CN1103586C - 蔗糖酯－c20－28醇制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定的，有效的治疗乳剂，其中主要治疗化合物是一种或多种C-20到C-28长链脂肪醇，例如正-二十二烷醇，还含有蔗糖可可脂酸酯，蔗糖硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯，或它们的混合物。

Description

蔗糖酯-C20-28醇制剂
发明领域
本发明涉及治疗病毒和炎症疾病以及减少皮肤和粘膜表面炎症所致疼痛的局部治疗制剂和方法。本发明的制剂实例是含20到28个碳的脂肪醇例如正-二十二烷醇的乳剂。
发明的背景
绝大多数抗病毒治疗化合物在感染的靶细胞中有阻碍各种专一性病毒基因复制的机制。这些方法有缺点，包括对宿主细胞的毒性、诱导产生抗药性的病毒-亚-菌株、对宿主细胞有诱变剂和/或致畸形药的潜在行为。因此，搜寻新的能提供有效治疗的且无这些对宿主有害结果的抗病毒化合物是首要重要的。的确，我们似乎已进入了一个迄今为止尚无法分清转录病毒族中的病毒的新时代。
能够产生抗病毒活性而无潜在的对感染的宿主的伤害性的化合物已被确定，且表现出一些有相当前途的结果。例如：在七十年代末，Snipes和其同事(W.Snipes，S.Person，G.Keller，W.Taylor，A.Keith；Antimicrob.Agents Chemother.II，98-104(1977)；J.Sands，D.Auperin，W.Snipes；Antimicrob.Agents Chemother.15，67-73(1979))报导了一系列研究证明中等链长度的饱和和不饱和醇均有这些活性。最佳抗病毒活性是在含10-12个碳长度的饱和醇上观察到的；在14-18碳长度的醇上观察到了弱一些的抗病毒活性，更高链长度的醇未被测试。当C-10和C-12的醇表现出显著的抗病毒活性的同时，这些化合物同时也展示出了细胞毒性的和溶血的作用。在不饱和醇和丙三醇单甘油酯上也观察到了同样的结果，含有三个双键的C-18醇表现出峰值活性。随后，Clark和其同事(L.L.Clark，炎症皮肤疾病的治疗，美国专利号4,670,471(1987)；P.T.McBride，L.L.Clark，G.G.Krueger；J.Invest.Dermatol.89，380-383(1987))断定30个碳长的饱和醇，三十烷醇，作为一种抗疱疹药剂是有活性的。然而，由于组织培养研究证明三十烷醇缺乏直接抗病毒活性。可以推测在动物研究中观察到的明显的抗疱疹活性可能反映了该化合物的推测性的免疫调节作用。
早在1974年，报导了正-二十二烷醇具有全身治疗价值。例如：Debat.美国专利号4,186,211曾报导1-二十二烷醇在口服时对治疗前列腺肥大症有效。类似的工作在十年后由Yamamoto等报导。例如：美国专利号4,624,966，由于错误地化学命名，将正-二十二烷醇称为聚戊二烯基化合物并描述了在治疗中口服或非肠道服用正-二十二烷醇。据本发明人所知，无论是Debat还是Yamamoto等或其他工作者们，都没有对在局部治疗中正-二十二烷醇可能是一种活性剂的可能性提出任何建议甚至是一点建议。
在检查了Snipes和其同事的结果及意识到长于18个碳的化合物并未被检查确定它们是否具有局部抗病毒或炎症活性后，我们推断，两倍于C-10或C-12长的分子(该类C-10或C-12分子表现出峰值抗病毒活性时，同时也具有细胞毒性和溶血活性)可能会保留该类C-10或C-12分子对病毒的生物活性，但(也许是因为分子的折叠)缺少短链分子的溶血和细胞毒性性质。我们实验室中测定正-二十二烷醇的抗病毒性质的研究是有利的(Katz，D.H.，美国专利号4,874,794)。
然而，制备稳定的有效的含有正-二十二烷醇的局部制剂提出了一种挑战。尽管某些传统剂型，如，乳剂和软膏对于初步估价在开始是足够的，但我们发现某些赋形剂对正-二十二烷醇的活性是有害的。因此，显然需要可长期稳定的，生理上可接受的并且适于对皮肤和粘膜局部使用的重现的有效的正-二十二烷醇制剂。制备稳定的有效的含正-二十二烷醇的组合物，存在着一个意想不到的困难的挑战。对绝大多数药品来说完全适于制备载体乳剂的传统乳剂制剂并不令人满意。尽管增强渗透性的化合物被认为是比较理想的，但渗透性的增强并非是一个特别的问题。许多渗透增强剂是可以得到的，但并无理由认为这些物质与渗透增强作用相对应，当然也没有理由预期用这些物质中的任何一种能得到一种乳剂，该乳剂会产生增强的药效，并且在存储和处理期间产品所遇到的所有温度下以及对于正常存储和处理所预期的所有时间段，该乳剂都是稳定的，此外，通过相变和/或暴露于比乳剂水性组份的冰点低且使本发明的高疏水长链醇保持药学活性的温度下，该乳剂也是稳定的。例如，Rajadhyaksha报告的Azone是一个极好的渗透增强剂，但它并未作为乳剂制剂中的稳定组份而为人所知。椰子脂肪酸的蔗糖酯已被用作制剂的渗透增强剂，Cheng等人的美国专利4,865,848和其它专利。然而，Cheng等并未认为这些物质会导致任何乳剂的稳定化作用，也无任何理由从Cheng等人的专利推测出这种稳定化作用。有关这些化合物的文献未暗示出这些物质可以特别有效地稳定含C-20至C-28脂肪醇的乳剂。本发明是专为解决这些问题的。本发明尤其是为得到一种用于治疗的有效的，稳定的，生理上可接受的，适于局部应用的C-20至C-28脂肪醇，例如：正-二十二烷醇乳剂。
通过试验测试了各种制剂组合物的稳定性，并提供了一种乳剂，其中，长链醇在局部应用的乳剂中具有很高的生理活性。有些制剂稳定性差而有些制剂生理活性差。发现只有本发明的制剂在稳定性和活性上都是令人满意的。
一个重要的结果完全令人吃惊-即它能立即减轻并且有时完全消除皮肤及粘膜炎症所带来的疼痛。
发明概述
本发明包括一种用于消除表皮和粘膜的炎症所引起的疼痛的治疗乳剂(cream)，其中主要的生理活性治疗组分是含有20到28个碳原子的长链脂肪醇，例如：正-二十烷醇，正-二十一烷醇，正-二十二烷醇，正-二十三烷醇，正-二十四烷醇，正-二十五烷醇，正-二十六烷醇，正-二十七烷醇，正-二十八烷醇或它们的混合物，正-二十二烷醇是这个直链饱和醇族中最易得到的，它在许多实验中是一个实例化合物。
本发明还包括用蔗糖及等同物糖基酯制备治疗乳剂，已发现所述蔗糖和糖基酯具有独特的稳定乳剂的能力，这些乳剂含有至少一种含20到28个碳原子的长链脂肪醇，例如：正-二十烷醇，正-二十一烷醇，正-二十二烷醇，正-二十三烷醇，正-二十四烷醇，正-二十五烷醇，正-二十六烷醇，正-二十七烷醇，和正-二十八烷醇或它们的混合物，正-二十二烷醇本身或其与其它该类醇的混合物被作为实例。
因此，本发明涉及一种适用于病毒和炎症疾病治疗的应用于皮肤和粘膜的治疗乳剂，该乳剂基本上由3％重量-15％重量的蔗糖酯表面活性剂、5％重量-25％重量的至少一种具有20至28个碳原子的长链脂肪醇、矿物油、润肤剂共溶剂和水组成，所述长链脂肪醇选自正-二十烷醇、正-二十一烷醇、正-二十二烷醇、正-二十三烷醇、正-二十四烷醇、正-二十五烷醇、正-二十六烷醇、正-二十七烷醇、正-二十八烷醇或它们的混合物，该乳剂在至少40℃的温度下保持至少3个月的时间和在重复冷冻-融解循环后仍是稳定的。
根据本发明的一个实施方案，乳剂中的长链脂肪醇为正-二十二烷醇。
根据本发明的另一个实施方案，乳剂中的蔗糖酯表面活性剂包括至少一种选自蔗糖可可脂酸酯、蔗糖硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯的化合物，并且其中蔗糖酯的量为所述乳剂重量的至少5％。
根据本发明的再一个实施方案，乳剂中的蔗糖酯占乳剂重量的至少10％±5％。
根据本发明的另外一个实施方案，乳剂中的润肤剂共溶剂选自聚氧丙烯-十八烷基醚、乙基己二醇、和苄醇、或它们的混合物。
根据本发明的还一个实施方案，乳剂中的正长链脂肪醇占乳剂重量的至少10％。
根据本发明的一个实施方案，乳剂的组成为：至少一种长链脂肪醇，它占乳剂重量的5％到15％；蔗糖硬脂酸酯，它占乳剂重量的0％到15％；蔗糖可可脂酸酯，它占乳剂重量的0％到10％；和蔗糖二硬脂酸酯，它占乳剂重量的0％到10％；其条件是至少存在一种蔗糖酯且为乳剂重量的至少3％；矿物油，它占乳剂重量的3％到15％；苄醇，它占乳剂重量的0.5％到10％；和水，它占乳剂重量的45％到70％。
根据本发明的另一个实施方案，乳剂的组成为：
正-二十二烷醇      5～20％(重量)
蔗糖硬脂酸酯       0～15％(重量)
蔗糖可可脂酸酯     0％～10％(重量)
蔗糖二硬脂酸酯     0％～10％(重量)
其条件为至少存在一种蔗糖酯，其中蔗糖酯占乳剂重量的3％-15％，
矿物油                     3～15％(重量)
丙二醇                     2～10％(重量)
聚氧丙烯-十八烷基醚        0～5％(重量)
苄醇                       0～5％(重量)
其条件为存在聚氧丙烯-十八烷基醚或苄醇，且其含量为1％或更多；和
水                          40～70％(重量)
本发明还涉及一种基本上由占治疗乳剂重量的5％-25％的至少一种具有20至28个碳原子的长链脂肪醇、乳剂基、矿物油、润肤剂共溶剂和水组成的治疗活性组合物在制备适用于治疗皮肤和粘膜的病毒感染和炎症的药物中的应用，所述长链脂肪醇选自正-二十烷醇、正-二十一烷醇、正-二十二烷醇、正-二十三烷醇、正-二十四烷醇、正-二十五烷醇、正-二十六烷醇、正-二十七烷醇、正-二十八烷醇或它们的混合物，其中所述乳剂基基本上由3％重量-15％重量的蔗糖酯表面活性剂组成。
根据本发明的再一个实施方案，乳剂中的正二十二烷醇占长链脂肪醇的一半以上。
本发明包括局部应用的乳剂制剂，该制剂适用于治疗动物皮肤或粘膜的由病毒引发的和炎症的疾病，也包括对人类的治疗。乳剂的基本成分是至少一种含有20到28个碳原子的长链脂肪醇(例如：正-二十烷醇，正-二十一烷醇，正-二十二烷醇，正-二十三烷醇，正-二十四烷醇，正-二十五烷醇，正-二十六烷醇，正-二十七烷醇，和正-二十八烷醇，或它们的混合物，正-二十二烷醇本身或其与其它该类醇的混合物被作为实例)，生理活性组分，水，油，糖和脂肪酸的酯(该酯是生理惰性的或能为生物体所代谢)，和能帮助正-二十二烷醇渗透到皮肤或粘膜的感染区域的润肤剂。如所指出的，比正-二十二烷醇不易得到得多的和昂贵得多的含有20到28个碳链长的脂肪醇的等同物，可以一起使用或代替正-二十二烷醇。糖基酯包括糖的部分和脂肪酸酯部分，糖部分的分子量大于约150，优选大于250，脂肪酸酯部分的分子量大于约150或更高，优选大于250；酯的分子量大约为400或更高。所用的术语“糖”是甜的或甜味的碳水化合物，它们是高级多元醇的酮或醛的衍生物，既包括单糖化合物也包括二糖化合物，优选二糖基酯。高分子量的多元醇被取代可能会得到较满意的结果，但远不是最佳结果，就此程度而言，高分子量多元醇与更传统的糖是等同物。这种酯化的糖基表面活性剂可以在一般的化学文献中及在各种目录中找到，例如：McCutcheno′sdirectories，卷1-“乳化剂和洗涤剂”，和卷2-“功能性物质”，(McCutcheno′s Division，The Manufacturing Confectioner PublishingCo.，Glen Rock，U.S.A.1993)。蔗糖脂肪酸酯是优选的，并用于此后所示的实施例中。
一般最佳乳剂制剂按重量百分比包括正-二十二烷醇*              5-25％或更多，虽然更高的量比低量并不更有利，最好为大约10％
                        ±5％；蔗糖硬脂酸酯                0-15％，最好为大约3到10％(以重量计)；蔗糖可可脂酸酯              0-15％，最好为大约3到10％；蔗糖二硬脂酸酯              0-15％，最好为大约3到10％；其条件为：至少含有一种蔗糖酯或
                        一种等同物糖基酯，该糖基酯占总组成的大约3％或更多，优选
                        大约为10％±5％；矿物油NF                    3-5％，最好为大约8％±4％；丙二醇USP                   2-10％，或功能相当的润肤剂(emollient)，最好为大约5％±2％；聚氧丙烯-十八烷基醚                  0-5％，最好为大约2-3％；苄醇NF                      0-5％，最好为大约2-3％；其条件为：聚氧丙烯-十八烷基醚或
                        苄醇或其功能等同物，以至少1％的含量存在，和水                          40-70％，最好为大约45到65％；
*或至少一种含20到28个碳原子的长链脂肪醇，例如：正-二十烷
醇，正-二十一烷醇，正-二十二烷醇，正-二十三烷醇，正-二十
四烷醇，正-二十五烷醇，正-二十六烷醇，正-二十七烷醇，和正-二十八烷醇或它们的混合物，正-二十二烷醇单独使用或与这类醇混合使用作为实例。
本发明包括使用本发明的乳剂治疗局部病毒感染的方法。在更一般的意义上，发明包括一般炎症组织的局部治疗。
附图的简要说明
图1至图3和图6A，6B是涉及I型单纯疱疹病毒(HSV-I)的实验，而图4，5和图7至9涉及II型单纯疱疹病毒(HSV-II)。
图1所示为制剂I(正-二十二烷醇10.0％；蔗糖硬脂酸酯11.0％；蔗糖可可脂酸酯(cocoate)5.0％；矿物油8.0％；丙二醇5.0％；2-乙基-1，3-己二醇2.7％和纯水58.3％)，制剂II的三种不同制品(除5％蔗糖硬脂酸酯为蔗糖二硬脂酸酯代替，乙基己二醇为等当量的聚氧丙烯-十八烷基醚所代替外其余与制剂I相同)和用于抑制HSV-I引起的对几内亚无毛猪皮肤损伤的制剂ZOVIRAX(无环鸟苷，Burroughs Wellcome Co.Research Triangle Park，NC；用于治疗HSV感染目前所选择的药剂，它可抑制病毒DNA聚合酶的活性)的活性比较。
图2所示为制剂I，制剂II，和制剂IA(正-二十二烷醇10.0％；蔗糖硬脂酸酯11.0％；蔗糖可可脂酸酯5.0％；矿物油8.0％；丙二醇5.0％；苄醇2.7％和纯水58.3％)的活性比较。
图3A示出制剂I对制剂III(正-二十二烷醇10.0％；蔗糖硬脂酸酯5.0％；矿物油8.0％；丙二醇5.0％；苄醇2.7％和纯水58.3％)的活性比较。
图3B描绘了对这些制剂作某些改变后的活性比较的数据。其中相关表面活性剂的浓度的变化是相对于制剂I而言的。已发现表面活性剂浓度的改变对药物活性的程度具有明显的有害影响。
图4描述了表示制剂III对抑制HSV-2所引起的几内亚无毛猪的皮肤损伤的剂量应答关系的数据。
图5图示了含有正-二十二烷醇的以蔗糖酯表面活性剂体系为基的乳剂(制剂III)也能抑制HSV-2所至几内亚无毛猪的皮肤损伤。
图6A图示描绘的数据证明在疱疹出现前施用以表面活性剂pluronicF-68配制的正-二十二烷醇悬浮液也能抑制HSV-I所至的水泡。悬浮液制剂不含有任何含有正-二十二烷醇乳剂的赋形剂，包括苄醇。
图6B图示描绘的数据证明在疱疹出现后施用正-二十二烷醇的非离子型表面活性剂pluronic F-68配制的悬浮液也能抑制HSV-I所至的水泡，悬浮液制剂不合有任何含有正-二十二烷醇乳剂的赋形剂，包括苄醇。
图7至13描绘了阐明正-二十二烷醇药理学的数据。
图7描述了表示正-二十二烷醇抑制无环鸟苷抗性HSV-2的数据。Vero细胞在35mm的培养池中(每池6×105个细胞)在培养介质本身中(＝无)或在所述浓度的无环鸟苷，正-二十二烷醇-Pluronic F-68悬浮液或对照悬浮液(只含pluronic F-68)存在下培养。培养物在24小时后接种150PFU的野生型HSV-2或接种经过菌斑纯化并在20mg/ml无环鸟苷中传代44小时后的野生型HSV-2的无环鸟苷抗性实验室分离物，平皿经过温育，固定，染色和计菌斑数，所表示的数据是重复培养物的菌斑数均值。在以无环鸟苷或正-二十二烷醇处理的培养物中，相对于未处理的对照培养物中观察到的抑制百分数表示在括号中。
图8描绘的数据表示正-二十二烷醇的局部乳剂制剂对几内亚猪的皮肤HSV的剂量应答。将几内亚无毛猪的后背洗净，用纹身器具刺穿皮肤来接种纯化的HSV-2。在病毒接种2小时后，接种部位或不处理或以100μl含正-二十二烷醇的乳剂或对照赋形剂处理；该部位在病毒接种24，30，48，52和56小时后作类似处理。每个部位的水泡数量在指定的时间点测定。数据以由每次测量重复部位所产生的水泡数量的均值和标准偏差来表示。括号中的数字描述在处理部位的水泡数与未处理部位相比较的抑制百分比。
图9描述的数据表示在正-二十二烷醇处理过的Vero细胞表面HSV-2保留时间延长。Vero细胞如图7所述过程培养温育过夜。然后将培养物冷至4℃，接种100PFU的HSV-2，在4℃温育3小时。在零时刻，培养物以培养液清洗，接种新鲜的培养液(含有所指明的抑制剂)并在37℃温育。在每个指定的时间段，将培养物以柠檬酸盐缓冲液(pH2.5)清洗并重新接种新鲜的培养液(无抑制剂)，在总共44小时的温育后，给培养物染色，计HSV-2所致菌斑数。数据以几何均值和偏离每组三份重复的培养物所产生的标准偏差表示。
图10描述的数据表明正-[14C]-二十二烷醇的放射性代谢物表现出磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的性质。一份(0.5ml)硅脂分级的甲醇洗脱液在氮气保护下蒸干，重新悬浮于20ml氯仿∶甲醇(3∶2，体积∶体积)中，在硅胶薄层色谱板上点板，在氯仿∶甲醇∶乙酸∶水(60∶50∶1∶4；体积∶体积∶体积∶体积)中展开；标准位置通过在碘蒸气中染色而确定。在将塑料底的TLC板割成5mm条状物后通过闪烁光谱法测定每个组分的每分钟计数(cpm)。
图11描述数据显示Vero细胞对正-[14C]-二十二烷醇的代谢要比MDBK细胞多。Vero或MDBK细胞如说明书中所述培养。将正-[14C]-二十二烷醇加至6mM[0.24mM Tetronic 908]中，培养物在37℃/CO2中温育72小时。提取出细胞，在TLC上用己烷∶乙醚∶乙酸(20∶30∶1，体积∶体积；体积)作为展开剂进行分析。在这个溶剂体系下，极性的磷脂保留在原点。正-二十二烷醇的迁移位置被指示出来重复的培养皿以相同的但无放射性标记的悬浮液处理，在这些重复的培养皿中的细胞数通过使用血细胞计数器排除台盼兰染色的细胞而计数测定。
图12描述数据表示正-二十二烷醇在体内抑制Friend病毒所至的白血病和病毒血。给成年的BALB/C鼠静脉内注射75脾病灶形成单位的FV。处理组在病毒接种的同一天静脉内注射所指示剂量的正-二十二烷醇或只注射Pluronic赋形剂，并在随后的三天每天注射一次。十天后，杀死每组中一半的动物，检查它们脾中的白血病病灶(A组)。剩余的鼠多保留十天后杀死以测定病毒血(B组)。病毒血是用X-C菌斑分析测量的。简单地说，原纤维细胞培养物是通过用胰蛋白酶消化1 4天的BALB/C胚胎，然后在DMEM培养液加10％小牛血清中培养而得到的。72小时后，将细胞转移至16mm盘中(105/每孔)，用5μg/ml的溴化己二甲铵预处理，然后以75X-C菌斑形成单位的Friend病毒的测试血浆储液或稀释液感染。在温育7天后，将培养物辐照，续加X-C细胞(3×105/每孔)。三天后，清洗培养物，染色，计多核巨细胞的菌斑数。所呈现的数据是几何平均值及每组中三个动物所产生的脾病灶或X-C菌斑形成单位的标准偏差。
图13描述数据显示正-二十二烷醇体外抑制在PHA/IL-2-激发的人体外周血液单核细胞的培养物中的HIV-1的复制。人体外周血液单核细胞是在只含有1μg/mlPHA加上5单位/mlIL-2中或在含有100μg/mlPFA，所指示剂量的正-二十二烷醇/Pluronic，或含在高剂量的正-二十二烷醇/Pluronic中的F-68对照赋形剂的培养液中培养的。在温育过夜后，培养物在1病毒粒子/每细胞的多重感染形式下接种HIV-1。在37℃中温育24小时后，清洗培养物，用含有PHA和IL-2，但无抑制剂的新鲜培养液接种，四天后通过用于HIV-1的P24特异性的ELISA进行病毒抗原定量分析来测定HIV-1的复制。
优选具体实施方案的描述
要制备乳剂，将正-二十二烷醇(≥98％纯度；M.Michel and Co.，纽约，NY)，一种水不溶性化合物，在80℃与蔗糖可可脂酸酯，蔗糖硬脂酸酯，蔗糖二硬脂酸酯，矿物油，丙二醇和聚氧丙烯-十八烷基醚混合。加入水，混匀则制得乳剂。乳剂也可以通过将除正-二十二烷醇外的所有物质加入水中形成乳剂基质，然后将正-二十二烷醇混合到乳剂基质中来制备。已发现下面的性质一般来说是优化的。
合适范围(重量百分数％) 最优化值(重量百分数％)
正-二十二烷醇*蔗糖硬脂酸酯蔗糖可可脂酸酯蔗糖二硬脂酸酯   5-25％0-15％0-10％0-10％  10％6％5％5％
    附加条件：至少有一种蔗糖酯存在，并且蔗糖酯占总组分的大约3％(重量)或更多，最好为大约10±5％(重量)。
矿物油NF丙二醇USP聚氧丙烯-十八烷基醚苄醇NF 3-15％2-10％0-5％0-5％ 8％5％2-3％2-3％
    附加条件：或者聚氧丙烯-十八烷基醚或者苄醇以2％的量存在。
纯水 40-70％ 55-60％
*或至少一种含有20至28个碳原子的长链脂肪醇，例如：正-二十
烷醇，正-二十一烷醇，正-二十二烷醇，正-二十三烷醇，正-
二十四烷醇，正-二十五烷醇，正-二十六烷醇，正-二十七烷
醇，和正-二十八烷醇或它们的混合物，正-二十二烷醇单独使用
或与其它这类醇形成混合物使用作为实例。
已发现含有2-乙基-1，3-己二醇而不是聚氧丙烯-十八烷基醚或苄醇和蔗糖酯的制剂也是有效的。但是已有人认为将化合物2-乙基-1，3-己二醇包括在用于重复性局部使用的组合物中是不合适的。
第一种LIDAKOL(商标)正-二十二烷醇的显示出希望的制剂描述于下面表1中：
表1
正-二十二烷醇的制剂I
     组分               重量百分比(％)               功能/基本原理
正-二十二烷醇               10.0                      活性药物物质
蔗糖硬脂酸酯                11.0                      乳化剂，润肤剂
蔗糖可可脂酸酯               5.0                      乳化剂，润肤剂
矿物油NF                     8.0                      润肤剂
丙二醇USP                    5.0                      共溶剂，致湿剂，皮肤感
                                                      觉修饰剂，辅助防腐剂2-乙基-1，3-己二醇               2.7                      共溶剂-辅助防腐剂
纯水qs ad                   58.3                      赋形介质
这是第一个能足够稳定较长一段时间的正-二十二烷醇乳剂，其间能对动物进行综合系列的治疗实验，并且其中的正-二十二烷醇在动物疱疹模型中具有持续活性(图1到3)，并被用于开始的I期人体临床研究，该研究显示该乳剂安全且尚好。然而，由于2-乙基-1，3-己二醇在美国以外的一些国家不适于重复使用，所以聚氧丙烯-十八烷基醚以等当量(2.7％)取代了2-乙基-1，3-己二醇，5％的蔗糖硬脂酸酯被5％的蔗糖二硬脂酸酯代替。得到的正-二十二烷醇制剂II的组成描述于下面的表2中。
表2
正-二十二烷醇制剂II
组分                  重量百分比％                       功能/基本原理
正-二十二烷醇             10.0                           活性药物物质
蔗糖硬脂酸酯               6.0                           乳化剂，润肤剂
蔗糖可可脂酸酯             5.0                           乳化剂，润肤剂
蔗糖二硬脂酸酯             5.0                           乳化剂，润肤剂
矿物油NF                   8.0                           润肤剂
丙二醇USP                  5.0                           共溶剂，致湿剂，皮肤感聚氧丙烯-十八烷基醚            2.7                           觉修饰剂，辅助防腐剂
纯水qs ad                                                共溶剂，辅助防腐剂
                          58.3                           赋形介质
这个改性的制剂II在取代乙基己二醇和对成药提供了物理稳定性上取得了成功，并且它在几内亚猪的疱疹动物模型(见图1和2)中表现良好。然而该制剂未通过美国药典(USP)防腐有效性试验，因此被认为不适用于人类临床使用。这种微生物不稳定性可以如下面所述通过以苄醇作为共溶赋形剂取代聚氧丙烯基-十八烷基醚而得到解决。
已发现使用所述表面活性剂类中的仅一种或两种并且所使用的表面活性剂量大约在5％会得到稳定的组成。仅使用一类或两类表面活性剂并使用更低量的表面活性剂来制备稳定的乳剂是一个意想不到的并且是我们实验室工作所期望的结果。过量的表面活性剂是不合适的，因为大于5％水平的过量表面活性剂有可能会增加刺激性。另外，含有过量非离子性表面活性剂的制剂经常会有防腐有效性的问题(这有可能归结于制剂II的微生物不稳定性)。
使用亲水性亲油性平衡值(HLB)为9.0到13.0范围内的几种表面活性剂混合物制备出各种的正-二十二烷醇乳剂并且对最优乳化质量，物理性质，药效和促进了的物理稳定性进行筛选。虽然绝大多数的药用乳化剂是以双表面活性剂混合物为基质来优化HLB，本项目揭示出蔗糖硬脂酸酯本身在改进了的正-二十二烷醇制剂中表现得跟任何一种表面活性剂混合物一样好或更好。这个改进了的正-二十二烷醇制剂(制剂III)的组成如下：
表3
正-二十二烷醇制剂III
组分                     重量百分比(％)                    功能/基本原理
正-二十二烷醇                10.0                          活性药物物质
蔗糖硬脂酸酯                  5.0                          乳化剂，润肤剂
矿物油NF                      8.0                          润肤剂
丙二醇USP                     5.0                          共溶剂，致湿剂，皮肤感
                                                           觉修饰剂，辅助防腐剂
苄醇NF                        2.7                          共溶剂，辅助防腐剂
 纯水qsad                    69.3                          赋形介质
与原制剂(制剂I)相比，对改进的制剂III的改变包括以公知的具有很长的安全使用历史和重要地位的防腐剂和共溶剂-苄醇取代2-乙基-1，3-己二醇。苄醇的液体性质和类似的功能使得对乙基己二醇的取代具有合理性和低冒险性。总的表面活性剂的水平降至5％活性而不改变产品的药学性质，显微镜检查对乳化质量无负作用，促进化试验中无物理稳定性的丧失。蔗糖可可脂酸酯被发现不是必须的，并且可被删去。
乳剂的制备可按原有的顺序进行，加热后加入组分，或通过优选的方法进行，先将油溶性组分合并，分别加热油溶性组分和水溶性组分，然后将热的油溶性组分加到热的水相中，同时剧烈混合。
表4总结了被评估的最重要的制剂。
表4
制剂(％组成)
组分                 I      II      IA      III      功能/基本原理
正-二十二烷醇       10.0   10.0    10.0     10.0     活性药物物质
蔗糖硬脂酸酯        11.0    6.0    11.0      5.0     乳化剂，润肤剂
蔗糖可可脂酸酯       5.0    5.0     5.0      --      乳化剂，润肤剂
蔗糖二硬脂酸酯      --      5.0      --      --      乳化剂，润肤剂
矿物油NF             8.0    8.0     8.0      8.0     润肤剂
丙二醇               5.0    5.0     5.0      5.0     共溶剂，辅助防腐剂2-乙基-1，3-已二醇       2.7    --      --       --      共溶剂，辅助防腐剂
聚氧丙烯基-十八烷  --    2.7     --     --        共溶剂，辅助防腐剂
基醚
苄醇NF             --    --      2.7    2.7       共溶剂，防腐剂
纯水qs ad         58.3  58.3    58.3   69.3       赋形介质
改进了的正-二十二烷醇制剂III通过了促进物理稳定性筛选(42℃储存；冷冻-解冻循环)，也通过了(美国药典)USP防腐有效性试验。在几内亚猪疱疹模型中的药效是在重复的场合下被证实的。
为控制稳定性，正-二十二烷醇的乳剂制剂被保存在不同的条件下，于室温(30℃)，在升高的温度下(42℃)和在聚丙烯罐子中的冷冻-解冻条件下。冷冻-解冻样品经过48小时冷冻-解冻循环，即：24小时在冷冻温度(-15℃)和24小时在室温的温度下。贮存于各种相应条件下的乳剂样品，在各种时间点上目视检查其物理稳定性。在30℃下、12个月，42℃下、3个月或24个冷冻-解冻循环后所有样品保持为米黄色乳剂。没有脱水收缩或相分离的迹象，根据以上视觉检查，含10％正-二十二烷醇的乳剂制剂III被认为在任何所述存储条件下都是物理稳定的。
制剂III的精确的货架寿命还未确定，但经验告诉我们，这种货架寿命足以满足对含正-二十二烷醇的商品乳剂的要求。
为在实验动物模型中验证正-二十二烷醇乳剂对HSV所至伤害的有效性，及比较其与ZOVIRRAX的活性，给几内亚无毛猪接种1×106PFU的HSV-1，然后以含正-二十二烷醇的乳剂或对照乳剂或ZOVIRAX软膏处理。正-二十二烷醇乳剂具有所述构成。空白乳剂除将正-二十二烷醇换成硬脂酸外，其余构成与正-二十二烷醇乳剂相似。在病毒接种后的2小时或48小时开始治疗，以水泡形成充脓的水泡作为标准，在指定的时间点对感染部位进行评估。
图1展示了制剂I和制剂II的三种不同制品以及ZOVIRAX的活性比较。正-二十二烷醇的制剂I和制剂II乳剂都显示出了比ZOVIRAX软膏大的抑制能力。
图2展示了制剂I，制剂IA和制剂II的活性比较，所示三种制剂都被证明能有效地抑制HSV-1所至伤害。
图3展示了制剂III对制剂I的活性比较，同时也描述了对这些制剂的某些改变，其中将制剂I中的表面活性剂浓度进行了改变，发现表面活性剂浓度的改变会对药物活性程度有相当的损害作用。制剂III显示出对HSV-1所至伤害有强有力的抑制能力。
有复发口腔或生殖器HSV-I或II感染的患者志愿者在急性疱疹发作的各个不同阶段以含正-二十二烷醇的局部用乳剂治疗。当在前驱症状阶段开始治疗时，正-二十二烷醇乳剂一般能抑制感染的进一步扩展(即：阻止水泡形成)。当水泡已经形成后开始治疗时，正-二十二烷醇乳剂能极大地缩短(例如缩小了50％或更多)治愈这种水泡伤害的时间(即：完全的上皮再生成)。在迄今为止的100例以上被治疗的口腔或生殖器患者案例中，观察到大于95％的治疗有效率。
因此，尽管绝大多数的正-二十二烷醇制剂是不稳定的，特别的制剂优选制剂III被发现既稳定又有效。
对制剂中的10％正-二十二烷醇的选择是通过对几内亚无毛猪的剂量-应答研究来确定的。如前所述给几内亚无毛猪的背部接种HSV-2，接种部位以1％，5％，10％和20％的正-二十二烷醇制剂处理。不含正-二十二烷醇的赋形剂对照物也被纳入研究。如图4所描述，结果表明，在病毒接种72小时后，未治疗处理的感染部位具有平均41个水泡。以20％和10％的含正-二十二烷醇乳剂治疗，则水泡数分别被抑制了50％和60％。含1％和5％的正-二十二烷醇乳剂比10％的制剂的效果差。对照赋形剂没有明显的抑制效果。
在配制憎水和亲水化合物的乳剂领域中的技术人员将会意识到可以进行某些取代。例如，在稍调整一下比率的情况下，可使用甘油或另一种二醇化合物来替换丙二醇。其它以聚氧链烯为基础的醚也可用来替换聚氧丙烯-十八烷基醚。基于糖基酯的相对比例可以有很大的变动，只要存在的糖基酯的总量足够使正-二十二烷醇稳定。这个量被认为是在大约5％到大约25％(重量百分比)之间，不过精确的最大值和最小值还未确定。
现行的最优选的正-二十二烷醇制剂是制剂III，它含有10％正-二十二烷醇，5％蔗糖硬脂酸酯，8％矿物油NF，5％丙二醇USP，2.7％苄醇NF和69.3％的纯化水。
由于有报导说苄醇在一定环境下具有一些抗病毒活性(Farah，A.E.等，美国专利号4,200,655)，本发明的制剂被测试以确定苄醇在制剂中是否起抗病毒剂的作用。我们检验了含苄醇和正-二十二烷醇的乳剂(10％正-二十二烷醇乳剂)和只含苄醇的(安慰剂)乳剂对几内亚无毛猪HSV-2所致皮肤损伤的作用，给几内亚猪的背部接种HSV-2，感染部位按图5所示治疗，在病毒接种48，56，72和78小时后对水泡形成进行评估。在48小时，在未处理部位平均有44个水泡并保持相对恒定直至感染后72小时。在78小时，伤害的消失开始变得明显，在96小时，接种后的水泡再无法见到。以正-二十二烷醇乳剂的治疗在48～56小时抑制水泡数达到50～60％。在72～78小时，抑制水泡数稍有上升。以对照赋形剂治疗时，在任何时间对水泡数目均无明显效果。将未治疗的和治疗的部位切下并处理后作病毒培养。水泡的存在直接与感染病毒的存在相关，而与治疗与否或分析时间(未示出)无关。因此，水泡数目在此中描述的研究中是疾病状态的一个适当的指示剂。另外，乳剂和安慰剂在II期引导研究中被测试，该研究包括68个患疱疹嘴唇的患者。双盲试验结果表明，早期使用正-二十二烷醇乳剂使病程几乎减半。治疗组的平均发作期为3.4天，而安慰组的平均发作期为6.6天，上述结果表明，在制剂中存在正-二十二烷醇对有效的抗病毒作用是必须的。
正-二十二烷醇的抗病毒活性在正-二十二烷醇于非离子表面活性剂pluronic F-68中的悬浮剂制剂中也被证明，其中不含有10％正-二十二烷醇乳剂制剂中的任何赋形剂，包括苄醇在内。图6中总结的结果证明了重要的两点。第一，如A组所示，正-二十二烷醇于pluronic F-68中的悬浮剂制剂在病毒感染2小时后使用也能抑制HSV-I所致水泡，正如在乳剂制剂中所观察到的。因此，未治疗部位在病毒感染48小时时具有平均74个水泡，但在用正-二十二烷醇/F-68治疗的部位仅观察到28个水泡(63％抑制率)。采用现行人感染HSV后所选择的治疗，即ZOVIRAX治疗，也有水泡数目下降，但比用正-二十二烷醇时下降得少。连续以正-二十二烷醇治疗也导致在72小时时更少的水泡。用于正-二十二烷醇制剂的赋形剂对照物在任何时间点上均无效。
从图6得来的第二个要点是，正-二十二烷醇加速HSV-I所致疾病的治愈，即使是在水泡出现后使用(B组)。各个部位在48小时都显示了几乎相同数目的水泡，这是可以预见的，因为它们在那时都未被治疗。在未被治疗部位水泡数目从48小时的平均73个降至72小时的43个。以ZOVIRAX治疗在72小时时表现出中等程度的加速疾病消失(27个水泡，与未治疗部位相比下降了37％)，这与其它相似设计的实验相一致。重要的是，应用正-二十二烷醇/F-68显著地使水泡消失，如示出的，与未治疗组相比抑制了77％的水泡数。相同的结论在相同设计的实验中使用乳剂制剂而得到。这表明正-二十二烷醇不必预防性地使用来改变HSV所致疾病的过程。
三个安全性和耐受力研究是在健康的高加索男性和女性志愿者身上进行的。总共78个健康志愿者暴露于药物之下。安全研究表明，正-二十二烷醇10％乳剂制剂似乎没有引起光毒性，但它仍是温和的初级刺激剂，虽然发病率较低，它还是有可能引起过敏性敏化作用(78个暴露者中的一个经历了接触性皮炎)。
二个临床有效性研究已经完成。研究A是对63个(男性和女性)复发性嘴唇疱疹患者的随机、双盲的、安慰剂作对照的2期研究。在A研究即嘴唇疱疹研究中，所有31个用10％正-二十二烷醇乳剂治疗的患者完成了他们的治疗。这31个患者中的2位在使用该乳剂后报告有灼烧或刺痛的感觉。在任意研究中均未显示出在临床实验室数据(血液化学，血液学和尿样分析)中有临床上显著的变化。研究B是对44个女性复发性生殖器疱疹患者的随机的、双盲的、安慰性作对照的试验。在B研究即生殖器研究中，所有22个用10％正-二十二烷醇乳剂治疗的患者完成了她们的治疗且无与药物相关的不利事件的报告。
研究A
65个患者(年龄18～60岁)参与了研究A，32个患者开始随机地接受10％正-二十二烷醇乳剂治疗，而33个患者开始随机地接受安慰剂乳剂。治疗是患者开始的，若治疗在前驱症状或红斑阶段开始，则定义治疗开始为“早”，若治疗在丘疹阶段或更晚开始，则定义治疗开始为“晚”。两个患者被排除于分析之外。63个评估的患者中，有22个患者进入研究的交叉期。另外有13个患者以同样的研究药物治疗了多于一个案例(episode)。因此，总共分析了98个疱疹案例，其中，48个给以10％正-二十二烷醇乳剂治疗，50个给以安慰剂乳剂处理。
根据表5中所列第一治疗案例，交换治疗和所有治疗案例，总结了研究A的结果。
表5
研究A：复发性嘴唇疱疹案例治愈的时间(天)A部分：第一案例的分析：
              10％正-二十二烷醇                     安慰剂
         均值   标准偏差(SD)  数目(n)   均值   标准偏差(SD)  数目(n)早期治疗    2.5        2.4          (10)       6.8         4.2         (4)晚期治疗    6.8        3.2          (21)       7.3         2.7         (29)所有治疗    5.4        3.6          (31)       7.3         2.8         (32)B部分：交叉研究的分析：
               10％正-二十二烷醇                    安慰剂
      均值    标准偏差(SD)    数目(n)    均值     标准偏差(SD)    数目(n)早期治疗  2.7        2.2            (7)       7.0                       (1)晚期治疗  5.6        2.1            (15)      8.0         2.6           (21)所有治疗  4.7        2.5            (22)      8.0         2.5           (22)C部分：研究中所有治疗案例的分析：
                10％正-二十二烷醇                  安慰剂
      均值    标准偏差(SD)    数目(n)    均值     标准偏差(SD)    数目(n)早期治疗  3.4        3.0           (13)       6.7        3.9             (7)晚期治疗  6.5        2.7           (35)       7.4        2.7             (43)所有治疗  5.7        3.1           (48)       7.3        2.9             (50)
31个患者用10％正-二十二烷醇治疗了他们的第一案例的嘴唇疱疹，32个患者用安慰剂(A部分)。正-二十二烷醇组中的10位患者和安慰组中的4位患者被划分为早期治疗。在早期治疗的正-二十二烷醇组中平均治愈时间是2.5天，与其它治疗方法相比治愈的平均时间降低了4.3～4.8天。这种差别具有极高的统计学意义(p＝0.0001)而有利于正-二十二烷醇。在晚期治疗组中，正-二十二烷醇对第一案例的平均治愈时间降低了0.5天，这在统计学上是没有意义的。
对进入交叉研究的22名患者，在两部分研究中都参与早期治疗他们的损伤(7名在交叉期使用正-二十二烷醇，1名使用安慰剂)的人数太小，因而不具有统计分析的意义(B部分)。然而，有实在数量(15名在交换期使用正-二十二烷醇，和21名使用安慰剂)的患者进行晚期治疗他们的损伤，因此，使患者间在这方面的比较成为可能。对各种晚期治疗的结果分析揭示了一个有利于正-二十二烷醇的显著性差异(p＝0.03)。
一起评估来自研究A的总共98个治疗案例的数据(使用相同药物的单一案例，交叉案例和附加案例)揭示了统计学有意义的(p＝0.02)总治愈时间的降低，即1.6天，它得自正-二十二烷醇治疗(5.7天)对安慰剂处理(7.3天)的患者(C部分)。在总共20个分类为早期治疗的案例中，局部使用的正-二十二烷醇降低了平均治愈时间3.3天(p＝0.05)。最后，当以正-二十二烷醇进行早期治疗的效率与所有其他治疗方法相比较时，在早期治疗的正-二十二烷醇组的平均治愈时间(3.4天)与其它组中的6.5到7.4天的范围有显著的差异；该差异是对正-二十二烷醇有利的极有意义的(p＝0.0002)。在用正-二十二烷醇(10％)的晚期治疗和用安慰剂处理的早期和晚期治疗之间无显著性差异。
如表5中总结的数据所证明的，以10％正-二十二烷醇乳剂的早期治疗(在前兆或红斑阶段)与用其他治疗所得结果相比能导致治愈时间的极大缩短。另外，始于损伤出现之后的晚期治疗在研究的交叉部分用正-二十二烷醇治疗的小组中，导致了统计学上有意义的治愈时间的降低，而在其他分析中则没有。
研究B
在第一临床研究中，60名女性复发性生殖器疱疹的患者在无症状及在非前兆阶段进入研究。30名初始随机地接受10％正-二十二烷醇乳剂，30名接受安慰乳剂，该试验的开始是由患者决定的，是对早期复发性生殖器疱疹的治疗。44名开始治疗的患者带着疱疹案例被返回临床；这些患者中的22名接受了正-二十二烷醇，22名接受了安慰剂。
16个可评估的正-二十二烷醇患者的平均治愈时间为4.7天±1.9，范围为从1.8到8.6天；对18个可评估的安慰剂患者，治愈完成在平均5.1天±2.3，范围为从1.7到10.4天；这种差异没有统计学意义(p＝0.5827，t-检验)。无生殖器损伤，无(疾病)主诉，用药间断，无可观察到案例的先兆，或有并发酵母菌感染的患者被认为没有可评估价值。当包括所有患者时，正-二十二烷醇组的平均治愈时间为5.5天±2.5，范围为从1.8到9.8天；对安慰剂组，治愈在平均4.7天±2.3时达到，范围为1.7到10.4天。在2个治疗组之间平均治愈时间之差异没有统计学意义(p＝0.2703、t-检验)。当根据治疗开始时患者的损伤阶段进行分类时(前兆，红斑或丘疹)，各治疗组之间的差异也无统计学意义。根据患者定标的平均治愈时间与根据临床医师的相似(对所有正-二十二烷醇患者的5.6天和对所有安慰剂患者的4.5天)。
根据患者对自我评估的疼痛进行了三种疼痛分析：对持续“无痛”的时间；第一次“无痛”的时间；和第一次疼痛减轻时间。持续“无痛”的时间是从在使用药物后第一次疼痛的时间到当1)疼痛被记录为“无痛”至少2个连续的记录的时间和2)在案例的其余部分，再次疼痛记录并不更频繁和比2个连续的“中等程度”疼痛的记录的分别案例不更严重的时间来测得的。第一次“无痛”的时间被定义为从使用药物时的第一次疼痛到“无痛”的第一次记录之间的间隔。第一次疼痛减轻时间是从在使用药物时的第一次疼痛到当相对于前面的评估疼痛水平的减低被注意到的第一次时间来测得的。一些患者被排除在这些分析之外，同为他们或者在第一个24小时内没有疼痛，或没有报告疼痛的主诉。
15名用正-二十二烷醇治疗的可评估的患者比14名安慰剂患者早达到“无痛”的持续响应：正-二十二烷醇的患者的平均3.2天±1.9与安慰剂患者的4.1天±2.5相比较。正-二十二烷醇患者达到“无痛”也比安慰剂患者快。正-二十二烷醇患者第一次记录“无痛”是在疼痛发作平均2.6天±2.1时，而安慰剂病人第一次报告“无痛”是在疼痛发作平均3.4天±2.1时。在可估价的正-二十二烷醇患者中，相对于在用药之前的疼痛，第一次疼痛的减轻发生于疼痛发作后平均1.2天±1.0。发生于安慰剂患者的第一次疼痛减轻在平均1.8天±1.4。这些差异并无统计学意义(分别为p＝0.2775，0.325和0.1757，t-检验)。无生殖器损伤，无主诉或用药间断，无可观察案例的先兆和并发酵母菌感染的患者被认为没有可评估价值。
根据它是有效的局部疼痛减缓剂的惊人发现，本发明包括减少皮肤和膜表面炎症的疼痛的方法。该方法包括对炎症表面使用至少含有一个长链脂肪醇的组合物，长链脂肪醇含20到28个碳原子，选自正-二十烷醇，正-二十一烷醇，正-二十二烷醇，正-二十三烷醇，正-二十四烷醇，正-二十五烷醇，正-二十六烷醇，正-二十七烷醇，和正-二十八烷醇或它们的混合物。该醇在生理相容性的载体中。所述醇占所述组合物的重量百分比为大约5％到大约25％。优选的，生理相容性的载体是乳剂基质，它包含一个或多个选自蔗糖可可脂酸酯，蔗糖硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯的化合物及一个或多个选自聚氧丙烯-十八烷基醚，乙基己二醇和苄醇的化合物。
虽然在研究B中接受10％正-二十二烷醇乳剂治疗的患者与接受安慰剂乳剂处理的患者的治愈时间之间没有发现有统计学意义上的差异。不过在以正-二十二烷醇治疗的可评估患者中有趋向于降低治愈时间的趋势。三种不同的疼痛分析都显示了接受正-二十二烷醇10％乳剂治疗的患者有更快的疼痛消失；虽然没有统计学上有意义的差异。在该研究中，不能检测到统计学显著性可能部分反应了(1)研究总数小；(2)就疱疹生殖器损伤自然历史而言二个研究组之间的研究记载的差异；和(3)在案例和治疗开始时二组损伤阶段之间的一个不相等的分布。
除了临床研究之外，还进行了一些研究以阐明正-二十二烷醇的药理学。这些研究导致了图7～13所描述的数据，并讨论如下。
为了研究正-二十二烷醇的生化活性，较难克服的障碍之一是开发一种能够使化合物可接收地释放到生物体系中的适当的制剂。开始时，这是通过在惰性，无毒的非离子性表面活性剂，pluronic F-68中配制憎水化合物的悬浮液来完成的。这种悬浮液被证明在质量上是均相的并由含平均粒度0.10微米的正-二十二烷醇组成。以这种方式悬浮的正-二十二烷醇具有极佳的在体外对猿和人类细胞的I型和II型单纯性疱疹病毒(HSV)传染性的抵抗作用。重要的是正-二十二烷醇/Pluronic悬浮液可以同样有效地抵抗野生型的HSV和抗无环鸟苷的HSV突变体。因此，如图7中A组所示，无环鸟苷和正-二十二烷醇都一样抑制由野生型HSV-2所致的菌斑形成。图7B组描述了抗无环鸟苷的HSV-2突变体如预期的那样不能对无环鸟苷产生应答，但明显地对正-二十二烷醇的抑制活性敏感。在两组中的最后一条描述了单独的pluronic表面活性剂缺乏任何抗病毒活性，甚至用300mM正-二十二烷醇也未观察到宿主细胞毒性。
用于这些组织培养研究中的显然是非常高剂量的正-二十二烷醇值得特别说明。这实际是在体外系统中的人为现象，是源于分子从颗粒悬浮剂到附着细胞的限制性释放。转移可能有几种原因而被限制。第一，这类悬浮剂的密度使绝大多数的颗粒朝上飘浮。结果，在组织培养孔中产生出了一种物理化学人为现象，为得到释放生物活性剂量到贴壁的靶细胞单层所需的液体动力学梯度，这种组织培养孔需要高周围量的悬浮药物。其次，将正-二十二烷醇分子从热力学稳态颗粒转移到培养细胞中预期不是一种有效过程。如摄入研究所示，在这些培养物中，正-二十二烷醇的实际生物活性剂量是图7和9所示剂量的1/1000，实际上可将所示的mM数简单地转译为μM。
在组织培养系统中的抗病毒活性并不总是转译为在整体动物或人体研究中的药效。因此，我们检查了用于人类的局部乳剂在治疗HSV-2所致的几内亚猪的皮肤损伤活性(该乳剂专门设计了使皮肤渗透力增至最大和使潜在的局部刺激反应降低到最小)。HSV-1或2用纹身器具接种于几内亚无毛猪的背部皮肤，这些接种部位或不作处理或以不同浓度的含正-二十二烷醇的乳剂或对照赋形剂处理，治疗是在接种2小时后进行的，然后在24，36和48小时再进行。接种后56和72小时在接种部位计数水泡的形成，分别代表疾病的蜂期和消失期。图8中所示数据表示检测浓度为1％，5％，10％和20％的正-二十二烷醇乳剂抑制HSV-2所致几内亚无毛猪皮肤损伤的剂量-应答研究。与10％含正-二十二烷醇制剂相对应的安慰剂也包括在这个实验中，用该安慰剂得到的数据描述于线状图的上方的水平柱栏中，数据点用箭头指出。仅72小时时间点的数据被示出，但在早些时间观察到相似的抑制形式。如所示，这个正-二十二烷醇的局部制剂具有很好的抗病毒活性；最优的抑制活性是用10％乳剂得到的(60％抑制率)，用20％的制剂观察到基本上相当的活性。20％乳剂的稍低的抑制活性能恒定地观察到，最可能是与正-二十二烷醇分子的憎水性所引起的表面活性剂的饱和相关。有证据显示，乳剂在皮肤上消失所需的时间较长(未示出)。含5％和1％正-二十二烷醇的乳剂显然比10％的制剂有效性低，与10％乳剂相比安慰剂绝对没有活性。虽然未示出，用HSV-1所致几内亚无毛猪皮肤损伤的模型已得到相当的结果。因此，10％正-二十二烷醇乳剂在降低HSV所致几内亚猪皮肤损伤中是有效的。
已进行了广泛的研究用于描述正-二十二烷醇发挥其抗病毒活性的机理。研究结果的总体含义是化合物看来干扰病毒进入细胞并迁移到被感染靶细胞的细胞核的一条或多条常见途径。支持这种说法的证据的关键点可总结如下：(a)化合物无直接杀病毒活性，因为病毒可与正-二十二烷醇悬浮液混合，然后从悬浮液中分离出来并显示保留了正常传染性；(b)虽然化合物并不干扰疱疹病毒与靶细胞上的HSV特异性受体结合，在正-二十二烷醇存在下结合于靶细胞受体的HSV病毒粒子可以在细胞表面停留延长的时间；和(c)被内在化的病毒随后的向细胞核的迁移被极大地抑制了，这已被可测得的HSV核心和包容蛋白，表达直接早期蛋白ICP-4的细胞数，和二级菌斑分析所测。
上面所描述的病毒内在化的延迟在图9所总结的实验中已被说明。在这个实验中，HSV-2在4℃，在正-二十二烷醇存在或不存在下与Vero细胞一起温育，使受体与病毒结合。在3小时末，所有培养物被清洗，然后在37℃再培养以便起始病毒进入过程，在20分钟间隔后，在除去和去活化表面束缚的，但未使HSV病毒粒子内在化的条件下，将各种培养物暴露于pH3.0的柠檬酸盐缓冲液中，然后重新培养，时间为发展最优HSV菌斑所需的全部44小时。如预期的，所有在“0”时暴露于柠檬酸盐缓冲液的培养物都没能发展菌斑。如图中最上面的线所示，在未处理的和pluronic对照-处理的培养物中HSV-2的内在化在变到37℃后于20分钟内基本上已完成。相反的，在正-二十二烷醇处理的培养物中HSV的内在化在20分钟时完成不足40％，且需要多于1个小时才达到完成。这些结果清楚地表明病毒融合和/或跨膜迁移被正-二十二烷醇以某种方式延缓了。
在正-二十二烷醇处理的细胞中甚至在内在化达到完成后，紧接着的病毒向细胞核的迁移被极大地抑制了。因此，HSV核及通过ELISA可检测的包容蛋白抗原的量以及通过免疫荧光法表达核间HSV-特异性直接早期蛋白，ICP-4的感染细胞数目下降大于80％。最后，在正-二十二烷醇处理的细胞中，在二级菌斑分析培养物中测得的传染性病毒粒子的复制显著地下降了99％或更多。
总之，正-二十二烷醇的存在对病毒结合的初始步骤无作用，但它相当大地延缓了病毒通过一些仍需确定的机理进入靶细胞胞质。另外，迁移到和定位于核的过程被极大地阻碍了。最终效果是病毒复制生产的显著下降。
为了更好地定义正-二十二烷醇发挥其抗病毒活性的精确机理，我们最近研究了以表面活性剂稳定化的正-二十二烷醇悬浮液的细胞摄取，分布和代谢。这一研究结果对研究化合物抗病毒作用的代谢基础提供了一些有趣的视点。第一，我们能够表明放射性标记的正-二十二烷醇会逐渐并入培养的Vero细胞，在暴露后6和12小时间达到每细胞的峰值摄取量。这一过程是不可逆的，因为一旦化合物与细胞结合后，甚至在用溴化铯强化冲洗也不能除去它，而溴化铯是能有效地除去非专一性结合的细胞束缚粒子。
第二，在饱和浓度下24小时内，加入培养物的低于1％的全部正-二十二烷醇会变成细胞结合的。然而，这相应于将近8×109个分子每个细胞，是一个惊人的量，与质膜中典型的磷脂分子的数目接近。在加入培养物的悬浮液中的少部分正-二十二烷醇变成细胞结合的这一事实说明实际的生物活性剂量比加到培养物中的药物的量要小几个数量级。
检查从以超声破坏细胞的差速离心机分离得到的亚细胞部分的细胞分布研究证明在暴露12小时后，细胞膜中含有75％的放射性化合物，并且不到1％与核部分相连；放射活性的平衡与胞质的可溶性部分有关。
正-二十二烷醇的代谢转化分析表明化合物是被逐渐代谢为极性化合物。薄层层析证明其为磷脂，或由合成代谢(醚连接)或降解代谢(氧化)反应生成。图10表示了正-二十二烷醇处理过的Vero细胞提取物在硅胶柱上的甲醇洗脱液组分(含磷脂)的薄层层析分析。未代谢的正-二十二烷醇先被从硅胶柱中用氯仿洗脱掉。如图所示，约62％的点数迁移在磷脂酰胆碱区，38％迁移在磷脂酰乙醇胺区。我们的研究表明这种代谢转换能够被适当的代谢抑制剂所阻滞。因此，有效能量毒化叠氮化钠，2-脱氧葡萄糖既降低Vero细胞对正-二十二烷醇摄取的90％又降低代谢转换为极性代谢物的80％。有可能叠氮化钠和2-脱氧葡萄糖的组合主要通过抑制细胞摄取作用来抑制正-二十二烷醇的细胞摄入。然而，其它的摄取机理包括一个能量依赖的融合机理，或一个由正-二十二烷醇的紧接着的能量依赖代谢所促进的被动扩散机理，也能被这些能量毒素所抑制。
这些研究的一个有趣的方面是表明了在化合物的抗病毒活性中正-二十二烷醇极性代谢物的一个可能作用。最近已证明，鼠的成纤维细胞对聚乙二醇所致融合的抵抗与游离脂肪醇的增加和甘油酯，包括一种醚连接的化合物的增加相关，该醚连接的化合物是如上所述的正-二十二烷醇通过代谢转换得到的产物类似物。因此，我们施行了实验来研究正-二十二烷醇的酶促转化是它的抗病毒活性的必须先决条件的可能性。这些研究的结果已证明，首先，正-二十二烷醇变成它的极性代谢物的代谢转换速度和程度，而不是它的细胞摄取，是由用于悬浮化合物的表面活性剂的性质所决定，以及，事实上，代谢转换的功效直接与正-二十二烷醇的抗病毒活性的大小相关。
在施行这种研究的最初一步涉及选用一种不同的表面活性剂用于悬浮正-二十二烷醇、Tetronic908与pluronic F-68紧密相关；两个都是环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物。然而，pluronic是一个双功能分子量为8,400的聚合物，Tetronic908是一个四功能共聚物，通过将环氧丙烷和环氧乙烷加入乙二胺而制得，得到平均分子量为25,000的分子。在其它事情中，当Vero细胞暴露于同剂量的悬浮于Tetronic和pluronic中的正-二十二烷醇，Tetronic的化合物代谢成为极性代谢物的速率和程度比在Pluronic悬浮液中要高许多。在两种不同悬浮制剂中的放射性正-二十二烷醇的总摄取量是相同的。仅代谢转含有极大的不同。与这个在Tetronic悬浮液中比在Pluronic悬浮液中要高的代谢转换相关的是发现正-二十二烷醇抑制HSV复制的ED50在Tetronic中是5-10mM，在Pluronic中几乎高3倍。这看来与用在Tetronic中的正-二十二烷醇治疗的细胞中的3倍高代谢转换水平相关。
为消除这些发现是对Vero细胞培养物系统特异的可能性，我们做了重复分析而利用这样的事实即：和Vero细胞相比类上皮小牛肾细胞系MDBK，显示出有趣的对正-二十二烷醇的抗HSV活性的明显的抵抗力。这种差异是显著的因为正-二十二烷醇在抑制Vero细胞中HSV所致菌斑时要比在MDBK细胞中有效3-4倍。当我们比较总的细胞摄取和相对代谢时，结果惊人地清晰。第一，在Vero细胞中的正-二十二烷醇的摄取总量和相对代谢转换量都比在MDBK细胞中要高3-4倍。在MDBK中比在Vero细胞中的摄取降低和代谢降低的结合效果以曲线方式描述于图11，它明确地示出在72小时后，Vero细胞在溶剂体系中的初始点含有几乎4倍量高的磷脂代谢物。然而，就两个细胞系中代谢的点数，在所形成的主类的磷脂代谢物中，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的相对量，在二个细胞系中无差别。进一步而言，脉冲追综实验表明二个系最终将所有的结合点都转换为更极化的形式。这些结果表明，MDBK细胞可能通过一种反馈型机理有效地调节对正-二十二烷醇的摄取和代谢，而该机理对Vero细胞或低效或不可行。
与上面总结的机理观察相一致，我们预计正-二十二烷醇可能具有潜在的干扰各种不同病毒的能力，尤其对那些在它们的外膜含磷脂的并使用融合机理进入易感染靶细胞的病毒。表5总结了人体和鼠的磷脂膜病毒，至今，它已显示出对正-二十二烷醇的抗病毒活性是敏感的。
表6
正-二十二烷醇*抵抗磷脂膜病毒的抗病毒活性谱
人体病毒                        鼠病毒
单纯性疱疹病毒-1和2             细胞肥大病毒
水痘带状疱疹病毒                Friend白血病病毒
人体疱疹病毒-6                  LP-BM5病毒
呼吸道合胞体病毒
细胞肥大病毒
流感A
HIV-1
*或至少一个含有20到28个碳原子的长链脂肪醇，例如：正-二十烷醇，正-二十一烷醇，正-二十二烷醇，正-二十三烷醇，正-二十四烷醇，正-二十五烷醇，正-二十六烷醇，正-二十七烷醇和正-二十八烷醇或它们的混合物，正-二十二烷醇单独使用或与其它这种醇混用被作为模型。
每个所测试的磷脂膜病毒可以有效被这药物所阻滞。与它的抗磷脂膜病毒的同一有效性相反，该药物对脊髓灰质炎病毒和呼吸道肠道病毒没有可测得的活性，二者是我们用于检测对化合物的敏感性的非膜性病毒。
正-二十二烷醇在体内和体外都有抗反转录病毒活性。一种具有抗反转录病毒活性和无毒性的制剂会对治疗人体或家养动物的各种反转录病毒疾病有实质性的用处。尽管未牵涉AIDS的治疗，但由反转录病毒，如猫白血病毒，小牛白血病毒和HTLV-1和2引起的疾病的可行的治疗方案在人道主义的意义上是实质性有意义的。我们的研究已明确了正-二十二烷醇确实在体内和体外抑制鼠反转录病毒的复制。
初始研究集中在鼠Friend白血病病毒(FV；8)。对成年鼠接种FV导致红细胞系祖代细胞，尤其是嗜碱性成红细胞的白血病诱发。这种红白血病的特征在于病毒感染的红细胞系细胞的快速繁殖，和毒血症，免疫抑制和最终动物死亡。静脉注射FV将循环通过造血器官，例如脾，感染红细胞系细胞。若这被感染的脾在病毒感染10天后治愈，分散的微观小结能够在器官表面上可被看到；这些代表白血病细胞的克隆且形成了以脾为中心的分析基础。
图12中所总结的实验说明了正-二十二烷醇抑制静脉注射了75病灶形成单位的Friend病毒的成年鼠的Friend病毒所致白血病和病毒血症。治疗组在病毒接种同天和在其后的三天每天一次静脉注射了不同剂量的正-二十二烷醇或仅Pluronic赋形剂。十天后，每组中一半数目的动物被杀死，检查它们脾中白血病病灶的存在，而剩余的动物保持另外十天来检测病毒血症。用正-二十二烷醇治疗的示出了一个非常明确的对白血病病灶的发展(示于表A)和病毒血症的发展(示于表B)的剂量相关抑制作用。相反，以相应量的仅Pluronic赋形剂作为对照的未示出可辨别的效果。我们相信这些结果反映了正-二十二烷醇对病毒复制的抑制活性，因为体外的推论研究证明这药物对在胚胎成纤维细胞前体培养物中的Friend病毒复制的抵抗有非常强的活性。
正-二十二烷醇在体外抑制HIV-1和人体疱疹病毒6的复制。我们最
初对HIV的研究是与美国国家健康实验研究院(U.S.National Institutes ofHealth Laboratory)合作的。几个这类实验中的一个实验总结于图13。正常的人体外周血液单核细胞以在介质中仅含1mg/mlPHA加上5单位/m1的IL-2或在正-二十二烷醇，Pluronic F-68对照赋形剂，或膦酰基甲酸(PFA)的存在下被活化。第二天，培养物接种HIV-1，四天后通过检测p24病毒抗原来检查病毒复制的证据。与在未处理组中观察到的相比，有实质水平的HIV-1复制存在于处理对照组中。如图所示，正-二十二烷醇展示出了对PHA/1L-2刺激的人体周边血液单核细胞培养物中HIV-1的一个剂量相关抑制活性。在最高剂量时的活性可与在非常强的抗病毒化合物，膦酰基甲酸(PFA)中观察到的相比较。因为这些最初的实验已经进行，我们在我们自己的实验室中重新进行了这些观察，结果显示在使用更有利的悬浮于Tetronic中的正-二十二烷醇制剂时有更高水平的抗病毒HIV活性。HIV-1对正-二十二烷醇的剂量响应指示出ED 50大约为6-9mM。
总之，最初在制备含有有效量的C-20到C-28的正脂肪醇(最优选基本上仅是正-二十二烷醇或其与其他这类醇的混合物)的困难已被克服且这些化合物的药理学已被阐明。作为一个组合物，本发明包括一种长期稳定的局部乳剂，该乳剂的货架寿命在正常储存条件下大于一年，即：在室温下稳定一年或更长，能够经受住重复的冷冻-融解循环，适用于治疗动物包括人类在内的皮肤或粘膜由病毒所致的和炎症的疾病。乳剂基本的成分是正-二十二烷醇，单独存在或是其与其他正长链(C-20到C-28)脂肪醇的混合物，生理学活性成分，水，油，糖和脂肪酸的酯，该酯为生理学惰性及能够被活体所代谢，和有助于正-二十二烷醇渗透到皮肤或粘膜的感染区域并与酯共同作用形成一个对生理活性的醇的稳定载体的润肤剂。糖基酯包括具有分子量大于大约150，最好为大约250的糖的部分和一个具有分子量大约150或更高，最好大于250的酯肪酸酯的部分。酯的分子量为大约400或更高。在这儿所用术语，糖是甜的或甜的碳水化合物，它是更高聚醇的酮或醛的衍生物，即：包括糖类又包括二糖类。二糖基酯是优选的。高分子量的多元醇可作为比更传统的糖稍差的等同物而被取代。
同时，可能对读者很明显的，药理学研究是用悬浮液进行的。悬浮液对这些研究中所用的细胞是更相容的，但不适于作为局部药剂，缺乏有效的局部治疗所需的体相和稳定性。
基于最终乳剂制剂的总重量(以重量百分比计)，通常优选的乳剂包括正-二十二烷醇，5-25％，或更优选的大约10％±5％，蔗糖硬脂酸酯0-15％，优选的大约为3-10％，和/或蔗糖可可脂酸酯，0-15％，优选的为3到10％，和/或蔗糖二硬脂酸酯0-15％，优选的为3到10％，至少一种蔗糖酯或相当量的糖基酯，含量为总组合物的大约3个重量百分比，优选的为大约10±5个重量百分比，油，如：矿物油NF3-15％，优选的大约为8％±4％，二醇，如：丙二醇USP或等同物，2-10％，优选的为大约5％±2％，一种润肤剂乙二醇醚，如：聚氧丙烯-十八烷基醚或苄醇，0～5％，优选的大约为2～3％和水40～70％，优选的大约为45％到65％。在这种一般制剂中，基于上面所示出的数据、在说明书中的讲授的精神和在说明书中提供的准则，将可以制备许多特别的制剂，它们稳定且显示出所示的治疗作用，本文提供第一种有效局部治疗组合物的基础，其中的治疗活性物质主要由正-二十二烷醇，单独的或其与正长链(C-20到C-28)脂肪醇的混合物组成。
工业应用本发明在制备药品和在治疗人类和动物患者时有用。

Claims (11)

1.一种适用于病毒和炎症疾病治疗的应用于皮肤和粘膜的治疗乳剂，该乳剂基本上由3％重量-15％重量的蔗糖酯表面活性剂、5％重量-25％重量的至少一种具有20至28个碳原子的长链脂肪醇、矿物油、润肤剂共溶剂和水组成，所述长链脂肪醇选自正-二十烷醇、正-二十一烷醇、正-二十二烷醇、正-二十三烷醇、正-二十四烷醇、正-二十五烷醇、正-二十六烷醇、正-二十七烷醇、正-二十八烷醇或它们的混合物，该乳剂在至少40℃的温度下保持至少3个月的时间和在重复冷冻-融解循环后仍是稳定的。
2.权利要求1的治疗乳剂，其中所述长链脂肪醇为正-二十二烷醇。
3.权利要求1或2的治疗乳剂，其中所述蔗糖酯表面活性剂包括至少一种选自蔗糖可可脂酸酯、蔗糖硬脂酸酯和蔗糖二硬脂酸酯的化合物，并且其中蔗糖酯的量为所述乳剂重量的至少5％。
4.权利要求1或2的治疗乳剂，其中蔗糖酯占乳剂重量的5％-15％。
5.权利要求1或2的治疗乳剂，其中润肤剂共溶剂选自聚氧丙烯-十八烷基醚、乙基己二醇、和苄醇、或它们的混合物。
6.权利要求1或2的治疗乳剂，其中所述正长链脂肪醇占乳剂重量的至少10％。
7.权利要求1或2的治疗乳剂，其组成为：至少一种长链脂肪醇，它占乳剂重量的5％到15％；蔗糖硬脂酸酯，它占乳剂重量的0％到15％；蔗糖可可脂酸酯，它占乳剂重量的0％到10％；和蔗糖二硬脂酸酯，它占乳剂重量的0％到10％；其条件是至少存在一种蔗糖酯且为乳剂重量的至少3％；矿物油，它占乳剂重量的3％到15％；苄醇，它占乳剂重量的0.5％到10％；和水，它占乳剂重量的45％到70％。
8.用于炎症或病毒感染预防或治疗的权利要求1或2的治疗乳剂，其组成为：
正-二十二烷醇       5～20％(重量)
蔗糖硬脂酸酯        0～15％(重量)
蔗糖可可脂酸酯    0％～10％(重量)
蔗糖二硬脂酸酯    0％～10％(重量)
其条件为至少存在一种蔗糖酯，其中蔗糖酯占乳剂重量的3％-15％，
矿物油                      3～15％(重量)
丙二醇                      2～10％(重量)
聚氧丙烯-十八烷基醚          0～5％(重量)
苄醇                        0～5％(重量)
其条件为存在聚氧丙烯-十八烷基醚或苄醇，且其含量为1％或更多；和
水                          40～70％(重量)
9.权利要求8的乳剂，其中蔗糖酯占乳剂重量的10％±5％。
10.权利要求1的乳剂在制备适用于治疗皮肤和粘膜的病毒感染和炎症的药物中的应用。
11.权利要求10的应用，其中正二十二烷醇占长链脂肪醇的一半以上。
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