CN110036910A - 一种血叶兰组培快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血叶兰组培快速繁殖方法。本发明通过外植体选取及消毒、诱导培养、增殖培养、壮苗生根和移栽，获得了大量优质的血叶兰种苗。通过本发明能对血叶兰进行快速培养繁殖，并且壮苗生根阶段无需添加植物生长调节剂，培养后的血叶兰苗株成苗率高，苗株品质好，栽培后适应性强，作为药用植物安全环保，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养血叶兰提供了技术支持。同时本组培繁殖方法消毒效果好、培养繁殖快、步骤精炼，培养周期短，约198天，降低了血叶兰在组培过程中的污染率，从而大大提高了成苗率及工作效率，节约了资源。
Description
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种血叶兰组培快速繁殖方法。
背景技术：
血叶兰(Ludisia discolor)又名石蚕，属兰科(Orchidaceae)血叶兰属多年生草本植物。血叶兰是高档的观叶观花植物，同时还是名贵药用植物。我国医学书籍《中华本草》、《全国中草药汇编》等均有记载，最早记载于慈济宫保生大帝药签，而今，是海南黎族医生处方的重要药材，药用历史悠久，民间应用广泛。
由于血叶兰具有很好的药用价值，而其种子在自然条件下难以萌发，资源再生慢，加上长期无节制的采挖，资源濒临枯竭。为了更好的保护血叶兰野生资源，应大力发展人工栽培，满足市场需求，保障血叶兰资源的可持续利用。然而关于血叶兰组织培养的快繁技术研究仍然处于初级阶段，在很大程度上阻碍了血叶兰的规模化生产。并且现有的其他兰花品种的组织培养不能直接运用到血叶兰培养上，所以目前急需一种血叶兰组培快速繁殖方法。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种培养繁殖快，效率高的血叶兰组培快速繁殖方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明的血叶兰组培快速繁殖方法，包括以下步骤：
a、外植体选取及消毒：从血叶兰母株上切取新发生的血叶兰幼苗，切除叶片后进行消毒处理，然后切成带有1-2个茎节的茎段，得到消毒后的外植体；
b、诱导培养：将消毒后的外植体接种在诱导培养基中进行培养，先进行弱光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照强度为500-700lx，然后再进行常规光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500-2000lx，直至诱导出不定芽；所述的诱导培养基为：每升含有花宝1号1-2g、花宝4号0.5-1.5g、6BA 0.6-1mg、NAA 0.03-0.06mg、椰汁100-150mL、蛋白胨1-3g、肌醇0.05-0.15g、蔗糖28-33g和琼脂5-7g，其余为水，pH值为5.5-5.8；
c、增殖培养：将不定芽转移至增殖培养基中进行不定芽的增殖，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500-2000lx；所述的增殖培养基为：每升含有花宝1号1-2g、花宝4号0.5-1.5g、6BA 1-3mg、NAA 0.4-0.6mg、椰汁100-150mL、蛋白胨1-3g、肌醇0.05-0.15g、蔗糖28-33g和琼脂5-7g，其余为水，pH值为5.5-5.8；
d、壮苗生根：将增殖培养获得的不定芽转入壮苗生根培养基中进行培养，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500-2000lx，获得生根的试管苗；所述的壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号2-4g、香蕉90-140g、土豆40-80g、蛋白胨1-3g、肌醇0.05-0.15g、蔗糖10-15g、琼脂5-7g和活性炭1-2g，其余为水，pH值为5.5-5.8；
e、移栽：将试管苗在自然光下炼苗6-9天，然后取出试管苗并洗净附着在根部的培养基，移栽至培养基质中培养获得血叶兰种苗。
选用无病虫害长势良好的血叶兰植株能降低苗株的发病率，保证在组培过程中不受其他因素的干扰，增加外植体成活率。外植体的诱导培养时先进行一段时间的弱光照培养，能够使外植体在培养过程中逐渐适应培养条件，有利于存活，同时抑制褐变的发生。
所述的从血叶兰母株上切取新发生的血叶兰幼苗，切除叶片后进行消毒处理具体为：从血叶兰母株上切取新发生的血叶兰幼苗，切除叶片，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min，在超净工作台上，将幼苗用体积分数75％的酒精水溶液浸泡15s，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.1％的升汞水溶液中消毒8min，消毒后，用无菌水冲洗5-8次，用无菌滤纸吸干幼苗表面水分。
所述的诱导培养基优选为：每升含有花宝1号2g、花宝4号1g、6BA 0.8mg、NAA0.05mg、椰汁130mL、蛋白胨1g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.6。
所述的增殖培养基优选为：每升含有花宝1号1.5g、花宝4号1g、6BA 2mg、NAA0.5mg、椰汁130mL、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.6。
所述的壮苗生根培养基优选为：每升含有花宝1号3g、香蕉120g、土豆50g、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，pH值为5.6。
所述的培养基质优选为椰块。
本发明的有益效果是：通过本发明能对血叶兰进行快速培养繁殖，并且壮苗生根阶段无需添加植物生长调节剂，培养后的血叶兰苗株成苗率高，苗株品质好，栽培后适应性强，作为药用植物安全环保，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养血叶兰提供了技术支持。同时本组培繁殖方法消毒效果好、培养繁殖快、步骤精炼，培养周期短，约198天，降低了血叶兰在组培过程中的污染率，从而大大提高了成苗率及工作效率，节约了资源。
附图说明：
图1为本发明的血叶兰组培快速繁殖的流程示意图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
(1)材料选取：选取无病虫害长势良好的血叶兰植株作为母株，从母株上切取新发生的血叶兰幼苗；
(2)外植体预处理：将幼苗的叶片切除，用软刷毛在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；
(3)外植体消毒：在超净工作台上，将幼苗用体积分数75％的酒精水溶液浸泡15s，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.1％的升汞水溶液中消毒8min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干幼苗表面水分，切成带有1-2个茎节的茎段，得到消毒后的外植体，放置于培养皿中备用；
(4)诱导培养：将消毒后的外植体接种在诱导培养基上进行培养(接种数60个)，先进行8d的弱光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照强度为600lx，然后再进行常规光照培养60d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，诱导出不定芽，接种后7天褐变率5％，接种后30天存活率96％；诱导培养基为：每升含有花宝1号2g、花宝4号1g、6BA0.8mg、NAA 0.05mg、椰汁130mL、蛋白胨1g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.6；
(5)增殖培养：将诱导出的不定芽转移至增殖培养基中增殖培养70d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx；增殖培养基为：每升含有花宝1号1.5g、花宝4号1g、6BA 2mg、NAA 0.5mg、椰汁130mL、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.6；
(6)壮苗生根：增殖培养后，选择高2cm以上的不定芽转入壮苗生根培养基中培养60d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号3g、香蕉120g、土豆50g、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，pH值为5.6；
(7)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为97％。
实施例2：
(1)材料选取：选取无病虫害长势良好的血叶兰植株作为母株，从母株上切取新发生的血叶兰幼苗；
(2)外植体预处理：将幼苗的叶片切除，用软刷毛在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；
(3)外植体消毒：在超净工作台上，将幼苗用体积分数75％的酒精水溶液浸泡15s，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.1％的升汞水溶液中消毒8min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干幼苗表面水分，切成带有1-2个茎节的茎段，得到消毒后的外植体，放置于培养皿中备用；
(4)诱导培养：将消毒后的外植体接种在诱导培养基上进行培养(接种数60个)，先进行8d的弱光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照强度为600lx，然后再进行常规光照培养60d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，诱导出不定芽，接种后7天褐变率6％，接种后30天存活率93％；诱导培养基为：每升含有花宝1号1.5g、花宝4号0.5g、6BA 0.7mg、NAA 0.04mg、椰汁120mL、蛋白胨2g、肌醇0.15g、蔗糖28g和琼脂5g，其余为水，pH值为5.6；
(5)增殖培养：将诱导出的不定芽转移至增殖培养基中增殖培养70d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx；增殖培养基为：每升含有花宝1号2g、花宝4号0.5g、6BA 3mg、NAA0.4mg、椰汁120mL、蛋白胨1g、肌醇0.15g、蔗糖28g和琼脂5g，其余为水，pH值为5.6；
(6)壮苗生根：增殖培养后，选择高2cm以上的不定芽转入壮苗生根培养基中培养65d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号4g、香蕉110g、土豆40g、蛋白胨3g、肌醇0.05g、蔗糖14g、琼脂5g和活性炭1.8g，其余为水，pH值为5.6；
(7)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为96％。
实施例3：
(1)材料选取：选取无病虫害长势良好的血叶兰植株作为母株，从母株上切取新发生的血叶兰幼苗；
(2)外植体预处理：将幼苗的叶片切除，用软刷毛在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；
(3)外植体消毒：在超净工作台上，将幼苗用体积分数75％的酒精水溶液浸泡15s，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.1％的升汞水溶液中消毒8min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干幼苗表面水分，切成带有1-2个茎节的茎段，得到消毒后的外植体，放置于培养皿中备用；
(4)诱导培养：将消毒后的外植体接种在诱导培养基上进行培养(接种数60个)，先进行8d的弱光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照强度为600lx，然后再进行常规光照培养60d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，诱导出不定芽，接种后7天褐变率7％，接种后30天存活率94％；诱导培养基为：每升含有花宝1号1g、花宝4号1.5g、6BA0.6mg、NAA 0.06mg、椰汁150mL、蛋白胨3g、肌醇0.05g、蔗糖29g和琼脂7g，其余为水，pH值为5.6；
(5)增殖培养：将诱导出的不定芽转移至增殖培养基中增殖培养70d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx；增殖培养基为：每升含有花宝1号1g、花宝4号1.5g、6BA 3mg、NAA 0.6mg、椰汁150mL、蛋白胨3g、肌醇0.05g、蔗糖29g和琼脂7g，其余为水，pH值为5.6；
(6)壮苗生根：增殖培养后，选择高2cm以上的不定芽转入壮苗生根培养基中培养68d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号2g、香蕉140g、土豆60g、蛋白胨1g、肌醇0.08g、蔗糖12g、琼脂7g和活性炭1.3g，其余为水，pH值为5.6；
(7)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为95％。
实施例4：
(1)材料选取：选取无病虫害长势良好的血叶兰植株作为母株，从母株上切取新发生的血叶兰幼苗；
(2)外植体预处理：将幼苗的叶片切除，用软刷毛在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；
(3)外植体消毒：在超净工作台上，将幼苗用体积分数75％的酒精水溶液浸泡15s，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.1％的升汞水溶液中消毒8min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干幼苗表面水分，切成带有1-2个茎节的茎段，得到消毒后的外植体，放置于培养皿中备用；
(4)诱导培养：将消毒后的外植体接种在诱导培养基上进行培养(接种数60个)，先进行8d的弱光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照强度为600lx，然后再进行常规光照培养60d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，诱导出不定芽，接种后7天褐变率8％，接种后30天存活率95％；诱导培养基为：每升含有花宝1号1g、花宝4号0.5g、6BA 1mg、NAA 0.03mg、椰汁140mL、蛋白胨3g、肌醇0.1g、蔗糖32g和琼脂5g，其余为水，pH值为5.6；
(5)增殖培养：将诱导出的不定芽转移至增殖培养基中增殖培养70d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx；增殖培养基为：每升含有花宝1号1g、花宝4号0.5g、6BA 2mg、NAA 0.6mg、椰汁140mL、蛋白胨3g、肌醇0.1g、蔗糖32g和琼脂5g，其余为水，pH值为5.6；
(6)壮苗生根：增殖培养后，选择高2cm以上的不定芽转入壮苗生根培养基中培养68d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号2g、香蕉100g、土豆50g、蛋白胨1g、肌醇0.1g、蔗糖15g、琼脂7g和活性炭1g，其余为水，pH值为5.6；
(7)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为94％。
实施例5：
(1)材料选取：选取无病虫害长势良好的血叶兰植株作为母株，从母株上切取新发生的血叶兰幼苗；
(2)外植体预处理：将幼苗的叶片切除，用软刷毛在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；
(3)外植体消毒：在超净工作台上，将幼苗用体积分数75％的酒精水溶液浸泡15s，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.1％的升汞水溶液中消毒8min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干幼苗表面水分，切成带有1-2个茎节的茎段，得到消毒后的外植体，放置于培养皿中备用；
(4)诱导培养：将消毒后的外植体接种在诱导培养基上进行培养(接种数60个)，先进行8d的弱光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照强度为600lx，然后再进行常规光照培养65d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，诱导出不定芽，接种后7天褐变率9％，接种后30天存活率92％；诱导培养基为：每升含有花宝1号1.5g、花宝4号1g、6BA 0.9mg、NAA 0.05mg、椰汁100mL、蛋白胨2g、肌醇0.15g、蔗糖33g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.6；
(5)增殖培养：将诱导出的不定芽转移至增殖培养基中增殖培养70d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx；增殖培养基为：每升含有花宝1号1.5g、花宝4号1g、6BA 1mg、NAA 0.5mg、椰汁100mL、蛋白胨2g、肌醇0.15g、蔗糖33g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.6；
(6)壮苗生根：增殖培养后，选择高2cm以上的不定芽转入壮苗生根培养基中培养62d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号3g、香蕉90g、土豆80g、蛋白胨3g、肌醇0.13g、蔗糖11g、琼脂6g和活性炭2g，其余为水，pH值为5.6；
(7)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为93％。
实施例6：
(1)材料选取：选取无病虫害长势良好的血叶兰植株作为母株，从母株上切取新发生的血叶兰幼苗；
(2)外植体预处理：将幼苗的叶片切除，用软刷毛在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；
(3)外植体消毒：在超净工作台上，将幼苗用体积分数75％的酒精水溶液浸泡15s，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.1％的升汞水溶液中消毒8min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干幼苗表面水分，切成带有1-2个茎节的茎段，得到消毒后的外植体，放置于培养皿中备用；
(4)诱导培养：将消毒后的外植体接种在诱导培养基上进行培养(接种数60个)，先进行8d的弱光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照强度为600lx，然后再进行常规光照培养65d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，诱导出不定芽，接种后7天褐变率7％，接种后30天存活率93％；诱导培养基为：每升含有花宝1号2g、花宝4号1.5g、6BA 0.8mg、NAA 0.04mg、椰汁110mL、蛋白胨1g、肌醇0.05g、蔗糖31g和琼脂7g，其余为水，pH值为5.6；
(5)增殖培养：将诱导出的不定芽转移至增殖培养基中增殖培养70d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx；增殖培养基为：每升含有花宝1号2g、花宝4号1.5g、6BA 1mg、NAA 0.4mg、椰汁110mL、蛋白胨1g、肌醇0.05g、蔗糖31g和琼脂7g，其余为水，pH值为5.6；
(6)壮苗生根：增殖培养后，选择高2cm以上的不定芽转入壮苗生根培养基中培养60d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号4g、香蕉130g、土豆70g、蛋白胨2g、肌醇0.15g、蔗糖10g、琼脂5g和活性炭1.8g，其余为水，pH值为5.6；
(7)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为95％。
实施例7：
(1)材料选取：选取无病虫害长势良好的血叶兰植株作为母株，从母株上切取新发生的血叶兰幼苗；
(2)外植体预处理：将幼苗的叶片切除，用软刷毛在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；
(3)外植体消毒：在超净工作台上，将幼苗用体积分数75％的酒精水溶液浸泡15s，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.1％的升汞水溶液中消毒8min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干幼苗表面水分，切成带有1-2个茎节的茎段，得到消毒后的外植体，放置于培养皿中备用；
(4)诱导培养：将消毒后的外植体接种在诱导培养基上进行培养(接种数60个)，进行常规光照培养78d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，诱导出不定芽，接种后7天褐变率12％，接种后30天存活率88％；诱导培养基为：每升含有花宝1号2g、花宝4号1g、6BA 0.8mg、NAA 0.05mg、椰汁130mL、蛋白胨1g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.6；
(5)增殖培养：将诱导出的不定芽转移至增殖培养基中增殖培养70d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx；增殖培养基为：每升含有花宝1号1.5g、花宝4号1g、6BA 2mg、NAA 0.5mg、椰汁130mL、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.6；
(6)壮苗生根：增殖培养后，选择高2cm以上的不定芽转入壮苗生根培养基中培养65d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1800lx，试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号3g、香蕉120g、土豆50g、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，pH值为5.6；
(7)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为80％，温度为25℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为90％。
实施例8：
(1)材料选取：选取无病虫害长势良好的血叶兰植株作为母株，从母株上切取新发生的血叶兰幼苗；
(2)外植体预处理：将幼苗的叶片切除，用软刷毛在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；
(3)外植体消毒：在超净工作台上，将幼苗用体积分数75％的酒精水溶液浸泡15s，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.1％的升汞水溶液中消毒8min，消毒后，用无菌水冲洗8次，用无菌滤纸吸干幼苗表面水分，切成带有1-2个茎节的茎段，得到消毒后的外植体，放置于培养皿中备用；
(4)诱导培养：将消毒后的外植体接种在诱导培养基上进行培养(接种数60个)，先进行7d的弱光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照强度为700lx，然后再进行常规光照培养75d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500lx，诱导出不定芽，接种后7天褐变率9％，接种后30天存活率93％；诱导培养基为：每升含有花宝1号2g、花宝4号1g、6BA0.8mg、NAA 0.05mg、椰汁130mL、蛋白胨1g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.8；
(5)增殖培养：将诱导出的不定芽转移至增殖培养基中增殖培养90d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500lx；增殖培养基为：每升含有花宝1号1.5g、花宝4号1g、6BA 2mg、NAA 0.5mg、椰汁130mL、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.8；
(6)壮苗生根：增殖培养后，选择高2cm以上的不定芽转入壮苗生根培养基中培养61d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500lx，试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号3g、香蕉120g、土豆50g、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，pH值为5.8；
(7)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为75％，温度为22℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为92％。
实施例9：
(1)材料选取：选取无病虫害长势良好的血叶兰植株作为母株，从母株上切取新发生的血叶兰幼苗；
(2)外植体预处理：将幼苗的叶片切除，用软刷毛在水池中进行初步清洗，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min；
(3)外植体消毒：在超净工作台上，将幼苗用体积分数75％的酒精水溶液浸泡15s，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.1％的升汞水溶液中消毒8min，消毒后，用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干幼苗表面水分，切成带有1-2个茎节的茎段，得到消毒后的外植体，放置于培养皿中备用；
(4)诱导培养：将消毒后的外植体接种在诱导培养基上进行培养(接种数60个)，先进行10d的弱光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照强度为500lx，然后再进行常规光照培养60d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000lx，诱导出不定芽，接种后7天褐变率8％，接种后30天存活率94％；诱导培养基为：每升含有花宝1号2g、花宝4号1g、6BA 0.8mg、NAA 0.05mg、椰汁130mL、蛋白胨1g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.5；
(5)增殖培养：将诱导出的不定芽转移至增殖培养基中增殖培养70d，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000lx；增殖培养基为：每升含有花宝1号1.5g、花宝4号1g、6BA 2mg、NAA 0.5mg、椰汁130mL、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.5；
(6)壮苗生根：增殖培养后，选择高2cm以上的不定芽转入壮苗生根培养基中培养60d，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为2000lx，试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片，生根率为100％；壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号3g、香蕉120g、土豆50g、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，pH值为5.5；
(7)移栽：当试管苗生长至4-5cm高，根2-4条，叶2-4片时，将试管苗放在自然光下炼苗5天，打开组培瓶瓶盖炼苗2天；然后取出试管苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至椰块中，保持湿度和透气，空气湿度为85％，温度为28℃，由此得到血叶兰种苗，移栽成活率为93％。
Claims (6)
1.一种血叶兰组培快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、外植体选取及消毒：从血叶兰母株上切取新发生的血叶兰幼苗，切除叶片后进行消毒处理，然后切成带有1-2个茎节的茎段，得到消毒后的外植体；
b、诱导培养：将消毒后的外植体接种在诱导培养基中进行培养，先进行弱光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照强度为500-700lx，然后再进行常规光照培养，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500-2000lx，直至诱导出不定芽；所述的诱导培养基为：每升含有花宝1号1-2g、花宝4号0.5-1.5g、6BA 0.6-1mg、NAA 0.03-0.06mg、椰汁100-150mL、蛋白胨1-3g、肌醇0.05-0.15g、蔗糖28-33g和琼脂5-7g，其余为水，pH值为5.5-5.8；
c、增殖培养：将不定芽转移至增殖培养基中进行不定芽的增殖，培养温度为(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500-2000lx；所述的增殖培养基为：每升含有花宝1号1-2g、花宝4号0.5-1.5g、6BA 1-3mg、NAA 0.4-0.6mg、椰汁100-150mL、蛋白胨1-3g、肌醇0.05-0.15g、蔗糖28-33g和琼脂5-7g，其余为水，pH值为5.5-5.8；
d、壮苗生根：将增殖培养获得的不定芽转入壮苗生根培养基中进行培养，培养温度(25±1)℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500-2000lx，获得生根的试管苗；所述的壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号2-4g、香蕉90-140g、土豆40-80g、蛋白胨1-3g、肌醇0.05-0.15g、蔗糖10-15g、琼脂5-7g和活性炭1-2g，其余为水，pH值为5.5-5.8；
e、移栽：将试管苗在自然光下炼苗6-9天，然后取出试管苗并洗净附着在根部的培养基，移栽至培养基质中培养获得血叶兰种苗。
2.根据权利要求1所述的血叶兰组培快速繁殖方法，其特征在于，所述的从血叶兰母株上切取新发生的血叶兰幼苗，切除叶片后进行消毒处理具体为：从血叶兰母株上切取新发生的血叶兰幼苗，切除叶片，去除表面泥沙，然后用洗洁精清洗干净，置于流水下冲洗30min，在超净工作台上，将幼苗用体积分数75％的酒精水溶液浸泡15s，无菌水冲洗1次，然后浸泡在质量分数0.1％的升汞水溶液中消毒8min，消毒后，用无菌水冲洗5-8次，用无菌滤纸吸干幼苗表面水分。
3.根据权利要求1或2所述的血叶兰组培快速繁殖方法，其特征在于，所述的诱导培养基为：每升含有花宝1号2g、花宝4号1g、6BA 0.8mg、NAA 0.05mg、椰汁130mL、蛋白胨1g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.6。
4.根据权利要求1或2所述的血叶兰组培快速繁殖方法，其特征在于，所述的增殖培养基为：每升含有花宝1号1.5g、花宝4号1g、6BA 2mg、NAA 0.5mg、椰汁130mL、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖30g和琼脂6g，其余为水，pH值为5.6。
5.根据权利要求1或2所述的血叶兰组培快速繁殖方法，其特征在于，所述的壮苗生根培养基为：每升含有花宝1号3g、香蕉120g、土豆50g、蛋白胨2g、肌醇0.1g、蔗糖13g、琼脂6g和活性炭1.5g，其余为水，pH值为5.6。
6.根据权利要求1所述的血叶兰组培快速繁殖方法，其特征在于，所述的培养基质为椰块。
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