KR20190111036A

KR20190111036A - 결합 폴리펩타이드 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20190111036A
Application number: KR1020197021677A
Authority: KR
Inventors: 재커리 슈라이버; 그레고리 배브콕; 루크 로빈슨
Original assignee: 비스테라, 인크.
Priority date: 2016-12-23
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2019-10-01
Also published as: US11820979B2; MX2019007356A; BR112019013096A2; IL267565A; CN110366557B; CL2019001757A1; US20240141334A1; JP2020511117A; AU2017382367A1; WO2018119402A1; RU2019123063A3; RU2019123063A; EP3559028A1; CO2019006663A2; JP2023169422A; MY201744A; JP7360324B2; CN110366557A; CA3045696A1; US20180201926A1

Abstract

폴리펩타이드, 예컨대, 항체 분자 및 TCR 분자, 및 이를 제조하는 방법이 개시되어 있다. 상기 폴리펩타이드는 장애를 치료하고/하거나, 예방하고/하거나 진단하는 데 사용될 수 있다.

Description

결합 폴리펩타이드 및 이의 제조 방법

관련 출원의 교차참조

본원은 2016년 12월 23일에 출원된 미국 가출원 제62/438,712호의 이익을 주장하다. 상기 출원의 내용은 전체로서 본원에 참고로 도입된다.

단일클론 항체 요법은 질환 관련 생물학적 분자와 특이적으로 상호작용할 수 있는 단일클론 항체(mAb)를 사용하는 면역요법의 한 부류이다. 최근에, 치료 항체가 표적일 수 있는 질환 영역이 상당히 확장되었고, 다수의 단일클론 항체들 및 항체 유도체 생성물들이 미국 및 많은 다른 국가들에서 치료적 사용을 위해 승인받았다. 단일클론 항체 요법은 예를 들면, 감염성 질환, 암, 면역 질환, 장기 이식, 심혈관 질환 및 대사 질환을 비롯한 다양한 질환들 또는 상태들을 치료하기 위해 현재 사용되고 있거나 연구되고 있다.

다양한 생물학적 기능을 조절하는 단일클론 항체 및 항체 유도체 생성물의 능력에 비추어 볼 때, 장애를 치료하고 예방하고 진단하는 데 적합한 항체를 생성하는 신규 방법을 개발할 필요성이 있다.

본 개시는 적어도 부분적으로 본원에 개시된 구조적 또는 기능적 특성들 중 하나 이상의 특성을 포함하는 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 T 세포 수용체(TCR) 분자)를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 결합 폴리펩타이드의 라이브러리, 상기 폴리펩타이드 또는 라이브러리의 제조 방법, 상기 결합 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포, 조성물(예를 들면, 약학 조성물), 키트 및 용기도 제공된다. 본원에 개시된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)는 장애, 예컨대, 본원에 개시된 장애 및 상태를 치료하고/하거나, 예방하고/하거나 진단하는 데 (단독으로, 또는 다른 물질 또는 치료법과 함께) 사용될 수 있다.

한 양태에서, 본 개시는 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고,

a) i) 세포로부터의 HCVR의 HC 요소, 예를 들면, 중쇄 가변 영역 서열(HCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 중쇄 이중 가닥 cDNA(HC ds cDNA)의 가닥인 중쇄(HC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 LCVR의 LC 요소, 예를 들면, 경쇄 가변 영역 서열(LCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 경쇄 이중 가닥 cDNA(LC ds cDNA)의 가닥인 경쇄(LC) 가닥을 포함하는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

b) HC 가닥을 LC 가닥에 공유결합시킴으로써, 예를 들면, 라이게이션시킴으로써, HCVR의 HC 요소 및 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계

를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포, 예를 들면, 상이한 B 세포)로부터의 HCVR 또는 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않고, HCVR과 LCVR은 매칭되는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, HC 요소는 HCVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 구성된다. 한 실시양태에서, LC 요소는 LCVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 구성된다.

한 실시양태에서, HC ds cDNA는 HCVRS를 코딩하는 분절을 포함한다. 한 실시양태에서, LC ds cDNA는 LCVRS를 코딩하는 분절을 포함한다. 한 실시양태에서, HC ds cDNA는 HCVRS를 코딩하는 분절을 포함하고, LC ds cDNA는 LCVRS를 코딩하는 분절을 포함한다.

한 실시양태에서, 세포는 면역 세포, 예를 들면, B 세포, 예를 들면, 인간 B 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포 또는 조류 세포이다.

한 실시양태에서, 핵산 서열은, 발현될 때, HC 요소와 LC 요소(예를 들면, HCVRS와 LCVRS)가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, scFv, Fab 또는 scFab를 형성하도록 구성된다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자, 예를 들면, scFv는 본원에 기재된 방법 또는 어세이에 의해 확인될 때 시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서 기능을 한다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계는

a) (i) 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA); 및 (ii) 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA에 결합된 포획 기재(capture substrate)(cDNA가 로딩된 포획 기재)를 획득하는 단계, 및

b) 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA의 증폭을 허용하는 조건 하에서 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 유지하여, 세포로부터의 HCVR의 HC 요소, 예를 들면, HCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 HC ds cDNA; 및 세포로부터의 LCVR의 LC 요소, 예를 들면, LCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 LC ds cDNA를 생성하는 단계

를 포함한다.

한 실시양태에서, HC ds cDNA는 제1 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일하다. 예를 들면, HC ds cDNA의 센스 가닥은 제1 ds cDNA의 센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하고/하거나, HC ds cDNA의 안티센스 가닥은 제1 ds cDNA의 안티센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하다.

한 실시양태에서, LC ds cDNA는 제2 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일하다. 예를 들면, LC ds cDNA의 센스 가닥은 제2 ds cDNA의 센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하고/하거나, LC ds cDNA의 안티센스 가닥은 제2 ds cDNA의 안티센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하다.

한 실시양태에서, HC 가닥은 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, LC 가닥은 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, HC 가닥은 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, LC 가닥은 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, HC 가닥 및 LC 가닥 둘 다가 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, HC 가닥 및 LC 가닥 둘 다가 안티센스 가닥이다.

한 실시양태에서, 포획 기재는 비드, 예를 들면, 자성 비드를 포함한다. 한 실시양태에서, 포획 기재는 cDNA에 결합하는 모이어티(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드), 예를 들면, (i) HC 가닥에 결합하는 모이어티; (ii) LC 가닥에 결합하는 모이어티; 또는 (iii) (i) 및 (ii) 둘 다를 포함한다. 한 실시양태에서, HC 가닥에 결합하는 모이어티는 예를 들면, 유사한 수준의 각각의 DNA 분자 유형을 포획하기에 유리한 조건의 생성을 용이하게 하기 위해 LC 가닥에 결합하는 모이어티와 상이하다. 한 실시양태에서, HC 가닥에 결합하는 모이어티는 LC 가닥에 결합하는 모이어티와 동일하다.

한 실시양태에서, 제1 mRNA 및 제2 mRNA는 mRNA가 로딩된 포획 기재에 배치된다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 (예를 들면, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 mRNA가 로딩된 포획 기재로부터 용액으로 유리된 후) 세포의 HCVR의 HC 요소, 예를 들면, HCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제1 ds cDNA, 및 세포의 LCVR의 LC 요소, 예를 들면, LCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제2 ds cDNA를 제1 mRNA 및 제2 mRNA로부터 생성하기에 적합한 시약 혼합물을 포함한다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 제1 ds cDNA의 생성을 매개하는 프라이머를 포함한다. 한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 제2 ds cDNA의 생성을 매개하는 프라이머를 포함한다.

한 실시양태에서, 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥은 제1 mRNA의 역전사에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥은 제2 mRNA의 역전사에 의해 제조된다.

한 실시양태에서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버에서 일어난다. 한 실시양태에서, 역전사는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버에서 일어난다. 한 실시양태에서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버의 외부, 또는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버의 외부에서 일어난다. 한 실시양태에서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버의 외부, 및 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버의 외부에서 일어난다. 한 실시양태에서, 역전사는 분리된 반응 부위의 외부, 예를 들면, 마이크로챔버의 외부에서 일어난다.

한 실시양태에서, 증폭은 30 이하의 사이클, 예를 들면, 20 이하의 사이클, 예를 들면, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하 또는 5 이하의 사이클을 포함한다.

한 실시양태에서, 역전사 및/또는 증폭은 예를 들면, HCVRS 및/또는 LCVRS에 특이적인 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머를 사용한다.

한 실시양태에서, 역전사 및/또는 증폭은 HC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 증폭은 LC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 적어도 하나의 프라이머는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 감소시키는, 예를 들면, 억제하는 뉴클레오타이드 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 프라이머는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 감소시키는, 예를 들면, 억제하는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 뉴클레오타이드 변형은 DNA 중합효소가 DNA를 연장하지 못하게 한다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 한 실시양태에서, DNA 중합효소 연장을 감소시키는(예를 들면, 차단하는) 임의의 화학적 독립체(entity)가 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있다고 생각된다.

한 실시양태에서, 뉴클레오타이드 변형은 스페이서를 프라이머, 예를 들면, 프라이머의 2개의 인접 뉴클레오타이드들 사이에 삽입하는 것이다. 한 실시양태에서, 스페이서는 플렉시블 스페이서이다. 한 실시양태에서, 스페이서는 탄소 스페이서(예를 들면, -(CH2)n-, 이 때 n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상), 2개 이상(예를 들면, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상)의 무염기 뉴클레오타이드, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 스페이서이다. 한 실시양태에서, 스페이서는 PEG 스페이서이다. 한 실시양태에서, 뉴클레오타이드 변형은 예를 들면, 리보스에 대한 2'-O-메틸, 2'-OH, 2'-NH₂ 또는 우라실 변형이다.

한 실시양태에서, 뉴클레오타이드 변형은 프라이머의 내부 또는 3' 말단에 위치한다. 한 실시양태에서, 적어도 하나의 프라이머는 (i) 제1 구성원; (ii) 제2 구성원; 및 임의적으로 (iii) 예를 들면, (i)과 (ii) 사이에 위치하는, 예를 들면, 본원에 기재된 뉴클레오타이드 변형을 포함하는 제3 구성원을 포함한다.

한 실시양태에서, 제1 구성원은 제2 구성원과 어닐링할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 구성원은 예를 들면, 분자내 하이브리드화를 통해 동일한 프라이머 내의 제2 구성원과 어닐링하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 구성원은 예를 들면, 분자간 하이브리드화를 통해 상이한 프라이머 내의 제2 구성원과 어닐링 하이브리드화하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 이중 가닥 구조를 형성할 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 한 실시양태에서, 변형된 프라이머에 의해 형성될 수 있고 기재(예를 들면, 비드) 포획에 대한 경쟁의 감소(예를 들면, 방해)를 용이하게 할 수 있는 적어도 2개의 이차 구조들이 존재한다고 생각된다. 예를 들면, 상기 이차 구조는 (동일한 프라이머 내에서) 분자내 하이브리드화에 의해 형성된 헤어핀 유사 구조일 수 있거나, 상기 이차 구조는 (2개의 상이한 프라이머 사이에) 분자간 하이브리드화에 의해 형성된 이중체 구조일 수 있다.

한 실시양태에서, 제1 구성원은 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, HCVRS 및/또는 LCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함한다. 한 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 상이하다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서) 상동성 재조합을 위한 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 적어도 하나의 프라이머는 링커 서열의 적어도 일부를 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 링커 서열의 적어도 일부를 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 프라이머는 인산화, 예를 들면, 5' 인산화된다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 한 실시양태에서, 일반적인 성질인 유연성 및 친수성(예를 들면, 글리신에 의해 용이해짐)을 갖는 임의의 서열이 본원에 기재된 방법에 따라 효과적으로 작동할 수 있다고 생각된다. 예시적 링커는 일반적으로 Gly, Ser, Thr 또는 Ala 중 하나 이상의 과다표시, 및 소수성 잔기, 예를 들면, Trp, Tyr, Phe, Cys, Met, Leu 또는 Ile 중 하나 이상의 과소표시를 가질 수 있다. 프라이머의 길이는 상이할 수 있고, 예를 들면, 3개 내지 50개 아미노산 잔기(예를 들면, 5개 내지 45개, 10개 내지 40개, 15개 내지 35개, 20개 내지 30개, 10개 내지 20개, 10개 내지 30개, 20개 내지 40개, 또는 30개 내지 40개 아미노산 잔기)일 수 있다. 한 실시양태에서, 링커 서열은 ((Gly)m-Ser))n을 포함하거나 이것으로 구성되고, 이 때 m은 3, 4 또는 5 이상이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상이다. 한 실시양태에서, 링커 서열은 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하거나 이것으로 구성되고, 이 때 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상이다.

한 실시양태에서, 프라이머는 본원, 예를 들면, 실시예에 기재된 프라이머이다.

한 실시양태에서, 역전사, 증폭 또는 이들 둘 다는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버 내의 용액에서 일어난다. 한 실시양태에서, 역전사, 증폭 또는 이들 둘 다는 기재(예를 들면, 비드)에서 일어나지 않는다. 예를 들면, 역전사, 증폭 또는 이들 둘 다는 소적 내의 용액에서 일어날 수 있다.

한 실시양태에서, HC ds cDNA는 5' 오버행(overhang), 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함한다. 한 실시양태에서, HC ds cDNA는 블런트(blunt) 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함한다. 한 실시양태에서, LC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함한다. 한 실시양태에서, LC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함한다. 한 실시양태에서, HC ds cDNA 및 LC ds cDNA는 점착성(sticky) 말단을 포함하고, 예를 들면, 이들 둘 다가 5' 오버행을 가진다.

한 실시양태에서, HC 가닥과 LC 가닥은 공유결합되어, 예를 들면, 라이게이션되어 단일 가닥 핵산 서열을 생성하고, 이 때 HC 가닥 및 LC 가닥은 둘 다 센스 가닥, 또는 둘 다 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, HC ds cDNA의 변성된 HC 가닥과 LC ds cDNA의 변성된 LC 가닥은 공유결합되고, 예를 들면, 라이게이션되고, 이 때 HC 가닥 및 LC 가닥은 둘 다 센스 가닥, 또는 둘 다 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, HC 가닥은 HC ds cDNA에 존재하고, LC 가닥은 LC ds cDNA에 존재하고, 이 때 HC ds cDNA와 LC ds cDNA는 공유결합되어, 예를 들면, 라이게이션되어, 예를 들면, 이중 가닥 핵산 서열을 생성한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위에서 일어난다. 한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버, 또는 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 HC 가닥과 LC 가닥, 또는 HC ds cDNA와 LC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함한다. 한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 HC 가닥과 LC 가닥, 또는 HC ds cDNA와 LC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 효소는 리가제(ligase), 예를 들면, 열안정성 리가제이다. 한 실시양태에서, 공유결합은 리가제 써모사이클링을 포함한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위와 상이한 부위에서 일어나고, 예를 들면, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어난다. 한 실시양태에서, HC 가닥 및 LC 가닥은 분리된 생성 부위로부터 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버로 옮겨지고, 공유결합은 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어난다. 한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 HC 가닥과 LC 가닥, 또는 HC ds cDNA와 LC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함한다. 한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 HC 가닥과 LC 가닥, 또는 HC ds cDNA와 LC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 효소는 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제이다. 한 실시양태에서, 공유결합은 리가제 써모사이클링을 포함한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 (a) HC 가닥 및 LC 가닥의 변성을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 95℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 가열하는 단계; (b) 스플린트(splint) 올리고뉴클레오타이드와 HC 가닥 및 LC 가닥의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 50℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 냉각시키는 단계; (c) HC 가닥과 LC 가닥의 라이게이션(예를 들면, HC 가닥과 LC 가닥 사이의 포스포디에스테르 결합의 형성)을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 45℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 유지하는 단계; 및 (d) 단계 (a), (b) 및 (c)를 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 이상의 사이클 동안 순차적으로 반복하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, HC 가닥과 LC 가닥은 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 공유결합, 예를 들면, 라이게이션된다. 한 실시양태에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 HC 가닥과 LC 가닥의 연접부(junction)를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화되고, 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성한다. 한 실시양태에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 억제하는 변형(예를 들면, NH₂ 기)을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 변형은 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 있다.

한 실시양태에서, 공유결합된, 예를 들면, 라이게이션된 HC 가닥과 LC 가닥에 상보적인 가닥은 증폭에 의해 생성된다.

한 실시양태에서, 방법, 예를 들면, 공유결합 단계는 중첩 연장에 의한 스플라이싱 또는 오버행 연장에 의한 스플라이싱(SOE) PCR로서도 공지되어 있는 중첩 연장 중합효소 연쇄 반응(OE-PCR) 단계를 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 방법은 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 얻기 전에 mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계는 a) i) 세포 및 ii) 상기 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및 b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버는 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 HCVR 또는 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버는 용해 시약, 예를 들면, 세제를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포는 열 또는 효소에 의해 용해된다. 한 실시양태에서, 포획 기재는 mRNA에 결합하는 모이어티(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드), 예를 들면, 올리고(dT)를 포함한다.

한 실시양태에서, 방법은 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버로부터 mRNA가 로딩된 포획 기재를 유리시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 유리 단계는 예를 들면, 포획되지 않은 mRNA의 교차결합을 감소시키기 위해 폴리(dA) 또는 폴리(dT) 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 수행된다.

한 실시양태에서, mRNA가 로딩된 포획 기재는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버로부터 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버로 옮겨진다.

한 실시양태에서, 방법은 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버로부터 핵산 서열을 유리시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산 서열의 증폭은 예를 들면, 핵산이 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버로부터 유리된 후 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버의 외부에서 일어난다. 한 실시양태에서, 핵산 서열의 증폭은 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버에서 일어난다.

한 실시양태에서, 방법은 핵산 서열의 전부 또는 일부를 시퀀싱하는 단계도 포함한다.

한 실시양태에서, 방법은 핵산 서열의 전부 또는 일부를 벡터 내로 삽입하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 핵산 서열에 포함되지 않은 추가 HC 요소 또는 LC 요소를 공급한다. 한 실시양태에서, 벡터는 HC CDR1, HC CDR2 또는 이들 둘 다를 공급한다. 한 실시양태에서, 방법은 벡터를 발현시키는 단계도 포함한다.

한 실시양태에서, 방법은 핵산 서열을 발현시켜, HCVR의 HC 요소, 예를 들면, HCVRS를 코딩하는 분절 및 LCVR의 LC 요소, 예를 들면, LCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, LC 요소는 폴리펩타이드에서 HC 요소의 N-말단에 있다. 한 실시양태에서, HC 요소는 폴리펩타이드에서 LC 요소의 C-말단에 있다.

한 실시양태에서, 방법은 폴리펩타이드를 항원과 접촉시키는 단계도 포함한다. 한 실시양태에서, 방법은 예를 들면, 본원에 기재된 방법 또는 어세이로 시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서 폴리펩타이드가 항원에 결합하는지를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.

a) i) 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포) 및 (ii) 상기 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재(예를 들면, 본원에 기재된 포획 기재)를 포함하는 분리된 세포 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 세포 반응 부위), 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계로서, 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 HCVR 또는 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

c) mRNA가 로딩된 포획 기재를, 로딩된 mRNA를 주형으로서 사용하는 반응 혼합물, 예를 들면, 역전사효소를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시켜 cDNA를 제조하는 단계(이것은 예를 들면, 분리된 세포 반응 부위 또는 분리된 생성 반응 부위에서 일어날 수 있거나, 이들 중 어느 부위에서도 일어나지 않을 수 있음, 예를 들면, 분리된 반응 부위에서 일어나지 않을 수 있음);

d) i) 세포로부터의 HCVR의 HC 요소, 예를 들면, 중쇄 가변 영역 서열(HCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 중쇄 이중 가닥 cDNA(HC ds cDNA)의 가닥인 중쇄(HC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 LCVR의 LC 요소, 예를 들면, 경쇄 가변 영역 서열(LCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 경쇄 이중 가닥 cDNA(LC ds cDNA)의 가닥인 경쇄(LC) 가닥을 포함하고 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 LCVR 또는 HCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위), 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

e) HC 가닥을 LC 가닥과 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 단계

를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 단계 a) 내지 e) 중 하나 이상의 단계(예를 들면, 2개, 3개, 4개 또는 모든 단계)는 본원에 기재된 방법에 따라 수행된다. 한 실시양태에서, 단계 a) 내지 e) 각각은 본원에 기재된 방법에 따라 수행된다.

a) i) 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포) 및 ii) 상기 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재(예를 들면, 본원에 기재된 포획 기재)를 포함하는 분리된 세포 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 세포 반응 부위), 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

c) mRNA가 로딩된 포획 기재를, 로딩된 mRNA를 주형으로서 사용하는 반응 혼합물, 예를 들면, 역전사효소를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시켜, 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA), 및 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA(cDNA 로딩된 포획 기재)를 생성하는 단계를 포함하는, 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위), 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 LCVR 또는 HCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

d) 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA의 증폭을 허용하는 조건 하에서 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 유지하여, 세포로부터의 HCVR의 HC 요소, 예를 들면, HCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 HC ds cDNA, 및 세포로부터의 LCVR의 LC 요소, 예를 들면, LCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 LC ds cDNA를 생성하는 단계;

e) HC ds cDNA의 가닥(HC 가닥)을 LC ds cDNA의 가닥(LC 가닥)에 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 단계를 포함하는, 분리된 결합 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 결합 반응 부위), 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 HC 가닥 및 LC 가닥 둘 다가 센스 가닥 또는 안티센스 가닥인 단계; 및

f) 공유결합된, 예를 들면, 라이게이션된 HC 가닥 및 LC 가닥을 증폭시키는 단계

를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 단계 a) 내지 f) 중 하나 이상의 단계(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모든 단계)는 본원에 기재된 방법에 따라 수행된다. 한 실시양태에서, 단계 a) 내지 f) 각각은 본원에 기재된 방법에 따라 수행된다.

한 양태에서, 본 개시는 복수의 특유한(unique) 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 의해 복수의 구성원들을 제조함으로써 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하고, 각각의 구성원이 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하고, HCVR과 LCVR은 매칭되고, 상기 복수의 특유한 구성원들의 각각의 특유한 핵산 서열이 상이한 특유한 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포)로부터의 HC 요소 및 LC 요소를 포함하는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 복수의 특유한 구성원들은 적어도 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개 또는 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함한다. 한 실시양태에서, 복수의 특유한 구성원들은 10⁴개 내지 10⁹개, 10⁴개 내지 10⁸개, 10⁴개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁶개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁸개 내지 10⁹개, 10⁷개 내지 10⁹개, 10⁶개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁸개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁵개 내지 10⁶개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁷개 내지 10⁸개, 또는 10⁸개 내지 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함한다. 한 실시양태에서, 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 구성원은 (매칭된 HC 요소 및 LC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다. 한 실시양태에서, 라이브러리에서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 HC 요소 및 LC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다.

한 양태에서, 본 개시는 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리로서,

i) 상기 복수의 특유한 구성원들 각각이 HC 요소, 예를 들면, HCVRS를 코딩하는 분절 및 LC 요소, 예를 들면, LCVRS를 코딩하는 분절을 포함하고, 이 때 각각의 특유한 구성원에서 HC 요소와 LC 요소가 매칭되고;

ii) 복수의 특유한 구성원들 각각이 상이한 특유한 세포로부터의 HC 요소, 예를 들면, HCVRS를 코딩하는 분절 및 LC 요소, 예를 들면, LCVRS를 코딩하는 분절을 포함하고;

iii) 하기 특성들 중 하나 이상의 특성(예를 들면, 2개, 3개, 4개 또는 전부)을 포함하는 라이브러리

를 특징으로 한다:

a) 상기 라이브러리는 본원에 기재된 방법에 의해 제조되거나;

b) 복수의 특유한 구성원들은 적어도 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개 또는 10⁹개의 특유한 핵산 서열들을 포함하거나;

c) 복수의 특유한 구성원들은 10⁴개 내지 10⁹개, 10⁴개 내지 10⁸개, 10⁴개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁶개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁸개 내지 10⁹개, 10⁷개 내지 10⁹개, 10⁶개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁸개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁵개 내지 10⁶개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁷개 내지 10⁸개, 또는 10⁸개 내지 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함하거나;

d) 상기 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 구성원은 (매칭된 HC 요소 및 LC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이거나;

e) 상기 라이브러리에서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 HC 요소 및 LC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다.

한 실시양태에서, 복수의 특유한 구성원들 각각은, 발현될 때, HC 요소, 예를 들면, HCVRS, 및 LC 요소, 예를 들면, LCVRS가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, scFv, Fab 또는 scFab를 형성하도록 구성된다.

한 실시양태에서, 라이브러리는 디스플레이 라이브러리이다. 한 실시양태에서, 복수의 구성원들 각각은 구성원을 디스플레이 독립체의 표면 위에 디스플레이하는 폴리펩타이드를 추가로 코딩한다. 한 실시양태에서, 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리이다. 한 실시양태에서, 라이브러리는 효모 디스플레이 라이브러리이다. 한 실시양태에서, 라이브러리는 포유동물 디스플레이 라이브러리이다.

한 양태에서, 본 개시는 결합 폴리펩타이드(예를 들면, HC 요소 및 LC 요소를 포함하는 폴리펩타이드)를 제조하는 방법으로서, a) 예를 들면, 본원에 기재된 방법에 의해 본원에 기재된 라이브러리를 획득하는 단계; 및 b) 상기 라이브러리의 특유한 핵산에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 폴리펩타이드를 항원과 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 항원에 결합하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 회수하는(예를 들면, 단리하거나 정제하는) 단계도 포함한다.

한 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, HCVR을 코딩하는 핵산 및 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하고, 이 때 HCVR과 LCVR은 매칭됨)인 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 상이한 세포로부터의 HCVR 또는 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 (i) HC 및 LC의 V 유전자 서열에 특이적인 하나 이상의 프라이머; (ii) HC cDNA 및 LC cDNA에 도입된 오버행에 특이적인 하나 이상의 프라이머; 또는 (iii) 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 변형(예를 들면, 스페이서)을 포함하는 제3 구성원을 포함하는 하나 이상의 프라이머 중 하나, 둘 또는 전부를 포함하고, 이 때 제1 구성원은 동일한 프라이머 또는 상이한 프라이머의 제2 구성원과 어닐링하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 구조를 형성할 수 있다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 핵산을 공유결합시킬 수 있는 시약, 예를 들면, 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 핵산을 공유결합시킬 수 있는 시약, 예를 들면, 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제를 포함한다.

한 양태에서, 본 개시는 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 변형(예를 들면, 스페이서)을 포함하는 제3 구성원을 포함하는 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드로서, 제1 구성원이 동일한 올리고뉴클레오타이드의 제2 구성원과 어닐링할 수 있는 것인 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드를 특징으로 한다(예를 들면, HCVR의 HC 요소 및 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되는 것인 방법의 경우).

한 실시양태에서, 제1 구성원과 제2 구성원은 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 구성원은 길이가 5개 내지 40개 뉴클레오타이드, 예를 들면, 5개 내지 10개, 5개 내지 20개, 5개 내지 30개, 30개 내지 40개, 20개 내지 40개, 10개 내지 30개, 10개 내지 30개, 또는 15개 내지 25개 뉴클레오타이드이다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 길이가 5개 내지 40개 뉴클레오타이드, 예를 들면, 5개 내지 10개, 5개 내지 20개, 5개 내지 30개, 30개 내지 40개, 20개 내지 40개, 10개 내지 30개, 10개 내지 30개, 또는 15개 내지 25개 뉴클레오타이드이다.

한 실시양태에서, 스페이서는 본원에 기재된 스페이서, 예를 들면, 플렉시블 스페이서 또는 PEG 스페이서이다.

한 실시양태에서, 제1 구성원은 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, HCVRS 및/또는 LCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함한다. 한 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 상이하다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서의) 상동 재조합을 위한 서열을 포함한다.

한 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 분리된 결합 반응 부위(예를 들면, HCVR을 코딩하는 핵산 및 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하고, 이 때 HCVR과 LCVR은 매칭됨)인 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 상이한 세포로부터의 HCVR 또는 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 HC 가닥과 LC 가닥의 연접부를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화하여 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성할 수 있는 스플린트 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 본원에 기재된 스플린트 올리고뉴클레오타이드)를 포함한다.

한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 핵산들을 공유결합시킬 수 있는 시약, 예를 들면, 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제를 포함한다.

한 양태에서, 본 개시는 TCR α 쇄 가변 영역(ACVR)의 α 쇄 요소(AC 요소) 및 TCR β 쇄 가변 영역(BCVR)의 β 쇄 요소(BC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, ACVR과 BCVR은 매칭되고,

a) i) 세포로부터의 ACVR의 AC 요소, 예를 들면, α 쇄 가변 영역 서열(ACVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 α 쇄 이중 가닥 cDNA(AC ds cDNA)의 가닥인 α 쇄(AC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 BCVR의 BC 요소, 예를 들면, β 쇄 가변 영역 서열(BCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 β 쇄 ds cDNA(BC ds cDNA)의 가닥인 β 쇄(BC) 가닥을 포함하는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

b) 제1 가닥과 제2 가닥을 공유결합시킴으로써, 예를 들면, 라이게이션시킴으로써, ACVR의 AC 요소 및 BCVR의 BC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계

를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포, 예를 들면, 상이한 T 세포)로부터의 ACVR 또는 BCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않고, ACVR과 BCVR이 매칭되는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, AC 요소는 ACVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 구성된다. 한 실시양태에서, BC 요소는 BCVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 구성된다.

한 실시양태에서, AC ds cDNA는 ACVRS를 코딩하는 분절을 포함한다. 한 실시양태에서, BC ds cDNA는 BCVRS를 코딩하는 분절을 포함한다. 한 실시양태에서, AC ds cDNA는 ACVRS를 코딩하는 분절을 포함하고, BC ds cDNA는 BCVRS를 코딩하는 분절을 포함한다.

한 실시양태에서, 세포는 면역 세포, 예를 들면, T 세포, 예를 들면, 인간 T 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포 또는 조류 세포이다.

한 실시양태에서, 핵산 서열은, 발현될 때, AC 요소와 BC 요소(예를 들면, ACVRS와 BCVRS)가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, 단일 쇄, 또는 TCR α 쇄와 β 쇄의 복합체를 형성하도록 구성된다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자, 예를 들면, TCR α 쇄 및/또는 β 쇄는 예를 들면, 본원에 기재된 방법 또는 어세이에 의해 확인될 때 시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서 기능을 한다.

a) (i) 세포로부터의 ACVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA), 및 (ii) 세포로부터의 BCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA에 결합된 포획 기재(cDNA 로딩된 포획 기재)를 획득하는 단계; 및

b) 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA의 증폭을 허용하는 조건 하에서 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 유지하여, 세포로부터의 ACVR의 AC 요소, 예를 들면, ACVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 AC ds cDNA, 및 세포로부터의 BCVR의 BC 요소, 예를 들면, BCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 BC ds cDNA를 생성하는 단계

를 포함한다.

한 실시양태에서, AC ds cDNA는 제1 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일하다. 예를 들면, AC ds cDNA의 센스 가닥은 제1 ds cDNA의 센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하고/하거나, AC ds cDNA의 안티센스 가닥은 제1 ds cDNA의 안티센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하다.

한 실시양태에서, BC ds cDNA는 제2 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일하다. 예를 들면, BC ds cDNA의 센스 가닥은 제2 ds cDNA의 센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하고/하거나, BC ds cDNA의 안티센스 가닥은 제2 ds cDNA의 안티센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하다.

한 실시양태에서, AC 가닥은 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, BC 가닥은 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, AC 가닥은 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, BC 가닥은 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, AC 가닥 및 BC 가닥 둘 다가 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, AC 가닥 및 BC 가닥 둘 다가 안티센스 가닥이다.

한 실시양태에서, 포획 기재는 비드, 예를 들면, 자성 비드를 포함한다. 한 실시양태에서, 포획 기재는 cDNA에 결합하는 모이어티(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드), 예를 들면, (i) AC 가닥에 결합하는 모이어티; (ii) BC 가닥에 결합하는 모이어티; 또는 (iii) (i) 및 (ii) 둘 다를 포함한다. 한 실시양태에서, AC 가닥에 결합하는 모이어티는 예를 들면, 유사한 수준의 각각의 DNA 분자 유형을 포획하기에 유리한 조건의 생성을 용이하게 하기 위해 BC 가닥에 결합하는 모이어티와 상이하다. 한 실시양태에서, AC 가닥에 결합하는 모이어티는 BC 가닥에 결합하는 모이어티와 동일하다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 (예를 들면, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 로딩된 mRNA 포획 기재로부터 용액으로 유리된 후) 세포의 ACVR의 AC 요소, 예를 들면, ACVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제1 cDNA, 및 세포의 BCVR의 BC 요소, 예를 들면, BCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제2 cDNA를 제1 mRNA 및 제2 mRNA로부터 생성하기에 적합한 시약 혼합물을 포함한다.

한 실시양태에서, 세포로부터의 ACVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥은 제1 mRNA의 역전사에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 세포로부터의 BCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥은 제2 mRNA의 역전사에 의해 제조된다.

한 실시양태에서, 증폭은 20 이하의 사이클, 예를 들면, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하 또는 5 이하의 사이클을 포함한다.

한 실시양태에서, 역전사 및/또는 증폭은 예를 들면, ACVRS 및/또는 BCVRS에 특이적인 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머를 사용한다.

한 실시양태에서, 역전사 및/또는 증폭은 AC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 증폭은 BC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 뉴클레오타이드 변형은 DNA 중합효소가 DNA를 연장하지 못하게 한다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 한 실시양태에서, DNA 중합효소 연장을 감소시키는(예를 들면, 차단하는) 임의의 화학적 독립체가 본원에 기재된 방법에 따라 사용될 수 있다고 생각된다.

한 실시양태에서, 제1 구성원은 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, ACVRS 및/또는 BCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함한다. 한 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 상이하다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서의) 상동 재조합을 위한 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 적어도 하나의 프라이머는 링커 서열의 적어도 일부를 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 링커 서열의 적어도 일부를 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 프라이머는 인산화, 예를 들면, 5' 인산화된다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 한 실시양태에서, 일반적인 특성인 유연성 및 친수성(예를 들면, 글리신에 의해 용이해짐)을 갖는 임의의 서열이 본원에 기재된 방법에 따라 효과적으로 작동할 수 있다고 생각된다. 예시적 링커는 일반적으로 Gly, Ser, Thr 또는 Ala 중 하나 이상의 과다표시, 및 소수성 잔기, 예를 들면, Trp, Tyr, Phe, Cys, Met, Leu 또는 Ile 중 하나 이상의 과소표시를 가질 수 있다. 프라이머의 길이는 상이할 수 있고, 예를 들면, 3개 내지 50개 아미노산 잔기(예를 들면, 5개 내지 45개, 10개 내지 40개, 15개 내지 35개, 20개 내지 30개, 10개 내지 20개, 10개 내지 30개, 20개 내지 40개, 또는 30개 내지 40개 아미노산 잔기)일 수 있다. 한 실시양태에서, 링커 서열은 ((Gly)m-Ser))n을 포함하거나 이것으로 구성되고, 이 때 m은 3, 4 또는 5 이상이고, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상이다. 한 실시양태에서, 링커 서열은 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하거나 이것으로 구성되고, 이 때 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 이상이다.

한 실시양태에서, AC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함한다. 한 실시양태에서, AC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함한다. 한 실시양태에서, BC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함한다. 한 실시양태에서, BC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함한다. 한 실시양태에서, AC ds cDNA 및 BC ds cDNA는 점착성 말단을 포함하고, 예를 들면, 이들 둘 다가 5' 오버행을 가진다.

한 실시양태에서, AC 가닥과 BC 가닥은 공유결합되어, 예를 들면, 라이게이션되어 단일 가닥 핵산 서열을 생성하고, 이 때 AC 가닥 및 BC 가닥은 둘 다 센스 가닥, 또는 둘 다 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, AC ds cDNA의 변성된 AC 가닥과 BC ds cDNA의 변성된 BC 가닥은 공유결합되고, 예를 들면, 라이게이션되고, 이 때 AC 가닥 및 BC 가닥은 둘 다 센스 가닥, 또는 둘 다 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, AC 가닥은 AC ds cDNA에 존재하고, BC 가닥은 BC ds cDNA에 존재하고, 이 때 AC ds cDNA와 BC ds cDNA는 공유결합되어, 예를 들면, 라이게이션되어, 예를 들면, 이중 가닥 핵산 서열을 생성한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위에서 일어난다. 한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버, 또는 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 AC 가닥과 BC 가닥, 또는 AC ds cDNA와 BC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함한다. 한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 AC 가닥과 BC 가닥, 또는 AC ds cDNA와 BC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 효소는 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제이다. 한 실시양태에서, 공유결합은 리가제 써모사이클링을 포함한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위와 상이한 부위에서 일어나고, 예를 들면, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어난다. 한 실시양태에서, AC 가닥 및 BC 가닥은 분리된 생성 부위로부터 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버로 옮겨지고, 공유결합은 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어난다. 한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 AC 가닥과 BC 가닥, 또는 AC ds cDNA와 BC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함한다. 한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 AC 가닥과 BC 가닥, 또는 AC ds cDNA와 BC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 효소는 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제이다. 한 실시양태에서, 공유결합은 리가제 써모사이클링을 포함한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 (a) AC 가닥 및 BC 가닥의 변성을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 95℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 가열하는 단계; (b) 스플린트 올리고뉴클레오타이드와 AC 가닥 및 BC 가닥의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 50℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 냉각시키는 단계; (c) AC 가닥과 BC 가닥의 라이게이션(예를 들면, AC 가닥과 BC 가닥 사이의 포스포디에스테르 결합의 형성)을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 45℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 유지하는 단계; 및 (d) 단계 (a), (b) 및 (c)를 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 이상의 사이클 동안 순차적으로 반복하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, AC 가닥과 BC 가닥은 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 공유결합, 예를 들면, 라이게이션된다. 한 실시양태에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 AC 가닥과 BC 가닥의 연접부를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화되고, 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성한다. 한 실시양태에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 억제하는 변형(예를 들면, NH₂ 기)을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형은 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 있다.

한 실시양태에서, 공유결합된, 예를 들면, 라이게이션된 AC 가닥과 BC 가닥에 상보적인 가닥은 증폭에 의해 생성된다.

한 실시양태에서, mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계는 a) i) 세포 및 ii) 상기 세포로부터의 ACVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 BCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및 b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버는 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 ACVR 또는 BCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 방법은 핵산 서열의 전부 또는 일부를 벡터 내로 삽입하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 핵산 서열에 포함되지 않은 추가 AC 요소 또는 BC 요소를 공급한다. 한 실시양태에서, 방법은 벡터를 발현시키는 단계도 포함한다.

한 실시양태에서, 방법은 핵산 서열을 발현시켜, ACVR의 AC 요소, 예를 들면, ACVRS를 코딩하는 분절 및 BCVR의 BC 요소, 예를 들면, BCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, BC 요소는 폴리펩타이드에서 AC 요소의 N-말단에 있다. 한 실시양태에서, AC 요소는 폴리펩타이드에서 BC 요소의 C-말단에 있다.

한 실시양태에서, 본 개시는 TCR α 쇄 가변 영역(ACVR)의 TCR α 쇄 요소(AC 요소) 및 TCR β 쇄 가변 영역(BCVR)의 TCR β 쇄 요소(BC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, ACVR과 BCVR은 매칭되고,

a) i) 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포) 및 (ii) 상기 세포로부터의 ACVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 BCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재(예를 들면, 본원에 기재된 포획 기재)를 포함하는 분리된 세포 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 세포 반응 부위), 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계로서, 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 ACVR 또는 BCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

d) i) 세포로부터의 ACVR의 AC 요소, 예를 들면, TCR α 쇄 가변 영역 서열(ACVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 TCR α 쇄 이중 가닥 cDNA(AC ds cDNA)의 가닥인 TCR α 쇄(AC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 BCVR의 BC 요소, 예를 들면, TCR β 쇄 가변 영역 서열(BCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 TCR β 쇄 이중 가닥 cDNA(BC ds cDNA)의 가닥인 TCR β 쇄(BC) 가닥을 포함하는 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위), 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 ACVR 또는 BCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계; 및

e) AC 가닥을 BC 가닥과 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 단계

를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 TCR α 쇄 가변 영역(ACVR)의 TCR α 쇄 요소(AC 요소) 및 TCR β 쇄 가변 영역(BCVR)의 TCR β 쇄 요소(BC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, ACVR과 BCVR은 매칭되고,

a) i) 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포) 및 ii) 상기 세포로부터의 ACVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 BCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재(예를 들면, 본원에 기재된 포획 기재)를 포함하는 분리된 세포 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 세포 반응 부위), 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

c) mRNA가 로딩된 포획 기재를, 로딩된 mRNA를 주형으로서 사용하는 반응 혼합물, 예를 들면, 역전사효소를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시켜, 세포로부터의 ACVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA), 및 세포로부터의 BCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA(cDNA 로딩된 포획 기재)를 생성하는 단계를 포함하는, 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위), 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 ACVR 또는 BCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

d) 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA의 증폭을 허용하는 조건 하에서 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 유지하여, 세포로부터의 ACVR의 AC 요소, 예를 들면, ACVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 AC ds cDNA, 및 세포로부터의 BCVR의 BC 요소, 예를 들면, BCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 BC ds cDNA를 생성하는 단계;

e) AC ds cDNA의 가닥(AC 가닥)을 BC ds cDNA의 가닥(BC 가닥)에 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 단계를 포함하는, 분리된 결합 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 결합 반응 부위), 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 AC 가닥 및 BC 가닥 둘 다가 센스 가닥 또는 안티센스 가닥인 단계; 및

f) 공유결합된, 예를 들면, 라이게이션된 AC 가닥 및 BC 가닥을 증폭시키는 단계

를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 의해 복수의 구성원들을 제조함으로써 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하고, 각각의 구성원이 TCR α 쇄 가변 영역(ACVR)의 TCR α 쇄 요소(AC 요소) 및 TCR β 쇄 가변 영역(BCVR)의 TCR β 쇄 요소(BC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하고, ACVR과 BCVR은 매칭되고, 상기 복수의 특유한 구성원들의 각각의 특유한 핵산 서열이 상이한 특유한 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포)로부터의 AC 요소 및 BC 요소를 포함하는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 복수의 특유한 구성원들은 적어도 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개 또는 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 복수의 특유한 구성원들은 10⁴개 내지 10⁹개, 10⁴개 내지 10⁸개, 10⁴개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁶개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁸개 내지 10⁹개, 10⁷개 내지 10⁹개, 10⁶개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁸개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁵개 내지 10⁶개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁷개 내지 10⁸개, 또는 10⁸개 내지 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함한다. 한 실시양태에서, 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 구성원은 (매칭된 AC 요소 및 BC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다. 한 실시양태에서, 라이브러리에서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 AC 요소 및 BC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다.

i) 상기 복수의 특유한 구성원들 각각이 AC 요소, 예를 들면, ACVRS를 코딩하는 분절 및 BC 요소, 예를 들면, BCVRS를 코딩하는 분절을 포함하고, 이 때 각각의 특유한 구성원에서 AC 요소와 BC 요소가 매칭되고;

ii) 복수의 특유한 구성원들 각각이 상이한 특유한 세포로부터의 AC 요소, 예를 들면, ACVRS를 코딩하는 분절 및 BC 요소, 예를 들면, BCVRS를 코딩하는 분절을 포함하고;

를 특징으로 한다:

d) 상기 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 구성원은 (매칭된 AC 요소 및 BC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이거나;

e) 상기 라이브러리에서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 AC 요소 및 BC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다.

한 실시양태에서, 복수의 특유한 구성원들 각각은, 발현될 때, AC 요소, 예를 들면, ACVRS, 및 BC 요소, 예를 들면, BCVRS가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, 단일 쇄, 또는 TCR α 쇄와 β 쇄의 복합체를 형성하도록 구성된다.

한 양태에서, 본 개시는 결합 폴리펩타이드(예를 들면, AC 요소 및 BC 요소를 포함하는 폴리펩타이드)를 제조하는 방법으로서, a) 예를 들면, 본원에 기재된 방법에 의해 본원에 기재된 라이브러리를 획득하는 단계; 및 b) 상기 라이브러리의 특유한 핵산에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, ACVR을 코딩하는 핵산 및 BCVR을 코딩하는 핵산을 포함하고, 이 때 ACVR과 BCVR이 매칭됨)인 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 상이한 세포로부터의 ACVR 또는 BCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 (i) AC 및 BC의 V 유전자 서열에 특이적인 하나 이상의 프라이머; (ii) AC cDNA 및 BC cDNA에 도입된 오버행에 특이적인 하나 이상의 프라이머; 또는 (iii) 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 변형(예를 들면, 스페이서)을 포함하는 제3 구성원을 포함하는 하나 이상의 프라이머 중 하나, 둘 또는 전부를 포함하고, 이 때 제1 구성원은 동일한 프라이머 또는 상이한 프라이머의 제2 구성원과 어닐링하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 구조를 형성한다.

한 양태에서, 본 개시는 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 변형(예를 들면, 스페이서)을 포함하는 제3 구성원을 포함하는 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드로서, 제1 구성원이 동일한 올리고뉴클레오타이드의 제2 구성원과 어닐링할 수 있는 것인 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드를 특징으로 한다(예를 들면, ACVR의 AC 요소 및 BCVR의 BC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, ACVR과 BCVR이 매칭되는 것인 방법의 경우).

한 실시양태에서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, ACVRS 및/또는 BCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함한다. 한 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 상이하다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서의) 상동 재조합을 위한 서열을 포함한다.

한 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 분리된 결합 반응 부위(예를 들면, ACVR을 코딩하는 핵산 및 BCVR을 코딩하는 핵산을 포함하고, 이 때 ACVR과 BCVR이 매칭됨)인 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 상이한 세포로부터의 ACVR 또는 BCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 AC 가닥과 BC 가닥의 연접부를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화하여 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성할 수 있는 스플린트 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 본원에 기재된 스플린트 올리고뉴클레오타이드)를 포함한다.

한 양태에서, 본 개시는 TCR γ 쇄 가변 영역(GCVR)의 γ 쇄 요소(GC 요소) 및 TCR δ 쇄 가변 영역(DCVR)의 δ 쇄 요소(DC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, GCVR과 DCVR이 매칭되고,

a) i) 세포로부터의 GCVR의 GC 요소, 예를 들면, γ 쇄 가변 영역 서열(GCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 γ 쇄 이중 가닥 cDNA(GC ds cDNA)의 가닥인 γ 쇄(GC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 DCVR의 DC 요소, 예를 들면, δ 쇄 가변 영역 서열(DCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 δ 쇄 ds cDNA(DC ds cDNA)의 가닥인 δ 쇄(DC) 가닥을 포함하는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

b) 제1 가닥과 제2 가닥을 공유결합시킴으로써, 예를 들면, 라이게이션시킴으로써, GCVR의 GC 요소 및 DCVR의 DC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계

를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포, 예를 들면, 상이한 T 세포)로부터의 GCVR 또는 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않고, GCVR과 DCVR이 매칭되는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, GC 요소는 GCVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 구성된다. 한 실시양태에서, DC 요소는 DCVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 구성된다.

한 실시양태에서, GC ds cDNA는 GCVRS를 코딩하는 분절을 포함한다. 한 실시양태에서, DC ds cDNA는 DCVRS를 코딩하는 분절을 포함한다. 한 실시양태에서, GC ds cDNA는 GCVRS를 코딩하는 분절을 포함하고, DC ds cDNA는 DCVRS를 코딩하는 분절을 포함한다.

한 실시양태에서, 핵산 서열은, 발현될 때, GC 요소와 DC 요소(예를 들면, GCVRS와 DCVRS)가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, 단일 쇄, 또는 TCR γ 쇄와 δ 쇄의 복합체를 형성하도록 구성된다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자, 예를 들면, TCR γ 쇄 및/또는 δ 쇄는 예를 들면, 본원에 기재된 방법 또는 어세이에 의해 확인될 때 시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서 기능을 한다.

a) (i) 세포로부터의 GCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA), 및 (ii) 세포로부터의 DCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA에 결합된 포획 기재(cDNA 로딩된 포획 기재)를 획득하는 단계; 및

b) 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA의 증폭을 허용하는 조건 하에서 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 유지하여, 세포로부터의 GCVR의 GC 요소, 예를 들면, GCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 GC ds cDNA, 및 세포로부터의 DCVR의 DC 요소, 예를 들면, DCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 DC ds cDNA를 생성하는 단계

를 포함한다.

한 실시양태에서, GC ds cDNA는 제1 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일하다. 예를 들면, GC ds cDNA의 센스 가닥은 제1 ds cDNA의 센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하고/하거나, GC ds cDNA의 안티센스 가닥은 제1 ds cDNA의 안티센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하다.

한 실시양태에서, DC ds cDNA는 제2 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일하다. 예를 들면, DC ds cDNA의 센스 가닥은 제2 ds cDNA의 센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하고/하거나, DC ds cDNA의 안티센스 가닥은 제2 ds cDNA의 안티센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하다.

한 실시양태에서, GC 가닥은 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, DC 가닥은 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, GC 가닥은 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, DC 가닥은 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, GC 가닥 및 DC 가닥 둘 다가 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, GC 가닥 및 DC 가닥 둘 다가 안티센스 가닥이다.

한 실시양태에서, 포획 기재는 비드, 예를 들면, 자성 비드를 포함한다. 한 실시양태에서, 포획 기재는 cDNA에 결합하는 모이어티(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드), 예를 들면, (i) GC 가닥에 결합하는 모이어티; (ii) DC 가닥에 결합하는 모이어티; 또는 (iii) (i) 및 (ii) 둘 다를 포함한다. 한 실시양태에서, GC 가닥에 결합하는 모이어티는 예를 들면, 유사한 수준의 각각의 DNA 분자 유형을 포획하기에 유리한 조건의 생성을 용이하게 하기 위해 DC 가닥에 결합하는 모이어티와 상이하다. 한 실시양태에서, GC 가닥에 결합하는 모이어티는 DC 가닥에 결합하는 모이어티와 동일하다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 (예를 들면, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 mRNA가 로딩된 포획 기재로부터 용액으로 유리된 후) 세포의 GCVR의 GC 요소, 예를 들면, GCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제1 cDNA, 및 세포의 DCVR의 DC 요소, 예를 들면, DCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제2 cDNA를 제1 mRNA 및 제2 mRNA로부터 생성하기에 적합한 시약 혼합물을 포함한다.

한 실시양태에서, 세포로부터의 GCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥은 제1 mRNA의 역전사에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 세포로부터의 DCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥은 제2 mRNA의 역전사에 의해 제조된다.

한 실시양태에서, 역전사 및/또는 증폭은 예를 들면, GCVRS 및/또는 DCVRS에 특이적인 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머를 사용한다.

한 실시양태에서, 역전사 및/또는 증폭은 GC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 증폭은 DC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 제1 구성원은 제2 구성원과 어닐링할 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 구성원은 예를 들면, 분자내 하이브리드화를 통해 동일한 프라이머 내의 제2 구성원과 어닐링하여, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 구성원은 예를 들면, 분자간 하이브리드화를 통해 상이한 프라이머 내의 제2 구성원과 어닐링 하이브리드화하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 이중 가닥 구조를 형성할 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 한 실시양태에서, 변형된 프라이머에 의해 형성될 수 있고 기재(예를 들면, 비드) 포획에 대한 경쟁의 감소(예를 들면, 방해)를 용이하게 할 수 있는 적어도 2개의 이차 구조들이 존재한다고 생각된다. 예를 들면, 상기 이차 구조는 (동일한 프라이머 내에서) 분자내 하이브리드화에 의해 형성된 헤어핀 유사 구조일 수 있거나, 상기 이차 구조는 (2개의 상이한 프라이머 사이에) 분자간 하이브리드화에 의해 형성된 이중체 구조일 수 있다.

한 실시양태에서, 제1 구성원은 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, GCVRS 및/또는 DCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함한다. 한 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 상이하다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서의) 상동 재조합을 위한 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, GC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함한다. 한 실시양태에서, GC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함한다. 한 실시양태에서, DC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함한다. 한 실시양태에서, DC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함한다. 한 실시양태에서, GC ds cDNA 및 DC ds cDNA는 점착성 말단을 포함하고, 예를 들면, 이들 둘 다가 5' 오버행을 가진다.

한 실시양태에서, GC 가닥과 DC 가닥은 공유결합되어, 예를 들면, 라이게이션되어 단일 가닥 핵산 서열을 생성하고, 이 때 GC 가닥 및 DC 가닥은 둘 다 센스 가닥, 또는 둘 다 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, GC ds cDNA의 변성된 GC 가닥과 DC ds cDNA의 변성된 DC 가닥은 공유결합되고, 예를 들면, 라이게이션되고, 이 때 GC 가닥 및 DC 가닥은 둘 다 센스 가닥, 또는 둘 다 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, GC 가닥은 GC ds cDNA에 존재하고, DC 가닥은 DC ds cDNA에 존재하고, 이 때 GC ds cDNA와 DC ds cDNA는 공유결합되어, 예를 들면, 라이게이션되어, 예를 들면, 이중 가닥 핵산 서열을 생성한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위에서 일어난다. 한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버, 또는 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 GC 가닥과 DC 가닥, 또는 GC ds cDNA와 DC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함한다. 한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 GC 가닥과 DC 가닥, 또는 GC ds cDNA와 DC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 효소는 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제이다. 한 실시양태에서, 공유결합은 리가제 써모사이클링을 포함한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위와 상이한 부위에서 일어나고, 예를 들면, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어난다. 한 실시양태에서, GC 가닥 및 DC 가닥은 분리된 생성 부위로부터 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버로 옮겨지고, 공유결합은 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어난다. 한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 GC 가닥과 DC 가닥, 또는 GC ds cDNA와 DC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함한다. 한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 GC 가닥과 DC 가닥, 또는 GC ds cDNA와 DC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 효소는 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제이다. 한 실시양태에서, 공유결합은 리가제 써모사이클링을 포함한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 (a) GC 가닥 및 DC 가닥의 변성을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 95℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 가열하는 단계; (b) 스플린트 올리고뉴클레오타이드와 GC 가닥 및 DC 가닥의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 50℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 냉각시키는 단계; (c) GC 가닥과 DC 가닥의 라이게이션(예를 들면, GC 가닥과 DC 가닥 사이의 포스포디에스테르 결합의 형성)을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 45℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 유지하는 단계; 및 (d) 단계 (a), (b) 및 (c)를 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 이상의 사이클 동안 순차적으로 반복하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, GC 가닥과 DC 가닥은 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 공유결합, 예를 들면, 라이게이션된다. 한 실시양태에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 GC 가닥과 DC 가닥의 연접부를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화되고, 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성한다. 한 실시양태에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 억제하는 변형(예를 들면, NH₂ 기)을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형은 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 있다.

한 실시양태에서, 공유결합된, 예를 들면, 라이게이션된 GC 가닥과 DC 가닥에 상보적인 가닥은 증폭에 의해 생성된다.

한 실시양태에서, mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계는 a) i) 세포 및 ii) 상기 세포로부터의 GCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 DCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및 b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버는 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 GCVR 또는 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 방법은 핵산 서열의 전부 또는 일부를 벡터 내로 삽입하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 핵산 서열에 포함되지 않은 추가 GC 요소 또는 DC 요소를 공급한다. 한 실시양태에서, 방법은 벡터를 발현시키는 단계도 포함한다.

한 실시양태에서, 방법은 핵산 서열을 발현시켜, GCVR의 GC 요소, 예를 들면, GCVRS를 코딩하는 분절 및 DCVR의 DC 요소, 예를 들면, DCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, DC 요소는 폴리펩타이드에서 GC 요소의 N-말단에 있다. 한 실시양태에서, GC 요소는 폴리펩타이드에서 DC 요소의 C-말단에 있다.

한 실시양태에서, 본 개시는 TCR γ 쇄 가변 영역(GCVR)의 TCR γ 쇄 요소(GC 요소) 및 TCR δ 쇄 가변 영역(DCVR)의 TCR δ 쇄 요소(DC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, GCVR과 DCVR이 매칭되고,

a) i) 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포) 및 (ii) 상기 세포로부터의 GCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 DCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재(예를 들면, 본원에 기재된 포획 기재)를 포함하는 분리된 세포 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 세포 반응 부위), 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계로서, 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 GCVR 또는 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

d) i) 세포로부터의 GCVR의 GC 요소, 예를 들면, TCR γ 쇄 가변 영역 서열(GCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 TCR γ 쇄 이중 가닥 cDNA(GC ds cDNA)의 가닥인 TCR γ 쇄(GC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 DCVR의 DC 요소, 예를 들면, TCR δ 쇄 가변 영역 서열(DCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 TCR δ 쇄 이중 가닥 cDNA(DC ds cDNA)의 가닥인 TCR δ 쇄(DC) 가닥을 포함하고 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 GCVR 또는 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위), 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

e) GC 가닥을 DC 가닥과 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 단계

를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 TCR γ 쇄 가변 영역(GCVR)의 TCR γ 쇄 요소(GC 요소) 및 TCR δ 쇄 가변 영역(DCVR)의 TCR δ 쇄 요소(DC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, GCVR과 DCVR이 매칭되고,

a) i) 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포) 및 ii) 상기 세포로부터의 GCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 DCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재(예를 들면, 본원에 기재된 포획 기재)를 포함하는 분리된 세포 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 세포 반응 부위), 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

c) mRNA가 로딩된 포획 기재를, 로딩된 mRNA를 주형으로서 사용하는 반응 혼합물, 예를 들면, 역전사효소를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시켜, 세포로부터의 GCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA), 및 세포로부터의 DCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA(cDNA 로딩된 포획 기재)를 생성하는 단계를 포함하는, 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위), 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 GCVR 또는 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

d) 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA의 증폭을 허용하는 조건 하에서 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 유지하여, 세포로부터의 GCVR의 GC 요소, 예를 들면, GCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 GC ds cDNA, 및 세포로부터의 DCVR의 DC 요소, 예를 들면, DCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 DC ds cDNA를 생성하는 단계;

e) GC ds cDNA의 가닥(GC 가닥)을 DC ds cDNA의 가닥(DC 가닥)에 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 단계를 포함하는, 분리된 결합 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 결합 반응 부위), 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 GC 가닥 및 DC 가닥 둘 다가 센스 가닥 또는 안티센스 가닥인 단계; 및

f) 공유결합된, 예를 들면, 라이게이션된 GC 가닥 및 DC 가닥을 증폭시키는 단계

를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 의해 복수의 구성원들을 제조함으로써 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하고, 각각의 구성원이 TCR γ 쇄 가변 영역(GCVR)의 TCR γ 쇄 요소(GC 요소) 및 TCR δ 쇄 가변 영역(DCVR)의 TCR δ 쇄 요소(DC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하고, GCVR과 DCVR이 매칭되고, 상기 복수의 특유한 구성원들의 각각의 특유한 핵산 서열이 상이한 특유한 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포)로부터의 GC 요소 및 DC 요소를 포함하는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 상기 복수의 특유한 구성원들은 적어도 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개 또는 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 복수의 특유한 구성원들은 10⁴개 내지 10⁹개, 10⁴개 내지 10⁸개, 10⁴개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁶개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁸개 내지 10⁹개, 10⁷개 내지 10⁹개, 10⁶개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁸개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁵개 내지 10⁶개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁷개 내지 10⁸개, 또는 10⁸개 내지 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함한다. 한 실시양태에서, 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 구성원은 (매칭된 GC 요소 및 DC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다. 한 실시양태에서, 라이브러리에서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 GC 요소 및 DC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다.

i) 상기 복수의 특유한 구성원들 각각이 GC 요소, 예를 들면, GCVRS를 코딩하는 분절 및 DC 요소, 예를 들면, DCVRS를 코딩하는 분절을 포함하고, 이 때 각각의 특유한 구성원에서 GC 요소와 DC 요소가 매칭되고;

ii) 복수의 특유한 구성원들 각각이 상이한 특유한 세포로부터의 GC 요소, 예를 들면, GCVRS를 코딩하는 분절 및 DC 요소, 예를 들면, DCVRS를 코딩하는 분절을 포함하고;

iii) 하기 특성들 중 하나 이상의 특성을 포함하는 라이브러리

를 특징으로 한다:

d) 상기 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 구성원은 (매칭된 GC 요소 및 DC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이거나;

e) 상기 라이브러리에서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 GC 요소 및 DC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다.

한 실시양태에서, 복수의 특유한 구성원들 각각은, 발현될 때, GC 요소, 예를 들면, GCVRS, 및 DC 요소, 예를 들면, DCVRS가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, 단일 쇄, 또는 TCR γ 쇄와 δ 쇄의 복합체를 형성하도록 구성된다.

한 양태에서, 본 개시는 결합 폴리펩타이드(예를 들면, GC 요소 및 DC 요소를 포함하는 폴리펩타이드)를 제조하는 방법으로서, a) 예를 들면, 본원에 기재된 방법에 의해 본원에 기재된 라이브러리를 획득하는 단계; 및 b) 상기 라이브러리의 특유한 핵산에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, GCVR을 코딩하는 핵산 및 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하고, 이 때 GCVR과 DCVR이 매칭됨)인 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 상이한 세포로부터의 GCVR 또는 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 (i) GC 및 DC의 V 유전자 서열에 특이적인 하나 이상의 프라이머; (ii) GC cDNA 및 DC cDNA에 도입된 오버행에 특이적인 하나 이상의 프라이머; 또는 (iii) 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 변형(예를 들면, 스페이서)을 포함하는 제3 구성원을 포함하는 하나 이상의 프라이머 중 하나, 둘 또는 전부를 포함하고, 이 때 제1 구성원은 동일한 프라이머 또는 상이한 프라이머의 제2 구성원과 어닐링하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 구조를 형성할 수 있다.

한 양태에서, 본 개시는 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 변형(예를 들면, 스페이서)을 포함하는 제3 구성원을 포함하는 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드로서, 제1 구성원이 동일한 올리고뉴클레오타이드의 제2 구성원과 어닐링할 수 있는 것인 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드를 특징으로 한다(예를 들면, GCVR의 GC 요소 및 DCVR의 DC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, GCVR과 DCVR이 매칭되는 것인 방법의 경우).

한 실시양태에서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, GCVRS 및/또는 DCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함한다. 한 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 상이하다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서의) 상동 재조합을 위한 서열을 포함한다.

한 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 분리된 결합 반응 부위(예를 들면, GCVR을 코딩하는 핵산 및 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하고, 이 때 GCVR과 DCVR이 매칭됨)인 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 상이한 세포로부터의 GCVR 또는 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 GC 가닥과 DC 가닥의 연접부를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화하여 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성할 수 있는 스플린트 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 본원에 기재된 스플린트 올리고뉴클레오타이드)를 포함한다.

도 1은 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 다수의 방식들을 묘사하고, 이 때 HCVR과 LCVR은 매칭된다. A1, B1 및 C2 상자는 분리된 반응 부위, 특히 분리된 세포 반응 부위에서 일어나는 단계들을 표시한다. C3, D1, D2, D3, D4, D5 및 D6 상자는 분리된 반응 부위, 특히 분리된 생성 반응 부위에서 일어나는 단계들을 표시한다. E1, E2 및 E3 상자는 분리된 반응 부위, 특히 분리된 결합 반응 부위에서 일어나는 단계들을 표시한다. C1 상자는 분리된 반응 부위에서 일어날 필요가 없는 단계를 표시한다. 본문에서 논의된 바와 같이, 분리된 반응 부위는 매칭되지 않은 HC 및 LC 요소를 야기할 핵산을 갖지 않는다.
도 2a 내지 2d는 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제조하는 예시적 방법을 보여주는 일련의 도식이고, 이 때 HCVR과 LCVR은 매칭된다. 도 2a에서, 세포(예를 들면, 면역 세포, 예컨대, B 세포)를 용해시키고, HCVR 및 매칭된 LCVR을 코딩하는 mRNA를 비드에 포획한다. 도 2b에서, 포획된 mRNA를 역전사에 이은 DNA 중합효소에 의한 증폭(PCR)으로 cDNA로 전환시켜, 매칭된 쌍의 HCVR 및 LCVR cDNA를 포함하는 cDNA 비드를 생성한다. 역전사 반응 및/또는 DNA 중합효소 증폭을 위해 자가 어닐링 프라이머(예를 들면, 제1 구성원, 및 제1 구성원에 하이브리드화할 수 있는 제2 구성원을 포함하고 HCVR 또는 LCVR 서열에 하이브리드화할 수 있는 서열을 추가로 포함하는 프라이머로서, 제1 구성원과 제2 구성원이 스페이서, 예를 들면, PEG 스페이서에 의해 분리된 것인 프라이머)를 사용할 수 있다. 도 2c에서, 각각의 LCVR 또는 HCVR 서열의 말단(예를 들면, LCVR의 3' 말단 및 HCVR의 5' 말단)에 하이브리드화할 수 있는 서열을 포함하는 스플린트 올리고를 사용함으로써 매칭된 쌍의 LCVR과 HCVR이 함께 존재하는 리가제 사이클링 반응을 이용하여 매칭된 LCVR 및 HCVR cDNA 생성물을 융합시킬 수 있다. 도 2d에서, 융합된 LCVR/HCVR 생성물을 예를 들면, PCR로 증폭할 수 있다.
도 3은 Taq 리가제 및 Ampligase 열안정성 리가제(Amp; Lucigen)가 VH 생성물과 VL 생성물을 효율적으로 연결할 수 있다는 것을 보여주는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 영상이다.
도 4a 및 4b는 항체 4G2 및 9E10 각각에 대한 천연적으로 페어링된 연결된 VH + VL 생성물이 리가제 사이클링에 의해 성공적으로 생성되었다는 것을 보여주는 겔 전기영동 영상이다. 도 4a에서, 리가제 사이클링 생성물의 변성 PAGE는 리가제 함유 반응이 4G2 및 9E10 각각에 대한 연결된 VH + VL 생성물뿐만 아니라 개별 VH 및 VL 폴리뉴클레오타이드도 제공하였다는 것을 보여주었다. 연결된 VH + VL 생성물은 리가제를 결여하는 반응에서 검출되지 않았다. 도 4b에서, 벌크 PCR 재증폭 생성물의 아가로스 겔 전기영동은 4G2 및 9E10에 대한 VH-VL 연결된 폴리뉴클레오타이드가 PCR 반응에서 혼합되었을 때 천연 페어링이 유지되었다는 것을 보여주었다.
도 5a 및 5b는 자가 어닐링 프라이머를 사용한 효율적인 특이적 PCR 생성물 포획을 보여주는 그래프 및 도식이다. 도 5a에서, (1) 스페이서를 포함하고 비드의 올리고에 상보적인 5' 서열 및 VL 주형 서열에 상보적인 3' 서열을 갖는 VL 프라이머, (2) 스페이서를 결여하고 비드의 올리고에 상보적인 5' 서열 및 VL 주형 서열에 상보적인 3' 서열을 갖는 VL 프라이머, (3) 비드의 올리고에 상보적인 5' 서열 및 VL 주형 서열에 상보적인 3' 서열을 결여하는 VL 프라이머, 및 (4) (1)의 디자인과 유사한 디자인을 갖되, (DNA 중합효소 연장을 위해) VH 주형에 상보적인 서열을 갖는 3' 말단을 갖는 VH 프라이머를 포함하는 일련의 정방향 PCR 프라이머 디자인들이 PCR 생성물을 포획하는 능력을 시험하였다. 도 5b에서, VL 올리고, VH 올리고 및 VH+VL 올리고의 효율적인 특이적 PCR 포획을 위해 스페이서를 포함하는 VL 프라이머를 사용하였다. 남은 프라이머 중 VH 프라이머만이 상기 올리고들(구체적으로, VH 올리고 및 VH+VL 올리고) 중 임의의 올리고를 포획할 수 있었다.
도 6은 천연적으로 페어링된 VH-VL 생성물이 4G2 항체를 발현하는 세포로부터 수득된 핵산으로부터 소적 내에서 생성될 수 있었다는 것을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 영상이다. NTC = 전체 소적 워크플로우가 수행되었으나 세포가 포함되지 않은 샘플; PCR NTC = 주형 부재 대조군.
도 7a 및 7b는 자가 어닐링 프라이머(도 7a)가 높은 수준의 사용되지 않은 프라이머에서 PCR 생성물 포획 경쟁을 방해할 수 있는 반면, 비-자가 어닐링 프라이머(도 7b)는 낮은 수준의 사용되지 않은 프라이머에서만 이러한 경쟁을 방해할 수 있다는 것을 보여주는 일련의 그래프이다.

본원은 높은 친화성 및 특이성으로 표적 분자 또는 세포, 예를 들면, 인간 단백질 또는 세포에 결합하는 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 T 세포 수용체 분자)를 개시한다. 한 실시양태에서, 폴리펩타이드는 결합 폴리펩타이드이다. 한 실시양태에서, 결합 폴리펩타이드는 항체 분자이다. 한 실시양태에서, 결합 폴리펩타이드는 TCR 분자(예를 들면, 가용성 TCR 분자)이다. 한 실시양태에서, 폴리펩타이드의 라이브러리, 상기 폴리펩타이드 또는 라이브러리를 제조하는 방법, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포, 조성물(예를 들면, 약학 조성물), 키트 및 용기도 제공된다. 본원에 기재된 방법은 천연적으로 매칭되거나 페어링된 2개 이상의 쇄들을 함유하는 기능성 폴리펩타이드를 제조하거나 선택하는 데 유용하다. 본원에 개시된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 T 세포 수용체 분자)는 장애, 예컨대, 본원에 개시된 장애 및 상태를 치료하고/하거나, 예방하고/하거나 진단하는 데 (단독으로, 또는 다른 물질 또는 치료법과 함께) 사용될 수 있다.

이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 본원에 기재된 방법은 예를 들면, 수백만 개의 B 세포/형질 세포 항체들의 고처리율 표현형(예를 들면, 결합) 스크리닝, 및 인간, 마우스, 래트, 토끼 또는 닭을 포함하나 이들로 한정되지 않는 상이한 종들로부터 유래한 B 세포로부터의 항체 발견을 용이하게 할 수 있다고 생각된다. 예를 들면, 유일한 요건은 그 종으로부터의 VH 및 VL 서열을 적절하게 증폭하기 위한 프라이머를 아는 것일 수 있다.

본원에 기재된 워크플로우는 임의의 종에서 사용될 수 있기 때문에, 각각의 종이 한 항원에 대한 상이한 유형의 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체)를 발생시킬 때, (면역화/백신접종 후) 표적 항원에 대한 다양한 결합 폴리펩타이드들(예를 들면, 항체들)을 발견할 능력을 유의미하게 개선할 수 있다. (예를 들면, 표적 에피토프에 대한) 면역 내성 문제는 표적 항원을 결여하거나 표적 항원에 대한 유의미한 아미노산 차이를 갖는 종, 예를 들면, 인간 또는 마우스가 인간 항원/에피토프에 대해 갖는 내성보다 인간 항원/에피토프에 대한 감소된 내성을 갖는 닭을 사용함으로써 더 잘 극복될 수 있다.

본원에 기재된 방법은 강인하고 재생장될 수 있는 효모에서 항체 레퍼토리의 '표현형적 카피'를 만드는 것을 용이하게 할 수 있다. 이것은 민감하고 시험관내에서 오래 생존하지 않고 혹독한 항체/BCR 결합 특징규명에서 생존할 수 없는 일차 B 세포를 사용할 때와 달리 항체 레퍼토리의 혹독한 반복된 시험을 용이하게 한다.

천연적으로 페어링된 VH-VL 서열을 소적 내에서 생성하는 다른 방법은 DNA를 연결하기 위해 DNA 중합효소를 사용한 중첩 연장(PCR)에 의한 스플라이싱을 이용할 수 있는데, 이것은 특이성과 함께 한계를 가질 수 있고 부정확한 연결로 인해 다양한 크기의 불균질한 생성물을 초래할 수 있다. 본원에 기재된 라이게이션 방법은 이러한 문제를 갖지 않는다.

추가로, 중첩 연장 PCR에 의한 스플라이싱을 이용하는 소적 방법은 소적 내의 융합되지 않은 임의의 PCR 생성물이 VH와 VL 사이의 공통의 추가된 서열로 인해 비-소적 PCR 증폭 동안 융합되게 될 잠재력을 가진다는 고유의 한계를 가진다. 소적의 외부에서 일어나는 융합은 쇄들이 구획화되지 않기 때문에 비-천연 페어링을 유발한다. 본원에 기재된 예시적 라이게이션 워크플로우의 경우, 공통의 서열을 VH 및 VL에 추가할 필요성이 없으므로, 이 문제는 일어날 여지가 없다.

이러한 PCR 증폭은 일부 서열들이 다른 서열들보다 더 효율적으로 증폭하기 때문에 PCR에서 일어나는 기하급수적 증폭 후 현저한 차이를 유발할 수 있는, 다양한 서열들의 유의미하게 편향된 표시를 유발할 수 있다. 본원에 기재된 워크플로우는 비드에 포획된 PCR 생성물을 가짐으로써 이 문제를 감소시킨다. 예를 들면, 세포의 VH 및 VL 서열이 매우 잘 증폭되거나 잘 증폭되지 않는 경우, 유사한 양의 생성물이 비드에 포획될 것이다. 이로써, 이 단계를 생략하고 중첩 연장 PCR에 의한 스플라이싱으로 연결을 수행하는 방법에 비해 최종 라이브러리에서 항체 서열의 보다 더 균일한 표시가 있다.

정의

용어 "HC 가변 영역"은, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 중쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 중쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

"LC 가변 영역"은, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 경쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 경쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

"중쇄 가변 영역 서열" 또는 "HCVRS"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 항원의 결합을 허용하도록 중쇄 CDR로부터의 충분한 서열 및 중쇄 FW 영역으로부터의 충분한 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, HCVRS는 경쇄 가변 영역과 조립될 수 있고, 예를 들면, 항원에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, HCVRS는 항원의 결합을 허용하도록 중쇄 CDR 1, 2 및 3으로부터의 충분한 서열, 및 중쇄 FW 영역, 예를 들면, 중쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, HCVRS는 경쇄 가변 영역과 복합체를 형성하고 항원의 결합을 허용하도록 중쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 중쇄 FW 영역, 예를 들면, 중쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다.

"경쇄 가변 영역 서열" 또는 "LCVRS"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 항원의 결합을 허용하도록 경쇄 CDR로부터의 충분한 서열 및 경쇄 FW 영역으로부터의 충분한 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LCVRS는 중쇄 가변 영역과 조립될 수 있고, 예를 들면, 항원에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, LCVRS는 항원의 결합을 허용하도록 경쇄 CDR 1, 2 및 3으로부터의 충분한 서열, 및 경쇄 FW 영역, 예를 들면, 경쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, LCVRS는 중쇄 가변 영역과 복합체를 형성하고 항원의 결합을 허용하도록 경쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 경쇄 FW 영역, 예를 들면, 경쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다.

LC 또는 HC 가변 영역의 "요소"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 적어도 하나의 아미노산을 코딩하는 서열을 지칭한다. 한 실시양태에서, 요소는 CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 FW 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 CDR 및 FW 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 HCVRS 또는 LCVRS를 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 적어도 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 아미노산 잔기를 포함한다.

"마이크로챔버"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 형성 시 단일 세포, 또는 단일 세포로부터의 내용물을 함유할 정도의 치수를 가진, 예를 들면, 충분히 작은 구획을 지칭한다. 한 실시양태에서, 마이크로챔버는 그 자신이 함유하는 세포보다 10배 내지 10,000배 더 큰 부피를 가진다. 한 실시양태에서, 마이크로챔버는 20 pl의 부피를 가진다. 한 실시양태에서, 마이크로챔버는 100 nl의 최대 치수를 가진다. 한 실시양태에서, 마이크로챔버는 액체의 소적을 포함한다. 한 실시양태에서, 마이크로챔버는 비혼화성 매질, 예를 들면, 기체 또는 제2 액체에 배치된 제1 액체의 소적을 포함한다. 한 실시양태에서, 마이크로챔버는 제1 액체를 비혼화성 제2 액체, 예를 들면, 불소첨가된 오일에 분산시킴으로써 형성된, 제1 액체, 예를 들면, 용해 완충제 또는 PCR 반응 완충제의 소적을 포함한다. 한 실시양태에서, 마이크로챔버는 기재, 및 기재 이외의 물질, 예를 들면, 용액을 포함한다. 한 실시양태에서, 소적은 기재(예를 들면, 포획 기재, 예를 들면, 비드) 및 기재 이외의 물질, 예를 들면, 용액을 포함한다.

"획득"은, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 독립체, 예를 들면, 물리적 독립체 또는 데이터의 제공을 갖는 것을 지칭한다. 물리적 독립체의 획득은 물리적 독립체의 제조 또는 제작(직접적인 획득)뿐만 아니라 또 다른 당사자 또는 공급원으로부터 물리적 독립체를 제공받는 것(간접적 획득)도 포함한다. 데이터 또는 값의 획득은 데이터 또는 값의 생성(직접적 획득)뿐만 아니라 또 다른 당사자 또는 공급원으로부터 데이터 또는 값을 제공받는 것(간접적 획득)도 포함한다.

"매칭된"은, 이 용어가 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 관련하여 본원에서 사용될 때, 이 영역들이 동일한 세포로부터 유래한다는 것을 의미한다. 경쇄 가변 영역의 요소 및 중쇄 가변 영역의 요소와 관련하여, 이 용어는 상기 요소들의 공급원인 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역이 동일한 세포로부터 유래한다는 것을 의미한다.

"분리된 반응 부위(isolated reaction site)"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 제1의 로딩된 포획 기재가 다른 세포로부터의 HC 또는 LC(또는 α 쇄 또는 β 쇄, 또는 γ 쇄 또는 δ 쇄)를 코딩하는 핵산으로 오염되지 않도록, 제1의 로딩된 포획 기재와 제2의 로딩된 포획 기재 사이의 충분한 분리, 또는 일반적으로 다른 세포의 HC 또는 LC(또는 α 쇄 또는 β 쇄, 또는 γ 쇄 또는 δ 쇄) 코딩 핵산으로부터의 충분한 분리를 허용하는 부위, 예를 들면, 기재 위의 위치, 마이크로챔버 또는 기재의 웰 상의 위치를 지칭한다. 한 실시양태에서, 분리된 반응 부위는 제1 로딩된 mRNA 포획 기재가 또 다른 세포로부터의 HC 또는 LC(또는 α 쇄 또는 β 쇄, 또는 γ 쇄 또는 δ 쇄)를 코딩하는 핵산, 예를 들면, mRNA로 오염되지 않도록 제1 mRNA가 로딩된 포획 기재와 제2 mRNA가 로딩된 포획 기재 사이의 충분한 분리, 또는 일반적으로 또 다른 세포의 LC 또는 HC 코딩 핵산으로부터의 충분한 분리를 제공한다. 한 실시양태에서, 분리된 반응 부위는 제1 로딩된 cDNA 포획 기재가 또 다른 세포로부터의 HC 또는 LC(또는 α 쇄 또는 β 쇄, 또는 γ 쇄 또는 δ 쇄)를 코딩하는 핵산, 예를 들면, cDNA로 오염되지 않도록 제1 cDNA 로딩된 포획 기재와 제2 cDNA 로딩된 포획 기재 사이의 충분한 분리, 또는 일반적으로 또 다른 세포의 HC 또는 LC(또는 α 쇄 또는 β 쇄, 또는 γ 쇄 또는 δ 쇄) 코딩 핵산으로부터의 충분한 분리를 제공한다. 분리는 예를 들면, 분리된 반응 부위들이 유체 연결 상태에 있지 않도록 구성하거나, 부피 또는 챔버와 환경 사이에 비혼화성 장벽을 형성함으로써 기재의 분리된 반응 부위들 사이의 충분한 거리에 의해 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 분리된 반응 부위는 기재, 및 기재 이외의 물질, 예를 들면, 용액을 포함한다.

"상보적"은, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 페어링을 형성할 수 있는 서열을 지칭한다. 제1 서열이 제2 서열에 상보적일 때, 제1 서열은 전체 제2 서열 또는 제2 서열의 일부에 상보적일 수 있다.

"디스플레이 독립체"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 포함하는 독립체, 예를 들면, 파지 또는 세포, 예를 들면, 효모 세포를 지칭한다.

"AC 가변 영역"은, 이 용어가 본원에서 사용될 때, TCR α 쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 α 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

"BC 가변 영역"은, 이 용어가 본원에서 사용될 때, β 쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 β 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

"GC 가변 영역"은, 이 용어가 본원에서 사용될 때, TCR γ 쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 γ 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

"DC 가변 영역"은, 이 용어가 본원에서 사용될 때, δ 쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 δ 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4를 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다.

"α 쇄 가변 영역 서열" 또는 "ACVRS"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 항원의 결합을 허용하도록 α 쇄 CDR로부터의 충분한 서열 및 α 쇄 FW 영역으로부터의 충분한 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, ACVRS는 β 쇄 가변 영역과 조립될 수 있고, 예를 들면, 항원에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, ACVRS는 항원의 결합을 허용하도록 α 쇄 CDR 1, 2 및 3으로부터의 충분한 서열, 및 α 쇄 FW 영역, 예를 들면, α 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, ACVRS는 β 쇄 가변 영역과 복합체를 형성하고 항원의 결합을 허용하도록 α 쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 α 쇄 FW 영역, 예를 들면, α 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다.

"β 쇄 가변 영역 서열" 또는 "BCVRS"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 항원의 결합을 허용하도록 β 쇄 CDR로부터의 충분한 서열 및 β 쇄 FW 영역으로부터의 충분한 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, BCVRS는 α 쇄 가변 영역과 조립될 수 있고, 예를 들면, 항원에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, BCVRS는 항원의 결합을 허용하도록 β 쇄 CDR 1, 2 및 3으로부터의 충분한 서열, 및 β 쇄 FW 영역, 예를 들면, β 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, BCVRS는 α 쇄 가변 영역과 복합체를 형성하고 항원의 결합을 허용하도록 β 쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 β 쇄 FW 영역, 예를 들면, β 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다.

"γ 쇄 가변 영역 서열" 또는 "GCVRS"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 항원의 결합을 허용하도록 γ 쇄 CDR로부터의 충분한 서열 및 γ 쇄 FW 영역으로부터의 충분한 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, GCVRS는 δ 쇄 가변 영역과 조립될 수 있고, 예를 들면, 항원에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, GCVRS는 항원의 결합을 허용하도록 γ 쇄 CDR 1, 2 및 3으로부터의 충분한 서열, 및 γ 쇄 FW 영역, 예를 들면, γ 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, GCVRS는 δ 쇄 가변 영역과 복합체를 형성하고 항원의 결합을 허용하도록 γ 쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 γ 쇄 FW 영역, 예를 들면, γ 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다.

"δ 쇄 가변 영역 서열" 또는 "DCVRS"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 항원의 결합을 허용하도록 δ 쇄 CDR로부터의 충분한 서열 및 δ 쇄 FW 영역으로부터의 충분한 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, DCVRS는 γ 쇄 가변 영역과 조립될 수 있고, 예를 들면, 항원에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, DCVRS는 항원의 결합을 허용하도록 δ 쇄 CDR 1, 2 및 3으로부터의 충분한 서열, 및 δ 쇄 FW 영역, 예를 들면, δ 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, DCVRS는 α 쇄 가변 영역과 복합체를 형성하고 항원의 결합을 허용하도록 δ 쇄 CDR 1, 2 및 3, 및 δ 쇄 FW 영역, 예를 들면, δ 쇄 FW 영역 1, 2, 3 및 4로부터의 충분한 서열을 포함한다.

α 쇄 또는 β 쇄 가변 영역의 "요소"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 적어도 하나의 아미노산을 코딩하는 서열을 지칭한다. 한 실시양태에서, 요소는 CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 FW 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 CDR 및 FW 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 ACVRS 또는 BCVRS를 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 적어도 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 아미노산 잔기를 포함한다.

γ 쇄 또는 δ 쇄 가변 영역의 "요소"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 적어도 하나의 아미노산을 코딩하는 서열을 지칭한다. 한 실시양태에서, 요소는 CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 FW 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 CDR 및 FW 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 GCVRS 또는 DCVRS를 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 적어도 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개 또는 100개의 아미노산 잔기를 포함한다.

"매칭된"은, 이 용어가 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역과 관련하여 본원에서 사용될 때, 이 영역들이 동일한 세포로부터 유래한다는 것을 의미한다. α 쇄 가변 영역의 요소 및 β 쇄 가변 영역의 요소와 관련하여, 이 용어는 상기 요소들의 공급원인 α 쇄 가변 영역 및 β 쇄 가변 영역이 동일한 세포로부터 유래한다는 것을 의미한다.

"매칭된"은, 이 용어가 γ 쇄 가변 영역 및 δ 쇄 가변 영역과 관련하여 본원에서 사용될 때, 이 영역들이 동일한 세포로부터 유래한다는 것을 의미한다. γ 쇄 가변 영역의 요소 및 δ 쇄 가변 영역의 요소와 관련하여, 이 용어는 상기 요소들의 공급원인 γ 쇄 가변 영역 및 γ 쇄 가변 영역이 동일한 세포로부터 유래한다는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 단수형 관사는 이 관사의 하나 또는 하나 초과(예를 들면, 적어도 하나)의 문법적 객체를 지칭한다.

문맥이 달리 명시하지 않은 한, 용어 "또는"은 용어 "및/또는"을 의미하기 위해 본원에서 사용되고 용어 "및/또는"과 상호교환 가능하게 사용된다.

"약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 특성 및 정확성을 고려할 때 측정된 양에 대한 허용 가능한 오차도를 의미할 것이다. 예시적 오차도는 소정의 값 또는 값의 범위의 20퍼센트(%) 이내, 전형적으로 10% 이내, 보다 전형적으로 5% 이내에 있다.

본원에 개시된 조성물 및 방법은 특정된 서열, 또는 이와 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예를 들면, 특정된 서열과 적어도 85%, 90% 또는 95% 이상 동일한 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 핵산을 포함한다.

아미노산 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 아미노산 서열과 제2 아미노산 서열이 공통의 구조적 도메인 및/또는 공통의 기능적 활성을 가질 수 있도록 제2 아미노산 서열에서 i) 정렬된 아미노산 잔기와 동일하거나, ii) 정렬된 아미노산 잔기의 보존적 치환인 충분한 또는 최소 수의 아미노산 잔기를 함유하는 제1 아미노산 서열을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, 공통의 구조적 도메인을 함유하는 아미노산 서열은 기준 서열, 예를 들면, 본원에서 제공된 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.

뉴클레오타이드 서열과 관련하여, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 뉴클레오타이드 서열과 제2 뉴클레오타이드 서열이 공통의 기능적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하거나, 공통의 구조적 폴리펩타이드 도메인 또는 공통의 기능적 폴리펩타이드 활성을 코딩하도록 제2 핵산 서열에서 정렬된 뉴클레오타이드와 동일한 충분한 또는 최소 수의 뉴클레오타이드를 함유하는 제1 핵산 서열을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열은 기준 서열, 예를 들면, 본원에서 제공된 서열과 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다.

용어 "기능성 변이체"는 천연 생성 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 실질적으로 동일한 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고 천연 생성 서열의 하나 이상의 활성을 가질 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다.

서열들 사이의 상동성 또는 서열 동일성(이 용어들은 본원에서 상호교환 가능하게 사용됨)의 계산은 다음과 같이 수행된다.

2개의 아미노산 서열들 또는 2개의 핵산 서열들의 퍼센트 동일성을 측정하기 위해, 최적 비교 목적으로 서열들을 정렬한다(예를 들면, 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 이들 둘 다에 갭을 도입할 수 있다). 전형적인 실시양태에서, 비교 목적으로 정렬된 기준 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 적어도 30%, 예를 들면, 적어도 40%, 50%, 60%, 예를 들면, 적어도 70%, 80%, 90% 또는 100%이다. 그 다음, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열의 한 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유될 때, 분자들은 그 위치에서 동일하다.

2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 2개의 서열들의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려할 때 상기 서열들에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다.

서열들의 비교 및 2개의 서열들 사이의 퍼센트 동일성의 측정은 수학 알고리즘을 사용함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는, GCG 소프트웨어 팩키지(www.gcg.com에서 입수 가능함)의 GAP 프로그램 내로 도입된 문헌(Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453)의 알고리즘을 사용함으로써 측정된다. 일부 실시양태에서, 2개의 뉴클레오타이드 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스, 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는, GCG 소프트웨어 팩키지(www.gcg.com에서 입수 가능함)의 GAP 프로그램을 사용함으로써 측정된다. 적합한 한 세트의 파라미터들(및 달리 특정되어 있지 않은 한, 사용되어야 하는 파라미터)는 12의 갭 벌점, 4의 갭 연장 벌점 및 5의 프레임시프트 갭 벌점을 갖는 Blossum 62 점수화 매트릭스이다.

2개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열들 사이의 퍼센트 동일성은 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 벌점 및 4의 갭 벌점을 사용하는, ALIGN 프로그램(버전 2.0) 내로 도입된 문헌(E. Meyers and W. Miller, (1989) CABIOS, 4:11-17)의 알고리즘을 사용함으로써 측정될 수 있다.

본원에 기재된 핵산 및 단백질 서열은 공용 데이터베이스에 대한 검색을 수행하여, 예를 들면, 다른 패밀리 구성원 또는 관련 서열을 찾기 위한 "질의(query) 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 검색은 문헌(Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-1)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용함으로써 수행될 수 있다. NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어길이 = 12를 사용하여 BLAST 뉴클레오타이드 검색을 수행함으로써, 본원에 기재된 핵산과 상동한 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3을 사용하여 BLAST 단백질 검색을 수행함으로써, 본원에 기재된 단백질 분자와 상동한 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적으로 갭을 갖는 정렬을 수득하기 위해, 갭을 갖는 BLAST를 문헌(Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. BLAST 및 갭을 갖는 BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램(예를 들면, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "낮은 엄격도, 중간 엄격도, 높은 엄격도 또는 매우 높은 엄격도 조건 하에서 하이브리드화한다"는 하이브리드화 및 세척을 위한 조건을 기술한다. 하이브리드화 반응을 수행하기 위한 지침은 참고로 도입되는 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6)에서 발견될 수 있다. 수성 방법 및 비수성 방법은 이 참고문헌에 기재되어 있고 이들 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 본원에서 언급된 특이적 하이브리드화 조건은 다음과 같다: 1) 약 45℃의 6X 염화나트륨/구연산나트륨(SSC)에서 낮은 엄격도 하이브리드화 조건에 이은, 적어도 50℃의 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 2회 세척(세척의 온도는 낮은 엄격도 조건을 위해 55℃까지 증가될 수 있음); 2) 약 45℃의 6X SSC에서 중간 엄격도 하이브리드화 조건에 이은, 60℃의 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상의 세척; 3) 약 45℃의 6X SSC에서 높은 엄격도 하이브리드화 조건에 이은, 65℃의 0.2X SSC, 0.1% SDS에서 1회 이상의 세척; 및 바람직하게는 4) 매우 높은 엄격도 하이브리드화 조건은 65℃의 0.5 M 인산나트륨, 7% SDS이고, 그 후 65℃의 0.2X SSC, 1% SDS에서 1회 이상의 세척이 수행된다. 매우 높은 엄격도 조건 4)는 적합한 조건이고, 달리 특정되어 있지 않은 한, 사용되어야 하는 조건이다.

본원에 기재된 분자는 그의 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 보존적 또는 비필수 아미노산 치환을 가질 수 있다는 것이 이해된다.

용어 "아미노산"은 아미노 작용기 및 산 작용기 둘 다를 포함하고 천연 생성 아미노산의 중합체에 포함될 수 있는 모든 천연 또는 합성 분자들을 포괄하기 위한 것이다. 예시적 아미노산은 천연 생성 아미노산; 이의 유사체, 유도체 및 동족체; 변이체 측쇄를 갖는 아미노산 유사체; 및 이들 중 임의의 물질의 모든 입체이성질체들을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 D 또는 L 광학 이성질체 및 펩티드 모방 물질 둘 다를 포함한다.

"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리들은 당분야에서 정의되어 있다. 이 패밀리들은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타 분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"(단일 쇄인 경우)은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지된 중합체일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 불연속될 수 있다. 상기 용어들은 예를 들면, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작, 예컨대, 표지부착 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체도 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 재조합 기법에 의해 진핵 또는 원핵 숙주로부터 생성될 수 있거나, 합성 절차의 생성물일 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩타이드는 항체 분자이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩타이드는 TCR 분자, 예를 들면, 가용성 TCR 분자이다.

용어 "핵산", "핵산 서열", "뉴클레오타이드 서열" 또는 "폴리뉴클레오타이드 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호교환 가능하게 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체인 뉴클레오타이드의 임의의 길이의 중합체성 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 단일 가닥인 경우 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 불연속될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합 후 예컨대, 표지부착 성분과의 접합에 의해 더 변형될 수 있다. 핵산은 재조합 폴리뉴클레오타이드일 수 있거나, 자연에서 존재하지 않거나 비-천연 정렬로 또 다른 폴리뉴클레오타이드에 연결되어 있는, 게놈, cDNA, 반합성 또는 합성 유래의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 그의 원래의 또는 천연 환경(예를 들면, 천연 생성 물질인 경우 자연 환경)으로부터 제거되어 있는 물질을 지칭한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 존재하는 천연 생성 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리되어 있지 않으나, 인간 개입에 의해 천연 시스템에 공존하는 물질들 중 일부 또는 전부로부터 분리되어 있는 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 단리되어 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고/있거나, 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있고, 이러한 벡터 또는 조성물이 자연에서 발견되는 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 예를 들면, 본원에 기재된 장애를 "치료한다"는 용어는 한 실시양태에서, 장애, 예를 들면, 본원에 기재된 장애를 갖고/갖거나 장애, 예를 들면, 본원에 기재된 장애의 증상을 경험하는 대상체(예를 들면, 인간)가 항체 분자를 투여 받지 않은 경우보다 항체 분자를 투여 받았을 때 덜 심각한 증상을 앓고/앓거나 더 빨리 회복한다는 것을 의미한다. 치료는 예를 들면, 장애의 영향 또는 증상, 특징 및/또는 원인의 하나 이상의 징후의 중증도를 부분적으로 또는 완전히 완화할 수 있거나, 호전시킬 수 있거나, 경감할 수 있거나, 억제할 수 있거나 감소시킬 수 있고/있거나, 상기 하나 이상의 징후의 발생률을 감소시킬 수 있고, 임의적으로 이러한 징후의 발병을 지연시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 치료는 장애의 특정 징후를 나타내지 않는 대상체, 및/또는 장애의 초기 징후만을 나타내는 대상체의 치료이다. 한 실시양태에서, 치료는 장애의 하나 이상의 확립된 징후를 나타내는 대상체의 치료이다. 한 실시양태에서, 치료는 장애를 앓고 있는 것으로서 진단된 대상체의 치료이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 장애를 "예방한다"는 용어는 대상체(예를 들면, 인간)가 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)를 제공받은 경우 장애를 가질 가능성이 더 낮다는 것을 의미한다.

본원의 조성물 및 방법의 다양한 양태들은 이하에 더 상세히 기재되어 있다. 추가 정의는 본 명세서 전체에 걸쳐 기재되어 있다.

결합 폴리펩타이드의 라이브러리

본원은 결합 폴리펩타이드, 예를 들면, 항체 분자 또는 T 세포 수용체 분자의 라이브러리(예를 들면, 디스플레이 라이브러리), 및 결합 폴리펩타이드, 예를 들면, 항체 분자 또는 T 세포 수용체 분자의 라이브러리를 제조하는 방법을 개시한다.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 리가제 매개 방법을 이용하여 2개의 DNA 단편들, 예컨대, 항체 중쇄 가변 영역(또는 이의 일부) 및 항체 경쇄 가변 영역(또는 이의 일부), TCR α 쇄(또는 이의 일부) 및 TCR β 쇄(또는 이의 일부), 또는 TCR γ 쇄(또는 이의 일부) 및 TCR δ 쇄(또는 이의 일부)를 코딩하는 서열들을 연결한다.

예를 들면, 항체는 별개의 mRNA 분자들로부터 각각 번역되는 두 유형의 폴리펩타이드 쇄들인 경쇄 및 중쇄로 구성된다. B 세포로부터 특정 항체(또는 B 세포 수용체)의 기능성 유닛을 복제하기 위해, 특정 중쇄 및 이의 동족 경쇄의 지식을 유지해야 한다. 이것은 전형적으로 개별 클론들이 마이크로웰 플레이트의 웰 내에 있음으로써, 클론들을 분리된 상태로 유지하는 방법을 이용함으로써 수행되고, 이로써 생성된 중쇄 서열과 경쇄 서열은 페어링되는 것으로 공지되어 있다. 이러한 클로닝 과정은 웰의 규모를 96웰 또는 384웰 플레이트에 적합한 B 세포 수까지 확장한다. 그러나, 인간 및 동물의 B 세포 레퍼토리는 약 10⁶개 내지 10¹¹개의 B 세포일 수 있고, 이들 중 대다수는 상이한 클론(즉, 상이한 BCR 또는 항체)이다. 따라서, (1) 쇄의 천연 페어링을 유지하고 (2) 이러한 많은 수의 특유한 클론들의 기능적 조사를 가능하게 하는 효율적인 방식으로 수백만 내지 수십억 개의 B 세포들의 카피를 제조할 수 있을 필요성이 있다. 이러한 방법은 다양한 방법들에 의해 기능적으로 조사될 수 있는 항체 레퍼토리의 재생 가능한 카피의 제조를 용이하게 할 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 (1) 소적(pl 내지 nl 부피 소적) 내로의 개별 세포(예를 들면, B 세포 또는 T 세포)의 소형화된 구획화 단계, (2) 용해, 및 2개의 쇄들(예를 들면, 항체 VH 및 VL, TCR α 및 β 쇄, 또는 TCR γ 및 δ 쇄)을 증폭시키는 PCR 단계, (3) 천연 쇄 페어링이 유지되고 열안정성 리가제가 연결을 촉진하도록 상기 2개의 쇄들을 특이적으로 연결하는 단계, 및 (4) 표면 디스플레이 기술, 예컨대, 효모 또는 파지 디스플레이에 의한 클론의 고처리율 표현형적 조사를 가능하게 하는 방식으로 연결된 DNA를 증폭시키는 단계 중 하나 이상의 단계(예를 들면, 2개, 3개 또는 모든 단계)를 이용한다.

본원에 기재된 방법은 핵산 서열로 하여금 발현될 때 기능성 폴리펩타이드, 예를 들면, 기능성 항원 결합 폴리펩타이드를 코딩하게 수 있다. 예를 들면, HC 요소 및 LC 요소(또는 AC 요소 및 BC 요소, 또는 GC 요소 및 DC 요소)는 헤드-대-헤드 또는 테일-대-테일 배향으로 배열되지 않는다. 한 실시양태에서, HC 요소 및 LC 요소(또는 AC 요소 및 BC 요소, 또는 GC 요소 및 DC 요소)는 헤드-대-테일 배향으로 배열된다. 예를 들면, LC 요소(또는 LCVRS)의 C-말단은 HC 요소(또는 HCVRS)의 N-말단과 직접적으로 또는 간접적으로 연결되거나, HC 요소(또는 HCVRS)의 C-말단은 LC 요소(또는 LCVRS)의 C-말단과 직접적으로 또는 간접적으로 연결된다.

예시적 워크플로우

세포(예를 들면, 면역 세포, 예를 들면, B 세포 또는 T 세포)는 소적 내로 개별적으로 캡슐화된다. 소적에서, 세포는 용해되고, mRNA는 mRNA에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 비드에 포획된다. 상기 비드는 천연 페어링 정보(예를 들면, 2개의 쇄들 사이, 예를 들면, 단일 B 세포에서 중쇄와 경쇄 사이; 단일 T 세포에서 α 쇄와 β 쇄 사이; 또는 단일 T 세포에서 γ 쇄와 δ 쇄 사이의 천연 페어링)를 유지하는 것을 용이하게 한다. 그 다음, mRNA는 역전사효소(RT)에 의해 cDNA로 역전사된다. 역전사는 용해 소적의 내부, 소적의 외부 또는 후속 소적('PCR' 소적)의 내부에서 수행될 수 있다. 포획된 mRNA 또는 cDNA를 갖는 비드는 초기 소적으로부터 회수된다. 그 다음, 상기 비드는 새로운 소적 내로 캡슐화되고, 이 때 핵산은 RT-PCR(mRNA가 주형일 때) 또는 PCR(cDNA가 주형일 때)에 의해 증폭된다. 상기 2개의 쇄들을 코딩하는 cDNA는 소적의 내부에서 증폭된다. 증폭된 생성물은 특이적 상보적 핵산 하이브리드화에 의해 비드에 다시 포획된다. 포획된 생성물을 갖는 비드는 소적으로부터 회수된 후 새로운 소적 내로 캡슐화된다. 하나의 쇄(예를 들면, VH)를 코딩하는 증폭된 생성물은 열안정성 리가제의 사용을 통해 소적의 내부에서 다른 쇄(예를 들면, VL)를 코딩하는 증폭 생성물과 연결된다. 한 방법("코헤시브(cohesive) 생성물의 연결")에서, 코헤시브(또는 "점착성 말단") PCR 생성물이 생성되고, 하이브리드화된 코헤시브 PCR 생성물들의 공유 라이게이션이 열안정성 리가제에 의해 수행된다. 또 다른 방법("리가제 사이클링 반응")에서, 코헤시브 PCR 생성물은 생성되지 않는다. 오히려, 소적의 내부에서 DNA는 열안정성 리가제 및 스플린트(또는 가교) 올리고뉴클레오타이드의 사용을 통해 함께 연결된다. 이론에 의해 구속받고자 하지는 않지만, 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 중첩 연장 PCR 방법에 의해 야기된 의도되지 않은 융합의 가능성을 감소시키거나 방지한다고 생각된다(Turchaninova et al. Eur J Immunol. 2013; 43(9): 2507-2515). 천연적으로 페어링된 쇄를 대표하는 라이게이션된 생성물은 더 증폭되어, 예컨대, 효모 또는 파지에서 디스플레이 라이브러리를 생성하기에 충분한 물질을 생성한다. scFv, scFab, Fab 또는 전체 길이 IgG와 같은 포맷으로 천연적으로 페어링된 쇄(예를 들면, 항체 중쇄 및 경쇄, TCR α 쇄 및 β 쇄, 또는 TCR γ 쇄 및 δ 쇄)를 코딩하는 증폭된 생성물은 적절한 발현 또는 디스플레이 비히클, 예컨대, 효모 또는 파지 디스플레이 내로 도입된다. 확립된 방법을 이용하여, 예를 들면, 10⁴개 초과 내지 10⁹개 이하 또는 더 큰 수의 구성원들을 갖는 구축된 라이브러리를 원하는 결합 및/또는 다른 표현형적 특성에 대해 신속히 조사할 수 있다.

리가제에 적합한 기질인 코헤시브 PCR 생성물의 생성

한 실시양태에서, 리가제에 적합한 기질인 코헤시브 말단을 갖는 증폭(예를 들면, PCR) 생성물이 생성된다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 한 실시양태에서, 화학적으로 변형된(예를 들면, 손상을 가진) 뉴클레오타이드 또는 염기, 또는 증폭을 위해 사용된 프라이머에 대한 다른 변경의 사용을 통해 DNA 중합효소 연장을 소정의 위치에서 조기에 종결시킬 수 있다고 생각된다. 그 후, 이 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기(또는 다른 프라이머 변경)을 증폭 생성물의 한 가닥 내로 도입한다. DNA 중합효소가 변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 주형 가닥을 지나면서 판독할 때, 이 중합효소는 변형된 뉴클레오타이드를 지나면서 판독할 수 없기 때문에 이 뉴클레오타이드(또는 근처)에서 연장을 조기에 중단한다. 변형으로 인한 이 이른 중합효소 종결은 코헤시브 말단을 갖는 증폭 생성물의 생성을 유발할 수 있다. 증폭 생성물은 유사한 방식으로 생성될 수 있는 상보적 코헤시브 말단을 갖는 또 다른 증폭 생성물과 효율적으로 하이브리드화(또는 어닐링)할 수 있다. 예를 들면, 상보적 코헤시브 말단을 각각 가진, 하나의 쇄(예를 들면, VH)를 코딩하는 PCR 생성물 및 또 다른 쇄(예를 들면, VL)를 코딩하는 PCR 생성물은 높은 효율로 서로 하이브리드화(또는 어닐링)할 수 있다. 그 다음, (예를 들면, 써모사이클링 전체에 걸쳐) DNA 중합효소와 함께 소적에 존재하는 열안정성 리가제는 하이브리드화된(또는 어닐링된) DNA 분자의 라이게이션(공유결합)을 촉진한다.

한 실시양태에서, 증폭 및 라이게이션 동안 천연 페어링 정보가 유지된다. 한 실시양태에서, 증폭 및 라이게이션 둘 다가 예를 들면, 소적을 깨뜨리지 않으면서 동일한 소적 내에서 일어난다. 한 실시양태에서, 리가제는 하나 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25 이상)의 열사이클 동안 95℃ 이상(예를 들면, 96℃ 이상, 97℃ 이상, 또는 98℃ 이상)에서 적어도 50%, 예를 들면, 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 활성을 보유한다. 한 실시양태에서, 리가제는 적어도 5분(예를 들면, 적어도 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 45분 또는 60분) 동안 95℃ 이상(예를 들면, 96℃ 이상, 97℃ 이상, 또는 98℃ 이상)에서 적어도 50%, 예를 들면, 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 활성을 보유한다. 한 실시양태에서, 리가제는 DNA 중합효소 활성을 허용하는 완충제 조건에서 95℃ 이상(예를 들면, 96℃ 이상, 97℃ 이상, 또는 98℃ 이상)에서 적어도 50%, 예를 들면, 적어도 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 활성을 보유한다.

한 실시양태에서, 변형은 DNA 중합효소 활성을 억제하거나 차단하고 라이게이션을 위한 기질을 유지한다. 한 실시양태에서, 변형은 증폭 생성물과 리가제의 결합을 억제하지 않거나 방해하지 않는다. 한 실시양태에서, 변형은 포스포디에스테르 결합의 형성을 억제하지 않거나 방해하지 않는다. 한 실시양태에서, 변형은 용적이 큰 화학적 기를 포함하지 않는다. 예시적 변형은 리보스 2'-C(두 번째 탄소) 변형(예를 들면, OH(즉, 데옥시리보뉴클레오타이드가 아니라 리보뉴클레오타이드), O-메틸(O-CH₃) 또는 아민(NH₂)); 리보스 4'-C(네 번째 탄소) 변형; 염기 변형(예를 들면, 비-천연 염기, 우라실 등); 무염기 부위(예를 들면, AP 부위 또는 아피리미딘(apyrimidine)/아푸린(apurine)); 또는 스태거드(staggered) 프라이머(예를 들면, 상이한 길이의 오버행)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 변형은 우라실을 포함하고, 우라실에 의해 억제되는 DNA 중합효소(예를 들면, 고세균 DNA 중합효소)가 증폭을 위해 사용된다.

소적 내에서 코헤시브 말단 PCR-라이게이션 실험을 수행하는 예시적 단계가 이하에 설명되어 있다.

세포 캡슐화

세포는 소적 내로 개별적으로 캡슐화될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 B 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 항체 생성 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 분리된 세포 또는 정제된 세포이다. 한 실시양태에서, 세포는 대상체, 예를 들면, 인간, 마우스, 토끼, 래트, 염소, 양 또는 닭으로부터 수득된다.

한 실시양태에서, 소적의 부피는 10 pl 내지 100 nl, 예를 들면, 10 pl 내지 100 pl, 10 pl 내지 1000 pl, 10 pl 내지 10 nl, 10 nl 내지 100 nl, 1000 pl 내지 100 nl, 100 pl 내지 100 nl, 100 pl 내지 10 nl, 100 pl 내지 1000 pl, 1000 pl 내지 10 nl, 또는 100 pl 내지 1000 pl이다. 한 실시양태에서, 소적의 부피는 100 pl 내지 1000 pl이다.

한 실시양태에서, 소적은 유중수 소적이다. 한 실시양태에서, 소적은 담체(예를 들면, 오일) 상, 예를 들면, 약 1%의 플루오로계면활성제(RAN Biotechnologies)와 함께 3M™ HFE-7500을 포함하는 담체 상에 존재한다.

소적은 예를 들면, 주사기 또는 압력 펌프에 의해 제어되는 유체 상의 유동을 갖는 마이크로플루이딕 칩(microfluidic chip)(예를 들면, 돌로마이트(Dolomite)로부터의 2R 100 ㎛)을 사용함으로써 형성될 수 있다. 한 실시양태에서, 소적의 수성 상은 완충제, 세포 용해를 돕는 시약, 및 비드를 포함한다. 한 실시양태에서, 완충제는 pH 7.5의 Tris를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 용해를 보조하는 시약은 세제를 포함한다. 세포 용해를 보조하는 데 사용될 수 있는 예시적 세제는 Tween-20, Triton X, IGEPAL 또는 나트륨 라우로일 사르코시네이트(Sarkosyl)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 비드는 자성 비드이다. 한 실시양태에서, 비드는 예를 들면, mRNA(예를 들면, 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 mRNA)에 어닐링하기 위해 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 프라이머)에 커플링된다.

한 실시양태에서, 소적은 캡슐화 후 1개 이하의 세포를 함유한다. 한 실시양태에서, 소적은 복수의 비드들을 함유한다. 한 실시양태에서, 복수의 비드들이 수득되고, 복수의 비드들 중 적어도 80%, 예를 들면, 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 비드들이 소적당 1개 이하의 세포를 함유한다. 한 실시양태에서, 복수의 비드들이 수득되고, 복수의 비드들 중 적어도 80%, 예를 들면, 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 비드들이 소적당 적어도 하나의 비드를 함유한다. 전형적으로, 소적의 점유는 소적당 1개 이하의 세포 및 소적당 적어도 하나의 비드이다.

세포 용해

캡슐화 후, 소적은 세포 용해를 용이하게 하기 위해 인큐베이션될 수 있다. 한 실시양태에서, 예를 들면, 비드에 더 효율적으로 포획될 수 있도록 mRNA 이차 구조를 감소시키고/시키거나 세제(예를 들면, Tween-20)의 존재 하에서 용해 효율을 개선하기 위해 (예를 들면, 유착 상이한 용액 상들을 함유하는) 에멀전을 가열할 수 있다. 한 실시양태에서, 40℃ 내지 80℃, 예를 들면, 40℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 70℃, 또는 60℃ 내지 80℃의 온도, 예를 들면, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃ 또는 80℃에서 에멀전을 인큐베이션한다. 한 실시양태에서, 5분 내지 60분, 예를 들면, 10분 내지 45분, 15분 내지 30분, 5분 내지 30분, 또는 30분 내지 50분 동안 에멀전을 인큐베이션한다. 한 실시양태에서, 세포는 가열에 의해 용해된다. 한 실시양태에서, 세포는 효소에 의해 용해된다. 전형적으로, 세포가 용해된 후, mRNA가 유리되고 비드의 올리고뉴클레오타이드에 어닐링함으로써 비드에 포획된다.

비드 회수

소적 불안정화 시약, 예를 들면, 퍼플루오로옥탄올(PFO)을 사용하여 (예를 들면, 유착 상이한 용액 상들을 함유하는) 에멀전을 깨뜨릴 수 있다. 한 실시양태에서, 비드 함유 수성 상을 회수한다. 한 실시양태에서, 비드는 자성 비드이고 자석을 이용함으로써 단리된다. 한 실시양태에서, 비드를 세척하고 완충제(예를 들면, Tris, pH 7.5)에 재현탁한다.

역전사

표준 방법을 이용하여 역전사를 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 역전사를 비-에멀전 반응에서 수행한다. 한 실시양태에서, 역전사를 에멀전 반응에서 수행한다. 한 실시양태에서, 포획된 mRNA를 갖는 비드를 완충제-효소 혼합물(예를 들면, Superscript II RT)에 재현탁하고 10분 내지 60분(예를 들면, 15분) 동안 35℃ 내지 45℃(예를 들면, 40℃)에서 인큐베이션하여 역전사를 용이하게 한다. 한 실시양태에서, 비드에 커플링된 올리고뉴클레오타이드는 제1 가닥 cDNA의 합성을 위한 프라이머로서 사용된다. 한 실시양태에서, 역전사 후 비드를 완충제(예를 들면, Tris, pH 7.5)로 세척한다.

비드 캡슐화

비드는 소적 내로 개별적으로 캡슐화될 수 있다. 한 실시양태에서, 소적의 부피는 5 pl 내지 500 pl, 예를 들면, 5 pl 내지 400 pl, 5 pl 내지 300 pl, 5 pl 내지 200 pl, 5 pl 내지 100 pl, 5 pl 내지 50 pl, 5 pl 내지 25 pl, 400 pl 내지 500 pl, 300 pl 내지 500 pl, 200 pl 내지 500 pl, 100 pl 내지 500 pl, 50 pl 내지 500 pl, 25 pl 내지 500 pl, 10 pl 내지 500 pl, 10 pl 내지 400 pl, 25 pl 내지 300 pl, 50 pl 내지 200 pl, 또는 10 pl 내지 50 pl이다. 한 실시양태에서, 소적의 부피는 10 pl 내지 50 pl이다.

한 실시양태에서, 소적은 캡슐화 후 1개의 비드를 함유한다. 한 실시양태에서, 복수의 비드들이 수득되고, 복수의 비드들 중 적어도 80%, 예를 들면, 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 비드들이 소적당 1개 이하의 비드를 함유한다.

PCR-라이게이션 반응

한 실시양태에서, PCR-라이게이션 반응을 수행한다. 한 실시양태에서, PCR-라이게이션 반응은 항체 중쇄 가변 영역(또는 이의 일부) 및 항체 경쇄 가변 영역(또는 이의 일부)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 라이게이션된 생성물(예를 들면, 이중 가닥 DNA)을 생성한다. 한 실시양태에서, PCR-라이게이션 반응은 TCR α 쇄(또는 이의 일부) 및 TCR β 쇄(또는 이의 일부)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 라이게이션된 생성물(예를 들면, 이중 가닥 DNA)을 생성한다. 한 실시양태에서, PCR-라이게이션 반응은 TCR γ 쇄(또는 이의 일부) 및 TCR δ 쇄(또는 이의 일부)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 라이게이션된 생성물(예를 들면, 이중 가닥 DNA)을 생성한다. 한 실시양태에서, cDNA와 커플링된 비드, DNA 중합효소, (예를 들면, cDNA의 증폭을 위한) 올리고뉴클레오타이드, 리가제(예를 들면, 열안정성 리가제) 및 완충제를 포함하는 소적에서 PCR-라이게이션 반응을 수행한다.

반응에서 사용될 수 있는 예시적 DNA 중합효소는 Phusion^® 고충실도(High-Fidelity) DNA 중합효소(NEB), Q5^® 고충실도 DNA 중합효소(NEB), Pfu DNA 중합효소, KAPA DNA 중합효소, Vent^® DNA 중합효소, 또는 Taq DNA 중합효소를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

한 실시양태에서, 라이게이션된 생성물은 scFv, Fab 또는 scFab 카세트를 함유한다. 한 실시양태에서, 카세트(예를 들면, scFv 카세트)는 VL-링커-VH로서 구축된다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 한 실시양태에서, 발현 또는 기능에 유의미한 영향을 미치지 않으면서 순서를 VH-링커-VL로 바꿀 수 있다고 생각된다. 한 실시양태에서, 카세트(예를 들면, scFv) 카세트는 VH-링커-VL로서 구축된다. 한 실시양태에서, 카세트는 불변 영역 서열(예를 들면, CH1 도메인 및/또는 CL 도메인), 예를 들면, VL-CL과 커플링된 VH-CH1을 포함한다.

유사하게, 라이게이션된 생성물은 α 쇄-링커-β 쇄 또는 β 쇄-링커-α 쇄, 또는 γ 쇄-링커-δ 쇄 또는 δ 쇄-링커-γ 쇄로서 구축된 카세트를 함유할 수 있다.

한 실시양태에서, VL 서열에 대한 역방향 프라이머는 (a) 링커 서열을 코딩하는 오버행 서열; (b) 예를 들면, 오버행에 있는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들면, 2'-O-메틸 변형을 갖는 3개의 연속 뉴클레오타이드); 또는 (c) 5'-포스페이트 중 하나, 둘 또는 전부를 함유한다. 한 실시양태에서, VH 서열에 대한 정방향 프라이머는 (a) 링커 서열을 코딩하는 오버행 서열; (b) 예를 들면, 오버행에 있는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들면, 2'-O-메틸 변형을 갖는 3개의 연속 뉴클레오타이드); 또는 (c) 5'-포스페이트 중 하나, 둘 또는 전부를 함유한다.

한 실시양태에서, VH 서열에 대한 역방향 프라이머는 (a) 링커 서열을 코딩하는 오버행 서열; (b) 예를 들면, 오버행에 있는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들면, 2'-O-메틸 변형을 갖는 3개의 연속 뉴클레오타이드); 또는 (c) 5'-포스페이트 중 하나, 둘 또는 전부를 함유한다. 한 실시양태에서, VL 서열에 대한 정방향 프라이머는 (a) 링커 서열을 코딩하는 오버행 서열; (b) 예를 들면, 오버행에 있는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들면, 2'-O-메틸 변형을 갖는 3개의 연속 뉴클레오타이드); 또는 (c) 5'-포스페이트 중 하나, 둘 또는 전부를 함유한다.

유사하게, 한 실시양태에서, α 쇄(또는 γ 쇄) 서열에 대한 역방향 프라이머는 (a) 링커 서열을 코딩하는 오버행 서열; (b) 예를 들면, 오버행에 있는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들면, 2'-O-메틸 변형을 갖는 3개의 연속 뉴클레오타이드); 또는 (c) 5'-포스페이트 중 하나, 둘 또는 전부를 함유한다. 한 실시양태에서, β 쇄(또는 δ 쇄) 서열에 대한 정방향 프라이머는 (a) 링커 서열을 코딩하는 오버행 서열; (b) 예를 들면, 오버행에 있는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들면, 2'-O-메틸 변형을 갖는 3개의 연속 뉴클레오타이드); 또는 (c) 5'-포스페이트 중 하나, 둘 또는 전부를 함유한다.

유사하게, 한 실시양태에서, β 쇄(또는 δ 쇄) 서열에 대한 역방향 프라이머는 (a) 링커 서열을 코딩하는 오버행 서열; (b) 예를 들면, 오버행에 있는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들면, 2'-O-메틸 변형을 갖는 3개의 연속 뉴클레오타이드); 또는 (c) 5'-포스페이트 중 하나, 둘 또는 전부를 함유한다. 한 실시양태에서, α 쇄(또는 γ 쇄) 서열에 대한 정방향 프라이머는 (a) 링커 서열을 코딩하는 오버행 서열; (b) 예를 들면, 오버행에 있는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들면, 2'-O-메틸 변형을 갖는 3개의 연속 뉴클레오타이드); 또는 (c) 5'-포스페이트 중 하나, 둘 또는 전부를 함유한다.

반응에서 사용될 수 있는 예시적 리가제(예를 들면, 열안정성 리가제)는 Taq DNA 리가제, Pfu DNA 리가제, Ampligase^® 열안정성 DNA 리가제, Tsc DNA 리가제, Rma DNA 리가제, Tfi DNA 리가제 또는 Tth DNA 리가제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

한 실시양태에서, 완충제는 DNA 중합효소 및 리가제 효소 활성 둘 다를 뒷받침한다.

한 실시양태에서, (예를 들면, PCR 튜브에서) 에멀전을 사용하여 써모사이클링을 수행한다. 한 실시양태에서, 하기 조건을 사용하여 써모사이클링을 수행한다: 30초 내지 2분 동안 95℃ 내지 98℃에서의 초기 변성; 10초 내지 30초 동안 95℃ 내지 98℃에서의 변성, 10초 내지 30초 동안 50℃ 내지 60℃에서의 프라이머 어닐링, 30초 동안 72℃에서의 중합효소 연장, 및 3분 동안 45℃ 내지 55℃에서의 코헤시브 생성물 어닐링 및 라이게이션의 10 내지 30 사이클. 반응물을 4℃에서 유지할 수 있다.

수성 부분의 회수

소적 불안정화 시약, 예를 들면, 퍼플루오로옥탄올(PFO)을 사용하여 (예를 들면, 유착 상이한 용액 상들을 함유하는) 에멀전을 깨뜨릴 수 있다. 한 실시양태에서, (예를 들면, 연결된 생성물 및 임의적으로 연결되지 않은 생성물을 함유하는) 수성 부분을 회수한다. 한 실시양태에서, 비드를 버린다.

연결된 생성물의 정제

(예를 들면, 천연적으로 연결된 VL-링커-VH를 대표하는) 연결된 생성물을 연결되지 않은 생성물(예를 들면, 연결되지 않은 VH 및 VL)로부터 정제할 수 있다. 라이게이션된 생성물은 크기 분리에 의해 라이게이션되지 않은 생성물로부터 분리된다. 예를 들면, 변성 PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 또는 변성 HPLC-SEC를 이용할 수 있다. 연결된 생성물(약 800 내지 900 bp)은 연결되지 않은 생성물(약 350 내지 500 bp)로부터 단리된다. 변성 PAGE 정제를 위해, 라이게이션된 밴드는 겔로부터 잘라내고 전기용출을 수행하여 겔 슬라이스로부터 DNA를 추출한다(Bio-Rad Electro-Elutor).

정제된 연결된 생성물의 증폭

정제된 연결된 생성물은 예를 들면, PCR에 의해 증폭될 수 있다. 예를 들면, 정제된 연결된 생성물은 변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 DNA를 통과하면서 적절하게 판독할 수 있는 조건 하에서 DNA 중합효소(예를 들면, Taq 중합효소)를 사용하는 PCR에 의해 증폭된다.

표준 방법(예를 들면, 발현 벡터를 사용한 전기천공)을 이용하여 최종 PCR 생성물을 효모 내로 도입하여, 생물학적 공급원으로부터 유래한 천연적으로 페어링된 라이브러리를 생성할 수 있다.

리가제 사이클링

한 실시양태에서, 상이한 쇄들(예를 들면, VH 및 VL)은 쇄들 둘 다에 공통된 DNA 서열을 도입하여, 점착성 말단 생성물들이 서로 직접적으로 어닐링하는 것을 용이하게 하는 방식으로 증폭되지 않는다. 한 실시양태에서, 가교(또는 스플린트) 올리고뉴클레오타이드가 cDNA의 증폭 후에 열안정성 리가제의 존재 하에서 포함된다. 가교 올리고뉴클레오타이드는 2개의 쇄들이 리가제의 기질이 되도록 이들을 서로 바로 인접하여 위치시키는 것을 용이하게 할 수 있다. 그 다음, 리가제는 DNA의 쇄들 사이의 공유결합 형성을 촉진한다. 이 기작은 쇄들 둘 다에 공통된 서열이 각각의 서열 내로 도입되는 것(예를 들면, VH 및 VL 둘 다에서 공통의 서열을 갖는 오버행 DNA)을 유발하지 않기 때문에, 중첩 연장 PCR에 의해 스플라이싱될 기회가 없다.

이 방법의 단계들은 에멀전 PCR 단계에서 시작된다는 점을 제외하고 전술된 단계들과 일반적으로 동일하다. cDNA의 PCR 증폭은 소적 내에서 수행될 수 있다. 프라이머는 오버행 서열을 추가할 수 있으나, (상기 전략과 달리) 추가되는, 쇄들 둘 다(예를 들면, VL 및 VH)에 공통된 서열은 일반적으로 없다. 소적 내의 비드는 그의 접합된 올리고뉴클레오타이드를 통해 특이적 오버행 서열을 각각 갖는 2개의 쇄들(예를 들면, VH 및 VL)의 dsDNA 생성물로 충전되거나 포화된다. 소적을 깨뜨리고, 비드에 연결되지 않거나 어닐링되지 않은 임의의 PCR 생성물을 세척하여 제거한다. 2개의 쇄들(예를 들면, VH 및 VL)의 dsDNA를 함유하는 비드를 열안정성 리가제 및 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 새로운 소적 내로 캡슐화한다. 이 에멀전 포맷에서, 3-DNA 조각 복합체의 형성을 용이하게 하는 써모사이클링을 수행한다. 이 복합체는 2개의 쇄들을 연결하는 공유결합 형성을 촉진하는 리가제에 대한 기질이다. 한 실시양태에서, 써모사이클링은 한 기질이 한정적 기질이 될 때까지 모든 '상부 가닥' DNA가 연결된 생성물로 전환되는 것을 보조한다. 또 다른 실시양태에서, 두 가닥들은 라이게이션된다. 예를 들면, 일단 '상부 가닥'이 라이게이션되면, 이 가닥은 반대 가닥을 위한 '스플린트'로서 사용될 수 있고, 리가제는 이 스플린트를 기질로서 인식할 것이다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 이 양상은 특히 반응을 효율적으로 만든다고, 즉, 초기 라이게이션된 생성물은 더 많은 주형(스플린트)으로서 사용되어 훨씬 더 많은 추가 라이게이션된 생성물을 생성할 수 있다고 생각된다. 소적을 깨뜨리고, 라이게이션된 생성물을 표준 PCR 수단으로 증폭한다.

리가제 사이클링 실험을 수행하기 위한 예시적 단계는 이하에 설명되어 있다.

세포 캡슐화

소적은 예를 들면, 주사기 또는 압력 펌프에 의해 제어되는 유체 상의 유동을 갖는 마이크로플루이딕 칩(예를 들면, 돌로마이트로부터의 2R 100 ㎛)을 사용함으로써 형성될 수 있다. 한 실시양태에서, 소적의 수성 상은 완충제, 세포 용해를 돕는 시약, 및 비드를 포함한다. 한 실시양태에서, 완충제는 pH 7.5의 Tris를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 용해를 보조하는 시약은 세제를 포함한다. 세포 용해를 보조하는 데 사용될 수 있는 예시적 세제는 Tween-20, Triton X, IGEPAL 또는 나트륨 라우로일 사르코시네이트(Sarkosyl)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 비드는 자성 비드이다. 한 실시양태에서, 비드는 예를 들면, mRNA(예를 들면, 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 mRNA)에 어닐링하기 위해 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 프라이머)에 커플링된다.

세포 용해

캡슐화 후, 소적은 세포 용해를 용이하게 하기 위해 인큐베이션될 수 있다. 한 실시양태에서, 세제(예를 들면, Tween-20)의 존재 하에서 용해 효율을 개선하기 위해 (예를 들면, 유착 상이한 용액 상들을 함유하는) 에멀전을 가열한다. 한 실시양태에서, 40℃ 내지 80℃, 예를 들면, 40℃ 내지 60℃, 50℃ 내지 70℃, 또는 60℃ 내지 80℃의 온도, 예를 들면, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃ 또는 80℃에서 에멀전을 인큐베이션한다. 한 실시양태에서, 5분 내지 60분, 예를 들면, 10분 내지 45분, 15분 내지 30분, 5분 내지 30분, 또는 30분 내지 50분 동안 에멀전을 인큐베이션한다. 한 실시양태에서, 세포는 가열에 의해 용해된다. 한 실시양태에서, 세포는 효소에 의해 용해된다. 전형적으로, 세포가 용해된 후, mRNA가 유리되고 비드의 올리고뉴클레오타이드에 어닐링함으로써 비드에 포획된다.

비드 회수

소적 불안정화 시약, 예를 들면, 퍼플루오로옥탄올(PFO)을 사용하여 (예를 들면, 유착 상이한 용액 상들을 함유하는) 에멀전을 깨뜨릴 수 있다. 한 실시양태에서, 비드 함유 수성 상을 회수한다. 한 실시양태에서, 비드는 자성 비드이고 자석을 이용함으로써 단리된다. 한 실시양태에서, 비드를 세척하고 완충제(예를 들면, Tris, pH 7.5)에 재현탁한다. 한 실시양태에서, 비드로부터의 mRNA의 해리를 감소시키기 위해 비드를 냉각된 상태로 보관한다.

역전사

표준 방법을 이용하여 역전사를 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 역전사를 비-에멀전 반응에서 수행한다. 한 실시양태에서, 역전사를 에멀전 반응에서 수행한다. 전형적인 실시양태에서, PCR 소적 내에서 역전사 단계를 수행한다. 예를 들면, cDNA 형성 및 dsDNA 증폭을 용이하게 하기 위해 역전사효소 및 DNA 중합효소 둘 다와 함께 mRNA-비드를 소적 내로 캡슐화한다. 한 실시양태에서, 포획된 mRNA를 갖는 비드를 완충제-효소 혼합물(예를 들면, Superscript II RT)에 재현탁하고 10분 내지 60분(예를 들면, 15분) 동안 35℃ 내지 45℃(예를 들면, 40℃)에서 인큐베이션하여 역전사를 용이하게 한다. 한 실시양태에서, 비드에 커플링된 올리고뉴클레오타이드는 제1 가닥 cDNA의 합성을 위한 프라이머로서 사용된다. 한 실시양태에서, 역전사 후 비드를 완충제(예를 들면, Tris, pH 7.5)로 세척한다.

PCR을 위한 비드 캡슐화

PCR 반응

한 실시양태에서, PCR 반응을 수행한다. 한 실시양태에서, cDNA와 커플링된 비드, DNA 중합효소, (예를 들면, cDNA의 증폭을 위한) 올리고뉴클레오타이드 및 완충제를 포함하는 소적 내에서 PCR 반응을 수행한다.

반응에서 사용될 수 있는 예시적 DNA 중합효소는 Phusion^® 고충실도 DNA 중합효소(NEB), Q5^® 고충실도 DNA 중합효소(NEB), Pfu DNA 중합효소, KAPA DNA 중합효소, Vent^® DNA 중합효소, 또는 Taq DNA 중합효소를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

한 실시양태에서, PCR 생성물은 scFv 카세트를 함유한다. 한 실시양태에서, scFv 카세트는 VL-링커-VH로서 구축된다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 한 실시양태에서, 발현 또는 기능에 유의미한 영향을 미치지 않으면서 순서를 VH-링커-VL로 바꿀 수 있다고 생각된다. 한 실시양태에서, scFv 카세트는 VH-링커-VL로서 구축된다.

유사하게, PCR 생성물은 α 쇄-링커-β 쇄 또는 β 쇄-링커-α 쇄, 또는 γ 쇄-링커-δ 쇄 또는 δ 쇄-링커-γ 쇄로서 구축된 카세트를 함유할 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 표적 가변 영역 서열에 대한 프라이머는 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 제1 서열, 스페이서(예를 들면, 본원에 기재된 스페이서, 예를 들면, PEG 스페이서), 제1 서열의 적어도 일부에 상보적인 서열, 유니버셜 프라이밍 서열, 및 표적 가변 영역 서열에 상보적인 서열을 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 함유할 수 있다.

한 실시양태에서, (예를 들면, PCR 튜브에서) 에멀전을 사용하여 써모사이클링을 수행한다. 한 실시양태에서, 하기 조건을 사용하여 써모사이클링을 수행한다: 30초 내지 2분 동안 95℃ 내지 98℃에서의 초기 변성; 10초 내지 30초 동안 95℃ 내지 98℃에서의 변성, 10초 내지 30초 동안 50℃ 내지 60℃에서의 프라이머 어닐링, 및 30초 동안 72℃에서의 중합효소 연장의 10 내지 30 사이클. 한 실시양태에서, 비드로의 PCR 생성물의 포획을 용이하게 하기 위해 반응물을 느리게 냉각시킨다. 반응물을 4℃에서 유지할 수 있다.

비드 회수

리가제 사이클링을 위한 비드 캡슐화

리가제 사이클링 반응

한 실시양태에서, 리가제 사이클링 반응을 수행한다. 한 실시양태에서, PCR 생성물과 커플링된 비드, (예를 들면, 한 가닥(예를 들면, "상부" VL 가닥)의 3' 말단 및 또 다른 가닥(예를 들면, "상부" VH 가닥)의 5' 말단에 상보적이고 어닐링하는) 스플린트 올리고뉴클레오타이드, 열안정성 리가제, 및 리가제 효소 활성을 뒷받침하는 하나 이상의 반응 성분(예를 들면, NAD)을 포함하는 소적 내에서 리가제 사이클링 반응을 수행한다.

한 실시양태에서, (예를 들면, PCR 튜브 내에서) 에멀전을 사용하여 써모사이클링을 수행한다. 한 실시양태에서, 하기 조건을 이용하여 써모사이클링을 수행한다: 30초 동안 90℃ 내지 95℃에서의 변성, 및 1분 내지 3분 동안 50℃ 내지 60℃에서의 어닐링 및 라이게이션의 3 내지 15 사이클. 반응물을 4℃에서 유지할 수 있다.

수성 부분의 회수

연결된 생성물의 정제

(예를 들면, 천연적으로 연결된 VL-링커-VH를 대표하는) 연결된 생성물을 연결되지 않은 생성물(예를 들면, 연결되지 않은 VH 및 VL)로부터 정제할 수 있다. 라이게이션된 생성물은 크기 분리에 의해 라이게이션되지 않은 생성물로부터 분리된다. 예를 들면, 변성 PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동), 변성 HPLC-SEC, 아가로스 겔 전기영동 또는 AMPure XP 비드를 사용할 수 있다. 연결된 생성물(약 800 내지 900 bp)은 연결되지 않은 생성물(약 350 내지 500 bp)로부터 단리된다. 변성 PAGE 정제를 위해, 라이게이션된 밴드는 겔로부터 잘라내고 전기용출을 수행하여 겔 슬라이스로부터 DNA를 추출한다(Bio-Rad Electro-Elutor).

정제된 연결된 생성물의 증폭

정제된 연결된 생성물은 예를 들면, PCR에 의해 증폭될 수 있다. 예를 들면, 정제된 연결된 생성물은 라이게이션된 생성물의 외부 말단들을 어닐링하는 올리고뉴클레오타이드와 함께 표준 조건 하에서 DNA 중합효소(예를 들면, Taq 중합효소)를 사용하는 PCR에 의해 증폭된다.

표준 방법(예를 들면, 발현 벡터를 사용한 전기천공)을 이용하여 최종 PCR 생성물을 효모 또는 포유동물 세포 내로 도입하여, 생물학적 공급원으로부터 유래한 천연적으로 페어링된 라이브러리를 생성할 수 있다.

항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되는 것인 방법의 예시적 단계들은 도 2a 내지 2d에 표시되어 있다.

추가 예시적 방법

한 양태에서, 본 개시는 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고, 도 1로부터의 단계 A1, B1, C1 및 D1을 수행함으로써, HCVR의 HC 요소 및 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계를 포함하고, HCVR과 LCVR은 매칭되는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고, 도 1로부터의 단계 A1, B1, C1, D2 및 E1을 수행함으로써, HCVR의 HC 요소 및 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계를 포함하고, HCVR과 LCVR은 매칭되는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고, 도 1로부터의 단계 A1, B1, C2 및 D3을 수행함으로써, HCVR의 HC 요소 및 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계를 포함하고, HCVR과 LCVR은 매칭되는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고, 도 1로부터의 단계 A1, B1, C2, D4 및 E2를 수행함으로써, HCVR의 HC 요소 및 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계를 포함하고, HCVR과 LCVR은 매칭되는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고, 도 1로부터의 단계 A1, B1, C3 및 D5를 수행함으로써, HCVR의 HC 요소 및 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계를 포함하고, HCVR과 LCVR은 매칭되는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고, 도 1로부터의 단계 A1, B1, C3, D6 및 E3을 수행함으로써, HCVR의 HC 요소 및 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계를 포함하고, HCVR과 LCVR은 매칭되는 것인 방법을 특징으로 한다.

상기 예시적 방법들에서, cDNA는 전형적으로 이 워크플로우 개념에서 기재(예를 들면, 비드)에 포획되지 않는다. 예를 들면, mRNA가 기재(예를 들면, 비드)로부터 해리한 후, 분리된 반응 부위(예를 들면, 마이크로챔버), 예를 들면, 소적 내의 용액에서 cDNA가 제조된 다음, 분리된 반응 부위(예를 들면, 마이크로챔버), 예를 들면, 소적 내의 용액에서 주형으로서의 cDNA로부터 PCR 생성물이 제조된다. 한 실시양태에서, 방법은 RT-PCR 반응을 포함하고, 이 때 두 효소 단계들은 소적 내의 용액에서 일어난다. 상기 예시적 방법들에서, 증폭된 생성물은 전형적으로 기재(예를 들면, 비드)에 포획되고, 이것은 페어링된 생성물을 다음 분리된 반응 부위(예를 들면, 마이크로챔버), 예를 들면, 다음 소적 내로 전이시키는 것을 용이하게 할 수 있다.

항체 분자

본원은 항체 분자 및 항체 분자의 라이브러리를 개시한다. 한 실시양태에서, 항체 분자 또는 항체 분자의 라이브러리는 본원에 기재된 방법에 의해 제조된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체 분자"는 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들면, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편을 지칭한다. 용어 "항체 분자"는 예를 들면, 전체 길이 성숙 항체, 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들면, 항체 분자는 중쇄(H) 가변 도메인 서열(본원에서 VH로서 약칭됨) 및 경쇄(L) 가변 도메인 서열(본원에서 VL로서 약칭됨)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 항체 분자는 2개의 중쇄(H) 가변 도메인 서열들 및 2개의 경쇄(L) 가변 도메인 서열들을 포함함으로써, 전체 항체의 변형에 의해 생성될 수 있거나 재조합 DNA 기술의 이용을 통해 새로 합성될 수 있는 2개의 항원 결합 부위, 예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Fd, Fd', Fv, 단일 쇄 항체(예를 들면, scFv), 단일 가변 도메인 항체, 디아바디(Dab)(2가 및 이중특이적) 및 키메라(예를 들면, 인간화된) 항체를 형성한다. 이 기능성 항체 단편들은 그들 각각의 항원 또는 수용체에 선택적으로 결합하는 능력을 보유한다. 항체 및 항체 단편은 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE를 포함하나 이들로 한정되지 않는 항체의 임의의 클래스, 및 항체의 임의의 서브클래스(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)로부터 유래할 수 있다. 항체 분자는 단일클론 또는 다중클론 항체 분자일 수 있다. 항체 분자는 인간, 인간화된, CDR-이식된 또는 시험관내에서 생성된 항체일 수도 있다. 항체 분자는 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 가질 수 있다. 항체 분자는 예를 들면, 카파 또는 람다로부터 선택된 경쇄도 가질 수 있다. 용어 "면역글로불린"(Ig)은 본원에서 용어 "항체"와 상호교환 가능하게 사용된다.

항원 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인들로 구성된 Fv 단편. (v) VH 도메인으로 구성된 디아바디(dAb) 단편; (vi) 낙타과 또는 낙타과화된 가변 도메인; (vii) 단일 쇄 Fv(scFv)(예를 들면, 문헌(Bird et al. (1988) Science 242:423-426) 및 문헌(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883) 참조); (viii) 단일 도메인 항체가 있다. 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 여러 통상적인 기법들을 포함하는 임의의 적합한 방법을 이용하여 이 항체 단편들을 수득할 수 있고, 온전한 항체와 동일한 방식으로 상기 단편들을 유용성에 대해 스크리닝할 수 있다.

용어 "항체"는 온전한 분자뿐만 아니라 이의 기능성 단편도 포함한다. 항체의 특성을 변형시키기 위해(예를 들면, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능 또는 보체 기능 중 하나 이상을 증가시키거나 감소시키기 위해) 항체의 불변 영역을 변경, 예를 들면, 돌연변이시킬 수 있다.

항체 분자는 단일 쇄 항체일 수 있다. 단일 쇄 항체(scFv)는 조작될 수 있다(예를 들면, 문헌(Colcher, D. et al. (1999) Ann N Y Acad Sci 880:263-80) 및 문헌(Reiter, Y. (1996) Clin Cancer Res 2:245-52) 참조). 단일 쇄 항체를 이량체화하거나 다량체화하여, 동일한 표적 단백질의 상이한 에피토프들에 대한 특이성을 갖는 다가 항체를 생성할 수 있다.

본원에 개시된 항체 분자는 단일 도메인 항체일 수도 있다. 단일 도메인 항체는 상보성 결정 영역이 단일 도메인 폴리펩타이드의 일부인 항체를 포함할 수 있다. 예로는 중쇄 항체, 경쇄를 천연적으로 결여하는 항체, 통상적인 4-쇄 항체로부터 유래한 단일 도메인 항체, 조작된 항체, 및 항체로부터 유래한 단일 도메인 스카폴드 이외의 단일 도메인 스카폴드가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 단일 도메인 항체는 당분야의 임의의 단일 도메인 항체, 또는 임의의 장래 단일 도메인 항체일 수 있다. 단일 도메인 항체는 마우스, 인간, 낙타, 라마, 어류, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 종으로부터 유래할 수 있다. 일부 양태에 따르면, 단일 도메인 항체는 경쇄를 결여하는 중쇄 항체로서 공지되어 있는 천연 생성 단일 도메인 항체이다. 이러한 단일 도메인 항체는 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 94/04678호에 개시되어 있다. 명료성 이유로, 경쇄를 천연적으로 결여하는 중쇄 항체로부터 유래한 이 가변 도메인은 본원에서 이것을 4-쇄 면역글로불린의 통상적인 VH와 구별하기 위해 VHH 또는 나노바디로서 공지되어 있다. 이러한 VHH 분자는 낙타과 종, 예를 들면, 낙타, 라마, 단봉낙타, 알파카 및 과나코에서 생성된 항체로부터 유래할 수 있다. 낙타과 이외의 다른 종도 경쇄를 천연적으로 결여하는 중쇄 항체를 생성할 수 있고; 이러한 VHH도 고려된다.

VH 및 VL 영역은 "프레임워크 영역"(FR 또는 FW)으로서 명명된, 보다 더 잘 보존된 영역에 의해 산재된, "상보성 결정 영역"(CDR)으로서 명명된 초가변 영역으로 세분될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화성을 부여하는, 항체 가변 영역 내의 아미노산 서열을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프레임워크", "FW" 및 "FR"은 상호교환 가능하게 사용된다.

프레임워크 영역 및 CDR의 정도는 다수의 방법들에 의해 정확히 정의되었다(문헌(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242); 문헌(Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917); 및 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된 AbM 정의) 참조). 일반적으로, 예를 들면, 문헌(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg))을 참조한다. 한 실시양태에서, 하기 정의가 사용된다: 중쇄 가변 도메인의 CDR1의 AbM 정의 및 다른 CDR에 대한 카바트(Kabat) 정의. 한 실시양태에서, 카바트 정의는 모든 CDR들에 대해 사용된다. 추가로, 카바트 또는 AbM CDR에 대해 기재된 실시양태는 초티아(Chothia) 초가변 루프를 사용함으로써 실시될 수도 있다. 각각의 VH 및 VL은 전형적으로 아미노-말단부터 카복시-말단까지 하기 순서로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4.

본원에서 사용된 바와 같이, "면역글로불린 가변 도메인 서열"은 면역글로불린 가변 도메인의 구조를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들면, 상기 서열은 천연 생성 가변 도메인의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 서열은 1개 또는 2개 이상의 N-말단 또는 C-말단 아미노산을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있거나, 단백질 구조의 형성에 적합한 다른 변경을 포함할 수 있다.

용어 "항원 결합 영역"은 항원 또는 이의 에피토프에 결합하는 계면을 형성하는 결정인자를 포함하는 항체 분자의 일부를 지칭한다. 단백질(또는 단백질 모방 물질)에 대하여, 항원 결합 영역은 전형적으로 항원에 결합하는 계면을 형성하는 하나 이상의 루프(예를 들면, 적어도 4개의 아미노산 또는 아미노산 모방 물질)을 포함한다. 전형적으로, 항체 분자의 항원 결합 영역은 적어도 1개 또는 2개의 CDR 및/또는 초가변 루프, 또는 보다 전형적으로 적어도 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR 및/또는 초가변 루프를 포함한다.

용어 "경쟁한다" 또는 "교차경쟁한다"는 항체 분자가 또 다른 항체 분자와 표적의 결합을 방해하는 능력을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 결합의 방해는 직접적일 수 있거나 간접적일 수 있다(예를 들면, 항체 분자 또는 표적의 알로스테릭 조절을 통한 방해). 항체 분자가 또 다른 항체 분자와 표적의 결합을 방해할 수 있는 정도, 및 경쟁한다고 말할 수 있는 지는 경쟁 결합 어세이, 예를 들면, FACS 어세이, ELISA 또는 BIACORE 어세이를 이용함으로써 확인될 수 있다. 한 실시양태에서, 경쟁 결합 어세이는 정량적 경쟁 어세이이다. 한 실시양태에서, 경쟁 결합 어세이(예를 들면, 본원에 기재된 경쟁 어세이)에서 제1 항체 분자와 표적의 결합이 10% 이상, 예를 들면, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상 감소될 때, 제1 항체 분자가 표적에의 결합에 대해 제2 항체 분자와 경쟁한다고 말한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 단일클론 항체는 하이브리도마 기술, 또는 하이브리도마 기술을 이용하지 않는 방법(예를 들면, 재조합 방법)에 의해 제조될 수 있다.

"효과적인 인간" 단백질은 중화 항체 반응, 예를 들면, 인간 항-뮤린 항체(HAMA) 반응을 일으키지 않는 단백질이다. HAMA는 다수의 환경들, 예를 들면, 항체 분자가 반복적으로 투여되는 경우, 예를 들면, 만성 또는 재발성 질환 상태의 치료에 있어서 문제점이 될 수 있다. HAMA 반응은 혈청으로부터의 증가된 항체 제거(예를 들면, 문헌(Saleh et al., Cancer Immunol. Immunother. 32:180-190 (1990)) 참조) 및 잠재적 알레르기 반응(예를 들면, 문헌(LoBuglio et al., Hybridoma, 5:5117-5123 (1986)) 참조) 때문에 반복된 항체 투여를 잠재적으로 비효과적으로 만들 수 있다.

항체 분자는 다중클론 또는 단일클론 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 재조합적으로 생성될 수 있고, 예를 들면, 임의의 적합한 파지 디스플레이 또는 조합적 방법에 의해 생성될 수 있다.

항체를 생성하는 다양한 파지 디스플레이 및 조합적 방법들이 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 내용이 본원에 참고로 도입되는 문헌(Ladner et al. 미국 특허 제5,223,409호; Kang et al. 국제 특허출원 공보 제WO 92/18619호; Dower et al. 국제 특허출원 공보 제WO 91/17271호; Winter et al. 국제 특허출원 공보 제WO 92/20791호; Markland et al. 국제 특허출원 공보 제WO 92/15679호; Breitling et al. 국제 특허출원 공보 제WO 93/01288호; McCafferty et al. 국제 특허출원 공보 제WO 92/01047호; Garrard et al. 국제 특허출원 공보 제WO 92/09690호; Ladner et al. 국제 특허출원 공보 제WO 90/02809호; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; and Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982)에 기재되어 있음).

한 실시양태에서, 항체 분자는 전체 인간 항체(예를 들면, 인간 면역글로불린 서열로부터 항체를 생성하도록 유전적으로 조작된 마우스에서 제조된 항체) 또는 비인간 항체, 예를 들면, 설치류(마우스 또는 래트), 염소, 영장류(예를 들면, 원숭이), 낙타 항체이다. 한 실시양태에서, 비인간 항체는 설치류(마우스 또는 래트) 항체이다. 설치류 항체를 제조하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다.

인간 단일클론 항체는 마우스 시스템보다 오히려 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 형질전환 마우스를 사용함으로써 생성될 수 있다. 관심 있는 항원으로 면역화된 이 형질전환 마우스로부터의 비장세포를 사용하여, 인간 단백질로부터의 에피토프에 대한 특이적 친화성을 갖는 인간 mAb를 분비하는 하이브리도마를 생성한다(예를 들면, 문헌(Wood et al. 국제 특허출원 공보 제WO 91/00906호, Kucherlapati et al. 국제 특허출원 공보 제WO 91/10741호; Lonberg et al. 국제 특허출원 공보 제WO 92/03918호; Kay et al. 국제 특허출원 공보 제WO 92/03917호; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison, S.L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326) 참조).

항체는 가변 영역 또는 이의 일부, 예를 들면, CDR이 비인간 유기체, 예를 들면, 래트 또는 마우스에서 생성된 항체일 수 있다. 키메라 항체, CDR-이식된 항체 및 인간화된 항체는 본 발명 내에 있다. 비인간 유기체, 예를 들면, 래트 또는 마우스에서 생성된 후, 인간에서의 항원성을 감소시키도록 예를 들면, 가변 프레임워크 또는 불변 영역에서 변형된 항체는 본 발명 내에 있다.

키메라 항체는 임의의 적합한 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 수 있다. 여러 기법들이 당분야에서 공지되어 있다(문헌(Robinson et al., 국제 특허출원 제PCT/US86/02269호; Akira, et al., 유럽 특허출원 제184,187호; Taniguchi, M., 유럽 특허출원 제171,496호; Morrison et al., 유럽 특허출원 제173,494호; Neuberger et al., 국제 특허출원 공보 제WO 86/01533호; Cabilly et al. 미국 특허 제4,816,567호; Cabilly et al., 유럽 특허출원 제125,023호; Better et al. (1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; and Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559) 참조).

인간화된 또는 CDR-이식된 항체는 기증자 CDR에 의해 대체된 (면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄의) 적어도 1개 또는 2개, 일반적으로 모든 3개의 수용자 CDR을 가질 것이다. 상기 항체가 비인간 CDR의 적어도 일부로 대체될 수 있거나, CDR들 중 일부만이 비인간 CDR로 대체될 수 있다. 인간화된 항체와 항원의 결합을 위해 요구된 수의 CDR만을 대체할 필요가 있다. 한 실시양태에서, 기증자는 설치류 항체, 예를 들면, 래트 또는 마우스 항체일 것이고, 수용자는 인간 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크일 것이다. 전형적으로, CDR을 제공하는 면역글로불린은 "기증자"로서 지칭되고, 프레임워크를 제공하는 면역글로불린은 "수용자"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 기증자 면역글로불린은 비인간(예를 들면, 설치류) 면역글로불린이다. 수용자 프레임워크는 전형적으로 천연 생성(예를 들면, 인간) 프레임워크 또는 컨센서스 프레임워크, 또는 이와 약 85% 이상, 예를 들면, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일한 서열이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 서열"은 관련된 서열들의 패밀리에서 가장 흔히 발견되는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로부터 형성된 서열을 지칭한다(예를 들면, 문헌(Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)) 참조). 단백질들의 패밀리에서, 컨센서스 서열 내의 각각의 위치는 상기 패밀리에서 그 위치에서 가장 흔히 발견되는 아미노산에 의해 점유된다. 2개의 아미노산들이 동등하게 흔히 발견되는 경우, 이들 각각이 컨센서스 서열에 포함될 수 있다. "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열 내의 프레임워크 영역을 지칭한다.

항체는 임의의 적합한 방법에 의해 인간화될 수 있고, 여러 이러한 방법들이 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 내용이 본원에 참고로 도입되는 문헌(Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207), 문헌(Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214), 및 미국 특허 제5,585,089호, 제5,693,761호 및 제5,693,762호(Queen et al.) 참조).

인간화된 또는 CDR-이식된 항체는 CDR 이식 또는 CDR 치환에 의해 생성될 수 있고, 이 때 면역글로불린 쇄의 1개, 2개 또는 모든 CDR들이 대체될 수 있다. 예를 들면, 내용이 본원에 명확히 참고로 도입되는 미국 특허 제5,225,539호; 문헌(Jones et al. 1986 Nature 321:552-525); 문헌(Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534); 문헌(Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060); 및 원터(Winter)의 미국 특허 제5,225,539호를 참조한다. 윈터는 인간화된 항체를 제조하는 이용될 수 있는 CDR 이식 방법을 기술한다(내용이 명맥히 참고로 도입되는, 1987년 3월 26일에 출원된 영국 특허출원 제2188638A호; 및 원터의 미국 특허 제5,225,539호).

특정 아미노산이 치환되어 있거나, 결실되어 있거나 추가되어 있는 인간화된 항체도 제공된다. 기증자로부터의 아미노산을 선택하기 위한 기준은 예를 들면, 내용이 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,585,089호, 예를 들면, 미국 특허 제5,585,089호의 컬럼 12 내지 16에 기재되어 있다. 항체를 인간화하는 다른 기법은 1992년 12월 23일에 공개된 유럽 특허출원 제519596 A1호(Padlan et al.)호에 기재되어 있다.

한 실시양태에서, 항체 분자는 예를 들면, IgG1, IgG2(예를 들면, IgG2a), IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE의 중쇄 불변 영역으로부터 선택된, 특히 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 (예를 들면, 인간) 중쇄 불변 영역으로부터 선택된 중쇄 불변 영역을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 항체 분자는 예를 들면, 카파 또는 람다의 (예를 들면, 인간) 경쇄 불변 영역으로부터 선택된 경쇄 불변 영역을 가진다. 불변 영역은 항체 분자의 특성을 변형시키도록(예를 들면, Fc 수용체 결합, 항체 글리코실화, 시스테인 잔기의 수, 이펙터 세포 기능, 및/또는 보체 기능 중 하나 이상을 증가시키거나 감소시키도록) 변경될, 예를 들면, 돌연변이될 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 이펙터 기능을 가질 수 있고 보체를 고정시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체 분자는 이펙터 세포를 결집시키지 않거나 보체를 고정시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체 분자는 Fc 수용체에 결합하는 능력이 감소되어 있거나 이 능력을 갖지 않는다. 예를 들면, 항체 분자는 Fc 수용체에의 결합을 뒷받침하지 않는 이소타입 또는 서브타입, 단편 또는 다른 돌연변이체일 수 있고, 예를 들면, 항체 분자는 돌연변이된 또는 결실된 Fc 수용체 결합 영역을 가진다.

한 실시양태에서, 항체 분자의 불변 영역은 변경된다. 항체 불변 영역을 변경시키는 방법은 당분야에서 공지되어 있다. 변경된 기능, 예를 들면, 이펙터 리간드, 예컨대, 세포의 FcR, 또는 보체의 C1 성분에 대한 변경된 친화성을 갖는 항체 분자는 항체의 불변 부분 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 잔기로 대체함으로써 생성될 수 있다(예를 들면, 내용이 본원에 참고로 도입되는 유럽 특허출원 제388,151 A1호, 미국 특허 제5,624,821호 및 미국 특허 제5,648,260호 참조). 항체 구조를 안정화시키는 아미노산 돌연변이, 예컨대, 인간 IgG4 내의 S228P(EU 명명법, 카바트 명명법의 경우 S241P)도 고려된다. 뮤린 또는 다른 종 면역글로불린에 적용되는 경우 이 기능들을 감소시키거나 제거할 유사한 유형의 변경이 기재될 수 있다.

한 실시양태에서, 항체 분자의 아미노산은 오로지 정규 아미노산이다. 한 실시양태에서, 항체 분자는 천연 생성 아미노산; 이의 유사체, 유도체 및 동족체; 변이체 측쇄를 갖는 아미노산 유사체; 및/또는 이들 중 임의의 물질의 모든 입체이성질체들을 포함한다. 항체 분자는 아미노산의 D 또는 L 광학 이성질체, 및 펩티드 모방 물질을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 항체 분자의 폴리펩타이드는 선형 또는 분지된 폴리펩타이드일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 불연속될 수 있다. 항체 분자는 예를 들면, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예컨대, 표지부착 성분과의 접합에 의해 변형될 수도 있다. 폴리펩타이드는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 진핵 또는 원핵 숙주로부터 재조합 기법에 의해 생성될 수 있거나, 합성 절차의 생성물일 수 있다.

본원에 기재된 항체 분자는 비접합된 형태로 단독으로 사용될 수 있거나, 물질, 예를 들면, 독소 또는 모이어티(예를 들면, 치료 약물; 방사선을 방사하는 화합물; 식물, 진균 또는 세균 유래의 분자; 또는 생물학적 단백질(예를 들면, 단백질 독소) 또는 입자(예를 들면, 바이러스 코트 단백질을 통해, 예를 들면 재조합 바이러스 입자)에 결합될 수 있다. 예를 들면, 항체 분자는 방사성 동위원소, 예컨대, α, β 또는 γ 방사체, 또는 β 및 γ 방사체에 커플링될 수 있다.

항체 분자는 유도체화될 수 있거나 또 다른 기능성 분자(예를 들면, 또 다른 펩타이드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "유도체화된" 항체 분자는 변형된 항체 분자이다. 유도체화 방법은 형광 모이어티, 방사뉴클레오타이드, 독소, 효소 또는 친화성 리간드, 예컨대, 바이오틴의 추가를 포함하나 이것으로 한정되지 않는다. 따라서, 항체 분자는 면역부착 분자를 포함하는, 본원에 기재된 항체의 유도체화된 형태 및 다른 방식으로 변형된 형태를 포함하기 위한 것이다. 예를 들면, 항체 분자는 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 또는 다른 방식에 의해) 하나 이상의 다른 분자 독립체, 예컨대, 또 다른 항체(예를 들면, 이중특이적 항체 또는 디아바디), 검출 가능한 물질, 독소, 약제, 및/또는 항체 또는 항체 일부와 또 다른 분자(예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드에 기능적으로 연결될 수 있다.

일부 유형의 유도체화된 항체 분자들은 (예를 들면, 이중특이적 항체를 생성하기 위해 동일한 유형 또는 상이한 유형의) 2개 이상의 항체들을 가교결합시킴으로써 생성된다. 적합한 가교링커는 적절한 스페이서에 의해 분리된 2개의 상이한 반응성 기들을 갖는 이종작용성 가교링커(예를 들면, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르), 또는 동종작용성 가교링커(예를 들면, 디석신이미딜 수버레이트)를 포함한다. 이러한 링커는 피어스 케미칼 컴파니(Pierce Chemical Company, 일리노이주 록포드 소재)로부터 입수될 수 있다.

항체 분자의 유도체화(또는 표지부착)에 사용될 수 있는 유용한 검출 가능한 물질은 형광 화합물, 다양한 효소들, 보결분자단, 발광 물질, 생체발광 물질, 형광 방사 금속 원자, 예를 들면, 유로퓸(Eu) 및 다른 안타나이드(anthanide), 및 방사성 물질(이하에 기재됨)을 포함한다. 예시적 형광 검출 가능한 물질은 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 파이코에리쓰린 등을 포함한다. 항체는 검출 가능한 효소, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 호스라디쉬 퍼록시다제, β-갈락토시다제, 아세틸콜린에스터라제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 유도체화될 수도 있다. 항체가 검출 가능한 효소에 의해 유도체화될 때, 항체는 효소가 사용하는 추가 시약을 첨가하여 검출 가능한 반응 생성물을 생성함으로써 검출된다. 예를 들면, 검출 가능한 물질인 호스라디쉬 퍼록시다제가 존재할 때, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출 가능한 착색된 반응 생성물을 이끌어낸다. 항체 분자는 보결분자단(예를 들면, 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴)에 의해 유도체화될 수도 있다. 예를 들면, 항체는 바이오틴에 의해 유도체화될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접적인 측정을 통해 검출될 수 있다. 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 파이코에리쓰린이 있고; 발광 물질의 예로는 루미놀이 있고; 생체발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린 및 애쿠오린이 있다.

표지된 항체 분자는 예를 들면, (i) 표준 기법, 예컨대, 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전으로 소정의 항원을 단리하는 것; (ii) 단백질 발현의 존재도 및 패턴을 평가하기 위해 (예를 들면, 세포 용해물 또는 세포 상청액에서) 소정의 항원을 검출하는 것; 및 (iii) 예를 들면, 소정의 치료 섭생법의 효능을 확인하기 위해 임상 시험 절차의 일부로서 조직에서 단백질 수준을 모니터링하는 것을 포함하는 다수의 환경에서 진단적 및/또는 실험적으로 사용될 수 있다.

항체 분자는 또 다른 분자 독립체, 전형적으로 표지, 또는 치료(예를 들면, 항미생물(예를 들면, 항균 또는 살균), 면역조절, 면역자극, 세포독성 또는 세포증식억제) 물질 또는 모이어티에 접합될 수 있다. 방사성 동위원소는 진단 또는 치료 적용에 사용될 수 있다. 항체 분자에 커플링될 수 있는 방사성 동위원소는 α, β 또는 γ 방사체, 또는 β 및 γ 방사체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 방사성 동위원소는 요오드(¹³¹I 또는 ¹²⁵I), 이트륨(⁹⁰Y), 루테튬(¹⁷⁷Lu), 악티늄(²²⁵Ac), 프라세오디뮴, 아스타틴(²¹¹At), 레늄(¹⁸⁶Re), 비스무쓰(²¹²Bi 또는 ²¹³Bi), 인듐(¹¹¹In), 테크네튬(⁹⁹mTc), 인(³²P), 로듐(¹⁸⁸Rh), 황(³⁵S), 탄소(¹⁴C), 삼중수소(³H), 크로뮴(⁵¹Cr), 염소(³⁶Cl), 코발트(⁵⁷Co 또는 ⁵⁸Co), 철(⁵⁹Fe), 셀레늄(⁷⁵Se) 또는 갈륨(⁶⁷Ga)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 치료제로서 유용한 방사성 동위원소는 이트륨(⁹⁰Y), 루테튬(¹⁷⁷Lu), 악티늄(²²⁵Ac), 프라세오디뮴, 아스타틴(²¹¹At), 레늄(¹⁸⁶Re), 비스무쓰(²¹²Bi 또는 ²¹³Bi) 및 로듐(¹⁸⁸Rh)을 포함한다. 예를 들면, 진단에 유용한 표지로서 유용한 방사성 동위원소는 요오드(¹³¹I 또는 ¹²⁵I), 인듐(¹¹¹In), 테크네튬(⁹⁹mTc), 인(³²P), 탄소(¹⁴C) 및 삼중수소(³H), 또는 상기 나열된 치료 동위원소들 중 하나 이상을 포함한다.

본 개시는 방사성표지된 항체 분자 및 이를 표지하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 항체 분자를 표지하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 항체 분자를 킬레이팅제와 접촉시킴으로써, 접합된 항체를 생성하는 단계를 포함한다. 접합된 항체를 방사성 동위원소, 예를 들면, ¹¹¹인듐, ⁹⁰이트륨 및 ¹⁷⁷루테튬으로 방사성표지함으로써, 표지된 항체 분자를 생성한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 항체 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 항원 또는 이의 단편을 제공하는 단계; 항원에 특이적으로 결합하는 항체 분자를 수득하는 단계; 항원 및/또는 항원을 발현하는 유기체의 활성을 조절하는 데 있어서 항체 분자의 효능을 평가하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 항체 분자의 유도체(예를 들면, 인간화된 항체 분자)를 비롯한 항체 분자를 대상체, 예를 들면, 인간에게 투여하는 단계도 포함할 수 있다.

본 개시는 상기 항체 분자를 코딩하는 분리된 핵산 분자, 이의 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 상기 핵산 분자는 RNA, 게놈 DNA 및 cDNA를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

다른 결합 폴리펩타이드

본원의 개시는 항체 분자로 한정되기 위한 것이 아니다. 본원에 기재된 방법은 2개 이상의 쇄들을 가진(예를 들면, 적어도 2개의 페어링된 또는 매칭된 쇄들을 가진) 임의의 결합 폴리펩타이드에 넓게 적용될 수 있다.

한 실시양태에서, 결합 분자는 X 쇄 가변 영역 및 Y 쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 본원의 임의의 양태, 실시양태 및 정의에서, 항체 중쇄(또는 가변 영역)는 X 쇄(또는 가변 영역)로 대체될 수 있고, 항체 경쇄(또는 가변 영역)는 Y 쇄(또는 가변 영역)로 대체될 수 있다.

한 양태에서, 본 개시는 항체 중쇄 가변 영역(XCVR)의 X 쇄 요소(XC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(YCVR)의 Y 쇄 요소(YC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, XCVR과 YCVR이 매칭되고,

a) i) 세포로부터의 XCVR의 XC 요소, 예를 들면, X 쇄 가변 영역 서열(XCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 X 쇄 이중 가닥 cDNA(XC ds cDNA)의 가닥인 X 쇄(XC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 YCVR의 YC 요소, 예를 들면, Y 쇄 가변 영역 서열(YCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 Y 쇄 이중 가닥 cDNA(YC ds cDNA)의 가닥인 Y 쇄(YC) 가닥을 포함하는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

b) XC 가닥을 YC 가닥에 공유결합시킴으로써, 예를 들면, 라이게이션시킴으로써, XCVR의 XC 요소 및 YCVR의 YC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계

를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 YCVR 또는 XCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않고, XCVR과 YCVR이 매칭되는 것인 방법을 특징으로 한다.

"매칭된"은, 이 용어가 X 쇄 가변 영역 및 Y 쇄 가변 영역과 관련하여 본원에서 사용될 때, 이들이 동일한 세포로부터 유래한다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, X 쇄 가변 영역 및 Y 쇄 가변 영역은 다량체성 단백질, 또는 다량체성 단백질의 일부를 형성할 수 있다. X 쇄 가변 영역의 요소 및 Y 쇄 가변 영역의 요소와 관련하여, 상기 용어는 상기 요소들의 공급원인 X 쇄 가변 영역 및 Y 쇄 가변 영역이 동일한 세포로부터 유래한다는 것을 의미한다.

"X 쇄 가변 영역 서열" 또는 "XCVRS"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 또 다른 폴리펩타이드(예를 들면, 항원)의 결합을 허용하기에 충분한 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, XCVRS는 Y 쇄 가변 영역과 조립될 수 있고, 예를 들면, 항원에 결합할 수 있다. "Y 쇄 가변 영역 서열" 또는 "YCVRS"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 또 다른 폴리펩타이드(예를 들면, 항원)의 결합을 허용하기에 충분한 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, YCVRS는 X 쇄 가변 영역과 조립될 수 있고, 예를 들면, 항원에 결합할 수 있다.

XC 또는 YC 가변 영역의 "요소"는, 이 용어가 본원에서 사용될 때, 적어도 하나의 아미노산을 코딩하는 서열을 지칭한다. 한 실시양태에서, 요소는 CDR을 포함한다. 한 실시양태에서, 요소는 FW 영역을 포함한다.

한 실시양태에서, XC 요소는 XCVRS를 포함하거나 XCVRS로 구성된다. 한 실시양태에서, YC 요소는 YCVRS를 포함하거나 YCVRS로 구성된다.

한 실시양태에서, XC ds cDNA는 XCVRS를 코딩하는 분절을 포함한다. 한 실시양태에서, YC ds cDNA는 YCVRS를 코딩하는 분절을 포함한다. 한 실시양태에서, XC ds cDNA는 XCVRS를 코딩하는 분절을 포함하고, YC ds cDNA는 YCVRS를 코딩하는 분절을 포함한다.

한 실시양태에서, 핵산 서열은, 발현될 때, XC 요소 및 YC 요소(예를 들면, XCVRS 및 YCVRS)가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, 단일 쇄, 또는 XC와 YC의 복합체를 형성하도록 구성된다. 한 실시양태에서, 항원 결합 분자는 예를 들면, 본원에 기재된 방법 또는 어세이에 의해 확인될 때 시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서 기능을 한다.

a) (i) 세포로부터의 XCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA); 및 (ii) 세포로부터의 YCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA에 결합된 포획 기재(cDNA 로딩된 포획 기재)를 획득하는 단계, 및

b) 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA의 증폭을 허용하는 조건 하에서 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 유지하여, 세포로부터의 XCVR의 XC 요소, 예를 들면, XCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 XC ds cDNA; 및 세포로부터의 YCVR의 YC 요소, 예를 들면, YCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 YC ds cDNA를 생성하는 단계

를 포함한다.

한 실시양태에서, XC ds cDNA는 제1 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일하다. 예를 들면, XC ds cDNA의 센스 가닥은 제1 ds cDNA의 센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하고/하거나, XC ds cDNA의 안티센스 가닥은 제1 ds cDNA의 안티센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하다.

한 실시양태에서, YC ds cDNA는 제2 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일하다. 예를 들면, YC ds cDNA의 센스 가닥은 제2 ds cDNA의 센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하고/하거나, YC ds cDNA의 안티센스 가닥은 제2 ds cDNA의 안티센스 가닥과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 1개, 2개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개 또는 50개 이하의 뉴클레오타이드에 의해 상이하다.

한 실시양태에서, XC 가닥은 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, YC 가닥은 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, XC 가닥은 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, YC 가닥은 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, XC 가닥 및 YC 가닥 둘 다가 센스 가닥이다. 한 실시양태에서, XC 가닥 및 YC 가닥 둘 다가 안티센스 가닥이다.

한 실시양태에서, 포획 기재는 비드, 예를 들면, 자성 비드를 포함한다. 한 실시양태에서, 포획 기재는 cDNA에 결합하는 모이어티(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드), 예를 들면, (i) XC 가닥에 결합하는 모이어티; (ii) YC 가닥에 결합하는 모이어티; 또는 (iii) (i) 및 (ii) 둘 다를 포함한다. 한 실시양태에서, XC 가닥에 결합하는 모이어티는 예를 들면, 유사한 수준의 각각의 DNA 분자 유형을 포획하기에 유리한 조건의 생성을 용이하게 하기 위해 YC 가닥에 결합하는 모이어티와 상이하다. 한 실시양태에서, XC 가닥에 결합하는 모이어티는 YC 가닥에 결합하는 모이어티와 동일하다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 (예를 들면, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 mRNA가 로딩된 포획 기재로부터 용액으로 유리된 후) 세포의 XCVR의 XC 요소, 예를 들면, XCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제1 cDNA, 및 세포의 YCVR의 YC 요소, 예를 들면, YCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제2 cDNA를 제1 mRNA 및 제2 mRNA로부터 생성하기에 적합한 시약 혼합물을 포함한다.

한 실시양태에서, 세포로부터의 XCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥은 제1 mRNA의 역전사에 의해 제조된다. 한 실시양태에서, 세포로부터의 YCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥은 제2 mRNA의 역전사에 의해 제조된다.

한 실시양태에서, 역전사 및/또는 증폭은 예를 들면, XCVRS 및/또는 YCVRS에 특이적인 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머를 사용한다.

한 실시양태에서, 역전사 및/또는 증폭은 XC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는다. 한 실시양태에서, 증폭은 YC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 제1 구성원은 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, XCVRS 및/또는 YCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함한다. 한 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 상이하다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서의) 상동 재조합을 위한 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, XC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함한다. 한 실시양태에서, XC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함한다. 한 실시양태에서, YC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함한다. 한 실시양태에서, YC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함한다. 한 실시양태에서, XC ds cDNA 및 YC ds cDNA는 점착성 말단을 포함하고, 예를 들면, 이들 둘 다가 5' 오버행을 가진다.

한 실시양태에서, XC 가닥과 YC 가닥은 공유결합되어, 예를 들면, 라이게이션되어 단일 가닥 핵산 서열을 생성하고, 이 때 XC 가닥 및 YC 가닥은 둘 다 센스 가닥, 또는 둘 다 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, XC ds cDNA의 변성된 XC 가닥과 YC ds cDNA의 변성된 YC 가닥은 공유결합되고, 예를 들면, 라이게이션되고, 이 때 XC 가닥 및 YC 가닥은 둘 다 센스 가닥, 또는 둘 다 안티센스 가닥이다. 한 실시양태에서, XC 가닥은 XC ds cDNA에 존재하고, YC 가닥은 YC ds cDNA에 존재하고, 이 때 XC ds cDNA와 YC ds cDNA는 공유결합되어, 예를 들면, 라이게이션되어, 예를 들면, 이중 가닥 핵산 서열을 생성한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위에서 일어난다. 한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버, 또는 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 XC 가닥과 YC 가닥, 또는 XC ds cDNA와 YC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함한다. 한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 XC 가닥과 YC 가닥, 또는 XC ds cDNA와 YC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 효소는 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제이다. 한 실시양태에서, 공유결합은 리가제 써모사이클링을 포함한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위와 상이한 부위에서 일어나고, 예를 들면, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어난다. 한 실시양태에서, XC 가닥 및 YC 가닥은 분리된 생성 부위로부터 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버로 전달되고, 공유결합은 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어난다. 한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 XC 가닥과 YC 가닥, 또는 XC ds cDNA와 YC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함한다. 한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 XC 가닥과 YC 가닥, 또는 XC ds cDNA와 YC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함한다. 한 실시양태에서, 효소는 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제이다. 한 실시양태에서, 공유결합은 리가제 써모사이클링을 포함한다.

한 실시양태에서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 (a) XC 가닥 및 YC 가닥의 변성을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 95℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 가열하는 단계; (b) 스플린트 올리고뉴클레오타이드와 XC 가닥 및 YC 가닥의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 50℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 냉각시키는 단계; (c) XC 가닥과 YC 가닥의 라이게이션(예를 들면, XC 가닥과 YC 가닥 사이의 포스포디에스테르 결합의 형성)을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 45℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 유지하는 단계; 및 (d) 단계 (a), (b) 및 (c)를 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 이상의 사이클 동안 순차적으로 반복하는 단계를 포함한다.

한 실시양태에서, XC 가닥과 YC 가닥은 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 공유결합, 예를 들면, 라이게이션된다. 한 실시양태에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 XC 가닥과 YC 가닥의 연접부를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화되고, 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성한다. 한 실시양태에서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 억제하는 변형(예를 들면, NH₂ 기)을 포함한다. 한 실시양태에서, 변형은 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 있다.

한 실시양태에서, 공유결합된, 예를 들면, 라이게이션된 XC 가닥과 YC 가닥에 상보적인 가닥은 증폭에 의해 생성된다.

한 실시양태에서, mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계는 a) i) 세포 및 ii) 상기 세포로부터의 XCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 YCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및 b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버는 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 XCVR 또는 YCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 방법은 핵산 서열의 전부 또는 일부를 벡터 내로 삽입하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 핵산 서열에 포함되지 않은 추가 XC 요소 또는 YC 요소를 공급한다. 한 실시양태에서, 벡터는 XC CDR1, XC CDR2 또는 이들 둘 다를 공급한다. 한 실시양태에서, 방법은 벡터를 발현시키는 단계도 포함한다.

한 실시양태에서, 방법은 핵산 서열을 발현시켜, XCVR의 XC 요소, 예를 들면, XCVRS를 코딩하는 분절 및 YCVR의 YC 요소, 예를 들면, YCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 한 실시양태에서, YC 요소는 폴리펩타이드에서 XC 요소의 N-말단에 있다. 한 실시양태에서, XC 요소는 폴리펩타이드에서 YC 요소의 C-말단에 있다.

a) i) 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포) 및 (ii) 상기 세포로부터의 XCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 YCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재(예를 들면, 본원에 기재된 포획 기재)를 포함하는 분리된 세포 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 세포 반응 부위), 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계로서, 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 XCVR 또는 YCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

d) i) 세포로부터의 XCVR의 XC 요소, 예를 들면, X 쇄 가변 영역 서열(XCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 X 쇄 이중 가닥 cDNA(XC ds cDNA)의 가닥인 X 쇄(XC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 YCVR의 YC 요소, 예를 들면, Y 쇄 가변 영역 서열(YCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 Y 쇄 이중 가닥 cDNA(YC ds cDNA)의 가닥인 Y 쇄(YC) 가닥을 포함하고 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 YCVR 또는 XCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위), 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

e) XC 가닥을 YC 가닥과 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 단계

를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

a) i) 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포) 및 ii) 상기 세포로부터의 XCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 YCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재(예를 들면, 본원에 기재된 포획 기재)를 포함하는 분리된 세포 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 세포 반응 부위), 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

c) mRNA가 로딩된 포획 기재를, 로딩된 mRNA를 주형으로서 사용하는 반응 혼합물, 예를 들면, 역전사효소를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시켜, 세포로부터의 XCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA), 및 세포로부터의 YCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA(cDNA 로딩된 포획 기재)를 생성하는 단계를 포함하는, 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위), 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포(예를 들면, 상이한 세포)로부터의 YCVR 또는 XCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

d) 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA의 증폭을 허용하는 조건 하에서 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 유지하여, 세포로부터의 XCVR의 XC 요소, 예를 들면, XCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 XC ds cDNA, 및 세포로부터의 YCVR의 YC 요소, 예를 들면, YCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 YC ds cDNA를 생성하는 단계;

e) XC ds cDNA의 가닥(XC 가닥)을 YC ds cDNA의 가닥(YC 가닥)에 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 단계를 포함하는, 분리된 결합 반응 부위(예를 들면, 본원에 기재된 분리된 결합 반응 부위), 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 XC 가닥 및 YC 가닥 둘 다가 센스 가닥 또는 안티센스 가닥인 단계; 및

f) 공유결합된, 예를 들면, 라이게이션된 XC 가닥 및 YC 가닥을 증폭시키는 단계

를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 본원에 기재된 방법에 의해 복수의 구성원들을 제조함으로써 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하고, 각각의 구성원이 X 쇄 가변 영역(XCVR)의 X 쇄 요소(XC 요소) 및 Y 쇄 가변 영역(YCVR)의 Y 쇄 요소(YC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하고, XCVR과 YCVR이 매칭되고, 상기 복수의 특유한 구성원들의 각각의 특유한 핵산 서열이 상이한 특유한 세포(예를 들면, 본원에 기재된 세포)로부터의 XC 요소 및 YC 요소를 포함하는 것인 방법을 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 상기 복수의 특유한 구성원들은 적어도 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개 또는 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 복수의 특유한 구성원들은 10⁴개 내지 10⁹개, 10⁴개 내지 10⁸개, 10⁴개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁶개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁸개 내지 10⁹개, 10⁷개 내지 10⁹개, 10⁶개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁸개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁵개 내지 10⁶개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁷개 내지 10⁸개, 또는 10⁸개 내지 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함한다. 한 실시양태에서, 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 구성원은 (매칭된 XC 요소 및 YC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다. 한 실시양태에서, 라이브러리에서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 XC 요소 및 YC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다.

i) 상기 복수의 특유한 구성원들 각각이 XC 요소, 예를 들면, XCVRS를 코딩하는 분절 및 YC 요소, 예를 들면, YCVRS를 코딩하는 분절을 포함하고, 이 때 각각의 특유한 구성원에서 XC 요소와 YC 요소가 매칭되고;

ii) 상기 복수의 특유한 구성원들 각각이 상이한 특유한 세포로부터의 XC 요소, 예를 들면, XCVRS를 코딩하는 분절 및 YC 요소, 예를 들면, YCVRS를 코딩하는 분절을 포함하고;

를 특징으로 한다:

d) 상기 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 구성원은 (매칭된 XC 요소 및 YC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이거나;

e) 상기 라이브러리에서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 XC 요소 및 YC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다.

한 실시양태에서, 복수의 특유한 구성원들 각각은, 발현될 때, XC 요소, 예를 들면, XCVRS, 및 YC 요소, 예를 들면, YCVRS가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, scFv를 형성하도록 구성된다.

한 양태에서, 본 개시는 결합 폴리펩타이드(예를 들면, XC 요소 및 YC 요소를 포함하는 폴리펩타이드)를 제조하는 방법으로서, a) 예를 들면, 본원에 기재된 방법에 의해 본원에 기재된 라이브러리를 획득하는 단계; 및 b) 상기 라이브러리의 특유한 핵산에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 방법을 특징으로 한다.

한 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 분리된 생성 반응 부위(예를 들면, XCVR을 코딩하는 핵산 및 YCVR을 코딩하는 핵산을 포함하고, 이 때 XCVR과 YCVR이 매칭됨)인 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 상이한 세포로부터의 XCVR 또는 YCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 (i) XC 및 YC의 V 유전자 서열에 특이적인 하나 이상의 프라이머; (ii) XC cDNA 및 YC cDNA에 도입된 오버행에 특이적인 하나 이상의 프라이머; 또는 (iii) 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 변형(예를 들면, 스페이서)을 포함하는 제3 구성원을 포함하는 하나 이상의 프라이머 중 하나, 둘 또는 전부를 포함하고, 이 때 제1 구성원은 동일한 프라이머 또는 상이한 프라이머의 제2 구성원과 어닐링하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 구조를 형성할 수 있다.

한 양태에서, 본 개시는 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 변형(예를 들면, 스페이서)을 포함하는 제3 구성원을 포함하는 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드로서, 제1 구성원이 동일한 올리고뉴클레오타이드의 제2 구성원과 어닐링할 수 있는 것인 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드를 특징으로 한다(예를 들면, XCVR의 XC 요소 및 YCVR의 YC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, XCVR과 YCVR이 매칭되는 것인 방법의 경우).

한 실시양태에서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, XCVRS 및/또는 YCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함한다. 한 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 동일하거나 실질적으로 동일하다. 또 다른 실시양태에서, 유니버셜 프라이밍 서열은 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열과 상이하다. 한 실시양태에서, 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서의) 상동 재조합을 위한 서열을 포함한다.

한 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 분리된 결합 반응 부위(예를 들면, XCVR을 코딩하는 핵산 및 YCVR을 코딩하는 핵산을 포함하고, 이 때 XCVR과 YCVR이 매칭됨)인 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 상이한 세포로부터의 XCVR 또는 YCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는다.

한 실시양태에서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 XC 가닥과 YC 가닥의 연접부를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화하여 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성할 수 있는 스플린트 올리고뉴클레오타이드(예를 들면, 본원에 기재된 스플린트 올리고뉴클레오타이드)를 포함한다.

T 세포 수용체 분자

본원의 개시는 항체 분자로 한정되기 위한 것이 아니다. 한 실시양태에서, 결합 분자는 TCR 분자, 예를 들면, 가용성 TCR 분자이다. 한 실시양태에서, 결합 분자는 TCR α 쇄 가변 영역 및 TCR β 쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 결합 분자는 TCR γ 쇄 가변 영역 및 TCR δ 쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 본원의 임의의 양태, 실시양태 및 정의에서, 항체 중쇄(또는 가변 영역)는 TCR α 쇄(또는 가변 영역)으로 대체될 수 있고, 항체 경쇄(또는 가변 영역)는 TCR β 쇄(또는 가변 영역)로 대체될 수 있거나; 항체 중쇄(또는 가변 영역)는 TCR γ 쇄(또는 가변 영역)로 대체될 수 있고, 항체 경쇄(또는 가변 영역)는 TCR δ 쇄(또는 가변 영역)로 대체될 수 있다.

본원은 T 세포 수용체(TCR) 분자 및 TCR 분자의 라이브러리를 개시한다. 한 실시양태에서, TCR 분자 또는 TCR 분자의 라이브러리는 본원에 기재된 방법에 의해 제조된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "T-세포 수용체 분자" 또는 "T 세포 수용체 분자"로서도 알려져 있는 용어 "TCR 분자"는 적어도 하나의 TCR 가변 도메인 서열을 포함하는 단백질, 예를 들면, TCR 쇄 또는 이의 단편을 지칭한다. 용어 "TCR 분자"는 예를 들면, 전체 길이 성숙 TCR, 및 TCR의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들면, TCR 분자는 α 쇄 가변 도메인 서열 및 β 쇄 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, TCR 분자는 γ 쇄 가변 도메인 서열 및 δ 쇄 가변 도메인 서열을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, TCR 분자는 가용성 TCR 분자이다.

T 세포 수용체는 T 세포의 표면에서 발견될 수 있고, 주조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 펩타이드로서 항원의 단편을 인식하는 것을 담당한다. TCR은 전형적으로 2개의 상이한 단백질 쇄들을 포함한다. 인간에서, 약 95%의 T 세포들에서 TCR은 알파(α) 쇄 및 베타(β) 쇄(각각 TRA 및 TRB에 의해 코딩됨)를 포함하는 반면, 약 5%의 T 세포들에서 TCR은 감마 및 델타(γ/δ) 쇄(각각 TRG 및 TRD에 의해 코딩됨)를 포함한다. 이 비는 개체발생 동안 및 병든 상태(예컨대, 백혈병)에서 변할 수 있다. TCR이 항원성 펩타이드 및 MHC(펩타이드/MHC)와 맞물릴 때, T 림프구는 신호 전달도입, 예를 들면, 관련된 효소, 보조수용체, 전문화된 어댑터 분자 및 활성화된 또는 방출된 전사 인자에 의해 매개된 일련의 생화학적 사건들을 통해 활성화된다.

예를 들면, 천연 생성 TCR은 전형적으로 예를 들면, 불변 CD3 쇄 분자를 갖는 복합체의 일부로서 발현된 고도 가변성 알파(α) 및 베타(β) 쇄를 포함하는 디설파이드-결합된 막-고착된 이종이량체성 단백질이다. 이 수용체를 발현하는 T 세포는 종종 α:β(또는 αβ) T 세포로서 지칭되지만, 종종 γδ T 세포로서 지칭되는 소수의 T 세포들은 가변 감마(γ) 및 델타(δ) 쇄에 의해 형성된 대안적 수용체를 발현한다.

TCR의 각각의 쇄는 2개의 세포외 도메인들, 즉 가변(V) 영역 및 불변(C) 영역을 포함할 수 있다. 불변 영역은 세포막에 인접하고, 이 불변 영역 다음에 막횡단 영역 및 짧은 세포질 꼬리가 있는 반면, 가변 영역은 펩타이드/MHC 복합체에 결합할 수 있다.

TCR α 쇄 또는 β 쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 초가변 또는 상보성 결정 영역들(CDR들)을 가질 수 있다. 전형적으로 항원과 접촉하지 않고 CDR로서 간주되지 않는 추가 초가변 영역(HV4)이 β 쇄에 존재할 수도 있다. 이 가변 도메인들의 잔기들은 TCR의 2개 영역들, α 쇄와 β 쇄의 계면, 및 CD3 신호 전달도입 복합체에 인접한 β 쇄 프레임워크 영역에 위치한다. 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 한 실시양태에서, CDR3은 프로세싱된 항원을 인식하는 것을 담당하는 주요 CDR이라고 생각된다. 알파 쇄의 CDR1은 항원성 펩타이드의 N-말단 부분과 상호작용할 수 있고, β 쇄의 CDR1은 상기 펩타이드의 C-말단 부분과 상호작용할 수 있다. CDR2는 MHC를 인식할 수 있다. β 쇄의 CDR4는 일반적으로 항원 인식에 참여하지 않는 것으로 생각되나, 수퍼항원과 상호작용할 수 있다.

TCR의 불변 도메인은 예를 들면, 디설파이드 결합을 통해 2개의 쇄들 사이의 연결을 형성하는 짧은 연결 서열을 포함한다.

TCR 다양성의 생성은 주로 체세포 V(D)J 재조합에 의해 개별 체세포성 T 세포에서 DNA 코딩된 분절의 유전적 재조합으로부터 발생된다. 각각의 재조합된 TCR은 예를 들면, αβ T 세포의 경우 α 및 β 쇄, 또는 γδ T 세포의 경우 γ 및 δ 쇄에 의해 형성된 항원 결합 부위의 구조에 의해 결정된 특유한 항원 특이성을 가질 수 있다. 예를 들면, TCR α 및 γ 쇄는 VJ 재조합에 의해 생성될 수 있고, β 및 δ 쇄는 VDJ 재조합에 의해 생성될 수 있다. 이 특이적 영역들(예를 들면, α 또는 γ 쇄의 경우 V 및 J; β 또는 δ 쇄의 경우 V, D 및 J)의 교차점은 전형적으로 펩타이드/MHC 인식에 중요한 CDR3 영역에 상응한다.

TCR 수용체는 가변 TCR 쇄들(예를 들면, 3개의 이량체성 신호전달 모듈 CD3δ/ε, CD3γ/ε 및 CD247 ζ/ζ 또는 ζ/η를 갖는 α 및 β 쇄)의 복합체를 형성할 수 있다. T 세포는 T 세포와 항원 제시 세포-APC(MHC 클래스 II) 또는 임의의 다른 유형의 세포(MHC 클래스 I) 사이의 물리적 접촉 동안 특정 펩타이드/MHC 복합체를 인식하는 클론성 TCR을 발현할 수 있다. T 세포 복합체로부터의 신호는 특정 보조수용체에 의한 MHC 분자의 동시적인 결합에 의해 향상될 수 있다. 예를 들면, 헬퍼 T 세포 및 조절 T 세포에서 보조수용체는 MHC 클래스 II에 특이적인 CD4이고, 세포독성 T 세포에서 보조수용체는 MHC 클래스 I에 특이적인 CD8이다.

용어 "TCR"은 온전한 분자뿐만 아니라 이의 기능성 단편도 포함한다. TCR 단편은 당분야에서 숙련된 자에게 알려져 있는 여러 통상적인 기법들을 포함하는 임의의 적합한 방법을 이용함으로써 수득될 수 있고, 단편은 온전한 TCR과 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. TCR의 불변 영역은 TCR의 특성을 변형시키도록 변경될, 예를 들면, 돌연변이될 수 있다.

TCR 분자는 단일 쇄 TCR일 수 있다. 단일 쇄 TCR은 동일한 표적 단백질의 상이한 에피토프들에 대한 특이성을 갖는 다가 TCR을 생성하도록 이량체화될 수 있거나 다량체화될 수 있다.

본원에 개시된 TCR 분자는 단일 도메인 TCR일 수도 있다. 단일 도메인 TCR은 단일 도메인 폴리펩타이드의 일부인 상보성 결정 영역을 갖는 TCR을 포함할 수 있다. 예로는 α, β, γ 또는 δ 쇄 TCR, α, β, γ 또는 δ 쇄를 천연적으로 결여하는 TCR, 통상적인 2-쇄 TCR로부터 유래한 단일 도메인 TCR, 조작된 TCR, 및 TCR로부터 유래한 단일 도메인 스카폴드 이외의 단일 도메인 스카폴드가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 단일 도메인 TCR은 당분야의 임의의 단일 도메인 TCR 또는 임의의 장래 단일 도메인 TCR일 수 있다. 단일 도메인 TCR은 마우스, 인간, 낙타, 라마, 어류, 상어, 염소, 토끼 및 소를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 종으로부터 유래할 수 있다.

가변 영역은 "프레임워크 영역"(FR 또는 FW)으로서 명명된, 보다 더 잘 보존된 영역에 의해 산재된, "상보성 결정 영역"(CDR)으로서 명명된 초가변 영역으로 세분될 수 있다. TCR 분자와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화성을 부여하는, TCR 가변 영역 내의 아미노산 서열을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프레임워크", "FW" 및 "FR"은 상호교환 가능하게 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "TCR 가변 도메인 서열"은 TCR 가변 도메인의 구조를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들면, 상기 서열은 천연 생성 가변 도메인의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 서열은 1개 또는 2개 이상의 N-말단 또는 C-말단 아미노산을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있거나, 단백질 구조의 형성에 적합한 다른 변경을 포함할 수 있다.

용어 "항원 결합 영역"은 항원 또는 이의 에피토프에 결합하는 계면을 형성하는 결정인자를 포함하는 TCR 분자의 일부를 지칭한다. 단백질(또는 단백질 모방 물질)에 대하여, 항원 결합 영역은 전형적으로 항원에 결합하는 계면을 형성하는 하나 이상의 루프(예를 들면, 적어도 4개의 아미노산 또는 아미노산 모방 물질)을 포함한다. 전형적으로, TCR 분자의 항원 결합 영역은 적어도 1개 또는 2개의 CDR 및/또는 초가변 루프, 또는 보다 전형적으로 적어도 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR 및/또는 초가변 루프를 포함한다.

용어 "경쟁한다" 또는 "교차경쟁한다"는 TCR 분자가 또 다른 TCR 분자와 표적의 결합을 방해하는 능력을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다. 결합의 방해는 직접적일 수 있거나 간접적일 수 있다(예를 들면, TCR 분자 또는 표적의 알로스테릭 조절을 통한 방해). 항체 분자가 또 다른 TCR 분자와 표적의 결합을 방해할 수 있는 정도, 및 경쟁한다고 말할 수 있는 지는 경쟁 결합 어세이, 예를 들면, FACS 어세이, ELISA 또는 BIACORE 어세이를 이용함으로써 확인될 수 있다. 한 실시양태에서, 경쟁 결합 어세이는 정량적 경쟁 어세이이다. 한 실시양태에서, 경쟁 결합 어세이(예를 들면, 본원에 기재된 경쟁 어세이)에서 제1 항체 분자와 표적의 결합이 10% 이상, 예를 들면, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 감소될 때, 제1 TCR 분자가 표적에의 결합에 대해 제2 TCR 분자와 경쟁한다고 말한다.

TCR 분자는 다중클론 또는 단일클론 TCR 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, TCR은 재조합적으로 생성될 수 있고, 예를 들면, 임의의 적합한 파지 디스플레이 또는 조합적 방법에 의해 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 및 조합적 방법은 당분야에서 공지되어 있다.

한 실시양태에서, TCR 분자는 전체 인간 TCR(예를 들면, 인간 TCR 서열로부터 TCR을 생성하도록 유전적으로 조작된 마우스에서 제조된 TCR) 또는 비인간 TCR, 예를 들면, 설치류(마우스 또는 래트), 염소, 영장류(예를 들면, 원숭이), 낙타 TCR이다. 한 실시양태에서, 비인간 TCR은 설치류(마우스 또는 래트 TCR)이다. 예를 들면, 마우스 시스템보다는 오히려 인간 TCR 유전자를 보유하는 형질전환 마우스를 사용하여 인간 TCR을 생성할 수 있다.

TCR은 가변 영역 또는 이의 일부, 예를 들면, CDR이 비인간 유기체, 예를 들면, 래트 또는 마우스에서 생성된 TCR일 수 있다. 키메라 TCR, CDR-이식된 TCR 및 인간화된 TCR은 본 발명 내에 있다. 비인간 유기체, 예를 들면, 래트 또는 마우스에서 생성된 후, 인간에서의 항원성을 감소시키도록, 예를 들면, 가변 프레임워크 또는 불변 영역에서 변형된 TCR은 본 발명 내에 있다.

키메라 TCR은 임의의 적합한 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 수 있다.

인간화된 또는 CDR-이식된 TCR은 기증자 CDR에 의해 대체된 (TCR 쇄의) 적어도 1개 또는 2개, 그러나 일반적으로 모든 3개의 수용자 CDR을 가질 것이다. 상기 TCR은 비인간 CDR의 적어도 일부로 대체될 수 있거나, CDR들 중 일부만이 비인간 CDR로 대체될 수 있다. 인간화된 TCR과 항원의 결합을 위해 요구된 수의 CDR만을 대체할 필요가 있다. 한 실시양태에서, 기증자는 설치류 TCR, 예를 들면, 래트 또는 마우스 TCR일 것이고, 수용자는 인간 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크일 것이다. 전형적으로, CDR을 제공하는 TCR은 "기증자"로서 지칭되고, 프레임워크를 제공하는 TCR은 "수용자"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 기증자 TCR은 비인간(예를 들면, 설치류) TCR이다. 수용자 프레임워크는 전형적으로 천연 생성(예를 들면, 인간) 프레임워크 또는 컨센서스 프레임워크, 또는 이와 약 85% 이상, 예를 들면, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일한 서열이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 서열"은 관련된 서열들의 패밀리에서 가장 흔히 발견되는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로부터 형성된 서열을 지칭한다(예를 들면, 문헌(Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)) 참조). 단백질들의 패밀리에서, 컨센서스 서열 내의 각각의 위치는 상기 패밀리에서 그 위치에서 가장 흔히 발견되는 아미노산에 의해 점유된다. 2개의 아미노산들이 동등하게 흔히 발견되는 경우, 이들 각각이 컨센서스 서열에 포함될 수 있다. "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 TCR 서열 내의 프레임워크 영역을 지칭한다.

TCR은 임의의 적합한 방법에 의해 인간화될 수 있다. 인간화된 또는 CDR-이식된 TCR은 CDR 이식 또는 CDR 치환에 의해 생성될 수 있고, 이 때 면역글로불린 쇄의 1개, 2개 또는 모든 CDR이 대체될 수 있다. 특정 아미노산이 치환되어 있거나, 결실되어 있거나 추가되어 있는 인간화된 TCR도 제공된다.

한 실시양태에서, TCR 분자는 불변 영역을 가진다. 불변 영역은 TCR 분자의 특성을 변형시키도록 변경될, 예를 들면, 돌연변이될 수 있다. 한 실시양태에서, TCR 분자의 불변 영역은 변경된다. 불변 영역을 변경시키는 방법은 당분야에서 공지되어 있다.

한 실시양태에서, TCR 분자 내의 아미노산은 오로지 정규 아미노산이다. 한 실시양태에서, TCR 분자는 천연 생성 아미노산; 이의 유사체, 유도체 및 동족체; 변이체 측쇄를 갖는 아미노산 유사체; 및/또는 이들 중 임의의 물질의 모든 입체이성질체들을 포함한다. TCR 분자는 아미노산의 D 또는 L 광학 이성질체, 및 펩티드 모방 물질을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 TCR 분자의 폴리펩타이드는 선형 또는 분지된 폴리펩타이드일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 불연속될 수 있다. TCR 분자는 예를 들면, 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예컨대, 표지부착 성분과의 접합에 의해 변형될 수도 있다. 폴리펩타이드는 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 진핵 또는 원핵 숙주로부터 재조합 기법에 의해 생성될 수 있거나, 합성 절차의 생성물일 수 있다.

본원에 기재된 TCR 분자는 비접합된 형태로 단독으로 사용될 수 있거나, 물질, 예를 들면, 독소 또는 모이어티(예를 들면, 치료 약물; 방사선을 방사하는 화합물; 식물, 진균 또는 세균 유래의 분자; 또는 생물학적 단백질(예를 들면, 단백질 독소) 또는 입자(예를 들면, 바이러스 코트 단백질을 통해, 예를 들면, 재조합 바이러스 입자)에 결합될 수 있다. 예를 들면, TCR 분자는 방사성 동위원소, 예컨대, α, β 또는 γ 방사체, 또는 β 및 γ 방사체에 커플링될 수 있다.

TCR 분자는 유도체화될 수 있거나 또 다른 기능성 분자(예를 들면, 또 다른 펩타이드 또는 단백질)에 연결될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "유도체화된" TCR 분자는 변형된 TCR 분자이다. 유도체화 방법은 형광 모이어티, 방사뉴클레오타이드, 독소, 효소 또는 친화성 리간드, 예컨대, 바이오틴의 추가를 포함하나 이것으로 한정되지 않는다. 따라서, TCR 분자는 면역부착 분자를 포함하는, 본원에 기재된 항체의 유도체화된 형태 및 다른 방식으로 변형된 형태를 포함하기 위한 것이다. 예를 들면, TCR 분자는 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 또는 다른 방식에 의해) 하나 이상의 다른 분자 독립체, 예컨대, 또 다른 TCR(예를 들면, 이중특이적 TCR), 검출 가능한 물질, 독소, 약제, 및/또는 TCR 또는 TCR 일부와 또 다른 분자(예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드에 기능적으로 연결될 수 있다.

일부 유형의 유도체화된 TCR 분자들은 (예를 들면, 이중특이적 TCR을 생성하기 위해 동일한 유형 또는 상이한 유형의) 2개 이상의 TCR들을 가교결합시킴으로써 생성된다. 적합한 가교링커는 적절한 스페이서에 의해 분리된 2개의 상이한 반응성 기들을 갖는 이종작용성 가교링커(예를 들면, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르), 또는 동종작용성 가교링커(예를 들면, 디석신이미딜 수버레이트)를 포함한다. 이러한 링커는 피어스 케미칼 컴파니(일리노이주 록포드 소재)로부터 입수될 수 있다.

TCR 분자의 유도체화(또는 표지부착)에 사용될 수 있는 유용한 검출 가능한 물질은 형광 화합물, 다양한 효소들, 보결분자단, 발광 물질, 생체발광 물질, 형광 방사 금속 원자, 예를 들면, 유로퓸(Eu) 및 다른 안타나이드, 및 방사성 물질(이하에 기재됨)을 포함한다. 예시적 형광 검출 가능한 물질은 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 파이코에리쓰린 등을 포함한다. TCR은 검출 가능한 효소, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 호스라디쉬 퍼록시다제, β-갈락토시다제, 아세틸콜린에스터라제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 유도체화될 수도 있다. TCR이 검출 가능한 효소에 의해 유도체화될 때, TCR은 효소가 사용하는 추가 시약을 첨가하여 검출 가능한 반응 생성물을 생성함으로써 검출된다. 예를 들면, 검출 가능한 물질인 호스라디쉬 퍼록시다제가 존재할 때, 과산화수소 및 디아미노벤지딘의 첨가는 검출 가능한 착색된 반응 생성물을 이끌어낸다. TCR 분자는 보결분자단(예를 들면, 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴)에 의해 유도체화될 수도 있다. 예를 들면, TCR은 바이오틴에 의해 유도체화될 수 있고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접적인 측정을 통해 검출될 수 있다. 적합한 형광 물질의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 댄실 클로라이드 또는 파이코에리쓰린이 있고; 발광 물질의 예로는 루미놀이 있고; 생체발광 물질의 예로는 루시퍼라제, 루시페린 및 애쿠오린이 있다.

표지된 TCR 분자는 예를 들면, (i) 표준 기법, 예컨대, 친화성 크로마토그래피 또는 면역침전으로 소정의 항원을 단리하는 것; (ii) 단백질 발현의 존재도 및 패턴을 평가하기 위해 (예를 들면, 세포 용해물 또는 세포 상청액에서) 소정의 항원을 검출하는 것; 및 (iii) 예를 들면, 소정의 치료 섭생법의 효능을 확인하기 위해 임상 시험 절차의 일부로서 조직에서 단백질 수준을 모니터링하는 것을 포함하는 다수의 환경에서 진단적 및/또는 실험적으로 사용될 수 있다.

TCR 분자는 또 다른 분자 독립체, 전형적으로 표지, 또는 치료(예를 들면, 항미생물(예를 들면, 항균 또는 살균), 면역조절, 면역자극, 세포독성 또는 세포증식억제) 물질 또는 모이어티에 접합될 수 있다. 방사성 동위원소는 진단 또는 치료 적용에 사용될 수 있다. 항체 분자에 커플링될 수 있는 방사성 동위원소는 α, β 또는 γ 방사체, 또는 β 및 γ 방사체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 방사성 동위원소는 요오드(¹³¹I 또는 ¹²⁵I), 이트륨(⁹⁰Y), 루테튬(¹⁷⁷Lu), 악티늄(²²⁵Ac), 프라세오디뮴, 아스타틴(²¹¹At), 레늄(¹⁸⁶Re), 비스무쓰(²¹²Bi 또는 ²¹³Bi), 인듐(¹¹¹In), 테크네튬(⁹⁹mTc), 인(³²P), 로듐(¹⁸⁸Rh), 황(³⁵S), 탄소(¹⁴C), 삼중수소(³H), 크로뮴(⁵¹Cr), 염소(³⁶Cl), 코발트(⁵⁷Co 또는 ⁵⁸Co), 철(⁵⁹Fe), 셀레늄(⁷⁵Se) 또는 갈륨(⁶⁷Ga)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 치료제로서 유용한 방사성 동위원소는 이트륨(⁹⁰Y), 루테튬(¹⁷⁷Lu), 악티늄(²²⁵Ac), 프라세오디뮴, 아스타틴(²¹¹At), 레늄(¹⁸⁶Re), 비스무쓰(²¹²Bi 또는 ²¹³Bi) 및 로듐(¹⁸⁸Rh)을 포함한다. 예를 들면, 진단에 사용될 표지로서 유용한 방사성 동위원소는 요오드(¹³¹I 또는 ¹²⁵I), 인듐(¹¹¹In), 테크네튬(⁹⁹mTc), 인(³²P), 탄소(¹⁴C) 및 삼중수소(³H), 또는 상기 나열된 치료 동위원소들 중 하나 이상을 포함한다.

본 개시는 방사성표지된 TCR 분자 및 이를 표지하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, TCR 분자를 표지하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은 TCR 분자를 킬레이팅제와 접촉시킴으로써, 접합된 TCR을 생성하는 단계를 포함한다. 접합된 항체를 방사성 동위원소, 예를 들면, ¹¹¹인듐, ⁹⁰이트륨 및 ¹⁷⁷루테튬으로 방사성표지함으로써, 표지된 TCR 분자를 생성한다.

일부 양태에서, 본 개시는 본원에 개시된 TCR 분자를 제조하는 방법을 제공한다. 이 방법은 항원 또는 이의 단편을 제공하는 단계; 항원에 특이적으로 결합하는 TCR 분자를 수득하는 단계; 및 항원 및/또는 항원을 발현하는 유기체의 활성을 조절하는 데 있어서 TCR 분자의 효능을 평가하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 TCR 분자의 유도체(예를 들면, 인간화된 TCR 분자)를 비롯한 TCR 분자를 대상체, 예를 들면, 인간에게 투여하는 단계도 포함할 수 있다.

본 개시는 상기 TCR 분자를 코딩하는 분리된 핵산 분자, 이의 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 상기 핵산 분자는 RNA, 게놈 DNA 및 cDNA를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

동물 모델

다양한 동물 모델들을 사용하여 생체내에서 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 결합 폴리펩타이드, 예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 평가할 수 있다. 예를 들면, 동물 모델을 사용하여, 표적 분자 또는 세포의 생물학적 기능을 조절하는 데 있어서 본원에 기재된 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 효능을 시험할 수 있다. 또 다른 예로서, 동물 모델을 사용하여, 본원에 기재된 장애를 치료하거나, 예방하거나 진단하는 데 있어서 본원에 기재된 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 효능을 시험할 수도 있다. 동물 모델을 사용하여, 예를 들면, 부작용을 조사할 수 있거나, 제자리에서 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 농도를 측정할 수 있거나, 표적 분자 또는 세포의 기능과 본원에 기재된 장애 사이의 상관관계를 입증할 수 있다.

본원에 기재된 다른 장애에 대한 예시적 동물 모델도 당분야에서 공지되어 있다. 본원에 기재된 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 평가하는 데 사용될 수 있는 예시적 유형의 동물은 마우스, 래트, 토끼, 기니 피그 및 원숭이를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

약학 조성물 및 키트

일부 양태에서, 본 개시는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제제화된, 폴리펩타이드(예를 들면, 결합 폴리펩타이드, 예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 조성물을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 모든 용매들, 분산 매질들, 등장성 물질들 및 흡수 지연 물질들 등을 포함한다. 상기 담체는 (예를 들면, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 직장, 척추 또는 표피 투여에 적합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물에서 약 5% 미만, 예를 들면, 약 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 결합 폴리펩타이드는 응집체로서 존재한다. 다른 실시양태에서, 약학 조성물에서 적어도 약 95%, 예를 들면, 적어도 약 96%, 97%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% 또는 99.8% 이상의 결합 폴리펩타이드는 단량체로서 존재한다. 일부 실시양태에서, 응집체 또는 단량체의 수준은 크로마토그래피, 예를 들면, 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HP-SEC)에 의해 측정된다.

본원에 기재된 조성물은 다양한 형태들로 존재할 수 있다. 이들은 예를 들면, 액체 제형, 반고체 제형 및 고체 제형, 예컨대, 액체 용액(예를 들면, 주사 가능한 용액 및 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 리포좀 및 좌약을 포함한다. 적합한 형태는 의도된 투여 방식 및 치료적 적용에 의존한다. 전형적인 적합한 조성물은 주사 가능한 또는 주입 가능한 용액의 형태로 존재한다. 한 적합한 투여 방식은 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 한 실시양태에서, 결합 폴리펩타이드는 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 결합 폴리펩타이드는 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.

본원에서 사용된 어구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"은 통상적으로 주사에 의한, 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골하 주사 및 주입을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.

치료 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균 상태이어야 하고 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀전, 분산액, 리포좀, 또는 고농도의 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)에 적합한 다른 정돈된 구조로서 제제화될 수 있다. 멸균 주사 가능한 용액은 요구된 양의 활성 화합물(예를 들면, 결합 폴리펩타이드)을 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매 내에 도입한 후, 요구될 때 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을, 기본 분산 매질 및 상기 나열된 성분들 중 요구된 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분과 임의의 추가 요구된 성분으로 구성된 분말을 이의 미리 멸균 여과된 용액으로부터 제공하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적절한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 요구된 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.

본원에 기재된 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 수용체)는 다양한 방법들에 의해 투여될 수 있다. 여러 방법들이 당분야에서 공지되어 있고, 많은 치료, 예방 또는 진단 적용에 적절한 투여 경로/방식은 정맥내 주사 또는 주입이다. 예를 들면, 결합 폴리펩타이드는 약 1 내지 100 mg/m², 바람직하게는 약 5 내지 50 mg/m², 약 7 내지 25 mg/m², 보다 바람직하게는 약 10 mg/m²의 용량에 도달하기 위해 10 mg/분 미만, 바람직하게는 5 mg/분 이하의 속도로 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 숙련된 당업자가 인식할 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 일부 실시양태에서, 활성 화합물은 신속한 방출로부터 화합물을 보호할 담체, 예컨대, 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제형으로 제조될 수 있다. 생체분해 가능한 생체적합성 중합체, 예컨대, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리젖산을 사용할 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 많은 방법들은 특허를 받았거나 당분야에서 숙련된 자에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)을 참조한다.

일부 실시양태에서, 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)는 예를 들면, 불활성 희석제 또는 동화 가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 결합 폴리펩타이드(및 원하는 경우 다른 성분)는 경질 또는 연질 외피 젤라틴 캡슐 내에 봉입될 수도 있거나, 정제로 압축될 수도 있거나, 대상체의 음식물 내에 직접적으로 도입될 수도 있다. 경구 치료적 투여를 위해, 결합 폴리펩타이드는 부형제와 함께 도입될 수 있고 삼킬 수 있는 정제, 협측 정제, 트로치, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여 이외의 투여로 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)를 투여하기 위해, 화합물의 불활성화를 방지하는 물질로 화합물을 코팅하거나 화합물을 이러한 물질과 함께 투여하는 것이 필요할 수 있다. 치료, 예방 또는 진단 조성물은 의료 디바이스에 의해 투여될 수도 있고, 여러 디바이스들이 당분야에서 공지되어 있다.

투여 용법은 원하는 반응(예를 들면, 치료, 예방 또는 진단 반응)을 제공하도록 조절된다. 예를 들면, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 여러 나누어진 용량이 시간의 경과에 따라 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 의해 표시될 때 비례적으로 감소될 수 있거나 증가될 수 있다. 투여의 용이함 및 용량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 유닛 제형으로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 유닛 제형은 치료될 대상체를 위한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 분리된 유닛을 지칭하고; 각각의 유닛은 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정 양의 활성 화합물을 요구된 약학 담체와 함께 함유한다. 유닛 제형에 대한 구체적인 요건은 (a) 항체 분자의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료, 예방 또는 진단 효과, 및 (b) 개체에서 민감성의 치료를 위해 이러한 결합 폴리펩타이드를 배합하는 분야에 내재하는 한계에 의해 좌우되고 이들에 직접적으로 의존한다.

결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 치료적, 예방적 또는 진단적 유효량에 대한 예시적 비한정적 범위는 약 0.1 내지 50 mg/kg, 예를 들면, 약 0.1 내지 30 mg/kg, 예를 들면, 약 1 내지 30, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 10, 또는 1 내지 3 mg/kg, 예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50 mg/kg이다. 결합 폴리펩타이드는 약 1 내지 100 mg/m², 예를 들면, 약 5 내지 50 mg/m², 약 7 내지 25 mg/m², 예를 들면, 약 10 mg/m²의 용량을 달성하기 위해 10 mg/분 미만, 예를 들면, 5 mg/분 이하의 속도로 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 용량 값은 완화될 상태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다는 것을 인식해야 한다. 임의의 특정 대상체를 위한 구체적인 투여 용법은 개체의 필요성 및 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간이 경과되면서 조절되어야 하고, 본원에 기재된 용량 범위는 예시적인 것일 뿐이고 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 한정하기 위한 것이 아니라는 것도 이해해야 한다.

본원의 약학 조성물은 "치료 유효량", "예방 유효량" 또는 "진단 유효량"의 본원에 기재된 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 포함할 수 있다.

"치료 유효량"은 필요한 시간 동안 필요한 용량에서 원하는 치료 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 치료 유효량은 질환 상태, 개체의 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 불러일으키는 항체 또는 항체 부분의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 치료적으로 유리한 효과가 항체 분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 능가하는 양이기도 하다.

"치료 유효 용량"은 전형적으로 측정 가능한 파라미터를 치료받지 않은 대상체에 비해 적어도 약 20%, 예를 들면, 적어도 약 40%, 적어도 약 60% 또는 적어도 약 80%까지 억제한다. 측정 가능한 파라미터는 예를 들면, 혈뇨, 착색된 소변, 거품이 있는 소변, 통증, 손과 발의 팽윤(부종), 또는 높은 혈압일 수 있다. 본원에 기재된 장애를 치료하거나 예방하는 데 있어서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 측정 가능한 파라미터를 억제하는 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)의 능력을 평가할 수 있다. 대안적으로, 예를 들면, 시험관내 어세이로 표적 분자 또는 세포의 생물학적 기능을 조절하는 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 능력을 조사함으로써 조성물의 이 특성을 평가할 수 있다.

"예방 유효량"은 필요한 시간 동안 필요한 용량에서 원하는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방 용량은 질환 전에 또는 질환의 초기 단계에서 대상체에 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 더 적을 것이다.

"진단 유효량"은 필요한 시간 동안 필요한 용량에서 원하는 진단 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 진단 유효량은 장애, 예를 들면, 본원에 기재된 장애가 시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서 진단될 수 있는 양이다.

본원에 기재된 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 포함하는 키트도 본 개시 내에 있다. 이 키트는 사용 설명서; 다른 시약, 예를 들면, 표지, 치료제, 또는 항체 분자를 표지 또는 치료제에 킬레이팅하거나 다른 방식으로 커플링시키는 데 유용한 물질, 또는 방사성보호 조성물; 투여를 위해 결합 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 준비하기 위한 디바이스 또는 다른 물질; 약학적으로 허용 가능한 담체; 및 대상체에게의 투여를 위한 디바이스 또는 다른 물질을 포함하는 하나 이상의 다른 요소를 포함할 수 있다.

핵산

본 개시는 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 결합 폴리펩타이드, 예를 들면, 항체 분자 또는 T 세포 수용체 분자)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산도 특징으로 한다.

한 실시양태에서, 상기 핵산은 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열도 포함하거나, 이와 실질적으로 상동한 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 이와 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일하고/하거나, 본원에 기재된 엄격도 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 서열)도 가진다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산은 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 상동한 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 이와 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일하고/하거나, 본원에 기재된 엄격도 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 서열)도 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산은 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 상동한 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 이와 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일하고/하거나, 본원에 기재된 엄격도 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 서열)도 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 핵산은 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 중쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 상동한 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 이와 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일하고/하거나, 본원에 기재된 엄격도 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 서열)도 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산은 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 상동한 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 이와 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일하고/하거나, 본원에 기재된 엄격도 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 서열)도 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 핵산은 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터의 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이와 실질적으로 상동한 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 이와 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일하고/하거나, 본원에 기재된 엄격도 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 서열)을 포함한다.

한 실시양태에서, 상기 핵산은 본원에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 일부를 포함한다. 상기 일부는 예를 들면, 가변 영역(예를 들면, VH 또는 VL); 1개, 2개 또는 3개 이상(예를 들면, 4개, 5개 또는 6개)의 CDR; 또는 1개, 2개, 3개 또는 4개 이상의 프레임워크 영역, 임의적으로 불변 영역 또는 Fc 영역을 코딩할 수 있다.

본원에 개시된 핵산은 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 단일 가닥인 경우 코딩 가닥 또는 비-코딩(안티센스) 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 불연속될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 중합 후, 예컨대, 표지부착 성분과의 접합에 의해 더 변형될 수 있다. 핵산은 재조합 폴리뉴클레오타이드일 수 있거나, 자연에서 존재하지 않거나 비-천연 정렬로 또 다른 폴리뉴클레오타이드에 연결되어 있는, 게놈, cDNA, 반합성 또는 합성 유래의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.

일부 양태에서, 본원은 본원에 기재된 핵산을 함유하는 숙주 세포 및 벡터를 특징으로 한다. 상기 핵산은 이하에 더 상세히 기재된 바와 같이 동일한 숙주 세포 또는 별개의 숙주 세포에 존재하는 단일 벡터 또는 별개의 벡터에 존재할 수 있다.

벡터

본 개시는 폴리펩타이드(예를 들면, 결합 폴리펩타이드, 예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 특징으로 한다.

벡터는 바이러스, 플라스미드, 코스미드, 람다 파지 또는 효모 인공 염색체(YAC)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

다수의 벡터 시스템들이 사용될 수 있다. 예를 들면, 한 부류의 벡터들은 동물 바이러스, 예를 들면, 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스(라우스 육종 바이러스, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스로부터 유래한 DNA 요소를 사용한다. 또 다른 부류의 벡터들은 RNA 바이러스, 예컨대, 셈리키 포레스트 바이러스, 이스턴 말 뇌염 바이러스 및 플라비바이러스로부터 유래한 RNA 요소를 사용한다.

추가로, 그의 염색체 내에 안정하게 삽입된 DNA를 갖는 세포는 형질감염된 숙주 세포의 선별을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선별될 수 있다. 상기 마커는 예를 들면, 영양요구성 숙주에 대한 프로토프로피(prototropy), 살생물제 내성(예를 들면, 항생제), 또는 중금속, 예컨대, 구리에 대한 내성 등을 제공할 수 있다. 선별 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접적으로 연결될 수 있거나, 공형질전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. 추가 요소도 mRNA의 최적 합성을 위해 요구될 수 있다. 이 요소는 스플라이스 신호뿐만 아니라, 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호도 포함할 수 있다.

일단 구축물을 함유하는 발현 벡터 또는 DNA 서열이 발현을 위해 준비되면, 발현 벡터를 적절한 숙주 세포 내로 형질감염시킬 수 있거나 도입할 수 있다. 다양한 기법들, 예를 들면, 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 전기천공, 레트로바이러스 형질도입, 바이러스 형질감염, 유전자 총, 지질 기반 형질감염 또는 다른 통상적인 기법을 이용하여 이를 달성할 수 있다. 원형질체 융합의 경우, 세포를 배지에서 생장시키고 적절한 활성에 대해 스크리닝한다.

수득된 형질감염된 세포를 배양하고 생성된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)를 회수하는 방법 및 조건은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있고, 본 설명을 기반으로 사용된 구체적인 발현 벡터 및 포유동물 숙주 세포에 따라 변경될 수 있거나 최적화될 수 있다.

세포

본 개시는 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포도 제공한다. 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)는 본원에 기재된 방법에 따라 조작될 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포는 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 본원에 기재된 항체 분자 또는 TCR 분자)의 뉴클레오타이드 서열, 이와 실질적으로 상동한 서열(예를 들면, 이와 적어도 약 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 동일하고/하거나 본원에 기재된 엄격도 조건 하에서 혼성화할 수 있는 서열), 또는 상기 핵산들 중 하나의 일부를 갖는 핵산 분자를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 코딩하는 핵산을 포함하도록 유전적으로 조작된다.

일부 실시양태에서, 숙주 세포는 발현 카세트를 사용함으로써 유전적으로 조작된다. 어구 "발현 카세트"는 이러한 서열과 상용 가능한 숙주에서 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 이러한 카세트는 프로모터, 인트론을 갖거나 갖지 않는 오픈 리딩 프레임, 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 발현에 영향을 미치는 데 필요하거나 도움을 주는 추가 인자, 예를 들면, 유도성 프로모터도 사용될 수 있다.

본 개시는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공한다.

상기 세포는 진핵 세포, 세균 세포, 곤충 세포 또는 인간 세포일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 적합한 진핵 세포는 Vero 세포, HeLa 세포, COS 세포, CHO 세포, HEK293 세포, BHK 세포 및 MDCKII 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 적합한 곤충 세포는 Sf9 세포를 포함하나 이것으로 한정되지 않는다.

폴리펩타이드의 용도

본원에 개시된 폴리펩타이드(예를 들면, 결합 폴리펩타이드, 예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)뿐만 아니라 본원에 개시된 약학 조성물도 시험관내, 생체외 및 생체내 치료, 예방 및/또는 진단 유용성을 가진다.

한 실시양태에서, 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)는 표적 분자(예를 들면, 단백질) 또는 세포의 하나 이상의 생물학적 활성을 조절한다(예를 들면, 감소시키거나(예를 들면, 억제하거나, 차단하거나 중화시키거나) 증가시킨다(예를 들면, 활성화시키거나, 시작하거나 향상시킨다)). 예를 들면, 표적 분자 또는 세포의 하나 이상의 생물학적 활성을 조절하기 위해 이 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 배양물, 시험관내 또는 생체외에서 세포에 투여할 수 있거나 대상체, 예를 들면, 인간 대상체, 예를 들면, 생체내에 투여할 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본 개시는 대상체에서 장애, 예를 들면, 본원에 기재된 장애를 치료하거나, 예방하거나 진단하는 방법으로서, 상기 장애가 치료되거나, 예방되거나 진단되도록 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 본 개시는 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 배양물, 예를 들면, 시험관내 또는 생체외에서 세포와 접촉시키거나, 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)를 대상체, 예를 들면, 생체내에 투여하여, 장애, 예를 들면, 표적 분자 또는 세포와 관련된 장애(예를 들면, 본원에 기재된 장애)를 치료하거나, 예방하거나 진단하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 포함하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체, 예를 들면, 본원에 기재된 장애를 갖거나 본원에 기재된 장애를 가질 위험에 있는 인간 환자이다. 용어 "비인간 동물"은 포유동물 및 비포유동물, 예컨대, 비인간 영장류를 포함한다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 본원에 기재된 장애에 대해 인간 환자를 치료하기에 적합하다. 본원에 기재된 장애를 갖는 환자는 본원에 기재된 장애를 발생시켰으나 (적어도 일시적으로) 증상을 보이지 않는 환자, 본원에 기재된 장애의 증상을 나타내는 환자, 또는 본원에 기재된 장애와 관련되어 있거나 연관되어 있는 장애를 갖는 환자를 포함한다.

장애를 치료하거나 예방하는 방법

본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)는 장애 또는 상태를 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩타이드는 장애 또는 상태를 치료하거나 예방하는 데 바람직할 수 있는 최적 또는 개선된 반감기를 가진다. 이론에 의해 구속받고자 하지는 않지만, 한 실시양태에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 최적 또는 개선된 반감기를 갖는 폴리펩타이드)는 동일하거나 유사한 결합 친화성 및/또는 특이성을 갖는 또 다른 폴리펩타이드(예를 들면, 최적 또는 개선된 반감기를 갖지 않거나 갖도록 조작되지 않은 폴리펩타이드)에 비해 하나 이상의 이점을 제공할 수 있다. 이 이점은 증가된 치료 또는 예방 효능, 감소된 투여 용법, 또는 개선된 약물동력학적 특성을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 폴리펩타이드는 본원에 기재된 돌연변이된 Fc 영역을 포함한다.

본원에 기재된 폴리펩타이드에 의해 치료될 수 있거나 예방될 수 있는 예시적 장애 또는 상태는 암(예를 들면, 고형 종양 또는 혈액 암), 감염성 질환(예를 들면, 세균 감염 또는 바이러스 감염), 면역 장애(예를 들면, 자가면역 장애), 염증 장애, 대사 장애(예를 들면, 당뇨병), 심혈관 장애, 장기 이식 거부를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본원에 기재된 폴리펩타이드에 의해 치료될 수 있거나 예방될 수 있는 예시적 암은 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 부신피질 암종, 카포시 육종, AIDS 관련 림프종, 원발성 중추신경계(CNS) 림프종, 항문암, 충수암, 성상세포종, 비정형 유기형/간상 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암(예를 들면, 에윙 육종 또는 골육종 및 악성 섬유 조직구종), 뇌종양(예를 들면, 성상세포종, 뇌간 신경교종, 중추신경계 비정형 유기형/간상 종양, 중추신경계 배아 종양, 중추신경계 배세포 종양, 두개인두종 또는 뇌실막세포종), 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카시노이드 종양(예를 들면, 위장 카시노이드 종양), 심(심장) 종양, 배아 종양, 배세포 종양, 림프종, 자궁경부암, 담관암종, 척색종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 골수증식성 신생물, 결장암, 대장암, 두개인두종, 피부 T 세포 림프종, 유관상피내암종(DCIS), 자궁내막암, 뇌실막세포종, 식도암, 감각신경모세포종, 에윙 육종, 두개외 배세포 종양, 성선외 배세포 종양, 안암(예를 들면, 안구내 흑색종 또는 망막모세포종), 난관암, 골의 섬유 조직구종, 골육종, 담낭암, 위(복부)암, 위장 카시노이드 종양, 위장 간질 종양(GIST), 배세포 종양(예를 들면, 중추신경계 종양, 두개외 종양, 성선외 종양, 난소암 또는 정소암), 임신 영양막 질환, 신경교종, 모발상 세포 백혈병, 두경부암, 간세포(간)암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안구내 흑색종, 췌도 세포 종양, 췌장 신경내분비 종양, 카포시 육종, 신장암(예를 들면, 신장세포암 또는 윌름스 종양), 랑게르한스 세포 조직구증(LCH), 후두암, 백혈병(예를 들면, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML) 또는 모발상 세포 백혈병), 구순구강암, 간암, 폐암(예를 들면, 비소세포 폐암(NSCLC) 또는 소세포 폐암), 림프종(예를 들면, 에이즈 관련 버킷 림프종, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종 또는 원발성 중추신경계(CNS) 림프종), 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 남성 유방암, 골의 악성 섬유 조직구종 및 골육종, 흑색종(예를 들면, 안구내(눈) 흑색종), 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평 경부암, 정중선관 암종, 입암, 다발성 내분비 신생물형성 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상 식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물, 만성 골수증식성 신생물, 비강부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 구강암, 구순구강암, 구인두암, 골육종 및 골의 악성 섬유 조직구종, 난소암(예를 들면, 상피 난소암 또는 배세포 난소 종양), 췌장암, 췌장 신경내분비 종양(췌도 세포 종양), 유두종증, 부신경절종, 부비동비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화성세포종, 뇌하수체 종양, 흉막폐 모세포종, 복막암, 전립선암, 직장암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액선암, 육종(예를 들면, 에윙 육종, 카포시 육종, 골육종, 횡문근육종, 연조직 육종 또는 자궁 육종), 세자리 증후군, 피부암(예를 들면, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 또는 비흑색종 피부암), 소장암, 편평 세포 암종, 정소암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 전이 세포 암, 요도암, 자궁내막 자궁암, 질암, 외음부암, 또는 이들의 전이성 병변을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본원에 기재된 폴리펩타이드에 의해 치료될 수 있거나 예방될 수 있는 예시적 감염성 질환은 악시네토박터 감염, 방선균증, 아프리카 수면병(아프리카 파동편모충증), AIDS(후천성 면역결핍 증후군), 아메바증, 아나플라즈마증, 광동주혈선충증, 고래회충증, 탄저병, 아카노박테리움 해몰라이티쿰 감염, 아르헨티나 출혈열, 회충증, 아스퍼길루스증, 아스트로바이러스 감염, 바베시아감염증, 바실러스 세레우스 감염, 세균성 폐렴, 세균성 질염, 박테로이데스 감염, 대장섬모충증, 바르토넬라증, 베이리사스카리스 감염, bk 바이러스 감염, 흑색사모증, 블라스토시스티스증, 블라스토마이세스증, 볼리비아 출혈열, 보톨리눔독소증(및 유아 보톨리눔독소증), 브라질 출혈열, 브루셀라증, 선페스트, 버크홀데리아 감염, 부룰리 궤양, 칼리시바이러스 감염(노로바이러스 및 사포바이러스), 캄필로박터증, 칸디다증(모닐리아증; 아구창), 캐필라리아증, 카리온병, 고양이발톱병, 봉와직염, 샤가스병(미국 파동편모충증), 연성하감, 수두, 치쿤구니야열, 클라미디아, 클라미도필라 뉴모니아 감염(대만 급성 호흡 물질 또는 twar), 콜레라, 크로모블라스토마이세스증, 항아리곰팡이병, 간흡충증, 클로스트리듐 디피실리 결장염, 콕시디오이데스진균증, 콜로라도 진드기열(CTF), 일반 감기(급성 바이러스성 비인두염; 급성 코리자), 크로이츠펠트-야콥병(CJD), 크림-콩고 출혈열(CCHF), 크립토콕쿠스증, 크립토스포리디움증, 피부 유충이행증(CLM), 원포자충증, 낭미충증, 사이토메갈로바이러스 감염, 뎅기열, 데스모데스무스 감염, 디엔트아베바증, 디프테리아, 열두조충증, 메디나충증, 에볼라 출혈열, 포충증, 엘리히증, 요충증(요충 감염), 엔테로코커스 감염, 엔테로바이러스 감염, 발진티푸스, 감염성 홍반(제5병), 돌발진(제6병), 간질증, 비대흡충증, 치명적 가족성 불면증(FFI), 사상충증, 클로스트리듐 퍼프린겐스에 의한 식중독, 자유 생활 아메바 감염, 푸소박테리움 감염, 가스 괴저(클로스트리듐성 근괴사), 지오트리쿰증, 게르스트만-스트라우슬러-쉐인커 증후군(GSS), 편모충증, 마비저, 악구충증, 임질, 사타구니육아종(도노반증), 군 A 스트렙토코커스 감염, 군 B 스트렙토코커스 감염, 해모필루스 인플루엔자 감염, 수족구병(HFMD), 한타바이러스 폐 증후군(HPS), 하트랜드 바이러스 질환, 헬리코박터 파일로리 감염, 용혈요독 증후군(HUS), 신장 증후군을 갖는 출혈열(HFRS), 간염 A, 간염 B, 간염 C, 간염 D, 간염 E, 단순포진, 히스토플라스마증, 구충 감염, 인간 보카바이러스 감염, 인간 에윙기이(ewingii) 엘리히증, 인간 과립구성 아나플라즈마증(HGA), 인간 메타뉴모바이러스 감염, 인간 단핵구성 엘리히증, 인간 파필로마바이러스(HPV) 감염, 인간 파라인플루엔자 바이러스 감염, 왜소조충증, 엡스테인-바 바이러스 감염성 단핵증(Mono), 인플루엔자(감기), 등포자충증, 가와사키병, 각막염, 킹겔라 킹개 감염, 쿠루, 라사열, 레지오넬라증(재향군인병), 레지오넬라증(폰티악열), 리슈마니아증, 한센병, 렙토스피라증, 리스테리아증, 라임병(라임 보렐리아증), 림프 사상충증(상피병), 림프구성 맥락수막염, 말라리아, 마르부르그 출혈열(MHF), 홍역, 중동 호흡 증후군(MERS), 유비저(휘트모어병), 수막염, 수막구균성 질환, 요코가와흡충증, 미포자충증, 전염성 연속종(MC), 원두, 볼거리, 발진열(전염성 티푸스), 마이코플라스마 폐렴, 진균종(중의성 해결), 구더기증, 신생아 결막염(신생아안염), (신종) 변이체 크로이츠펠트-야콥병(vCJD, nvCJD), 노카르디아증, 회선사상충증(사상충증), 간흡충증, 파라콕시디오이데스진균증(남아프리카 블라스토마이세스증), 폐흡충증, 파스퇴렐라증, 두슬증(머리이), 구슬증(몸이), 사면발이증(치골이, 게이), 골반 염증 질환(PID), 백일해(쌕쌕 기침), 흑사병, 폐구균 감염, 뉴모시스티스 폐렴(PCP), 폐렴, 소아마비, 프레보텔라 감염, 원발성 아메바성 뇌수막염(PAM), 진행성 다초점 백질뇌병증, 앵무새병, Q열, 광견병, 재귀열, 호흡 세포융합 바이러스 감염, 리노스포리듐증, 리노바이러스 감염, 리케차 감염, 리케차 두창, 리프트 계곡열(RVF), 록키산 홍반열(RMSF), 로타바이러스 감염, 풍진, 살모넬라증, SARS(중증 급성 호흡 증후군), 옴, 주혈흡충증, 패혈증, 시겔라증(세균성 이질), 대상포진(헤르페스 조스터), 천연두(두창), 스포로트리쿰증, 스타필로코커스 식중독, 스타필로코커스 감염, 분선충증, 아급성 경화성 범뇌염, 매독, 조충증, 파상풍(개구장애), 백선성 모창(이발소 양진), 두부 백선(두피의 백선), 체부 백선(몸의 백선), 샅백선(조크 양진), 손 백선(손의 백선), 흑색 백선, 발 백선(운동선수의 발), 조갑 백선(손발톱진균증), 전풍(어루러기), 톡소카라증(눈 유충이행증(OLM)), 톡소카라증(내장 유충이행증(VLM)), 트라코마, 톡소플라스마증, 선모충증, 편모충증, 편충증(편충 감염), 결핵, 야토병, 장티푸스, 발진티푸스, 유레아플라스마 유레아라이티쿰 감염, 계곡열, 베네수엘라 말 뇌염, 베네수엘라 출혈열, 비브리오 불니피쿠스 감염, 비브리오 파라해몰라이티쿠스 장염, 바이러스성 폐렴, 웨스트 나일열, 백색 사모(백색 윤선), 예르시니아 슈도튜버큘로시스 감염, 예르시니아증, 황열, 지카열 또는 접합진균증을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본원에 기재된 폴리펩타이드에 의해 치료될 수 있거나 예방될 수 있는 예시적 면역 장애 또는 상태는 애디슨병, 무감마글로불린혈증, 원형탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질 증후군(APS), 자가면역 간염, 자가면역 내이 질환(AIED), 축삭 & 신경 신경병증(AMAN), 베체트병, 수포성 유천포창, 캐슬맨병(CD), 셀리악병, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초화 다발신경병증(CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 처르그-스트라우스, 반흔성 유천포창/양성 점막 유천포창, 코간 증후군, 한랭 응집소 질환, 선천성 심장 차단, 콕사키 심근염, CREST 증후군, 크론병, 포진형 피부염, 피부근염, 데빅병(시신경척수염), 원판모양 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산구성 식도염(EoE), 호산구성 근막염, 결절 홍반, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 에반스 증후군, 섬유근육통, 섬유성 폐포염, 거대 세포 동맥염(측두 동맥염), 거대 세포 심근염, 사구체신염, 굿파스처 증후군, 다발혈관염을 갖는 육아종증, 그레이브스병, 길랭-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인 자색반(HSP), 임신 포진 또는 임신 유천포창(PG), 저감마글로불린혈증, IgA 신장병증, IgG4 관련 경화성 질환, 봉입체 근염(IBM), 간질성 방광염(IC), 소아 관절염, 소아 당뇨병(1형 당뇨병), 소아 근염(JM), 가와사키병, 램버트-이튼 증후군, 백혈구파괴성 혈관염, 편평태선, 경화태선, 목질 결막염, 선형 IgA 질환(LAD), 루푸스, 만성 라임병, 메니에르병, 미시적 다발혈관염(MPA), 혼합 결합 조직 질환(MCTD), 무렌 궤양, 무차-하버만병, 다발성 경화증(MS), 중증 근무력증, 근염, 기면증, 시신경척수염, 호중구감소증, 눈 반흔성 유천포창, 시신경염, 재발성 류마티즘(PR), PANDAS(스트렙토코커스와 관련된 소아 자가면역 신경정신병성 장애), 방종양성 소뇌 변성(PCD), 발작성 야간 혈색뇨(PNH), 패리 롬버그 증후군, 평면부염(말초 포도막염), 파르소내지-터너(Parsonnage-Turner) 증후군, 천포창, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈(PA), POEMS 증후군(다발신경병증, 장기종대, 내분비병증, 단일클론 감마글로불린병증, 피부 변화), 결절성 다발동맥염, 류마티스성 다발근육통, 다발근염, 심근경색후 증후군, 심막절개후 증후군, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 프로게스테론 피부염, 건선, 건선성 관절염, 진성 적혈구계 무형성증(PRCA), 괴저성 농피증, 레이노 현상, 반응성 관절염, 반사성 교감신경성 이영양증, 레이터 증후군, 재발성 다발연골염, 하지불안 증후군(RLS), 후복막 섬유증, 류마티스열, 류마티스성 관절염(RA), 사르코이드증, 슈미트 증후군, 공막염, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 정자 & 정소 자가면역, 강직 인간 증후군(SPS), 아급성 세균성 심내막염(SBE), 수삭 증후군, 교감성 안염(SO), 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판감소성 자반증(TTP), 톨로사-헌트 증후군(THS), 횡단 척수염, 1형 당뇨병, 궤양성 결장염(UC), 미분화 결합 조직 질환(UCTD), 포도막염, 혈관염, 백반증 또는 베게너 육아종증(다발동맥염을 갖는 육아종증(GPA))을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)는 전형적으로 환자가 회복할 때까지 환자의 시스템에서 치료 유효 수준의 상기 폴리펩타이드를 유지하는 빈도로 투여된다. 예를 들면, 상기 폴리펩타이드는 적어도 약 1개, 2개, 5개, 10개, 20개, 30개 또는 40개의 폴리펩타이드가 각각의 표적 분자 또는 세포에 결합하기에 충분한 혈청 농도를 달성하는 빈도로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일마다, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주마다, 또는 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월마다 투여된다.

다양한 폴리펩타이드들(예를 들면, 항체 분자들 또는 TCR 분자들)을 투여하는 방법은 당분야에서 공지되어 있고 이하에 기재되어 있다. 사용되는 폴리펩타이드의 적합한 용량은 대상체의 연령 및 체중, 및 사용되는 구체적인 약물에 의해 좌우될 것이다.

상기 폴리펩타이드는 단독으로 사용될 수 있거나, 제2 물질, 예를 들면, 세균성 물질, 독소 또는 단백질, 예를 들면, 제2 폴리펩타이드에 접합된 상태로 사용될 수 있다. 이 방법은 단독으로 또는 제2 물질에 접합된 상기 폴리펩타이드를, 이러한 치료를 요구하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 폴리펩타이드는 다양한 치료제들, 예를 들면, 독소 또는 이들의 혼합물을 전달하는 데 사용될 수 있다.

조합 요법

폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자 또는 TCR 분자)는 다른 요법과 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들면, 조합 요법은 하나 이상의 추가 치료제, 예를 들면, 본원에 기재된 하나 이상의 추가 치료제와 함께 제제화되고/되거나 함께 투여되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩타이드는 다른 치료적 치료법, 예를 들면, 본원에 기재된 다른 치료적 치료법과 조합되어 투여된다. 이러한 조합 요법은 유리하게는 보다 낮은 용량의 투여되는 치료제를 사용함으로써, 다양한 단일요법들과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "조합되어" 투여된다는 것은 대상체가 장애를 앓기 전 또는 앓는 과정 동안 2종(또는 더 많은 종류)의 상이한 치료를 대상체에게 전달한다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 2종 이상의 치료는 예방을 위해, 예를 들면, 대상체가 장애를 갖거나 장애를 진단받기 전에 전달된다. 또 다른 실시양태에서, 2종 이상의 치료는 대상체가 장애를 발생시켰거나 장애를 진단받은 후에 전달된다. 일부 실시양태에서, 한 치료의 전달은 제2 치료의 전달이 시작될 때 여전히 일어나므로, 중첩이 있다. 이것은 종종 본원에서 "동시적인" 또는 "동시 전달"로서 지칭된다. 다른 실시양태에서, 한 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종결된다. 이들 중 어느 한 경우의 일부 실시양태에서, 치료는 조합된 투여로 인해 더 효과적이다. 예를 들면, 제2 치료가 더 효과적이거나, 예를 들면, 더 적은 제2 치료의 사용 시 동등한 효과가 관찰되거나, 제2 치료가 제1 치료의 부재 하에서 제2 치료를 투여하였을 경우 확인된 정도보다 더 큰 정도로 증상을 감소시키거나, 제1 치료의 사용 시 유사한 상황이 확인된다. 일부 실시양태에서, 전달은 증상, 또는 장애와 관련된 다른 파라미터의 감소가 다른 치료의 부재 하에서 전달된 한 치료의 사용 시 관찰된 감소보다 더 클 정도의 전달이다. 2종의 치료의 효과는 부분적으로 상가적일 수 있거나, 전체적으로 상가적일 수 있거나, 상가적 효과보다 더 클 수 있다. 전달은 전달된 제1 치료의 효과가 제2 치료를 전달할 때 여전히 검출될 수 있을 정도의 전달일 수 있다.

한 실시양태에서, 폴리펩타이드는 본원에 기재된 장애를 치료하거나 예방하기 위해 제2 요법(예를 들면, 추가 물질)과 조합되어 투여된다. 한 실시양태에서, 추가 물질은 제1 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)와 상이한 제2 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자), 예를 들면, 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)이다. 조합되어 사용될 수 있는 예시적 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)는 본원에 기재된 폴리펩타이드들(예를 들면, 항체 분자들)의 임의의 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 추가 물질은 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자) 이외의 물질이다. 예를 들면, 추가 물질은 소분자 또는 핵산 분자일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제2 요법은 수술, 방사선 요법, 세포 요법(예를 들면, 줄기 세포 요법), 또는 장기 또는 조직 이식으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 제2 요법은 하기 요법들 중 하나 이상으로부터 선택된 요법을 포함한다: 안드로겐 대체 요법, 항호르몬 요법, 항혈청 요법, 자가 면역 향상 요법, 생물요법, 혈액 방사선조사 요법, 근접요법, 심장 재동기화 요법, 세포 요법, 세포 전달 요법, 킬레이션 요법, 화학요법, 금요법, 코발트 요법, 냉압 요법, 한랭요법, 전기경련 요법, 전자기 요법, 전자 요법, 전기요법, 효소 대체 요법, 후성유전학 요법, 에스트로겐 대체 요법, 체외 충격파 요법, 고속 중성자 요법, 플루오라이드 요법, 유전자 요법, 열 요법, 구충 요법, 호르몬 요법, 호르몬 대체 요법, 숙주 조절 요법, 고압 산소 요법, 발열 요법, 면역억제 요법, 면역요법, 수술중 전자 방사선 요법, 수술중 방사선 요법, 역위 요법, 레이저 요법, 광 요법, 리튬 요법, 저수준 레이저 요법, 자석 요법, 자기 공명 요법, 의료용 가스 요법, 의료용 영양 요법, 분자 샤페론 요법, 분자 요법, 단일클론 항체 요법, 음성 공기 이온화 요법, 중성자 포획 요법, 중성자 요법, 경구 재수화 요법, 삼투압요법, 산소 요법, 오존 요법, 완화 요법, 입자 요법, 파지 요법, 음소 신경학적 하이포크로뮴 요법, 광역학 요법, 광요법, 광열 요법, 물리적 요법, 증식요법, 단백질 요법, 양성자 요법, 박동 전자기장 요법, PUVA 요법, 방사선 요법, 재수화 요법, 호흡 요법, 살비지 요법, 혈청요법, 줄기 세포 요법, 정위 방사선 요법, 표적화된 요법, 온열요법, TK 세포 요법, 관용 요법, 경피 연속 산소 요법, 자외선 요법 또는 바이러스요법.

다른 장애를 치료하거나 예방하기 위해 본원에 기재된 폴리펩타이드 또는 조성물과 조합되어 사용될 수 있는 예시적 요법은 본원의 단락 "장애를 치료하거나 예방하는 방법"에도 기재되어 있다.

진단 방법

일부 양태에서, 본 개시는 시험관내(예를 들면, 생물학적 샘플, 예컨대, 생검 또는 체액(예를 들면, 혈액, 소변 또는 뇌척수액) 샘플) 또는 생체내(예를 들면, 대상체에서의 생체내 영상화)에서 표적 분자(예를 들면, 단백질) 또는 세포의 존재를 검출하는 진단 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 샘플을 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 본원에 기재된 항체 분자)와 접촉시키거나, 상기 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)를 대상체에게 투여하는 단계; (임의적으로) (ii) 기준 샘플, 예를 들면, 대조군 샘플(예를 들면, 대조군 생물학적 샘플, 예컨대, 생검 또는 체액(예를 들면, 혈액, 소변 또는 뇌척수액) 샘플) 또는 대조군 대상체를 본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 본원에 기재된 항체)와 접촉시키는 단계; 및 (iii) 상기 샘플 또는 대상체, 또는 상기 대조군 샘플 또는 대상체에서 상기 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)와 표적 분자 또는 세포 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하고, 이 때 상기 대조군 샘플 또는 대상체에 비해 상기 샘플 또는 대상체에서의 상기 복합체의 형성의 변화, 예를 들면, 통계학적으로 유의미한 변화는 표적 분자 또는 세포가 상기 샘플에 존재한다는 것을 표시한다. 결합되었거나 결합되지 않은 상기 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)의 검출을 용이하게 하기 위해 상기 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)를 검출 가능한 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지할 수 있다. 적합한 검출 가능한 물질은 본원에 기재된 다양한 효소들, 보결분자단들, 형광 물질들, 발광 물질들 및 방사성 물질들을 포함한다.

세균을 검출하는 데 사용된 샘플을 지칭할 때, 용어 "샘플"은 세포, 세포 용해물, 세포의 단백질 또는 막 추출물, 체액, 예컨대, 혈액, 소변 또는 CSF, 또는 조직 샘플, 예컨대, 생검을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)와 표적 분자 또는 세포 사이의 복합체 형성은 표적 분자 또는 세포에 결합된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자), 또는 결합되지 않은 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)를 측정하거나 가시화함으로써 검출될 수 있다. 임의의 적합한 검출 어세이가 이용될 수 있고, 통상적인 검출 어세이는 효소-연결된 면역흡착 어세이(ELISA), 방사면역어세이(RIA), FACS 어세이, BIACORE 어세이 또는 조직 면역조직화학을 포함한다. 폴리펩타이드의 표지부착에 대한 대안으로서, 검출 가능한 물질로 표지된 표준물 및 표지되지 않은 폴리펩타이드를 사용하는 경쟁 면역어세이로 샘플에서 표적 분자 또는 세포의 존재를 어세이할 수 있다. 이 어세이에서, 생물학적 샘플, 표지된 표준물 및 폴리펩타이드를 조합하고 표지되지 않은 결합 분자에 결합된 표지된 표준물의 양을 측정한다. 샘플 중의 표적 분자 또는 세포의 양은 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)에 결합된 표지된 표준물의 양에 반비례한다.

본원에 기재된 폴리펩타이드(예를 들면, 항체 분자)는 본원에 기재된 폴리펩타이드에 의해 치료될 수 있거나 예방될 수 있는 장애를 진단하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 검출 또는 진단 방법은 본원에 기재된 장애를 치료하거나 예방하는 데 있어서 본원에 기재된 다른 방법과 조합되어 이용될 수 있다.

추가 실시양태는 하기 넘버링된 단락들에 기재되어 있다.

1. 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고,

를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 HCVR 또는 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않고, HCVR과 LCVR은 매칭되는 것인 방법.

2. 단락 1에 있어서, HC 요소는 HCVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법.

3. 단락 1 또는 2에 있어서, LC 요소는 LCVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법.

4. 단락 1 내지 3 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열은, 발현될 때, HCVRS 및 LCVRS가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, scFv를 형성하도록 구성되는 것인 방법.

5. 단락 4에 있어서, 항원 결합 분자, 예를 들면, scFv는 예를 들면, 본원에 기재된 방법 또는 어세이에 의해 확인될 때 시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서 기능을 하는 것인 방법.

6. 단락 1 내지 5 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계는

a) (i) 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA); 및 (ii) 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA에 결합된 포획 기재(cDNA 로딩된 포획 기재)를 획득하는 단계, 및

b) 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA의 증폭을 허용하는 조건 하에서 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 유지하여, 세포로부터의 HCVR의 HC 요소, 예를 들면, HCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 HC ds cDNA; 및 세포로부터의 LCVR의 LC 요소, 예를 들면, LCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 LC ds cDNA를 생성하는 단계

를 포함하는 것인 방법.

7. 단락 6에 있어서, HC ds cDNA는 제1 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일한 것인 방법.

8. 단락 6 또는 7에 있어서, LC ds cDNA는 제2 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일한 것인 방법.

9. 단락 6 내지 8 중 어느 한 단락에 있어서, 포획 기재는 비드, 예를 들면, 자성 비드를 포함하는 것인 방법.

10. 단락 6 내지 9 중 어느 한 단락에 있어서, 포획 기재는 cDNA에 결합하는 모이어티(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드), 예를 들면, (i) HC 가닥에 결합하는 모이어티; (ii) LC 가닥에 결합하는 모이어티; 또는 (iii) (i) 및 (ii) 둘 다를 포함하는 것인 방법.

11. 단락 6 내지 10 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 mRNA가 로딩된 포획 기재에 배치하는 것인 방법.

12. 단락 6 내지 11 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 (예를 들면, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 mRNA가 로딩된 포획 기재로부터 용액으로 유리된 후) 세포의 HCVR의 HC 요소, 예를 들면, HCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제1 ds cDNA, 및 세포의 LCVR의 LC 요소, 예를 들면, LCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제2 ds cDNA를 제1 mRNA 및 제2 mRNA로부터 생성하기에 적합한 시약 혼합물을 포함하는 것인 방법.

13. 단락 6 내지 12 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 제1 ds cDNA의 생성을 매개하는 프라이머를 포함하는 것인 방법.

14. 단락 6 내지 13 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 제2 ds cDNA의 생성을 매개하는 프라이머를 포함하는 것인 방법.

15. 단락 6 내지 14 중 어느 한 단락에 있어서, 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥을 제1 mRNA의 역전사로 제조하는 것인 방법.

16. 단락 6 내지 15 중 어느 한 단락에 있어서, 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥을 제2 mRNA의 역전사로 제조하는 것인 방법.

17. 단락 15 또는 16에 있어서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

18. 단락 15 또는 16에 있어서, 역전사는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

19. 단락 15 또는 16에 있어서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버의 외부, 또는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버의 외부에서 일어나는 것인 방법.

20. 단락 15 또는 16에 있어서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버의 외부 및 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버의 외부에서 일어나는 것인 방법.

21. 단락 15 또는 16에 있어서, 역전사는 분리된 반응 부위의 외부, 예를 들면, 마이크로챔버의 외부에서 일어나는 것인 방법.

22. 단락 6 내지 21 중 어느 한 단락에 있어서, 증폭은 20 이하의 사이클, 예를 들면, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하 또는 5 이하의 사이클을 포함하는 것인 방법.

23. 단락 6 내지 22 중 어느 한 단락에 있어서, 역전사 및/또는 증폭은 예를 들면, HCVRS 및/또는 LCVRS에 특이적인 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머를 사용하는 것인 방법.

24. 단락 6 내지 23 중 어느 한 단락에 있어서, 증폭은 HC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는 것인 방법.

25. 단락 6 내지 24 중 어느 한 단락에 있어서, 증폭은 LC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는 것인 방법.

26. 단락 25에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 감소시키는, 예를 들면, 억제하는 뉴클레오타이드 변형을 포함하는 것인 방법.

27. 단락 25 또는 26에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 감소시키는, 예를 들면, 억제하는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는 것인 방법.

28. 단락 26 또는 27에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 DNA 중합효소가 DNA를 연장하는 것을 억제하는 것인 방법.

29. 단락 26 내지 28 중 어느 한 단락에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 스페이서를 프라이머, 예를 들면, 프라이머 내의 2개의 인접 뉴클레오타이드들 사이에 삽입하는 것인 방법.

30. 단락 29에 있어서, 스페이서는 플렉시블 스페이서, 탄소 스페이서(예를 들면, -(CH2)n-, 이 때 n=3, 4 또는 5 이상), 2개 이상(예를 들면, 3개, 4개 또는 5개 이상)의 무염기 뉴클레오타이드, 또는 PEG 스페이서인 방법.

31. 단락 26 내지 28 중 어느 한 단락에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 예를 들면, 리보스에 대한 2'-O-메틸, 2'-OH, 2'-NH₂ 또는 우라실 변형인 방법.

32. 단락 26 내지 31 중 어느 한 단락에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 프라이머의 내부 또는 3' 말단에 위치하는 것인 방법.

33. 단락 23 내지 32 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 (i) 제1 구성원; (ii) 제2 구성원; 및 임의적으로 (iii) 예를 들면, (i)과 (ii) 사이에 위치하는, 본원에 기재된 뉴클레오타이드 변형을 포함하는 것인 방법.

34. 단락 33에 있어서, 제1 구성원은 동일한 프라이머 또는 상이한 프라이머 내의 제2 구성원과 어닐링하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 헤어핀 구조(분자내 하이브리드화를 통해) 또는 이중 가닥 구조(분자간 하이브리드화를 통해)를 형성할 수 있는 것인 방법.

35. 단락 33 또는 34에 있어서, 제1 구성원은 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.

36. 단락 33 내지 35 중 어느 한 단락에 있어서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, HCVRS 및/또는 LCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함하고, 임의적으로 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서의) 상동 재조합을 위한 서열을 포함하는 것인 방법.

37. 단락 23 내지 36 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 링커 서열의 적어도 일부를 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 것인 방법.

38. 단락 37에 있어서, 링커 서열의 적어도 일부를 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 프라이머는 인산화된, 예를 들면, 5' 인산화된 것인 방법.

39. 단락 37 또는 38에 있어서, 링커 서열은 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하거나 이것으로 구성되고, 이 때 n은 1, 2, 3, 4 또는 5 이상인 방법.

40. 단락 1 내지 39 중 어느 한 단락에 있어서, HC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함하는 것인 방법.

41. 단락 1 내지 40 중 어느 한 단락에 있어서, HC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함하는 것인 방법.

42. 단락 1 내지 41 중 어느 한 단락에 있어서, LC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함하는 것인 방법.

43. 단락 1 내지 42 중 어느 한 단락에 있어서, LC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함하는 것인 방법.

44. 단락 1 내지 43 중 어느 한 단락에 있어서, HC ds cDNA 및 LC ds cDNA는 점착성 말단을 포함하는 것인, 예를 들면, 둘 다 5' 오버행을 갖는 것인 방법.

45. 단락 1 내지 44 중 어느 한 단락에 있어서, HC 가닥과 LC 가닥을 공유결합시켜, 예를 들면, 라이게이션시켜 단일 가닥 핵산 서열을 생성하고, HC 가닥 및 LC 가닥은 둘 다 센스 가닥 또는 둘 다 안티센스 가닥인 방법.

46. 단락 1 내지 44 중 어느 한 단락에 있어서, HC ds cDNA의 변성된 HC 가닥과 LC ds cDNA의 변성된 LC 가닥을 공유결합시키고, 예를 들면, 라이게이션시키고, HC 가닥 및 LC 가닥은 둘 다 센스 가닥 또는 둘 다 안티센스 가닥인 방법.

47. 단락 1 내지 44 중 어느 한 단락에 있어서, HC 가닥은 HC ds cDNA에 존재하고, LC 가닥은 LC ds cDNA에 존재하고, HC ds cDNA와 LC ds cDNA를 공유결합시켜, 예를 들면, 라이게이션시켜, 예를 들면, 이중 가닥 핵산 서열을 생성하는 것인 방법.

48. 단락 1 내지 47 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위에서 일어나는 것인 방법.

49. 단락 48에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 HC 가닥과 LC 가닥, 또는 HC ds cDNA와 LC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함하는 것인 방법.

50. 단락 48 또는 49에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 HC 가닥과 LC 가닥, 또는 HC ds cDNA와 LC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함하는 것인 방법.

51. 단락 1 내지 47 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위와 상이한 부위에서 일어나는 것인, 예를 들면, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

52. 단락 51에 있어서, HC 가닥 및 LC 가닥을 분리된 생성 부위로부터 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버로 옮기고, 공유결합은 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

53. 단락 51 또는 52에 있어서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 HC 가닥과 LC 가닥, 또는 HC ds cDNA와 LC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함하는 것인 방법.

54. 단락 51 내지 53 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 HC 가닥과 LC 가닥, 또는 HC ds cDNA와 LC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함하는 것인 방법.

55. 단락 50 또는 54에 있어서, 효소는 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제인 방법.

56. 단락 51 내지 55 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은

(a) HC 가닥 및 LC 가닥의 변성을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 95℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 가열하는 단계;

(b) 스플린트 올리고뉴클레오타이드와 HC 가닥 및 LC 가닥의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 50℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 냉각시키는 단계;

(c) HC 가닥과 LC 가닥의 라이게이션(예를 들면, HC 가닥과 LC 가닥 사이의 포스포디에스테르 결합의 형성)을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 45℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 유지하는 단계; 및

(d) 단계 (a), (b) 및 (c)를 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50 이상의 사이클 동안 순차적으로 반복하는 단계

를 포함하는 것인 방법.

57. 단락 1 내지 56 중 어느 한 단락에 있어서, HC 가닥과 LC 가닥을 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 것인 방법.

58. 단락 57에 있어서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 HC 가닥과 LC 가닥의 연접부를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화되고, 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성하는 것인 방법.

59. 단락 57 또는 58에 있어서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 억제하는 변형(예를 들면, NH₂ 기)을 포함하는 것인 방법.

60. 단락 59에 있어서, 변형은 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 있는 것인 방법.

61. 단락 1 내지 60 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합된, 예를 들면, 라이게이션된 HC 가닥 및 LC 가닥에 상보적인 가닥을 증폭으로 생성하는 것인 방법.

62. 단락 1 내지 61 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 얻기 전에 mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

63. 단락 62에 있어서, mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계는

a) i) 세포 및 ii) 상기 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계

를 포함하고, 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버는 상기 세포 이외의 세포로부터의 HCVR 또는 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 방법.

64. 단락 63에 있어서, 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버는 용해 시약, 예를 들면, 세제를 포함하는 것인 방법.

65. 단락 63 또는 64에 있어서, 세포를 열 또는 효소로 용해시키는 것인 방법.

66. 단락 63 내지 65 중 어느 한 단락에 있어서, 포획 기재는 mRNA에 결합하는 모이어티(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드), 예를 들면, 올리고(dT)를 포함하는 것인 방법.

67. 단락 62 내지 66 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버로부터 mRNA가 로딩된 포획 기재를 유리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

68. 단락 67에 있어서, 유리 단계를 폴리(dA) 또는 폴리(dT) 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 수행하여, 예를 들면, 포획되지 않은 mRNA의 교차결합을 감소시키는 것인 방법.

69. 단락 62 내지 68 중 어느 한 단락에 있어서, mRNA가 로딩된 포획 기재를 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버로부터 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버로 옮기는 것인 방법.

70. 단락 1 내지 69 중 어느 한 단락에 있어서, 생성 마이크로챔버로부터 핵산 서열을 유리시키는 단계를 포함하는 방법.

71. 단락 1 내지 70 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

72. 단락 1 내지 71 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열의 전부 또는 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함하는 방법.

73. 단락 1 내지 72 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열의 전부 또는 일부를 벡터 내에 삽입하는 단계를 포함하는 방법.

74. 단락 73에 있어서, 벡터는 핵산 서열에 포함되지 않은 추가 HC 요소 또는 LC 요소를 공급하는 것인 방법.

75. 단락 73 또는 74에 있어서, 벡터는 HC CDR1, HC CDR2, 또는 이들 둘 다를 공급하는 것인 방법.

76. 단락 73 내지 75 중 어느 한 단락에 있어서, 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.

77. 단락 1 내지 76 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열을 발현시켜, HCVR의 HC 요소, 예를 들면, HCVRS를 코딩하는 분절, 및 LCVR의 LC 요소, 예를 들면, LCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 포함하는 방법.

78. 단락 77에 있어서, LC 요소는 폴리펩타이드에서 HC 요소의 N-말단에 있는 것인 방법.

79. 단락 77에 있어서, HC 요소는 폴리펩타이드에서 LC 요소의 C-말단에 있는 것인 방법.

80. 단락 77 내지 79 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩타이드를 항원과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

81. 단락 77 내지 80 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩타이드가 항원에 결합하는지를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

82. 단락 1 내지 81 중 어느 한 단락에 있어서, 세포는 면역 세포, 예를 들면, B 세포 또는 T 세포, 예를 들면, 인간 B 세포 또는 T 세포인 방법.

83. 단락 1 내지 82 중 어느 한 단락에 있어서, 세포는 포유동물 세포 또는 조류 세포인 방법.

84. 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고,

a) i) 세포 및 (ii) 상기 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계로서, 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 HCVR 또는 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

d) i) 세포로부터의 HCVR의 HC 요소, 예를 들면, 중쇄 가변 영역 서열(HCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 중쇄 이중 가닥 cDNA(HC ds cDNA)의 가닥인 단계 b)로부터의 중쇄(HC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 LCVR의 LC 요소, 예를 들면, 경쇄 가변 영역 서열(LCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 경쇄 이중 가닥 cDNA(LC ds cDNA)의 가닥인 단계 b)로부터의 경쇄(LC) 가닥을 포함하는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 LCVR 또는 HCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 방법.

85. 항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고,

a) i) 세포 및 ii) 상기 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

c) mRNA가 로딩된 포획 기재를, 로딩된 mRNA를 주형으로서 사용하는 반응 혼합물, 예를 들면, 역전사효소를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시켜, 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA), 및 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA(cDNA 로딩된 포획 기재)를 생성하는 단계를 포함하는, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 LCVR 또는 HCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

e) HC ds cDNA의 가닥(HC 가닥)을 LC ds cDNA의 가닥(LC 가닥)에 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 단계를 포함하는, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 HC 가닥 및 LC 가닥이 둘 다 센스 가닥 또는 안티센스 가닥인 단계; 및

를 포함하는 방법.

86. 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 단락 1 내지 85 중 어느 한 단락의 방법에 의해 복수의 구성원들을 제조함으로써 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하고, 각각의 구성원이 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하고, HCVR과 LCVR은 매칭되고, 상기 복수의 특유한 구성원들의 각각의 특유한 핵산 서열이 상이한 특유한 세포로부터의 HC 요소 및 LC 요소를 포함하는 것인 방법.

87. 단락 86에 있어서, 복수의 특유한 구성원들은 적어도 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개 또는 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함하는 것인 방법.

88. 단락 86 내지 87에 있어서, 복수의 특유한 구성원들은 10⁴개 내지 10⁹개, 10⁴개 내지 10⁸개, 10⁴개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁶개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁸개 내지 10⁹개, 10⁷개 내지 10⁹개, 10⁶개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁸개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁵개 내지 10⁶개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁷개 내지 10⁸개, 또는 10⁸개 내지 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함하는 것인 방법.

89. 단락 86 내지 88 중 어느 한 단락에 있어서, 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 구성원은 (매칭된 HC 요소 및 LC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원인 방법.

90. 단락 86 내지 89 중 어느 한 단락에 있어서, 라이브러리에서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 HC 요소 및 LC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원인 방법.

91. 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리로서,

iii) 하기 특성들 중 하나 이상의 특성(예를 들면, 2개, 3개, 4개 또는 전부)을 포함하는 라이브러리:

a) 상기 라이브러리는 단락 1 내지 85 중 어느 한 단락의 방법에 의해 제조되거나;

92. 단락 91에 있어서, 복수의 특유한 구성원들 각각은, 발현될 때, HC 요소, 예를 들면, HCVRS, 및 LC 요소, 예를 들면, LCVRS가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, scFv를 형성하도록 구성되는 것인 라이브러리.

93. 단락 91 또는 92에 있어서, 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

94. 단락 91 내지 93 중 어느 한 단락에 있어서, 복수의 구성원들 각각은 구성원을 디스플레이 독립체의 표면 위에 디스플레이하는 폴리펩타이드를 추가로 코딩하는 것인 라이브러리.

95. 단락 91 내지 94 중 어느 한 단락에 있어서, 파지 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

96. 단락 91 내지 94 중 어느 한 단락에 있어서, 효모 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

97. 단락 91 내지 94 중 어느 한 단락에 있어서, 포유동물 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

98. 결합 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,

a) 단락 91 내지 97 중 어느 한 단락의 라이브러리를 획득하는 단계; 및

b) 상기 라이브러리의 특유한 핵산에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 발현시키는 단계

를 포함하는 방법.

99. 단락 98에 있어서, 폴리펩타이드를 항원과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

100. 단락 98 또는 99에 있어서, 항원에 결합하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

101. TCR α 쇄 가변 영역(ACVR)의 α 쇄 요소(AC 요소) 및 TCR β 쇄 가변 영역(BCVR)의 β 쇄 요소(BC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, ACVR과 BCVR은 매칭되고,

a) i) 세포로부터의 ACVR의 AC 요소, 예를 들면, α 쇄 가변 영역 서열(ACVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 α 쇄 이중 가닥 cDNA(AC ds cDNA)의 가닥인 α 쇄(AC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 BCVR의 BC 요소, 예를 들면, β 쇄 가변 영역 서열(BCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 β 쇄 이중 가닥 cDNA(BC ds cDNA)의 가닥인 β 쇄(BC) 가닥을 포함하는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

b) AC 가닥과 BC 가닥을 공유결합시킴으로써, 예를 들면, 라이게이션시킴으로써, ACVR의 AC 요소 및 BCVR의 BC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계

를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 BCVR 또는 ACVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않고, ACVR과 BCVR이 매칭되는 것인 방법.

102. 단락 101에 있어서, AC 요소는 ACVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법.

103. 단락 101 또는 102에 있어서, BC 요소는 BCVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법.

104. 단락 101 내지 103 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열은, 발현될 때, ACVRS와 BCVRS가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, 단일 쇄 TCR 분자를 형성하도록 구성되는 것인 방법.

105. 단락 104에 있어서, 항원 결합 분자는 예를 들면, 본원에 기재된 방법 또는 어세이에 의해 확인될 때 시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서 기능을 하는 것인 방법.

106. 단락 101 내지 105 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계는

b) 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA의 증폭을 허용하는 조건 하에서 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 유지하여, 세포로부터의 ACVR의 AC 요소, 예를 들면, ACVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 AC ds cDNA, 및 세포로부터의 BCVR의 BC 요소, 예를 들면, BCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 BC ds cDNA를 생성하는 단계

를 포함하는 것인 방법.

107. 단락 106에 있어서, AC ds cDNA는 제1 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일한 것인 방법.

108. 단락 106 또는 107에 있어서, BC ds cDNA는 제2 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일한 것인 방법.

109. 단락 106 내지 108 중 어느 한 단락에 있어서, 포획 기재는 비드, 예를 들면, 자성 비드를 포함하는 것인 방법.

110. 단락 106 내지 109 중 어느 한 단락에 있어서, 포획 기재는 cDNA에 결합하는 모이어티(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드), 예를 들면, (i) AC 가닥에 결합하는 모이어티; (ii) BC 가닥에 결합하는 모이어티; 또는 (iii) (i) 및 (ii) 둘 다를 포함하는 것인 방법.

111. 단락 106 내지 110 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 mRNA가 로딩된 포획 기재에 배치하는 것인 방법.

112. 단락 106 내지 111 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 (예를 들면, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 mRNA가 로딩된 포획 기재로부터 용액으로 유리된 후) 세포의 ACVR의 AC 요소, 예를 들면, ACVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제1 ds cDNA, 및 세포의 BCVR의 BC 요소, 예를 들면, BCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제2 ds cDNA를 제1 mRNA 및 제2 mRNA로부터 생성하기에 적합한 시약 혼합물을 포함하는 것인 방법.

113. 단락 106 내지 112 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 제1 ds cDNA의 생성을 매개하는 프라이머를 포함하는 것인 방법.

114. 단락 106 내지 113 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 제2 ds cDNA의 생성을 매개하는 프라이머를 포함하는 것인 방법.

115. 단락 106 내지 114 중 어느 한 단락에 있어서, 세포로부터의 ACVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥을 제1 mRNA의 역전사로 제조하는 것인 방법.

116. 단락 106 내지 115 중 어느 한 단락에 있어서, 세포로부터의 BCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥을 제2 mRNA의 역전사로 제조하는 것인 방법.

117. 단락 115 또는 116에 있어서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

118. 단락 115 또는 116에 있어서, 역전사는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

119. 단락 115 또는 116에 있어서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버의 외부, 또는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버의 외부에서 일어나는 것인 방법.

120. 단락 115 또는 116에 있어서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버의 외부, 및 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버의 외부에서 일어나는 것인 방법.

121. 단락 115 또는 116에 있어서, 역전사는 분리된 반응 부위의 외부, 예를 들면, 마이크로챔버의 외부에서 일어나는 것인 방법.

122. 단락 106 내지 121 중 어느 한 단락에 있어서, 증폭은 20 이하의 사이클, 예를 들면, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하 또는 5 이하의 사이클을 포함하는 것인 방법.

123. 단락 106 내지 122 중 어느 한 단락에 있어서, 역전사 및/또는 증폭은 예를 들면, ACVRS 및/또는 BCVRS에 특이적인 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머를 사용하는 것인 방법.

124. 단락 106 내지 123 중 어느 한 단락에 있어서, 증폭은 AC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는 것인 방법.

125. 단락 106 내지 124 중 어느 한 단락에 있어서, 증폭은 BC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는 것인 방법.

126. 단락 125에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 감소시키는, 예를 들면, 억제하는 뉴클레오타이드 변형을 포함하는 것인 방법.

127. 단락 125 또는 126에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 감소시키는, 예를 들면, 억제하는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는 것인 방법.

128. 단락 126 또는 127에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 DNA 중합효소가 DNA를 연장하는 것을 억제하는 것인 방법.

129. 단락 126 내지 128 중 어느 한 단락에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 스페이서를 프라이머, 예를 들면, 프라이머 내의 2개의 인접 뉴클레오타이드들 사이에 삽입하는 것인 방법.

130. 단락 129에 있어서, 스페이서는 플렉시블 스페이서, 탄소 스페이서(예를 들면, -(CH2)n-, 이 때 n=3, 4 또는 5 이상), 2개 이상(예를 들면, 3개, 4개 또는 5개 이상)의 무염기 뉴클레오타이드, 또는 PEG 스페이서인 방법.

131. 단락 126 내지 128 중 어느 한 단락에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 예를 들면, 리보스에 대한 2'-O-메틸, 2'-OH, 2'-NH₂ 또는 우라실 변형인 방법.

132. 단락 126 내지 131 중 어느 한 단락에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 프라이머의 내부 또는 3' 말단에 위치하는 것인 방법.

133. 단락 123 내지 132 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 (i) 제1 구성원; (ii) 제2 구성원; 및 임의적으로 (iii) 예를 들면, (i)과 (ii) 사이에 위치하는, 본원에 기재된 뉴클레오타이드 변형을 포함하는 것인 방법.

134. 단락 133에 있어서, 제1 구성원은 동일한 프라이머 또는 상이한 프라이머 내의 제2 구성원과 어닐링하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 헤어핀 구조(분자내 하이브리드화를 통해) 또는 이중 가닥 구조(분자간 하이브리드화를 통해)를 형성할 수 있는 것인 방법.

135. 단락 133 또는 134에 있어서, 제1 구성원은 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.

136. 단락 133 내지 135 중 어느 한 단락에 있어서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, ACVRS 및/또는 BCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함하고, 임의적으로 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서의) 상동 재조합을 위한 서열을 포함하는 것인 방법.

137. 단락 123 내지 136 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 링커 서열의 적어도 일부를 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 것인 방법.

138. 단락 137에 있어서, 링커 서열의 적어도 일부를 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 프라이머는 인산화된, 예를 들면, 5' 인산화된 것인 방법.

139. 단락 137 또는 138에 있어서, 링커 서열은 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하거나 이것으로 구성되고, 이 때 n은 1, 2, 3, 4 또는 5 이상인 방법.

140. 단락 101 내지 139 중 어느 한 단락에 있어서, AC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함하는 것인 방법.

141. 단락 101 내지 140 중 어느 한 단락에 있어서, AC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함하는 것인 방법.

142. 단락 101 내지 141 중 어느 한 단락에 있어서, BC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함하는 것인 방법.

143. 단락 101 내지 142 중 어느 한 단락에 있어서, BC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함하는 것인 방법.

144. 단락 101 내지 143 중 어느 한 단락에 있어서, AC ds cDNA 및 BC ds cDNA는 점착성 말단을 포함하는 것인, 예를 들면, 둘 다 5' 오버행을 갖는 것인 방법.

145. 단락 101 내지 144 중 어느 한 단락에 있어서, AC 가닥과 BC 가닥을 공유결합시켜, 예를 들면, 라이게이션시켜 단일 가닥 핵산 서열을 생성하고, AC 가닥 및 BC 가닥은 둘 다 센스 가닥 또는 둘 다 안티센스 가닥인 방법.

146. 단락 101 내지 144 중 어느 한 단락에 있어서, AC ds cDNA의 변성된 AC 가닥과 BC ds cDNA의 변성된 BC 가닥을 공유결합시키고, 예를 들면, 라이게이션시키고, AC 가닥 및 BC 가닥은 둘 다 센스 가닥 또는 둘 다 안티센스 가닥인 방법.

147. 단락 101 내지 144 중 어느 한 단락에 있어서, AC 가닥은 AC ds cDNA에 존재하고, BC 가닥은 BC ds cDNA에 존재하고, AC ds cDNA와 BC ds cDNA를 공유결합시켜, 예를 들면, 라이게이션시켜, 예를 들면, 이중 가닥 핵산 서열을 생성하는 것인 방법.

148. 단락 101 내지 147 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위에서 일어나는 것인 방법.

149. 단락 148에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 AC 가닥과 BC 가닥, 또는 AC ds cDNA와 BC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함하는 것인 방법.

150. 단락 148 또는 149에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 AC 가닥과 BC 가닥, 또는 AC ds cDNA와 BC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함하는 것인 방법.

151. 단락 101 내지 147 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위와 상이한 부위에서 일어나는 것인, 예를 들면, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

152. 단락 151에 있어서, AC 가닥 및 BC 가닥을 분리된 생성 부위로부터 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버로 옮기고, 공유결합은 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

153. 단락 151 또는 152에 있어서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 AC 가닥과 BC 가닥, 또는 AC ds cDNA와 BC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함하는 것인 방법.

154. 단락 151 내지 153 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 AC 가닥과 BC 가닥, 또는 AC ds cDNA와 BC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함하는 것인 방법.

155. 단락 150 또는 154에 있어서, 효소는 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제인 방법.

156. 단락 151 내지 155 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은

(a) AC 가닥 및 BC 가닥의 변성을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 95℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 가열하는 단계;

(b) 스플린트 올리고뉴클레오타이드와 AC 가닥 및 BC 가닥의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 50℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 냉각시키는 단계;

(c) AC 가닥과 BC 가닥의 라이게이션(예를 들면, AC 가닥과 BC 가닥 사이의 포스포디에스테르 결합의 형성)을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 45℃ 내지 65℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 유지하는 단계; 및

를 포함하는 것인 방법.

157. 단락 101 내지 156 중 어느 한 단락에 있어서, AC 가닥과 BC 가닥을 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 것인 방법.

158. 단락 157에 있어서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 AC 가닥과 BC 가닥의 연접부를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화되고, 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성하는 것인 방법.

159. 단락 157 또는 158에 있어서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 억제하는 변형(예를 들면, NH₂ 기)을 포함하는 것인 방법.

160. 단락 159에 있어서, 변형은 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 있는 것인 방법.

161. 단락 101 내지 160 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합된, 예를 들면, 라이게이션된 AC 가닥 및 BC 가닥에 상보적인 가닥을 증폭으로 생성하는 것인 방법.

162. 단락 101 내지 161 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 얻기 전에 mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

163. 단락 162에 있어서, mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계는

a) i) 세포 및 ii) 상기 세포로부터의 ACVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 BCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

를 포함하고, 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버는 상기 세포 이외의 세포로부터의 ACVR 또는 BCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 방법.

164. 단락 163에 있어서, 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버는 용해 시약, 예를 들면, 세제를 포함하는 것인 방법.

165. 단락 163 또는 164에 있어서, 세포를 열 또는 효소로 용해시키는 것인 방법.

166. 단락 163 내지 165 중 어느 한 단락에 있어서, 포획 기재는 mRNA에 결합하는 모이어티(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드), 예를 들면, 올리고(dT)를 포함하는 것인 방법.

167. 단락 162 내지 166 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버로부터 mRNA가 로딩된 포획 기재를 유리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

168. 단락 167에 있어서, 유리 단계를 폴리(dA) 또는 폴리(dT) 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 수행하여, 예를 들면, 포획되지 않은 mRNA의 교차결합을 감소시키는 것인 방법.

169. 단락 162 내지 168 중 어느 한 단락에 있어서, mRNA가 로딩된 포획 기재를 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버로부터 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버로 옮기는 것인 방법.

170. 단락 101 내지 169 중 어느 한 단락에 있어서, 생성 마이크로챔버로부터 핵산 서열을 유리시키는 단계를 포함하는 방법.

171. 단락 101 내지 170 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

172. 단락 101 내지 171 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열의 전부 또는 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함하는 방법.

173. 단락 101 내지 72 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열의 전부 또는 일부를 벡터 내에 삽입하는 단계를 포함하는 방법.

174. 단락 173에 있어서, 벡터는 핵산 서열에 포함되지 않은 추가 AC 요소 또는 BC 요소를 공급하는 것인 방법.

175. 단락 173 또는 174에 있어서, 벡터는 AC CDR1, AC CDR2, 또는 이들 둘 다를 공급하는 것인 방법.

176. 단락 173 내지 175 중 어느 한 단락에 있어서, 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.

177. 단락 101 내지 176 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열을 발현시켜, ACVR의 AC 요소, 예를 들면, ACVRS를 코딩하는 분절, 및 BCVR의 BC 요소, 예를 들면, BCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 포함하는 방법.

178. 단락 177에 있어서, BC 요소는 폴리펩타이드에서 AC 요소의 N-말단에 있는 것인 방법.

179. 단락 177에 있어서, AC 요소는 폴리펩타이드에서 BC 요소의 C-말단에 있는 것인 방법.

180. 단락 177 내지 179 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩타이드를 항원과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

181. 단락 177 내지 180 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩타이드가 항원에 결합하는지를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

182. 단락 101 내지 181 중 어느 한 단락에 있어서, 세포는 면역 세포, 예를 들면, B 세포 또는 T 세포, 예를 들면, 인간 B 세포 또는 T 세포인 방법.

183. 단락 101 내지 182 중 어느 한 단락에 있어서, 세포는 포유동물 세포 또는 조류 세포인 방법.

184. TCR α 쇄 가변 영역(ACVR)의 α 쇄 요소(AC 요소) 및 TCR β 쇄 가변 영역(BCVR)의 β 쇄 요소(BC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, ACVR과 BCVR은 매칭되고,

a) i) 세포 및 (ii) 상기 세포로부터의 ACVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 BCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계로서, 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 ACVR 또는 BCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

d) i) 세포로부터의 ACVR의 AC 요소, 예를 들면, α 쇄 가변 영역 서열(ACVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 α 쇄 이중 가닥 cDNA(AC ds cDNA)의 가닥인 α 쇄(AC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 BCVR의 BC 요소, 예를 들면, β 쇄 가변 영역 서열(BCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 β 쇄 이중 가닥 cDNA(BC ds cDNA)의 가닥인 β 쇄(BC) 가닥을 포함하는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 BCVR 또는 ACVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 방법.

185. TCR α 쇄 가변 영역(ACVR)의 α 쇄 요소(AC 요소) 및 TCR β 쇄 가변 영역(BCVR)의 β 쇄 요소(BC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, ACVR과 BCVR은 매칭되고,

a) i) 세포 및 ii) 상기 세포로부터의 ACVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 BCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

c) mRNA가 로딩된 포획 기재를, 로딩된 mRNA를 주형으로서 사용하는 반응 혼합물, 예를 들면, 역전사효소를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시켜, 세포로부터의 ACVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA), 및 세포로부터의 BCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA(cDNA 로딩된 포획 기재)를 생성하는 단계를 포함하는, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 BCVR 또는 ACVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

e) AC ds cDNA의 가닥(AC 가닥)을 BC ds cDNA의 가닥(BC 가닥)에 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 단계를 포함하는, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 AC 가닥 및 BC 가닥 둘 다가 센스 가닥 또는 안티센스 가닥인 단계; 및

를 포함하는 방법.

186. 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 단락 101 내지 185 중 어느 한 단락의 방법에 의해 복수의 구성원들을 제조함으로써 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하고, 각각의 구성원이 α 쇄 가변 영역(ACVR)의 α 쇄 요소(AC 요소) 및 β 쇄 가변 영역(BCVR)의 β 쇄 요소(BC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하고, ACVR과 BCVR은 매칭되고, 상기 복수의 특유한 구성원들의 각각의 특유한 핵산 서열이 상이한 특유한 세포로부터의 AC 요소 및 BC 요소를 포함하는 것인 방법.

187. 단락 186에 있어서, 복수의 특유한 구성원들은 적어도 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개 또는 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함하는 것인 방법.

188. 단락 186 내지 187에 있어서, 복수의 특유한 구성원들은 10⁴개 내지 10⁹개, 10⁴개 내지 10⁸개, 10⁴개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁶개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁸개 내지 10⁹개, 10⁷개 내지 10⁹개, 10⁶개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁸개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁵개 내지 10⁶개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁷개 내지 10⁸개, 또는 10⁸개 내지 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함하는 것인 방법.

189. 단락 186 내지 188 중 어느 한 단락에 있어서, 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 구성원은 (매칭된 AC 요소 및 BC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원인 방법.

190. 단락 186 내지 189 중 어느 한 단락에 있어서, 라이브러리에서 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 AC 요소 및 BC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원인 방법.

191. 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리로서,

a) 상기 라이브러리는 단락 101 내지 185 중 어느 한 단락의 방법에 의해 제조되거나;

192. 단락 191에 있어서, 복수의 특유한 구성원들 각각은, 발현될 때, AC 요소, 예를 들면, ACVRS, 및 BC 요소, 예를 들면, BCVRS가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, 단일 쇄 TCR을 형성하도록 구성되는 것인 라이브러리.

193. 단락 191 또는 192에 있어서, 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

194. 단락 191 내지 193 중 어느 한 단락에 있어서, 복수의 구성원들 각각은 구성원을 디스플레이 독립체의 표면 위에 디스플레이하는 폴리펩타이드를 추가로 코딩하는 것인 라이브러리.

195. 단락 191 내지 194 중 어느 한 단락에 있어서, 파지 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

196. 단락 191 내지 194 중 어느 한 단락에 있어서, 효모 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

197. 단락 191 내지 194 중 어느 한 단락에 있어서, 포유동물 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

198. 결합 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,

a) 단락 191 내지 197 중 어느 한 단락의 라이브러리를 획득하는 단계; 및

를 포함하는 방법.

199. 단락 198에 있어서, 폴리펩타이드를 항원과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

200. 단락 198 또는 199에 있어서, 항원에 결합하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

201. TCR γ 쇄 가변 영역(GCVR)의 γ 쇄 요소(GC 요소) 및 TCR δ 쇄 가변 영역(DCVR)의 δ 쇄 요소(DC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, GCVR과 DCVR이 매칭되고,

a) i) 세포로부터의 GCVR의 GC 요소, 예를 들면, γ 쇄 가변 영역 서열(GCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 γ 쇄 이중 가닥 cDNA(GC ds cDNA)의 가닥인 γ 쇄(GC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 DCVR의 DC 요소, 예를 들면, δ 쇄 가변 영역 서열(DCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 δ 쇄 이중 가닥 cDNA(DC ds cDNA)의 가닥인 δ 쇄(DC) 가닥을 포함하는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

b) GC 가닥과 DC 가닥을 공유결합시킴으로써, 예를 들면, 라이게이션시킴으로써, GCVR의 GC 요소 및 DCVR의 DC 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 단계

를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 DCVR 또는 GCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않고, GCVR과 DCVR이 매칭되는 것인 방법.

202. 단락 201에 있어서, GC 요소는 GCVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법.

203. 단락 201 또는 202에 있어서, DC 요소는 DCVRS 또는 이의 기능성 단편(예를 들면, 이의 항원 결합 단편)을 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법.

204. 단락 201 내지 203 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열은, 발현될 때, GCVRS와 DCVRS가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, 단일 쇄 TCR 분자를 형성하도록 구성되는 것인 방법.

205. 단락 204에 있어서, 항원 결합 분자는 예를 들면, 본원에 기재된 방법 또는 어세이에 의해 확인될 때 시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서 기능을 하는 것인 방법.

206. 단락 201 내지 205 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계는

를 포함하는 것인 방법.

207. 단락 206에 있어서, GC ds cDNA는 제1 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일한 것인 방법.

208. 단락 206 또는 207에 있어서, DC ds cDNA는 제2 ds cDNA와 동일하거나 실질적으로 동일한 것인 방법.

209. 단락 206 내지 208 중 어느 한 단락에 있어서, 포획 기재는 비드, 예를 들면, 자성 비드를 포함하는 것인 방법.

210. 단락 206 내지 209 중 어느 한 단락에 있어서, 포획 기재는 cDNA에 결합하는 모이어티(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드), 예를 들면, (i) GC 가닥에 결합하는 모이어티; (ii) DC 가닥에 결합하는 모이어티; 또는 (iii) (i) 및 (ii) 둘 다를 포함하는 것인 방법.

211. 단락 206 내지 220 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 mRNA 및 제2 mRNA를 mRNA가 로딩된 포획 기재에 배치하는 것인 방법.

212. 단락 206 내지 211 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 (예를 들면, 제1 mRNA 및 제2 mRNA가 mRNA가 로딩된 포획 기재로부터 용액으로 유리된 후) 세포의 GCVR의 GC 요소, 예를 들면, GCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제1 ds cDNA, 및 세포의 DCVR의 DC 요소, 예를 들면, DCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 제2 ds cDNA를 제1 mRNA 및 제2 mRNA로부터 생성하기에 적합한 시약 혼합물을 포함하는 것인 방법.

213. 단락 206 내지 212 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 제1 ds cDNA의 생성을 매개하는 프라이머를 포함하는 것인 방법.

214. 단락 206 내지 213 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 제2 ds cDNA의 생성을 매개하는 프라이머를 포함하는 것인 방법.

215. 단락 206 내지 214 중 어느 한 단락에 있어서, 세포로부터의 GCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥을 제1 mRNA의 역전사로 제조하는 것인 방법.

216. 단락 206 내지 215 중 어느 한 단락에 있어서, 세포로부터의 DCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 cDNA 가닥을 제2 mRNA의 역전사로 제조하는 것인 방법.

217. 단락 215 또는 216에 있어서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

218. 단락 215 또는 216에 있어서, 역전사는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

219. 단락 215 또는 216에 있어서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버의 외부, 또는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버의 외부에서 일어나는 것인 방법.

220. 단락 215 또는 216에 있어서, 역전사는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버의 외부, 및 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버의 외부에서 일어나는 것인 방법.

221. 단락 215 또는 216에 있어서, 역전사는 분리된 반응 부위의 외부, 예를 들면, 마이크로챔버의 외부에서 일어나는 것인 방법.

222. 단락 206 내지 221 중 어느 한 단락에 있어서, 증폭은 20 이하의 사이클, 예를 들면, 25 이하, 24 이하, 23 이하, 22 이하, 21 이하, 20 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하 또는 5 이하의 사이클을 포함하는 것인 방법.

223. 단락 206 내지 222 중 어느 한 단락에 있어서, 역전사 및/또는 증폭은 예를 들면, GCVRS 및/또는 DCVRS에 특이적인 서열을 포함하는 하나 이상의 프라이머를 사용하는 것인 방법.

224. 단락 206 내지 223 중 어느 한 단락에 있어서, 증폭은 GC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는 것인 방법.

225. 단락 206 내지 224 중 어느 한 단락에 있어서, 증폭은 DC ds cDNA의 생성을 매개하는 2개 이상의 프라이머들을 사용하는 단계를 포함하고, 이 때 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 적어도 하나의 프라이머는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는 것인 방법.

226. 단락 225에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 감소시키는, 예를 들면, 억제하는 뉴클레오타이드 변형을 포함하는 것인 방법.

227. 단락 225 또는 226에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 감소시키는, 예를 들면, 억제하는 뉴클레오타이드 변형을 포함하지 않는 것인 방법.

228. 단락 226 또는 227에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 DNA 중합효소가 DNA를 연장하는 것을 억제하는 것인 방법.

229. 단락 226 내지 228 중 어느 한 단락에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 스페이서를 프라이머, 예를 들면, 프라이머 내의 2개의 인접 뉴클레오타이드들 사이에 삽입하는 것인 방법.

230. 단락 229에 있어서, 스페이서는 플렉시블 스페이서, 탄소 스페이서(예를 들면, -(CH2)n-, 이 때 n=3, 4 또는 5 이상), 2개 이상(예를 들면, 3개, 4개 또는 5개 이상)의 무염기 뉴클레오타이드, 또는 PEG 스페이서인 방법.

231. 단락 226 내지 228 중 어느 한 단락에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 예를 들면, 리보스에 대한 2'-O-메틸, 2'-OH, 2'-NH₂ 또는 우라실 변형인 방법.

232. 단락 226 내지 231 중 어느 한 단락에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 프라이머의 내부 또는 3' 말단에 위치하는 것인 방법.

233. 단락 223 내지 232 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 (i) 제1 구성원; (ii) 제2 구성원; 및 임의적으로 (iii) 예를 들면, (i)과 (ii) 사이에 위치하는, 본원에 기재된 뉴클레오타이드 변형을 포함하는 것인 방법.

234. 단락 233에 있어서, 제1 구성원은 동일한 프라이머 또는 상이한 프라이머 내의 제2 구성원과 어닐링하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 헤어핀 구조(분자내 하이브리드화를 통해) 또는 이중 가닥 구조(분자간 하이브리드화를 통해)를 형성할 수 있는 것인 방법.

235. 단락 233 또는 234에 있어서, 제1 구성원은 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인 방법.

236. 단락 233 내지 235 중 어느 한 단락에 있어서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, GCVRS 및/또는 DCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함하고, 임의적으로 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서의) 상동 재조합을 위한 서열을 포함하는 것인 방법.

237. 단락 223 내지 236 중 어느 한 단락에 있어서, 적어도 하나의 프라이머는 링커 서열의 적어도 일부를 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 것인 방법.

238. 단락 237에 있어서, 링커 서열의 적어도 일부를 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 프라이머는 인산화된, 예를 들면, 5' 인산화된 것인 방법.

239. 단락 237 또는 238에 있어서, 링커 서열은 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하거나 이것으로 구성되고, 이 때 n은 1, 2, 3, 4 또는 5 이상인 방법.

240. 단락 201 내지 239 중 어느 한 단락에 있어서, GC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함하는 것인 방법.

241. 단락 201 내지 240 중 어느 한 단락에 있어서, GC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함하는 것인 방법.

242. 단락 201 내지 241 중 어느 한 단락에 있어서, DC ds cDNA는 5' 오버행, 예를 들면, 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화할 수 있는 5' 오버행을 포함하는 것인 방법.

243. 단락 201 내지 242 중 어느 한 단락에 있어서, DC ds cDNA는 블런트 말단, 예를 들면, 5' 포스페이트를 포함하는 블런트 말단을 포함하는 것인 방법.

244. 단락 201 내지 243 중 어느 한 단락에 있어서, GC ds cDNA 및 DC ds cDNA는 점착성 말단을 포함하는 것인, 예를 들면, 둘 다 5' 오버행을 갖는 것인 방법.

245. 단락 201 내지 244 중 어느 한 단락에 있어서, GC 가닥과 DC 가닥을 공유결합시켜, 예를 들면, 라이게이션시켜 단일 가닥 핵산 서열을 생성하고, GC 가닥 및 DC 가닥은 둘 다 센스 가닥 또는 둘 다 안티센스 가닥인 방법.

246. 단락 201 내지 245 중 어느 한 단락에 있어서, GC ds cDNA의 변성된 GC 가닥과 DC ds cDNA의 변성된 DC 가닥을 공유결합시키고, 예를 들면, 라이게이션시키고, GC 가닥 및 DC 가닥은 둘 다 센스 가닥 또는 둘 다 안티센스 가닥인 방법.

247. 단락 201 내지 245 중 어느 한 단락에 있어서, GC 가닥은 GC ds cDNA에 존재하고, DC 가닥은 DC ds cDNA에 존재하고, GC ds cDNA와 DC ds cDNA를 공유결합시켜, 예를 들면, 라이게이션시켜 이중 가닥 핵산 서열을 생성하는 것인 방법.

248. 단락 201 내지 247 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위에서 일어나는 것인 방법.

249. 단락 248에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 GC 가닥과 DC 가닥, 또는 GC ds cDNA와 DC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함하는 것인 방법.

250. 단락 248 또는 249에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버는 GC 가닥과 DC 가닥, 또는 GC ds cDNA와 DC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함하는 것인 방법.

251. 단락 201 내지 247 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은 분리된 생성 반응 부위와 상이한 부위에서 일어나는 것인, 예를 들면, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

252. 단락 251에 있어서, GC 가닥 및 DC 가닥을 분리된 생성 부위로부터 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버로 옮기고, 공유결합은 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버에서 일어나는 것인 방법.

253. 단락 251 또는 252에 있어서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 GC 가닥과 DC 가닥, 또는 GC ds cDNA와 DC ds cDNA를 공유결합시킬 수 있는, 예를 들면, 라이게이션시킬 수 있는 시약을 포함하는 것인 방법.

254. 단락 251 내지 253 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버는 GC 가닥과 DC 가닥, 또는 GC ds cDNA와 DC ds cDNA를 공유커플링시키는 효소를 포함하는 것인 방법.

255. 단락 250 또는 254에 있어서, 효소는 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제인 방법.

256. 단락 251 내지 255 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합, 예를 들면, 라이게이션은

(a) GC 가닥 및 DC 가닥의 변성을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 95℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 가열하는 단계;

(b) 스플린트 올리고뉴클레오타이드와 GC 가닥 및 DC 가닥의 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 60℃ 내지 66℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 냉각시키는 단계;

(c) GC 가닥과 DC 가닥의 라이게이션(예를 들면, GC 가닥과 DC 가닥 사이의 포스포디에스테르 결합의 형성)을 허용하는 조건 하에서(예를 들면, 46℃ 내지 66℃에서) 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 유지하는 단계; 및

(d) 단계 (a), (b) 및 (c)를 2, 6, 20, 26, 20, 26, 30, 36, 40, 46 또는 60 이상의 사이클 동안 순차적으로 반복하는 단계

를 포함하는 것인 방법.

257. 단락 201 내지 256 중 어느 한 단락에 있어서, GC 가닥과 DC 가닥을 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 것인 방법.

258. 단락 257에 있어서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 GC 가닥과 DC 가닥의 연접부를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화되고, 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성하는 것인 방법.

259. 단락 257 또는 258에 있어서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 억제하는 변형(예를 들면, NH₂ 기)을 포함하는 것인 방법.

260. 단락 259에 있어서, 변형은 스플린트 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단에 있는 것인 방법.

261. 단락 201 내지 260 중 어느 한 단락에 있어서, 공유결합된, 예를 들면, 라이게이션된 GC 가닥 및 DC 가닥에 상보적인 가닥을 증폭으로 생성하는 것인 방법.

262. 단락 201 내지 261 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 얻기 전에 mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

263. 단락 262에 있어서, mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계는

a) i) 세포 및 ii) 상기 세포로부터의 GCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 DCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

를 포함하고, 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버는 상기 세포 이외의 세포로부터의 GCVR 또는 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 방법.

264. 단락 263에 있어서, 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버는 용해 시약, 예를 들면, 세제를 포함하는 것인 방법.

265. 단락 263 또는 264에 있어서, 세포를 열 또는 효소로 용해시키는 것인 방법.

266. 단락 263 내지 265 중 어느 한 단락에 있어서, 포획 기재는 mRNA에 결합하는 모이어티(예를 들면, 올리고뉴클레오타이드), 예를 들면, 올리고(dT)를 포함하는 것인 방법.

267. 단락 262 내지 266 중 어느 한 단락에 있어서, 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버로부터 mRNA가 로딩된 포획 기재를 유리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

268. 단락 267에 있어서, 유리 단계를 폴리(dA) 또는 폴리(dT) 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 수행하여, 예를 들면, 포획되지 않은 mRNA의 교차결합을 감소시키는 것인 방법.

269. 단락 262 내지 268 중 어느 한 단락에 있어서, mRNA가 로딩된 포획 기재를 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버로부터 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버로 옮기는 것인 방법.

270. 단락 201 내지 269 중 어느 한 단락에 있어서, 생성 마이크로챔버로부터 핵산 서열을 유리시키는 단계를 포함하는 방법.

271. 단락 201 내지 270 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

272. 단락 201 내지 271 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열의 전부 또는 일부를 시퀀싱하는 단계를 포함하는 방법.

273. 단락 201 내지 272 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열의 전부 또는 일부를 벡터 내에 삽입하는 단계를 포함하는 방법.

274. 단락 273에 있어서, 벡터는 핵산 서열에 포함되지 않은 추가 GC 요소 또는 DC 요소를 공급하는 것인 방법.

275. 단락 273 또는 274에 있어서, 벡터는 GC CDR1, GC CDR2, 또는 이들 둘 다를 공급하는 것인 방법.

276. 단락 273 내지 275 중 어느 한 단락에 있어서, 벡터를 발현시키는 단계를 포함하는 방법.

277. 단락 201 내지 276 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산 서열을 발현시켜, GCVR의 GC 요소, 예를 들면, GCVRS를 코딩하는 분절, 및 DCVR의 DC 요소, 예를 들면, DCVRS를 코딩하는 분절을 포함하는 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 포함하는 방법.

278. 단락 277에 있어서, DC 요소는 폴리펩타이드에서 GC 요소의 N-말단에 있는 것인 방법.

279. 단락 277에 있어서, GC 요소는 폴리펩타이드에서 DC 요소의 C-말단에 있는 것인 방법.

280. 단락 277 내지 279 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩타이드를 항원과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

281. 단락 277 내지 280 중 어느 한 단락에 있어서, 폴리펩타이드가 항원에 결합하는지를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

282. 단락 201 내지 281 중 어느 한 단락에 있어서, 세포는 면역 세포, 예를 들면, B 세포 또는 T 세포, 예를 들면, 인간 B 세포 또는 T 세포인 방법.

283. 단락 201 내지 282 중 어느 한 단락에 있어서, 세포는 포유동물 세포 또는 조류 세포인 방법.

284. TCR γ 쇄 가변 영역(GCVR)의 γ 쇄 요소(GC 요소) 및 TCR δ 쇄 가변 영역(DCVR)의 δ 쇄 요소(DC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, GCVR과 DCVR이 매칭되고,

a) i) 세포 및 (ii) 상기 세포로부터의 GCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 DCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 유지하는 단계로서, 상기 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 GCVR 또는 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

d) i) 세포로부터의 GCVR의 GC 요소, 예를 들면, γ 쇄 가변 영역 서열(GCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 γ 쇄 이중 가닥 cDNA(GC ds cDNA)의 가닥인 γ 쇄(GC) 가닥, 및 ii) 세포로부터의 DCVR의 DC 요소, 예를 들면, δ 쇄 가변 영역 서열(DCVRS)을 코딩하는 분절을 포함하는 δ 쇄 이중 가닥 cDNA(DC ds cDNA)의 가닥인 δ 쇄(DC) 가닥을 포함하는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계; 및

를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 DCVR 또는 GCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 방법.

285. TCR γ 쇄 가변 영역(GCVR)의 γ 쇄 요소(GC 요소) 및 TCR δ 쇄 가변 영역(DCVR)의 δ 쇄 요소(DC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제조하는 방법으로서, GCVR과 DCVR이 매칭되고,

a) i) 세포 및 ii) 상기 세포로부터의 GCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 DCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재를 포함하는 분리된 세포 반응 부위, 예를 들면, 세포 분리 마이크로챔버를 획득하는 단계;

c) mRNA가 로딩된 포획 기재를, 로딩된 mRNA를 주형으로서 사용하는 반응 혼합물, 예를 들면, 역전사효소를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시켜, 세포로부터의 GCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA), 및 세포로부터의 DCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA(cDNA 로딩된 포획 기재)를 생성하는 단계를 포함하는, 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버가 상기 세포 이외의 세포로부터의 DCVR 또는 GCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 단계;

e) GC ds cDNA의 가닥(GC 가닥)을 DC ds cDNA의 가닥(DC 가닥)에 공유결합시키는, 예를 들면, 라이게이션시키는 단계를 포함하는, 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버를 획득하는 단계로서, 상기 GC 가닥 및 DC 가닥 둘 다가 센스 가닥 또는 안티센스 가닥인 단계; 및

를 포함하는 방법.

286. 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 방법으로서, 단락 201 내지 285 중 어느 한 단락의 방법에 의해 복수의 구성원들을 제조함으로써, 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하고, 각각의 구성원이 γ 쇄 가변 영역(GCVR)의 γ 쇄 요소(GC 요소) 및 δ 쇄 가변 영역(DCVR)의 δ 쇄 요소(DC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하고, GCVR과 DCVR이 매칭되고, 상기 복수의 특유한 구성원들의 각각의 특유한 핵산 서열이 상이한 특유한 세포로부터의 GC 요소 및 DC 요소를 포함하는 것인 방법.

287. 단락 86에 있어서, 복수의 특유한 구성원들은 적어도 20⁴개, 20⁵개, 20⁶개, 20⁷개, 20⁸개 또는 20⁹개의 특유한 구성원들을 포함하는 것인 방법.

288. 단락 286 또는 287에 있어서, 복수의 특유한 구성원들은 20⁴개 내지 20⁹개, 20⁴개 내지 20⁸개, 20⁴개 내지 20⁷개, 20⁴개 내지 20⁶개, 20⁴개 내지 20⁵개, 20⁸개 내지 20⁹개, 20⁷개 내지 20⁹개, 20⁶개 내지 20⁹개, 20⁵개 내지 20⁹개, 20⁵개 내지 20⁸개, 20⁶개 내지 20⁷개, 20⁴개 내지 20⁵개, 20⁵개 내지 20⁶개, 20⁶개 내지 20⁷개, 20⁷개 내지 20⁸개, 또는 20⁸개 내지 20⁹개의 특유한 구성원들을 포함하는 것인 방법.

289. 단락 286 내지 288 중 어느 한 단락에 있어서, 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 200%의 구성원은 (매칭된 GC 요소 및 DC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원인 방법.

290. 단락 286 내지 289 중 어느 한 단락에 있어서, 라이브러리에서 20%, 25%, 20%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 GC 요소 및 DC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원인 방법.

291. 복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리로서,

a) 상기 라이브러리는 단락 201 내지 285 중 어느 한 단락의 방법에 의해 제조되거나;

b) 복수의 특유한 구성원들은 적어도 20⁴개, 20⁵개, 20⁶개, 20⁷개, 20⁸개 또는 20⁹개의 특유한 핵산 서열들을 포함하거나;

c) 복수의 특유한 구성원들은 20⁴개 내지 20⁹개, 20⁴개 내지 20⁸개, 20⁴개 내지 20⁷개, 20⁴개 내지 20⁶개, 20⁴개 내지 20⁵개, 20⁸개 내지 20⁹개, 20⁷개 내지 20⁹개, 20⁶개 내지 20⁹개, 20⁵개 내지 20⁹개, 20⁵개 내지 20⁸개, 20⁶개 내지 20⁷개, 20⁴개 내지 20⁵개, 20⁵개 내지 20⁶개, 20⁶개 내지 20⁷개, 20⁷개 내지 20⁸개, 또는 20⁸개 내지 20⁹개의 특유한 구성원들을 포함하거나;

d) 상기 라이브러리에서 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 200%의 구성원은 (매칭된 GC 요소 및 DC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이거나;

e) 상기 라이브러리에서 20%, 25%, 20%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 구성원은 (매칭된 GC 요소 및 DC 요소 서열을 코딩하는) 특유한 구성원이다.

292. 단락 291에 있어서, 복수의 특유한 구성원들 각각은, 발현될 때, GC 요소, 예를 들면, GCVRS, 및 DC 요소, 예를 들면, DCVRS가 기능성 항원 결합 분자, 예를 들면, 단일 쇄 TCR을 형성하도록 구성되는 것인 라이브러리.

293. 단락 291 또는 292에 있어서, 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

294. 단락 291 내지 293 중 어느 한 단락에 있어서, 복수의 구성원들 각각은 구성원을 디스플레이 독립체의 표면 위에 디스플레이하는 폴리펩타이드를 추가로 코딩하는 것인 라이브러리.

295. 단락 291 내지 294 중 어느 한 단락에 있어서, 파지 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

296. 단락 291 내지 294 중 어느 한 단락에 있어서, 효모 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

297. 단락 291 내지 294 중 어느 한 단락에 있어서, 포유동물 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.

298. 결합 폴리펩타이드를 제조하는 방법으로서,

a) 단락 291 내지 297 중 어느 한 단락의 라이브러리를 획득하는 단계; 및

를 포함하는 방법.

299. 단락 298에 있어서, 폴리펩타이드를 항원과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.

300. 단락 298 또는 299에 있어서, 항원에 결합하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

301. 단락 1 내지 85, 101 내지 185, 또는 201 내지 285 중 어느 한 단락에 기재된 분리된 생성 반응 부위인 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버.

302. 단락 401에 있어서, 상기 세포 이외의 세포로부터의 (i) HCVR 또는 LCVR, (ii) ACVR 또는 BCVR, 또는 (iii) GCVR 또는 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버.

303. 단락 301 또는 302에 있어서,

(i) (a) HC 및 LC, (b) α 쇄 및 β 쇄, 또는 (c) γ 쇄 및 δ 쇄의 V 유전자 서열에 특이적인 하나 이상의 프라이머;

(ii) (a) HC 및 LC, (b) α 쇄 및 β 쇄, 또는 (c) γ 쇄 및 δ 쇄 cDNA로 도입된 오버행에 특이적인 하나 이상의 프라이머; 및

(iii) 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 변형(예를 들면, 스페이서)를 포함하는 하나 이상의 프라이머로서, 제1 구성원이 동일한 프라이머 또는 상이한 프라이머 내의 제2 구성원과 어닐링하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 헤어핀 구조(분자내 하이브리드화를 통해) 또는 이중 가닥 구조(분자간 하이브리드화를 통해)를 형성할 수 있는 것인 하나 이상의 프라이머

중 하나, 둘 또는 전부를 포함하는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버.

304. 단락 301 내지 103 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산을 공유결합시킬 수 있는 시약, 예를 들면, 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제를 포함하지 않는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버.

305. 단락 301 내지 303 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산을 공유결합시킬 수 있는 시약, 예를 들면, 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제를 포함하는 분리된 생성 반응 부위, 예를 들면, 생성 마이크로챔버.

306. 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 위치하는 뉴클레오타이드 변형(예를 들면, 스페이서)을 포함하는 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드로서, 제1 구성원이 동일한 올리고뉴클레오타이드 또는 상이한 올리고뉴클레오타이드 내의 제2 구성원과 어닐링하여, 예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 헤어핀 구조(분자내 하이브리드화를 통해) 또는 이중 가닥 구조(분자간 하이브리드화를 통해)를 형성할 수 있는 것인 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드.

307. 단락 306에 있어서, 제1 구성원과 제2 구성원은 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 것인 올리고뉴클오타이드.

308. 단락 306 또는 307에 있어서, 제1 구성원은 길이가 5개 내지 40개 뉴클레오타이드, 예를 들면, 5개 내지 10개, 5개 내지 20개, 5개 내지 30개, 30개 내지 40개, 20개 내지 40개, 10개 내지 30개, 10개 내지 30개, 또는 15개 내지 25개 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드.

309. 단락 306 내지 308 중 어느 한 단락에 있어서, 제2 구성원은 길이가 5개 내지 40개 뉴클레오타이드, 예를 들면, 5개 내지 10개, 5개 내지 20개, 5개 내지 30개, 30개 내지 40개, 20개 내지 40개, 10개 내지 30개, 10개 내지 30개, 또는 15개 내지 25개 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드.

310. 단락 306 내지 309 중 어느 한 단락에 있어서, 스페이서는 플렉시블 스페이서 또는 PEG 스페이서인 올리고뉴클레오타이드.

311. 단락 306 내지 310 중 어느 한 단락에 있어서, 제1 구성원은 포획 기재에 부착된 올리고뉴클레오타이드의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오타이드.

312. 단락 306 내지 311 중 어느 한 단락에 있어서, 제2 구성원은 (i) 제1 구성원의 적어도 일부에 상보적인 서열; (ii) (예를 들면, PCR 증폭 또는 차세대 시퀀싱을 위한) 유니버셜 프라이밍 서열; 및 (iii) 표적 서열, 예를 들면, GCVRS 및/또는 DCVRS에 상보적인 서열 중 하나, 둘 또는 전부를 (예를 들면, 5'에서 3'으로) 포함하고, 임의적으로 제2 구성원은 (예를 들면, 효모 또는 포유동물 세포에서의) 상동 재조합을 위한 서열을 포함하는 것인 올리고뉴클레오타이드.

313. 단락 51 내지 83, 85, 151 내지 183, 185, 251 내지 283, 또는 285 중 어느 한 단락에 기재된 분리된 결합 반응 부위인 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버.

314. 단락 313에 있어서, 상기 세포 이외의 세포로부터의 (i) HCVR 또는 LCVR, (ii) ACVR 또는 BCVR, 또는 (iii) GCVR 또는 DCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버.

315. 단락 313 또는 314에 있어서, (i) HC 가닥과 LC 가닥, (ii) AC 가닥과 BC 가닥, 또는 (iii) GC 가닥과 DC 가닥의 연접부를 포함하는 서열 또는 이의 상보적 서열에 하이브리드화하여, 라이게이션 부위에서 이중체 영역을 형성할 수 있는 스플린트 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버.

316. 단락 313 내지 315 중 어느 한 단락에 있어서, 핵산을 공유결합시킬 수 있는 시약, 예를 들면, 리가제, 예를 들면, 열안정성 리가제를 포함하는 분리된 결합 반응 부위, 예를 들면, 결합 마이크로챔버.

317. 단락 1 내지 300 중 어느 한 단락에 있어서, 예를 들면, 연결 단계에서 중첩 연장에 의한 스플라이싱 또는 오버행 연장에 의한 스플라이싱(SOE) PCR(Higuchi et al., Nucleic Acids Res. 1988; 16(15):7351-67)로서 공지되어 있는 중첩 연장 중합효소 연쇄 반응(OE-PCR) 단계를 포함하지 않는 방법.

실시예

실시예 1: 소적 내에서의 코헤시브-말단 PCR-라이게이션

B 세포를 소적 내로 캡슐화하였다. B 세포를, 10 pl 내지 100 nl, 전형적으로 약 100 내지 1000 pl의 소적 부피를 갖는 소적 내로 캡슐화하였다. B 세포의 공급원은 예를 들면, 마우스, 인간, 래트, 토끼 또는 닭을 포함할 수 있다. 담체(오일) 상은 약 1%의 플루오로계면활성제(RAN Biotechnologies)를 갖는 3M HFE-7500으로 구성되었다. 소적은 주사기 또는 압력 펌프에 의해 제어되는 유체 상의 유동을 갖는 마이크로플루이딕 칩(예를 들면, 돌로마이트로부터의 2R 100 ㎛)에 의해 형성되었다. 소적의 수성 상은 완충제(예를 들면, Tris, pH 7.5), 세포 용해를 보조하기 위한 세제, 및 중쇄 및 경쇄 mRNA에 어닐링하는 올리고뉴클레오타이드(프라이머)를 함유하는 자성 비드로 구성되었다. 소적의 점유는 소적당 1개 이하의 세포 및 소적당 적어도 하나의 비드이어야 한다.

소적을 인큐베이션하여 세포 용해를 용이하게 하였다. 에멀전을 특정 세제(예를 들면, Tween 20)의 존재 하에서 가열하여 용해 효율을 개선하였다. 예를 들면, 에멀전을 대략 5분 내지 60분 동안 40℃, 50℃, 60℃, 70℃ 또는 80℃의 온도에서 가열할 수 있다. 세포를 용해시킨 후, mRNA를 유리시키고 비드의 올리고뉴클레오타이드에 어닐링시킴으로써 비드에 포획하였다.

에멀전을 깨뜨리고 비드를 회수하였다. 소적 불안정화 시약, 예컨대, PFO(퍼플루오로옥탄올)을 사용하여 에멀전(또는 유착 상이한 용액 상)을 깨뜨렸다. 비드를 함유하는 수성 상을 회수하였다. 자석을 이용하여 비드를 단리하였다. 비드를 세척하고 완충제(예를 들면, Tris, pH 7.5)에 재현탁하였다.

역전사(RT)를 수행하여 (비-에멀전 반응에서) cDNA-비드를 생성하였다. 상기 비드를 완충제-효소 혼합물에 재현탁하여 RT(예를 들면, Superscript II RT)를 용이하게 하였다. 반응물을 15분 동안 40℃에서 인큐베이션하여 RT를 용이하게 하였다. 비드를 완충제(예를 들면, 트리스, pH 7.5)로 한번 세척하였다.

PCR-라이게이션 반응을 위해 회수된 비드를 캡슐화할 수 있다. 약 5 pl 내지 500 pl, 가장 통상적으로 약 10 내지 50 pl의 부피를 갖는 소적을 사용할 수 있다. 담체(오일) 상은 약 2%의 플루오로계면활성제(RAN Biotechnologies)를 함유하는 3M HFE-7500으로 구성될 수 있다. cDNA를 갖는 비드; (예를 들면, DNA 중합효소, 예를 들면, Phusion^® 고충실도 DNA 중합효소(NEB), Q5^® 고충실도 DNA 중합효소(NEB), Pfu DNA 중합효소, KAPA DNA 중합효소, Vent^® DNA 중합효소, 또는 Taq DNA 중합효소를 포함하는) PCR 시약; VH 및 VL 서열의 증폭을 허용하는 올리고뉴클레오타이드; 열안정성 리가제(예를 들면, Taq DNA 리가제, Pfu DNA 리가제, Ampligase^® 열안정성 DNA 리가제, Tsc DNA 리가제, Rma DNA 리가제, Tfi DNA 리가제, 또는 Tth DNA 리가제); 및 (DNA 중합효소 효소 활성 및 리가제 효소 활성 둘 다를 뒷받침하기에 적합한) 최적화된 완충제 조건을 이용하여 소적을 캡슐화할 수 있다.

튜브에서 시험된 바와 같이, scFv 카세트를 VL-링커-VH로서 구축하였다. 기능 또는 성능에 유의미한 영향을 미치지 않으면서 순서를 바꿀 수 있다(VH-링커-VL). VL 서열의 역방향 프라이머는 링커 서열을 코딩하는 오버행 서열 및 적어도 1개의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들면, 2'-O-메틸 변형을 갖는 3개의 연속 뉴클레오타이드)를 함유할 수 있다. VL 역방향 프라이머는 (리가제의 기질이기 위해 요구되는) 5'-포스페이트도 함유할 수 있다. VH 서열의 정방향 프라이머는 링커 서열을 코딩하는 오버행 서열 및 적어도 1개의 변형된 뉴클레오타이드(예를 들면, 2'-O-메틸 변형을 갖는 3개의 연속 뉴클레오타이드)를 함유할 수 있다. VH 정방향 프라이머는 (리가제의 기질이기 위해 요구되는) 5'-포스페이트도 함유할 수 있다. 소적의 점유는 소적당 1개 이하의 비드이어야 한다.

에멀전을 사용하여 써모사이클링을 수행할 수 있다. 생성된 에멀전을 PCR 튜브로 옮길 수 있다. 하기 조건을 이용하여 써모사이클링을 수행할 수 있다: 30초 내지 2분 동안 95℃ 내지 98℃에서의 초기 변성; 10초 내지 30초 동안 95℃ 내지 98℃에서의 변성, 10초 내지 30초 동안 50℃ 내지 60℃에서의 프라이머 어닐링, 30초 동안 72℃에서의 중합효소 연장, 및 3분 동안 45℃ 내지 55℃에서의 코헤시브 생성물 어닐링 및 라이게이션의 10 내지 30 사이클. 반응물을 4℃에서 유지할 수 있다.

에멀전을 깨뜨렸고 연결된 생성물(및 연결되지 않은 생성물)을 함유하는 부분을 회수하였다. 소적 불안정화 시약, 예컨대, PFO(퍼플루오로옥탄올)를 사용하여 에멀전을 깨뜨릴 수 있다. 수성 상을 회수할 수 있고 비드를 버릴 수 있다.

튜브에서 시험된 바와 같이, (천연적으로 연결된 VL-링커-VH를 대표하는) 연결된 생성물을 연결되지 않은 VH 및 VL 생성물로부터 정제하였다. 라이게이션된 생성물을 크기 분리로 라이게이션되지 않은 생성물로부터 분리하였다. 예를 들면, 변성 PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 또는 변성 HPLC-SEC를 이용할 수 있다. 연결된 생성물(약 800 내지 900 bp)을 연결되지 않은 생성물(약 350 내지 500 bp)로부터 단리하였다. 변성 PAGE 정제를 위해, 라이게이션된 밴드를 겔로부터 잘라내었고, 전기용출을 수행하여 겔 슬라이스로부터 DNA를 추출하였다(Bio-Rad Electro-Elutor).

정제된 연결된 생성물을 PCR로 증폭할 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 DNA를 지나면서 적절하게 판독할 수 있는 중합효소/조건, 예를 들면, Taq 중합효소를 사용할 수 있다.

표준 방법(예를 들면, 발현 벡터를 사용한 전기천공)을 이용하여 최종 PCR 생성물을 효모에 도입하여, 생물학적 공급원으로부터 유래한 천연적으로 페어링된 라이브러리를 생성할 수 있다.

실시예 2: 리가제 사이클링 방법

에멀전을 깨뜨렸고 비드를 회수하였다. 소적 불안정화 시약, 예컨대, PFO(퍼플루오로옥탄올)을 사용하여 에멀전(또는 유착 상이한 용액 상)을 깨뜨렸다. 비드를 함유하는 수성 상을 회수하였다. 자석을 이용하여 비드를 단리하였다. 비드를 세척하고 완충제(예를 들면, Tris, pH 7.5)에 재현탁하였다.

역전사(RT)를 수행하여 (비-에멀전 반응에서) cDNA-비드를 생성할 수 있다. 상기 비드를 완충제-효소 혼합물에 재현탁하여 RT(예를 들면, Superscript II RT)를 용이하게 할 수 있다. 반응물을 15분 동안 40℃에서 인큐베이션하여 RT를 용이하게 할 수 있다. 비드를 완충제(예를 들면, Tris, pH 7.5)로 한번 세척할 수 있다.

PCR 반응을 위해 회수된 비드를 캡슐화하였다. 약 5 pl 내지 500 pl, 가장 통상적으로 약 10 내지 50 pl의 부피를 갖는 소적을 사용할 수 있다. 담체(오일) 상은 약 2%의 플루오로계면활성제(RAN Biotechnologies)를 함유하는 3M HFE-7500으로 구성될 수 있다. cDNA를 함유하는 비드(일부 비드는 '빈' 상태일 수 있고, 이것은 문제가 되지 않음); (예를 들면, DNA 중합효소, 예를 들면, Phusion^® 고충실도 DNA 중합효소(NEB), Q5^® 고충실도 DNA 중합효소(NEB), Pfu DNA 중합효소, KAPA DNA 중합효소, Vent^® DNA 중합효소, 또는 Taq DNA 중합효소를 포함하는) PCR 시약; VH 및 VL 서열의 증폭을 허용하는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 소적을 캡슐화할 수 있다.

scFv 카세트를 VL-링커-VH로서 구축할 수 있다. 기능 또는 성능에 유의미한 영향을 미치지 않으면서 순서를 바꿀 수 있다(VH-링커-VL). VL 역방향 프라이머 및 VH 정방향 프라이머는 링커를 코딩하는 오버행 서열을 함유할 수 있다. VH 역방향 프라이머는 5'-포스페이트를 가질 수 있다. 소적의 점유는 소적당 1개 이하의 비드이어야 한다.

에멀전을 사용하여 써모사이클링을 수행할 수 있다. 생성된 에멀전을 PCR 튜브로 옮길 수 있다. 표준 PCR 조건을 이용하여 써모사이클링을 수행할 수 있다: 30초 내지 2분 동안 95℃ 내지 98℃에서의 초기 변성; 10초 내지 30초 동안 95℃ 내지 98℃에서의 변성, 10초 내지 30초 동안 50℃ 내지 60℃에서의 프라이머 어닐링, 및 30초 동안 72℃에서의 중합효소 연장의 10 내지 30 사이클. 반응물을 4℃에서 유지할 수 있다.

에멀전을 깨뜨릴 수 있고 비드를 회수할 수 있다. 소적 불안정화 시약, 예컨대, PFO(퍼플루오로옥탄올)을 사용하여 에멀전(또는 유착 상이한 용액 상)을 깨뜨릴 수 있다. 비드를 함유하는 수성 상을 회수할 수 있다. 자석을 이용하여 비드를 단리할 수 있다. 비드를 세척하여 비드에 포획되지 않은 PCR 생성물을 제거할 수 있다. 비드를 완충제(예를 들면, Tris, pH 7.5)에 재현탁할 수 있다.

리가제 사이클링 반응을 위해 회수된 비드를 캡슐화할 수 있다. 약 5 pl 내지 500 pl, 가장 통상적으로 약 10 내지 50 pl의 부피를 갖는 소적을 사용할 수 있다. 담체(오일) 상은 약 2%의 플루오로계면활성제(RAN Biotechnologies)를 함유하는 3M HFE-7500으로 구성될 수 있다. '상부' VL 가닥의 3' 말단 및 '상부' VH 가닥의 5' 말단에 상보적이고 어닐링하는 스플린트 올리고뉴클레오타이드; 열안정성 리가제(예를 들면, Taq DNA 리가제, Pfu DNA 리가제, Ampligase^® 열안정성 DNA 리가제, Tsc DNA 리가제, Rma DNA 리가제, Tfi DNA 리가제, 또는 Tth DNA 리가제); 리가제 효소 활성을 뒷받침하기 위해 요구되는 반응 성분(예를 들면, NAD)을 사용하여 소적을 캡슐화할 수 있다. 점유는 소적당 1개 이하의 비드이어야 한다.

에멀전을 사용하여 써모사이클링을 수행할 수 있다. 생성된 에멀전을 PCR 튜브로 옮길 수 있다. 표준 조건을 이용하여 써모사이클링을 수행할 수 있다: 30초 동안 90℃ 내지 95℃에서의 변성, 1분 내지 3분 동안 50℃ 내지 60℃에서의 어닐링 및 라이게이션의 3 내지 15 사이클. 반응물을 4℃에서 유지할 수 있다.

에멀전을 깨뜨릴 수 있고, 연결된 생성물을 함유하는 수성 부분을 회수할 수 있다. 소적 불안정화 시약, 예컨대, PFO(퍼플루오로옥탄올)를 사용하여 에멀전(또는 유착 상이한 용액 상)을 깨뜨릴 수 있다. 수성 상을 회수할 수 있고 비드를 버릴 수 있다.

정제된 연결된 생성물을 PCR로 증폭할 수 있다. 연결된 VL-링커-VH 라이게이션된 단편의 외부 말단들을 어닐링하는 올리고뉴클레오타이드와 함께 표준 조건을 사용할 수 있다.

최종 PCR 생성물을 효모에 도입하여, 생물학적 공급원으로부터 유래한 천연적으로 페어링된 라이브러리를 생성할 수 있다.

실시예 3: 리가제 사이클링 반응

이 실시예에서, 열안정성 리가제 및 스플린트 올리고를 사용하여 VH PCR 생성물과 VL PCR 생성물을 공유결합시켰다.

RNeasy 키트(Qiagen)를 사용하여 하이브리도마 클론(ATCC, HB-112, "4G2")으로부터 RNA를 단리하였다. 제조자의 권장된 조건에 따라 SuperScript IV 역전사효소(Thermo Fisher) 및 분리된 RNA를 사용하여 cDNA를 생성하였다. 사용된 프라이머는 중쇄 및 경쇄의 불변 영역에 대해 유도되었다: 마우스 IgG_CH1_역방향(5'-CHGATGGGGSTGTYGTTKTRGC(서열번호 1)) 및 마우스 카파_역방향(5'-GTGCAGCATCAGCCC(서열번호 2)). 본원에서 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드는 IUPAC 뉴클레오타이드 코드에 의해 정의된다: 예를 들면, R=A 또는 G; Y=C 또는 T; S=G 또는 C; K=G 또는 T; H=A 또는 C 또는 T.

성분들을 혼합하고 5분 동안 65℃까지 가열한 후 적어도 1분 동안 얼음 위에서 인큐베이션하였다. 그 다음, 하기 성분들을 첨가하였다:

성분들을 혼합한 후 10분 동안 55℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 반응물을 10분 동안 80℃에서 인큐베이션함으로써 불활성화시켰다. cDNA 생성물을 PCR용 주형으로서 사용하여, VH 생성물 및 VL 생성물을 따로 생성하였다. 사용된 프라이머는 하기 프라이머들을 포함하였다:

PCR 반응물 각각은 하기 성분들을 포함하였다:

그 다음, 써모사이클링을 다음과 같이 수행하였다:

AMPure 비드를 사용하여 PCR 생성물을 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 Nanodrop으로 정량하였다. VH 생성물, VL 생성물 및 스플린트 올리고의 1:1:1 몰 비를 달성하기 위해 리가제 사이클링 반응물을 25 ㎕ 반응물로 설정하였다. 사용된 스플린트 올리고는 하기 서열을 가졌다: 5'-ACCTGTGCCTTCGGTAGTTCCACCAGCAGAGCTCTCACCTG/3AmMO/(서열번호 6).

각각의 리가제 사이클링 반응물은 하기 성분들을 포함하였다:

리가제 사이클링 반응물을 변성 PAGE(폴리아크릴아미드 겔 전기영동)로 분석하였다. Taq 리가제 이외에, 추가 열안정성 리가제(Ampligase(Amp), Lucigen)를 평가하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, Taq 리가제 및 Ampligase 열안정성 리가제 둘 다를 사용하여 VH 생성물과 VL 생성물의 효율적인 연결을 관찰하였다.

실시예 4: 연결된 생성물의 벌크 재증폭 동안 천연 페어링의 유지

에멀전 OE-PCR 워크플로우는 중첩 연장에 의한 스플라이싱을 용이하게 하기 위해 반드시 서열을 공유하는 VH 생성물 및 VL 생성물을 생성한다. 이러한 워크플로우에서, 소적 내에서 함께 스플라이싱되지 않은 임의의 유지된 VH/VL 생성물은 생성물의 벌크 (비-에멀전) PCR 증폭 동안 스플라이싱될 수 있다. 이러한 스플라이싱은 모든 세포 생성물들(예를 들면, 많은 클론들/특유한 서열들)이 혼합될 때 벌크 상 동안 일어나기 때문에, 무작위(비-천연) 페어링이 일어날 수 있다(문헌(Eur J Immunol. 2013; 43(9):2507-15) 참조). 상기 워크플로우는 이 발생을 감소시킬 뿐만 아니라 완전히 방지하는 전략으로부터 이익을 얻을 것이다. VH 생성물과 VL 생성물이 임의의 공통의 서열을 공유하지 않음으로써, 상기 워크플로우가 벌크 재증폭 단계 동안 OE-PCR에 의한 우발적인 스플라이싱에 민감하지 않은 방법이 본원에 기재되어 있다.

이를 입증하기 위해, 크기에 의해 서로 상이한 2개의 하이브리도마 클론들로부터 연결된 VH-VL 생성물을 생성하였다. 따라서, 천연 페어링 대 비-천연 페어링을 생성물의 크기로 평가할 수 있다. 하이브리도마 4G2로부터의 VH 생성물 및 VL 생성물을 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성하였다. 동일한 RT 프라이머 및 하기 PCR 프라이머를 사용하여 하이브리도마 9E10(ATCC, CRL-1729) "미니" VH 생성물 및 VL 생성물을 유사하게 생성하였다:

생성된 4G2 VH 생성물 및 VL 생성물은 각각 400 bp 및 378 bp의 크기를 가졌다. 생성된 미니 9E10 VH 생성물 및 VL 생성물은 각각 203 bp 및 168 bp의 크기를 가졌다. AMPure 비드를 사용하여 PCR 생성물을 정제하였다.

그 다음, 20 사이클의 써모사이클링을 이용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 생성물에 대한 리가제 사이클링 반응을 수행하였다. 4G2 VH-VL 생성물 및 9E10 VH-VL 생성물을 별개의 튜브에서 라이게이션시켜, 소적(개별 구획) 내에서의 천연적으로 연결된 생성물의 생성을 시뮬레이션하였다. 생성물을 변성 PAGE로 분석하였다. 4G2 VH-VL의 천연적으로 연결된 생성물 및 9E10 VH-VL의 천연적으로 연결된 생성물은 각각 778 bp 및 371 bp의 크기에 상응하였다. 20 사이클의 리가제 사이클링을 이용하여, 라이게이션된 생성물뿐만 아니라 라이게이션되지 않은 VH 및 VL DNA도 함유하는 생성물을 생성하였다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 6G2 및 9E10 둘 다에 대한 천연적으로 연결된 VH-VL 생성물을 생성하였다.

라이게이션 생성물을 AMPure 비드로 정제한 후, 조합하였고 연결된 생성물의 PCR 재증폭을 위한 주형으로서 사용하였다. 이 단계는 소적 내에서의 VH-VL 연결의 수행 후 생성물의 회수에 이은, 연결된 VH-VL의 PCR 재증폭을 시뮬레이션하였다. 이것은 PCR의 주형으로서 라이게이션되지 않은 VH 및 VL DNA를 가짐으로써, PCR에 의한 벌크 재증폭 동안 DNA가 함께 연결될 기회를 제공하였다. 상기 DNA는 개별 클론에 의해 구획화되지 않았기 때문에, 벌크 상에서 일어난 임의의 연결은 비-천연 페어링을 유발할 것이다.

PCR 재증폭을 이하에 기재된 바와 같이 수행하였다. 연결된 생성물을 증폭시키는 데 사용된 "외부" 프라이머는 다음과 같다:

PCR 반응물 각각은 하기 성분들을 포함하였다:

그 다음, 써모사이클링을 다음과 같이 수행하였다:

마지막으로, 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. 비-천연적으로 연결된 생성물들은 이들의 중간 크기에 의해 용이하게 식별될 수 있었다. 구체적으로, 4G2-VL/9E10-미니-VH 및 9E10-미니-VL/4G2 VH 연결된 생성물은 각각 581 bp 및 568 bp의 크기에 상응할 것이다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 벌크 재증폭 동안 혼합되었을 때 천연 페어링의 유지가 관찰되었다(레인 5).

실시예 5: 비드에의 PCR 생성물의 포획을 용이하게 하기 위한 올리고 디자인

(예를 들면, 전술된 바와 같이) 소적 내에서의 RT-PCR 후, PCR 생성물을 소적 내의 비드에 포획하여, VH 생성물과 VL 생성물의 천연 매칭을 유지할 수 있다. 비드에의 dsDNA PCR 생성물의 효율적인 포획을 용이하게 하기 위해, 자신의 말단에서 규정된 ssDNA를 갖는 생성물을 생성하는 전략을 고안하였다. 이 ssDNA의 서열은 비드에 접합된 올리고의 서열에 상보적이다. 따라서, 이 서열들의 상보성은 dsDNA PCR 생성물의 특이적 및 효율적 포획을 용이하게 한다.

하기 프라이머 및 Q5 DNA 중합효소를 사용하는 PCR을 이용하여 4G2 cDNA로부터 PCR 생성물을 생성하였다. 역방향 프라이머는 비드에서 PCR 생성물의 특이적 검출을 용이하게 하기 위해 5'-바이오틴 모이어티를 함유한다. PCR 전략은 다음과 같았다:

하기 프라이머들을 사용하였다:

PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였고 AMPure 비드로 정제하였고 Nanodrop으로 정량하였다.

표준 방법을 이용하여 아민으로 표지된 포획 올리고를 카복실화된 비드(COMPEL, Bangs Laboratories)에 접합시켰다. 상기 PCR 프라이머들에서 PEG 스페이서의 5' 서열에 상보적인 서열을 갖는 하기 올리고들을, 비드에의 접합을 위해 사용하였다. 비드를 VL 올리고에만 접합시켰거나, VH 올리고에만 접합시켰거나, 이 올리고들 둘 다에 접합시켰다.

PCR 생성물을 포획하기 위해, 하기 반응을 설정하였다. 정제된 PCR 생성물을 0.5X SSC 완충제로 희석하여 25 ㎕ 최종 부피로 250 ng DNA를 달성하였다. 올리고에 접합된 비드를 0.5X SSC로 세척한 후, 400,000개의 비드들을 각각의 희석된 PCR 생성물과 혼합하였다. 비드-PCR 생성물 혼합물을 피펫으로 혼합하여 비드를 현탁시킨 후, 튜브를 써모사이클링기에 배치하였고 하기 프로그램을 실행하였다:

샘플은 다음과 같았다:

온도 인큐베이션 후, 샘플을 자석에 적용하여 튜브의 측면에서 비드를 모았다. 상청액을 제거하였고, 비드를 0.5X SSC 완충제로 세척하였다. 1% BSA를 함유하는 PBS에서 1:1000으로 희석된 50 ㎕의 AlexaFluor 647 IgG 분획 단일클론 마우스 항-바이오틴 항체(Jackson)를 사용하여 포획된 PCR 생성물에 대해 각각의 샘플을 프로빙하였다. 실온에서 25분 동안 혼합하면서 인큐베이션한 후, 튜브를 자석에 적용하였고, 상청액을 제거하였고, 비드를 PBS 완충제로 세척하였다. 상기 비드를 50 ㎕ PBS에 재현탁한 후 유세포분석으로 분석하였다.

도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, 결과는 (예를 들면, 샘플 (1)에서와 같이) PCR 프라이머 내의 PEG 스페이서 및 비드에 접합된 적절한 상보적 올리고를 요구하는, 이 방법에 의한 효율적 및 특이적 PCR 생성물 포획을 입증한다.

실시예 6: 리가제 사이클링에 의한 소적 내에서의 천연적으로 페어링된 VH-VL 생성물의 생성

이 실시예에서, 항체 4G2의 VH 서열 및 VL 서열을 발현하는 세포를 용해시켰고, 용해물로부터의 mRNA를 사용하여 리가제 사이클링으로 천연적으로 페어링된 VH-VL 생성물을 생성하였다. 세포 용해 완충제를 다음과 같이 제조하였다:

300 ㎕ 20% Ficoll PM400

10 ㎕ 20% Sarkosyl

40 ㎕ 5 mM EDTA

100 ㎕ 2 M Tris pH 7.5

350 ㎕ 물

200 ㎕ 100% Optiprep

카복실화된 COMPEL 자성 비드(Bangs Labs)를 하기 아민-변형된 올리고와 접합시켰다:

올리고(dT)는 mRNA 포획(예를 들면, VH 및/또는 VL을 코딩하는 mRNA의 포획)을 위해 사용될 수도 있다.

비드를 2x10⁷개 비드/㎖의 밀도로 용해 완충제에 현탁하여, 사용된 소적 크기를 갖는 소적당 약 2.5개 비드의 캡슐화를 용이하게 하였다.

4G2 마우스 하이브리도마 세포를 PBS로 세척하였고, 0.1% BSA 및 24% Optiprep을 함유하는 PBS에 2x10⁶개 세포/㎖의 밀도로 재현탁하였다. 이 밀도는 2개의 소적당 대략 1개의 세포로 소적 내로의 캡슐화를 용이하게 한다. 세포와 비드를 소적 내로 함께 캡슐화하기 위해, 3개의 Mitos P-Pump 압력 펌프들(Dolomite)에 의해 제어된 용액 유동을 갖는 2-시약 100 ㎛ 직경 플루오로친화성 마이크로플루이딕 칩(Dolomite)을 사용하였다. 상기 마이크로플루이딕 칩은 수성 용액을 위한 2개의 입력 채널들 및 플루오로탄소 오일을 위한 2개의 입력 채널들을 함유하였다. 세포 및 비드를 각각 10 ㎕/분의 속도로 유동시켰고, 불소첨가된 오일(1% 플루오로계면활성제(RAN Biotechnologies)를 함유하는 HFE-7500)을 55 ㎕/분의 속도로 유동시켰다. 이 유속들은 부피가 대략 500 pl인 소적을 생성하였다. 한 시간 동안 에멀전을 모았다.

에멀전(세포 및 비-세포 대조군)을 20분 동안 45℃에서 가열 블록에 적용하여, 비드에의 mRNA 포획을 용이하게 하였다. 그 후, 에멀전 및 비드를 4℃에서 보관하고 취급하여 비드로부터의 mRNA의 해리를 감소시켰다. 과량의 오일을 주사기로 제거하였고, RNAse 억제제를 함유하는 5 ㎖의 빙냉 6X SSC 완충제(1:100)를 에멀전에 첨가하였다. PFO(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로-1-옥탄올)(100 ㎕)을 에멀전에 첨가하여 소적 유착을 유도하였다. 샘플을 역위로 철저히 혼합한 후, 4℃에서 5분 동안 500xg에서 원심분리하였다. 수성 상을 피펫으로 혼합하고 모은 후 새로운 튜브로 옮겼다. 상기 튜브를 자석에 적용한 후, (하이브리드화된 mRNA를 가진) 비드를, RNAse 억제제를 함유하는 500 ㎕의 빙냉 완충제(100 mM Tris HCl pH 8, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂)로 2회 세척하였다. 그 다음, 상기 비드를, RNase 억제제를 함유하는 500 ㎕의 빙냉 완충제(100 mM Tris HCl pH 8, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂)에 현탁하였다(1:100).

mRNA 비드 및 RT-PCR 혼합물로 제2 에멀전을 제조하였다. mRNA 비드를 RT-PCR 비드 완충제(100 ㎕ 2X RT-PCR 완충제(OneTaq One-Step RT-PCR, NEB), 70 ㎕의 Optiprep, 4 ㎕의 RNase 억제제, 6.4 ㎕의 미리 혼합된 25 μM 프라이머 및 32 ㎕의 물)에 현탁하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같았다:

별도로, 효소 혼합물을 제조하였다(400 ㎕ 2X RT-PCR 완충제, RT-PCR 완충제에서 1.33배로 희석된 43 ㎕의 효소, 16 ㎕ RNase 억제제, 및 341 ㎕ 물).

각각 2.5 ㎕/분 및 7.5 ㎕/분의 속도로 비드 및 효소 혼합물, 및 35 ㎕/분의 속도로 오일(2% 플루오로계면활성제를 함유하는 HFE7500)을 함께 유동시킴으로써 RT-PCR용 에멀전을 생성하였다. 압력 펌프와 함께 2-시약 30 ㎛ 직경 플루오로친화성 마이크로플루이딕 칩(Dolomite)을 사용하여 소적을 생성하였다. 이 조건 하에서, 부피가 대략 15 내지 35 pl인 소적이 형성되었고, 이 때 비드 점유는 5개 소적당 1개 미만의 비드이었다. 모든 비드들이 캡슐화될 때까지(약 30분 내지 60분) 소적을 생성하였다. 그 다음, 하기 프로그램으로 써모사이클링기에서 써모사이클링시키기 위해 에멀전을 PCR 튜브 내로 분취하였다:

써모사이클링된 에멀전을 1개의 튜브 내로 조합하였다. 주사기를 이용하여 과량의 오일을 바닥으로부터 제거하였다. 소적을 깨뜨리기 위해, 100 ㎕의 PFO를 첨가한 후, 혼합하고 2분 동안 2000xg에서 원심분리하였다. 그 다음, (비드를 현탁하기 위해) 수성 상을 피펫으로 혼합하고 새로운 튜브로 옮겼다. 비드는 포획된 PCR 생성물을 함유하였다. 튜브를 자석에 적용하였고 상청액을 제거하였다. 비드를 500 ㎕의 빙냉 0.5X SSC 완충제로 약하게 세척하였다. 비드를 자석에 다시 적용하였고, 상청액을 제거한 후 100 ㎕의 빙냉 0.5X SSC 완충제에 재현탁하였다.

그 다음, VH 생성물과 VL 생성물을 공유결합시키기 위한 리가제 사이클링 에멀전을 위해 샘플을 제조하였다. 비드를 비드 용액(20 ㎕ 10X Taq 리가제 완충제(NEB), 117 ㎕ 60% 수크로스, 및 63 ㎕ 물)에 현탁하였다. Taq 리가제 혼합물을 제조하였다(80 ㎕ 10X Taq 리가제 완충제, 42 ㎕ Taq 리가제, 13 ㎕의 스플린트 올리고(0.1 μM), 및 665 ㎕ 물). 사용된 스플린트 올리고는 5'-ACCTGTGCCTTCGGTAGTTCCACCAGCAGAGCTCTCACCTG/3AmMO/(서열번호 6)이었다.

2 ㎕/분으로 비드 용액, 6 ㎕/분으로 효소 혼합물, 및 35 ㎕/분으로 오일(2% 플루오로계면활성제를 함유하는 HFE7500)을 유동시킴으로써 에멀전을 생성하였다. 압력 펌프와 함께 2-시약 30 ㎛ 직경 플루오로친화성 마이크로플루이딕 칩(Dolomite)을 사용하여 소적을 생성하였다. 이 조건 하에서, 부피가 대략 15 내지 35 pl인 소적이 형성되었고, 이 때 비드 점유는 5개 소적당 1개 미만의 비드이었다. 모든 비드들이 캡슐화될 때까지(약 30분 내지 60분) 소적을 생성하였다. 그 다음, 하기 프로그램을 이용하여 써모사이클링기에서 써모사이클링시키기 위해 에멀전을 PCR 튜브 내로 분취하였다:

써모사이클링된 에멀전을 1개의 튜브 내로 조합하였다. 주사기를 이용하여 과량의 오일을 바닥으로부터 제거하였다. 소적을 깨뜨리기 위해, 100 ㎕의 PFO를 첨가한 후, 혼합하고 2분 동안 2000xg에서 원심분리하였다. 그 다음, (비드를 현탁하기 위해) 수성 상을 피펫으로 혼합하고 PCR 튜브로 옮겼다(튜브당 50 ㎕). 그 다음, 비드에 하이브리드화된 라이게이션된 PCR 생성물의 해리를 용이하게 하기 위해 80℃까지 예열된 써모사이클링기에 샘플을 적용하였다. 비드가 가라앉게 한 후, 상청액을 제거하고 새로운 튜브로 옮겼다. 그 다음, AMPure 비드를 사용하여 생성물을 정제하였다.

그 후, 하기 프라이머를 사용하는 PCR로 라이게이션된 생성물을 튜브에서 재증폭하였다:

써모사이클링을 다음과 같이 수행하였다:

재증폭 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 4G2 세포 샘플은 의도된 생성물인 연결된 VH-VL DNA를 제공한 반면, 음성 대조군 샘플은 어떠한 생성물도 제공하지 않았다.

예를 들면, 온전한 오픈 리딩 프레임 내에서 사이에 플렉시블 링커 서열을 갖는 천연적으로 페어링된 VL 및 VH를 함유하는 최종 PCR 생성물을 효모 표면 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있고 표준 방법을 이용하여 효모 내로 형질전환시켜, 천연적으로 페어링된 효모 디스플레이 라이브러리를 생성할 수 있다고 생각된다. 예를 들면, 각각의 말단에서 추가 50 bp가 PCR에 의해 도입될 수 있다. 이 50 bp는 효모 발현 벡터 내의 적절한 서열과 매칭됨으로써, (예를 들면, 천연적으로 연결된 VL-VH를 함유하는) 삽입체 PCR 생성물 및 선형화된 효모 발현 벡터의 효모 공-형질전환 후 효모에서의 상동 재조합에 의한 클로닝을 용이하게 한다.

실시예 7: 프라이머로부터의 PCR 생성물 포획 경쟁을 방지하기 위한 자가 어닐링 프라이머

스페이서, 예컨대, PEG의 도입을 통해 PCR 생성물의 말단에서 점착성 말단(ssDNA)을 생성함으로써 비드에의 PCR 생성물 포획을 용이하게 하였다. 이 ssDNA 부분은 비드에 접합된 올리고에 상보적인 서열을 가짐으로써, 특이적 하이브리드화를 용이하게 하였다. PCR 생성물의 서열들은 이들을 증폭 프라이머에 포함시킴으로써 도입되었다. PCR 프라이머들은 PCR 생성물 ssDNA 말단과 동일한 서열을 가졌기 때문에, 이들도 특이적 하이브리드화를 통해 비드에 포획될 수 있다. 이러한 프라이머 포획은 PCR 생성물 포획과 반드시 경쟁할 것이다.

PCR에 의한 항체 레퍼토리의 증폭은 전형적으로 변경된 항체 유전자 서열을 증폭하기 위해 다수의 PCR 프라이머들을 요구한다. 예를 들면, 인간 및 마우스 레퍼토리의 V 및 J 영역을 인식하는 프라이머 세트는 종종 중쇄 및 경쇄의 V 영역에 대해 유도된 약 15개 내지 20개의 프라이머들로 구성된다. 다수의 프라이머들에 대한 요구는 PCR 생성물을 비드에 포획하는 데 있어서 프라이머의 경쟁 효과를 악화시키는 환경을 유발한다. 다중체 PCR 시나리오의 경우, 소정의 소적(구획)에서 단일(또는 한정된 수의) 프라이머는 소적 내의 표적 항체 서열에 대한 상보성을 가질 수 있다. 남은 레퍼토리 프라이머들은 표적 서열과 매칭되지 않을 것이다. 이 매칭되지 않은 프라이머들은 PCR 동안 앰플리콘 내로 도입되지 않을 것이므로, PCR 생성물 포획에 대해 효과적으로 경쟁할 태세를 갖춘다. 이 한계를 해결하기 위해, 소적 내의 사용되지 않은 PCR 프라이머가 포획에 대해 PCR 생성물과 경쟁하는 능력을 감소시키는 디자인을 생성하였다. PCR 생성물 포획은 예를 들면, 사용되지 않은 프라이머 대 앰플리콘을 생성하는 프라이머의 몰 비가 15:1인 조건 하에서 달성될 수 있다.

전술된 바와 같이, 카복실화된 자성 비드를 하기 아민-변형된 올리고와 접합시켰다.

하기 올리고들을 사용하여 4G2 하이브리도마에 상응하는 VL 서열을 증폭하기 위해 RT-PCR 반응을 설정하였다. 이 올리고들은 자가 어닐링 서열을 갖지 않는 디자인(비-SA) 및 자가 어닐링 서열을 갖는 디자인(SA)을 대표한다. 추가로, 자신의 5'-말단에서 자가 어닐링 서열을 갖되 4G2 VL 또는 VH mRNA 서열에 매칭되지 않는(미스매치) 3'-말단 서열을 갖는 올리고는 다중체 레퍼토리 프라이머와 유사한, PCR 동안 소비되지 않을 예시적 PCR 프라이머로서 포함되었다. 비드에서 포획된 PCR 생성물의 검출을 용이하게 하기 위해 역방향 프라이머를 바이오티닐화하였다.

밑줄은 자가 어닐링(상보적) 서열들을 표시한다.

정방향 자가 어닐링 프라이머(4G2_VL_정방향_SA)와 함께 사용된 경쟁하는 미스매치 올리고 농도의 경우, 하기 조건을 이용하였다:

정방향 비-자가 어닐링 프라이머(4G2_VL_정방향_비-SA)와 함께 사용된 경쟁하는 미스매치 올리고 농도의 경우, 하기 조건을 이용하였다:

샘플을 하기 프로그램으로 써모사이클링시켰다:

써모사이클링 후, 피펫팅으로 샘플을 약하게 혼합하여 비드를 현탁하였다. 그 다음, 비드에의 PCR 생성물 포획을 용이하게 하기 위해 하기 프로그램을 이용하는 써모사이클링기 내에 샘플을 배치하였다:

포획 절차 후, 튜브를 자석에 적용하였고 상청액을 회수하였다. 상청액을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여 PCR 생성물의 성공적인 생성을 확인하였다. 비드를 격리하기 위해 자석을 이용하여 포획된 PCR 생성물을 갖는 비드를 100 ㎕의 빙냉 PBSA(1% BSA를 함유하는 1X PBS)로 3회 세척하였다. 그 다음, 4℃에서 회전시키고 45분 동안 광으로부터 차단하면서 각각의 샘플을 PBSA 중의 100 ㎕ 1:500 AlexaFluor 647 IgG 분획 단일클론 마우스 항-바이오틴(Jackson)과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 비드를 100 ㎕ 빙냉 PBSA로 3회 세척하였다. 최종 세척 후, 비드를 100 ㎕ 빙냉 PBSA로 재현탁하고 AlexaGluo647 형광 신호에 대해 유세포분석기로 분석하였다.

각각의 샘플에 대한 평균 형광 강도(MFI)를 측정하였다. 미스매치 올리고의 부재에 상응하는 MFI에 비해 MFI의 퍼센트로서 샘플 데이터를 작도하였다. 도 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, 자가 어닐링 프라이머만이 미스매칭된 프라이머 올리고 대 매칭된 프라이머 올리고의 높은 비에서 PCR 생성물 포획 경쟁을 방해할 수 있었다. 이 결과는 특히 자가 어닐링 프라이머 디자인을 이용함으로써 15배 더 많은 사용되지 않은 프라이머의 조건 - 예를 들면, 다수의 항체 레퍼토리 조건들을 시뮬레이션하는 조건 하에서 PCR 생성물을 효율적으로 포획할 수 있다는 것을 보여준다.

참고에 의한 도입

본원에서 언급된 모든 공개문헌들, 특허들 및 수탁번호들은 각각의 개별 공개문헌 또는 특허가 구체적으로 및 개별적으로 참고로 도입되는 것으로 표시된 것처럼 전체로서 본원에 참고로 도입된다.

균등물

본 발명의 특정 실시양태들이 논의되어 있지만, 상기 명세서는 예시하기 위한 것이고 제한하기 위한 것이 아니다. 본 발명의 많은 변경들은 본 명세서 및 하기 청구범위의 검토 시 당분야에서 숙련된 자에게 자명해질 것이다. 본 청구범위를 그의 전체 균등물 범위와 함께 참조하고 본 명세서를 이러한 변경과 함께 참조함으로써 본 발명의 전체 범위를 결정해야 한다.

Claims

항체 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 항체 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열의 제조 방법으로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고, 상기 방법은
a) i) 세포로부터의 HCVR의 HC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 중쇄 이중 가닥 cDNA(HC ds cDNA)의 가닥인 중쇄(HC) 가닥, 및
ii) 세포로부터의 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 경쇄 이중 가닥 cDNA(LC ds cDNA)의 가닥인 경쇄(LC) 가닥
을 포함하는 분리된 생성 반응 부위를 획득하는 단계; 및
b) HC 가닥을 LC 가닥에 공유결합시킴으로써 상기 핵산 서열을 제조하는 단계
를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위는 상기 세포 이외의 세포로부터의 HCVR 또는 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 핵산 서열의 제조 방법.
제1항에 있어서, HC 요소는 중쇄 가변 영역 서열(HCVRS) 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, LC 요소는 경쇄 가변 영역 서열(LCVRS) 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하거나 이것으로 이루어지는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열은, 발현될 때, HC 요소 및 LC 요소가 시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서 기능성 항원 결합 분자를 형성하도록 구성되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 생성 반응 부위를 획득하는 단계는
a) (i) 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제1 이중 가닥 cDNA(ds cDNA), 및
(ii) 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 상보적인 가닥을 포함하는 제2 ds cDNA
에 결합된 포획 기재(capture substrate)를 획득하여, 로딩된 포획 기재를 생성하는 단계; 및
b) 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA의 증폭을 허용하는 조건 하에서 분리된 생성 반응 부위를 유지하여, 세포로부터의 HCVR의 HC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 HC ds cDNA, 및 세포로부터의 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 복수의 LC ds cDNA를 생성하는 단계
를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 기재는 비드, 및 cDNA에 결합하는 모이어티를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 생성 반응 부위는 세포의 HCVR의 HC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 제1 ds cDNA, 및 세포의 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 제2 ds cDNA를 제1 mRNA 및 제2 mRNA로부터 생성하기에 적합한 시약 혼합물을 포함하는 것인 방법.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 ds cDNA 및 제2 ds cDNA를 프라이머의 존재 하에서 증폭시키고, 이 때 프라이머 중 적어도 하나는 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이의 뉴클레오타이드 변형을 포함하고, 상기 뉴클레오타이드 변형은 DNA 합성을 감소시키는 것인 방법.
제8항에 있어서, 뉴클레오타이드 변형은 2개의 인접 뉴클레오타이드 사이의 스페이서의 삽입 또는 리보스에 대한 변형을 포함하는 것인 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 제1 구성원은 동일한 프라이머 또는 상이한 프라이머 내의 제2 구성원과 어닐링하여, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 이중 가닥 구조를 형성할 수 있는 것인 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 중 적어도 하나는 인산화되고, 링커 서열의 적어도 일부를 코딩하는 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, HC ds cDNA는 5' 오버행(overhang) 및 블런트(blunt) 말단을 포함하고, LC ds cDNA는 5' 오버행 및 블런트 말단을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, HC 가닥과 LC 가닥을 공유결합시켜 단일 가닥 핵산 서열을 생성하고, 이 때 HC 가닥 및 LC 가닥은 둘 다 센스 가닥이거나 둘 다 안티센스 가닥인 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 공유결합은 리가제(ligase)를 포함하는 분리된 결합 반응 부위에서 일어나는 것인 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, HC 가닥과 LC 가닥을 스플린트(splint) 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 공유결합시키고, 이 때 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 HC 가닥과 LC 가닥의 연접부(junction)를 포함하는 서열에 하이브리드화되어, 결합 부위에서 이중체 영역을 형성하는 것인 방법.
제15항에 있어서, 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 DNA 합성을 억제하는 변형을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 분리된 생성 반응 부위를 획득하기 전에,
a) i) 세포, 및
ii) 상기 세포로부터의 HCVR을 코딩하는 제1 mRNA 및 상기 세포로부터의 LCVR을 코딩하는 제2 mRNA에 결합할 수 있는 포획 기재
를 포함하는 분리된 세포 반응 부위를 획득하는 단계; 및
b) 세포의 용해를 허용하고 포획 기재가 제1 mRNA 및 제2 mRNA와 결합하여 mRNA가 로딩된 포획 기재를 형성하게 하는 조건 하에서 상기 분리된 세포 반응 부위를 유지하는 단계
를 포함하는, mRNA가 로딩된 포획 기재를 획득하는 단계를 추가로 포함하며,
상기 분리된 세포 반응 부위는 상기 세포 이외의 세포로부터의 HCVR 또는 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 방법.
제17항에 있어서, 폴리(dA) 또는 폴리(dT) 올리고뉴클레오타이드의 존재 하에서 분리된 세포 반응 부위로부터 mRNA가 로딩된 포획 기재를 유리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열의 전부 또는 일부를 시퀀싱하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열의 전부 또는 일부를 벡터 내로 삽입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열을 발현시켜, HCVR의 HC 요소를 코딩하는 분절 및 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 폴리펩타이드를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
제22항에 있어서, 폴리펩타이드를 항원과 접촉시키는 단계, 및 폴리펩타이드가 항원에 결합하는지를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
복수의 특유한(unique) 구성원들을 포함하는 라이브러리의 제조 방법으로서,
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 방법에 의해 복수의 구성원들을 제조함으로써 상기 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하고, 각각의 구성원은 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 요소(HC 요소) 및 경쇄 가변 영역(LCVR)의 경쇄 요소(LC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하고, HCVR과 LCVR은 매칭되고, 상기 복수의 특유한 구성원들의 각각의 특유한 핵산 서열은 상이한 특유한 세포로부터의 HC 요소 및 LC 요소를 포함하는 것인 제조 방법.
제24항에 있어서, 상기 라이브러리는 하기 특성들 중 1개, 2개, 3개 또는 전부를 포함하는 것인 방법:
a) 복수의 특유한 구성원들이 적어도 10⁴개, 10⁵개, 10⁶개, 10⁷개, 10⁸개 또는 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함하거나;
b) 복수의 특유한 구성원들이 10⁴개 내지 10⁹개, 10⁴개 내지 10⁸개, 10⁴개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁶개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁸개 내지 10⁹개, 10⁷개 내지 10⁹개, 10⁶개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁹개, 10⁵개 내지 10⁸개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁴개 내지 10⁵개, 10⁵개 내지 10⁶개, 10⁶개 내지 10⁷개, 10⁷개 내지 10⁸개, 또는 10⁸개 내지 10⁹개의 특유한 구성원들을 포함하거나;
c) 상기 라이브러리에서 구성원의 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%가 특유한 구성원이거나;
d) 상기 라이브러리에서 구성원의 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이 특유한 구성원이다.
제25항의 방법에 의해 제조된 라이브러리.
제26항에 있어서, 디스플레이 라이브러리인 라이브러리.
결합 폴리펩타이드의 제조 방법으로서,
a) 제26항 또는 제27항의 라이브러리를 획득하는 단계; 및
b) 상기 라이브러리의 특유한 핵산에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 발현시키는 단계
를 포함하는 제조 방법.
제28항에 있어서, 폴리펩타이드를 항원과 접촉시키는 단계 및 항원에 결합하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 얻는 단계를 추가로 포함하는 방법.
T 세포 수용체(TCR) α 쇄 가변 영역(ACVR)의 α 쇄 요소(AC 요소) 및 TCR β 쇄 가변 영역(BCVR)의 β 쇄 요소(BC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열의 제조 방법으로서, ACVR과 BCVR은 매칭되고, 상기 방법은
a) i) 세포로부터의 ACVR의 AC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 α 쇄 이중 가닥 cDNA(AC ds cDNA)의 가닥인 α 쇄(AC) 가닥, 및
ii) 세포로부터의 BCVR의 BC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 β 쇄 이중 가닥 cDNA(BC ds cDNA)의 가닥인 β 쇄(BC) 가닥
을 포함하는 분리된 생성 반응 부위를 획득하는 단계; 및
b) AC 가닥과 BC 가닥을 공유결합시킴으로써 상기 핵산 서열을 제조하는 단계
를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위는 상기 세포 이외의 세포로부터의 BCVR 또는 ACVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 제조 방법.
제30항에 있어서, 핵산 서열은, 발현될 때, AC 요소 및 BC 요소가 기능성 항원 결합 분자를 형성하도록 구성되는 것인 방법.
제31항에 있어서, 공유결합은 리가제를 포함하는 분리된 결합 반응 부위에서 일어나는 것인 방법.
복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리의 제조 방법으로서,
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항의 방법에 의해 복수의 구성원들을 제조함으로써 상기 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하고, 각각의 구성원은 α 쇄 가변 영역(ACVR)의 α 쇄 요소(AC 요소) 및 β 쇄 가변 영역(BCVR)의 β 쇄 요소(BC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하고, ACVR과 BCVR은 매칭되고, 복수의 특유한 구성원들의 각각의 특유한 핵산 서열은 상이한 특유한 세포로부터의 AC 요소 및 BC 요소를 포함하는 것인 방법.
제33항의 방법에 의해 제조된 라이브러리.
결합 폴리펩타이드의 제조 방법으로서,
a) 제34항의 라이브러리를 획득하는 단계; 및
b) 상기 라이브러리의 특유한 핵산에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 발현시키는 단계
를 포함하는 제조 방법.
TCR γ 쇄 가변 영역(GCVR)의 γ 쇄 요소(GC 요소) 및 TCR δ 쇄 가변 영역(DCVR)의 δ 쇄 요소(DC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열의 제조 방법으로서, GCVR과 DCVR은 매칭되고, 상기 방법은
a) i) 세포로부터의 GCVR의 GC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 γ 쇄 이중 가닥 cDNA(GC ds cDNA)의 가닥인 γ 쇄(GC) 가닥, 및
ii) 세포로부터의 DCVR의 DC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 δ 쇄 이중 가닥 cDNA(DC ds cDNA)의 가닥인 δ 쇄(DC) 가닥
을 포함하는 분리된 생성 반응 부위를 획득하는 단계; 및
b) GC 가닥과 DC 가닥을 공유결합시킴으로써 상기 핵산 서열을 제조하는 단계
를 포함하고, 상기 분리된 생성 반응 부위는 상기 세포 이외의 세포로부터의 DCVR 또는 GCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 것인 제조 방법.
제36항에 있어서, 핵산 서열은, 발현될 때, GC 요소 및 DC 요소가 기능성 항원 결합 분자를 형성하도록 구성되는 것인 방법.
제36항 또는 제37항에 있어서, 공유결합은 리가제를 포함하는 분리된 결합 반응 부위에서 일어나는 것인 방법.
복수의 특유한 구성원들을 포함하는 라이브러리의 제조 방법으로서,
제36항 내지 제38항 중 어느 한 항의 방법에 의해 복수의 구성원들을 제조함으로써 상기 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하고, 각각의 구성원은 γ 쇄 가변 영역(GCVR)의 γ 쇄 요소(GC 요소) 및 δ 쇄 가변 영역(DCVR)의 δ 쇄 요소(DC 요소)를 코딩하는 서열을 포함하고, GCVR과 DCVR은 매칭되고, 복수의 특유한 구성원들의 각각의 특유한 핵산 서열은 상이한 특유한 세포로부터의 GC 요소 및 DC 요소를 포함하는 것인 제조 방법.
제39항의 방법에 의해 제조된 라이브러리.
결합 폴리펩타이드의 제조 방법으로서,
a) 제40항의 라이브러리를 획득하는 단계; 및
b) 상기 라이브러리의 특유한 핵산에 의해 코딩된 폴리펩타이드를 발현시키는 단계
를 포함하는 제조 방법.
a) 세포로부터의 HCVR의 HC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 중쇄 이중 가닥 cDNA(HC ds cDNA)의 가닥인 중쇄(HC) 가닥;
b) 세포로부터의 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 경쇄 이중 가닥 cDNA(LC ds cDNA)의 가닥인 경쇄(LC) 가닥; 및
c) 제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이의 뉴클레오타이드 변형을 포함하는 프라이머로서, 상기 뉴클레오타이드 변형은 DNA 합성을 감소시키는 것인 프라이머
를 포함하고, 상기 세포 이외의 세포로부터의 LCVR 또는 HCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 분리된 생성 반응 부위로서, HCVR과 LCVR은 매칭되는 것인 분리된 생성 반응 부위.
제42항에 있어서, 제1 구성원은 동일한 프라이머 또는 상이한 프라이머 내의 제2 구성원과 어닐링하여, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 이중 가닥 구조를 형성할 수 있는 것인 분리된 생성 반응 부위.
제1 구성원, 제2 구성원, 및 제1 구성원과 제2 구성원 사이에 위치하는 스페이서를 포함하는 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드로서, 제1 구성원은 동일한 올리고뉴클레오타이드 또는 상이한 올리고뉴클레오타이드 내의 제2 구성원과 어닐링하여, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 염기쌍의 이중체 영역을 포함하는 헤어핀 구조 또는 이중 가닥 구조를 형성할 수 있는 것인 자가 어닐링 올리고뉴클레오타이드.
제44항에 있어서, 스페이서는 플렉시블 스페이서 또는 PEG 스페이서인 올리고뉴클레오타이드.
a) 세포로부터의 HCVR의 HC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 중쇄 이중 가닥 cDNA(HC ds cDNA)의 가닥인 중쇄(HC) 가닥;
b) 세포로부터의 LCVR의 LC 요소를 코딩하는 분절을 포함하는 경쇄 이중 가닥 cDNA(LC ds cDNA)의 가닥인 경쇄(LC) 가닥; 및
c) HC 가닥과 LC 가닥의 연접부를 포함하는 서열에 하이브리드화하여, 결합 부위에서 이중체 영역을 형성할 수 있는 스플린트 올리고뉴클레오타이드
를 포함하고, 상기 세포 이외의 세포로부터의 HCVR 또는 LCVR을 코딩하는 핵산을 포함하지 않는 분리된 결합 반응 부위로서, HCVR과 LCVR은 매칭되고, HC 가닥과 LC 가닥은 공유결합되는 것인 분리된 결합 반응 부위.
제46항에 있어서, 리가제를 추가로 포함하는 분리된 결합 반응 부위.