿瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤、宫颈癌、胆管癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、原位导管癌(DCIS)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、嗅神经母细胞瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、眼癌(如眼内黑色素瘤或视网膜母细胞瘤)、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、骨肉瘤、胆囊癌、胃癌(胃部癌)、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(如中枢神经系统肿瘤、颅外肿瘤、性腺外肿瘤、卵巢癌或睾丸癌)、妊娠滋养细胞疾病、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈部癌症、肝细胞癌(肝癌)、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、卡波西肉瘤、肾癌(如肾细胞癌或肾母细胞瘤)、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(LCH)、喉癌、白血病(如急性淋巴细胞白血病(ALL))、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性粒细胞白血病(CML)或毛细胞白血病)、唇癌和口腔癌、肝癌、肺癌(如非小细胞肺癌(NSCLC)或小细胞肺癌)、淋巴瘤(如艾滋病相关、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、或原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤)、巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、黑色素瘤(如眼内(眼)黑色素瘤)、Merkel细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状细胞颈癌、中线癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、唇癌和口腔癌、口咽癌、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌(如上皮性卵巢癌或生殖细胞卵巢肿瘤)、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞瘤)、乳头瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺母细胞瘤、腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(如尤文肉瘤、卡波西肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、软组织肉瘤或子宫肉瘤)、塞沙瑞综合征、皮肤癌(例如、黑色素瘤、默克尔(Merkel)细胞癌或非黑色素瘤皮肤癌)、小肠癌、鳞状细胞癌、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌或其转移性病变。

可用本文所述多肽治疗或预防的示例性感染性疾病包括但不限于：不动杆菌感染(Acinetobacter infections)、放线菌病(actinomycosis)、非洲昏睡病(非洲锥虫病)(African sleeping sickness(African trypanosomiasis))、艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)(AIDS(acquired immunodeficiency syndrome))、阿米巴病(amebiasis)、无形体病(anaplasmosis)、血管神经病(angiostrongyliasis)、绿僵菌病(anisakiasis)、炭疽病(anthrax)、溶血性杆菌感染(arcanobacterium haemolyticum infection)、阿根廷出血热(argentine hemorrhagic fever)、蛔虫病(ascariasis)、曲霉菌病(aspergillosis)、星状病毒感染(astrovirus infection)、巴贝虫病(babesiosis)、蜡状芽孢杆菌感染(bacilluscereus infection)、细菌性肺炎(bacterial pneumonia)、细菌性阴道病(bacterialvaginosis)、拟杆菌感染(bacteroides infection)、小袋虫病(balantidiasis)、巴尔通体病(bartonellosis)、蛔虫感染(baylisascaris infection)、bk病毒感染(bk virusinfection)、黑色毛孢子菌病(black piedra)、囊胚菌病(blastocystosis)、芽生菌病(blastomycosis)、玻利维亚出血热(bolivian hemorrhagic fever)、肉毒杆菌中毒(和婴儿肉毒杆菌中毒)(botulism(and infant botulism))、巴西出血热(brazilianhemorrhagic fever)、布鲁氏菌病(brucellosis)、腺鼠疫(bubonic plague)、伯克霍尔德氏菌感染(burkholderia infection)、布鲁里溃疡(buruli ulcer)、杯状病毒感染(诺如病毒和沙波病毒)(calicivirus infection(norovirus and sapovirus))、弯曲杆菌病(campylobacteriosis)、念珠菌病(念珠菌；鹅口疮)(candidiasis(moniliasis；thrush))、毛细血管炎(capillariasis)、腐肉病(carrion′s disease)、猫抓病(cat-scratchdisease)、蜂窝织炎(cellulitis)、南美锥虫病(美洲锥虫病)(chagas disease(americantrypanosomiasis))、软性下疳(chancroid)、水痘(chickenpox)、基孔肯雅病(chikungunya)、衣原体感染(chlamydia)、肺炎衣原体感染(台湾急性呼吸道疾病或twar)(chlamydophila pneumoniae infection(taiwan acute respiratory agent or twar))、霍乱(cholera)、色真菌病(chromoblastomycosis)、壶菌病(chytridiomycosis)、支睾吸虫病(clonorchiasis)、艰难梭菌结肠炎(clostridium difficile colitis)、球孢子菌病(coccidioidomycosis)、科罗拉多蜱热(colorado tick fever(CTF))、普通感冒(急性病毒性鼻咽炎；急性鼻炎)(common cold(Acute viral rhinopharyngitis；Acute coryza))、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease(CJD))、克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congohemorrhagic fever(CCHF))、隐球菌病(cryptococcosis)、隐孢子虫病(cryptosporidiosis)、皮肤幼虫迁移(cutaneous larva migrans(CLM))、环孢子虫病(cyclosporiasis)、囊尾蚴病(cysticercosis)、巨细胞病毒感染(cytomegalovirusinfection)、登革热(dengue fever)、链带藻感染(desmodesmus infection)、脆弱双核阿米巴病(dientamoebiasis)、白喉(diphtheria)、裂头绦虫病(diphyllobothriasis)、麦地那龙线虫病(dracunculiasis)、埃博拉出血热(ebola hemorrhagic fever)、棘球蚴病(echinococcosis)、埃立克体病(ehrlichiosis)、肠虫病(挠虫感染)(enterobiasis(pinworm infection))、肠球菌感染(enterococcus infection)、肠道病毒感染(enterovirus infection)、流行性斑疹伤寒(epidemic typhus)、感染性红斑(第五疾病)(erythema infectiosum(fifth disease))、幼儿急疹(第六疾病)(exanthem subitum(sixth disease))、片吸虫病(fasciolasis)、姜片虫病(fasciolopsiasis)、致命性家族性失眠症(fatal familial insomnia(FFI))、丝虫病(filariasis)、产气荚膜梭菌引起的食物中毒(food poisoning by clostridium perfringens)、自由生活的阿米巴感染(free-living amebic infection)、梭杆菌感染(fusobacterium infection)、气性坏疽(梭菌性肌坏死)(gas gangrene(clostridial myonecrosis))、地缘病(geotrichosis)、综合征(syndrome(GSS))、贾第虫病(giardiasis)、鼻疽(glanders)、颚口线虫病(gnathostomiasis)、淋病(gonorrhea)、腹股沟肉芽肿(第五性病)(granuloma inguinale(donovanosis))、A组链球菌感染(Group A streptococcal infection)、B组链球菌感染(Group B streptococcalinfection)、流感嗜血杆菌感染(haemophilus influenzae infection)、手足口病(HFMD)(Hand,foot and mouth disease(HFMD))、汉坦病毒肺综合征(Hantavirus PulmonarySyndrome(HPS))、心脏病毒病(heartland virus disease)、幽门螺杆菌感染(helicobacter pylori infection)、溶血性尿毒症综合征(hemolytic-uremic syndrome(HUS))、肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS))、甲型肝炎(hepatitis A)、乙型肝炎(hepatitis B)、丙型肝炎(hepatitis C)、丁型肝炎(hepatitisD)、戊型肝炎(hepatitis E)、单纯疱疹(herpes simplex)、组织胞浆菌病(histoplasmosis)、钩虫感染(hookworm infection)、人类博卡病毒感染(humanbocavirus infection)、人类伊氏埃立克体病(human ewingii ehrlichiosis)、人粒细胞无形体病(human granulocytic anaplasmosis(HGA))、人间质肺病毒感染(humanmetapneumovirus infection)、人单核细胞埃里希体病(Human monocyticehrlichiosis)、人乳头瘤病毒(HPV))感染(human papillomavirus(HPV)infection)、人副流感病毒感染(Human parainfluenza virus infection)、膜壳绦虫病(Hymenolepiasis)、Epstein-Barr病毒传染性单核细胞增多症(Epstein-Barr Virus InfectiousMononucleosis(Mono))、流感(influenza(flu))、等孢子球虫病(isosporiasis)、川崎病(kawasaki disease)、角膜炎(keratitis)、金氏杆菌感染(kingella kingae infection)、库鲁病(kuru)、拉沙热(lassa fever)、军团病(legionellosis(legionnaires'disease))、军团病(庞蒂亚克热)(legionellosis(pontiac fever))、利什曼病(leishmaniasis)、麻风病(leprosy)、钩端螺旋体病(leptospirosis)、李斯特菌病(listeriosis)、莱姆病(螺旋体病)(lyme disease(lyme borreliosis))、淋巴丝虫病(象皮病)(lymphatic filariasis(Elephantiasis))、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(Lymphocytic choriomeningitis)、疟疾(Malaria)、马尔堡出血热(Marburg hemorrhagic fever(MHF))、麻疹(Measles)、中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome(MERS))、类鼻疽病(惠特摩尔病)(melioidosis(Whitmore's disease))、脑膜炎(meningitis)、脑膜炎球菌病(meningococcal disease)、后殖吸虫病(metagonimiasis)、微孢子虫病(microsporidiosis)、传染性软疣(MC)(molluscum contagiosum(MC))、猴痘(Monkeypox)、腮腺炎(Mumps)、鼠伤寒(地方性斑疹伤寒)(Murine typhus(Endemic typhus))、支原体肺炎(Mycoplasma pneumonia)(Mycoplasma pneumonia)、分枝菌病(消歧disambiguation)(Mycetoma(disambiguation))、蝇蛆病(Myiasis)、新生儿结膜炎(新生儿眼炎)(Neonatalconjunctivitis(Ophthalmia neonatorum))、(新)变异克雅氏病(vCJD((New)VariantCreutzfeldt-Jakob disease(vCJD)、nvCJD)(nvCJD))、诺卡氏菌病(nocardiosis)、盘尾丝虫病(河盲症)(onchocerciasis(River blindness))、肝吸虫症(opisthorchiasis)、副球菌病(南美芽生菌病)(paracoccidioidomycosis(South American blastomycosis))、肺吸虫病(paragonimiasis)、巴斯德氏菌病(pasteurellosis)、头虱(头虱)(pediculosiscapitis(head lice))、虱病(体虱)(pediculosis corporis(body lice))、耻骨病(阴虱(pediculosis pubis(pubic lice)、蟹虱)(crab lice))、盆腔炎(pelvic inflammatorydisease(PID))、百日咳(百日咳)(pertussis(Whooping cough))、鼠疫(plague)、肺炎球菌感染(pneumococcal infection)、肺孢子虫肺炎(pneumocystis pneumonia(PCP))、肺炎(pneumonia)、脊髓灰质炎(poliomyelitis)、普氏菌感染(prevotella infection)、原发性阿米巴脑膜脑炎(primary amoebic meningoencephalitis(PAM))、进行性多灶性白质脑病(progressive multifocal leukoencephalopathy)、鹦鹉热(psittacosis)、Q热(Qfever)、狂犬病(rabies)、复发性疾病(relapsing fever)、呼吸道合胞病毒感染(respiratory syncytial virus infection)、鼻孢子虫病(rhinosporidiosis)、鼻病毒感染(rhinovirus infection)、立克次体感染(rickettsial infection)、立克次体痘(rickettsialpox)、裂谷热(Rift Valley fever(RVF))、落基山斑疹热(Rocky Mountainspotted fever(RMSF))、轮状病毒感染(rotavirus infection)、风疹(rubella)、沙门氏菌病(salmonellosis)、SARS(严重急性呼吸系统综合症)(Severe Acute RespiratorySyndrome)、疥疮(scabies)、血吸虫病(schistosomiasis)、败血症(sepsis)、志贺菌病(细菌性痢疾)(shigellosis(Bacillary dysentery))、带状疱疹(带状疱疹)(shingles(Herpes zoster))、天花(天花)(smallpox(Variola))、孢子菌病(sporotrichosis)、葡萄球菌食物中毒(staphylococcal food poisoning)、葡萄球菌感染(staphylococcalinfection)、类圆线虫病(strongyloidiasis)、亚急性硬化性全脑炎(subacutesclerosing panencephalitis)、梅毒(syphilis)、绦虫病(Taeniasis)、破伤风(牙关紧闭症)(Tetanus(Lockjaw))、癣(理发痒)(Tinea barbae(Barber's itch))、头癣(头皮癣)(Tinea capitis(Ringworm of the Scalp))、体癣(体癣)(Tinea corporis(Ringworm ofthe Body))、股癣(股癣)(Tinea cruris(Jock itch))、手足癣(手癣)(Tinea manum(Ringworm of the Hand))、黑癣(Tinea nigra)、脚癣(运动员足)(Tinea pedis(Athlete’s foot))、甲癣(甲癣)(Tinea unguium(Onychomycosis))、花斑癣(花斑糠疹)(Tineaversicolor(Pityriasis versicolor))、弓蛔虫病(眼部幼虫偏头痛)(Toxocariasis(Ocular Larva Migrans(OLM)))、弓蛔虫病(内脏幼虫偏头痛)(Toxocariasis(VisceralLarva Migrans(VLM)))、沙眼(Trachoma)、弓形虫病(Toxoplasmosis)、旋毛虫病(Trichinosis)、毛滴虫病(Trichomoniasis)、鞭虫病(鞭虫感染)(Trichuriasis(Whipworminfection))、肺结核(Tuberculosis)、兔热病(Tularemia)、伤寒(Typhoid fever)、斑疹伤寒(Typhus fever)、解脲支原体感染(Ureaplasma urealyticum infection)、谷热(Valleyfever)、委内瑞拉马脑炎(Venezuelan equine encephalitis)、委内瑞拉出血热(Venezuelan hemorrhagic fever)、创伤弧菌感染(Vibrio vulnificus infection)、副溶血性弧菌性肠炎(Vibrio parahaemolyticus enteritis)、病毒性肺炎(viralpneumonia)、西尼罗热(West Nile Fever)、白色脓疱(白秃疮)(white piedra(Tineablanca))、耶尔森氏假结核感染(Yersinia pseudotuberculosis infection)、耶尔森氏菌病(yersiniosis)、黄热病(yellow fever)、寨卡热病(Zika fever)或接合菌病(zygomycosis)。

可用本文所述多肽治疗或预防的示例性免疫病症或状况包括但不限于：爱迪生氏病(Addison's disease)、血丙种球蛋白缺乏症(agammaglobulinemia)、脱发(alopeciaareata)、淀粉样变性(amyloidosis)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、抗GBM/抗TBM肾炎(anti-GBM/anti-TBM nephritis)、抗磷脂综合症(antiphospholipid syndrome(APS))、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、自身免疫性内耳病(autoimmune innerear disease(AIED))、轴突&神经元神经病变(axonal&neuronal neuropathy(AMAN))、白赛氏病(Behcet’s disease)、大疱性类天疱疮(Bullous pemphigoid)、卡斯尔曼病(Castleman disease(CD))、腹腔病(Celiac disease)、锥虫病(Chagas disease)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy(CIDP))、慢性复发性多病灶骨髓炎(chronic recurrent multifocal osteomyelitis(CRMO))、血管炎(Churg-Strauss)、疤痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮(Cicatricialpemphigoid/benign mucosal pemphigoid)、科干综合症(Cogan’s syndrome)、冷凝集素病(Cold agglutinin disease)、先天性心脏传导阻滞(Congenital heart block)、柯萨奇病毒性心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST综合症(CREST syndrome)、克罗恩病(Crohn’s disease)、疱疹性皮炎(dermatitis herpetiformis)、皮肌炎(dermatomyositis)、德维客病(Devic’s disease(疱疹样皮炎(neuromyelitis optica))、盘状红斑狼疮(Discoidlupus)、德雷斯勒综合症(Dressler’s syndrome)、子宫内膜异位(endometriosis)、嗜酸性食管炎(eosinophilic esophagitis(EoE))、嗜酸性筋膜炎(eosinophilic fasciitis)、结节性红斑(erythema nodosum)、基础混合型球蛋白血症(essential mixedcryoglobulinemia)、伊娃氏综合症(Evans syndrome)、纤维肌瘤(fibromyalgia)、纤维化牙槽炎(fibrosing alveolitis)、巨细胞动脉炎(giant cell arteritis(暂时性动脉炎(temporal arteritis)))、巨细胞心肌炎(giant cell myocarditis)、肾小球肾炎(Glomerulonephritis)、古德帕斯彻综合症(Goodpasture’s syndrome)、伴多血管炎的肉芽肿病(Granulomatosis with Polyangiitis)、甲亢(Graves’disease)、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、溶血性贫血(hemolytic anemia)、过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura(HSP))、孕期疱疹(herpesgestationis)或孕期类天疱疮(pemphigoid gestationis(PG))、低γ球蛋白血症(hypogammalglobulinemia)、IgA肾炎(IgA nephropathy)、IgG4相关硬化病(IgG4-relatedsclerosing disease)、内涵体肌炎(inclusion body myositis(IBM))、间质性膀胱炎(interstitial cystitis(IC))、青少年关节炎(juvenile arthritis)、青少年糖尿病(juvenile diabetes(1型糖尿病))、青少年肌炎(juvenile myositis(JM))、川崎病(Kawasaki disease)、兰伯特-伊顿综合症(Lambert-Eaton syndrome)、白细胞破裂性血管炎(leukocytoclastic vasculitis)、扁平苔藓(Lichen planus)、硬化性苔藓(Lichensclerosus)、木样结膜炎(Ligneous conjunctivitis)、线性IgA病(linear IgA disease(LAD))、狼疮(lupus)、慢性莱姆病(Lyme disease chronic)、梅尼埃病(Meniere’sdisease)、显微性多血管病(microscopic polyangiitis(MPA))、混合性结缔组织病(mixedconnective tissue disease(MCTD))、蚕蚀性角膜溃疡(Mooren’s ulcer)、Mucha-Habermann二氏病(Mucha-Habermann disease)、多发性硬化(multiple sclerosis(MS))、重症肌无力(Myasthenia gravis)、肌肉发炎(Myositis)、嗜睡症(Narcolepsy)、视神经脊髓炎(Neuromyelitis optica)、中性粒细胞减少症(neutropenia)、眼瘢痕性类天疱疮(ocular cicatricial pemphigoid)、视神经炎(optic neuritis)、回文风湿病(palindromic rheumatism(PR))、PANDAS(链球菌相关性儿童自身免疫性神经精神病(Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated withStreptococcus))、副肿瘤性小脑变性(paraneoplastic cerebellar degeneration(PCD))、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(PNH))、帕里博格综合症(Parry Romberg syndrome)、睫状体平坦部炎(Pars planitis(葡萄膜炎(peripheral uveitis)))、Parsonnage-Turner二氏综合症(Parsonnage-Turnersyndrome)、天疱疮(Pemphigus)、外周神经病(peripheral neuropathy)、静脉周脑脊髓炎(Perivenous encephalomyelitis)、恶性贫血(pernicious anemia(PA))、POEMS综合症(多神经病，(polyneuropathy)、器官巨大症(organomegaly)、内分泌病(endocrinopathy)、单克隆丙种球蛋白病(monoclonal gammopathy)、皮肤改变(skin changes)、结节性多动脉炎(polyarteritis nodosa)、风湿性多肌疼(polymyalgia rheumatica)、多肌炎(polymyositis)、心肌梗塞后综合症(postmyocardial infarction syndrome)、心包切开术后综合症(postpericardiotomy syndrome)、原发胆汁性硬化(primary biliarycirrhosis)、原发硬化性胆管炎(primary sclerosing cholangitis)、黄体酮皮炎(progesterone dermatitis)、牛皮癣(psoriasis)、牛皮癣性关节炎(psoriaticarthritis)、纯红细胞发育不全(pure red cell aplasia(PRCA))、坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)、雷诺氏现象(Raynaud’s phenomenon)、反应性关节炎(ReactiveArthritis)、反射交感性营养不良(Reflex sympathetic dystrophy)、赖特综合症(Reiter’s syndrome)、复发性软骨炎(relapsing polychondritis)、多动腿综合症(restless legs syndrome(RLS))、腹膜后纤维变性(retroperitoneal fibrosis)、风湿热(rheumatic fever)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis(RA))、结节病(sarcoidosis)、施密特综合症(Schmidt syndrome)、巩膜炎(scleritis)、硬皮病(scleroderma)、舒格伦综合症(Sjogren’s syndrome)、精子&睾丸自身免疫病(sperm&testicular autoimmunity)、僵人综合症(Stiff person syndrome(SPS))、亚急性细菌性心内膜炎(subacute bacterial endocarditis(SBE))、苏萨克综合症(Susac’ssyndrome)、交感性眼炎(sympathetic ophthalmia(SO))、高安氏动脉炎(Takayasu’sarteritis)、颞动脉炎/巨细胞动脉炎(temporal arteritis/Giant cell arteritis)、血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura(TTP))、Tolosa-Hunt二氏综合症(Tolosa-Hunt syndrome(THS))、横贯性脊髓炎(transverse myelitis)、I型糖尿病(type1diabetes)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis(UC))、未分化结缔组织病(undifferentiated connective tissue disease(UCTD))、葡萄膜炎(uveitis)、血管炎(vasculitis)、白癜风(vitiligo)、或魏格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis(伴多血管炎的肉芽肿病(Granulomatosis with Polyangiitis，GPA)))。

本文所述多肽(例如抗体分子或TCR分子)通常以在患者系统中保持治疗有效水平的频度给药直至患者康复。例如，多肽的给药频度可实现足以使至少约1、2、5、10、20、30或40个/种多肽结合各自目标分子或细胞的血清浓度。在一个实施方式中，每1、2、3、4、5、6或7天，每1、2、3、4、5或6周，或者每1、2、3、4、5或6个月给予多肽。

给予各种多肽(例如抗体分子或TCR分子)的方法是本领域中已知的，或如下所述。所用多肽的适宜剂量将取决于对象的年龄和体重以及所用的具体药物。

可单独使用多肽或将其与第二药剂偶联，所述第二药剂为例如菌类药剂(bacterial agent)、毒素或蛋白质(例如第二多肽)。该方法包括：给予需要该治疗的对象单独的多肽或与第二试剂偶联的多肽。可用多种治疗剂(例如毒素或其混合物)递送多肽。

联合治疗

多肽(例如抗体分子或TCR分子)可与其他治疗联用。例如，联合治疗可包括将多肽与一种或多种其他治疗剂(例如一种或多种本文所述的其他治疗剂)共同配制和/或共同给药。在其他实施方式中，联合给予多肽和其他治疗性处理模式(例如本文所述的其他治疗性处理模式)。此类联合治疗可有利地利用较低剂量的所给治疗剂，由此避免了与各种单独治疗相关的可能毒性或并发症。

如本文所用，“联合”给予是指在对象罹患病症之前或期间，将两种(或更多种)不同处理/治疗递送给该对象。在一个实施方式中，两种或更多种处理是预防性递送的，例如在对象罹患病症前或被诊断患有该病症前递送。在另一个实施方式中，两种或更多种处理是在对象已患有病症或已被诊断患有该病症后递送。在一些实施方式中，在第二处理开始递送时，第一处理的递送仍在持续，由此存在重叠。有时称此为“同时”或“共同递送”。在其他实施方式中，在第一处理的递送终止后，再开始递送其他处理。在这两种情况之任一的实施方式中，处理因联合给予而更有效。例如，与若只给予第二处理而不给予第一处理所能观察到的相比，第二处理更有效(例如采用更少的第二处理观察到同样的效果，或者第二处理更大程度地减轻或减少症状)，或者第一处理亦然。在一些实施方式中，与递送一种处理而不递送另一种所能观察到的相比，递送更大程度地减轻或减少或降低症状或病症相关的其他参数。两种处理的效果可部分加合、完全加合或大于加合。递送可使递送第一处理的效果在递送第二处理时仍可被检测到。

在一个实施方式中，将多肽与第二治疗(例如其他试剂)联合给予以治疗或预防本文所述的病症。在一个实施方式中，其他试剂是第二多肽(例如抗体分子)，例如不同于第一多肽(例如抗体分子)的多肽(例如抗体分子)。可联合使用的示例性多肽(例如抗体分子)包括但不限于本文所述多肽(例如抗体分子)的任何组合。在另一个实施方式中，其他试剂不是多肽(例如抗体分子)。例如，其他试剂可为小分子或核酸分子。在另一个实施方式中，第二治疗可选自手术、放疗、细胞疗法(例如干细胞疗法)或者组织或器官移植。

例如，第二治疗包括选自以下一种或多种的治疗：雄激素替代疗法疗法、抗激素疗法、抗血清疗法、自身免疫增强性疗法、生物疗法、血液辐射疗法、多支(brachy)疗法、心脏再同步疗法、细胞疗法、细胞转移疗法、螯合疗法、化疗法、金疗法、钴疗法、冷压疗法、冷疗法、电休克疗法、电磁疗法、电子疗法、电疗法、酶替代疗法、表观遗传疗法、雌激素替代疗法、体外冲击波疗法、快中子疗法、氟化物疗法、基因疗法、热疗、驱虫治疗、激素疗法、激素替代疗法、宿主调节性疗法、高压氧疗法、过热疗法、免疫抑制疗法、免疫疗法、术中电子辐射疗法、术中辐射疗法、逆转疗法、激光疗法、光疗、锂疗、弱激光疗法、磁疗、磁共振疗法、医用气体疗法、营养医学疗法、分子伴侣疗法、分子疗法、单抗疗法、空气阴离子化疗法、中子捕获疗法、中子疗法、口服补液治疗、渗透疗法、氧疗、臭氧疗法、姑息治疗、局部疗法、阶段治疗、音位神经低铬疗法(phonemic neurological hypochromium therapy)、光动力疗法、光疗、光热疗法、物理疗法、增生疗法、蛋白质疗法、质子疗法、脉冲电磁场疗法、PUVA疗法、放疗、水化治疗、吸入疗法、挽救疗法、血清疗法、干细胞疗法、立体定向放射治疗、靶向治疗、热疗法、TK细胞疗法、耐受原疗法、经皮连续氧疗法、紫外线治疗或病毒疗法。

可与本文所述多肽或组合物联合使用以治疗或预防其他病症的示例性治疗/疗法也描述于本文“治疗或预防病症的方法”部分中。

诊断方法

在一些方面中，本公开提供了用于体外检测(例如生物样品中，如活检样品或体液(例如血液、尿液或脑脊液)样品)或体内检测(例如对象的体内成像)目标分子(例如蛋白质)或细胞存在的诊断方法。所述方法包括：(i)使样品接触本文所述的多肽(例如本文所述的抗体分子)，或将多肽(例如抗体分子)给予对象；(可任选地)(ii)使参比样品(例如对照样品(例如对照生物样品，如活检或体液(例如血液、尿液或脑脊液)样品))或对照对象接触本文所述的多肽(例如本文所述的抗体分子)；以及(iii)检测该多肽(例如抗体分子)与样品或对象中目标分子或细胞或者与对照样品或对象之间的复合物的形成，其中样品或对象中复合物的形成相对于对照样品或对象发生变化(例如统计学显著的变化)指示了样品中目标分子或细胞的存在。多肽(例如抗体分子)可直接或间接用可检测物质标记，以有助于检测结合或未结合的多肽(例如抗体分子)。合适的可检测物质包括如本文所述的各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、和放射性材料。

术语“样品”在涉及用于检测细菌的样品时包括但不限于：细胞，细胞裂解物，细胞的蛋白质或膜提取物，体液(如血液、尿液或CSF)或组织样品(如活检样品)。

可如下检测多肽(例如抗体分子)和目标分子或细胞之间复合物的形成：测定结合目标分子或细胞的多肽(例如多肽分子)或未结合的多肽(例如抗体分子)，或者使其可视化。任何合适的检测方法均可使用，常规检测方法包括酶联免疫测试(ELISA)、放射免疫测试(RIA)、FACS测试、BIACORE测试或组织免疫组化法。作为标记多肽的替代，样品中目标分子和细胞的存在还可通过采用以可检测物质标记的标准物质和无标记多肽的竞争性免疫测试法来测定。在该测试中，合并生物样品、有标记标准物质和多肽，并测定与无标记结合分子结合的有标记标准物质的量。样品中目标分子或细胞的量与结合于多肽(例如抗体分子)的有标记标准物质的量成反比。

本文所述的多肽(例如抗体分子)可用于病症的诊断，所述病症可用本文所述的多肽治疗或预防。本文所述的检测或诊断方法可与本文所述的其他方法联合以治疗或预防本文所述的病症。

其它实施方式在下面的编号段落中描述。

1.一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：

b)共价联接，例如连接HC链与LC链，

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的HCVR或LCVR的核酸；

2.如段1的方法，其中HC元件包含或由HCVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。

3.如段1或2的方法，其中LC元件包含或由LCVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。

4.如段1-3任一所述的方法，其中核酸序列配置成当表达时HCVRS和LCVRS形成功能性抗原结合分子，例如scFv。

5.如段4所述的方法，其中抗原结合分子例如scFv在体外、离体或体内是功能性的，如用本文所述的方法或实验所测定。

6.如段1-5任一所述的方法，其中获得分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：

a)获得结合至以下物质的捕获基质：

(i)第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自一种细胞的ACVR的第一mRNA互补的链；

ii)第二ds cDNA，其包含与编码来自所述细胞的LCVR的第二mRNA互补的链(cDNA负载的捕获基质)，和

b)将分离的生产反应位点(例如生产微室)维持在允许第一和第二ds cDNA扩增的条件下，以产生：

多条HC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的HCVR的HC元件(例如HCVRS)的区段；和

多条LC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的LCVR的LC元件(例如LCVRS)的区段；和

7.如段6所述的方法，其中HC ds cDNA与第一ds cDNA相同或基本相同。

8.如段6或7所述的方法，其中LC ds cDNA与第二ds cDNA相同或基本相同。

9.如段6-8任一所述的方法，其中捕获基质包含珠，如磁珠。

10.如段6-9任一所述的方法，其中捕获基质包含与cDNA结合的部分(例如寡核苷酸)，如(i)与HC链结合的部分；(ii)与LC链结合的部分；或(iii)(i)和(ii)两者。

11.如段6-10任一所述的方法，其中第一mRNA和第二mRNA置于载有mRNA的捕获基质上。

12.如段6-11任一所述的方法，其中获得分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：

适于从第一和第二mRNA产生第一ds cDNA和第二ds cDNA的试剂混合物(例如，在第一和第二mRNA从载有mRNA的捕获基质上释放入溶液后)，第一ds cDNA包含编码细胞的HCVR的HC元件(例如HCVRS)的区段，第二ds cDNA包含编码细胞的LCVR的LC元件(例如LCVRS)的区段。

13.如段6-12任一所述的方法，其中分离的生产反应位点，例如生产微室包含介导第一ds cDNA生产的引物。

14.如段6-13任一所述的方法，其中分离的生产反应位点，例如生产微室包含介导第二ds cDNA生产的引物。

15.如段6-14任一所述的方法，其中通过逆转录第一mRNA产生与编码来自细胞的HCVR的第一mRNA互补的cDNA链。

16.如段6-15任一所述的方法，其中通过逆转录第二mRNA产生与编码来自细胞的LCVR的第二mRNA互补的cDNA链。

17.如段15或16所述的方法，其中逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室中发生。

18.如段15或16所述的方法，其中逆转录在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室中发生。

19.如段15或16所述的方法，其中逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室之外发生，或在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室外发生。

20.如段15或16所述的方法，其中逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室之外发生，和在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室外发生。

21.如段15或16所述的方法，其中逆转录在分离的反应位点，例如微室外发生。

22.如段6-21任一所述的方法，其中扩增包括20或更少轮循环，例如，15或更少，14或更少，13或更少，12或更少，11或更少，10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，或5或更少轮循环。

23.如段6-22任一所述的方法，其中逆转录和/或扩增使用一个或多个引物，例如包含对HCVRS和/或LCVRS特异性的序列。

24.如段6-23任一所述的方法，其中逆转录和/或扩增包括使用介导HC ds cDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。

25.如段6-24任一所述的方法，其中逆转录和/或扩增包括使用介导LC ds cDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。

26.如段25所述的方法，其中至少一种引物包含例如减少，例如抑制DNA聚合酶的DNA合成的核苷酸修饰。

27.如段25或26所述的方法，其中至少一种引物不包含例如减少，例如抑制DNA聚合酶的DNA合成的核苷酸修饰。

28.如段26或27所述的方法，其中核苷酸修饰抑制DNA聚合酶延伸DNA。

29.如段26-28任一所述的方法，其中核苷酸修饰是在引物中插入间隔子，例如在引物内的两个相邻核苷酸之间。

30.如段29任一所述的方法，其中间隔子是柔性间隔子、碳间隔子(例如,-(CH2)n-,其中n＝3,4,5或更大),两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多)脱碱基核苷酸，或PEG间隔子。

31.如段26-28任一所述的方法，其中核苷酸修饰是例如对核糖的2’-O-甲基,2’-OH,2’-NH₂,或尿嘧啶修饰。

32.如段26-31任一所述的方法，其中核苷酸修饰位于引物内部或3’末端。

33.如段23-32任一所述的方法，其中至少一个引物包括(i)第一组成部分；(ii)第二组成部分，和可任选的(iii)本文所述的核苷酸修饰，例如位于(i)和(ii)之间。

34.如段33任一所述的方法，其中第一组成部分能够与相同引物或不同引物内的第二组成部分退火，例如(通过分子内杂交)形成发夹结构或(通过分子间杂交)形成双链结构，其包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域。

35.如段33或34的方法，其中第一组成部分包括与附连至捕获基质的寡核苷酸序列互补的序列。

36.如段33-35任一所述的方法，其中第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(例如HCVRS和/或LCVRS)互补的序列，其中第二组成部分包含同源重组的序列(例如在酵母细胞或哺乳动物细胞中)。

37.如段23-36任一的方法，其中至少一种引物包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列。

38.如段37所述的方法，其中包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列的引物被磷酸化，例如被5’磷酸化。

39.如段37或38所述的方法，其中接头序列包含或由(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n组成，其中n＝1,2,3,4,5或更大。

40.如段1-39任一所述的方法，其中HC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。

41.如段1-40任一所述的方法，其中HC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。

42.如段1-41任一所述的方法，其中LC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。

43.如段1-42任一所述的方法，其中LC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。

44.如段1-43任一所述的方法，其中HC ds cDNA和LC ds cDNA包含粘性末端，例如都具有5’突出端。

45.如段1-44任一所述的方法，其中HC链和LC链共价联接，例如连接产生单链核酸序列，其中HC和LC链都是正义链或都是反义链。

46.如段1-44任一所述的方法，其中HC ds cDNA的变性HC链与LC ds cDNA的变性LC链共价联接，例如连接，其中HC链和LC链都是正义链或都是反义链。

47.如段1-44任一所述的方法，其中HC链存在于HC ds cDNA中，LC链存在于LC dscDNA中，其中HC ds cDNA和LC ds cDNA共价联接，例如连接，以产生双链核酸序列。

48.段1-47任一所述的方法，其中共价联接，例如连接在分离的生产反应位点发生。

49.段48所述的方法，其中分离的生产反应位点例如生产微室包含能够共价联接，例如连接HC和LC链或HC和LC ds cDNA的试剂。

50.段48或49所述的方法，其中分离的生产反应位点例如生产微室包含共价偶联HC和LC链或HC和LC ds cDNA的酶。

51.段1-47任一所述的方法，其中共价联接，例如连接，在与分离的生产反应位点不同的位点发生，例如在分离的联接反应位点，例如联接微室中发生。

52.段51所述的方法，其中HC链和LC链从分离的生产位点转移到分离的联接反应位点，例如联接微室，共价连接发生在分离的联接反应位点例如联接微室。

53.段51或52所述的方法，其中分离的联接反应位点例如联接微室包含能够共价联接，例如连接HC和LC链或HC和LC ds cDNA的试剂。

54.段51-53任一所述的方法，其中分离的联接反应位点例如联接微室包含共价偶联HC和LC链或HC和LC ds cDNA的酶。

55.段50或54所述的方法，其中酶是连接酶，例如热稳定连接酶。

56.如段51-55任一所述的方法，其中共价联接，例如连接，包括：

(a)在允许HC链和LC链变性的条件下(例如在95℃)加热分离的联接反应位点，例如联接微室；

(b)在允许夹板寡核苷酸与HC链和LC链杂交的条件下(例如在50-65℃)冷却分离的联接反应位点，例如联接微室；

(c)在允许HC链和LC链连接(例如在HC链和LC链之间形成磷酸二酯键)的条件下(例如在45-65℃)维持分离的联接反应位点，例如联接微室；和

(d)依次重复步骤(a)、(b)和(c)2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或更多轮循环。

57.如段1-56任一所述的方法，其中HC链和LC链在夹板寡核苷酸的存在下共价联接，例如连接。

58.如段57所述的方法，其中夹板寡核苷酸与包含HC链和LC链接合区(junction)的序列，或其互补序列杂交，在连接位点形成双链区域。

59.如段57或58所述的方法，其中夹板寡核苷酸包含抑制例如DNA聚合酶的DNA合成的修饰(例如NH₂基团)。

60.如段59所述的方法，其中修饰在夹板寡核苷酸3’末端。

61.如段1-60任一所述的方法，其中扩增产生与共价联接，例如连接的HC和LC链互补的链。

62.如段1-61任一所述的方法，其中还包括在获得分离的生产反应位点，例如生产微室，获得载有mRNA的捕获基质。

63.如段62所述的方法，其中获得载有mRNA的捕获基质包含：

a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：

i)细胞，和

ii)捕获基质，其能结合编码来自细胞的HCVR的第一mRNA和编码来自细胞的LCVR的第二mRNA；和

其中分离的细胞反应位点(例如细胞分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的HCVR或LCVR的核酸。

64.如段63所述的方法，其中分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括裂解剂，例如去污剂。

65.如段63或64任一所述的方法，其中由热或酶裂解细胞。

66.如段63-65任一所述的方法，其中捕获基质包括结合mRNA的部分(例如寡核苷酸)，如寡(dT)。

67.如段62-66任一所述的方法，其中还包括从分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室释放载有mRNA的捕获基质。

68.如段67所述的方法，其中释放步骤在聚(dA)或聚(dT)寡核苷酸的存在下进行，例如以减少非捕获mRNA的交叉结合。

69.如段62-68任一所述的方法，其中载有mRNA的捕获基质从分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室转移到分离的生产反应位点，例如生产微室。

70.如段1-69任一所述的方法，其中还包括从生产微室释放核酸序列。

71.如段1-70任一所述的方法，其中还包括扩增核酸序列。

72.如段1-71任一所述的方法，其中还包括对全部或部分核酸序列进行测序。

73.如段1-72任一所述的方法，其中还包括将全部或部分核酸序列插入载体。

74.如段73所述的方法，其中载体提供未包括在核酸序列内的额外HC元件或LC元件。

75.如段73或74所述的方法，其中载体提供了HC CDR1、HCCDR2或两者。

76.如段73-75所述的方法，其中包括表达载体。

77.如段73-75所述的方法，其中包括表达核酸序列以产生包含编码HCVR的HC元件(例如HCVRS)的区段和编码LCVR的LC元件(例如LCVRS)的区段的多肽。

78.如段77所述的方法，其中LC元件在多肽内在HC元件的N-末端。

79.如段77所述的方法，其中HC元件在多肽内在LC元件的C-末端。

80.如段77-79任一所述的方法，其中还包括使多肽接触抗原。

81.如段77-80任一所述的方法，其中还包括确定是否多肽与抗原结合。

82.如段1-81任一所述的方法，其中细胞是免疫细胞，例如B细胞或T细胞，例如人B细胞或T细胞。

83.如段1-82任一所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞或禽类细胞。

84.一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，所述方法包括：

a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：

i)细胞，和

ii)捕获基质，其能结合编码来自细胞的HCVR的第一mRNA和编码来自细胞的LCVR的第二mRNA；

其中分离的细胞反应位点(例如细胞分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的HCVR或LCVR的核酸；

d)获得分离的生产位点，例如生产微室，包括：

i)来自步骤b)的重链(HC)链，其中HC链是重链双链cDNA(HC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的HCVR的HC元件(例如重链可变区序列(HCVRS))的区段；和

ii)来自步骤b)的轻链(LC)链，其中LC链是轻链双链cDNA(LC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的LCVR的LC元件(例如轻链可变区序列(LCVRS))的区段；和

e)共价联接，例如连接HC链与LC链，

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的HCVR或LCVR的核酸。

85.一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码抗体重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和抗体轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR相匹配，所述方法包括：

a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：

i)细胞，和

c)获得分离的生产位点，例如生产微室，包括：使载有mRNA的捕获基质与反应混合物接触，例如含有逆转录酶反应混合物，其用负载mRNA作为模板，产生：

第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自一种细胞的ACVR的第一mRNA互补的链；

第二ds cDNA，其包含与编码来自所述细胞的LCVR的第二mRNA互补的链(cDNA负载的捕获基质)；

d)将分离的生产反应位点(例如生产微室)维持在允许第一和第二ds cDNA扩增的条件下，以产生：

多条LC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的LCVR的LC元件(例如LCVRS)的区段；

e)获得分离的联接反应位点，例如联接微室，包括：共价联接(例如连接)HC dscDNA链的链(HC链)和LC ds cDNA的链(LC链)，其中HC和LC链都是正义链或都是反义链；和

f)扩增共价联接的，例如连接的HC和LC链。

86.一种产生包括多个独特组成部分的文库的方法，该方法包括：

产生多个组成部分，其中每个组成部分包含编码重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，和其中HCVR和LCVR匹配，由段1-85任一所述的方法产生，

其中所述多个中的每一个独特核酸序列包含来自不同独特细胞的HC元件和LC元件，

从而产生包含多个独特组成部分的文库。

87.如段86所述的方法，其中多个独特组成部分包括至少10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个独特组成部分。

88.如段86或87所述的方法，其中多个独特组成部分包括10⁴至10⁹、10⁴至10⁸、10⁴至10⁷、10⁴至10⁶、10⁴至10⁵、10⁸至10⁹、10⁷至10⁹、10⁶至10⁹、10⁵至10⁹、10⁵至10⁸、10⁶至10⁷、10⁴至10⁵、10⁵至10⁶、10⁶至10⁷、10⁷至10⁸、或10⁸至10⁹个独特组成部分。

89.如段86-88所述的方法，其中所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的HC元件和LC元件序列)。

90.如段86-89所述的方法，其中所述文库中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的HC元件和LC元件序列)。

91.一种文库，其包含：

多个独特组成部分，

其中，

iii)文库包括一个或多个(例如2、3、4、或全部)以下特征：

a)用段1-85任一所述的方法制备的文库；

d)所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的HC元件和LC元件序列)；或

92.如段91所述的文库，其中多个独特组成部分中的每一个配置成当表达时HC元件(例如HCVRS)和LC元件(例如LCVRS)形成功能性抗原结合分子，例如scFv。

93.如段91-92任一所述的文库，其中文库是展示文库。

94.如段91-93任一所述的文库，其中多个组成部分中的每一个还编码多肽，其导致组成部分展示在展示实体表面。

95.如段91-94任一所述的文库，其中文库是噬菌体展示文库。

96.如段91-94任一所述的文库，其中文库是酵母展示文库。

97.如段91-94任一所述的文库，其中文库是哺乳动物展示文库。

98.一种制备结合多肽的方法，该方法包括：

a)获得段91-97任一所述的文库；和

b)表达文库的独特核酸编码的多肽。

99.如段98所述的方法，其中还包括使多肽接触抗原。

100.如段98或99所述的方法，还包括回收编码结合抗原的多肽的核酸。

101.一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRα链可变区(ACVR)的α链元件(AC元件)和编码TCRβ链可变区(BCVR)的β链元件(BC元件)的序列，其中ACVR和BCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的生产位点，例如生产微室，包括：

ii)β链(BC)链，其中BC链是β链双链cDNA(BC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的BCVR的BC元件(例如β链可变区序列(BCVRS))的区段；和

b)共价联接，例如连接AC链与BC链，

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的BCVR或ACVR的核酸。

如此产生一种核酸，其包含编码ACVR的AC元件和BCVR的BC元件的序列，其中ACVR和BCVR匹配。

102.如段101的方法，其中AC元件包含或由ACVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。

103.如段101或102的方法，其中BC元件包含或由BCVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。

104.如段101-103任一所述的方法，其中核酸序列配置成当表达时ACVRS和BCVRS形成功能性抗原结合分子，例如单链TCR分子。

105.如段104所述的方法，其中抗原结合分子例如scFv在体外、离体或体内是功能性的，如用本文所述的方法或实验所测定。

106.如段101-105任一所述的方法，其中获得分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：

a)获得结合至以下物质的捕获基质：

ii)第二ds cDNA，其包含与编码来自一种细胞的BCVR的第二mRNA互补的链(载有cDNA的捕获基质)，和

多条AC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的ACVR的AC元件(例如ACVRS)的区段；和

多条BC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的BCVR的BC元件(例如BCVRS)的区段；和

107.如段106所述的方法，其中AC ds cDNA与第一ds cDNA相同或基本相同。

108.如段106或107所述的方法，其中BC ds cDNA与第二ds cDNA相同或基本相同。

109.如段106-108任一所述的方法，其中捕获基质包含珠，如磁珠。

110.如段106-109任一所述的方法，其中捕获基质包含与cDNA结合的部分(例如寡核苷酸)，如(i)与AC链结合的部分；(ii)与BC链结合的部分；或(iii)(i)和(ii)两者。

111.如段106-110任一所述的方法，其中第一mRNA和第二mRNA置于载有mRNA的捕获基质上。

112.如段106-111任一所述的方法，其中获得分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：

适于从第一和第二mRNA产生第一ds cDNA和第二ds cDNA的试剂混合物(例如，在第一和第二mRNA从载有mRNA的捕获基质上释放入溶液后)，第一ds cDNA包含编码细胞的ACVR的AC元件(例如ACVRS)的区段，第二ds cDNA包含编码细胞的BCVR的BC元件(例如BCVRS)的区段。

113.如段106-112任一所述的方法，其中分离的生产反应位点，例如生产微室包含介导第一ds cDNA生产的引物。

114.如段106-113任一所述的方法，其中分离的生产反应位点，例如生产微室包含介导第二ds cDNA生产的引物。

115.如段106-114任一所述的方法，其中通过逆转录第一mRNA产生与编码来自细胞的ACVR的第一mRNA互补的cDNA链。

116.如段106-115任一所述的方法，其中通过逆转录第二mRNA产生与编码来自细胞的BCVR的第二mRNA互补的cDNA链。

117.如段115或116所述的方法，其中逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室中发生。

118.如段115或116所述的方法，其中逆转录在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室中发生。

119.如段115或116所述的方法，其中逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室之外发生，或在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室外发生。

120.如段115或116所述的方法，其中逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室之外发生，或在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室外发生。

121.如段115或116所述的方法，其中逆转录在分离的反应位点，例如微室外发生。

122.如段106-121任一所述的方法，其中扩增包括20或更少轮循环，例如，15或更少，14或更少，13或更少，12或更少，11或更少，10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，或5或更少轮循环。

123.如段106-122任一所述的方法，其中逆转录和/或扩增使用一个或多个引物，例如包含对ACVRS和/或BCVRS特异性的序列。

124.如段106-123任一所述的方法，其中逆转录和/或扩增包括使用介导AC dscDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。

125.如段106-124任一所述的方法，其中逆转录和/或扩增包括使用介导BC dscDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。

126.如段125所述的方法，其中至少一种引物包含例如减少，例如抑制DNA聚合酶的DNA合成的核苷酸修饰。

127.如段125或126所述的方法，其中至少一种引物不包含例如减少，例如抑制DNA聚合酶的DNA合成的核苷酸修饰。

128.如段126或127所述的方法，其中核苷酸修饰抑制DNA聚合酶延伸DNA。

129.如段126-128任一所述的方法，其中核苷酸修饰是在引物中插入间隔子，例如在引物内的两个相邻核苷酸之间。

130.如段129所述的方法，其中间隔子是柔性间隔子、碳间隔子(例如,-(CH2)n-,其中n＝3,4,5或更大),两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多)脱碱基核苷酸，或PEG间隔子。

131.如段126-128任一所述的方法，其中核苷酸修饰是例如对核糖的2’-O-甲基,2’-OH,2’-NH₂,或尿嘧啶修饰。

132.如段126-131任一所述的方法，其中核苷酸修饰位于引物内部或3’末端。

133.如段123-132任一所述的方法，其中至少一个引物包括(i)第一组成部分；(ii)第二组成部分，和可任选的(iii)本文所述的核苷酸修饰，例如位于(i)和(ii)之间。

134.如段133任一所述的方法，其中第一组成部分能够与相同引物或不同引物内的第二组成部分退火，例如(通过分子内杂交)形成发夹结构或(通过分子间杂交)形成双链结构，其包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域。

135.如段133或134的方法，其中第一组成部分包括与附连至捕获基质的寡核苷酸序列互补的序列。

136.如段133-135任一所述的方法，其中第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(例如ACVRS和/或BCVRS)互补的序列，其中第二组成部分包含同源重组的序列(例如在酵母细胞或哺乳动物细胞中)。

137.如段123-136任一的方法，其中至少一种引物包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列。

138.如段137所述的方法，其中包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列的引物被磷酸化，例如被5’磷酸化。

139.如段137或138所述的方法，其中接头序列包含或由(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n组成，其中n＝1,2,3,4,5或更大。

140.如段101-139任一所述的方法，其中AC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。

141.如段101-140任一所述的方法，其中AC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。

142.如段101-141任一所述的方法，其中BC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。

143.如段101-142任一所述的方法，其中BC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。

144.如段101-143任一所述的方法，其中AC ds cDNA和BC ds cDNA包含粘性末端，例如都具有5’突出端。

145.如段101-144任一所述的方法，其中AC链和BC链共价联接，例如连接产生单链核酸序列，其中AC和BC链都是正义链或都是反义链。

146.如段101-144任一所述的方法，其中AC ds cDNA的变性AC链与BC ds cDNA的变性BC链共价联接，例如连接，其中AC链和BC链都是正义链或都是反义链。

147.如段101-144任一所述的方法，其中AC链存在于AC ds cDNA中，BC链存在于BCds cDNA中，其中AC ds cDNA和BC ds cDNA共价联接，例如连接，以产生双链核酸序列。

148.段101-147任一所述的方法，其中共价联接，例如连接在分离的生产反应位点发生。

149.段148所述的方法，其中分离的生产反应位点例如生产微室包含能够共价联接，例如连接AC和BC链或AC和BC ds cDNA的试剂。

150.段148或149所述的方法，其中分离的生产反应位点例如生产微室包含共价偶联AC和BC链或AC和BC ds cDNA的酶。

151.段101-147任一所述的方法，其中共价联接，例如连接，在与分离的生产反应位点不同的位点发生，例如在分离的联接反应位点，例如联接微室中发生。

152.段151所述的方法，其中AC链和BC链从分离的生产位点转移到分离的联接反应位点，例如联接微室，共价连接发生在分离的联接反应位点例如联接微室。

153.段151或152所述的方法，其中分离的联接反应位点例如联接微室包含能够共价联接，例如连接AC和BC链或AC和BC ds cDNA的试剂。

154.段151-153任一所述的方法，其中分离的联接反应位点例如联接微室包含共价偶联AC和BC链或AC和BC ds cDNA的酶。

155.段150或154所述的方法，其中酶是连接酶，例如热稳定连接酶。

156.如段151-155任一所述的方法，其中共价联接，例如连接，包括：

(a)在允许AC链和BC链变性的条件下(例如在95℃)加热分离的联接反应位点，例如联接微室；

(b)在允许夹板寡核苷酸与AC链和BC链杂交的条件下(例如在50-65℃)冷却分离的联接反应位点，例如联接微室；

(c)在允许AC链和BC链连接(例如在AC链和BC链之间形成磷酸二酯键)的条件下(例如在45-65℃)维持分离的联接反应位点，例如联接微室；和

157.如段101-156任一所述的方法，其中AC链和BC链在夹板寡核苷酸的存在下共价联接，例如连接。

158.如段157所述的方法，其中夹板寡核苷酸与包含AC链和BC链接合区(junction)的序列，或其互补序列杂交，在连接位点形成双链区域。

159.如段157或158所述的方法，其中夹板寡核苷酸包含抑制例如DNA聚合酶的DNA合成的修饰(例如NH₂基团)。

160.如段159所述的方法，其中修饰在夹板寡核苷酸3’末端。

161.如段101-160任一所述的方法，其中扩增产生与共价联接，例如连接的AC和BC链互补的链。

162.如段101-161任一所述的方法，其中还包括在获得分离的生产反应位点，例如生产微室，获得载有mRNA的捕获基质。

163.如段162所述的方法，其中获得载有mRNA的捕获基质包含：

a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：

i)细胞，和

ii)捕获基质，其能结合编码来自细胞的ACVR的第一mRNA和编码来自细胞的BCVR的第二mRNA；和

其中分离的细胞反应位点(例如细胞分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的ACVR或BCVR的核酸。

164.如段163所述的方法，其中分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括裂解剂，例如去污剂。

165.如段163或164任一所述的方法，其中由热或酶裂解细胞。

166.如段163-165任一所述的方法，其中捕获基质包括结合mRNA的部分(例如寡核苷酸)，如寡(dT)。

167.如段162-166任一所述的方法，其中还包括从分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室释放载有mRNA的捕获基质。

168.如段167所述的方法，其中释放步骤在聚(dA)或聚(dT)寡核苷酸的存在下进行，例如以减少非捕获mRNA的交叉结合。

169.如段162-168任一所述的方法，其中载有mRNA的捕获基质从分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室转移到分离的生产反应位点，例如生产微室。

170.如段101-169任一所述的方法，其中还包括从生产微室释放核酸序列。

171.如段101-170任一所述的方法，其中还包括扩增核酸序列。

172.如段101-171任一所述的方法，其中还包括对全部或部分核酸序列进行测序。

173.如段101-72任一所述的方法，其中还包括将全部或部分核酸序列插入载体。

174.如段173所述的方法，其中载体提供未包括在核酸序列内的额外AC元件或BC元件。

175.如段173或174所述的方法，其中载体提供了AC CDR1、AC CDR2或两者。

176.如段173-175所述的方法，其中包括表达载体。

177.如段101-176所述的方法，还包括表达核酸序列以产生包含编码ACVR的AC元件(例如ACVRS)的区段和编码BCVR的BC元件(例如BCVRS)的区段的多肽。

178.如段177所述的方法，其中BC元件在多肽内在AC元件的N-末端。

179.如段177所述的方法，其中AC元件在多肽内在BC元件的C-末端。

180.如段177-179任一所述的方法，其中还包括使多肽接触抗原。

181.如段177-180任一所述的方法，其中还包括确定是否多肽与抗原结合。

182.如段101-181任一所述的方法，其中细胞是免疫细胞，例如B细胞或T细胞，例如人B细胞或T细胞。

183.如段101-182任一所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞或禽类细胞。

184.一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRα链可变区(ACVR)的α链元件(AC元件)和编码TCRβ链可变区(BCVR)的β链元件(BC元件)的序列，其中ACVR和BCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：

i)细胞，和

ii)捕获基质，其能结合编码来自细胞的ACVR的第一mRNA和编码来自细胞的BCVR的第二mRNA；

其中分离的细胞反应位点(例如细胞分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的ACVR或BCVR的核酸；

d)获得分离的生产位点，例如生产微室，包括：

i)来自步骤b)的α链(AC)链，其中AC链是α链双链cDNA(AC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的ACVR的AC元件(例如α链可变区序列(ACVRS))的区段；和

ii)来自步骤b)的β链(BC)链，其中BC链是β链cDNA(BC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的BCVR的BC元件(例如β链可变区序列(BCVRS))的区段；和

e)共价联接，例如连接AC链与BC链，

185.一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRα链可变区(ACVR)的α链元件(AC元件)和编码TCRβ链可变区(BCVR)的β链元件(BC元件)的序列，其中ACVR和BCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：

i)细胞，和

c)获得分离的生产位点，例如生产微室，包括：使载有mRNA的捕获基质与反应混合物接触，例如含有逆转录酶的反应混合物，其用负载mRNA作为模板，产生：

第二ds cDNA，其包含与编码来自所述细胞的BCVR的第二mRNA互补的链(cDNA负载的捕获基质)；

e)获得分离的联接反应位点，例如联接微室，包括：共价联接(例如连接)AC dscDNA链的链(AC链)和BC ds cDNA的链(BC链)，其中AC和BC链都是正义链或都是反义链；和

f)扩增共价联接的，例如连接的AC和BC链。

186.一种产生包括多个独特组成部分的文库的方法，该方法包括：

产生多个组成部分，其中每个组成部分包含编码α链可变区(ACVR)的α链元件(AC元件)和β链可变区(BCVR)的β链元件(BC元件)的序列，和其中ACVR和BCVR匹配，由段101-185任一所述的方法产生，

其中所述多个中的每一个独特核酸序列包含来自不同独特细胞的AC元件和BC元件，

从而产生包含多个独特组成部分的文库。

187.如段186所述的方法，其中多个独特组成部分包括至少10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个独特组成部分。

188.如段186或187所述的方法，其中多个独特组成部分包括10⁴至10⁹、10⁴至10⁸、10⁴至10⁷、10⁴至10⁶、10⁴至10⁵、10⁸至10⁹、10⁷至10⁹、10⁶至10⁹、10⁵至10⁹、10⁵至10⁸、10⁶至10⁷、10⁴至10⁵、10⁵至10⁶、10⁶至10⁷、10⁷至10⁸、或10⁸至10⁹个独特组成部分。

189.如段186-188所述的方法，其中所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的AC元件和BC元件序列)。

190.如段186-189所述的方法，其中所述文库中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的AC元件和BC元件序列)。

191.一种文库，其包含：

多个独特组成部分，

其中，

iii)文库包括一个或多个(例如2、3、4、或全部)以下特征：

a)用段101-185任一所述的方法制备的文库；

d)所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的AC元件和BC元件序列)；或

192.如段191所述的文库，其中多个独特组成部分中的每一个配置成当表达时AC元件(例如ACVRS)和BC元件(例如BCVRS)形成功能性抗原结合分子，例如单链TCR。

193.如段191-192任一所述的文库，其中文库是展示文库。

194.如段191-193任一所述的文库，其中多个组成部分中的每一个还编码多肽，其导致组成部分展示在展示实体表面。

195.如段191-194任一所述的文库，其中文库是噬菌体展示文库。

196.如段191-194任一所述的文库，其中文库是酵母展示文库。

197.如段191-194任一所述的文库，其中文库是哺乳动物展示文库。

198.一种制备结合多肽的方法，该方法包括：

a)获得段191-197任一所述的文库；和

b)表达文库的独特核酸编码的多肽。

199.如段198所述的方法，其中还包括使多肽接触抗原。

200.如段198或199所述的方法，还包括回收编码结合抗原的多肽的核酸。

201.一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRγ链可变区(GCVR)的TCRγ链元件(GC元件)和TCRδ链可变区(DCVR)的TCRδ链元件(DC元件)的序列，其中GCVR和DCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的生产位点，例如生产微室，包括：

ii)δ链(DC)链，其中DC链是δ链双链cDNA(DC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的DCVR的DC元件(例如δ链可变区序列(DCVRS))的区段；和

b)共价联接，例如连接GC链与DC链，

其中分离的生产反应位点(例如生产分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的DCVR或GCVR的核酸，

202.如段201的方法，其中GC元件包含或由GCVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。

203.如段201或202的方法，其中DC元件包含或由DCVRS或其功能性片段(例如其抗原结合片段)组成。

204.如段201-203任一所述的方法，其中核酸序列配置成当表达时GCVRS和DCVRS形成功能性抗原结合分子，例如单链TCR分子。

205.如段204所述的方法，其中抗原结合分子例如scFv在体外、离体或体内是功能性的，如用本文所述的方法或实验所测定。

206.如段201-205任一所述的方法，其中获得分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：

a)获得结合至以下物质的捕获基质：

(i)第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自一种细胞的GCVR的第一mRNA互补的链；

ii)第二ds cDNA，其包含与编码来自一种细胞的DCVR的第二mRNA互补的链(载有cDNA的捕获基质)，和

多条GC ds cDNA，其包含编码来自一种细胞的GCVR的GC元件(例如GCVRS)的区段；和

多条DC ds cDNA，其包含编码来自一种细胞的DCVR的DC元件(例如DCVRS)的区段。

207.如段206所述的方法，其中GC ds cDNA与第一ds cDNA相同或基本相同。

208.如段206或207所述的方法，其中DC ds cDNA与第二ds cDNA相同或基本相同。

209.如段206-208任一所述的方法，其中捕获基质包含珠，如磁珠。

210.如段206-209任一所述的方法，其中捕获基质包含与cDNA结合的部分(例如寡核苷酸)，如(i)与GC链结合的部分；(ii)与DC链结合的部分；或(iii)(i)和(ii)两者。

211.如段206-220任一所述的方法，其中第一mRNA和第二mRNA置于载有mRNA的捕获基质上。

212.如段206-211任一所述的方法，其中获得分离的生产反应位点，例如生产微室，包括：

适于从第一和第二mRNA产生第一ds cDNA和第二ds cDNA的试剂混合物(例如，在第一和第二mRNA从载有mRNA的捕获基质上释放入溶液后)，第一ds cDNA包含编码细胞的GCVR的AC元件(例如GCVRS)的区段，第二ds cDNA包含编码细胞的DCVR的DC元件(例如DCVRS)的区段。

213.如段206-212任一所述的方法，其中分离的生产反应位点，例如生产微室包含介导第一ds cDNA生产的引物。

214.如段206-213任一所述的方法，其中分离的生产反应位点，例如生产微室包含介导第二ds cDNA生产的引物。

215.如段206-214任一所述的方法，其中通过逆转录第一mRNA产生与编码来自细胞的GCVR的第一mRNA互补的cDNA链。

216.如段206-215任一所述的方法，其中通过逆转录第二mRNA产生与编码来自细胞的DCVR的第二mRNA互补的cDNA链。

217.如段215或216所述的方法，其中逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室中发生。

218.如段215或216所述的方法，其中逆转录在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室中发生。

219.如段215或216所述的方法，其中逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室之外发生，或在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室外发生。

220.如段215或216所述的方法，其中逆转录在分离的生产反应位点，例如生产微室之外发生，或在分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室外发生。

221.如段215或216所述的方法，其中逆转录在分离的反应位点，例如微室外发生。

222.如段206-221任一所述的方法，其中扩增包括20或更少轮循环，例如，25或更少，24或更少，23或更少，22或更少，21或更少，20或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，或5或更少轮循环。

223.如段206-222任一所述的方法，其中逆转录和/或扩增使用一个或多个引物，例如包含对GCVRS和/或DCVRS特异性的序列。

224.如段206-223任一所述的方法，其中逆转录和/或扩增包括使用介导GC dscDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。

225.如段206-224任一所述的方法，其中逆转录和/或扩增包括使用介导DC dscDNA产生的两种或更多种引物，其中至少一种引物包含核苷酸修饰，和其中至少一种引物不包括核苷酸修饰。

226.如段225所述的方法，其中至少一种引物包含例如减少，例如抑制DNA聚合酶的DNA合成的核苷酸修饰。

227.如段225或226所述的方法，其中至少一种引物不包含例如减少，例如抑制DNA聚合酶的DNA合成的核苷酸修饰。

228.如段226或227所述的方法，其中核苷酸修饰抑制DNA聚合酶延伸DNA。

229.如段226-228任一所述的方法，其中核苷酸修饰是在引物中插入间隔子，例如在引物内的两个相邻核苷酸之间。

230.如段229任一所述的方法，其中间隔子是柔性间隔子、碳间隔子(例如,-(CH2)n-,其中n＝3,4,5或更大),两个或更多个(例如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多)脱碱基核苷酸，或PEG间隔子。

231.如段226-228任一所述的方法，其中核苷酸修饰是例如对核糖的2’-O-甲基,2’-OH,2’-NH₂,或尿嘧啶修饰。

232.如段226-231任一所述的方法，其中核苷酸修饰位于引物内部或3’末端。

233.如段223-232任一所述的方法，其中至少一个引物包括(i)第一组成部分；(ii)第二组成部分，和可任选的(iii)本文所述的核苷酸修饰，例如位于(i)和(ii)之间。

234.如段233任一所述的方法，其中第一组成部分能够与相同引物或不同引物内的第二组成部分退火，例如(通过分子内杂交)形成发夹结构或(通过分子间杂交)形成双链结构，其包含4、5、6、7、8、9、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、20个更多碱基对的双链体区域。

235.如段233或234的方法，其中第一组成部分包括与附连至捕获基质的寡核苷酸序列互补的序列。

236.如段233-235任一所述的方法，其中第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(例如GCVRS和/或DCVRS)互补的序列，其中第二组成部分包含同源重组的序列(例如在酵母细胞或哺乳动物细胞中)。

237.如段223-236任一的方法，其中至少一种引物包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列。

238.如段237所述的方法，其中包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列的引物被磷酸化，例如被5’磷酸化。

239.如段237或238所述的方法，其中接头序列包含或由(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n组成，其中n＝1,2,3,4,5或更大。

240.如段201-239任一所述的方法，其中GC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。

241.如段201-240任一所述的方法，其中GC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。

242.如段201-241任一所述的方法，其中DC ds cDNA包含5’突出端，例如能够与结合于捕获基质的寡核苷酸杂交的5’突出端。

243.如段201-242任一所述的方法，其中DC ds cDNA包含钝端，例如包含5’磷酸的钝端。

244.如段201-243任一所述的方法，其中GC ds cDNA和DC ds cDNA包含粘性末端，例如都具有5’突出端。

245.如段201-244任一所述的方法，其中GC链和DC链共价联接，例如连接产生单链核酸序列，其中GC和DC链都是正义链或都是反义链。

246.如段201-245任一所述的方法，其中GC ds cDNA的变性GC链与DC ds cDNA的变性DC链共价联接，例如连接，其中GC链和DC链都是正义链或都是反义链。

247.如段201-245任一所述的方法，其中GC链存在于GC ds cDNA中，DC链存在于DCds cDNA中，其中GC ds cDNA和DC ds cDNA共价联接，例如连接，以产生双链核酸序列。

248.段201-247任一所述的方法，其中共价联接，例如连接在分离的生产反应位点发生。

249.段248所述的方法，其中分离的生产反应位点例如生产微室包含能够共价联接，例如连接GC和DC链或GC和DC ds cDNA的试剂。

250.段248或249所述的方法，其中分离的生产反应位点例如生产微室包含共价偶联GC和DC链或GC和DC ds cDNA的酶。

251.段201-247任一所述的方法，其中共价联接，例如连接，在与分离的生产反应位点不同的位点发生，例如在分离的联接反应位点，例如联接微室中发生。

252.段251所述的方法，其中GC链和DC链从分离的生产位点转移到分离的联接反应位点，例如联接微室，共价连接发生在分离的联接反应位点例如联接微室。

253.段251或252所述的方法，其中分离的联接反应位点例如联接微室包含能够共价联接，例如连接GC和DC链或GC和DC ds cDNA的试剂。

254.段251-253任一所述的方法，其中分离的联接反应位点例如联接微室包含共价偶联GC和DC链或GC和DC ds cDNA的酶。

255.段250或254所述的方法，其中酶是连接酶，例如热稳定连接酶。

256.如段251-255任一所述的方法，其中共价联接，例如连接，包括：

(a)在允许GC链和DC链变性的条件下(例如在96℃)加热分离的联接反应位点，例如联接微室；

(b)在允许夹板寡核苷酸与GC链和DC链杂交的条件下(例如在60-66℃)冷却分离的联接反应位点，例如联接微室；

(c)在允许GC链和DC链连接(例如在GC链和DC链之间形成磷酸二酯键)的条件下(例如在46-66℃)维持分离的联接反应位点，例如联接微室；和

(d)依次重复步骤(a)、(b)和(c)2、6、20、26、20、26、30、36、40、46、60、或更多轮循环。

257.如段201-256任一所述的方法，其中GC链和DC链在夹板寡核苷酸的存在下共价联接，例如连接。

258.如段257所述的方法，其中夹板寡核苷酸与包含GC链和DC链接合区(junction)的序列，或其互补序列杂交，在连接位点形成双链区域。

259.如段257或258所述的方法，其中夹板寡核苷酸包含抑制例如DNA聚合酶的DNA合成的修饰(例如NH₂基团)。

260.如段259所述的方法，其中修饰在夹板寡核苷酸3’末端。

261.如段201-260任一所述的方法，其中扩增产生与共价联接，例如连接的GC和DC链互补的链。

262.如段201-261任一所述的方法，其中还包括在获得分离的生产反应位点，例如生产微室，获得载有mRNA的捕获基质。

263.如段262所述的方法，其中获得载有mRNA的捕获基质包含：

a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：

i)细胞，和

ii)捕获基质，其能结合编码来自细胞的GCVR的第一mRNA和编码来自细胞的DCVR的第二mRNA；和

其中分离的细胞反应位点(例如细胞分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的GCVR或DCVR的核酸。

264.如段263所述的方法，其中分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括裂解剂，例如去污剂。

265.如段263或264任一所述的方法，其中由热或酶裂解细胞。

266.如段263-265任一所述的方法，其中捕获基质包括结合mRNA的部分(例如寡核苷酸)，如寡(dT)。

267.如段262-266任一所述的方法，其中还包括从分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室释放载有mRNA的捕获基质。

268.如段267所述的方法，其中释放步骤在聚(dA)或聚(dT)寡核苷酸的存在下进行，例如以减少非捕获mRNA的交叉结合。

269.如段262-268任一所述的方法，其中载有mRNA的捕获基质从分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室转移到分离的生产反应位点，例如生产微室。

270.如段201-269任一所述的方法，其中还包括从生产微室释放核酸序列。

271.如段201-270任一所述的方法，其中还包括扩增核酸序列。

272.如段201-271任一所述的方法，其中还包括对全部或部分核酸序列进行测序。

273.如段201-272任一所述的方法，其中还包括将全部或部分核酸序列插入载体。

274.如段273所述的方法，其中载体提供未包括在核酸序列内的额外GC元件或DC元件。

275.如段273或274所述的方法，其中载体提供了GC CDR1、GC CDR2或两者。

276.如段273-275所述的方法，其中包括表达载体。

277.如段201-276任一所述的方法，包括表达核酸序列以产生包含编码GCVR的GC元件(例如GCVRS)的区段和编码DCVR的DC元件(例如DCVRS)的区段的多肽。

278.如段277所述的方法，其中DC元件在多肽内在GC元件的N-末端。

279.如段277所述的方法，其中GC元件在多肽内在DC元件的C-末端。

280.如段277-279任一所述的方法，其中还包括使多肽接触抗原。

281.如段277-280任一所述的方法，其中还包括确定是否多肽与抗原结合。

282.如段201-281任一所述的方法，其中细胞是免疫细胞，例如B细胞或T细胞，例如人B细胞或T细胞。

283.如段201-282任一所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞或禽类细胞。

284.一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRγ链可变区(GCVR)的TCRγ链元件(GC元件)和TCRδ链可变区(DCVR)的TCRδ链元件(DC元件)的序列，其中GCVR和DCVR相匹配，所述方法包括：

a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：

i)细胞，和

ii)捕获基质，其能结合编码来自细胞的GCVR的第一mRNA和编码来自细胞的DCVR的第二mRNA；

其中分离的细胞反应位点(例如细胞分离微室)不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的GCVR或DCVR的核酸；

d)获得分离的生产位点，例如生产微室，包括：

i)来自步骤b)的γ链(GC)链，其中GC链是γ链双链cDNA(GC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的GCVR的GC元件(例如γ链可变区序列(GCVRS))的区段；和

ii)来自步骤b)的δ链(DC)链，其中DC链是δ链双链cDNA(DC ds cDNA)的链，包含编码来自细胞的DCVR的DC元件(例如δ链可变区序列(DCVRS))的区段；和

e)共价联接，例如连接GC链与DC链，

285.一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRγ链可变区(GCVR)的TCRγ链元件(GC元件)和TCRδ链可变区(DCVR)的TCRδ链元件(DC元件)的序列，其中GCVR和DCVR相匹配，所述方法包括：

a)获得分离的细胞反应位点，例如细胞分离微室，包括：

i)细胞，和

第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自一种细胞的GCVR的第一mRNA互补的链；

第二ds cDNA，其包含与编码来自所述细胞的DCVR的第二mRNA互补的链(cDNA负载的捕获基质)；

多条GC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的GCVR的GC元件(例如GCVRS)的区段；和

多条DC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的DCVR的DC元件(例如DCVRS)的区段；和

e)获得分离的联接反应位点，例如联接微室，包括：共价联接(例如连接)GC dscDNA链的链(GC链)和DC ds cDNA的链(DC链)，其中GC和DC链都是正义链或都是反义链；和

f)扩增共价联接的，例如连接的GC和DC链。

286.一种产生包括多个独特组成部分的文库的方法，该方法包括：

产生多个组成部分，其中每个组成部分包含编码γ链可变区(GCVR)的γ链元件(GC元件)和δ链可变区(DCVR)的δ链元件(DC元件)的序列，和其中GCVR和DCVR匹配，由段201-285任一所述的方法产生，

其中所述多个中的每一个独特核酸序列包含来自不同独特细胞的GC元件和DC元件，

从而产生包含多个独特组成部分的文库。

287.如段86所述的方法，其中所述多个独特组成部分包括至少204、205、206、207、208或209个独特组成部分。

288.如段286或287所述的方法，其中多个独特组成部分包括204至209、204至208、204至207、204至206、204至205、208至209、207至209、206至209、205至209、205至208、206至207、204至205、205至206、206至207、207至208、或208至209个独特组成部分。

289.如段286-288所述的方法，其中所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或200％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的GC元件和DC元件序列)。

290.如段286-289所述的方法，其中所述文库中少于20％、25％、20％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的GC元件和DC元件序列)。

291.一种文库，其包含：

多个独特组成部分，

其中，

iii)文库包括一个或多个(例如2、3、4、或全部)以下特征：

a)用段201-285任一所述的方法制备的文库；

b)多个独特组成部分包括至少204、205、206、207、208或209个独特核酸序列；

c)多个独特组成部分包括204至209、204至208、204至207、204至206、204至205、208至209、207至209、206至209、205至209、205至208、206至207、204至205、205至206、206至207、207至208、或208至209个独特组成部分；

d)所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或200％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的GC元件和DC元件序列)；或

e)所述文库中少于20％、25％、20％、5％、4％、3％、2％、或1％的组成部分是独特组成部分(其编码匹配的GC元件和DC元件序列)。

292.如段291所述的文库，其中多个独特组成部分中的每一个配置成当表达时GC元件(例如GCVRS)和DC元件(例如DCVRS)形成功能性抗原结合分子，例如单链TCR。

293.如段291-292任一所述的文库，其中文库是展示文库。

294.如段291-293任一所述的文库，其中多个组成部分中的每一个还编码多肽，其导致组成部分展示在展示实体表面。

295.如段291-294任一所述的文库，其中文库是噬菌体展示文库。

296.如段291-294任一所述的文库，其中文库是酵母展示文库。

297.如段291-294任一所述的文库，其中文库是哺乳动物展示文库。

298.一种制备结合多肽的方法，该方法包括：

a)获得段291-297任一所述的文库；和

b)表达文库的独特核酸编码的多肽。

299.如段298所述的方法，其中还包括使多肽接触抗原。

300.如段298或299所述的方法，还包括回收编码结合抗原的多肽的核酸。

301.一种分离的生产反应位点，例如生产微室，其是如段1-85、101-185、或201-285中任一所述的分离的生产反应位点。

302.如段401所述的分离的生产反应位点(例如生产微室)，其不包括编码来自不同细胞(i)HCVR或LCVR，(ii)ACVR或BCVR，或(iii)GCVR或DCVR的核酸。

303.如段301或302所述的分离的生产反应位点(例如生产微室)，其包括一个、两个、或全部以下：

(i)对(a)HC和LC，(b)α链和β链，或(c)γ链和δ链的V基因序列特异性的一个或多个引物；

(ii)对引入(a)HC和LC，(b)α链和β链，或(c)γ链和δ链cDNA的突出端特异性的一个或多个引物；

(iii)一个或多个引物，其包含第一组成部分、第二组成部分和位于第一组成部分和第二组成部分之间的核苷酸修饰(例如间隔子)，其中第一组成部分能与相同引物或不同引物中的第二组成部分退火，例如形成含有具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域的结构。

304.如段301或103所述的分离的生产反应位点(例如生产微室)，其不包含能够共价联接核酸的试剂，如连接酶，例如热稳定连接酶。

305.如段301或103所述的分离的生产反应位点(例如生产微室)，其包含能够共价联接核酸的试剂，如连接酶，例如热稳定连接酶。

306.一种自退火寡核苷酸，其包含第一组成部分、第二组成部分和位于第一组成部分和第二组成部分之间的核苷酸修饰(例如间隔子)，其中第一组成部分能与相同寡核苷酸或不同寡核苷酸中的第二组成部分退火，例如形成发夹结构(通过分子内杂交)或含有具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域的双链结构(通过分子间杂交)。

307.如段306所述的寡核苷酸，其中第一和第二组成部分能形成发夹结构，其包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个更多碱基对的双链体区域。

308.如段306或307所述的寡核苷酸，其中第一组成部分是5-40个核苷酸，例如长度为5-10、5-20、5-30、30-40、20-40、10-30、10-30、或15-25个核苷酸。

309.如段306-308任一所述的寡核苷酸，其中第二组成部分是5-40个核苷酸，例如长度为5-10、5-20、5-30、30-40、20-40、10-30、10-30、或15-25个核苷酸。

310.如段306-309任一所述的寡核苷酸，其中间隔子是柔性间隔子或PEG间隔子。

311.如段306-310任一的方法，其中第一组成部分包括与附连至捕获基质的寡核苷酸序列互补的序列。

312.如段306-311任一所述的寡核苷酸，其中第二组成部分(例如从5’到3’)包含以下一者、两者或全部：(i)与第一组成部分的至少部分互补的序列；(ii)通用引物序列(例如用于PCR扩增或下一代测序)；和(iii)与靶序列(例如GCVRS和/或DCVRS)互补的序列，其中第二组成部分包含同源重组的序列(例如在酵母细胞或哺乳动物细胞中)。

313.一种分离的联接反应位点，例如联接微室，其是如段51-83、85、151-183、185、251-283、或285中任一所述的分离的联接反应位点。

314.如段313所述的分离的联接反应位点(例如联接微室)，其不包括编码来自不同细胞(i)HCVR或LCVR，(ii)ACVR或BCVR，或(iii)GCVR或DCVR的核酸。

315.如段313或314所述的分离的联接反应位点(例如联接微室)，其包括夹板寡核苷酸，其能催化与含有i)HC链和LC链，(ii)α链和β链，或(iii)γ链和δ链的接合区的序列或其互补序列的杂交，在连接位点形成双链区域。

316.如段313-315任一所述的分离的联接反应位点(例如联接微室)，其包含能够共价联接核酸的试剂，如连接酶，例如热稳定连接酶。

317.如段1-300任一所述的方法，其在例如连接步骤中不包括重叠延伸聚合酶链反应(OE-PCR)步骤，也被称作重叠延伸剪接或突出端延伸(SOE)PCR剪接的步骤(Higuchi等,Nucleic Acids Res.1988；16(15):7351-67)。

实施例：

实施例1:液滴中的粘性末端PCR连接

B细胞包封在液滴中。B细胞包封入液滴，液滴体积范围为10pL-100nL，典型为100-1000pL。B细胞来源可包括例如小鼠、人、大鼠、家兔或鸡。运载体(油)相由3M HFE-7500和约1％氟化表面活性剂(RAN Biotechnologies)组成。由微流体芯片(例如来自Dolomite的2R100μm)通过针筒或压力泵控制流体相流动来形成液滴。液滴的水相由缓冲液(例如Tris，pH7.5)、辅助细胞裂解的去污剂和含有用以与重链和轻链mRNA退火的寡核苷酸(引物)的磁珠组成。通常液滴的占有率应为每个液滴不多于一个细胞，和每个液滴至少一个珠。

孵育液滴以促使细胞裂解。在某些去污剂(例如吐温20)存在下加热乳液以促进裂解效率。例如，可加热乳液至40℃、50℃、60℃、70℃、或80℃的温度约5-60分钟。细胞裂解后，释放mRNA并通过与珠上的寡核苷酸退火被捕获到珠上。

破碎乳液并回收珠。用液滴去稳定剂，例如PFO(全氟辛醇)破碎乳液(或聚结的不同溶液相)。回收含珠的水相。用磁铁分离珠。洗涤珠并重悬浮在缓冲液(例如Tris，pH7.5)中。

进行逆转录(RT)来建立cDNA-珠(在非乳液反应中)。珠重悬浮于缓冲液-酶混合物(例如Superscript II RT)中。反应在40℃孵育15分钟，以促进RT。用缓冲液洗涤珠一次(例如Tris，pH7.5)。

可包封回收的珠，用于PCR-连接反应。可使用体积为约5pL-500pL，最常约10-50pL的液滴。运载体(油)相可由含约2％氟化表面活性剂(RAN Biotechnologies)的3M HFE-7500组成。可用以下包封液滴：具有cDNA的珠；PCR试剂(包括例如DNA聚合酶，如高保真DNA聚合酶(NEB)，高保真DNA聚合酶(NEB)、Pfu DNA聚合酶、KAPA DNA聚合酶、DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶)；允许扩增VH和VL序列的寡核苷酸；热稳定连接酶(例如Taq DNA连接酶、Pfu DNA连接酶，热稳定DNA连接酶、Tsc DNA连接酶、RmaDNA连接酶、Tfi DNA连接酶或Tth DNA连接酶)；和优化的缓冲条件(同时支持DNA聚合酶和连接酶活性的相容性)。

如在试管中测试的，scFv盒构建成VL-接头-VH。顺序可切换成VH-接头-VL，对于功能或表现无显著影响。VL序列的反向引物含有编码接头序列且具有至少一个修饰的核苷酸(例如具有2’-O-甲基修饰的3个连续核苷酸)的突出端。VL的反向引物还可含有5’-磷酸(连接酶底物所必需)。VH序列的反向引物含有编码接头序列且具有至少一个修饰的核苷酸(例如具有2’-O-甲基修饰的3个连续核苷酸)的突出端。VH的反向引物还可含有5’-磷酸(连接酶底物所必需)。液滴的占有率应不高于每个液滴1个珠。

可用乳液进行热循环。产生的乳液可转移到PCR管中。可用以下条件进行热循环：最初变性为95-98℃30秒-2分钟；10-30轮的：95-98℃变性10-30秒，最初退火50-60℃下10-30秒，聚合酶延伸72℃30秒，和粘性产物退火和连接在45-55℃3分钟。可在4℃维持反应。

破碎乳液，并回收含有联接的(和未联接的)产物的部分。可用液滴去稳定剂，例如PFO(全氟辛醇)破碎乳液。可回收水相部分并弃去珠。

如试管中测试的，从未联接的VH和VL产物纯化联接产物(代表性的天然联接的VL-接头-VH)。从非连接产物通过尺寸分离分离连接产物。例如，可使用变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)或变性HPLC-SEC。从非联接产物(约350-500bp)分离联接产物(约800-900bp)。对于变性PAGE纯化，从凝胶上切下连接的条带，进行电洗脱从凝胶切片提取DNA(Bio-Rad电洗脱仪)。

可通过PCR扩增纯化的联接产物。可用能够中度通读含有修饰的核苷酸的DNA的聚合酶/条件，例如Taq聚合酶。

实施例2:连接酶循环方法

可进行逆转录(RT)来建立cDNA-珠(在非乳液反应中)。可将珠重悬浮于缓冲液-酶混合物(例如Superscript II RT)中。反应可在40℃孵育15分钟，以促进RT。可用缓冲液洗涤珠一次(例如Tris，pH7.5)。

包封回收的珠用于PCR反应。可使用体积为约5pL-500pL，最常约10-50pL的液滴。运载体(油)相可由含约2％氟化表面活性剂(RAN Biotechnologies)的3M HFE-7500组成。可用以下包封液滴：具有cDNA的珠(一些珠可能是“空的”，其不成问题)；PCR试剂(包括例如DNA聚合酶，如高保真DNA聚合酶(NEB)，高保真DNA聚合酶(NEB)、Pfu DNA聚合酶、KAPA DNA聚合酶、DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶)；允许扩增VH和VL序列的寡核苷酸。

scFv盒可构建为VL-接头-VH。顺序可切换成VH-接头-VL，对于功能或表现无显著影响。VL反向和VH正向引物可含有编码接头的突出端序列。VH反向引物可具有5’-磷酸。液滴的占有率应不高于每个液滴1个珠。

可用乳液进行热循环。产生的乳液可转移到PCR管中。可用标准PCR条件进行热循环：最初变性：95-98℃30秒-2分钟；10-30轮的：95-98℃变性10-30秒，最初退火50-60℃下10-30秒，聚合酶延伸72℃30秒。可在4℃维持反应。

破碎乳液，并可回收珠。可用液滴去稳定剂，例如PFO(全氟辛醇)破碎乳液(或聚结的不同溶液相)。可回收含有珠的水相。可用磁铁分离珠。可洗涤珠以除去未捕获在珠上的PCR产物。洗涤珠并重悬浮在缓冲液(例如Tris，pH7.5)中。

可包封回收的珠，用于连接酶循环反应。可使用体积为约5pL-500pL，最常约10-50pL的液滴。运载体(油)相可由含约2％氟化表面活性剂(RAN Biotechnologies)的3MHFE-7500组成。可用夹板寡核苷酸(其与“顶部”VL链的3’末端和“顶部”VL链的5’末端互补并退火)；热稳定连接酶(Taq DNA连接酶、Pfu DNA连接酶，热稳定DNA连接酶、Tsc DNA连接酶、Rma DNA连接酶、Tfi DNA连接酶或Tth DNA连接酶)；和支持连接酶活性的一种或多种反应组分(例如NAD)包封液滴。占有率应不高于每个液滴1个珠。

可用乳液进行热循环。产生的乳液可转移到PCR管中。可用标准条件进行热循环：3-15轮的：90-95℃变性30秒，50-60℃退火和连接1-3分钟。可在4℃维持反应。

可破碎乳液，可回收含有联接的产物的水相部分。可用液滴去稳定剂，例如PFO(全氟辛醇)破碎乳液(或聚结的不同溶液相)。可回收水相部分并弃去珠。

可通过PCR扩增纯化的联接产物。标准条件可与联接的VL-接头-VH连接片段的外部末端退火的寡核苷酸一起使用。

可将最终PCR产物引入酵母，以建立衍生自生物来源的天然配对的文库。

实施例3:连接酶循环反应

在该实施例中，VH和VL PCR产物用热稳定连接酶和夹板寡核苷酸共价联接。

用RNeasy试剂盒(Qiagen)分离来自杂交瘤克隆(ATCC，HB-112，“4G2”)的RNA。用SuperScript IV逆转录酶(Thermo Fisher)产生cDNA，用厂商推荐的条件分离RNA。所用的引物针对重链和轻链的恒定区：小鼠IgG_CH1_rev(5’-CHGATGGGGSTGTYGTTKTRGC(SEQ IDNO:1))和小鼠Kappa_Rev(5’-GTGCAGCATCAGCCC(SEQ ID NO:2))。如本文所用的寡核苷酸由IUPAC核苷酸编码定义，例如R＝A或G；Y＝C或T；S＝G或C；K＝G或T；H＝A或C或T。

组分	体积(ul)
		水	10
10mM dNTP混合物	1
		2uM引物	1
RNA模板	1

混合组分，65℃加热5分钟，然后冰上孵育至少1分钟。然后，加入以下组分：

组分	体积(ul)
		5X SSIV缓冲液	4
100mM DTT	1
		RNaseOUT RNA酶抑制剂(40U/ul)	1
SuperScript IV逆转录酶	1

将组分混合，然后在55℃孵育10分钟。然后通过在80℃孵育10分钟使反应失活。cDNA产物用作PCR模板以分别产生VH和VL产物。使用的引物包括：

4G2VL_Fwd

5’-GACATCAAGATGACCCAGTCTC(SEQ ID NO:3)

小鼠κ_Rev-Phos

5’-/5Phos/ACCAGCAGAGCTCTCACCTGGTGCAGCATCAGCCC(SEQ ID NO:4)

4G2VH_Fwd-Phos

5’-/5Phos/GGAACTACCGAAGGCACAGGTGAGGTCCAGCTGCAACAGTC(SEQ ID NO:5)

小鼠IgG_CH1_rev

5’-CHGATGGGGSTGTYGTTKTRGC(SEQ ID NO:1)

各PCR反应包括：

组分	体积(ul)
		Q5热启动2X主混物(NEB)	50
正向引物(10uM)	5
		反向引物(10uM)	5
4G2cDNA	1
		水	39

然后如下进行热循环：

用AMPure珠纯化PCR产物。用Nanodrop定量纯化的PCR产物。在25μl反应物中建立连接酶循环反应，实现1:1:1摩尔比的VH产物、VL产物和夹板寡核苷酸。夹板寡核苷酸具有以下序列：

5’-ACCTGTGCCTTCGGTAGTTCCACCAGCAGAGCTCTCACCTG/3AmMO/(SEQ ID NO:6)。

每个连接酶循环反应包括：

通过变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析连接酶循环反应。除了Taq连接酶，评估了额外的热稳定连接酶(Ampligase(Amp),Lucigen)。

如图3所示，用Taq连接酶和Ampligase热稳定连接酶观察到VH和VL产物的有效连接。

实施例4:联接产物的批量再扩增过程中的天然配对的维持

乳液OE-PCR工作流产生VH和VL产物，其需要共享序列以促进重叠延伸剪接。在这样的工作流中，在液滴内不能剪接在一起的任何保留的VH/VL产物可在批量(非乳液)PCR产物扩增时被剪接。由于这样的剪接发生在所有细胞产物(例如许多克隆/独特序列)混合的批量相，可发生随机(非天然)配对(见Eur J Immunol.2013；43(9):2507-15)。工作流可从不仅减少这种发生率而且能完全避免它的策略获得好处。本文描述了一种方法，其中VH和VL产物没有任何共同序列，因此工作流不会在批量再扩增步骤时受到OE-PCR的偶然剪接的影响。

为了证明这一点，从彼此大小不同的两个杂交瘤克隆产生联接的VH-VL产物。因此能用产物的大小评估天然对比非天然的配对。杂交瘤4G2的VH和VL产物如实施例3所述产生。用相同的RT引物和以下PCR引物以类似方式产生杂交瘤9E10(ATCC,CRL-1729)“小”VH和VL产物：

9E10Mini_VL_Fwd

5’-GGCAGTGGGTCTGGGACAG(SEQ ID NO:7)

小鼠κ_Rev-Phos

5’-/5Phos/ACCAGCAGAGCTCTCACCTGGTGCAGCATCAGCCC(SEQ ID NO:4)

9E10_VH_Fwd

5’-/5Phos/GGAACTACCGAAGGCACAGGTGAGGTGCACCTGGTGGAGTCT GGGGG(SEQ ID NO:8)

9E10Mini_VH_Rev

5’-GGATAGTGGGTGTAAGTACCACGACTACCAATG(SEQ ID NO:9)

产生的4G2VH和VL产物大小分别为400bp和378bp。产生的小9E10VH和VL产物大小分别为203bp和168bp。用AMPure珠纯化PCR产物。

然后产物如实施例3所述用20轮热循环进行连接酶循环反应。在单独的试管中连接4G2和9E10VH-VL产物，模拟在液滴中产生天然联接的产物(在单独的区室中)。变性PAGE分析产物。4G2VH-VL和9E10VH-VL的天然联接产物分别大小为778bp和371bp。用20轮连接酶循环建立同时含有连接产物和非连接的VH和VL DNA的产物。如图4A所示，对于6G2和9E10都产生天然联接的VH-VL产物。

用AMPure珠纯化连接产物，然后合并，用作联接产物PCR再扩增的模板。该步骤模拟在液滴中进行VH-VL连接后回收产物，然后PCR再扩增联接的VH-VL。通过在PCR中包含未连接的VH和VL DNA作为模板，这提供了DNA在PCR批量再扩增中彼此联接的机会。由于每个克隆的DNA没有区室化，任何在批量相中的连接可导致非天然配对。

如下进行PCR再扩增。用于扩增联接产物的“外部”引物如下：

9E10Mini_VL_Fwd

5’-GGCAGTGGGTCTGGGACAG(SEQ ID NO:7)

4G2VL_Fwd

5’-GACATCAAGATGACCCAGTCTC(SEQ ID NO:3)

9E10Mini_VH_Rev

5’-GGATAGTGGGTGTAAGTACCACGACTACCAATG(SEQ ID NO:9)

小鼠IgG_CH1_rev

5’-CHGATGGGGSTGTYGTTKTRGC(SEQ ID NO:1)

PCR反应各自包括：

组分	体积(ul)
		Q5热启动2X主混物	12.5
正向引物(10uM)	0.9(每种)
		反向引物(10uM)	0.9(每种)
纯化的连接产物	4.5(每种)
		水	达25

然后如下进行热循环：

最后，用琼脂糖凝胶分析产物。可轻易通过其中间尺寸鉴定非天然联接的产物。具体而言，4G2-VL/9E10-mini-VH和9E10-mini-VL/4G2VH联接的产物各自对应的大小为581bp和568bp。如图4B所示，当在批量再扩增中混合时，观察到天然配对的维持(泳道5)。

实施例5:促进在珠上捕获PCR产物的寡核苷酸的设计

液滴中RT-PCR(例如如上所述)后，可在液滴内将PCR产物捕获到珠上，以保留VH和VL产物的天然匹配。为了促进dsDNA PCR产物有效捕获到珠上，开发了产生在其末端具有确定的ssDNA的产物的策略。该ssDNA的序列与偶联于珠的寡核苷酸序列互补。这些序列的互补性因此实现dsDNA PCR产物的特异性和有效捕获。

用以下引物和Q5DNA聚合酶产生来自4G2cDNA的PCR产物。反向引物含有5’-生物素部分以实现珠上PCR产物的特异性检测。PCR策略如下：

样品/产物	正向引物	反向引物
			(1)(VL)	4G2VL Fwd+PEG	Mus Kap Rev生物素
(2)(VL)	4G2VL Fwd-PEG	Mus Kap Rev生物素
			(3)(VL)	4G2VL Fwd No_5’	Mus Kap Rev生物素
(3)(VH)	4G2VH Fwd生物素	Mus IgG-HC Rev+PEG

采用如下引物：

4G2VL Fwd+PEG

5’-TGGATCGTTACTAATATTCGC/iSp18/GGACTCAGACACTTCCGTGCGACATCAAGATGACCCAGTCTC(SEQ ID NO:10)

4G2VL Fwd-PEG

5’-

TGGATCGTTACTAATATTCGCGGACTCAGACACTTCCGTGCGACATCAAGAT GACCCAGTCTC(SEQID NO:11)

4G2VL Fwd No_5’

5’-GGACTCAGACACTTCCGTGCGACATCAAGATGACCCAGTCTC(SEQ ID NO:12)

Mus Kap Rev生物素

5’-/5生物素TEG/ACCAGCAGAGCTCTCACCTGGTGCAGCATCAGCCC(SEQ ID NO:13)

Mus IgG-HC Rev+PEG

5’-GCAATCCATCAACGTC/iSp18/CGTGACACATGTGGTTCAAGTACGGCHGATGGGGSTGTYGTTKTRGC(SEQ ID NO:14)

4G2VH Fwd生物素

5’-/5生物素TEG/GGAACTACCGAAGGCACAGGTGAGGTCCAGCTGCAACAGTC(SEQ ID NO:15)

琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，用AMPure珠纯化并用Nanodrop定量。

用标准方法将胺标记的捕获寡核苷酸偶联于羧基化珠((COMPEL,BangsLaboratories)。用以下具有与上述PCR引物中的PEG间隔子的5’序列互补的序列的寡核苷酸与珠偶联。珠仅与VL寡核苷酸，仅与VH寡核苷酸，或与两种寡核苷酸偶联。

VL捕获

5’-GCGAATATTAGTAACGATCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA/iSp18//iSp18//iSp18//3AmMO/(SEQ ID NO:16)

VH捕获

5’-GACGTTGATGGATTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA/iSp18//iSp18//i Sp18//3AmMO/(SEQ ID NO:17)

为了捕获PCR产物，建立了以下反应。纯化的PCR产物稀释在0.5X SSC缓冲液中，实现最终25μl体积中含有250ng DNA。用0.5X SSC洗涤寡核苷酸偶联的珠，然后将400,000珠与每种稀释的PCR产物混合。用吸管混合珠-PCR产物混合物，以悬浮珠，然后将试管置于热循环仪中，运行以下程序：

步骤	温度	时间
			1	70℃	30秒
2	55℃	30秒
			3	50℃	30秒
4	45℃	4分钟
			5	40℃	4分钟
6	35℃	4分钟
			7	4℃	保持

样品如下所述：

样品#	珠	PCR产物
			1	空白(无捕获寡核苷酸)	(1)(VL)
2	空白(无捕获寡核苷酸)	(2)(VL)
			3	空白(无捕获寡核苷酸)	(3)(VL)
4	空白(无捕获寡核苷酸)	(4)(VH)
			5	VL捕获	(1)(VL)
6	VL捕获	(2)(VL)
			7	VL捕获	(3)(VL)
8	VL捕获	(4)(VH)
			9	VH捕获	(1)(VL)
10	VH捕获	(4)(VH)
			11	VH和VL捕获	(1)(VL)
12	VH和VL捕获	(4)(VH)

温孵后，样品加到磁铁上以在试管一侧收集珠。除去上清液，用0.5X SSC缓冲液洗涤珠。用50μl AlexaFluor 647IgG片段单克隆小鼠抗-生物素抗体(Jackson)(1:10000稀释于含有1％BSA的PBS)探测各样品中捕获的PCR产物。在室温下混合孵育25分钟后，试管加到磁铁上，除去上清，用PBC缓冲液洗涤珠。珠重悬浮于50μL PBS中，然后用流式细胞计数分析。

如图5A-5B所示，结果证明通过该方法实现的有效且特异性PCR产物捕获，需要在PCR引物中有PEG间隔子和与珠偶联的合适互补的寡核苷酸(例如在样品(1)中)。

实施例6:天然配对的VH-VL产物在液滴中通过连接酶循环产生

在该实施例中，裂解表达抗体4G2的VH和VL序列的细胞，用裂解物的mRNA通过连接酶循环产生天然配对的VH-VL产物。

如下制备细胞裂解缓冲液：

300ul 20％Ficoll PM400

10ul 20％Sarkosyl

40ul 5mM EDTA

100ul 2M Tris pH 7.5

350ul水

200ul 100％Optiprep

羧基化的COMPEL磁珠(Bangs Labs)与如下的胺修饰的寡核苷酸偶联：

VL捕获

VH捕获

Mus_IgG_CH1_mRNA捕获

5’-CTGGACAGGGATCCAKAGTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA/iSp18//iSp18//iSp18//3AmMO/(SEQ ID NO:18)

Mus_Kap_mRNA捕获

5’-GTGCAGCATCAGCCCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA/iSp18//iSp18//i Sp18//3AmMO/(SEQ ID NO:19)

可用寡聚dT进行mRNA捕获(例如用于捕获编码VH和/或VL的mRNA)。

珠以2x10⁷珠/ml悬浮于裂解缓冲液中，其能实现所用的液滴大小的每个液滴中包封约2.5个珠。

用PBS洗涤4G2小鼠杂交瘤细胞，以2x10⁶细胞/ml重悬浮在含有0.1％BSA和24％Optiprep的PBS中。该密度实现以每两滴1个细胞的比例包封入液滴。对于细胞和珠共包封入液滴，使用2-试剂的100μm直径的亲氟微流体芯片(Dolomite)和三个Mitos P－Pump压力泵(Dolomite)控制的溶液流动。微流体芯片含有两个水性溶液的输入通道，两个氟碳油的输入通道。细胞和珠各自以10μl/分钟的速度流动，氟化油(含有1％氟表面活性剂的HFE-7500(RAN Biotechnologies))以55μl/分钟流动。这些流速得到体积约500pl的液滴。收集乳液1小时。

45℃热休克乳液(细胞和无细胞对照)20分钟以使mRNA捕获到珠上。乳液和珠随后在4℃维持并处理，以减少mRNA从珠上解离。用针筒除去过量的油，在乳液中加入5ml含RNA酶抑制剂(1:100)的冰冷的6X SSC缓冲液。将PFO(1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛烷)加到(100μl)乳液中减少液滴聚结。通过倒转然后在500xg4℃离心5分钟充分混合样品。用滴管混合水相，收集并转移到新试管中。试管加到磁铁上后，用500μl含RNA酶抑制剂(1:100)的冰冷缓冲液(100mM Tris HCl pH 8,500mM KCl,15mM MgCl₂)洗涤珠(具有杂交的mRNA)两次。然后将珠悬浮在500μl含有RNA酶抑制剂(1:100)的冰冷缓冲液(100mM Tris HCl pH8，500mMKCl，15mM MgCl₂)中。

用mRNA珠和RT-PCR混合物制备第二乳液。mRNA珠悬浮在RT-PCR珠缓冲液(100μl2X RT-PCR缓冲液(OneTaq One-Step RT-PCR,NEB)，70μl Optiprep，4μl RNA酶抑制剂，6.4μl预混的25μM引物和32μl水)中。使用的引物是：

4G2VL Fwd+PEG

Mus IgG-HC Rev+PEG

小鼠κ_Rev-Phos

5’-/5Phos/ACCAGCAGAGCTCTCACCTGGTGCAGCATCAGCCC(SEQ ID NO:4)

4G2VH Fwd-Phos

5’-/5Phos/GGAACTACCGAAGGCACAGGTGAGGTCCAGCTGCAACAGTC(SEQ ID NO:5)

独立地，制备酶混合物(400ul 2X RT-PCR缓冲液,43ul酶，在RT-PCR缓冲液中稀释到1.33X,16ul RNA酶抑制剂和341ul水)。

使珠和酶混合物以各自2.5μl/分钟和7.5μl/分钟的速度与35μl/分钟的油(含有2％氟表面活性剂的HFE7500)共同流动，产生RT-PCR的乳液。用双试剂30μm直径的亲氟微流体芯片(Dolomite)和压力泵产生液滴。在这些条件下，形成体积为约15-35pl的液滴，珠占有率为5个液滴中少于1个珠。产生液滴，直到所有珠被包封(约30-60分钟)。然后将乳液等分到PCR试管中，在热循环仪中进行热循环，采用以下程序：

将热循环后的乳液合并到一根试管中。用针筒从底部除去过量的油。为了破碎液滴，加入100μl PFO，然后混合并在2000xg离心2分钟。然后用滴管混合水相(悬浮珠)并转移到新试管中。珠含有捕获的PCR产物。将珠加到磁铁上，除去上清液。用500μl冰冷的0.5XSSC缓冲液温和洗涤珠。再将珠加到磁铁上，除去上清，然后重悬浮于100μl冰冷的0.5X SSC缓冲液中。

然后制备样品用于连接酶循环乳液，以共价连接VH和VL产物。将珠悬浮于珠溶液(20μl 10X Taq连接酶缓冲液(NEB),117μl 60％蔗糖,和63μl水)。制备Taq连接酶混合物(80μl 10X Taq连接酶缓冲液,42μl Taq连接酶,13μl夹板寡核苷酸(0.1μM),和665μl水)。使用的夹板寡核苷酸是：

5’-ACCTGTGCCTTCGGTAGTTCCACCAGCAGAGCTCTCACCTG/3AmMO/(SEQ ID NO:6)。

使珠溶液以2μl/分钟流动，酶混合物以6μl/分钟流动，以及油(含有2％氟表面活性剂的HFE7500)以35μl/分钟流动，产生乳液。用双试剂30μm直径的亲氟微流体芯片(Dolomite)和压力泵产生液滴。在这些条件下，形成体积为约15-35pl的液滴，珠占有率为5个液滴中少于1个珠。产生液滴，直到所有珠被包封(约30-60分钟)。然后将乳液等分到PCR试管中，在热循环仪中进行热循环，采用以下程序：

将热循环后的乳液合并到一根试管中。用针筒从底部除去过量的油。为了破碎液滴，加入100μl PFO，然后混合并在2000xg离心2分钟。然后用滴管混合水相(悬浮珠)并转移到PCR试管中(50μl/试管)。然后将样品加到预热到80℃的热循环仪上，以实现杂交到珠上的连接PCR产物解离。珠沉淀后，除去上清并转移到新试管。然后用AMPure珠纯化产物。

然后在试管中用以下引物PCR扩增连接的产物：

4G2-VL-Fwd-Reamp 5’–TGACCCAGTCTCCATCTTCA(SEQ ID NO:23)

4G2-VL-Fwd-Reamp 5’–TGTTGTTTTGGCTGAGGAGA(SEQ ID NO:24)

组分	体积(ul)
		Q5热起始2X主混物	12.5
正向和反向引物(各10uM)	1.25
		纯化的连接产物	2
水	9.25

如下进行热循环：

用琼脂糖凝胶电泳分析再扩增产物。如图6所示，4G2细胞样品得到想要的联接的VH-VL DNA产物，其中阴性对照样品不产生任何产物。

考虑在完整的开放阅读框中包含例如天然配对的VL和VH，在其之间具有柔性连接序列的最终PCR产物可克隆入酵母表面表达载体，并用标准方法转化入酵母，得到天然配对的酵母展示文库。例如，可通过PCR在每个末端掺入额外的50bp。这些50bp匹配酵母表达载体中的合适序列，以实现通过同源重组克隆入酵母，然后酵母共转化以插入PCR产物(例如含有天然联接的VL-VH)和线性酵母表达载体。

实施例7:自退火引物，用以防止来自引物的PCR产物捕获竞争

通过在PCR产物末端掺入间隔子，例如PEG产生粘性末端(ssDNA)实现PCR产物捕获到珠上。这些ssDNA部分具有与珠偶联的寡核苷酸序列互补性，因此能实现特异性杂交。通过引入扩增引物，掺入PCR产物中的序列。由于PCR引物与PCR产物的ssDNA末端具有相同序列，它们彼此也可通过特异性杂交捕获到珠上。这样的引物捕获必然会与PCR产物捕获竞争。

抗体储库的PCR扩增通常需要多个PCR引物来扩增不同的抗体基因序列。例如，识别人和小鼠的V和J区域的引物对的储库通常由针对重链和轻链V区的约15-20个引物组成。对多重引物的需要导致加剧引物对PCR产物捕获到珠上的竞争效应。对于多重PCR的情况，在给定液滴(区室)、单引物(或有限数量)可与目标抗体序列在一个液滴内互补。剩下的储库引物不匹配目标序列。这些非匹配引物不能在PCR过程中掺入扩增子，易于有效与PCR产物捕获竞争。为了克服该缺陷，产生了这样的设计，在液滴内减少未使用的PCR引物与PCR引物竞争捕获的能力。可在15:1摩尔比的未使用引物对产生扩增子的引物的条件下获得PCR产物捕获的设计。

如上所述，用以下胺修饰的寡核苷酸缀合羧基化的磁珠。

VL_捕获

GCGAATATTAGTAACGATCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA/iSp18//iSp18//iSp18//3AmMO/(SEQ ID NO:16)

VH_捕获

GACGTTGATGGATTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA/iSp18//iSp18//iSp18//3AmMO/(SEQID NO:17)

Mus_IgG_CH1_mRNA_capt

CTGGACAGGGATCCAKAGTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA/iSp18//iSp18//iSp18//3AmMO/(SEQ ID NO:18)

Mus_Kap_mRNA_capt

GTGCAGCATCAGCCCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA/iSp18//iSp18//iSp18//3AmMO/(SEQID NO:19)

建立RT-PCR以扩增对应于4G2杂交瘤的VL序列，使用以下寡核苷酸。这些寡核苷酸代表不包括自退火序列(Non-SA)的设计和具有自退火序列(SA)的设计此外，将在5’末端具有自退火序列但具有不匹配4G2VL或VH mRNA序列的3’-末端序列(错配)的寡核苷酸包括作为示范性PCR引物，其在PCR过程中不被消耗，类似于多重储库引物。生物素化反向引物，以促进检测珠上的捕获PCR产物。

4G2_VL_Fwd_Non-SA

错配_VL_Fwd_Non-SA

5’-TGGATCGTTACTAATATTCGC/iSp18/GGACTCAGACACTTCCGTGCATTGTGCTGACGCAAACTGTTA(SEQ ID NO:20)

4G2_VL_Fwd_SA

5’-TGGATCGTTACTAATATTCGC/iSp18/GAATATTAGTAACGATCCAGGACTCGGACCGACATCAAGATGACCCAGTCTC(SEQ ID NO:21)

错配_VL_Fwd_SA

5’-TGGATCGTTACTAATATTCGC/iSp18/GAATATTAGTAACGATCCAGGACTCGGACCATTGTGCTGACGCAAACTGTTA(SEQ ID NO:22)

Mus_κ_Rev_生物素

5’-/5BiotinTEG/ACCAGCAGAGCTCTCACCTGGTGCAGCATCAGCCC(SEQ ID NO:13)

下面显示了自退火(互补)序列。

为了和正向自退火引物(4G2_VL_Fwd_SA)所用的寡核苷酸浓度相竞争，使用以下条件：

为了竞争与Fwd非自退火引物(4G2_VL_Fwd_Non-SA)所用的错配寡苷酸浓度，使用以下条件：

用以下程序热循环样品：

热循环后，用滴管吹打温和混合样品，以悬浮珠。然后将样品至于热循环仪中，使用以下程序使PCR产物捕获到珠上：

步骤	温度	时间
			1	70℃	30秒
2	55℃	4分钟
			3	50℃	4分钟
4	45℃	4分钟
			5	40℃	3分钟
7	4℃	维持

捕获程序后，试管加到磁铁上，回收上清液。用琼脂糖凝胶电泳分析上清液，以确认PCR产物的成功产生。用100μl冰冷的PBSA(含有1％BSA的1X PBS)洗涤具有捕获PCR产物的珠三次，用磁铁吸附珠。然后用100μl 1:500的AlexaFluor64/IgG组分单克隆小鼠抗生物素(Jackson)的PBSA溶液孵育样品，4℃旋转，避光45分钟。孵育后，用100μl冰冷的PBSA洗涤珠三次。最终洗涤后，用100μl冰冷的PBSA重悬浮珠，用流式细胞计数分析AlexaGluo647荧光信号。

测定每个样品的平均荧光强度(MFI)。样品数据作为不存在错配寡核苷酸的MFI的相对MFI百分数作图。如图7A-7B所示，仅自退火引物能在错配引物寡核苷酸对匹配引物寡核苷酸的高比例下防止PCR产物捕获竞争。这些结果显示，特别是通过自退火引物设计，可在15倍更高的未用引物的条件下有效捕获PCR产物，该条件是例如模拟多重抗体储库条件。

通过参考纳入

本文提到的所有出版物、专利和登记号在此通过引用全文纳入本文，如同每个单独的出版物或专利被明确单独指明通过引用纳入。

等同形式

尽管讨论了本发明的具体实施方式，但以上说明书仅为说明性而非限制性的。本领域的技术人员阅读了本说明书和下面权利要求后将清楚了解本发明的许多变化。本发明的全部范围应该通过参考所附权利要求书连同其等同物的全部范围，以及说明书连同此类变化来确定。

Claims

a)获得分离的生产反应位点，包含：

i)重链(HC)链，其中HC链是重链双链cDNA(HC ds cDNA)的链,其包含编码来自细胞的HCVR的HC元件的区段；和

ii)轻链(LC)链，其中LC链是轻链双链cDNA(LC ds cDNA)的链，其包含编码来自细胞的LCVR的LC元件的区段；和

b)共价联接HC链与LC链，

其中分离的生产反应位点不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的HCVR或LCVR的核酸，

从而产生核酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中HC元件包含重链可变区序列(HCVRS)或其抗原结合片段，或由其组成。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中LC元件包含轻链可变区序列(LCVRS)或其抗原结合片段，或由其组成。

4.如权利要求1-3任一所述的方法，其中核酸序列配置成当表达时HC元件和LC元件体外、离体或体内形成功能性抗原结合分子。

5.如权利要求1-4任一所述的方法，其中获得分离的生产反应位点包括

a)获得结合至以下物质的捕获基质：

(i)第一双链cDNA(ds cDNA)，其包含与编码来自细胞的HCVR的第一mRNA互补的链；

ii)第二ds cDNA，其包含与编码来自细胞的LCVR的第二mRNA互补的链，以产生负载的捕获基质，和

b)将分离的生产反应位点维持在允许第一和第二ds cDNA扩增的条件下，以产生：

多个HC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的HCVR的HC元件的区段；和

多个LC ds cDNA，其包含编码来自所述细胞的LCVR的LC元件的区段。

6.如权利要求1-5任一所述的方法，其中捕获基质包含珠和与cDNA结合的部分。

7.如权利要求1-6任一所述的方法，其中分离的生产反应位点包含适于从第一和第二mRNA产生第一ds cDNA和第二ds cDNA的试剂混合物，第一ds cDNA包含编码细胞的HCVR的HC元件的区段，第二ds cDNA包含编码细胞的LCVR的LC元件的区段。

8.如权利要求5-7任一所述的方法，其中在引物存在下扩增第一或第二ds cDNA，其中引物的至少一个包含第一组成部分、第二组成部分和第一与第二组成部分之间的核苷酸修饰，其中核苷酸修饰减少DNA合成。

9.如权利要求8所述的方法，其中核苷酸修饰包含在两个相邻核苷酸之间插入的间隔子或对核糖的修饰。

10.如权利要求8或9所述的方法，其中第一组成部分能够与相同引物或不同引物内的第二组成部分退火，形成双链结构，其包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多碱基对的双链体区域。

11.如权利要求8-10任一所述的方法，其中所述引物中至少一个是磷酸化的，且包含编码接头序列的至少部分的序列或其互补序列。

12.如权利要求1-11任一所述的方法，其中HC ds cDNA包含5’突出端和钝端，且LC dscDNA包含5’突出端和钝端。

13.如权利要求1-12任一所述的方法，其中HC链和LC链共价联接以产生单链核酸序列，其中HC和LC链都是正义链或都是反义链。

14.如权利要求1-13任一所述的方法，其中共价联接在包含连接酶的分离的联接反应位点发生。

15.如权利要求1-14任一所述的方法，其中HC链和LC链在夹板寡核苷酸的存在下共价联接，其中夹板寡核苷酸与包含HC链和LC链接合区的序列杂交，以在联接位点形成双链体区域。

16.如权利要求15所述的方法，其中夹板寡核苷酸包含抑制DNA合成的修饰。

17.如权利要求1-16任一所述的方法，其中还包括在获得分离的生产反应位点前，获得载有mRNA的捕获基质，包含：

a)获得分离的细胞反应位点，包含：

i)细胞；和

b)将分离的细胞反应位点维持在允许细胞裂解和捕获基质与第一mRNA和第二mRNA结合的条件下，以形成载有mRNA的捕获基质，

其中分离的细胞反应位点不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的HCVR或LCVR的核酸。

18.如权利要求17所述的方法，还包括在聚(dA)或聚(dT)寡核苷酸的存在下，从分离的细胞反应位点释放载有mRNA的捕获基质。

19.如权利要求1-18任一所述的方法，其中还包括扩增核酸序列。

20.如权利要求1-19任一所述的方法，其中还包括对全部或部分核酸序列进行测序。

21.如权利要求1-20任一所述的方法，其中还包括将全部或部分核酸序列插入载体。

22.如权利要求1-21任一所述的方法，其中包括表达核酸序列以产生包含编码HCVR的HC元件的区段和编码LCVR的LC元件的区段的多肽。

23.如权利要求22所述的方法，还包括用抗原接触所述多肽，并确定所述多肽是否与所述抗原结合。

24.一种产生包括多个独特组成部分的文库的方法，该方法包括：

用权利要求1-23任一所述的方法产生多个组成部分，

其中每个组成部分包含编码重链可变区(HCVR)的重链元件(HC元件)和轻链可变区(LCVR)的轻链元件(LC元件)的序列，其中HCVR和LCVR匹配，和其中所述多个中的每一个独特核酸序列包含来自不同的独特细胞的HC元件和LC元件，

从而产生文库。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述文库包含以下性质中的1、2、3种或全部：

a)所述多个独特组成部分包括至少10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹个独特组成部分；

b)所述多个独特组成部分包括10⁴至10⁹、10⁴至10⁸、10⁴至10⁷、10⁴至10⁶、10⁴至10⁵、10⁸至10⁹、10⁷至10⁹、10⁶至10⁹、10⁵至10⁹、10⁵至10⁸、10⁶至10⁷、10⁴至10⁵、10⁵至10⁶、10⁶至10⁷、10⁷至10⁸或10⁸至10⁹个独特组成部分；

c)所述文库中至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的组成部分是独特组成部分；或

d)所述文库中少于20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的组成部分是独特组成部分。

26.一种通过权利要求25所述方法制备的文库。

27.如权利要求26所述的文库，其中文库是展示文库。

28.一种制备结合多肽的方法，该方法包括：

a)获得权利要求26或27的文库；和

b)表达由所述文库的独特核酸编码的多肽。

29.如权利要求28所述的方法，还包括用抗原接触多肽，并获得编码与所述抗原结合的多肽的核酸。

30.一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码T细胞受体(TCR)α链可变区(ACVR)的α链元件(AC元件)和TCRβ链可变区(BCVR)的β链元件(BC元件)的序列，其中ACVR和BCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的生产反应位点，其包含：

i)α链(AC)链，其中AC链是α链双链cDNA(AC ds cDNA)的链，其包含编码来自细胞的ACVR的AC元件的区段；和

ii)β链(BC)链，其中BC链是β链双链cDNA(BC ds cDNA)的链，其包含编码来自细胞的BCVR的BC元件的区段；和

b)共价联接AC链与BC链，

其中分离的生产反应位点不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的BCVR或ACVR的核酸，

从而产生核酸序列。

31.如权利要求30所述的方法，其中核酸序列配置成当表达时，AC元件和BC元件形成功能性抗原结合分子。

32.如权利要求31所述的方法，其中共价联接在包含连接酶的分离的联接反应位点发生。

33.一种产生包括多个独特组成部分的文库的方法，该方法包括：

用权利要求30-32任一所述的方法产生多个组成部分，

其中每个组成部分包含编码α链可变区(ACVR)的α链元件(AC元件)和β链可变区(BCVR)的β链元件(BC元件)的序列，其中ACVR和BCVR相匹配，和其中所述多个中的每一个独特核酸序列包含来自不同的独特细胞的AC元件和BC元件，

从而产生文库。

34.一种通过权利要求33所述方法制备的文库。

35.一种制备结合多肽的方法，该方法包括：

a)获得权利要求34所述的文库，和

b)表达由所述文库的独特核酸编码的多肽。

36.一种制备核酸序列的方法，该核酸序列包含编码TCRγ链可变区(GCVR)的γ链元件(GC元件)和TCRδ链可变区(DCVR)的δ链元件(DC元件)的序列，其中GCVR和DCVR相匹配，该方法包括：

a)获得分离的生产反应位点，其包含：

i)γ链(GC)链，其中GC链是γ链双链cDNA(GC ds cDNA)的链，其包含编码来自细胞的GCVR的GC元件的区段；和

ii)δ链(DC)链，其中DC链是δ链双链cDNA(DC ds cDNA)的链，其包含编码来自细胞的DCVR的DC元件的区段；和

b)共价联接GC链与DC链，

其中分离的生产反应位点不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的DCVR或GCVR的核酸，

从而产生核酸序列。

37.如权利要求36所述的方法，其中核酸序列配置成当表达时，GC元件和DC元件形成功能性抗原结合分子。

38.如权利要求36或37所述的方法，其中共价联接在包含连接酶的分离的联接反应位点发生。

39.一种产生包括多个独特组成部分的文库的方法，该方法包括：

用权利要求36-38任一所述的方法产生多个组成部分，

其中每个组成部分包含编码γ链可变区(GCVR)的γ链元件(GC元件)和δ链可变区(DCVR)的δ链元件(DC元件)的序列，其中GCVR和DCVR相匹配，和其中所述多个中的每一个独特核酸序列包含来自不同的独特细胞的GC元件和DC元件，

从而产生文库。

40.一种通过权利要求39所述方法制备的文库。

41.一种制备结合多肽的方法，该方法包括：

a)获得权利要求40所述的文库，和

b)表达由所述文库的独特核酸编码的多肽。

42.分离的生产反应位点，其包含：

a)重链(HC)链，其中HC链是包含编码来自细胞的HCVR的HC元件的区段的重链双链cDNA(HC ds cDNA)的链；和

b)轻链(LC)链，其中LC链是包含编码来自细胞的LCVR的LC元件的区段的轻链双链cDNA(LC ds cDNA)的链；和

c)引物，其包含第一组成部分、第二组成部分和第一与第二组成部分之间的核苷酸修饰，其中所述核苷酸修饰减少DNA合成，

其中HCVR和LCVR匹配，其中分离的生产反应位点不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的LCVR或HCVR的核酸。

43.如权利要求42所述的分离的生产反应位点，其中第一组成部分能够与相同引物或不同引物内的第二组成部分退火形成双链结构，其包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多碱基对的双链体区域。.

44.一种自退火寡核苷酸，其包含第一组成部分、第二组成部分和位于第一组成部分和第二组成部分之间的间隔子，其中第一组成部分能与相同寡核苷酸或不同寡核苷酸中的第二组成部分退火，形成发夹结构或双链结构，其含有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多碱基对的双链体区域。

45.如权利要求44所述的寡核苷酸，其中，间隔子是柔性间隔子或PEG间隔子。

46.分离的联接反应位点，其包含：

c)夹板寡核苷酸，其能与包含HC链和LC链接合区的序列杂交，以在联接位点形成双链体区域，

其中HCVR和LCVR匹配，其中HC链和LC链共价联接，并且其中分离的联接反应位点不包括编码来自除了该细胞以外的细胞的HCVR或LCVR的核酸。

47.如权利要求46所述的分离的联接反应位点，还包括连接酶。