CN110237232A - 太子参环肽b在改善记忆和/或防治老年痴呆症中的应用 - Google Patents
太子参环肽b在改善记忆和/或防治老年痴呆症中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了太子参环肽B在改善记忆和/或防治老年痴呆症中的应用,具体公开了太子参水提取物、太子参环肽类提取物、太子参环肽B对正常小鼠记忆增强作用和对侧脑室注射Aβ1‑42致痴呆小鼠学习记忆障碍的改善作用,并探讨其作用机制。结果表明太子参水提取物、太子参环肽类提取物、太子参环肽B可显著增强正常小鼠的认知记忆能力并改善痴呆模型小鼠记忆障碍,促进大脑皮层神经元突起再生、保护Aβ诱导的皮层神经元丢失和突起萎缩,结果提示太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物可能通过促进神经突起再生而重建神经回路网而起到改善记忆的作用,可用于制备防治老年痴呆症的药品或保健食品。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,更具体地,涉及太子参环肽B在改善记忆和/或防治老年痴呆症中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种长期进行性的神经退行性疾病,约占痴呆患者总数的60~70%,然而现在临床上用于治疗阿尔茨海默病的药物如胆碱酯酶抑制剂rivastigmine和NMDA受体抑制剂memantine属于对症疗法,不足以改善患者的记忆功能并且伴随着严重的副作用。中国痴呆患者人数居世界首位,据报道痴呆症患者在中国的人数2020年预计达到1410万人,2030年达到2330万人,给家庭和社会带来巨大的经济和护理负担。
老年痴呆病的发病机制至今尚未明确。但其发病机制有多种学说,如:β淀粉样蛋白(Aβ)学说、tau蛋白过度磷酸化学说等。(1)在正常情况下,大脑与脑脊液(cerebrospinalfluid,CSF)都可以释放Aβ,但是释放量少且利于清除,当睡眠不足,神经元受到损伤时候,可溶性Aβ释放量过大,而清除力度却不够,可溶性的Aβ蛋白就会慢慢沉积变成垃圾,并聚集成为Aβ纤维,进而诱发老年痴呆病。(2)Tau蛋白是含量最高的微管相关蛋白,过度磷酸化后会导致细胞维管系统丧失功能,破坏神经元微管结构,造成脑神经退行性病变,从而导致老年痴呆。然而传统的以Aβ和Tau蛋白为作用靶点设计的药物均以失败告终,说明疾病的发生机制与药物的治疗作用机制很可能是以不同的信号通路实现的,而仅仅抑制AD的病理因素不足以逆转其进程。Aβ寡聚体能够引起神经突起萎缩和突触丢失,启动并加速神经细胞死亡,最终导致神经网络的破坏和记忆损伤,而发明人的前期研究结果表明药物促进神经细胞轴突再伸长与改善AD记忆功能之间存在很好的相关性。因此,通过促进神经突起的再伸长从而达到神经网络的再构建可能是治疗阿尔茨海默病的关键。
太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Paxet Hoffm.的干燥块根。味甘、微苦,性平,归脾、肺经。具有益气健脾,生津润肺之功效。其主要成分有糖苷类、脂肪酸类、磷脂类、环肽类、挥发性成分和微量元素等。有报道显示,太子参多糖能够改善东莨菪碱所致小鼠记忆获得障碍。太子参肽类成分能够通过激活脾淋巴细胞Ca2+/CaN/NFATc1/IFN-γ信号通路起到免疫调节作用,太子参环肽B具有通过抑制PI3K/Akt信号通路改善LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7炎症和氧化应激的作用;但是关于太子参提取物,尤其是太子参环肽类提取物在神经系统方面的作用目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷和不足,提供太子参环肽B在制备改善记忆和/或防治老年痴呆症的药品和/或保健品中的应用。
本发明的另一目的在于提供太子参提取物在制备改善记忆和/或防治老年痴呆症的药品和/或保健品中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的:
本发明采用正常小鼠口服给与太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物,通过新物体认知记忆、空间记忆,测试其对小鼠学习记忆增强的作用。结果表明太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物可显著增强小鼠的认知记忆和空间记忆。
本发明采用侧脑室注射Aβ1-42致痴呆小鼠模型进行实验,通过新物体认知记忆、空间记忆,测试太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物对小鼠学习记忆能力的影响。结果表明太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物可显著改善小鼠认知记忆障碍及空间学习记忆障碍。
利用正常培养的小鼠原代大脑皮层神经元,发现太子参环肽B、太子参提取物具有促进神经突起再伸长的作用。利用Aβ建立神经元突起损伤模型,发现太子参环肽B及太子参提取物具有促进Aβ诱导的神经元突起萎缩再生的作用,对Aβ诱导的原代神经细胞损伤具有抑制作用。提示太子参环肽B可能通过促进神经突起再生和神经保护作用改善记忆和老年痴呆症,因此太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物可用于制备改善记忆和防治老年痴呆症的药品或保健食品。因此,下列所述关于太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物的应用均在本发明保护范围内。
太子参环肽B在制备改善记忆和/或防治老年痴呆症的药品和/或保健品中的应用。
太子参提取物在制备改善记忆和/或防治老年痴呆症的药品和/或保健品中的应用,所述太子参提取物含有太子参环肽B。
太子参环肽B在制备促进神经突起再生的药品和/或保健品中的应用。
太子参提取物在制备促进神经突起再生的药品和/或保健品中的应用,所述太子参提取物含有太子参环肽B。
具体地,是在制备由Aβ诱导的神经元突起萎缩再生的药品和/或保健品中的应用。
太子参环肽B在制备神经元损伤保护剂中的应用。
太子参提取物在制备促进制备神经元损伤保护剂中的应用,所述太子参提取物含有太子参环肽B。
具体地,是在制备由Aβ诱导的神经元损伤保护剂中的应用。
理论上,所以含太子参环肽B的太子参提取物都在本发明保护范围内;优选地,上述太子参提取物为太子参水和/或环肽类提取物;所述太子参提取物利用本领域常规的提取手段均可以提取得到。
优选地,所述太子参水提取物经过水提取得到,例如太子参水煎液;在水提取后进一步用以下方法纯化得到太子参环肽类提取物:有机溶剂萃取法、大孔树脂法、反相制备液相色谱法中的一种或多种。
本发明还提供一种太子参制品,是由太子参环肽B或含有太子参环肽B的太子参提取物及其药学上可接受的赋形剂或载体混匀制成临床上可接受的药物制剂,或者制成保健品、食品。
具体地,所述药物制剂为片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、酊剂、口服液、滴丸或注射剂。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供了太子参环肽B在改善记忆和/或防治老年痴呆症中的应用。本发明研究发现太子参水提取物、太子参环肽类提取物、太子参环肽B可显著增强正常小鼠的认知记忆能力并改善痴呆模型小鼠记忆障碍;促进大脑皮层神经元突起再生、保护Aβ诱导的皮层神经元丢失和突起萎缩,表明太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物可能通过促进神经突起再生而重建神经回路网而起到改善记忆的作用,可用于制备防治老年痴呆症的药品或保健食品。
附图说明
图1为太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物对正常小鼠认知记忆的影响。
图2为太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物对正常小鼠位置记忆的影响。
图3为太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物对侧脑室注射Aβ1-42致痴呆小鼠认知记忆的作用。
图4为太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物对侧脑室注射Aβ1-42致痴呆小鼠空间记忆的作用。
图5为太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物对Aβ诱导的神经元突起萎缩再生的作用。
图6为太子参环肽B对Aβ诱导的神经元损伤的保护作用。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1太子参水提取物的制备
太子参(产自福建省)干燥块根30g,加3L水提取一次,保持微沸状态1小时,过滤,滤液经冷冻干燥后得水提取物7.2g,收率为24%。
实施例2有机溶剂萃取法制备太子参环肽类提取物
太子参(产自福建省)干燥块根30g,加3L 95%乙醇提取一次,保持微沸状态1小时,过滤,滤液经减压干燥后得醇提取物。将醇提取物重悬于400mL石油醚中,室温搅拌溶解2次,弃去石油醚溶液,再加入400mL乙酸乙酯溶解萃取两次,合并滤液,减压干燥得总环肽提取物200mg,含太子参环肽B约10mg。
实施例3大孔树脂法制备太子参环肽类提取物
太子参(产自福建省)干燥块根30g,加3L 95%乙醇提取一次,保持微沸状态1小时,过滤,滤液经减压干燥后得醇提取物。用大孔吸附树脂柱富集,分别用水,40%乙醇,65%乙醇,90%乙醇梯度洗脱,收集65%乙醇洗脱液,减压回收乙醇,得到总环肽提取物235mg,含太子参环肽B约12mg。
实施例4制备高效液相色谱法制备太子参环肽B
太子参(产自福建省)干燥块根500g,加3L 95%乙醇提取一次,保持微沸状态1小时,过滤,滤液经减压干燥后得醇提取物。将醇提取物重悬于400mL乙酸乙酯中,萃取液减压浓缩,经硅胶柱层析,用二氯甲烷:甲醇(100:1~1:100)梯度洗脱后,合并相同组分洗脱物,再经ODS反向柱、制备高效液相(HPLC)等方法纯化,得到太子参环肽B 31mg。
实施例5太子参提取物中太子参环肽B的高效液相色谱验证
将实施例1、2、3所得到的太子参提取物经高效液相(HPLC)与实施例4中所得到太子参环肽B进行比较,显示其含有太子参环肽B。
实施例6太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物对正常小鼠认知记忆的影响
1、方法
将20只鼠(ICR,雄性)随机分为5组:对照组、太子参水提取物组(500mg/kg)、太子参环肽类提取物组(4mg/kg)、太子参环肽B(10μM/kg),每组5只。
太子参水提取物、太子参环肽类提取物和太子参环肽B混悬于生理盐水中,各组小鼠连续灌胃给药,给药体积为10ml/kg,对照组给予等体积生理盐水,直至实验结束。给药后第7天,进行小鼠自发活动实验,第8天进行小鼠新物体认知记忆训练,第10天进行新物体认知记忆测试,第15天进行物体位置记忆训练,第17天进行物体位置记忆测试,以上行为学实验均在给予相应药物或溶剂1h后进行,具体时间表如图1A。
自发活动测试:将小鼠放入自发活动装置中(长33cm,宽28cm,高26.5cm),摄像机拍摄10min内的活动过程并输入计算机,动物行为分析系统自动记录并分析小鼠的总路程。
新物体认知记忆测试:训练时将两个相同的物体A和A‘放置于自发活动装置(长33cm,宽28cm,高26.5cm)中,后将小鼠放入其中,让小鼠自发探索物体A和A’,并记录其探索次数(鼻子嗅物体和爪子攀爬物体),计算小鼠探索物体A‘的概率为探索A‘占A、A’总次数的百分率,即A’/(A+A‘)×100%。经过48h后,将活动箱中的物体A‘取出,换成不同的新奇物体B,再次将小鼠放入其中,让小鼠自发探索物体A和B,并记录其探索次数。计算小鼠探索物体B的概率B/(A+B)×100%,见图1B,本测试基于小鼠更喜欢接触新奇的物体。
位置记忆测试:训练时将活动箱的两侧贴上不同的图案,将两个相同的物体A1和A2放置于自发活动箱中,后将小鼠放入其中,让小鼠自发探索物体A1和A2,并记录其探索次数,计算小鼠探索物体A1的概率。经过48h后,将活动箱中的物体A1换到活动箱中另一个位置A1‘,再次将小鼠放入其中,让小鼠自发探索物体A1’和A2,并记录其探索次数。计算小鼠探索A1‘的概率A1’/(A1‘+B)×100%,见图2A,本测试基于小鼠更喜欢接触新位置的物体。
统计方法:实验数据用mean±SEM表示,使用Graphpad Prism5.0软件进行组间的双因素Bonferroni测试的方差分析。
2、结果
与对照组相比,各给药组小鼠自发活动总路程无显著性差异(图1C),提示各药物组不会通过影响中枢神经系统兴奋性而干扰后续的行为学实验。
新物体认知记忆训练时,各组对A‘的的探索率无显著性差异,在测试时,对照组与训练时相比对A‘和新物体B的的探索率无显著性差异,提示48h后小鼠对新物体认知记忆消失,各给药组对新物体B的的探索率显著增加,提示给药组能显著增加小鼠的认知记忆能力(图1D)。
物体位置记忆训练时,各组对A1的的探索率无显著性差异,在测试时,对照组与训练时相比对A1和新位置物体A1‘的的探索率无显著性差异,提示48h后小鼠对位置记忆消失,各给药组对新位置物体A1‘的探索率显著增加,提示给药组能显著增加小鼠的位置记忆能力(图2B)。
实施例7太子参环肽B及太子参水、环肽类提取物对侧脑室注射Aβ1-42致痴呆小鼠认知和位置记忆的影响
1、方法
将25只鼠(ICR,雄性)随机分为5组:对照组、模型组、太子参水提取物组(500mg/kg)、太子参环肽类提取物组(4mg/kg)、太子参环肽B(0.2mg/kg),每组5只。将Aβ25-35溶解于生理盐水中配制成5mM的母液,37℃孵育4d,待用。手术时,空白组小鼠侧脑室(A-0.22,L-1.0,V 2.5)注射生理盐水5μL,其余各组小鼠侧脑室注射Aβ25-35溶液5μL(25nmol)。术后第7天起,各组小鼠连续灌胃给药14天,给药体积为10ml/kg,对照组及模型组给予等体积生理盐水,直至实验结束。
给药后第14天,进行小鼠自发活动实验,第15天进行小鼠新物体认知记忆训练,30min后进行新物体认知记忆测试(图3A),第16天进行物体位置记忆训练,30min后进行物体位置记忆测试(图4A),以上行为学实验均在给予相应药物或溶剂1h后进行。
统计方法:如实施例6。
2、结果
与对照组相比,各给药组小鼠自发活动总路程无显著性差异(图3B)。新物体认知记忆测试时,模型组失去对新物体识别记忆能力,而各药物组均能显著改善对新物体识别记忆能力(图3C)。物体位置记忆测试时,模型组失去对物体位置记忆能力,而各药物组均能显著改善对物体位置记忆能力(图4B)。
实施例8太子参环肽B、太子参水和环肽类提取物对Aβ诱导的神经元突起萎缩再生的作用
1、方法
小鼠原代大脑皮层神经元培养:取ICR E14天的胎鼠,在HS培养基(含12%马血清,0.6%葡萄糖,2mM谷氨酰胺的Neurobasal培养基)中分离大脑皮层,并除去硬脑膜,将组织切碎,100g离心3分钟,弃去上清,用0.05%胰蛋白酶-EDTA在37℃培养箱中消化15分钟,每5分钟振荡一次,加入HS培养基终止消化,100g离心3分钟,弃去上清,然后加入600U/mlDNase I和0.3mg/ml胰蛋白酶抑制剂(Gibco)15分钟,每5分钟振荡一次。后加入HS培养基后,100g离心3分钟,弃去上清,沉淀用1×HBSS吹打清洗2次,吹打过程中以不产生气泡为准,收集沉淀并悬浮于HS培养基,将细胞吹打均匀。细胞计数后将其接种到8-孔板中(15000细胞每孔)并在10%CO2、37℃培养箱中培养。
Aβ模型和药物处理:原代皮层神经元培养3天后,加入Aβ25-35(10μM)或空白(dH2O)继续培养3天,然后加入不同浓度的药物(太子参水提取物和太子参环肽类提取物1、10μg/mL,太子参环肽B 1、10μM)或空白试剂(0.1%DMSO),培养4天后,用4%的PFA固定1h,然后加入一次抗体β3-Tubulin,4℃过夜孵育,后加入二次抗体GAM594和DAPI,常温孵育2h后,封片,荧光显微镜下观察并拍摄照片(图5A)。
2、结果
与空白组(Cont)相比,模型组(Veh)神经突起密度显著降低,而加入不同浓度的太子参环肽B、太子参水提取物和太子参环肽类提取物后,神经元突起密度显著增加(图5B),说明其有促进突起再生的作用。
实施例9太子参环肽B对Aβ诱导的神经元损伤的保护作用
1、方法
原代大脑皮层神经细胞培养如实施例8所述。原代皮层神经元培养3天后,加入Aβ25-35(10μM)和/或不同浓度的药物(太子参水提取物和太子参环肽类提取物1、10μg/mL,太子参环肽B 1、10μM)或空白试剂(0.1%DMSO),培养3天后,加入CCK8试剂,反应2小时后,在450nm下检测吸光度(图6A)。
2、实验结果
与空白组(Cont)相比,模型组(Veh)神经细胞存活率显著降低,而加入不同浓度的太子参环肽B后,细胞存活率显著增加(图6B),说明其有保护Aβ诱导的神经元损伤的作用。
实施例10太子参环肽胶囊的制备
太子参(产自福建省)干燥块根500g,加3L 95%乙醇提取一次,保持微沸状态1小时,过滤,滤液经减压干燥后得醇提取物。用大孔吸附树脂柱富集,分别用水,40%乙醇,65%乙醇,90%乙醇梯度洗脱,收集65%乙醇洗脱液,减压回收乙醇,得到总环肽提取物4.0g。加入1g淀粉,混匀,80%乙醇制粒,干燥,加入硬脂酸镁0.04g,混匀,装入胶囊,即得本发明制得的硬胶囊剂25粒。每粒含内容物0.2g。
Claims (9)
1.太子参环肽B在制备改善记忆和/或防治老年痴呆症的药品和/或保健品中的应用。
2.太子参提取物在制备改善记忆和/或防治老年痴呆症的药品和/或保健品中的应用,其特征在于,所述太子参提取物含有太子参环肽B。
3.太子参环肽B在制备促进神经突起再生的药品和/或保健品中的应用。
4.太子参提取物在制备促进神经突起再生的药品和/或保健品中的应用,其特征在于,所述太子参提取物含有太子参环肽B。
5.太子参环肽B在制备神经元损伤保护剂中的应用。
6.太子参提取物在制备神经元损伤保护剂中的应用,其特征在于,所述太子参提取物含有太子参环肽B。
7.根据权利要求1~6任一所述的应用,其特征在于,所述太子参提取物为太子参水和/或环肽类提取物。
8.一种太子参制品,其特征在于,是由太子参环肽B或含有太子参环肽B的太子参提取物及其药学上可接受的赋形剂或载体混匀制成临床上可接受的药物制剂,或者制成保健品、食品。
9.根据权利要求8所述的制品,其特征在于,所述药物制剂为片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、酊剂、口服液、滴丸或注射剂。
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