CN109983012B - 赖氨酸牙龈蛋白酶的酮抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供如本文中所述的式I的化合物，及其用于抑制来自细菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的赖氨酸牙龈蛋白酶(Kgp)的用途。还描述了牙龈蛋白酶活性探针化合物，及还描述了用于分析牙龈蛋白酶活性的方法，以及用于治疗与牙龈卟啉单胞菌感染相关的病症，包括诸如阿兹海默氏病(Alzheimer’s disease)的脑病症的方法。

Description

赖氨酸牙龈蛋白酶的酮抑制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年9月16日提交的美国临时申请第62/395,938号及于2017年2月15日提交的美国临时申请第62/459,456号的优先权，这些申请通过援引整体并入本文。
发明背景
细菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)的感染与牙周疾病、阿兹海默氏病(Alzheimer’s)及其他脑病症、心血管疾病、糖尿病、癌症、肝病、肾病、早产、关节炎、肺炎及其他病症的发展相关联。牙龈卟啉单胞菌是已知会感染口腔且全身性移位至冠状动脉、主动脉、胎盘组织、脑、肾及肝中的厌氧非解糖(asaccharolytic)革兰氏阴性杆状菌。亦已在癌组织中鉴别出该细菌且已提出牙龈蛋白酶(gingipains)可触发永生化及转移的机制。参见：Gandhimadhi等人，Journal of Indian Society of Periodontology.2010；14(2)：114-120；Liao等人，Med Hypotheses,2009.72(6):732-5；Byrne等人，Oral MicrobiolImmunol,2009.24(6):469-77；Mahindra等人，J Maxillofac Oral Surg,2009.8(2):108-13；Stelzel等人，J Periodontol,2002.73(8):868-70；Katz等人，Journal of DentalResearch,2009.88(6):575-578；Poole等人，J Alzheimers Dis,2015,43(1):67-80；Ishikawa等人，Biochim Biophys Acta,2013.1832(12):2035-2043；Inaba等人，CellularMicrobiology,2014.16(1):131-145。
牙龈卟啉单胞菌会产生名为牙龈蛋白酶的蛋白酶，其包括精氨酸牙龈蛋白酶A(RgpA)、精氨酸牙龈蛋白酶B(RgpB)及赖氨酸牙龈蛋白酶(Kgp)。牙龈蛋白酶有助于生物体的许多功能，包括其存活及毒力。牙龈蛋白酶可由牙龈卟啉单胞菌分泌、运送至其外膜表面，或由于该细菌而释放于外膜囊泡中。牙龈蛋白酶降解宽范围的蛋白质(例如，免疫球蛋白、蛋白酶抑制剂、肌动蛋白及胶原)，这可导致许多类型的细胞中的细胞骨架塌陷及细胞凋亡，且已发现抑制牙龈蛋白酶可预防牙龈卟啉单胞菌诱导的细胞死亡。参见：Travis等人，Adv Exp Med Biol,2000.477:455-65；Sheets等人，Infect Immun,2005.73(3):1543-52；Sheets等人，Infect Immun,2006.74(10):5667-78；Stathopoulou等人，BMCMicrobiol,2009.9:107。需要用于抑制牙龈蛋白酶活性及治疗与牙龈蛋白酶活性及牙龈卟啉单胞菌感染相关的疾病的新化合物。另外，需要用于检测并量化牙龈蛋白酶活性的化合物以有效诊断感染牙龈卟啉单胞菌的个体，鉴别新治疗剂且研发用于治疗牙龈蛋白酶介导的疾病的新方法。本发明解决这些需要。
发明概述
在第一实施方案中，本发明提供式I的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
A选自-CH2-及-O-；
R1a及R1b各自独立地选自氢、C1-4烷基及胺保护基团；
R2a及R2b各自独立地选自氢、卤素、C1-4卤代烷基及C1-4卤代烷氧基；
R3选自C3-8环烃基、C3-8烷基、3员至12员杂环基、C6-10芳基、5员至12员杂芳基及报告子(reporter)部分，其中R3任选地经一个或多个R3a取代基取代；
每一R3a独立地选自卤素、-CN、-NO2、-N3、-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、-N(Rc)2、-N+(Rb)3、-(CH2)kC(O)Rb、-NRc(CH2)uC(O)Rb、-O(CH2)uC(O)Rb、-(CH2)kCONRcRc、-(CH2)kNRcC(O)Rb、-NRc(CH2)uCONRcRc、-NRc(CH2)uNRcC-(O)Rb、-O(CH2)uCONRcRc及-O(CH2)uNRcC(O)Rb以及任选地经取代的三唑基；
每一Rb独立地选自C1-4烷基、C1-4卤代烷基及C1-4氘代烷基；
每一Rc独立地选自氢及C1-8烷基；
每一下标k独立地选自0、1、2、3、4、5及6；
每一下标u独立地选自1、2、3、4、5及6；
R4选自氢及C1-4烷基；
R5选自-CH2R5a、-CHS(O)(R5b)2及C1-6卤代烷基；
R5a选自-O-R6、-S-R7、-SO-R7、-SO2-R7、-N(R8)2、5员至12员杂芳基及3员至12员杂环基，
其中5员至12员杂芳基任选地经一个或多个独立地选自卤素、C1-3烷基及C1-3卤代烷基的成员取代，且
3员至12员杂环基任选地经一个或多个独立地选自氧代、卤素、C1-3烷基及C1-3卤代烷基的成员取代；
每一R5b是独立选择的C1-6烷基；
R6及R7选自苯基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基及5员至12员杂芳基，
其中苯基经1至5个卤素取代，且
其中5员至12员杂芳基任选地经一个或多个卤素、C1-3烷基或C1-3卤代烷基取代；
每一R8是独立选择的C1-6烷基；且
R5任选地包含淬灭部分R9；
条件是R5不为2,3,5,6-四氟苯氧基甲基。
在相关实施方案中，本发明提供包括一种或多种本发明的化合物及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在另一实施方案中，本发明提供用于治疗与牙龈卟啉单胞菌感染相关的疾病或病状的方法。所述方法包括向有需要的个体施用有效量的本发明的化合物或组合物。在一些实施方案中，脑病症(例如，阿兹海默氏病)、牙周疾病、糖尿病、心血管疾病、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、感染性关节炎、银屑病关节炎、升高的早产风险、肺炎、癌症、肾病、肝病、视网膜病症及青光眼。
在另一实施方案中，本发明提供包含报告子部分及牙龈蛋白酶反应性部分的化合物以及用于检测生物样品中的牙龈蛋白酶活性的方法。所述方法包括：在足以使牙龈蛋白酶与如上文所述的化合物的牙龈蛋白酶反应性部分反应的条件下形成包含生物样品及该化合物的混合物；检测该混合物中的该化合物的报告子部分；及当检测到报告子部分时确定生物样品中存在牙龈蛋白酶。
附图简述
图1显示本发明的Kgp抑制剂保护SH-SY5Y神经胚细胞瘤细胞免于牙龈卟啉单胞菌诱导的细胞死亡。
图2显示本发明的Kgp抑制剂防止血红素分解及铁获取(牙龈卟啉单胞菌的关键存活增强机制)。
图3显示本发明的化合物在小鼠中提供增加的血浆浓度。
图4显示本发明的化合物在小鼠中提供增加的游离脑浓度。
图5A显示本发明的活性探针可用于表征细菌涂片。暴露于活性探针15a或38a的牙龈卟啉单胞菌的细菌涂片可通过荧光显微镜术检测。信号取决于Kgp的存在，且在Kgp基因剔除的牙龈卟啉单胞菌W83菌株的细菌涂片中未检测到。
图5B显示本发明的活性探针可用于表征组织切片。利用免疫荧光剂CAB102(针对Kgp的多克隆抗体)使来自患有牙周疾病的患者的牙龈组织切片染色。单独的连续组织切片在与活性探针15a一起孵育之后产生荧光信号。
图6A显示含有来自经或不经牙龈卟啉单胞菌W83感染的人类Jurkat细胞的样品的SDS-PAGE凝胶的荧光影像。使样品与荧光探针15a或非荧光Kgp抑制剂化合物73(N-[7-氨基-2-氧代-1-(2,3,5,6-四氟苯氧基)庚-3-基]环戊烷甲酰胺)反应，之后进行SDS-PAGE。泳道1：仅细胞。泳道2：细胞+探针15a。泳道3：细胞+探针15a，牙龈卟啉单胞菌感染复数(MOI)：100。泳道4：细胞+与化合物73、之后探针15a的预孵育物，MOI：100。泳道5：细胞+探针15a，MOI：10。泳道6：细胞+与化合物73、之后探针15a的预孵育物，MOI：10。泳道7：经纯化的Kgp+探针15a。泳道8：经纯化的Kgp+不含探针15a的溶解缓冲液。
图6B显示含有滴定量的牙龈卟啉单胞菌W83的SDS-PAGE凝胶的荧光影像。泳道A：107个菌落形成单位(colony forming unit，CFU)；泳道B：106个CFU；泳道C：105个CFU；泳道D：104个CFU；泳道E：103个CFU；泳道F：102个CFU；泳道G：经纯化的Kgp。滴定的荧光数据可用于量化生物样品中的牙龈卟啉单胞菌感染。
图7显示颊细胞的荧光显微镜成像，该颊细胞获取自人类个体的口腔，与活性探针15a一起孵育并分析活性探针结合。利用活性探针15a的点状染色(punctate staining)指示在一些细胞中存在Kgp。左图显示此点状染色，而右图中的细胞显示细胞未经探针染色且假定未受牙龈卟啉单胞菌感染。蓝色染料是用于细胞核的DAPI染色剂。
图8显示生物素活性探针51a可用于共价标记牙龈卟啉单胞菌溶解物中的Kgp，用于随后将经标记的Kgp结合至链霉抗生物素蛋白珠粒。在自珠粒释放之后，通过SDS-PAGE分析经标记的Kgp并利用多克隆Kgp抗体CAB102在蛋白质印迹(Western blot)上进行检测。经由此方法下拉Kgp并自至少106CFU的牙龈卟啉单胞菌检测到。泳道1：经纯化的Kgp。泳道2：牙龈卟啉单胞菌W83，102CFU。泳道3：W83，104CFU。泳道4：W83，106CFU。泳道5：Kgp剔除菌株，106CFU。泳道6：仅探针51a。
图9A显示在与探针化合物71一起孵育之后通过SDS-PAGE的牙龈卟啉单胞菌W83溶解物及牙龈卟啉单胞菌Kgp剔除菌株溶解物的可视化。
图9B显示在与CAB102抗体缀合珠粒一起进行预孵育或不进行预孵育的情形下，在与探针化合物71一起孵育之后通过SDS-PAGE的牙龈卟啉单胞菌溶解物的可视化。
图9C显示通过SDS-PAGE及Cy5信号可视化的经标记的牙龈卟啉单胞菌W83溶解物的分析(顶图)或通过CAB102一级抗体检测及化学发光检测的蛋白质印迹(底图)。
图10显示在进行或不进行用化合物1的处理的情况下，在感染有牙龈卟啉单胞菌的小鼠中的槽牙骨损失。
图11显示在用化合物1处理后感染的小鼠的脑组织中牙龈卟啉单胞菌DNA的降低。
图12显示在用化合物1处理后感染的小鼠的脑组织中海马神经元丢失的降低。
发明详述
I.概述
本发明提供用于抑制牙龈卟啉单胞菌赖氨酸牙龈蛋白酶(Kgp)的强效化合物。本发明是部分地基于以下惊人发现：某些抑制剂展现较内源性蛋白酶(例如组织蛋白酶)对于Kgp增加的选择性，同时亦展现与先前已知化合物相当的活性。此外，当与先前已知化合物相比时，本发明的化合物提供改良的药代动力学性质。该化合物可用于阻止与牙龈卟啉单胞菌感染相关的各种疾病(包括衰老相关病状(例如阿兹海默氏病))中的细胞死亡、发炎及其他病理过程。
II.定义
如本文中所使用，术语“牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis及P.gingivalis)”是指公认为牙周炎及相关病状的发病机制中的关键致病微生物的革兰氏阴性(gram-negative)非解糖细菌。“牙龈卟啉单胞菌感染”是指牙龈卟啉单胞菌在身体组织(例如牙龈或脑)中的入侵及定殖。牙龈卟啉单胞菌感染常以随后的组织损伤及疾病为特征。
如本文中所使用，术语“牙龈蛋白酶(gingipain)”是指由具有胰蛋白酶样特异性(即，Lys-Xaa及Arg-Xaa)的牙龈卟啉单胞菌表达的半胱氨酸蛋白酶。牙龈蛋白酶认为是牙龈卟啉单胞菌的主要毒力因子且有助于细菌吸附及定殖、营养获得、逃避宿主防御及组织入侵。术语“精氨酸牙龈蛋白酶”及“Rgp”可互换使用，是指牙龈卟啉单胞菌精氨酸特异性牙龈蛋白酶RgpA及RgpB，按照EC编号EC 3.4.22.37分类。rgpA及rgpB基因转译产物RgpA及RgpB共享半胱天冬酶样蛋白酶结构域(对Arg-Xaa肽键具特异性)及免疫球蛋白样结构域。在RgpA中，蛋白酶及免疫球蛋白样结构域之后是含有血球凝集素-黏附素结构域的大C末端延伸。
如本文中所使用，术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有指示碳原子数的直链或支链饱和脂肪族基团。烷基可包括任何数量的碳，例如C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6及C5-6。举例而言，C1-6烷基包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基等。烷基亦可以是指具有最多20个碳原子的烷基，例如(但不限于)庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可经取代或未经取代。除非另外规定，否则“经取代的烷基”可经一个或多个选自以下的基团取代：卤基、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基及烷氧基。
如本文中所使用，术语“烷氧基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有式-OR的基团，其中R是烷基。
如本文中所使用，术语“环烃基”本身或作为另一取代基的一部分是指含有3至12个环原子或指示原子数的饱和或部分不饱和的单环、稠合二环或桥接多环集合。环烃基可包括任何数量的碳，例如C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11及C3-12。饱和单环环烃基环包括(例如)环丙基、环丁基、环戊基、环己基及环辛基。饱和二环及多环环烃基环包括(例如)降莰烷、[2.2.2]二环辛烷、十氢萘及金刚烷。环烃基亦可以是在环中具有一个或多个双键或三键的部分不饱和基团。部分不饱和的代表性环烃基包括(但不限于)环丁烯、环戊烯、环己烯、环己二烯(1,3-及1,4-异构物)、环庚烯、环庚二烯、环辛烯、环辛二烯(1,3-、1,4-及1,5-异构物)、降莰烯及降莰二烯。当环烃基是饱和单环C3-8环烃基时，例示性基团包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基及环辛基。当环烃基是饱和单环C3-6环烃基时，例示性基团包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基及环己基。环烃基可经取代或未经取代。除非另外规定，否则“经取代的环烃基”可经一个或多个选自以下的基团取代：卤基、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基及烷氧基。术语“低碳数环烃基”是指具有3至7个碳的环烃基，其包括(例如)环丙基、环丁基、环戊基、环己基及环庚基。
如本文中所使用，术语“亚烷基”是指如上文所定义的连接至少两个其他基团的烷基(即，二价烷基)。连接至亚烷基的两个部分可连接至亚烷基的同一碳原子或不同碳原子。术语“亚环烃基”是指如上文所定义的连接至少两个其他基团的环烃基(即，二价环烃基)。连接至亚环烃基的两个部分可连接至亚环烃基的同一碳原子或不同碳原子。
如本文中所使用，术语“烷硫基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有式-SR的基团，其中R是烷基。
如本文中所使用，术语“杂烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有任何适宜长度且具有1至3个杂原子(例如N、O及S)的烷基。举例而言，杂烷基可包括醚、硫醚及烷基-胺。亦可使用其他杂原子，包括(但不限于)B、Al、Si及P。该杂原子可经氧化以形成诸如(但不限于)-S(O)-及-S(O)2-的部分。杂烷基的杂原子部分可替代烷基的氢原子以形成羟基、硫基或氨基。或者，杂原子部分可以是连结原子，或插入两个碳原子之间。
如本文中所使用，术语“亚杂烷基”是指如上文所定义的连接至少两个其他基团的杂烷基(即，二价杂烷基)。连接至亚杂烷基的两个部分可连接至亚杂烷基的同一原子或不同原子。术语“亚杂环基”是指如上文所定义的连接至少两个其他基团的环烃基(即，二价杂环基)。连接至亚杂环基的两个部分可连接至亚杂环基的同一原子或不同原子。
如本文中所使用，术语“卤代”及“卤素”本身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子。
如本文中所使用，术语“卤代烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指其中一些或所有氢原子经卤素原子替代的烷基。正如对于烷基，卤代烷基可具有任何适宜数量的碳原子，例如C1-6。举例而言，卤代烷基包括三氟甲基、氟甲基等。在一些情况下，术语“全氟”可用于界定其中所有氢均经氟替代的化合物或基团。举例而言，全氟甲基是指1,1,1-三氟甲基。
如本文中所使用，术语“卤代烷氧基”本身或作为另一取代基的一部分是指其中一些或所有氢原子经卤素原子替代的烷氧基。
如本文中所使用，术语“卤环烃基”本身或作为另一取代基的一部分是指其中一些或所有氢原子经卤素原子替代的环烃基。
如本文中所使用，术语“氘代烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指其中一些或所有氢原子经氘原子替代的烷基。正如对于烷基，氘代烷基可具有任何适宜数量的碳原子，例如C1-6。在一些情况下，术语“全氘代”可用于界定其中所有氢均经氘替代的化合物或基团。
如本文中所使用，术语“芳基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有任何适宜数量的碳环原子及任何适宜数量的环的芳香族环系统。芳基可包括任何适宜数量的碳环原子，例如C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15或C16以及C6-10、C6-12或C6-14。芳基可以是单环基团，稠合而形成二环(例如，苯并环己基)或三环基团，或通过键连接而形成联芳基。代表性芳基包括苯基、萘基及联苯基。其他芳基包括苄基，其具有亚甲基连接基团。一些芳基具有6至12个环成员，例如苯基、萘基或联苯基。其他芳基具有6至10个环成员，例如苯基或萘基。一些其他芳基具有6个环成员，例如苯基。芳基可经取代或未经取代。除非另外规定，否则“经取代的芳基”可经一个或多个选自以下的基团取代：卤基、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基及烷氧基。
如本文中所使用，术语“亚芳基”是指如上文所定义的连接至少两个其他基团的芳基(即，二价芳基)。
如本文中所使用，术语“杂芳基”本身或作为另一取代基的一部分是指含有5至16个环原子的单环或稠合二环或三环芳香族环集合，其中1至5个环原子是杂原子(例如N、O或S)。亦可使用其他杂原子，包括(但不限于)B、Al、Si及P。该杂原子可经氧化以形成诸如(但不限于)-S(O)-及-S(O)2-的部分。杂芳基可包括任何数量的环原子，例如C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11或C3-12，其中至少一个碳原子由杂原子替代。杂芳基中可包括任何适宜数量的杂原子，例如1个、2个、3个、4个；或5个，或1至2个、1至3个、1至4个、1至5个、2至3个、2至4个、2至5个、3至4个、或3至5个。举例而言，杂芳基可以是C5-8杂芳基，其中1至4个碳环原子经杂原子替代；或C5-8杂芳基，其中1至3个碳环原子经杂原子替代；或C5-6杂芳基，其中1至4个碳环原子经杂原子替代；或C5-6杂芳基，其中1至3个碳环原子经杂原子替代。杂芳基可包括诸如以下的基团：吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、四唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-及1,3,5-异构物)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑及异噁唑。杂芳基亦可稠合至芳香族环系统(例如苯基环)以形成包括(但不限于)以下的成员：苯并吡咯(例如吲哚及异吲哚)、苯并吡啶(例如喹啉及异喹啉)、苯并吡嗪(喹喔啉)、苯并嘧啶(喹唑啉)、苯并哒嗪(例如酞嗪及噌啉)、苯并噻吩及苯并呋喃。其他杂芳基包括通过键连接的杂芳基环，例如联吡啶。杂芳基可经取代或未经取代。除非另外规定，否则“经取代的杂芳基”可经一个或多个选自以下的基团取代：卤基、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基及烷氧基。
杂芳基可经由环上的任一位置连接。举例而言，吡咯包括1-、2-及3-吡咯，吡啶包括2-、3-及4-吡啶，咪唑包括1-、2-、4-及5-咪唑，吡唑包括1-、3-、4-及5-吡唑，三唑包括1-、4-及5-三唑，四唑包括1-及5-四唑，嘧啶包括2-、4-、5-及6-嘧啶，哒嗪包括3-及4-哒嗪，1,2,3-三嗪包括4-及5-三嗪，1,2,4-三嗪包括3-、5-及6-三嗪，1,3,5-三嗪包括2-三嗪，噻吩包括2-及3-噻吩，呋喃包括2-及3-呋喃，噻唑包括2-、4-及5-噻唑，异噻唑包括3-、4-及5-异噻唑，噁唑包括2-、4-及5-噁唑，异噁唑包括3-、4-及5-异噁唑，吲哚包括1-、2-及3-吲哚，异吲哚包括1-及2-异吲哚，喹啉包括2-、3-及4-喹啉，异喹啉包括1-、3-及4-异喹啉，喹唑啉包括2-及4-喹唑啉，噌啉包括3-及4-噌啉，苯并噻吩包括2-及3-苯并噻吩且苯并呋喃包括2-及3-苯并呋喃。
一些杂芳基包括具有5至10个环成员及包括N、O或S的1至3个环原子的那些，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-及1,3,5-异构物)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪、噌啉、苯并噻吩及苯并呋喃。其他杂芳基包括具有5至8个环成员及包括N、O或S的1至3个杂原子的那些，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-及1,3,5-异构物)、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑及异噁唑。一些其他杂芳基包括具有9至12个环成员及1至3个杂原子的那些，例如吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪、噌啉、苯并噻吩、苯并呋喃及联吡啶。其他杂芳基包括具有5至6个环成员及包括N、O或S的1至2个环原子的那些，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、噻吩、呋喃、噻唑、异噻唑、噁唑及异噁唑。
一些杂芳基包括5至10个环成员及仅氮杂原子，例如吡咯、吡啶、咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-及1,3,5-异构物)、吲哚、异吲哚、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪及噌啉。其他杂芳基包括5至10个环成员及仅氧杂原子，例如呋喃及苯并呋喃。一些其他杂芳基包括5至10个环成员及仅硫杂原子，例如噻吩及苯并噻吩。其他杂芳基包括5至10个环成员及至少两个杂原子，例如咪唑、吡唑、三唑、吡嗪、嘧啶、哒嗪、三嗪(1,2,3-、1,2,4-及1,3,5-异构物)、噻唑、异噻唑、噁唑、异噁唑、喹喔啉、喹唑啉、酞嗪及噌啉。
如本文中所使用，术语“亚杂芳基”是指如上文所定义的连接至少两个其他基团的杂芳基(即，二价杂芳基)。
如本文中所使用，术语“杂环基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有3至12个环成员及1至4个N、O及S的杂原子的饱和环系统。亦可使用其他杂原子，包括(但不限于)B、Al、Si及P。该杂原子可经氧化以形成诸如(但不限于)-S(O)-及-S(O)2-的部分。杂环基可包括任何数量的环原子，例如C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11或C3-12，其中至少一个碳原子由杂原子替代。在杂环基中，任何适宜数量的碳环原子可经杂原子替代，例如1个、2个、3个、或4个，或1至2个、1至3个、1至4个、2至3个、2至4个、或3至4个。杂环基可包括诸如以下的基团：氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯烷、哌啶、氮杂环庚烷(azepane)、氮杂环辛烷(azocane)、奎宁环(quinuclidine)、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪(1,2-、1,3-及1,4-异构物)、环氧乙烷、氧杂环丁烷、四氢呋喃、噁烷(四氢吡喃)、氧杂环庚烷、硫杂环丙烷、硫杂环丁烷、四氢噻吩(四氢噻吩)、硫杂环己烷(四氢噻喃)、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、二氧戊环、二硫戊环、吗啉、硫代吗啉、二噁烷或二噻烷。杂环基亦可稠合至芳香族或非芳香族环系统以形成包括(但不限于)吲哚啉的成员。杂环基可未经取代或经取代。除非另外规定，否则“经取代的杂环基”可经一个或多个选自以下的基团取代：卤基、羟基、氨基、氧代(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基及烷氧基。
杂环基可经由环上的任一位置连接。举例而言，氮丙啶可以是1-或2-氮丙啶，氮杂环丁烷可以是1-或2-氮杂环丁烷，吡咯烷可以是1-、2-或3-吡咯烷，哌啶可以是1-、2-、3-或4-哌啶，吡唑烷可以是1-、2-、3-或4-吡唑烷，咪唑烷可以是1-、2-、3-或4-咪唑烷，哌嗪可以是1-、2-、3-或4-哌嗪，四氢呋喃可以是1-或2-四氢呋喃，噁唑烷可以是2-、3-、4-或5-噁唑烷，异噁唑烷可以是2-、3-、4-或5-异噁唑烷，噻唑烷可以是2-、3-、4-或5-噻唑烷，异噻唑烷可以是2-、3-、4-或5-异噻唑烷且吗啉可以是2-、3-或4-吗啉。
当杂环基包括3至8个环成员及1至3个杂原子时，代表性成员包括(但不限于)吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、噁烷、四氢噻吩、硫杂环己烷、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、吗啉、硫代吗啉、二噁烷及二噻烷。杂环基亦可形成具有5至6个环成员及1至2个杂原子的环，其中代表性成员包括(但不限于)吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、四氢噻吩、吡唑烷、咪唑烷、哌嗪、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷及吗啉。
如本文中所使用，术语“胺保护基团”是指使得氨基不反应，但亦可去除以恢复氨基的化学部分。胺保护基团的实例包括(但不限于)苄基氧基羰基；9-芴基甲基氧基羰基(Fmoc)；叔丁基氧基羰基(Boc)；烯丙基氧基羰基(Alloc)；对甲苯磺酰基(Tos)；2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基(Pmc)；2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢苯并呋喃-5-磺酰基(Pbf)；均三甲苯基-2-磺酰基(Mts)；4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯基磺酰基(Mtr)；乙酰氨基；邻苯二甲酰亚氨基；及诸如此类。其他胺保护基团为本领域技术人员所已知，包括(例如)Green及Wuts阐述的那些(Protective Groups in Organic Synthesis，第4版，2007,Wiley-Interscience,New York)。
如本文中所使用，术语“羰基”本身或作为另一取代基的一部分是指-C(O)-，即，碳原子双键键合至氧且结合至具有该羰基的部分中的两个其他基团。
如本文中所使用，术语“氨基”是指部分-NR2，其中每一R基团是H或烷基。氨基部分可经电离以形成相应铵阳离子。“二烷基氨基”是指氨基部分，其中每一R基团是烷基。
如本文中所使用，术语“磺酰基”是指部分-SO2R，其中R基团是烷基、卤代烷基或芳基。氨基部分可经电离以形成相应铵阳离子。“烷基磺酰基”是指氨基部分，其中R基团是烷基。
如本文中所使用，术语“羟基”是指部分-OH。
如本文中所使用，术语“氰基”是指碳原子三键键合至氮原子(即，部分-C≡N)。
如本文中所使用，术语“羧基”是指部分-C(O)OH。羧基部分可经电离以形成相应羧酸根阴离子。
如本文中所使用，术语“酰氨基”是指部分-NRC(O)R或-C(O)NR2，其中每一R基团是H或烷基。
如本文中所使用，术语“硝基”是指部分-NO2。
如本文中所使用，术语“氧代”是指双键键合至化合物的氧原子(即，O＝)。
如本文中所使用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指有助于向个体施用活性剂的物质。“药学上可接受的”意指赋形剂与调配物的其他成分兼容且对其接受者无害。可用于本发明中的药物赋形剂包括(但不限于)黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂及色素(colors)。
如本文中所使用，术语“盐”是指本发明化合物的酸式盐或碱式盐。药学上可接受的盐的说明性实例是矿物酸(盐酸、氢溴酸、磷酸及诸如此类)盐、有机酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸及诸如此类)盐、季铵(碘甲烷、碘乙烷及诸如此类)盐。应理解，药学上可接受的盐是无毒的。
本发明的酸性化合物的药学上可接受的盐是与碱所形成的盐，即阳离子盐，例如碱金属盐及碱土金属盐(例如钠、锂、钾、钙、镁)以及铵盐(例如铵、三甲基铵、二乙基铵及三-(羟基甲基)-甲基-铵盐)。
类似地，酸加成盐，例如矿物酸、有机羧酸及有机磺酸(例如盐酸、甲磺酸、马来酸)的酸加成盐亦有可能，条件是碱性基(例如吡啶基)构成结构的一部分。
化合物的中性形式可通过使盐与碱或酸接触并以常规方式分离母体化合物来再生。化合物的母体形式在某些物理性质上与各种盐形式不同(例如在极性溶剂中的溶解性)，但在其他方面，于本发明的目的，该盐等效于化合物的母体形式。
除了盐形式以外，本发明提供呈前药形式的化合物。本文中所述化合物的前药是在生理条件下容易进行化学变化以提供本发明化合物的那些化合物。另外，前药可通过化学或生物化学方法在离体环境中转化为本发明的化合物。举例而言，当与适宜的酶或化学试剂一起置于经皮贴片贮器中时，前药可缓慢转化为本发明的化合物。
如本文中所使用，术语“牙龈蛋白酶反应性部分”是指化合物中与牙龈蛋白酶活性位点硫醇反应以形成经共价修饰的牙龈蛋白酶的化学官能基，或是指化合物中与牙龈蛋白酶相互作用以形成非共价的牙龈蛋白酶/化合物复合物的化学官能基。牙龈蛋白酶反应性部分的实例包括(但不限于)卤代乙酰胺基(包括氯乙酰胺及碘乙酰胺)、马来酰亚胺基、苯并噻唑基-羰基及苯氧基甲基(包括卤化苯氧基甲基)。
如本文中所使用，术语“报告子部分”是指可使用包括(但不限于)光学方法(例如，荧光或UV-vis吸光度)及生物化学方法(例如，利用免疫化学试剂(例如抗体))的技术检测的化合物中的化学官能基。
如本文中所使用，术语“治疗(treat、treatment及treating)”是指在治疗或改善损伤、病理、病状或症状(例如，认知损害)方面(包括任何客观或主观参数)方面任何成功的迹象，例如，症状减轻、缓解、消除或使患者更能耐受该症状、损伤、病理或病状；降低症状进展的速率；减小症状或病状的频率或持续时间；或在一些情况下阻止症状发作。症状的治疗或改善可基于任何客观或主观参数；包括(例如)身体检查结果。
如本文中所使用，术语“有效量”及“治疗有效量”是指由于其施用而产生治疗效应的化合物(例如Rgp抑制剂)的剂量。准确剂量将取决于治疗目的，且将可由本领域技术人员使用已知技术来确定(例如，参见Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd，The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，Dosage Calculations(1999)；Goodman及Gilman，The PharmacologicalBasis of Therapeutics,第11版,2006,Brunton编辑,McGraw-Hill；及Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,第21版,2005,Hendrickson编辑,Lippincott,Williams&Wilkins)。
如本文中所使用，术语“阿兹海默氏病”是指人类及其他哺乳动物的中枢神经系统的进展性疾病。其显现为痴呆(尤其在老人中)；迷失方向；记忆丧失；关于语言、计算或视觉空间技能的困难；及精神病学表现。阿兹海默氏病与进展性神经退化及特征性病理学(即β淀粉样蛋白斑块及tau缠结)相关。
如本文中所使用，术语“骨关节炎”是指由关节软骨、滑膜组织及下伏骨的分解所造成的慢性退化性关节疾病。
如本文中所使用，术语“个体”是指动物，例如哺乳动物，其包括(但不限于)灵长类(例如人类)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠及诸如此类。
III.赖氨酸牙龈蛋白酶的抑制剂
本发明提供用于抑制牙龈卟啉单胞菌的化合物。在第一实施方案中，本发明提供式I的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
A选自-CH2-及-O-；
R1a及R1b各自独立地选自氢、C1-4烷基及胺保护基团；
R2a及R2b各自独立地选自氢、卤素、C1-4卤代烷基及C1-4卤代烷氧基；
R3选自C3-8环烃基、C3-8烷基、3员至12员杂环基、C6-10芳基、5员至12员杂芳基及报告子部分，其中R3任选地经一个或多个R3a取代基取代；
每一R3a独立地选自卤素、-CN、-NO2、-N3、-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、-N(Rc)2、-N+(Rb)3、-(CH2)kC(O)Rb、-NRc(CH2)uC(O)Rb、-O(CH2)uC(O)Rb、-(CH2)kCONRcRc、-(CH2)kNRcC(O)Rb、-NRc(CH2)uCONRcRc、-NRc(CH2)uNRcC-(O)Rb、-O(CH2)uCONRcRc及-O(CH2)uNRcC(O)Rb以及任选地经取代的三唑基；
每一Rb独立地选自C1-4烷基、C1-4卤代烷基及C1-4氘代烷基；
每一Rc独立地选自氢及C1-8烷基；
每一下标k独立地选自0、1、2、3、4、5及6；
每一下标u独立地选自1、2、3、4、5及6；
R4选自氢及C1-4烷基；
R5选自-CH2R5a、-CHS(O)(R5b)2及C1-6卤代烷基；
R5a选自-O-R6、-S-R7、-SO-R7、-SO2-R7、-N(R8)2、5员至12员杂芳基及3员至12员杂环基，
其中5员至12员杂芳基任选地经一个或多个独立地选自卤素、C1-3烷基及C1-3卤代烷基的成员取代，且
3员至12员杂环基任选地经一个或多个独立地选自氧代、卤素、C1-3烷基及C1-3卤代烷基的成员取代；
每一R5b是独立选择的C1-6烷基；
R6及R7选自苯基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基及5员至12员杂芳基，
其中苯基经1至5个卤素取代，且
其中5员至12员杂芳基任选地经一个或多个卤素、C1-3烷基或C1-3卤代烷基取代；
每一R8是独立选择的C1-6烷基；且
R5任选地包含淬灭部分R9；
条件是R5不为2,3,5,6-四氟苯氧基甲基。
在一些实施方案中：
A选自-CH2-及-O-；
R1a及R1b各自独立地选自氢、C1-4烷基及胺保护基团；
R2a及R2b各自独立地选自氢、卤素、C1-4卤代烷基及C1-4卤代烷氧基；
R3选自C3-8环烃基、C3-8烷基、C6-10芳基、C5-12杂芳基及C3-12杂环基，其中R3任选地经一个或多个R3a取代基取代；
每一R3a独立地选自卤素、-CN、-NO2、-N3、-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、-N(Rc)2、-(CH2)kC(O)Rb、-NRc(CH2)uC(O)Rb、-O(CH2)uC(O)Rb、-(CH2)kCONRcRc、-(CH2)kNRcC(O)Rb、-NRc(CH2)uCONRcRc、-NRc(CH2)uNRcC(O)Rb、-O(CH2)uCONRcRc、及-O(CH2)uNRcC(O)Rb以及任选地经取代的三唑基；
每一Rb独立地选自C1-4烷基、C1-4卤代烷基及C1-4氘代烷基；
每一Rc独立地选自氢及C1-8烷基；
每一下标k独立地选自0、1、2、3、4、5及6；
每一下标u独立地选自1、2、3、4、5及6；
R4选自氢及C1-4烷基；
R5选自C1-6卤代烷基及-CH2R5a；
R5a选自-O-R6、-S-R7、-SO-R7、-SO2-R7、-N(R8)2及C5-12杂芳基；
R6选自苯基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基及C5-12杂芳基,
其中苯基经1至5个卤素取代，且
其中C5-12杂芳基任选地经卤素或C1-3卤代烷基取代；
R7选自苯基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基及C5-12杂芳基，
其中苯基任选地经1至5个卤素取代，且
其中C5-12杂芳基任选地经卤素或C1-3卤代烷基取代；且
每一R8是独立选择的C1-6烷基；
条件是当R5不为2,3,5,6-四氟苯氧基甲基时。
本发明的化合物可以经保护的形式(即，其中R1a及R1b的至少一者是胺保护基团的化合物)来制备。可使用多个适宜保护基团，如(例如)Green及Wuts(Protective Groups inOrganic Synthesis,第4版,2007,Wiley-Interscience,New York)所阐述。在一些实施方案中，R1a是H且R1b选自苄基氧基羰基；9-芴基甲基氧基羰基；叔丁基氧基羰基；及烯丙基氧基羰基。在一些实施方案中，R1a是H且R1b是叔丁基氧基羰基。化合物亦可以烷基化形式(即，其中R1a及R1b的至少一者是烷基的化合物)来制备。R1a及R1b的一者或两者可以是(例如)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基或叔丁基。
在一些实施方案中，R1a及R1b是H；R2a及R2b独立地选自氢及氟；且A是-CH2-。
在一些实施方案中，R1a及R1b是H；R2a及R2b独立地选自氢及氟；A是-CH2-；且R4选自氢及C1-4烷基。在一些此类实施方案中，R4选自氢及甲基。在一些此类实施方案中，R4是氢。
在一些实施方案中，A是-CH2-；R2a是氢；R2b是氢或氟；且R1a及R1b是H。在一些实施方案中，A是-CH2-；R2a是氢；R2b是氟；且R1a及R1b是H。
在一些实施方案中，本发明提供具有式Ia结构的化合物：
及其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，本发明提供式I或式Ia的化合物及其药学上可接受的盐，其中R3选自C3-8环烃基、C3-8烷基、C6-10芳基、C5-12杂芳基及C3-12杂环基，其各自任选地经一个或多个R3a取代基取代。举例而言，R3可以是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。R3可以是正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、支链戊基、正己基、支链己基、正庚基、支链庚基、正辛基或支链辛基。在一些实施方案中，R3选自未经取代或经取代的环丁基、未经取代或经取代的环戊基及未经取代或经取代的环己基。在一些实施方案中，R3是未经取代或经取代的异丙基。
在一些实施方案中，R3选自未经取代或经取代的苯基及未经取代或经取代的萘基。在一些实施方案中，R3选自未经取代或经取代的吡咯基、未经取代或经取代的吡啶基、未经取代或经取代的咪唑基、未经取代或经取代的吡唑基、未经取代或经取代的三唑基、未经取代或经取代的吡嗪基、未经取代或经取代的三嗪基、未经取代或经取代的吲哚基、未经取代或经取代的异吲哚基及未经取代或经取代的喹啉基。
在一些实施方案中，R3选自环戊基及苯基，其各自任选地经一个或多个R3a取代基取代。在一些此类实施方案中，每一R3a独立地选自卤素、-N3、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基及-NRcC(O)Rb。在一些实施方案中，R3是环戊基。
在一些实施方案中，本发明提供式I或式Ia的化合物及其药学上可接受的盐，其中R3选自C3-8烷基、C3-8环烃基、C6-10芳基、C5-12杂芳基及C3-12杂环基，其各自任选地经一个或多个R3a取代基取代。在一些此类实施方案中，R3选自异丙基、环戊基、苯基、吡啶-2-基、吡啶-3-基及吡啶-4-基，其各自任选地经一个或多个R3a取代基取代。在一些此类实施方案中，每一R3a独立地选自卤素、-N3、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、-N(Rc)2、-N+(Rb)3及-NRcC(O)Rb。
在一些实施方案中，R3是环戊基。在一些实施方案中，R3是环戊基且R5选自如下文所述的实施方案(A)、实施方案(B)、实施方案(C)、实施方案(D)、实施方案(E)、实施方案(F)、实施方案(G)、实施方案(H)、实施方案(J)或实施方案(K)中的取代基。
在一些实施方案中，R3是经C1-4烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、异丙氧基、叔丁氧基及诸如此类)取代的C3-8烷基(例如，正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基及诸如此类)。在一些实施方案中，R3是甲氧基丙基。在一些实施方案中，R3是(2-甲氧基)-丙-2-基。在一些实施方案中，R3是(2-甲氧基)丙-2-基且R5选自如下文所述的实施方案(A)、实施方案(B)、实施方案(C)、实施方案(D)、实施方案(E)、实施方案(F)、实施方案(G)、实施方案(H)、实施方案(J)或实施方案(K)中的取代基。
在一些实施方案中，R3是未经取代的苯基或R3是经一个或多个卤素、-N3、C1-4卤代烷氧基和/或-NRcC(O)Rb取代的苯基。在一些此类实施方案中，R5选自如下文所述的实施方案(A)、实施方案(B)、实施方案(C)、实施方案(D)、实施方案(E)、实施方案(F)、实施方案(G)、实施方案(H)、实施方案(J)或实施方案(K)中的取代基。
在一些实施方案中，R3是未经取代的吡啶基(即，吡啶-2-基、吡啶-3-基或吡啶-4-基)或经一个或多个卤素、-N(Rc)2和/或-N+(Rb)3取代的吡啶基。在一些此类实施方案中，R5选自如下文所述的实施方案(A)、实施方案(B)、实施方案(C)、实施方案(D)、实施方案(E)、实施方案(F)、实施方案(G)、实施方案(H)、实施方案(J)或实施方案(K)中的取代基。
含有叠氮基团的化合物(例如，其中R3a是-N3的化合物)可经由与互补反应配偶体(例如携带炔烃的化合物或携带膦的化合物)反应而经其他官能基修饰。叠氮化物与炔烃经由[3+2]环加成(通常称为“点击化学”)的反应可用于在本发明的化合物中安装各种经取代的三唑基。因此，本发明的一些实施方案提供化合物，其中连接部分-L3-是根据下式的任选地经取代的三唑基部分：
其中波形线是与R3a的连结点且虚线是与R3c的连结点。
在一些实施方案中，连接部分L3a具有结构-L3b-L3c-，其中L3b及L3c独立地选自键、二价聚合物部分及直链或支链、饱和或不饱和C1-30烃基；
其中C1-30烃基中的一个或多个碳原子任选地且独立地由O、S、NRa替代；
其中C1-30烃基中的两个或更多个毗邻碳原子组群任选地且独立地由-NRa(CO)-或-(CO)NRa-替代；且
其中C1-30烃基中的两个或更多个毗邻碳原子组群任选地且独立地由4员至8员二价碳环或4员至8员具有1至4个选自O、S及N的杂原子的二价杂环替代；
且其中每一Ra独立地选自H及C1-6烷基。
在一些实施方案中，官能基R3c选自发色团、荧光团及结合部分(例如，生物素、谷胱甘肽及诸如此类)，如下文更详细地阐述。
在某些实施方案中，R3与其所键合的羰基形成除天然氨基酸残基(L氨基酸残基)或天然氨基酸残基的异构物(D氨基酸残基)以外的部分。在一些实施方案中，R3与其所键合的羰基形成除以下以外的部分：天冬酰氨酰基、经取代的天冬酰氨酰基、谷氨酰氨酰基(即，谷氨酰胺残基)、经取代的谷氨酰氨酰基(即，经取代的谷氨酰胺残基)、谷氨酰基(即，谷氨酸残基)、经取代的谷氨酰基(即，经取代的谷氨酸残基)、异亮氨酰基、经取代的异亮氨酰基、亮氨酰基、经取代的亮氨酰基、赖氨酰基、经取代的赖氨酰基、甲硫氨酰基、经取代的甲硫氨酰基、脯氨酰基、经取代的脯氨酰基、苏氨酰基、经取代的苏氨酰基、缬氨酰基或经取代的缬氨酰基。经取代的氨基酸残基可存在于具有两个或更多个经由胺键连接的氨基酸残基的较大肽基团中。
在一些实施方案中，本发明提供式I或式Ia的化合物及其药学上可接受的盐，其中R4是氢或甲基。在一些此类实施方案中，R5是-CH2R5a且R5a选自C5-12杂芳基及-O-R6。在一些此类实施方案中，R5a是-O-苯基，其中苯基经1至5个卤素取代。在一些此类实施方案中，R4是氢。
在一些实施方案中，式I或式Ia的化合物中的R5a选自-S-R7、-SO-R7、-SO2-R7、C5-12杂芳基及-N-R8。在一些实施方案中，R5a选自-O-R6、C5-12杂芳基及-N-R8。在一些实施方案中，R5a选自-O-R6、-S-R7、-SO-R7、-SO2-R7及-N-R8。在一些实施方案中，R5a选自-O-R6、-S-R7、-SO-R7、-SO2-R7及C5-12杂芳基。
在一些实施方案(A)中，式I或式Ia的化合物中的R5a选自C1-6卤代烷氧基(即-O-R6，其中R6是C1-6卤代烷基)、C1-6烷硫基(即-S-R7，其中R7是C1-6烷基)、C1-6卤代烷硫基(即-S-R7，其中R7是C1-6卤代烷基)、C1-6烷基磺酰基(即-SO2-R7，其中R7是C1-6烷基)、(C1-6二烷基)氨基(即-NR8)、C5-12杂芳基、3员至12员杂环基、-O-苯基(其中苯基经1至5个卤素取代)及-S-苯基(其中苯基任选地经1至5个卤素取代)。在实施方案(A)中，R3可以是上文所述的取代基或取代基群的任一者。
在一些实施方案(B)中，式I或式Ia的化合物中的R5a选自C1-6烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6卤代烷硫基、C1-6烷基磺酰基、(C1-6二烷基)氨基、C5-12杂芳基、3员至12员杂环基、-O-苯基(其中苯基经1至5个卤素取代)及-S-苯基(其中苯基任选地经1至5个卤素取代)。在实施方案(B)中，R3可以是上文所述的取代基或取代基群的任一者。
在一些实施方案(C)中，式I或式Ia的化合物中的R5a选自C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、C1-6卤代烷硫基、C1-6烷基磺酰基、(C1-6二烷基)氨基、C5-12杂芳基、3员至12员杂环基、-O-苯基(其中苯基经1至5个卤素取代)及-S-苯基(其中苯基任选地经1至5个卤素取代)。在实施方案(C)中，R3可以是上文所述的取代基或取代基群的任一者。
在一些实施方案(D)中，式I或式Ia的化合物中的R5a选自C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6烷基磺酰基、(C1-6二烷基)氨基、C5-12杂芳基、3员至12员杂环基、-O-苯基(其中苯基经1至5个卤素取代)及-S-苯基(其中苯基任选地经1至5个卤素取代)。在实施方案(D)中，R3可以是上文所述的取代基或取代基群的任一者。
在一些实施方案(E)中，式I或式Ia的化合物中的R5a选自C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6卤代烷硫基、(C1-6二烷基)氨基、C5-12杂芳基、3员至12员杂环基、-O-苯基(其中苯基经1至5个卤素取代)及-S-苯基(其中苯基任选地经1至5个卤素取代)。在实施方案(E)中，R3可以是上文所述的取代基或取代基群的任一者。
在一些实施方案(F)中，式I或式Ia的化合物中的R5a选自C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6卤代烷硫基、C1-6烷基磺酰基、C5-12杂芳基、3员至12员杂环基、-O-苯基(其中苯基经1至5个卤素取代)及-S-苯基(其中苯基任选地经1至5个卤素取代)。在实施方案(F)中，R3可以是上文所述的取代基或取代基群的任一者。
在一些实施方案(G)中，式I或式Ia的化合物中的R5a选自C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6卤代烷硫基、C1-6烷基磺酰基、(C1-6二烷基)氨基、3员至12员杂环基、-O-苯基(其中苯基经1至5个卤素取代)及-S-苯基(其中苯基任选地经1至5个卤素取代)。在实施方案(G)中，R3可以是上文所述的取代基或取代基群的任一者。
在一些实施方案(H)中，式I或式Ia的化合物中的R5a选自C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6卤代烷硫基、C1-6烷基磺酰基、(C1-6二烷基)氨基、C5-12杂芳基、3员至12员杂环基及-S-苯基(其中苯基任选地经1至5个卤素取代)。在实施方案(H)中，R3可以是上文所述的取代基或取代基群的任一者。
在一些实施方案(J)中，式I或式Ia的化合物中的R5a选自C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6卤代烷硫基、C1-6烷基磺酰基、(C1-6二烷基)氨基、C5-12杂芳基、3员至12员杂环基及-O-苯基(其中苯基经1至5个卤素取代)。在实施方案(J)中，R3可以是上文所述的取代基或取代基群的任一者。
在一些实施方案(K)中，式I或式Ia的化合物中的R5a选自C1-6烷氧基、C1-6卤代烷氧基、C1-6烷硫基、C1-6卤代烷硫基、C1-6烷基磺酰基、(C1-6二烷基)氨基、C5-12杂芳基、-O-苯基(其中苯基经1至5个卤素取代)及-S-苯基(其中苯基任选地经1至5个卤素取代)。在实施方案(K)中，R3可以是上文所述的取代基或取代基群的任一者。
在一些实施方案中，R5a中的每一卤素独立地选自F及Cl。在一些实施方案中，R5a中的每一卤素是F。
在一些实施方案中，R5a是具有以下结构的部分：
其中R5b、R5c、R5d、R5e及R5f独立地选自氢及卤素，且波形线表示与化合物的连结点。
在一些实施方案中：
R5c是卤素，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是H，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是H，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是H，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是H，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是H。
在一些实施方案中：
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是H。
在一些实施方案中：
R5c是F，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是F，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是H，R5e是F，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是H，R5e是H，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是F，R5e是F，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F，R5e是H，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F，R5e是H，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是F，R5e是F，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是F，R5e是H，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是F，R5e是H，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是H，R5e是F，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是H，R5e是F，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是H，R5e是H，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是F，R5e是F，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F，R5e是F，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是F，R5e是H，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是F，R5e是F，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是H，R5e是F，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是F，R5e是F，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是F，R5e是F，R5f是F，且R5g是H。
在某些实施方案中，R5a不为2,3,5,6-四氟苯氧基。
在一些实施方案中，本发明提供式I的化合物及其药学上可接受的盐，其中R5a选自2-氟苯氧基；3-氟苯氧基；4-氟苯氧基；2,3-二氟苯氧基；2,4-二氟苯氧基；2,5-二氟苯氧基；2,6-二氟苯氧基；3,4-二氟苯氧基；3,5-二氟苯氧基；2,3,6-三氟苯氧基；及2,3,5-三氟苯基。在一些此类实施方案中，R5a选自2-氟苯氧基；3-氟苯氧基；2,3-二氟苯氧基；2,5-二氟苯氧基；2,6-二氟苯氧基；3,5-二氟苯氧基；2,3,6-三氟苯氧基；及2,3,5-三氟苯氧基。在一些此类实施方案中，R5a选自2,6-二氟苯氧基及2,3,6-三氟苯氧基。
在一些实施方案中，本发明提供式Ia化合物及其药学上可接受的盐，其中R5a选自2-氟苯氧基；3-氟苯氧基；4-氟苯氧基；2,3-二氟苯氧基；2,4-二氟苯氧基；2,5-二氟苯氧基；2,6-二氟苯氧基；3,4-二氟苯氧基；3,5-二氟苯氧基；2,3,6-三氟苯氧基；及2,3,5-三氟苯基。在一些此类实施方案中，R5a选自2-氟苯氧基；3-氟苯氧基；2,3-二氟苯氧基；2,5-二氟苯氧基；2,6-二氟苯氧基；3,5-二氟苯氧基；2,3,6-三氟苯氧基；及2,3,5-三氟苯氧基。在一些此类实施方案中，R5a选自2,6-二氟苯氧基及2,3,6-三氟苯氧基。
在一些实施方案中，本发明提供式I或式Ia的化合物及其药学上可接受的盐，其中R5a选自-N(R8)2、5员至12员杂芳基及3员至12员杂环基，其中5员至12员杂芳基任选地经一个或多个独立地选自卤素、C1-3烷基及C1-3卤代烷基的成员取代，且3员至12员杂环基任选地经一个或多个独立地选自氧代、卤素、C1-3烷基及C1-3卤代烷基的成员取代。
在一些实施方案中，R5a是5员至12员杂芳基或3员至12员杂环基。R5a可以是(例如)吡咯基、吡啶基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、吡嗪基、三嗪基、吲哚基、异吲哚基或喹啉基。在一些实施方案中，R5a是四唑基(例如，1H-四唑-1-基或2H-四唑-2-基)。在一些实施方案中，R5a是6-氧代嘧啶-1(6H)-基。在一些实施方案中，R5a是四唑基或6-氧代嘧啶-1(6H)-基，且R3选自(2-甲氧基)丙-2-基、未经取代的苯基、经一个或多个卤素、-N3、C1-4卤代烷氧基和/或-NRcC(O)Rb取代的苯基、未经取代的吡啶基以及经一个或多个卤素、-N(Rc)2和/或-N+(Rb)3取代的吡啶基。
在一些实施方案中，R5a是-N(R8)2，其中每一R8是独立选择的C1-6烷基。在此类实施方案中，每一R8可独立地是(例如)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基或正己基。在一些实施方案中，R5a是二甲基氨基。在一些实施方案中，R5a是二甲基氨基且R3选自(2-甲氧基)丙-2-基、未经取代的苯基、经一个或多个卤素、-N3、C1-4卤代烷氧基和/或-NRcC(O)Rb取代的苯基、未经取代的吡啶基以及经一个或多个卤素、-N(Rc)2和/或-N+(Rb)3取代的吡啶基。
在一些实施方案中，R5a是-O-R6，其中R6是C1-6卤代烷基。在此类实施方案中，R6可以是(例如)氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氯乙基、2,2,2-三氟乙基、五氯乙基、五氟乙基、1,1,1,3,3,3-六氯丙基、1,1,1,3,3,3-六氟丙基或诸如此类。在一些实施方案中，R5a选自2,2,2-三氟乙氧基及1,1,1,3,3,3-六氟异丙氧基。在一些此类实施方案中，R3选自(2-甲氧基)丙-2-基、未经取代的苯基、经一个或多个卤素、-N3、C1-4卤代烷氧基和/或-NRcC(O)Rb取代的苯基、未经取代的吡啶基以及经一个或多个卤素、-N(Rc)2和/或-N+(Rb)3取代的吡啶基。
在一些实施方案中，R5a是-O-R6，且R6是5员至12员杂芳基，其任选地经一个或多个独立地选自卤素、C1-3烷基及C1-3卤代烷基的成员取代。举例而言，当R5a是-O-R6时，R6可以是异噁唑基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、噁嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基。在一些实施方案中，R5a是-O-R6且R6选自吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基、异噁唑-3-基、异噁唑-4-基、异噁唑-5-基、嘧啶-2-基、嘧啶-4-基、嘧啶-5-基及嘧啶-6-基。在一些实施方案中，R5a是-O-R6且R6选自异噁唑-3-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基、2,6-二甲基吡啶-5-基及2-甲基嘧啶-5-基。在一些实施方案中，R5a是-O-R6，R6选自异噁唑-3-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基、2,6-二甲基吡啶-5-基及2-甲基嘧啶-5-基，且R3选自(2-甲氧基)丙-2-基、未经取代的苯基、经一个或多个卤素、-N3、C1-4卤代烷氧基和/或-NRcC(O)Rb取代的苯基、未经取代的吡啶基以及经一个或多个卤素、-N(Rc)2和/或-N+(Rb)3取代的吡啶基。
在一些实施方案中，R5选自-CH2R5a及-CHS(O)(R5b)2。在一些实施方案中，R5是-CHS(O)(R5b)2(例如，二甲基(氧代)-λ6-亚硫烷基)。在一些实施方案中，R5是-CH2R5a，R5a选自-S-R7及-SO2-R7，且R7是C1-6烷基。在此类实施方案中，R7可以是(例如)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基或正己基。在一些实施方案中，R5a是甲硫基。在一些实施方案中，R5a是甲磺酰基。在一些实施方案中，R5a是甲硫基或甲磺酰基，且R3选自(2-甲氧基)丙-2-基、未经取代的苯基、经一个或多个卤素、-N3、C1-4卤代烷氧基和/或-NRcC(O)Rb取代的苯基、未经取代的吡啶基以及经一个或多个卤素、-N(Rc)2和/或-N+(Rb)3取代的吡啶基。
在一些实施方案中，R5a是-S-R7，且R7是5员至12员杂芳基，其任选地经一个或多个独立地选自卤素、C1-3烷基及C1-3卤代烷基的成员取代。举例而言，当R5a是-S-R7时，R7可以是异噁唑基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、噁嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基。在一些实施方案中，R5a是-S-R7且R7选自吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基、异噁唑-3-基、异噁唑-4-基、异噁唑-5-基、嘧啶-2-基、嘧啶-4-基、嘧啶-5-基及嘧啶-6-基。在一些实施方案中，R5a是-S-R7且R7选自异噁唑-3-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基、2,6-二甲基吡啶-5-基及2-甲基嘧啶-5-基。在一些实施方案中，R5a是-S-R7，R7选自吡啶-3-基、吡啶-4-基、2,6-二甲基吡啶-5-基及2-甲基嘧啶-5-基，且R3选自(2-甲氧基)丙-2-基、未经取代的苯基、经一个或多个卤素、-N3、C1-4卤代烷氧基和/或-NRcC(O)Rb取代的苯基、未经取代的吡啶基以及经一个或多个卤素、-N(Rc)2和/或-N+(Rb)3取代的吡啶基。
在一些实施方案中，R5是C1-6卤代烷基。R5可以是(例如)氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氯乙基、2,2,2-三氟乙基、五氯乙基、五氟乙基、1,1,1,3,3,3-六氯丙基、1,1,1,3,3,3-六氟丙基或诸如此类。在一些实施方案中，R5是二氟甲基。在一些实施方案中，R5是二氟甲基且R3选自(2-甲氧基)丙-2-基、未经取代的苯基、经一个或多个卤素、-N3、C1-4卤代烷氧基和/或-NRcC(O)Rb取代的苯基、未经取代的吡啶基以及经一个或多个卤素、-N(Rc)2和/或-N+(Rb)3取代的吡啶基。
在一些实施方案中，本发明提供式I或式Ia的化合物及其药学上可接受的盐，其中R5是卤代烷基。举例而言，R5可以是氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、二氟甲基或三氟甲基。
在一些实施方案中，本发明提供如下表1中所述的化合物或其药学上可接受的盐。
表1.赖氨酸牙龈蛋白酶抑制剂。
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在一些实施方案中，化合物选自：
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及其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，化合物选自：
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及其药学上可接受的盐。
本文中所述的化合物及使用其的方法涵盖所述化合物的治疗活性对映异构物或非对映异构物的制备及用途。这些化合物的所有此类对映异构物及非对映异构物均包括在本发明的范围中。此类化合物可作为混合物(例如，外消旋混合物)或作为经分离的对映异构物或非对映异构物使用。
本发明的化合物可经制备以便包括用于诊断成像应用(例如正电子发射断层摄影术(PET)及单光子发射计算机断层摄影术(SPECT))的放射性核素。举例而言，如本文中所述的Kgp抑制剂可经制备以便包括一种或多种选自以下的放射性核素：氧-15(15O)、氮-13(13N)、碳-11(11C)、碘-131(131I)及氟-18(18F)。此类经放射标记的化合物可用于PET成像。本发明的化合物亦可以氘化形式(即，具有一个或多个氘原子2H替代一个或多个氢原子)、氚化形式(即，具有一个或多个氚原子3H替代一个或多个氢原子)或经14C-标记的形式(即，具有一个或多个14C原子替代一个或多个碳原子)来制备。
本发明的化合物可使用如方案1中所示的起始材料A1来制备。在A1中，可使用不影响另一者的化学条件来操控优选的R9及R1c基团。举例而言，R1c＝苄基可通过氢及钯-碳催化剂去除，但R1c不受三氟乙酸影响，而R9＝叔丁基可通过三氟乙酸去除，但R9不受氢及钯-碳催化剂影响。R9及R1c的其他适当的互补组合及用于其选择性修饰的方法为本领域已知的。
方案1
可于有机溶剂(例如DMF)中用羧酸R3CO2H及外消旋化抑制剂(例如HOBt)以及脱水剂(例如EDAC)来处理A1，从而产生A2。或者，可于有机溶剂(例如CH2Cl2)中用R3COX(其中X是离去基团(例如氯))及有机碱(例如Et3N)来处理A1，从而产生A2。各种可应用的羧酸(R3CO2H)及其衍生物(R3COX)可购得，或可根据已知方法来制备。R9可通过适当化学条件去除而产生A3。可使A3与氯甲酸酯(例如，氯甲酸异丁酯、氯甲酸乙酯及诸如此类)、之后重氮甲烷反应以提供A4。A4可经由利用氢卤酸(即HX，其中X是卤素(例如Cl、Br或I))处理而转化为A5。在碱存在下使用化合物R5a-H(例如，卤化酚或杂芳香族化合物)自A5置换卤化物可提供经保护的化合物A6，其可去保护从而提供式I的产物。或者，可使羧酸A3N-酰化且环化以得到相应的5(4H)-噁唑酮。可使噁唑酮进一步与α-氟化羧酸的酸酐(例如，三氟乙酸酐)反应以提供C-酰化的5(4H)-噁唑酮，其使用草酸去羰基以形成式I的化合物，其中R5是卤代烷基(参见，Kolb等人，Liebigs.Ann.Chem.,1990,第1-6页；Kolb等人，Tet.Lett.1986,(27)：第1579-1582页及第4437-4440页)。
式(I)的某些实例的制备将需要首先制备非天然氨基酸，该非天然氨基酸的特征在于不存在于蛋白质中所出现的任何氨基酸中的侧链。对于特征在于非天然侧链的氨基酸的制备，已发表众多种方法，包括如下文所汇总的最有用及重要的方法F1-4。
尽管在F1-3中未图解说明，但在应用这些方法之前胺及羧酸根基团通常经保护，且在构筑非天然侧链之后去除该保护。在F1中，天然侧链(R)经修饰以形成非天然侧链(R’)。天然氨基酸丝氨酸、谷氨酸及甲硫氨酸将尤其用于式(I)及(II)的某些实例的制备。在F2中，利用烷基化剂(R’X)处理金属化甘氨酸衍生物以安装非天然侧链(R’)。在一些情况下，金属化甘氨酸衍生物是通过利用强碱性金属化剂(例如二异丙基氨基锂或叔丁醇钾)处理甘氨酸衍生物来产生。在其他情况下，起始甘氨酸衍生物是足够酸的，使得
碱性极小的金属化剂(例如碳酸钾)即令人满意。在后者情况下，金属化甘氨酸衍生物可作为解离的离子对而非作为F2中所图解说明的共价键合物质存在。在F3中，利用烷基化剂(R’X)处理金属化丙氨酸衍生物以安装非天然侧链(R’)。在大多数情况下，金属化丙氨酸衍生物是通过利用低价金属(例如锌粉)处理卤化丙氨酸衍生物来产生。在多种情况下，利用可溶性钯催化剂来促进F3。在F4中，使醛(R’CHO)与氨源及氰化物源反应以产生氨基-腈，其随后进行水解以产生特征在于非天然侧链(R’)的氨基酸。
尽管在F1-3中未图解说明，但在应用这些方法之前胺及羧酸根基团通常经保护，且在构筑非天然侧链之后去除该保护。在F1中，天然侧链(R)经修饰以形成非天然侧链(R’)。天然氨基酸丝氨酸、谷氨酸及甲硫氨酸将尤其用于式(I)及(II)的某些实例的制备。在F2中，利用烷基化剂(R’X)处理金属化甘氨酸衍生物以安装非天然侧链(R’)。在一些情况下，金属化甘氨酸衍生物是通过利用强碱性金属化剂(例如二异丙基氨基锂或叔丁醇钾)处理甘氨酸衍生物来产生。在其他情况下，起始甘氨酸衍生物是足够酸的，使得碱性极小的金属化剂(例如碳酸钾)即令人满意。在后者情况下，金属化甘氨酸衍生物可作为解离的离子对而非作为F2中所图解说明的共价键合物质存在。在F3中，利用烷基化剂(R’X)处理金属化丙氨酸衍生物以安装非天然侧链(R’)。在大多数情况下，金属化丙氨酸衍生物是通过利用低价金属(例如锌粉)处理卤化丙氨酸衍生物来产生。在多种情况下，利用可溶性钯催化剂来促进F3。在F4中，使醛(R’CHO)与氨源及氰化物源反应以产生氨基-腈，其随后进行水解以产生特征在于非天然侧链(R’)的氨基酸。
在应用适当方法以制备特征在于非天然侧链的氨基酸之后，如上文所阐述，这些氨基酸可经适当保护，且然后可应用适当方法以产生其中赖氨酸侧链已经非天然侧链替代的中间体及产物。因此，可使用适宜方法来提供指定用于式(I)的CH2AC(R2a)(R2b)CH2N(R1a)(R1b)的变化形式。
IV.药物组合物及赖氨酸牙龈蛋白酶抑制剂的施用
在相关方面中，本发明提供包含式I的化合物及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
药物组合物可通过药学及药物递送领域中所熟知的任何方法来制备。一般而言，制备组合物的方法包括使活性成分与含有一种或多种辅助成分的载剂缔合的步骤。药物组合物通常是通过以下来制备：使活性成分与液体载剂或精细分散的固体载剂或二者均匀且充分地缔合，且然后(若需要)使产物成形为所期望的调配物。组合物可便捷地制备和/或以单位剂型包装。
含有本发明的化合物的药物组合物可经调配用于经口使用。用于经口施用的适宜组合物包括(但不限于)片剂、糖锭剂、锭剂、水性或油性混悬剂、可分散粉末或颗粒、乳液、硬脂或软质胶囊、糖浆、酏剂、溶液、经颊贴剂、经口凝胶、口香糖、可咀嚼片剂、泡腾粉及泡腾片。用于经口施用的组合物可根据本领域技术人员已知的任何方法来调配。此类组合物可含有一种或多种选自甜味剂、矫味剂、着色剂、抗氧化剂及防腐剂的试剂以提供药学上美观且可口的制剂。
片剂通常含有活性成分与无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物，该赋形剂包括：惰性稀释剂，例如纤维素、二氧化硅、氧化铝、碳酸钙、碳酸钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、乳糖、磷酸钙及磷酸钠；造粒剂及崩解剂，例如玉米淀粉及海藻酸；黏合剂，例如聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、纤维素、聚乙二醇(PEG)、淀粉、明胶及阿拉伯树胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸及滑石。片剂可未包被或可通过已知技术包被(肠溶包衣或其他方式)以延迟在胃肠道中的崩解及吸收，并藉此在较长时期内提供持续的作用。举例而言，可采用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的延时材料。片剂亦可根据已知技术经半渗透膜及任选的聚合渗透剂(osmogent)包被以形成用于受控释放的渗透泵组合物。
用于经口施用的组合物可调配为硬质明胶胶囊，其中将活性成分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土(kaolin))混合；或软质明胶胶囊，其中将活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
Kgp抑制剂亦可作为溶液、软膏剂、乳霜、凝胶或混悬剂以及漱口剂、滴眼剂及诸如此类而局部施用。此外，Kgp抑制剂的经皮递送可藉助离子电渗贴剂及诸如此类来完成。
含有Kgp抑制剂的药物组合物亦可呈无菌可注射水性或油性溶液及混悬液的形式。无菌可注射制剂可使用无毒的非经肠可接受的媒剂(包括水、林格氏溶液(Ringer’ssolution)及等渗氯化钠溶液)以及可接受的溶剂(例如1,3-丁二醇)来调配。另外，可使用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于此目的，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯。
在一些实施方案中，Kgp抑制剂可与聚合物(例如Pluronic F127)一起调配并皮下递送。Pluronic是在体温下固化的水凝胶，且可在持续数天至数周的时期内提供延长的药物递送。
水性悬浮液可含有一种或多种Kgp抑制剂与赋形剂的混合物，该赋形剂包括(但不限于)：悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、油性-丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯基-吡咯烷酮、黄蓍胶及阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，例如卵磷脂、聚氧乙烯硬脂酸酯及聚乙烯去水山梨醇单油酸酯；以及防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯及对羟基苯甲酸正丙酯。可分散的粉末及颗粒(适于通过添加水来制备水性混悬液)可含有一种或多种Kgp抑制剂与分散剂、润湿剂、悬浮剂或其组合的混合物。油性混悬剂可通过将Kgp抑制剂悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或于矿物油(例如液体石蜡)中来调配。油性混悬剂可含有一种或多种增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。这些组合物可通过添加抗氧化剂(例如抗坏血酸)来保存。
本发明的药物组合物亦可呈水包油乳液形式。油相可为植物油(例如，橄榄油或花生油)或矿物油(例如，液体石蜡)或它们的混合物。适宜的乳化剂可为天然树胶，例如阿拉伯树胶或黄蓍胶；天然磷脂，例如大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸及己糖醇酸酐的酯或偏酯，例如去水山梨醇单油酸酯；及该偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯。
使用杂化分子以促进纳米粒子的主动运输可用于某些实施方案中以增加血脑障壁运输。举例而言，与运输蛋白质穿过血脑障壁的受体(包括LPR-1受体、转铁蛋白受体、EGF样生长因子或谷胱甘肽运输蛋白)结合的脂质体、蛋白质、工程化肽化合物或抗体可用于增加对脑的渗透。可使用包括渗透性开放、超音波、激光、蝶腭神经节刺激、经由泵的直接颅内、鞘内或心室内递送的物理技术。
根据本发明的药物组合物亦可包括一种或多种可用于治疗与牙龈卟啉单胞菌感染相关的病状的其他活性剂。在某些实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含如本文中所述的一种或多种Kgp抑制剂与一种或多种用于治疗阿兹海默氏病的其他活性剂的组合。若干种疗法正处于研发及临床使用中用于治疗阿兹海默氏病。治疗策略包括降低β-淀粉样蛋白及tau(如下文更详细地阐述)的循环含量、稳定化微管、去除动脉粥样硬化斑块、调节自体吞噬、调节神经传递质含量及抑制GABA(A)α5受体。此类疗法可维持和/或恢复患有阿兹海默氏病的个体的认知功能；减缓认知功能下降；且有助于神经可塑性及脑恢复。
可与Kgp抑制剂组合于药物组合物中的活性剂包括(但不限于)抗生素(即，杀菌化合物及抑菌化合物)、胆碱酯酶抑制剂、α-7烟碱受体调节剂、血清素调节剂、NMDA调节剂、Aβ靶向疗法、ApoE靶向疗法、小神经胶质细胞靶向疗法、血/脑障壁靶向疗法、tau靶向疗法、补体靶向疗法及抗炎药。
任何适宜的抗生素可与本发明的药物组合物中的一种或多种Kgp抑制剂组合。在某些实施方案中，本发明提供药物组合物，其含有一种或多种Kgp抑制剂及牙龈卟啉单胞菌MIC50为小于25μg/ml的抗生素。举例而言，抗生素的牙龈卟啉单胞菌MIC50可小于20μg/ml、小于15μg/ml、小于10μg/ml、小于8μg/ml、小于6μg/ml或小于5μg/ml。在一些实施方案中，抗生素的牙龈卟啉单胞菌MIC50小于1μg/ml。在一些实施方案中，抗生素的牙龈卟啉单胞菌MIC50小于0.2μg/ml。
杀菌及抑菌化合物的实施例包括(但不限于)：喹啉酮(例如，莫西沙星(moxifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、氧氟沙星(oflaxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、西他沙星(sitafloxacin)及诸如此类)、β-内酰胺(例如青霉素，例如阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸(clavulanate)、必倍西林(piperacillin)-三唑巴坦(tazobactam)、青霉素G及诸如此类；及头孢菌素，例如头孢曲松(ceftriaxone)及诸如此类)、大环内酯(例如，红霉素(erythromycin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)及诸如此类)、碳青霉烯(例如，多尼培南(doripenem)、亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、厄他培南(ertapenem)及诸如此类)、噻唑化物(例如，替唑尼丁(tizoxanidine)、尼唑尼丁(nitazoxanidine)、RM 4807、RM 4809及诸如此类)、四环素(例如，四环素、米诺环素(minocycline)、强力霉素、埃拉卡环素(eravacycline)及诸如此类)、克林达霉素(clindamycin)、甲硝唑及沙曲硝唑(satranidazole)。杀菌及抑菌化合物亦包括抑制或以其他方式干扰厌氧革兰氏阴性细菌的生物膜形成的试剂；此类试剂包括奥克太尔(oxantel)、莫仑太尔(morantel)、噻苯咪唑及诸如此类。本发明的组合物可含有一种或多种Kgp抑制剂与一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种或更多种)杀菌/抑菌化合物。含有杀菌/抑菌化合物的组合物可进一步含有洛赫西定(chlorhexidine)(例如，二葡萄糖酸洛赫西定)或与锌化合物(例如，乙酸锌)的组合，其亦可与所施用的抗生素组合使用。
在一些实施方案中，使用青霉素(例如阿莫西林)与甲硝唑的组合或青霉素(例如阿莫西林)、甲硝唑与四环素的组合。在一些实施方案中，抗生素选自米诺环素、强力霉素、甲硝唑、阿莫西林、克林达霉素、沃格孟汀(augmentin)、沙曲硝唑及其组合。
适宜的胆碱酯酶抑制剂的实例包括(但不限于)多奈派齐(donepezil)、多奈派齐/美金刚(memantine)、加兰他敏(galantamine)、卡巴拉汀(rivastigmine)及他克宁(tacrine)以及其药学上可接受的盐。适宜的血清素调节剂的实例包括(但不限于)伊哚派丁(idalopirdine)、RVT-101、西酞普兰(citalopram)、依地普仑(escitalopram)、氟西汀(fluoxetine)、氟伏沙明(fluvoxamine)、帕罗西汀(paroxetine)及舍曲林(sertraline)以及其药学上可接受的盐。适宜的α-7烟碱受体调节剂的实例包括(但不限于)α-7激动剂，例如恩森克林(encenicline)及APN1125。适宜的NMDA调节剂包括(但不限于)NMDA受体拮抗剂，例如美金刚及其衍生物。
本发明的药物组合物亦可含有针对与神经疾病相关的生物分子靶标的活性剂。此类靶标包括β淀粉样蛋白肽(亦称为β淀粉样蛋白、aβ或Aβ)、载脂蛋白E(亦称为ApoE)及微管相关tau(亦称为tau蛋白或简称为tau)。
Aβ靶向疗法尤其包括Aβ产生的抑制剂(例如β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂、α-分泌酶活化剂)、Aβ聚集的抑制剂、Aβ寡聚的抑制剂及Aβ清除的上调剂(例如，参见Jia等人，BioMed Research International,2014。文章ID 837157，22页)。Aβ靶向疗法的实例包括(但不限于)抗体、吡格列酮(pioglitazone)、贝加司他(begacestat)、阿托伐他汀(atorvastatin)、斯伐他汀(simvastatin)、依他唑酯(etazolate)及高牛磺酸(tramiprosate)以及其药学上可接受的盐。
ApoE靶向疗法的实例包括(但不限于)类视色素X受体激动剂(参见，Cramer等人，Science 2012.335(6075):1503-1506)及Liu等人所述的其他者(Nat Rev Neurol.2013.9(2):106-118)。Tau靶向疗法包括(但不限于)亚甲蓝、白-亚甲蓝、抗体及Lee等人所述的那些(Cold Spring Harb Perspect Med 2011；1:a006437)。
本发明的药物组合物亦可含有补体靶向疗法。此类疗法靶向参与先天免疫反应的补体系统的组分。补体靶向疗法包括(但不限于)Ricklin及Lambris所述的那些(Nat.Biotechnology 2007.25(11):1265-1275)。
适宜的抗炎药的实例包括(但不限于)NSAID，例如阿扎丙宗(apazone)、双氯芬酸、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、酮洛芬(ketoprofen)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、吡罗昔康(piroxicam)及舒林酸(sulindac)以及其药学上可接受的盐。
V.抑制牙龈蛋白酶及治疗与牙龈卟啉单胞菌感染相关的病状的方法
在另一实施方案中，本发明提供抑制牙龈蛋白酶的方法。该方法包括使牙龈蛋白酶与有效量的如本文中所述的化合物接触。在某些实施方案中，牙龈蛋白酶是赖氨酸牙龈蛋白酶(即，Kgp或含有一个或多个氨基酸取代、缺失和/或其他肽序列变化形式的变体)。抑制牙龈蛋白酶通常包括使牙龈蛋白酶与一定量的化合物接触，与不存在该化合物的情形下的牙龈蛋白酶活性相比，该量足以降低牙龈蛋白酶的活性。举例而言，使牙龈蛋白酶与牙龈蛋白酶抑制剂接触可导致约1％至约99％的牙龈蛋白酶抑制(即，经抑制的牙龈蛋白酶的活性是在不存在该化合物的情形下的牙龈蛋白酶活性的99％至1％范围内)。牙龈蛋白酶的抑制程度可在以下范围内：约1％至约10％、或约10％至约20％、或约20％至约30％、或约30％至约40％、或约40％至约50％、或约50％至约60％、或约60％至约70％、或约70％至约80％、或约80％至约90％、或约90％至约99％。牙龈蛋白酶的抑制程度可在以下范围内：约5％至约95％、或约10％至约90％、或约20％至约80％、或约30％至约70％、或约40％至约60％。在一些实施方案中，使牙龈蛋白酶与如本文中所述的化合物接触将导致完全(即，100％)牙龈蛋白酶抑制。
如上文所阐述，牙龈卟啉单胞菌的感染及牙龈蛋白酶活性与牙周疾病、阿兹海默氏病及其他脑病症、心血管疾病、糖尿病、癌症、肝病、肾病、早产、关节炎、肺炎及其他病症的发展相关。参见：Bostanci等人，FEMS Microbiol Lett,2012.333(1):1-9；Ghizoni等人，J Appl Oral Sci,2012.20(1):104-12；Gatz等人，Alzheimers Dement,2006.2(2):110-7；Stein等人，J Am Dent Assoc,2007.138(10):1314-22；测验1381-2；Noble等人，J NeurolNeurosurg Psychiatry,2009.80(11):1206-11；Sparks Stein等人，Alzheimers Dement,2012.8(3):196-203；Velsko等人，PLoS ONE,2014.9(5):e97811；Demmer等人，J Dent Res,2015.94(9S):201-S-11S；Atanasova及Yilmaz，Molecular Oral Microbiology,2014.29(2):55-66；Yoneda等人，BMC Gastroenterol,2012.12:16。
由牙龈卟啉单胞菌产生的细胞外蛋白酶(包括精氨酸牙龈蛋白酶A(RgpA)、精氨酸牙龈蛋白酶B(RgpB)及赖氨酸牙龈蛋白酶(Kgp))亦可降解结缔组织及血浆中广泛范围的蛋白质(例如胶原、免疫球蛋白及蛋白酶抑制剂等)。牙龈蛋白酶可进入体循环和/或滑膜细胞及软骨细胞，且其亦可引起激肽释放素-激肽级联、血液凝固及宿主防御系统的破坏。在关节及循环系统中具有牙龈蛋白酶的患者可经受牙龈蛋白酶诱导的滑膜细胞和/或软骨细胞的死亡，导致骨关节炎。
最近已发现，RgpB及Kgp可浸润人类及狗关节，导致骨关节炎的发生。相信牙龈卟啉单胞菌及牙龈蛋白酶可经由多个途径浸润关节组织。牙龈蛋白酶可由牙龈卟啉单胞菌分泌、运送至牙龈卟啉单胞菌的外膜表面，或释放于外膜囊泡中。先前已在牙周组织、冠状动脉、主动脉及最近在肝中鉴别出牙龈卟啉单胞菌，即，这些生态区位(niche)中任一者的牙龈卟啉单胞菌和/或牙龈蛋白酶释放至体循环中可导致牙龈卟啉单胞菌和/或牙龈蛋白酶移位至关节。参见：Travis等人，Adv Exp Med Biol,2000.477:455-65；Byrne等人，OralMicrobiol Immunol,2009.24(6):469-77；Mahendra等人，J Maxillofac Oral Surg,2009.8(2):108-13；Stelzel，Periodontol,2002.73(8):868-70；Ishikawa等人，BiochimBiophys Acta,2013.1832(12):2035-2043。
牙龈卟啉单胞菌和/或牙龈蛋白酶亦可通过降解保护血液/关节障壁的内皮细胞或通过关节的创伤事件(例如半月板损伤)而进入关节，其永久性或短暂地降低关节组织的完整性。举例而言，此创伤性关节损伤的破坏可促成牙龈卟啉单胞菌和/或牙龈蛋白酶在受感染个体中的浸润及随后发生慢性骨关节炎。处于高风险创伤性关节损伤的人，包括从事身体接触运动(如足球)的运动员，可利用牙龈蛋白酶抑制剂预防性治疗以降低创伤相关骨关节炎的风险。
牙龈卟啉单胞菌及牙龈蛋白酶亦可经由其他机制到达关节，该机制包括主动运输，被动运输或巨噬细胞递送。这些机制中的任一者所引起的骨关节炎可限于单一关节或存在于多个关节中。
类似于人类，牙龈卟啉单胞菌感染及牙周疾病是影响成年狗及猫的最常见传染病中的一者。在其关节及循环系统中具有牙龈卟啉单胞菌感染及牙龈蛋白酶的狗及猫可经历因牙龈蛋白酶诱导的细胞死亡所致的牙周疾病及骨关节炎，其可根据本发明的方法治疗或预防。老年狗自发性发展骨关节炎的许多特征，包括与前交叉韧带(ACL，anteriorcruciate ligament)变性相关的常见发炎性膝关节炎。Muir等人对患有发炎性膝关节炎及ACL变性的狗的研究在37％的来自患病狗的膝关节中检测到来自一系列细菌物种的DNA。Muir等人假设细菌是狗发炎性关节炎的发病机制中的重要致病因素。在Muir等人的研究中，在狗关节中未检测到来自牙龈卟啉单胞菌的DNA。参见Muir等人，Microb Pathog,2007.42(2-3):47-55。然而，类似于人类，牙龈卟啉单胞菌是影响成年狗的常见口腔病原体，且可因菌血症而潜在地自口腔移位至关节组织。已展示，牙龈卟啉单胞菌在活体外会感染软骨细胞，引起软骨细胞凋亡，此显示狗及人类二者中骨关节炎软骨损失的途径。参见：Rohner等人，Calcif Tissue Int,2010.87(4)：第333-40页；Houle等人，FEMS MicrobiolLett,2003.221(2)：第181-5页；Kataoka等人，FASEB J,2014.28:3564-3578；Pischon等人，Ann Rheum Dis,2009.68(12)：第1902-7页。
因此，Kgp抑制剂可用于治疗由牙龈卟啉单胞菌引起或以其他方式受牙龈卟啉单胞菌感染的疾病及病状(例如脑病症)。因此，本发明的另一方面提供治疗与牙龈卟啉单胞菌感染相关的疾病或病状的方法。该方法包括向有需要的个体施用有效量的如上文所述的本发明的化合物或组合物。
在某些实施方案中，本发明的化合物抑制哺乳动物(例如，人类或动物(例如狗))的脑中的活性Kgp，且是细胞保护性化合物或神经保护性化合物。“神经保护性”意指该化合物防止神经元的异常变化或神经元的死亡。因此，本发明的化合物可用于(例如)治疗脑病症(例如，神经退化性疾病(例如，阿兹海默氏病、唐氏综合征(Down’s syndrome)、癫痫、自闭症、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、特发性震颤、额-颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿氏症(Huntington’s disease)、多发性硬化、轻度认知损害、年龄相关性记忆损害、慢性创伤性脑病、中风、脑血管疾病、路易氏体病(Lewy Bodydisease)、多重系统萎缩、精神分裂症及抑郁症等)、糖尿病、心血管疾病、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、感染性关节炎、银屑病关节炎、视网膜病症(例如，年龄相关性黄斑变性)及青光眼。
在一些实施方案中，疾病或病状选自脑病症、牙周疾病、糖尿病、心血管疾病、关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、早产、肺炎、癌症、肾病、肝病、视网膜病症及青光眼。
在一些实施方案中，疾病或病状是脑病症。
在一些实施方案中，脑病症选自阿兹海默氏病、唐氏综合征、癫痫、自闭症、帕金森氏病、特发性震颤、额-颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿氏症、多发性硬化、轻度认知损害、年龄相关性记忆损害、慢性创伤性脑病、中风、脑血管疾病、路易氏体病、多重系统萎缩、精神分裂症及抑郁症。
在一些实施方案中，脑病症是阿兹海默氏病。
在一些实施方案中，方法进一步包括向个体施用一种或多种选自以下的活性剂：胆碱酯酶抑制剂、血清素调节剂、NMDA调节剂、Aβ靶向疗法、ApoE靶向疗法、小神经胶质细胞靶向疗法、血脑障壁靶向疗法、tau靶向疗法、补体靶向疗法及抗炎药。
在一些实施方案中，疾病或病状是牙周疾病。在一些实施方案中，疾病或病状是肝病。在一些实施方案中，肝病是非酒精性脂肪性肝炎。在一些实施方案中，疾病或病状是视网膜病症。在一些实施方案中，视网膜病症是年龄相关性黄斑变性。
在一些实施方案中，疾病或病状是癌症。在一些实施方案中，癌症是乳癌、口腔癌、胰脏癌或多形性成胶质细胞瘤。
如本文中所述的Kgp抑制剂可在本发明的方法中以任何适宜剂量施用。一般而言，Kgp抑制剂是以约0.1毫克至约1000毫克/千克个体体重(即，约0.1-1000mg/kg)范围内的剂量施用。Kgp抑制剂的剂量可以是(例如)约0.1-1000mg/kg、或约1-500mg/kg、或约25-250mg/kg、或约50-100mg/kg。Kgp抑制剂的剂量可以是约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000mg/kg。剂量可根据患者需求、所治疗病症的严重程度及所施用的具体调配物而有所变化。施用于患者的剂量应足以在患者中产生有益治疗反应。剂量大小亦可通过伴随具体患者中药物的施用的任何不良副作用的存在、性质及程度来确定。针对具体情形确定适当剂量是在典型从业人员的能力范围内。可将总剂量分开且在适于治疗癫痫发作的时期内分批施用。
Kgp抑制剂可施用一定时期，该时期将根据具体病症的性质、其严重程度及施用Kgp抑制剂的个体的总体状况而有所变化。施用可(例如)每小时、每2小时、3小时、4小时、6小时、8小时或每日两次(包括每12小时)或以其任何中间间隔进行。施用可每日进行一次，或每36小时或48小时进行一次，或每月或若干个月进行一次。在治疗后，可监测个体的其状况改变及病症症状的缓和。在个体对特定剂量水平无显著反应的情形下可增加Kgp抑制剂的剂量，或若观察到病症症状的缓和或若病症已经补救或若在特定剂量下观察到不可接受的副作用，则可将剂量减少。
可将治疗有效量的Kgp抑制剂以包含剂量之间至少1小时或6小时或12小时或24小时或36小时或48小时间隔的治疗方案施用于个体。施用可以至少72、96、120、144、168、192、216或240小时(即，3、4、5、6、7、8、9或10天)的间隔进行。在某些实施方案中，一种或多种Kgp抑制剂的施用是以长期方式经若干个月至若干年范围内的时期进行。因此，本发明的一些实施方案提供治疗如上文所述的与牙龈卟啉单胞菌感染相关的疾病或病状的方法，其中将化合物向个体施用至少一年。在一些实施方案中，将化合物向个体施用至少10年。在一些实施方案中，将化合物向个体施用至少60年。
根据本发明的方法施用抑制剂通常使得个体中活性Kgp的循环含量降低和/或脑中活性Kgp降低。在某些实施方案中，根据本发明的方法施用Kgp抑制剂使得活性Kgp的循环含量降低至少20％和/或脑中的活性Kgp降低至少20％。举例而言，与第一次施用Kgp抑制剂24小时之前的相应Kgp含量相比，Kgp的循环含量和/或脑中Kgp的含量优选降低约25％至约95％、或约35％至约95％、或约40％至约85％、或约40％至约80％。
Kgp抑制剂可单独施用或与一种或多种其他治疗活性剂组合施用，如上文所阐述。该一种或多种其他治疗有效试剂包括(例如)：(i)抑制RgpA、RgpB和/或Kgp产生、RgpA、RgpB和/或Kgp移位至体循环或脑中、和/或哺乳动物中RgpA、RgpB和/或Kgp的病理(例如，神经毒性效应)的药学上可接受的试剂；(ii)对于牙龈卟啉单胞菌为抑菌或杀菌的抗细菌剂；(iii)一种或多种与RgpA、RgpB和/或Kgp结合的抗体(例如，18E6，其与RgpB的免疫球蛋白结构域的前半部分结合；Kgp特异性单克隆抗体7B9，其识别Kgp催化结构域内的表位；RgpA抗体61Bg 1.3，前述任一者的人类化形式等)；(iv)与RgpA、RgpB和/或Kgp或牙龈卟啉单胞菌表达的其他蛋白质结合的抗体的表位；及(v)前述任一者的组合。
其他治疗活性剂亦包括Aβ肽含量降低剂、致病程度的tau降低剂、微管稳定剂、能够去除动脉粥样硬化斑块的试剂、降低β-淀粉样蛋白及tau的循环含量的试剂、自体吞噬调节剂、神经传递质含量调节剂、GABA(A)α5受体抑制剂及有助于维持和/或恢复阿兹海默氏病的认知功能及功能缺陷和/或减慢阿兹海默氏病中的认知功能下降及功能缺陷的其他试剂。
本发明的药物组合物可含有一种或多种如本文中所述的Kgp抑制剂与利托那韦(ritonavir，RTV)的组合，其可增加生物利用度且增加血脑障壁渗透。举例而言，利托那韦通常与口服肽型HIV蛋白酶抑制剂组合以通过抑制P450 3A4酶而增加血浆含量，且因此减少首传(first-pass)代谢(参见，Walmsley等人，N Engl J Med,2002.346(26):2039-46)。另外，RTV结合至P-醣蛋白(在许多组织中发现的跨膜流出泵，包括血脑障壁)，此容许共施用的化合物更好地进入脑(参见，Marzolini等人，Mol Pharm,2013.10(6):2340-9)。因此，RTV与Kgp抑制剂的组合可用于增加牙龈蛋白酶抑制剂的血浆浓度及脑含量。如美国专利申请第14/875,416号中所阐述，在Kgp抑制剂Kyt-36之前15分钟经口施用RTV增加半衰期，因此预期RTV将亦增加其他Kgp抑制剂的半衰期。
在一些实施方案中，本发明的化合物可与自肉豆蔻分离的天然牙龈蛋白酶抑制剂(包括美拉巴酮C(melabaricone C))一起施用，或源自植物(例如蔓越莓、绿茶、苹果及蛇麻草)的多酚化合物可结合施用用于治疗或预防脑病症。包括κ-酪蛋白肽(109-137)34、组胺素5及CL(14-25)、CL(K25A)以及CL(R24A,K25A)的天然及非天然抗微生物肽亦可结合本发明的Kgp抑制剂施用。(例如，参见Taniguchi等人，Biopolymers,2014.102(5):379-89)。
如本文中所述的Kgp抑制剂可与靶向牙龈蛋白酶或其他牙龈卟啉单胞菌蛋白质的抗体一起施用。抗体可依赖于牙龈蛋白酶及牙龈卟啉单胞菌增殖对血脑障壁的损害以进入脑或外围干扰。抗体亦可有助于刺激免疫系统在清除细菌方面的效能。可利用针对RgpA、RgpB或Kgp的新颖或现有的抗体，包括18E6及7B9。RgpA抗体61BG 1.3先前已展示局部防止牙周治疗后牙龈卟啉单胞菌重新定殖的效能。参见，Booth等人，Infect Immun,1996.64(2):422-7。抗体将优选人类化以用于人类。可使用本领域技术人员已知的用于递送生物制剂以改良半衰期及脑渗透的方法，该方法包括(但不限于)静脉内递送、皮下递送、鼻内递送、鞘内递送、关节内递送、载体运送及直接脑递送。
本发明的方法亦涵盖施用如本文中所述的Kgp抑制剂与以下其他治疗活性剂或其药学上可接受的盐的一种或多种：精氨酸衍生物；组胺素5；杆状病毒p35；牛痘病毒细胞介素-反应调节剂的单点突变体(CrmA(Asp>Lys))；苯丙氨酰基-脲基-瓜氨酰基-缬氨酰基-环精氨醛(FA-70C1)；(酰氧基)甲基酮(Cbz-Phe-Lys-CH2OCO-2,4,6-Me3Ph)；肽基氯-甲基酮(例如，精氨酸的氯甲基酮衍生物、赖氨酸的氯甲基酮衍生物及诸如此类)；氟-甲基酮；溴-甲基酮；酮肽；1-(3-苯基丙酰基)哌啶-3(R,S)-甲酸[4-氨基-1(S)-(苯并噻唑-2-羰基)丁基]酰胺(A71561)；氮杂肽富马酰胺；氮杂-肽迈克尔受体(aza-peptide Michaelacceptor)；苯甲脒化合物；环甲基酮；经活化的因子X抑制剂(例如，DX-9065a)；蔓越莓不可透析部分；蔓越莓多酚部分；胰脏胰蛋白酶抑制剂；Cbz-Phe-Lys-CH2O-CO-2,4,6-Me3-Ph；E-64；洛赫西定；锌(例如，乙酸锌)；或任何前述的两者、三者或更多者的组合。在这些实施方案中的一些实施方案中，Zn可增强本发明的方法中所使用的化合物(例如，洛赫西定、苯甲脒等)的功效及选择性。
本发明的Kgp抑制剂可以与额外治疗活性剂在相同的组合物中施用。或者，额外治疗活性剂可在Kgp抑制剂施用之前、同时或之后分开施用。
VI.牙龈蛋白酶活性探针
在相关实施方案中，本发明提供包含报告子部分及牙龈蛋白酶反应性部分的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，牙龈蛋白酶反应性部分是Kgp反应性部分。在一些实施方案中，牙龈蛋白酶反应性部分是Rgp反应性部分。
在一些实施方案中，牙龈蛋白酶反应性部分可逆地结合至靶标牙龈蛋白酶。在一些实施方案中，牙龈蛋白酶反应性部分不可逆地结合至靶标牙龈蛋白酶。
在一些实施方案中，Kgp反应性部分进一步包含淬灭部分。
在一些实施方案中，报告子部分选自荧光团、荧光部分、发色团、发色部分、生物素、地高辛(digoxigenin)、肽标签(例如FLAG肽)、寡核苷酸及多核苷酸。
如本文中所使用，术语“FLAG肽”是指含有氨基酸序列Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(即，DYKDDDDK)的寡肽或多肽。FLAG肽及其变体阐述于(例如)Hopp等人的美国专利第4,703,004号中，该专利以援引方式并入本文中。可代替FLAG肽使用的其他肽包括(但不限于)含有序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala(即，YPYDVPDYA)的HA肽标签、含有序列His-His-His-His-His-His(即，HHHHHH)的His6肽标签及含有序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu(即，EQKLISEEDL)的Myc肽标签。肽标签可由与比色试剂、化学发光试剂等一起使用的抗体或其他结合部分识别，以便便利地鉴别和/或量化。同样，报告子部分可含有可由互补一级核苷酸或其他互补核苷酸识别的核苷酸(例如，RNA、单链DNA或双链DNA)，以便通过PCR技术(例如，定量PCR)来检测，如(例如)WO 2016/019929(Navratil等人)中所阐述，该公开案以援引方式并入本文中。可用的DNA序列包括(但不限于)CCTGCCAGTTGAGCATTTTTATCTGCCACCTTCTCCACCAGACAAAAGCTGGAAA；CACTCTGTGCTCGTTGCTACAC；及CAGACAGCAAGCAGCACTACAC。
如本文中所使用，术语“地高辛”是指3-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-3,12,14-三羟基-10,13-二甲基-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-十四氢环戊[a]菲-17-基]-2H-呋喃-5-酮(CAS登记号1672-46-4)及其经取代的类似物。如本文中所使用，术语“生物素”是指5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酸(CAS登记号58-85-5)及其经取代的类似物。
在一些实施方案中，化合物具有上文所述的式I的结构，其中R3是报告子部分。在一些实施方案中，化合物具有式II的结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
RA是侧链IIa：
或侧链IIb：
其中波形线表示与式II的连结点；
A选自-CH2-及-O-；
R1a、R1b、R1c、R1d及R1e各自独立地选自氢、C1-4烷基及胺保护基团；
R2a及R2b各自独立地选自氢、卤素、C1-4卤代烷基及C1-4卤代烷氧基；
R3是报告子部分；
R4选自氢及C1-4烷基；且
R5是牙龈蛋白酶反应性部分，其中该牙龈蛋白酶反应性部分任选地包含淬灭部分R9。
本发明的化合物可以经保护的形式来制备(即，其中R1a、R1b、R1c、R1d及R1e的至少一者是胺保护基团的化合物)。可使用多个适宜保护基团，如(例如)Green及Wuts(ProtectiveGroups in Organic Synthesis,第4版,2007,Wiley-Interscience,New York)所述的。在一些实施方案中，R1a是H且R1b选自苄基氧基羰基；9-芴基甲基氧基羰基；叔丁基氧基羰基；及烯丙基氧基羰基。在一些实施方案中，R1a是H且R1b是叔丁基氧基羰基。化合物亦可以烷基化形式(即，其中R1a及R1b的至少一者是烷基的化合物)来制备。R1a及R1b的一者或两者可以是(例如)甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基或叔丁基。
在一些实施方案中，化合物具有式III的结构：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中：
R5选自C1-6卤代烷基、-CH2-O-R6、-CH2-S-R7、-CH2-SO-R7、-CH2-SO2-R7、-CH2-N(R8)2及-CH2-C5-12杂芳基；
R6及R7选自苯基、C1-6烷基、C1-6卤代烷基及C5-12杂芳基，其中苯基经1至5个卤素取代且其中C5-12杂芳基任选地经卤素或C1-3卤代烷基取代；且
R8是独立选择的C1-6烷基。
在一些实施方案中，牙龈蛋白酶反应性部分R5是-CH2-O-苯基，且苯基经1至5个卤素取代。在一些实施方案中，苯基任选地经淬灭部分R9取代。在一些实施方案中，牙龈蛋白酶反应性部分具有下式：
其中波形线表示与式II或式III的连结点。
在一些实施方案中：
R5c是卤素，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是H，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是H，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是H，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是H，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是H，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是H，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是H，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是H，且R5g是卤素；或
R5c是卤素，R5d是卤素，R5e是卤素，R5f是卤素，且R5g是H；
其中R5c、R5d、R5e、R5f及R5g的一者中的H或卤素任选地经淬灭部分R9替代。
在一些实施方案中：
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是H，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是H，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是H，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是H，且R5g是F或Cl；或
R5c是F或Cl，R5d是F或Cl，R5e是F或Cl，R5f是F或Cl，且R5g是H；
其中R5c、R5d、R5e、R5f及R5g的一者中的H、F或Cl任选地经淬灭部分R9替代。
在一些实施方案中：
R5c是F，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是F，R5e是H，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是H，R5e是F，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是H，R5e是H，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是H，R5e是H，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是F，R5e是F，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F，R5e是H，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F，R5e是H，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是H，R5e是H，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是F，R5e是F，R5f是H，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是F，R5e是H，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是F，R5e是H，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是H，R5e是F，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是F，R5d是H，R5e是F，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是H，R5e是H，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是F，R5e是F，R5f是F，且R5g是H；或
R5c是H，R5d是F，R5e是F，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是F，R5e是H，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是H，R5e是F，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是H，R5d是F，R5e是F，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是H，R5e是F，R5f是F，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是F，R5e是F，R5f是H，且R5g是F；或
R5c是F，R5d是F，R5e是F，R5f是F，且R5g是H；
其中R5c、R5d、R5e、R5f及R5g的一者中的H或F或Cl任选地经淬灭部分R9替代。
在某些实施方案中，牙龈蛋白酶反应性部分不为2,3,5,6-四氟苯氧基甲基。
在一些实施方案中，化合物具有式IIIa的结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
R5c、R5d、R5e、R5f及R5g的一者选自氢、卤素及淬灭部分；且
R5c、R5d、R5e、R5f及R5g的四者独立地选自氢及卤素；
条件是R5c、R5d、R5e、R5f及R5g的至少一者是卤素。
在一些实施方案中，本发明提供淬灭部分包括于R5中的化合物。此类化合物包括(但不限于)：
及其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，化合物具有式IV的结构：
/>
或其药学上可接受的盐，其中：
R5e选自H及淬灭部分-L9-R9a；
L9是连接部分；且
R9a选自偶氮苯、呫吨鎓(xanthylium)、蒽醌及紫罗碱。
在一些实施方案中，报告子部分R3是-R3b-L3-R3c，其中：
R3b选自C3-8亚烷基、C3-8亚环烃基、C3-12亚杂环基、C6-10亚芳基及C5-12亚杂芳基；
L3是连接部分；且
R3c选自发色团或荧光团。
使用如下文所述的UV-可见吸收光谱或荧光测定法，含有发色团或荧光团的报告部分可用于检测经标记的牙龈蛋白酶。任何适宜的发色团或荧光团可用于本发明的化合物中。一般而言，适宜的发色团及荧光团具有可直接或经由一个或多个连接基团共价键合至式II化合物的反应基团(例如，羧酸根部分、氨基部分、卤代烷基部分或诸如此类)。适宜的发色团及荧光团的实例包括(但不限于)美国专利第7,687,282号；第7,671,214号；第7,446,202号；第6,972,326号；第6,716,979号；第6,579,718号；第6,562,632号；第6,399,392号；第6,316,267号；第6,162,931号；第6,130,101号；第6,005,113号；第6,004,536号；第5,863,753号；第5,846,737号；第5,798,276号；第5,723,218号；第5,696,157号；第5,658,751号；第5,656,449号；第5,582,977号；第5,576,424号；第5,573,909号；及第5,187,288号中所述的那些，这些专利均以全文援引方式并入本文中。
在一些实施方案中，R3c是具有以下结构的硼-二吡咯亚甲基部分：
其中
R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i及R3j的六者独立地选自H、卤素、C1-6烷基、C3-8环烃基、C6-10芳基、C7-16芳基烷基、C1-6酰基及-SO3H；且其中
R3d、R3e、R3f、R3g、R3h、R3i及R3j的一者是连接部分-L3-。
在一些实施方案中，R3d及R3f是独立选择的C1-6烷基(例如，甲基或乙基)，且R3h、R3i及R3j的一者是连接部分-L3-。在一些实施方案中，R3d及R3f是甲基且R3j是连接部分-L3-。
在一些实施方案中，R3c是具有以下结构的青色素部分：
其中
R3k及R3l独立地选自H、C1-6烷基、(CH2)tCOOH、(CH2)tSO3H及连接部分L3；
每一下标t独立地是1至10的整数；
R3m及R3n独立地选自H、卤素、C1-6烷基、-SO3H、-PO3H2、-OPO3H2、-COOH及连接部分L3；
每一Y独立地选自O、S、C(R3p)2、-CH＝CH-及NR3p，其中每一R3p独立地是H或C1-6烷基；且
下标n是1至6的整数，条件是R3k、R3l、R3m及R3n的一者且仅一者是连接部分-L3-。
在一些实施方案中，R3c是具有以下结构的香豆素部分：
其中
W是N或CR3u；
Z是O、S或NR3v；且
R3q、R3s、R3t、R3u的每一者独立地选自H、卤素、C1-6烷基、-CN、-CF3、-COOR3v、-CON(R3v)2、-OR3v及连接部分-L3-；
R3r选自-OR3v及-N(R3v)2
每一R3v独立地选自H、C1-6烷基及连接部分-L3-；
条件是R3q、R3s、R3t、R3u及R3v的一者且仅一者是连接部分-L3-。
在一些实施方案中，R3c是具有以下结构的呫吨部分：
其中：
T选自O、S、C(R3z)2及NR3z；
U是O或N(R3z)2；
每一R3w独立地选自H、卤素、C1-6烷基、-SO3H及连接部分-L3-；
R3x选自H、-OH、-OR3z、-N(R3z)2及连接部分-L3-；
R3y选自H、C1-6烷基、R3aa及连接部分-L3-；
每一R3z独立地是H或C1-6烷基；且
R3aa选自
其中：
每一R3ab独立地选自H及连接部分-L3-；
条件是R3w、R3x、R3y及R3ab的一者且仅一者是连接部分-L3-。
在一些实施方案中，R3c是荧光黄，其中T及U是O；R3x是OH，且R3y是：
在一些实施方案中，呫吨部分是曙红，其中T及U是O；R3x是OH，每一R3w是卤素(例如，溴)，且R3y是：
在一些实施方案中，呫吨部分是若丹明，其中T是O；U是N(R3z)2(例如，＝NH2 +)；R3x是-N(R3z)2(例如，-NH2)，且R3y是：
在一些实施方案中，呫吨部分是具有以下结构的若丹明：
其中R3aa选自
一个R3ab是H，且另一个R3ab是连接部分-L3-。
在一些实施方案中，本发明提供式II化合物，其中报告子部分R3是-R3b-L3-R3c，其中：
R3b选自C3-8亚烷基、C3-8亚环烃基、C3-12亚杂环基、C6-10亚芳基及C5-12亚杂芳基；
L3是连接部分；且
R3c选自生物素、地高辛及抗体表位。
在一些实施方案中，报告子部分R3是-R3b-L3-R3c，其中：
R3b选自C3-8亚烷基、C3-8亚环烃基、C3-12亚杂环基、C6-10亚芳基及C5-12亚杂芳基；
L3是连接部分；且
R3c选自荧光黄、若丹明、曙红、青色素、硼-二吡咯亚甲基、香豆素、生物素、地高辛、FLAG肽(或其他肽标签)、寡核苷酸及多核苷酸。
本领域技术人员将了解，含有叠氮基团的化合物(例如，其中R3a是-N3的化合物)可经由与互补反应配偶体(例如携带炔烃的化合物或携带膦的化合物)反应经其他官能基修饰。叠氮化物与炔烃经由[3+2]环加成(通常称为“点击化学”)的反应可用于在本发明的化合物中安装各种经取代的三唑基。因此，本发明的一些实施方案提供化合物，其中连接部分-L3-是根据下式的任选地经取代的三唑基部分：
其中波形线是与R3a的连结点且虚线是与R3c的连结点。
在一些实施方案中，L3a具有结构-L3b-L3c-，其中：
L3b及L3c独立地选自键、二价聚合物部分及直链或支链、饱和或不饱和C1-30烃基；
C1-30烃基中的一个或多个碳原子任选地且独立地由O、S、NRa替代；
C1-30烃基中的两个或更多个毗邻碳原子组群任选地且独立地由-NRa(CO)-或-(CO)NRa-替代；
C1-30烃基中的两个或更多个毗邻碳原子组群任选地且独立地由4员至8员二价碳环或4员至8员具有1至4个选自O、S及N的杂原子的二价杂环替代；且
每一Ra独立地选自H及C1-6烷基。
在一些实施方案中，化合物具有式V的结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
R5e选自H及-C(O)NH-(CH2)x-R9a；且
下标x是1至4范围内的整数。
在一些实施方案中，化合物选自：
/>
/>
/>
及其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，化合物选自：
/>
/>
/>
及其药学上可接受的盐。
VII.探测牙龈蛋白酶活性的方法
在另一实施方案中，本发明提供检测生物样品中牙龈蛋白酶活性的方法。该方法包括：在足以使牙龈蛋白酶与如上文所述的化合物的牙龈蛋白酶反应性部分反应的条件下，形成包含生物样品及该化合物的混合物；检测该混合物中的该化合物的报告子部分；及当检测到报告子部分时确定生物样品中存在牙龈蛋白酶。在一些实施方案中，方法进一步包括在检测混合物中化合物的报告子部分之前，将未反应的化合物自混合物去除。
任何适宜的生物样品均可使用本发明的方法加以分析。适宜的生物样品的实例包括(但不限于)组织样品(例如，牙龈组织样品或脑组织样品)、细胞样品(例如，经由口腔拭子获自患者口腔中的哺乳动物细胞或自人类样品培养出的细菌细胞)、血液或血清样品及唾液样品。
使生物样品及牙龈蛋白酶活性探针彼此接触的方式将部分地取决于诸如所分析样品的类型及活性探针中报告子部分的检测方法等因素。举例而言，当欲检测细胞样品中的牙龈蛋白酶活性时，可将细胞悬浮于水性缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水、柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液及诸如此类)中并且合并于含有牙龈蛋白酶活性探针及任选的共溶剂(例如，二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺及诸如此类)的混合物中，使得活性探针与细胞样品中所存在的牙龈蛋白酶反应。活性探针通常是以约1μM至约5mM范围内的浓度使用，且细胞是在约4℃至约40℃范围内的温度下孵育几分钟至若干小时或更久的时期。孵育期之后可经由离心自混合物收集细胞，且未反应的活性探针可通过将细胞在适宜体积的缓冲液中重复性重新悬浮并离心而自混合物去除。然后，可利用光学显微镜或荧光显微镜检查细胞，且可使用比色或荧光报告子部分的检测来确定细胞中牙龈蛋白酶的存在和/或定位。
比色或荧光报告子部分的检测波长将取决于包括(但不限于)活性探针的结构及样品分析条件等因素。报告子部分的UV-可见吸收可在(例如)约190nm至约1100nm范围内(例如，介于190nm与380nm之间或介于380nm与750nm之间)的波长下测量。荧光报告子部分可在约300nm至约800nm范围内的波长下激发，且所得荧光发射可在约350nm至约800nm范围内的波长下检测。可使用其他吸收波长、激发波长及发射波长来检测经标记的牙龈蛋白酶，此取决于所采用的具体活性探针或样品。报告子部分可通过包括以下的方式来检测：目视检查、照相胶卷或使用诸如荧光计、量子计数器、读板仪、显微镜及流式细胞仪的仪器。用于基于UV-vis吸收及基于荧光的方法的仪器以及比色及荧光部分的光学性质为本领域技术人员所已知，如(例如)The Molecular ProbesTM Handbook,第11版(2010)中所阐述。
在某些实施方案中，牙龈蛋白酶活性探针含有淬灭部分，其在结合牙龈蛋白酶之前防止在探针上检测到来自报告子部分的吸光度信号和/或荧光信号。举例而言，具有荧光黄、若丹明或青色素报告子部分的活性探针可含有包含苯胺淬灭部分(例如dabcyl)的牙龈蛋白酶反应性部分。在与靶标牙龈蛋白酶反应之前报告子部分与淬灭部分的邻近将防止荧光检测，此可有利地降低背景信号。在使牙龈蛋白酶反应性部分与靶标牙龈蛋白酶反应之后释放淬灭部分则容许检测荧光报告子部分。
可使用自个体获得的生物样品制备细胞溶解物或组织溶解物，且可将该溶解物与如上文所述的活性探针组合，使得溶解物中的牙龈蛋白酶与探针反应。未反应的活性探针可经由凝胶过滤自溶解物混合物去除，且可经由藉助UV-vis吸收光谱法或荧光测定法检测报告子部分在混合物中鉴别牙龈蛋白酶。或者，经标记的牙龈蛋白酶可经由电泳(例如，SDS-PAGE、毛细管电泳、等电聚焦及诸如此类)自未反应的活性探针及其他混合物组分分离。可通过检测比色或荧光活性探针在经解析的样品(例如聚丙烯酰胺凝胶)中检测经标记的牙龈蛋白酶。若使用生物素、FLAG肽或另一基于亲和力的报告子部分，则可利用经标记的结合配偶体(例如链霉抗生物素蛋白-荧光黄)或经标记的抗体(或一级/二级抗体对)来探测凝胶以检测经解析的样品中经标记的牙龈蛋白酶。若需要，可在检测步骤之前将经标记的牙龈蛋白酶通过电印迹自聚丙烯酰胺凝胶或其他经解析的样品转移至适宜的支撑材料(例如硝化纤维素、聚偏二氟乙烯(PVDF)或诸如此类)。
组织样品可自个体获得，切片并封固用于用牙龈蛋白酶活性探针进行处理。样品可新鲜冷冻，且在用牙龈蛋白酶活性探针处理之前任选地经乙醇、福尔马林或另一适宜固定剂固定。可在检测报告子部分之前将所封固的样品浸入一份或多份水或缓冲液中将未反应的活性探针自组织样品去除。使用具有淬灭部分的探针可在不需要将任何未反应的活性探针去除的情形下使得能够检测组织样品中的信号。若需要，则可使用如上文所述的光学显微镜或荧光显微镜结合一种或多种经标记的结合配偶体来检测经标记的牙龈蛋白酶。
当牙龈蛋白酶经具有基于亲和力的报告子部分(例如，生物素、地高辛、FLAG肽或其他表位)的活性探针标记时，可使用固定于适宜载体上的结合配偶体将经标记的牙龈蛋白酶自复合混合物(例如，细胞溶解物或组织溶解物)分离。作为非限制性实例，牙龈蛋白酶可经生物素活性探针修饰并结合至链霉抗生物素蛋白珠粒(例如，具有共价或非共价结合的链霉抗生物素蛋白的交联多醣、多孔硅胶、磁性粒子或诸如此类)。在检测活性探针中的报告子部分之前，可经由物理方式(例如离心或过滤)将具有结合牙龈蛋白酶的珠粒自混合物分离。携有对报告子部分表位(例如，FLAG肽)具特异性的抗体的表面可用于经由包括(但不限于)ELISA(包括夹心式ELISA及竞争性ELISA)及表面等离子体共振分析的技术来结合并检测经标记的抗体。
VIII.实施例
实施例1.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(2,3,6-三氟苯氧基)庚-3-基)环戊烷甲酰胺(1)盐酸盐的制备
在N2(15psi)下在-40℃下向化合物1.4(23.0g,67.2mmol,1.00eq)于THF(200mL)中的混合物添加NMM(6.79g,67.2mmol,7.38mL,1.00eq)、氯甲酸异丁酯(9.17g,67.2mmol,8.82mL,1.00eq)及重氮甲烷(5.65g,134mmol,2.00eq)。将混合物在0℃下搅拌30min。LCMS显示反应已完成。向反应添加H2O(200mL)，并用两份300-mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用两份200-mL盐水(200)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩以提供呈黄色油状物的粗制化合物1.3(30.0g，粗制)。
在N2(15psi)下在-20℃下向化合物1.3(20.0g,54.6mmol,1.00eq)于EtOAc(300mL)中的混合物添加溴化氢(29.8g,121.7mmol,20.0mL,33％纯度，2.23eq)。将混合物在-20℃下搅拌10min。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝0:1)显示反应已完成。通过添加饱和NaHCO3使反应碱化直至混合物的pH达到8为止，并用三份500-mL EtOAc萃取混合物。将合并的有机相用两份200-mL盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩，以得到呈黄色固体的粗制化合物1.2(15.0g，粗制)。
在25℃下向化合物1.2(4.00g,9.54mmol,1.00eq)于DMF(40.0mL)中的混合物添加2,6-二氟苯酚(1.49g,11.4mmol,1.20eq)及KF(1.66g,28.6mmol,670μL,3.00eq)。将混合物在25℃下搅拌3h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)显示反应已完成。向混合物添加H2O(150mL)并用两份200-mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用两份100-mL盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。残余物通过硅胶层析(石油醚:乙酸乙酯＝100:1,5:1)进行纯化，以得到呈黄色固体的化合物1.1(2.50g,5.35mmol,56.1％产率)。
在25℃下向化合物1.1(4.00g,8.22mmol,1.00eq)于EtOAc(3.00mL)中的混合物添加HCl/EtOAc(40.0mL)。将混合物在25℃下搅拌2h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)显示反应已完成。将混合物在减压中浓缩以提供呈浅黄色固体的(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(2,3,6-三氟苯氧基)庚-3-基)环戊烷甲酰胺1盐酸盐(1.34g,3.16mmol)。LCMS(ESI)：针对C19H25N2F3O3计算的m/z:[M+H]：387.2；实验值387.1；RT＝2.508min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.21-1.83(m,15H)2.60-2.81(m,3H)4.30(ddd,J＝9.70,7.17,4.52Hz,1H)5.02-5.22(m,2H)7.12-7.24(m,2H)7.98(br s,3H)8.32(d,J＝7.28Hz,1H)。
实施例2.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(2)盐酸盐的制备
如上文所阐述制备化合物1.2(4.00g,9.54mmol,1.00eq)，并在25℃下与DMF(40.0mL)、2,6-二氟苯酚(1.49g,11.5mmol,1.20eq)及KF(1.66g,28.6mmol,670μL,3.00eq)合并。将混合物在25℃下搅拌3h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)显示反应已完成。向混合物添加H2O(150mL)并利用乙酸乙酯(100mL*2)萃取。将合并的有机相用盐水(100mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。残余物通过硅胶层析(石油醚:乙酸乙酯＝100:1，5:1)进行纯化，以得到呈黄色固体的化合物2.1(2.50g,5.35mmol,56.1％产率)。
在25℃下向化合物2.1(3.50g,7.47mmol,1.00eq)于EtOAc(2.00mL)中的混合物添加HCl/EtOAc(20.0mL)。将混合物在25℃下搅拌1h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)显示反应已完成。残余物通过制备型HPLC(酸)进行预纯化，以得到呈浅黄色固体的(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺2盐酸盐(1.13g,2.79mmol)。LCMS(ESI)：针对C19H26N2F2O3计算的m/z:[M+H]：369.2；实验值369.1；RT＝2.439min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.18-1.84(m,15H)2.56-2.82(m,3H)4.25-4.39(m,1H)4.92-5.13(m,2H)7.02-7.18(m,3H)7.91(br s,3H)8.27(br d,J＝7.28Hz,1H)。
实施例3.外消旋N-(7-氨基-2-氧代-1-(2,3,6-三氟苯氧基)庚-3-基)环戊烷甲酰胺的制备
在15℃下向环戊烷甲酸(4.40g,38.6mmol,4.19mL,0.95eq)于DCM(50.0mL)中的混合物添加(COCl)2(5.87g,46.3mmol,4.05mL,1.14eq)。将混合物在15℃下搅拌30min。然后将其在真空下浓缩以形成残余物，将其溶解于EtOAc(40.0mL)。在0℃下将所得溶液逐滴添加至化合物1b.5(10.0g,40.6mmol,1.00eq)、Na2CO3(5.16g,48.7mmol,1.20eq)及NaOH(1.64g,41.0mmol,1.01eq)于H2O(80.0mL)中的混合物。然后将混合物在15℃下搅拌14小时。LCMS显示反应已完成。将乙酸乙酯去除，并使剩余溶液冷却至0℃，之后用固体KHSO4将pH调整至6-7。将混合物过滤，收集到呈白色固体的化合物1b.4(12.0g,35.0mmol,86.3％产率)。
在N2(15psi)下在-40℃下向化合物1b.4(12.0g,35.0mmol,1.00eq)于THF(300mL)中的混合物添加NMM(3.54g,35.0mmol,3.85mL,1.00eq)氯甲酸异丁酯(4.79g,35.0mmol,4.61mL,1.00eq)及重氮甲烷(2.95g,70.1mmol,2.00eq)。将混合物在0℃下搅拌30min。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝0:1)显示反应已完成。向反应添加H2O(100mL)并用两份200-mL乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用两份100-mL盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩以提供呈黄色油状物的化合物1b.3(13.7g，粗制)。
在N2(15psi)下在-20℃下向化合物1b.3(13.7g,37.4mmol,1.00eq)于EtOAc(140mL)中的混合物添加溴化氢(20.9g,85.3mmol,14.0mL,33％纯度，2.28eq)。将混合物在-20℃下搅拌10min。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)显示反应已完成。通过饱和NaHCO3使反应碱化直至pH达到8为止，并用三份200-mL EtOAc萃取混合物。将合并的有机相用两份100-mL盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩，以得到呈黄色固体的化合物1b.2(8.80g，粗制)。
在25℃下向化合物1b.2(400mg,954μmol,1.00eq)于DMF(10.0mL)中的混合物添加KF(166mg,2.86mmol,67.0μL,3.00eq)及2,3,6-三氟苯酚(170mg,1.14mmol,1.20eq)。将混合物在25℃下搅拌10h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)显示反应已完成。然后将混合物用H2O(10mL)稀释并用三份10-mL EtOAc萃取。将有机层合并，用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以得到呈黄色油状物的化合物21.1(400mg,822μmol,86.2％产率)。
在25℃下向化合物21.1(400mg,822μmol,1.00eq)于EtOAc(5.00mL)中的混合物添加HCl/EtOAc(822μmol,15.0mL,1.00eq)。将混合物在25℃下搅拌30min。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)显示反应已完成。将反应在减压下浓缩。残余物通过制备型HPLC进行纯化以提供呈浅黄色固体的化合物21的三氟乙酸盐(90.0mg,213μmol,25.9％产率)。
将化合物1(36mg)及化合物21(36mg)与水(2mL)及MeOH(0.5mL)一起混合。然后，通过冻干将溶剂去除以提供外消旋N-(7-氨基-2-氧代-1-(2,3,6-三氟苯氧基)庚-3-基)环戊烷甲酰胺三氟乙酸盐(72mg)。
实施例4.外消旋N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺的制备
在25℃下将如上文所阐述制备的化合物1b.2(400mg,954μmol,1.00eq)与DMF(10.0mL)、KF(166mg,2.86mmol,67.0μL,3.00eq)及2,6-二氟苯酚(149mg,1.14mmol,1.20eq)合并。将混合物在25℃下搅拌10h。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)显示反应已完成。用H2O(10mL)稀释混合物并用三份10-mL EtOAc萃取。将有机层合并，用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以提供呈黄色油状物的粗制2b.1(400mg，粗制)。
在25℃下向2b.1(400mg,856μmol,1.00eq)于EtOAc(5.00mL)中的混合物添加HCl/EtOAc(856μmol,15.0mL,1.00eq)。将混合物在25℃下搅拌30min。TLC(石油醚:乙酸乙酯＝2:1)显示反应已完成。将混合物在减压下浓缩，并通过制备型HPLC对所得残余物进行纯化，以得到呈浅黄色固体的化合物2b的三氟乙酸盐(70.0mg,173μmol,20.2％产率)。
N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺三氟乙酸盐(55mg)的外消旋混合物是通过如上文针对化合物1及化合物21所阐述的那样合并化合物2及化合物2b来制备。
实施例5.(S)-N-(7-氨基-1-(2-氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(3)的制备
在N2下在0℃下向化合物1.5(10.00g,40.60mmol,1.00eq)及环戊烷甲酰氯(5.92g,44.66mmol,5.43mL,1.10eq)于EtOAc(20.00mL)中的混合物添加于H2O(80.00mL)中的Na2CO3(5.16g,48.72mmol,1.20eq)及NaOH(1.64g,41.01mmol,1.01eq)。将混合物在10℃下搅拌3小时。去除EtOAc且然后使溶液冷却至0℃，并利用HCl(1N)将pH调整至6-7。将悬浮液过滤，并用50mL PE洗涤滤饼且在真空下干燥，以得到呈白色固体的化合物1.4(10.60g,30.96mmol,76.26％产率)。LCMS(ESI)：针对C17H30N2O5计算的m/z:[M+H]：343.4；实验值343.2；RT＝1.022min。
在N2下在-20℃下向化合物1.4(2.00g,5.84mmol,1.00eq)于THF(20.00mL)中的混合物一次性添加NMM(708.86mg,7.01mmol,770.50μL,1.20eq)及氯甲酸异丁酯(797.61mg,5.84mmol,766.93μL,1.00eq)。将混合物在-20℃下搅拌1小时。在0℃下添加于Et2O(20ml)中的重氮甲烷溶液并搅拌2小时。用H2O(20mL)稀释混合物并用EtOAc(3×20mL)萃取。将有机层合并，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物，其通过硅胶层析(PE/EtOAc＝1/1)进行纯化，以得到呈黄色固体的化合物1.3(130.00mg,354.76μmol)。LCMS(ESI)：针对C18H30N4O4计算的m/z:[M+H]：367.4；实验值339.2；RT＝0.772min。
在N2下在-20℃下向化合物1.3(130.00mg,354.75μmol,1.00eq)于EtOAc(1.00mL)中的混合物一次性添加HBr/AcOH(150.00μL,33％纯度)。将混合物在N2下在-20℃下搅拌10min，用饱和NaHCO3碱化至pH＝8，并用EtOAc(3×10mL)萃取。将有机层合并，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以得到呈白色固体的化合物1.2(100.00mg,238.46μmol,67.22％产率)。LCMS(ESI)：针对C18H31N2O4计算的m/z:[M+H]：420.3；实验值316.2；RT＝0.709min。
在N2下在20℃下向化合物1.2(50.00mg,119.23μmol,1.00eq)及2-氟苯酚(13.37mg,119.23μmol,11.05μL,1.00eq)于DMF(1.00mL)中的混合物一次性添加KF(20.78mg,357.69μmol,8.38μL,3.00eq)。将混合物在20℃下搅拌15小时。用EtOAc(3×5mL3)萃取水相。将合并的有机相用盐水(3mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残余物，以得到呈黄色油状物的化合物3.1(15.00mg,33.29μmol,27.92％产率)。LCMS(ESI)：针对C24H36N2O5F计算的m/z:[M+H]：451.5；实验值451.4；RT＝0.929min。
将化合物3.1(15.00mg,33.29μmol,1.00eq)于HCl/EtOAc(1.00mL)中的混合物在20℃下搅拌3小时。蒸发溶液以去除有机溶剂。将残余水溶液冻干，以得到呈白色固体的化合物3的盐酸盐(2.00mg,5.71μmol,17.14％产率)。LCMS(ESI)：针对C19H28N2O3F计算的m/z:[M+H]：351.4；实验值351.3；RT＝2.477min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.25-1.83(m,17H)2.61-2.87(m,4H)4.24-4.43(m,1H)4.95-5.13(m,2H)6.87-7.27(m,4H)7.83(br s,3H)8.31(d,J＝6.90Hz,1H)。
实施例6.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(2,3,5-三氟苯氧基)庚-3-基)环戊烷甲酰胺(4)的制备
在N2下在25℃下向化合物1.2(100.00mg,238.46μmol,1.00eq)及2,3,5-三氟苯酚(42.37mg,286.15μmol,1.20eq)于DMF(1.00mL)中的混合物一次性添加KF(41.56mg,715.38μmol,16.76μL,3.00eq)。将混合物在25℃下搅拌15小时。将反应混合物倾倒至H2O(50mL)中，并用EtOAc(3×20mL)萃取水相。将合并的有机相用盐水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残余物，以得到呈白色固体的化合物4.1(50.00mg,102.77μmol,43.10％产率)。LCMS(ESI)：针对C24H33N2F3O5计算的m/z:[M+H]：487.2；实验值487.3；RT＝0.936min。
在N2下在20℃下将化合物4.1(50.00mg,102.77μmol,1.00eq)于HCl/EtOAc(2.00mL)中的混合物搅拌15小时。蒸发溶液以去除有机溶剂。将残余水溶液冻干，以得到呈白色固体的化合物4的盐酸盐(30.00mg,77.64μmol,75.55％产率)。LCMS(ESI)：针对C19H25N2F3O3计算的m/z:[M+H]：387.2；实验值387.2；RT＝2.321min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.24-1.85(m,15H)2.63-2.83(m,3H)4.20-4.35(m,1H)5.18(d,J＝1.32Hz,2H)6.83-7.14(m,2H)7.98(br s,3H)8.44(d,J＝6.62Hz,1H)。
实施例7.(S)-N-(7-氨基-1-(2,3-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(5)的制备
在N2下在20℃下向化合物1.2(100.00mg,238.46μmol,1.00eq)于DMF(1.00mL)中的混合物一次性添加KF(41.56mg,715.38μmol,16.76μL,3.00eq)及2,3-二氟苯酚(37.23mg,286.15μmol,1.20eq)。将混合物在20℃下搅拌15小时。将反应混合物倾倒至H2O(5mL)中，并用EtOAc(3×5mL)萃取水相。将合并的有机相用盐水(3mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥且过滤并在真空下浓缩。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残余物，以得到呈白色固体的化合物5.1(50.00mg,106.72μmol,44.75％产率)。
在N2下在20℃下将化合物5.1(50.00mg,106.72μmol,1.00eq)于HCl/EtOAc(2.00mL)中的混合物搅拌15小时。蒸发溶液以去除有机溶剂。将残余水溶液冻干，以得到呈白色固体的化合物5的盐酸盐(15.00mg,40.71μmol,38.15％产率)。LCMS(ESI)：针对C19H26N2F2O3计算的m/z:[M+H]：369.2；实验值369.2；RT＝2.246min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.23-1.83(m,15H)2.62-2.83(m,3H)4.32(ddd,J＝9.59,6.73,4.63Hz,1H)5.03-5.19(m,2H)6.77-7.14(m,3H)7.90(br s,3H)8.36(d,J＝6.83Hz,1H)。
实施例8.(S)-N-(7-氨基-1-(2,5-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(6)的制备
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在N2下在20℃下向化合物1.2(100.00mg,238.46μmol,1.00eq)于DMF(1.00mL)中的混合物一次性添加KF(41.56mg,715.38μmol,16.76μL,3.00eq)及2,5-二氟苯酚(37.23mg,286.15μmol,1.20eq)。将混合物在20℃下搅拌15小时。将反应混合物倾倒至H2O(5mL)中，并用EtOAc(5mL*3)萃取水相。将合并的有机相用盐水(3mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残余物，以得到呈白色固体的化合物6.1(41.00mg,87.51μmol,36.70％产率)。
在N2下在20℃下将化合物6.1(41.00mg,87.51μmol,1.00eq)于HCl/EtOAc(2.00mL)中的混合物搅拌15小时。蒸发溶液以去除有机溶剂。将残余水溶液冻干，以得到呈白色固体的化合物6的盐酸盐(17.00mg,46.14μmol,52.73％产率)。LCMS(ESI)：针对C19H26N2F2O3计算的m/z:[M+H]：369.2；实验值369.2；RT＝2.239min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.10-1.85(m,16H)2.62-2.84(m,3H)4.31(br t,J＝10.23Hz,1H)5.02-5.18(m,2H)6.69-7.33(m,3H)7.85(br s,3H)8.35(br d,J＝6.65Hz,1H)。
实施例9.(S)-N-(7-氨基-1-(3-氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(7)的制备
在N2下在20℃下向化合物1.2(100.00mg,238.46μmol,1.00eq)于DMF(1.00mL)中的混合物一次性添加KF(41.56mg,715.38μmol,16.76μL,3.00eq)及3-氟苯酚(32.08mg,286.15μmol,26.30μL,1.20eq)。将混合物在20℃下搅拌15小时。将反应混合物倾倒至H2O(5mL)中，用EtOAc(3×5mL)萃取水相。将合并的有机相用盐水(3mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残余物，以得到呈白色固体的化合物7.1(47.00mg,104.32μmol,43.75％产率)。
在N2下在20℃下将化合物7.1(47.00mg,104.32μmol,1.00eq)于HCl/EtOAc(2.00mL)中的混合物搅拌15小时。蒸发溶液以去除有机溶剂。将残余水溶液冻干，以得到呈白色固体的化合物7的盐酸盐(20.00mg,57.07μmol,54.71％产率)。LCMS(ESI)：针对C19H27N2FO3计算的m/z:[M+H]：351.2；实验值351.2；RT＝2.205min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.19-1.85(m,15H)2.60-2.87(m,3H)4.33(ddd,J＝9.43,6.67,4.85Hz,1H)4.93-5.13(m,2H)6.61-6.88(m,3H)7.68(br s,3H)8.27(d,J＝6.84Hz,1H)。
实施例10.(S)-N-(7-氨基-1-(3,5-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(8)的制备
在N2下在20℃下向化合物1.2(100.00mg,238.46μmol,1.00eq)于DMF(1.00mL)中的混合物一次性添加KF(41.56mg,715.38μmol,16.76μL,3.00eq)及3,5-二氟苯酚(37.23mg,286.15μmol,1.20eq)。将混合物在20℃下搅拌15小时。将反应混合物倾倒至H2O(5mL)中，并用EtOAc(3×5mL)萃取水相。将合并的有机相用盐水(3mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。然后通过制备型HPLC(TFA条件)纯化残余物，以得到呈白色固体的化合物8.1(50.00mg,106.72μmol,44.75％产率)。
在N2下在20℃下将化合物8.1(50.00mg,106.72μmol,1.00eq)于HCl/EtOAc(2.00mL)中的混合物搅拌4小时。蒸发溶液以去除有机溶剂。将残余水溶液冻干，以得到呈白色固体的化合物8的盐酸盐(20.00mg,54.29μmol,50.87％产率)。LCMS(ESI)：针对C19H26N2F2O3计算的m/z:[M+H]：369.2；实验值369.1；RT＝2.750min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.24-1.82(m,15H)2.61-2.83(m,3H)4.32(ddd,J＝9.43,6.67,4.85Hz,1H)4.96-5.08(m,2H)6.67(dd,J＝9.48,2.21Hz,2H)6.79(tt,J＝9.43,2.26Hz,1H)7.67(br s,3H)8.26(d,J＝6.84Hz,1H)。
实施例11.(R)-3-(乙酰氨基-2,2,2-d3)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)苯甲酰胺(10)的制备
在N2下在0℃下向化合物10.7(10.00g,72.92mmol,1.00eq)于MeOH(100.00mL)中的溶液一次性添加SOCl2(17.35g,145.84mmol,10.58mL,2.00eq)。将混合物在65℃下搅拌15小时。将反应混合物倾倒至H2O(20mL)中，并用EtOAc(3×10mL)萃取水相。将合并的有机相用盐水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩，以得到呈白色固体的化合物10.6(13.10g，粗制)。LCMS(ESI)：针对C8H9NO2计算的m/z:[M+H]：152.1；实验值152.2；RT＝1.191min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 3.35(s,3H)3.95(s,3H)7.65-7.72(m,2H)8.07(s,1H)8.10-8.16(m,1H)
在N2下在0℃下向化合物10.6(3.77g,24.97mmol,1.00eq)、HOBt(3.71g,27.47mmol,1.10eq)及EDCI(4.79g,24.97mmol,1.00eq)于DMF(50.00mL)中的混合物一次性添加DIEA(16.14g,124.85mmol,21.80mL,5.00eq)及氘化2,2,2-三氘乙酸酯(1.60g,24.97mmol,1.00eq)。将混合物在15℃下搅拌15小时。将反应混合物倾倒至H2O(20mL)中，并用EtOAc(3×10mL)萃取水相。将合并的有机相用盐水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10:1至2:1)进行纯化，以得到呈无色油状物的化合物10.5(2.90g,14.78mmol,59.19％产率)。LCMS(ESI)：针对C10H8D3NO3计算的m/z:[M+H]：197.1；实验值197.2；RT＝0.634min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 3.91(s,3H)7.41(t,J＝7.94Hz,1H)7.51(br s,1H)7.78(d,J＝7.72Hz,1H)7.92(br d,J＝8.16Hz,1H)8.01(s,1H)。
在N2下在15℃下向化合物10.5(2.90g,14.78mmol,1.00eq)于MeOH(36.00mL)中的溶液一次性添加于H2O(12.00mL)中的NaOH(1.18g,29.56mmol,2.00eq)。将混合物在15℃下搅拌15小时。去除EtOAc且然后使溶液冷却至0℃，并利用HCl(1N)将pH调整至6-7。将悬浮液过滤并用50mL PE洗涤滤饼且在真空下干燥，以得到呈白色固体的化合物10.4(2.10g，粗制)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm7.41(t,J＝7.94Hz,1H)7.75(dt,J＝7.72,1.32Hz,1H)7.82(ddd,J＝8.05,2.21,0.99Hz,1H)8.21(t,J＝1.87Hz,1H)。
在N2下在0℃下向化合物10.4(1.00g,5.49mmol,1.00eq)、HOBt(815.81mg,6.04mmol,1.10eq)及EDCI(1.16g,6.04mmol,1.10eq)于DMF(2.00mL)中的混合物一次性添加DIEA(2.84g,21.96mmol,3.83mL,4.00eq)及(2S)-2-氨基-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸甲酯(1.43g,5.49mmol,1.00eq)。将混合物在15℃下搅拌15小时。将反应混合物倾倒至H2O(30mL)中，用EtOAc(3×30mL)萃取水相。将合并的有机相用盐水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝4:1至0:1)进行纯化，以得到呈浅黄色固体的化合物10.3(1.90g,4.48mmol,81.53％产率)。LCMS(ESI)：针对C21H28D3N3O6计算的m/z:[M+H]：425.2；实验值325.3；RT＝0.757min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.31-1.54(m,14H)1.70-1.97(m,2H)2.11-2.19(m,1H)3.00-3.12(m,2H)3.71(s,3H)4.64-4.81(m,2H)7.11(br d,J＝7.50Hz,1H)7.28-7.36(m,1H)7.47(br d,J＝7.28Hz,1H)7.75(br s,1H)7.95(br d,J＝7.72Hz,1H)8.47(br s,1H)。
在N2下在0℃下向DIPA(760.95mg,7.52mmol,1.06mL,4.00eq)于THF(15.00mL)中的溶液添加n-BuLi(481.73mg,7.52mmol,4.00eq)。0.5h之后，在N2下在-78℃下将化合物10.3(800.00mg,1.88mmol,1.00eq)及氯(碘)甲烷(1.33g,7.52mmol,545.83μL,4.00eq)添加至混合物。将所得混合物在-78℃下搅拌1.5小时。添加水(20mL)，并用EtOAc(3×20mL)萃取混合物。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩，以得到呈深棕色油状物的化合物10.2(900.00mg，粗制)。LCMS(ESI)：针对C21H27D3ClN3O5计算的m/z:[M+H]：442.2；实验值339.3；RT＝0.748min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.35-1.59(m,17H)1.67(br s,3H)1.76-2.02(m,3H)3.11(br d,J＝6.17Hz,2H)3.77(s,3H)4.60-4.82(m,2H)6.87(br s,1H)7.40(br t,J＝7.61Hz,1H)7.52(br s,1H)7.66-7.82(m,2H)7.92(brs,1H)。
在N2下在20℃下向化合物10.2(200.00mg,451.52μmol,1.00eq)及2,6-二氟苯酚(58.74mg,451.52μmol,1.00eq)于DMF(4.00mL)中的混合物一次性添加DIEA(175.06mg,1.35mmol,236.57μL,3.00eq)。将混合物在20℃下搅拌15小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以得到呈深棕色固体的化合物10.1(20.00mg,37.27μmol,8.26％产率)。LCMS(ESI)：针对C27H30D3F2N3O6计算的m/z:[M+H]：537.3；实验值481.3；RT＝1.208min。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm1.41(br s,18H)1.80(br s,2H)2.08-2.24(m,2H)3.13(br s,3H)4.91(br s,3H)5.24(br s,1H)6.88-7.05(m,5H)7.37-7.46(m,3H)7.56(br s,2H)7.78(brs,1H)7.93(br s,1H)
在N2下在20℃下向化合物10.1(10.00mg,18.64μmol,1.00eq)于DCM(10.00mL)中的溶液一次性添加TFA(3.08g,27.01mmol,2.00mL,1449.18eq)。将混合物在20℃下搅拌4小时，过滤，并在真空下浓缩。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以得到呈深棕色固体的化合物10的三氟乙酸盐(1.00mg,2.29μmol,12.29％产率)。LCMS(ESI)：针对C22H22D3F2N3O4计算的m/z:[M+H]：437.2；实验值437.3；RT＝2.042min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.48-1.87(m,5H)2.13(br s,1H)2.91-2.99(m,2H)4.90-5.08(m,5H)6.94-7.12(m,3H)7.39-7.46(m,1H)7.54-7.65(m,2H)8.13(s,1H)。
实施例12.生物素化牙龈蛋白酶抑制剂(11)的制备
在N2下在0℃下向化合物10.7(5.00g,36.46mmol,1.00eq)于CH3CN(50.00mL)中的溶液一次性添加t-BuONO(5.64g,54.69mmol,6.48mL,1.50eq)及TMSN3(5.04g,43.75mmol,5.73mL,1.20eq)。将混合物在15℃下搅拌1小时，过滤，并在真空下浓缩。添加H2O(20mL)，并用EtOAc(3×10mL)萃取水相。将合并的有机相用盐水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩，以得到呈白色固体的化合物11.6(4.00g，粗制)。LCMS(ESI)：针对C7H5N3O2计算的m/z:[M+H]：164.0；实验值164.1；RT＝0.705min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 2.71(d,J＝9.48Hz,1H)6.93-6.98(m,1H)7.27-7.32(m,1H)7.44-7.57(m,1H)7.79-7.84(m,1H)7.90-7.95(m,1H)。
在N2下在0℃下向化合物11.6(2.00g,12.26mmol,1.00eq)、HOBt(1.82g,13.49mmol,1.10eq)及EDCI(2.59g,13.49mmol,1.10eq)于DMF(40.00mL)中的混合物一次性添加(2S)-2-氨基-6-(叔丁氧基羰基氨基)己酸甲酯(3.19g,12.26mmol,1.00eq)及DIEA(6.34g,49.04mmol,8.57mL,4.00eq)。将混合物在15℃下搅拌4小时。将反应混合物倾倒至H2O(20mL)中。用EtOAc(3×50mL)萃取水相。将合并的有机相用盐水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10:1至2:1)进行纯化，以得到呈白色固体的化合物11.5(3.50g,8.63mmol,70.39％产率)。LCMS(ESI)：针对C19H27N5O5计算的m/z:[M+H]：406.2；实验值350.2；RT＝0.840min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.39(s,10H)1.46-1.56(m,3H)1.75-2.00(m,2H)3.05-3.14(m,2H)3.77(s,3H)4.64(br s,1H)4.72-4.80(m,1H)6.94(br d,J＝7.06Hz,1H)7.14(ddd,J＝8.05,2.32,0.88Hz,1H)7.40(t,J＝7.83Hz,1H)7.47-7.56(m,2H)。
在N2下在0℃下向DIPA(2.25g,22.20mmol,3.12mL,6.00eq)于THF(40.00mL)中的溶液添加n-BuLi(1.42g,22.20mmol,6.00eq)。0.5h之后，在N2下在-78℃下将化合物11.5(1.50g,3.70mmol,1.00eq)及氯(碘)甲烷(2.61g,14.80mmol,1.07mL,4.00eq)添加至混合物。将所得混合物在-78℃下搅拌1.5小时。将反应混合物添加至水(20mL)，并用EtOAc(3×20mL)萃取溶液。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以产生残余物，以得到呈深棕色油状物的化合物11.4(1.50g，粗制)。
在N2下在20℃下向化合物11.4(1.50g,3.54mmol,1.00eq)及2,6-二氟苯酚(460.34mg,3.54mmol,1.00eq)于DMF(15.00mL)中的混合物一次性添加DIEA(1.37g,10.62mmol,1.85mL,3.00eq)。将混合物在20℃下搅拌15小时。将反应混合物添加至水(20mL)，并用EtOAc(3×20mL)萃取溶液。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10:1至2:1)进行纯化，以得到呈浅黄色油状物的化合物11.3(400.00mg,772.92μmol,21.83％产率)。LCMS(ESI)：针对C25H29F2N5O5计算的m/z:[M+H]：518.2；实验值518.3；RT＝0.912min。
在N2下在20℃下向化合物11.3(270.00mg,521.72μmol,1.00eq)及丙-2-炔-1-胺(28.74mg,521.72μmol,33.41μL,1.00eq)于CH3CN(4.00mL)中的混合物一次性添加CuSO4(4.16mg,26.09μmol,4.00μL,0.05eq)及抗坏血酸钠(20.67mg,104.34μmol,0.20eq)。将混合物在20℃下搅拌15小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以得到呈深棕色油状物的化合物11.2(70.00mg,122.25μmol,23.43％产率)。LCMS(ESI)：针对C28H34F2N6O5计算的m/z:[M+H]：573.3；实验值573.5；RT＝0.846min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.19-1.69(m,8H)2.04(br s,1H)2.67-3.25(m,3H)4.45(br s,1H)4.72-5.15(m,2H)6.78-7.09(m,2H)7.58-8.01(m,2H)8.16-8.49(m,1H)8.63-9.26(m,1H)。
在N2下在0℃下向生物素-DPEG(4)-COOH(34.34mg,69.86μmol,1.00eq)、HOBt(9.44mg,69.86μmol,1.00eq)及EDCI(13.39mg,69.86μmol,1.00eq)于DMF(1.00mL)中的混合物一次性添加化合物11.2(40.00mg,69.86μmol,1.00eq)及DIEA(36.11mg,279.44μmol,48.80μL,4.00eq)。将混合物在20℃下搅拌15小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以得到呈白色固体的化合物11.1(20.00mg,19.12μmol,27.37％产率)。LCMS(ESI)：针对C49H69F2N9O12S计算的m/z:[M+H]：1046.5；实验值1046.3；RT＝1.115min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.21-1.34(m,12H)1.35-1.75(m,9H)1.85(br dd,J＝9.59,3.64Hz,1H)2.05(t,J＝7.39Hz,2H)2.35-2.42(m,1H)2.38(t,J＝6.50Hz,1H)2.53-2.60(m,2H)2.80(dd,J＝12.35,5.07Hz,1H)2.89(br d,J＝5.95Hz,2H)3.08(ddd,J＝8.49,6.06,4.63Hz,1H)3.16(q,J＝5.88Hz,2H)3.44-3.50(m,15H)3.62(t,J＝6.50Hz,3H)4.11(dd,J＝7.72,4.41Hz,1H)4.29(dd,J＝7.72,4.41Hz,1H)4.40(d,J＝5.73Hz,2H)4.59-4.67(m,1H)5.06-5.20(m,2H)6.76(br t,J＝5.51Hz,1H)7.06-7.14(m,3H)7.71(t,J＝8.05Hz,1H)7.82(t,J＝5.62Hz,1H)7.95-8.00(m,1H)8.06(ddd,J＝8.16,2.21,0.88Hz,1H)8.36(t,J＝1.76Hz,1H)8.45(t,J＝5.51Hz,1H)8.64(s,1H)8.95(d,J＝7.28Hz,1H)。
在N2下在20℃下将化合物11.1(20.00mg,19.12μmol,1.00eq)于TFA(1.03g,9.00mmol,666.11μL,470.61eq)中的溶液搅拌4小时。将混合物过滤并在真空下浓缩，以得到呈白色固体的化合物11的三氟乙酸盐(18.00mg,16.98μmol,88.81％产率，TFA)。LCMS(ESI)：针对C44H61F2N9O10S计算的m/z:[M+H]：946.4；实验值946.6；RT＝2.076min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.10-1.77(m,14H)1.82-1.95(m,1H)2.05(t,J＝7.40Hz,2H)2.17(t,J＝8.03Hz,1H)2.30-2.42(m,2H)2.53-2.60(m,3H)2.64-2.71(m,2H)2.73-2.85(m,3H)3.04-3.12(m,2H)3.17(q,J＝5.86Hz,3H)3.44-3.52(m,14H)3.63(br t,J＝6.46Hz,2H)4.08-4.15(m,1H)4.26-4.33(m,1H)4.40(d,J＝5.52Hz,2H)4.63-4.72(m,1H)5.07-5.21(m,2H)6.31-6.42(m,2H)6.95-6.99(m,1H)6.97(s,1H)7.06-7.15(m,3H)7.23(s,1H)7.58-7.76(m,4H)7.81(br t,J＝5.46Hz,1H)7.95-8.01(m,1H)7.98(d,J＝7.91Hz,1H)8.07(dd,J＝8.03,1.25Hz,1H)8.38(s,1H)8.45(t,J＝5.52Hz,1H)8.63-8.66(m,1H)8.64(s,1H)8.98(d,J＝7.53Hz,1H)。
实施例13.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-叠氮基苯甲酰胺(12)的制备
在N2下在18℃下向化合物12.7(5.00g,36.46mmol,1.00eq)及t-BuONO(5.64g,54.69mmol,6.48mL,1.50eq)于CH3CN(70.00mL)中的混合物一次性添加TMSN3(5.04g,43.75mmol,5.73mL,1.20eq)。将混合物在18℃下搅拌10小时。将反应混合物用H2O(100mL)稀释，并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2,DCM:MeOH＝10:1)进行纯化，以得到呈黄色固体的化合物12.6(3.00g,18.39mmol,50.44％产率)。
在N2下在25℃下向化合物12.5(20.00g,81.20mmol,1.00eq)于THF(160.00mL)及MeOH(40.00mL)中的溶液逐滴添加TMSCHN2(27.82g,243.60mmol,3.00eq)。将混合物在25℃下搅拌20小时。将反应混合物在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，乙酸乙酯)进行纯化，以得到呈无色油状物的化合物12.4(8.00g,30.73mmol,37.85％产率)。
在N2下在0℃下向化合物12.6(1.25g,7.68mmol,1.00eq)及EDCI(1.62g,8.45mmol,1.10eq)于DMF(20.00mL)中的混合物一次性添加HOBt(1.14g,8.45mmol,1.10eq)。将混合物在0℃下搅拌1小时，然后向混合物逐滴添加化合物12.4(2.00g,7.68mmol,1.00eq)于DMF(5mL)中的溶液。逐滴添加DIPEA(2.98g,23.04mmol,4.03mL,3.00eq)，并将混合物在0℃下搅拌1小时。将反应混合物用H2O(20mL)稀释并用EtOAc(3×15mL)萃取。将合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1:1)进行纯化，以得到呈黄色油状物的化合物12.3(2.80g,6.91mmol,89.97％产率)。1H NMR(400MHz,CD3OD-d4)δppm 1.40(s,8H)1.44-1.58(m,4H)1.80-2.00(m,2H)3.00-3.10(m,2H)3.74(s,3H)4.58(dd,J＝9.26,5.07Hz,1H)7.25(ddd,J＝8.05,2.32,1.10Hz,1H)7.49(t,J＝7.83Hz,1H)7.56(t,J＝1.76Hz,1H)7.63-7.69(m,1H)。LCMS(ESI)：针对C19H27O5N5计算的m/z:[M+H]：405；实验值350,306；RT＝0.897min。
在0℃下向DIPA(1.50g,14.80mmol,2.08mL,6eq)于THF(15.00mL)中的溶液添加n-BuLi(2.5M,5.92mL,6.00eq)，并将混合物在0℃下搅拌30min。在-78℃下向该混合物添加化合物12.3(1.00g,2.47mmol,1.00eq)及氯(碘)甲烷(2.18g,12.35mmol,895.11μL,5.00eq)于THF(15.00mL)中的溶液。将混合物在-78℃下搅拌30min。添加饱和NH4Cl水溶液(10mL)，且然后用EtOAc(3×15mL)萃取混合物。将合并的有机层用饱和Na2SO3水溶液(20)及盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以提供呈黄色油状物的粗制化合物12.2(2.00g，粗制)，其用于下一步骤中。
在N2下在20℃下向化合物12.2(2.00g,4.72mmol,1.00eq)及2,6-二氟苯酚(613.79mg,4.72mmol,1.00eq)于DMF(5.00mL)中的混合物一次性添加DIPEA(2.44g,18.87mmol,3.30mL,4.00eq)。将混合物在20℃下搅拌10小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以得到呈黄色油状物的化合物12.1(200.00mg,386.46μmol,8.19％产率)。
在N2下在18℃下向化合物12.1(100.00mg,193.23μmol,1.00eq)于DCM(5.00mL)中的溶液一次性添加TFA(1.54g,13.51mmol,1.00mL,69.90eq)。将混合物在18℃下搅拌10小时。将反应混合物在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以得到呈黄色油状物的化合物12的三氟乙酸盐(80.00mg,191.66μmol,99.19％)。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.49-1.67(m,2H)1.67-1.88(m,3H)2.11(dddd,J＝13.84,9.48,6.78,4.30Hz,1H)2.89-2.99(m,2H)4.91-5.08(m,3H)6.95-7.05(m,2H)7.05-7.12(m,1H)7.26-7.31(m,1H)7.48-7.54(m,1H)7.56(t,J＝1.87Hz,1H)7.64-7.70(m,1H)。LCMS(ESI)：针对C20H21F2O3N5计算的m/z:[M+H]：418；实验值418；RT＝3.08min。
实施例14.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(1H-四唑-1-基)庚-3-基)环戊烷甲酰胺(13)及(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(2H-四唑-2-基)庚-3-基)环戊烷甲酰胺(14)的制备
/>
向化合物1.2(50.00mg,119.23μmol,1.00eq)于DMF(3.00mL)中的溶液添加DIEA(46.23mg,357.70μmol,62.47μL,3.00eq)及四唑(0.45M,264.96μL,1.00eq)。将混合物在25℃下搅拌15小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化。获得呈白色固体的化合物13.1(5.00mg,12.24μmol,10.27％产率)，且获得5mg呈白色固体的化合物14.1。
将化合物13.1(5.00mg,12.24μmol,1.00eq)于DCM(5.00mL)及TFA(1.00mL)中的混合物在25℃下搅拌2小时。将混合物在减压下浓缩，以得到化合物13的三氟乙酸盐(5.00mg,11.84μmol,96.71％产率，TFA)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.25-1.57(m,4H)1.58-1.81(m,12H)1.84-2.09(m,6H)2.68-2.84(m,1H)2.94(br t,J＝7.50Hz,3H)4.44-4.58(m,1H)5.51-5.79(m,2H)9.06-9.18(m,1H)。LCMS(ESI)：针对C14H24O2N6·C2HF3O2计算的m/z:[M+H]：423；实验值309；RT＝1.208min。
将化合物14.1(5.00mg,12.24μmol,1.00eq)于DCM(5.00mL)及TFA(1.00mL)中的混合物在25℃下搅拌2小时。将混合物在减压下浓缩，以得到化合物14的三氟乙酸盐(5.00mg,11.84μmol,96.71％产率，TFA)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.20-1.53(m,5H)1.54-1.80(m,12H)1.82-2.08(m,5H)2.64-2.83(m,1H)2.93(br t,J＝7.28Hz,3H)4.55(dd,J＝9.37,4.74Hz,1H)5.71-5.94(m,2H)8.76(s,1H)。LCMS(ESI)：针对C14H24N6O2·C2HF3O2计算的m/z：[M+H]:423；实验值309；RT＝1.606min。
实施例15.荧光牙龈蛋白酶活性探针(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-(4-((3-(5,5-二氟-7,9-二甲基-5H-5l4,6l4-二吡咯并[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]二氮杂硼环三烯(diazaborinin)-3-基)丙酰氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酰胺(15)的制备
在N2下在50℃下向化合物15.7(5.00g,52.58mmol,1.00eq)及2-二乙氧基磷酰基乙酸甲酯(11.05g,52.58mmol,1.00eq)于THF(60.00mL)中的混合物一次性添加K2CO3(14.53g,105.16mmol,2.00eq)。将混合物在50℃下搅拌10小时。将反应混合物用H2O(50mL)稀释并用EtOAc(3×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝5:1)进行纯化，以得到呈白色固体的15.6(8.60g,56.89mmol,108.20％产率)。
在N2下向化合物15.6(8.60g,56.89mmol,1.00eq)于MeOH(100.00mL)中的溶液添加Pd-C(10％,0.9g)。将悬浮液在真空下脱气并用H2吹扫若干次。将混合物在H2(50psi)下在18℃下搅拌10小时。过滤反应混合物并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝5:1)进行纯化，以得到呈无色油状物的化合物15.5(5.00g,32.64mmol,57.37％产率)。
在N2下在18℃下向化合物15.5(3.00g,19.58mmol,1.00eq)及化合物15.4(2.65g,21.54mmol,1.10eq)于DCM(60.00mL)中的混合物一次性添加POCl3(3.30g,21.54mmol,2.00mL,1.10eq)。将混合物在18℃下搅拌10小时，之后在18℃下逐滴添加BF3·Et2O(11.12g,78.32mmol,9.67mL,4.00eq)及DIEA(10.63g,82.24mmol,14.36mL,4.20eq)。将混合物在18℃下搅拌10小时。将反应混合物过滤，用H2O(50mL)稀释，并用DCM(3×50mL)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1:4)进行纯化，以得到呈红色固体的化合物15.3(3.00g,9.80mmol,50.05％产率)。
在N2下在18℃下向化合物15.3(1.00g,3.27mmol,1.00eq)于THF(120.00mL)及H2O(80.00mL)中的混合物一次性添加HCl(51.11g,519.15mmol,50.11mL,37％纯度，158.76eq)。将混合物在18℃下搅拌10小时。通过添加DCM(100mL)使反应混合物淬灭，然后用DCM(3×100mL)萃取。将合并的有机层用盐水(300mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2,DCM:MeOH＝20:1)进行纯化，以得到呈红色固体的化合物15.2(700.00mg,2.40mmol,73.29％产率)。
在N2下在0℃下向化合物15.2(300.00mg,1.03mmol,1.00eq)及HOBt(152.66mg,1.13mmol,1.10eq)于DMF(3.00mL)中的混合物一次性添加EDCI(216.58mg,1.13mmol,1.10eq)。将混合物在0℃下搅拌1小时。然后，在0℃下一次性添加炔丙基胺(56.57mg,1.03mmol,65.78μL,1.00eq)及DIPEA(398.22mg,3.08mmol,538.13μL,3.00eq)，并将混合物在0℃下搅拌1小时。将反应混合物用EtOAc(4mL)稀释并用EtOAc(3×3mL)萃取。将合并的有机层用盐水(5mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过制备型TLC(SiO2,DCM:MeOH＝20:1)进行纯化，以得到呈红色固体的化合物15.1(150.00mg,455.72μmol,44.24％产率)。
在N2下在18℃下向化合物15.1(100.00mg,303.81μmol,1.00eq)及化合物12(126.81mg,303.81μmol,1.00eq)于乙腈(2.00mL)中的混合物一次性添加CuSO4(2.42mg,15.19μmol,2.33μL,0.05eq)于H2O(100.00μL)中的溶液及抗坏血酸钠(120.38mg,607.62μmol,2.00eq)。将混合物在18℃下搅拌10小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈红色固体的化合物15的三氟乙酸盐(5.00mg,6.70μmol,2.21％产率)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.46-1.68(m,1H)1.46-1.67(m,1H)1.69-1.90(m,1H)2.04-2.18(m,2H)2.19-2.31(m,3H)2.48(s,2H)2.69(br t,J＝7.45Hz,2H)2.95(br s,2H)3.19-3.28(m,2H)4.52(s,2H)5.04(br s,3H)6.19(s,1H)6.31(br d,J＝3.51Hz,1H)6.91-7.12(m,4H)7.31-7.32(m,1H)7.35(s,1H)7.68(br t,J＝8.11Hz,1H)7.65-7.71(m,1H)7.95-8.04(m,2H)8.25-8.36(m,2H)。LCMS(ESI)：针对C37H39F4O4N8B计算的m/z:[M+H]：746；实验值747；RT＝2.117min
实施例16.(S)-N-(7-氨基-1-(甲硫基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(16)的制备
向化合物1.2(100.00mg,240μmol,1.00eq)于DMF(2.00mL)中的溶液添加甲基硫基钠(16mg,240μmol,15μL,1.00eq)。将混合物在25℃下搅拌0.5小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化。获得呈黄色油状物的化合物16.1(50.00mg,99.89μmol,55.16％产率，TFA)。
向化合物16.1(50.00mg,129.35μmol,1.00eq)于DCM(5.00mL)中的溶液添加TFA(1.00mL)。将混合物在25℃下搅拌5小时。将混合物在减压下浓缩以产生化合物16的三氟乙酸盐(5.00mg,17.46μmol,13.50％产率)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.33-1.54(m,2H)1.55-1.79(m,11H)1.80-1.99(m,4H)2.06(s,3H)2.64-2.80(m,1H)2.86-2.99(m,2H)3.36(d,J＝1.54Hz,2H)4.67(dd,J＝9.48,4.41Hz,1H)。LCMS(ESI)：针对C14H26SO2N2计算的m/z:[M+H]：287；实验值287；RT＝1.826min。
实施例17.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(2,2,2-三氟乙氧基)庚-3-基)环戊烷甲酰胺(17)的制备
向化合物1.2(50.00mg,119.23μmol,1.00eq)于DMF(2.00mL)中的溶液添加K2CO3(49.44mg,357.69μmol,3.00eq)及2,2,2-三氟乙-1-醇(11.93mg,119.23μmol,8.58μL,1.00eq)。将混合物在25℃下搅拌15小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化。获得呈黄色油状物的化合物17.1(10.00mg,22.81μmol,19.13％产率)。
向叔丁基化合物17.1(10.00mg,22.81μmol,1.00eq)于DCM(2.50mL)中的溶液添加TFA(500.00μL)。将混合物在25℃下搅拌2小时。将混合物在减压下浓缩，以产生呈黄色油状物的化合物17的三氟乙酸盐(5.00mg,14.78μmol,64.78％产率)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.32-1.51(m,3H)1.53-1.78(m,10H)1.80-1.96(m,4H)2.72(quin,J＝7.88Hz,1H)2.86-2.99(m,2H)3.96-4.08(m,2H)4.36-4.55(m,3H)。LCMS(ESI)：针对C15H25O3N2F3计算的m/z:[M+H]：339；实验值339；RT＝2.060min。
实施例18.(S)-N-(7-氨基-1-((1,1,1,3,3,3-六氟丙-2-基)氧基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(18)的制备
向化合物1.2(50.00mg,119.23μmol,1.00eq)于DMF(2.00mL)中的溶液添加K2CO3(49.44mg,357.69μmol,3.00eq)及1,1,1,3,3,3-六氟丙-2-醇(20.04mg,119.23μmol,1.00eq)。将混合物在25℃下搅拌15小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化。获得呈黄色油状物的化合物18.1(15.00mg,29.62μmol,24.84％产率)。
向化合物18.1(15.00mg,29.62μmol,1.00eq)于DCM(5.00mL)中的溶液添加TFA(1.00mL)。将混合物在25℃下搅拌15小时。将混合物在减压下浓缩，以产生呈黄色油状物的化合物18的三氟乙酸盐(5.00mg,12.30μmol,41.54％产率)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.35-1.54(m,2H)1.55-1.78(m,10H)1.80-1.97(m,3H)2.65-2.79(m,1H)2.85-2.98(m,2H)4.45-4.54(m,1H)4.60-4.78(m,1H)4.98-5.08(m,1H)。LCMS(ESI)：针对C16H24O3N2F6计算的m/z:[M+H]：407；实验值407；RT＝2.356min。
实施例19.(S)-N-(7-氨基-1-(二甲基氨基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(19)的制备
在N2下在20℃下向化合物1.2(100.00mg,238.46μmol,1.00eq)及N-甲基甲胺(19.44mg,238.46μmol,21.85μL,1.00eq,HCl)于DMF(1.00mL)中的混合物一次性添加DIPEA(123.28mg,953.86μmol,166.59μL,4.00eq)。将混合物在20℃下搅拌1小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈无色油状物的化合物19.1(50.00mg,130.37μmol,54.67％产率)。LCMS(ESI)：针对C20H37O4N3计算的m/z:[M+H]：383；实验值384；RT＝0.672min
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将化合物19.1(50.00mg,130.37μmol,1.00eq)溶解于DMF(1.00mL)中，向混合物添加TFA(1.12g,9.85mmol,728.95μL,75.52eq)，并在18℃下搅拌10小时。将反应混合物在减压下浓缩，以产生呈无色油状物的化合物19的三氟乙酸盐(50.00mg，粗制)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.39-1.58(m,3H)1.59-1.66(m,2H)1.66-1.78(m,7H)1.87-1.98(m,3H)2.68-2.81(m,1H)2.90(s,6H)2.92-2.97(m,2H)4.28-4.32(m,1H)4.32-4.42(m,2H)。LCMS(ESI)：针对C15H29O2N3计算的m/z:[M+H]：283；实验值284；RT＝2.365min
实施例20.(S)-3-乙酰氨基-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)苯甲酰胺(9)的制备
向化合物3-乙酰胺苯甲酸(1.21g,6.74mmol,1.00eq)于DMF(30.00mL)中的溶液添加HOBt(1.00g,7.41mmol,1.10eq)及EDCI(1.42g,7.41mmol,1.10eq)。添加后，将混合物在0℃下搅拌30min。然后在N2下在0℃下向上述混合物添加DIEA(3.48g,26.96mmol,4.71mL,4.00eq)及化合物9.4(2.00g,6.74mmol,1.00eq)。将所得混合物在25℃下搅拌15.5小时。向反应混合物添加水(10mL)，用EtOAc(30mL*3)萃取。分离有机相，用NaCl(10mL)洗涤并经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。获得呈白色固体的化合物9.3(2.30g,5.46mmol,80.96％产率)。LCMS(ESI)：针对C21H31N3O6计算的m/z:[M+H]：421.22；实验值322.3；RT＝0.748min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.30-1.56(m,14H)1.68-1.98(m,2H)2.16(s,3H)2.98-3.15(m,2H)3.71(s,3H)4.61-4.83(m,2H)7.14(br d,J＝7.50Hz,1H)7.28-7.37(m,1H)7.47(br d,J＝7.06Hz,1H)7.74(br s,1H)7.91-8.02(m,1H)8.52(br s,1H)。
在N2下在0℃下向DIPA(384.12mg,3.80mmol,533.50μL,4.00eq)于THF(10.00mL)中的溶液添加n-BuLi(243.17mg,3.80mmol,4.00eq)。0.5h之后，在N2下在-78℃下向上述混合物添加化合物9.3(400.00mg,949.01μmol,1.00eq)及氯碘甲烷(669.55mg,3.80mmol,275.53μL,4.00eq)。将所得混合物在-78℃下搅拌1.5小时。向反应混合物添加水(20mL)，用EtOAc(20mL*3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL*1)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。获得呈黑棕色油状物的化合物9.2(500.00mg，粗制)。
在N2下在25℃下向化合物9.2(200.00mg,454.62μmol,1.00eq)及DIEA(176.27mg,1.36mmol,238.20μL,3.00eq)于DMF(4.00mL)中的溶液添加2,6-二氟苯酚(118.28mg,909.24μmol,2.00eq)。将所得混合物在25℃下搅拌16小时。向反应混合物添加水(10mL)，用EtOAc(10mL*3)萃取。将合并的有机层用盐水(5mL*1)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。获得呈黄色油状物的粗产物(500.00mg)。残余物通过制备型HPLC(中性条件)进行纯化。获得呈白色固体的化合物9.1(10.00mg,18.74μmol,2.00％产率)。
在N2下向化合物9.1(5.00mg,9.37μmol,1.00eq)于DCM(2.00mL)中的溶液添加TFA(2.14mg,18.74μmol,1.39μL,2.00eq)。将混合物在25℃下搅拌16小时。浓缩以得到残余物。获得呈红色油状物的化合物9的三氟乙酸盐(5.00mg,9.13μmol,97.47％产率，TFA)。LCMS(ESI)：针对C22H25F2N3O4计算的m/z:[M+H]：433.18；实验值434.2；RT＝2.052min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.44-1.88(m,1H)1.44-1.51(m,1H)1.51-1.84(m,1H)1.52-1.82(m,1H)1.52-1.85(m,1H)1.83-1.85(m,1H)2.07-2.20(m,1H)2.94(br t,J＝6.50Hz,1H)4.90-5.10(m,1H)4.91-5.10(m,1H)6.91-7.13(m,1H)7.33-7.47(m,1H)7.49-7.68(m,1H)8.03-8.18(m,1H)
其他化合物是根据前述实施例中的程序来合成。
实施例21.(S)-N-(7-氨基-1-(甲磺酰基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(20)的制备
向化合物1.2(200.00mg,476.93μmol,1.00eq)于DMF(3.00mL)中的溶液添加甲基硫基钠(33.43mg,476.93μmol,30.39uL,1.00eq)。将混合物在25℃下搅拌0.5小时。残余物通过制备型HPLC进行纯化，且获得呈黄色油状物的化合物20.2(80.00mg,206.96μmol,43.39％产率)。
向化合物20.2(60.00mg,155.22μmol,1.00eq)于THF(2.00mL)及H2O(600.00μL)中的溶液添加过硫酸氢钾复合盐(oxone，190.85mg,310.44μmol,2.00eq)。将混合物在25℃下搅拌12小时。残余物通过制备型HPLC进行纯化，且获得呈白色固体的化合物20.1(20.00mg,47.78μmol,30.78％产率)
将于TFA(1.00mL)及DCM(5.00mL)中的化合物20.1(20.00mg,47.78μmol,1.00eq)在25℃下搅拌14小时。将混合物在减压下浓缩以提供呈黄色油状物的化合物20的三氟乙酸盐(10.00mg,31.40μmol,65.73％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.18-1.39(m,1H)1.18-1.39(m,1H)1.39-1.66(m,9H)1.67-1.88(m,3H)2.58-2.86(m,3H)3.08(s,3H)4.15-4.32(m,1H)4.39-4.61(m,2H)7.70(br s,3H)8.23(d,J＝7.06Hz,1H)。LCMS(ESI)：针对C14H26SO4N2计算的m/z:[M+H]：319；实验值319；RT＝1.916min。
实施例22.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-氟苯甲酰胺(26)的制备
在N2下在0℃下向化合物26.1(420.44mg,3.0mmol,1当量)及EDCI(632.77mg,3.3mmol,1.1当量)、HOBt(446.01mg,3.3mmol,1.1当量)于DMF(10mL)中的混合物一次性添加化合物26.2(1g,3mmol,1当量)及DIEA(1.55g,12mmol,2.09mL,4当量)。将混合物在0℃下搅拌15小时。用EtOAc(20mL×3)萃取水相。将合并的有机相用盐水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10:1至1:1)进行纯化，以产生呈白色固体的化合物26.3(600mg,1.57mmol,52.3％产率)；LCMS[M+H]+:383；RT＝0.824min。
将n-BuLi(301.51mg,4.71mmol,6当量)及DIPA(476.28mg,4.71mmol,661.49μL,6当量)于THF(6mL)中的混合物在N2下在0℃下搅拌。0.5h之后，在N2下在-78℃下向上述混合物添加26.3(300mg,784.46μmol,1当量)及碘氯甲烷(553.45mg,3.14mmol,227.76μL,4当量)。将所得混合物在-78℃下搅拌2小时。向反应混合物添加水(20mL)，然后用EtOAc(20mL×3)对其进行萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。获得呈棕色油状物的26.4(200mg,499μmol,63.6％产率)。
在N2下在20℃下向化合物26.4(200mg,499μmol,1当量)及2,6-二氟苯酚(64.9mg,499μmol,1当量)于DMF(4mL)中的混合物一次性添加DIEA(193.44mg,1.5mmol,261.41μL,3当量)。将混合物在20℃下搅拌15小时。残余物通过制备级HPLC(TFA条件)进行纯化。获得呈白色固体的化合物26.5(18mg,36.4μmol,1当量)。LCMS[M+H]+:496；RT＝0.886min。
将化合物26.5(18mg,36.4μmol,1当量)于HCl/EtOAc(10mL)中的混合物在20℃下搅拌4小时；然后过滤并在真空下浓缩。残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈无色油状物的化合物26(12mg)；LCMS[M+H]+:395；RT＝1.53min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.48-1.63(m,2H),1.67-1.86(m,3H),2.07-2.18(m,1H),2.89-2.99(m,2H),4.92-4.96(m,1H),4.96-5.06(m,2H),6.95-7.03(m,2H),7.03-7.12(m,1H),7.29-7.35(m,1H),7.51(td,J＝7.99,5.62Hz,1H),7.60(dt,J＝9.70,2.09Hz,1H),7.67-7.71(m,1H)。
实施例23.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-(2-氟乙氧基)苯甲酰胺(27)的制备
在N2下在20℃下向27.1(1g,6.57mmol,1当量)及1-氟-2-溴乙烷(834.44mg,6.57mmol,1当量)于DMF(10mL)中的混合物一次性添加K2CO3(2.72g,19.71mmol,3当量)。将混合物在80℃下搅拌15小时。用EtOAc(20mL×3)萃取水相。将合并的有机相用盐水(5mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至2/1)进行纯化，以产生呈无色油状物的化合物27.2(890mg,4.49mmol,68.35％产率)；LCMS[M+H]+:199；RT＝0.77min。
将27.2(890mg,4.49mmol,1当量)于MeOH(27mL)及NaOH(1M,8.98mL,2当量)中的溶液在20℃下搅拌15小时。用EtOAc(40mL×2)萃取合并的水层以去除中性杂质。利用HCl水溶液使水相酸化至pH 5并用EtOAc(40mL)进行萃取。获得呈无色油状物的化合物27.3(600mg,3.26mmol,72.6％产率)。
在N2下在0℃下向化合物27.3(600mg,3.26mmol,1当量)及HOBt(484.54mg,3.59mmol,1.1当量)、EDCI(687.44mg,3.59mmol,1.1当量)于DMF(10mL)中的混合物一次性添加26.1(967.54mg,3.26mmol,1当量，HCl)及DIEA(1.69g,13.04mmol,2.28mL,4当量)。将混合物在20℃下搅拌15小时。将反应混合物添加至水(20mL)，然后用EtOAc(20mL×3)进行萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以产生呈无色油状物的27.4(1.17g,2.74mmol,84％产率)；LCMS[M+H]+:427；RT＝0.825min。
在N2下在0℃下将n-BuLi(270.37mg,4.22mmol,6当量)一次性添加至于THF(6mL)中的DIPA(427.08mg,4.22mmol,593.17μL,6当量)。0.5小时之后，在N2下在-78℃下向上述混合物添加27.4(300mg,703.43μmol,1当量)及碘氯甲烷(744.43mg,4.22mmol,306.35μL,6当量)。将所得混合物在-78℃下搅拌2小时。向反应混合物添加水(20mL)，然后用EtOAc(20mL×3)对其进行萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。获得呈棕色油状物的化合物27.5(300mg，粗制)。
在N2下在20℃下向化合物27.5(300mg,674.3μmol,1当量)及2,6-二氟苯酚(87.72mg,674.28μmol,1当量)于DMF(4mL)中的混合物一次性添加DIEA(261.43mg,2.02mmol,353.29μL,3当量)。将混合物在20℃下搅拌15小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化。获得呈棕色固体的化合物27.6(72mg,133.7μmol,19.8％产率)；LCMS[M+H]+:539；RT＝2.85min。
向27.6(72mg,133.7μmol,1当量)于DCM(1mL)中的溶液添加TFA(304.87mg,2.67mmol,197.97μL,20当量)。将混合物在20℃下搅拌4小时。将其过滤并在真空中浓缩以产生化合物27(50mg,75.02μmol,56％产率，2TFA)；LCMS[M+H]+：667；RT＝0.69min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.37-1.55(m,2H),1.57-1.59(m,2H),1.69-1.72(m,2H),1.73-1.85(m,2H),2.75-2.79(t,J＝8.0Hz,2H),4.26-4.27(d,J＝4.0Hz,1H),4.33-4.34(d,J＝3.6Hz,2H),4.34-4.35(m,1H),4.69-4.71(m,1H),4.81-4.82(m,1H),5.09-5.13(dd,J＝1.6Hz,2H),7.09-7.12(m,4H),7.39-7.48(m,4H),7.73(s,2H),8.77-8.78(d,J＝7.6Hz,2H)。
实施例24.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-6-氟吡啶甲酰胺(28)的制备
向化合物28.1(366.07mg,2.6mmol,1.1当量)于DMF(15mL)中的溶液添加HOBt(350.77mg,2.6mmol,1.1当量)及EDCI(497.65mg,2.60mmol,1.1当量)。将混合物在0℃下搅拌1小时。然后向该混合物添加化合物26.1(700mg,2.36mmol,1当量，HCl)及DIEA(1.22g,9.44mmol,1.65mL,4当量)；将混合物在25℃下搅拌14小时。通过添加H2O(30mL)使反应混合物淬灭并利用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和盐水(5mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2,DCM:MeOH＝10:1)进行纯化，以产生呈黄色油状物的化合物28.2(750mg,1.96mmol,83％产率)；LCMS[M+H-Boc]+：384；RT＝0.817min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.42(s,11H),1.53(br d,J＝6.17Hz,2H),1.65(s,1H),1.75-2.05(m,2H),3.12(br d,J＝6.17Hz,2H),3.78(d,J＝0.66Hz,3H),4.57(brs,1H),4.67-4.89(m,1H),6.97-7.18(m,1H),7.87-8.03(m,1H),8.05-8.22(m,2H)。
向DIPA(526.19mg,5.2mmol,730.82μL,5当量)于THF(5mL)中的溶液添加n-BuLi(2.5M,2.08mL,5当量)。将混合物在N2下在0℃下搅拌0.5小时；然后向该混合物添加化合物28.2(400mg,1.04mmol,1当量)及氯(碘)甲烷(917.18mg,5.2mmol,377.44μL,5当量)于THF(10mL)中的溶液。将其在-78℃下搅拌0.5小时。通过在25℃下添加饱和NH4Cl(20ml)使反应混合物淬灭，并利用乙酸乙酯(15mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和Na2SO3(10mL)、饱和NaHCO3(10mL)及盐水(10mL)洗涤；然后使其经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，以产生呈黄色油状物的28.3(500mg，粗制)。
向28.3(500mg,1.24mmol,1当量)于DMF(8mL)中的溶液添加DIEA(481mg,3.72mmol,649.69μL,3当量)及2,6-二氟苯酚(241.97mg,1.86mmol,1.5当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈黄色油状物的28.4(50mg,101μmol,8％产率)；LCMS[M+H]+：496；RT＝2.84min。
向28.4(50mg,101μmol,1当量)于DCM(5mL)中的溶液添加TFA(1mL)。将混合物在25℃下搅拌15小时；然后在减压下浓缩以产生化合物28(20mg,50.6μmol,50％产率)；LCMS[M+H]+：396；RT＝2.11min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.21-1.44(m,2H),1.45-1.65(m,2H),1.71-2.01(m,2H),2.69-2.85(m,2H),4.55-4.76(m,2H),4.97-5.34(m,2H),7.03-7.21(m,2H),7.48(dd,J＝8.27,1.65Hz,1H),7.68(br s,3H),7.99(dd,J＝7.28,1.76Hz,1H),8.22(q,J＝8.08Hz,1H),8.98(d,J＝8.38Hz,1H)。
实施例25.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-6-氟烟酰胺(29)的制备
向6-氟烟碱酸(366.3mg,2.6mmol,1.1当量)于DMF(15mL)中的溶液添加HOBt(351mg,2.6mmol,1.1当量)及EDCI(497.65mg,2.60mmol,1.1当量)。将混合物在0℃下搅拌1小时。然后向该混合物添加化合物26.1(700mg,2.36mmol,1当量，HCl盐)及DIEA(1.22g,9.44mmol,1.65mL,4当量)；将混合物在25℃下搅拌14小时。通过添加H2O(50mL)使反应混合物淬灭，并利用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和盐水(5mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝2/1)进行纯化以产生29.1(300mg,782.45μmol,33.15％产率)；LCMS[M+H-Boc]+：384；RT＝0.7min。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.40(s,11H),1.48-1.59(m,3H),1.63(s,1H),1.76-2.04(m,2H),3.13(br d,J＝6.15Hz,2H),4.47-4.86(m,2H),6.93(br s,1H),7.01(dd,J＝8.53,2.76Hz,1H),8.29(td,J＝7.97,2.38Hz,1H),8.72(s,1H)。
向DIPA(396mg,3.91mmol,549.82μL,5当量)于THF(5mL)中的溶液添加n-BuLi(2.5M,1.56mL,5当量)。将混合物在N2下在0℃下搅拌0.5小时。然后将混合物添加至29.1(300mg,782.43μmol,1当量)及氯碘甲烷(690mg,3.91mmol,284μL,5当量)于THF(5mL)中的溶液；将其在-78℃下搅拌0.5小时。通过添加饱和NH4Cl(20ml)使反应混合物淬灭，然后用乙酸乙酯(15mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和Na2SO3(10mL)、饱和NaHCO3(10mL)及盐水(10mL)洗涤。使其经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，以产生呈黄色油状物的29.2(500mg，粗制)。
向29.2(300.00mg,746.53μmol,1.00当量)及2,6-二氟苯酚(145.7mg,1.12mmol,1.5当量)于DMF(6mL)中的溶液添加DIEA(289mg,2.24mmol,391μL,3当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时，然后使其蒸发并通过半制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈黄色油状物的29.3(40mg,81μmol,11％产率)；LCMS[M+H]+：496；RT＝0.874min。
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向于DCM(5mL)中的29.3(40mg,81μmol,1当量)添加TFA(1mL)。将混合物在25℃下搅拌15小时，然后蒸发。残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化以产生化合物29(10mg,25μmol,31％产率)；LCMS[M+H]+：396；RT＝0.7min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.43-1.67(m,2H),1.67-1.89(m,3H),2.05-2.20(m,1H),2.86-3.01(m,2H),4.93-5.11(m,3H),6.92-7.16(m,2H),7.19(dd,J＝8.60,2.65Hz,1H),8.38(td,J＝8.05,2.65Hz,1H),8.71(d,J＝2.43Hz,1H)。
实施例26.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-(3-氟丙氧基)苯甲酰胺(30)的制备
向30.1(540.13mg,3.55mmol,1当量)及30.2(500mg,3.55mmol,1当量)于DMF(10mL)中的混合物添加K2CO3(981.29mg,7.1mmol,2当量)；将混合物在80℃下搅拌15小时。用水(20mL)稀释反应混合物并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1/1)进行纯化，以产生呈无色油状物的30.2(440mg,2.07mmol,58％产率)；LCMS[M+H]+：213；RT＝0.82min。
将于含有NaOH(1M,4.14mL,2当量)的MeOH(12mL)中的30.2(440mg,2.07mmol,1当量)在20℃下搅拌15小时。将反应用水(40mL)稀释，然后用EtOAc(40mL×2)萃取以去除中性杂质。利用HCl水溶液使水相酸化至pH 5，然后用乙酸乙酯(40mL)萃取。获得呈白色固体的30.3(160mg,807μmol,39％产率)；LCMS[M+H]+：199；RT＝1.01min。
在N2下在0℃下向于DMF(2mL)中的30.3(160mg,807.31μmol,1当量)及EDCI(170.24mg,888.04μmol,1.1当量)、HOBt(120mg,888μmol,1.1当量)一次性添加化合物26.1(210.17mg,807.31μmol,1当量)及DIEA(417.34mg,3.23mmol,563.97μL,4当量)。将混合物在20℃下搅拌15小时。用水(20mL)稀释反应混合物并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1/1)进行纯化，以产生呈白色固体的30.4(240mg,545μmol,67.5％产率)；LCMS[M+H]+：441；RT＝0.84min。
在N2下在0℃下向n-BuLi(209.41mg,3.27mmol,6当量)的混合物一次性添加于THF(6mL)中的DIPA(330.8mg,3.3mmol,460μL,6当量)。0.5h之后，在N2下在-78℃下向上述混合物添加30.4(240mg,545μmol,1当量)及氯(碘)甲烷(577mg,3.3mmol,237.3μL,6当量)。将所得混合物在-78℃下搅拌2小时。用水(20mL)稀释反应混合物，然后用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，且获得呈棕色油状物的30.5(200mg，粗制)。
向于DMF(4mL)中的30.5(200mg,436μmol,1当量)及2,5-二氟苯酚(57mg,436μmol,1当量)添加DIEA(168.96mg,1.31mmol,228.32μL,3当量)；将混合物在20℃下搅拌15小时。残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化以产生30.6(13mg,23.5μmol,5.4％产率)；LCMS[M+H]+：553；RT＝0.91min。
向于DCM(500μL)中的30.6(13mg,23.53μmol,1当量)添加TFA(160.97mg,1.41mmol,104.53μL,60当量)。将混合物在20℃下搅拌3小时。残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈无色油状物的化合物30(2mg,4.42μmol,19％产率)；LCMS[M+H]+：453；RT＝0.7min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.47-1.63(m,2H),1.67-1.86(m,2H),2.10-2.23(m,2H),2.85-3.01(m,2H),4.10-4.20(m,1H),4.11-4.20(m,1H),4.57(t,J＝5.84Hz,1H),4.69(t,J＝5.84Hz,1H),4.90-5.07(m,4H),6.95-7.03(m,2H),7.03-7.11(m,1H),7.14(ddd,J＝7.94,2.54,1.21Hz,1H),7.35-7.46(m,3H)。
实施例27.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-2-氟异烟酰胺(31)的制备
向2-氟-4-羧基吡啶(523mg,3.71mmol,1.1当量)于DMF(15mL)中的溶液添加HOBt(501mg,3.71mmol,1.1当量)及EDCI(710.5mg,3.71mmol,1.1当量)。将混合物在0℃下搅拌1小时。然后向该混合物添加26.1(1g,3.37mmol,1当量，HCl盐)及DIEA(1.74g,13.48mmol,2.35mL,4当量)；将混合物在25℃下搅拌14小时。通过添加H2O(50mL)使反应混合物淬灭，并利用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和盐水(5mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝2:1)进行纯化，以产生呈黄色油状物的化合物31.1(800mg,2.1mmol,62％产率)；LCMS[M+H-Boc]：384；RT＝0.8min。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.27-1.62(m,14H),1.69-2.08(m,2H),3.05(t,J＝6.50Hz,2H),3.75(s,3H),4.59(dd,J＝9.37,4.96Hz,1H),7.46(s,1H),7.69(dt,J＝5.29,1.54Hz,1H),8.35(d,J＝5.29Hz,1H)
向于THF(5mL)中的DIPA(659.8mg,6.52mmol,916.4μL,5当量)添加n-BuLi(2.5M,2.61mL,5当量)。将混合物在N2下在0℃下搅拌0.5小时；然后将混合物添加至31.1(500mg,1.3mmol,1当量)及氯(碘)甲烷(1.15g,6.52mmol,473.3μL,5当量)于THF(10mL)中的溶液；将其在-78℃下搅拌0.5小时。通过添加饱和NH4Cl(20ml)使反应混合物淬灭，并利用乙酸乙酯(15mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和Na2SO3(10mL)、饱和NaHCO3(10mL)及盐水(10mL)洗涤。使其经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩以产生31.2(620mg)。
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向于DMF(5mL)中的31.2(620mg,1.54mmol,1当量)添加DIEA(598.2mg,4.63mmol,808.36μL,3当量)及2,6-二氟苯酚(301.1mg,2.31mmol,1.5当量)；将其在25℃下搅拌15小时。水处理(work up)之后，残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化以产生31.3(20mg,40.36μmol,3％产率)。
将于DCM(5mL)及TFA(1mL)中的31.3(50mg,101μmol,1当量)在25℃下搅拌15小时。残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化以产生化合物31(10mg,25.3μmol,25％产率)；LCMS[M+H]：396；RT＝1.3min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.40-1.91(m,5H),2.03-2.22(m,1H),2.83-3.03(m,2H),4.87-5.15(m,3H),6.90-7.17(m,2H),7.38-7.53(m,1H),7.60-7.74(m,1H),8.24-8.39(m,1H)。
实施例28.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-2-氟烟酰胺(32)的制备
向于DMF(15mL)中的2-(氟)烟碱酸(366.3mg,2.6mmol,1.1当量)添加HOBt(350.8mg,2.6mmol,1.1当量)及EDCI(497.65mg,2.6mmol,1.1当量)。将混合物在0℃下搅拌1小时；然后向该混合物添加26.1(700mg,2.36mmol,1当量，HCl盐)及DIEA(1.22g,9.44mmol,1.65mL,4当量)。将混合物在25℃下搅拌14小时。用H2O(50mL)使反应混合物淬灭，然后用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(5mL)洗涤，然后经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝2/1)进行纯化，以产生呈棕色油状物的32.1(600mg,1.56mmol,66％产率)；LCMS[M+H]：284；RT＝0.7min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.42(s,11H),1.54(dt,J＝13.68,6.84Hz,3H),1.63(s,1H),1.76-2.10(m,2H),3.12(br d,J＝6.15Hz,2H),3.80(s,3H),4.57(br s,1H),4.76-4.90(m,1H),7.30-7.48(m,2H),8.36(br d,J＝4.52Hz,1H),8.55(ddd,J＝9.66,7.72,1.95Hz,1H)。
向于THF(5mL)中的DIPA(527.8mg,5.2mmol,733μL,5当量)添加n-BuLi(2.5M,2.1mL,5当量)；将混合物在N2下在0℃下搅拌0.5小时。然后将该混合物添加至于THF(5mL)中的32.2(400mg,1.04mmol,1当量)及氯(碘)甲烷(920mg,5.22mmol,378.6μL,5当量)；将其在-78℃下搅拌0.5小时。利用饱和NH4Cl(20ml)使反应混合物淬灭，并利用乙酸乙酯(15mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和Na2SO3(10mL)、饱和NaHCO3(10mL)及盐水(10mL)洗涤；使其经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩以产生32.2(620mg)。
向于DMF(6mL)中的32.2(500mg,1.24mmol,1当量)及2,6-二氟苯酚(242.8mg,1.87mmol,1.5当量)添加DIEA(482.41mg,3.73mmol,652μL,3当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化以产生32.2(20mg,40.4μmol,3％产率)；LCMS[M+H]：496；RT＝0.86min。
将于DCM(5mL)及TFA(1mL)中的32.2(20mg,40.4μmol,1当量)在25℃下搅拌15小时。残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生化合物32(5mg,12.65μmol,31％产率)；LCMS[M+H]：396；RT＝1.25min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.44-1.87(m,5H),2.06-2.22(m,1H),2.85-3.03(m,2H),4.89-5.12(m,3H),6.93-7.05(m,2H),7.06-7.15(m,1H),7.45(ddd,J＝7.22,5.02,1.87Hz,1H),8.26(ddd,J＝9.48,7.50,1.98Hz,1H),8.30-8.40(m,1H)。
实施例29.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-叠氮基苯甲酰胺(33)的制备
在N2下在18℃下向于AcN(70mL)中的33.1(5g,36.5mmol,1当量)及t-BuONO(5.64g,54.7mmol,6.5mL,1.5当量)一次性添加TMSN3(5.04g,43.75mmol,5.73mL,1.2当量)。将混合物在18℃下搅拌10小时。用H2O(100mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(50mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。此材料通过管柱层析(SiO2,DCM:MeOH＝10:1)进行纯化，以产生33.2(3g,18.4mmol,50％产率)。
向于DMF(20mL)中的33.2(1.25g,7.68mmol,1当量)及EDCI(1.62g,8.45mmol,1.1当量)添加HOBt(1.14g,8.45mmol,1.1当量)。将混合物在0℃下搅拌1小时；然后逐滴添加26.1(2g,7.68mmol,1当量)于DMF(5mL)中的溶液，之后添加DIPEA(2.98g,23.04mmol,4.03mL,3当量)。将此混合物在0℃下搅拌1小时。用H2O(20mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(15mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(40mL×1)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/1)进行纯化，以产生33.3(2.8g,6.91mmol,90％产率)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.40(s,8H),1.44-1.58(m,4H),1.80-2.00(m,2H),3.00-3.10(m,2H),3.74(s,3H),4.58(dd,J＝9.26,5.07Hz,1H),7.25(ddd,J＝8.05,2.32,1.10Hz,1H),7.49(t,J＝7.83Hz,1H),7.56(t,J＝1.76Hz,1H),7.63-7.69(m,1H)。
在0℃下向DIPA(1.5g,14.8mmol,2.08mL,6当量)于THF(15mL)中的溶液添加n-BuLi(2.5M,5.92mL,6当量)；将混合物搅拌30min。在-78℃下将其添加至于THF(15mL)中的33.3(1g,2.47mmol,1当量)及氯(碘)甲烷(2.18g,12.35mmol,895.11μL,5当量)。将混合物在-78℃下搅拌30min。通过添加NH4Cl(10mL)使反应混合物淬灭，且然后用EtOAc(15mL×3)萃取。将合并的有机层用Na2SO3(20mL)及盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥；然后过滤并浓缩以产生33.4(2g)，其用于下一步骤。
向于DMF(5mL)中的33.4(2g)及2,6-二氟苯酚(614mg,4.72mmol,1当量)添加DIPEA(2.44g,18.87mmol,3.3mL,4当量)；将此混合物在20℃下搅拌10小时。水处理之后，残余物通过半制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生33.5(200mg,386.46μmol,8％产率)。
将于DCM(5mL)及TFA(1mL)中的33.5 5(100mg,193.23μmol,1当量)在18℃下搅拌10小时。将反应混合物在减压下浓缩，然后通过半制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈黄色油状物的化合物33(80mg,192μmol,产率99％)；LCMS[M+H]：418；RT＝3.1min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.49-1.67(m,2H)1.67-1.88(m,3H)2.11(dddd,J＝13.84,9.48,6.78,4.30Hz,1H)2.89-2.99(m,2H)4.91-5.08(m,3H)6.95-7.05(m,2H)7.05-7.12(m,1H)7.26-7.31(m,1H)7.48-7.54(m,1H)7.56(t,J＝1.87Hz,1H)7.64-7.70(m,1H)。
实施例30.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-2-溴烟酰胺(34)的制备
/>
向于DMF(30mL)中的2-(溴)烟碱酸(748.71mg,3.71mmol,1.1当量)添加HOBt(501mg,3.71mmol,1.1当量)及EDCI(710.5mg,3.71mmol,1.1当量)；将其在0℃下搅拌1小时。向此混合物添加化合物26.1(1g,3.37mmol,1当量，HCl盐)及DIEA(1.74g,13.48mmol,2.35mL,4当量)；将其在25℃下搅拌14小时。通过添加H2O(50mL)使反应混合物淬灭，并利用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(5mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝2/1)进行纯化，以产生呈黄色油状物的34.1(950mg,2.14mmol,63.5％产率)；LCMS[M+H]：345；RT＝0.73min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.29-1.60(m,16H),1.76-2.04(m,2H),2.98-3.27(m,2H),3.80(s,3H),4.59(br s,1H),4.71-4.86(m,1H),6.95(br d,J＝6.61Hz,1H),7.36(dd,J＝7.61,4.74Hz,1H),7.92(dd,J＝7.61,1.87Hz,1H),8.45(dd,J＝4.85,1.98Hz,1H)
向于THF(5mL)中的DIPA(1.08g,10.69mmol,1.50mL,5当量)添加n-BuLi(2.5M,4.28mL,5当量)；将此混合物在N2下在0℃下搅拌0.5小时。将此混合物添加至于THF(10mL)中的34.1(950mg,2.14mmol,1当量)及氯(碘)甲烷(1.89g,10.7mmol,776.65μL,5当量)，并在-78℃下搅拌0.5小时。在25℃下利用NH4Cl(20ml)使反应混合物淬灭，并利用乙酸乙酯(15mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和Na2SO3(10mL)、NaHCO3(10mL)及盐水(10mL)洗涤。使其经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩以产生34.2(1.1g)。
向于DMF(10mL)中的34.2(1.1g,2.38mmol,1当量)添加DIEA(921.63mg,7.13mmol,1.25mL,3当量)及2,6-二氟苯酚(463.84mg,3.57mmol,1.5当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时；水处理之后，产物通过半制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生34.3(150mg,269.6μmol,11％产率)。
将于DCM(10mL)及TFA(2mL)中的34.3(150mg,270μmol,1当量)在25℃下搅拌14小时。将混合物在减压下浓缩以产生化合物34(100mg,219.16μmol,81.3％产率)；LCMS[M+H]：456；RT＝2.28min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.51-1.88(m,6H),1.97-2.21(m,1H),2.95(br t,J＝7.50Hz,2H),4.96(dd,J＝9.70,4.19Hz,1H),5.00-5.14(m,1H),6.93-7.15(m,2H),7.41-7.56(m,1H),7.73-7.89(m,1H),8.35-8.48(m,1H)。
实施例31.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-4-氟苯甲酰胺(35)的制备
向于DMF(15mL)中的4-(氟)苯甲酸(538.2mg,3.84mmol,1当量)添加HOBt(570.75mg,4.22mmol,1.1当量)及EDCI(809.74mg,4.22mmol,1.1当量)；将混合物在25℃下搅拌0.5h。向该混合物添加26.1(1g,3.84mmol,1当量)及DIEA(1.99g,15.36mmol,2.68mL,4当量)；将反应搅拌14h。通过添加H2O(50mL)使反应混合物淬灭，并用EtOAc(50mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和NaHCO3(25mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩以产生35.1(1.10g)；LCMS[M+H]：369；RT＝0.8min。
向于THF(10mL)中的DIPA(1.32g,13.05mmol,1.83mL,5当量)添加n-BuLi(835.98mg,13.05mmol,5当量)；将其在N2下在25℃下搅拌0.5h。将混合物添加至于THF(10mL)中的35.1(1g,2.61mmol,1当量)及氯(碘)甲烷(5当量)，然后在-78℃下搅拌2h。通过添加饱和氯化铵(30mL)使反应混合物淬灭，并用EtOAc(50mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和亚硫酸氢钠(25mL)及盐水洗涤。使其经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩以产生35.2(800mg,2mmol,77％产率)。产物不经进一步纯化即用于下一步骤中；LCMS[M+H]：402；RT＝0.8min。
向于DMF(10mL)中的35.2(800mg,2mmol,1当量)添加DIEA(773.76mg,5.99mmol,1.05mL,3当量)及2,6-二氟苯酚(389.42mg,2.99mmol,1.5当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。水处理之后，通过半制备型HPLC(TFA条件)对其进行纯化，以产生35.3(80mg,161.78μmol,8％产率)；LCMS[M+H]：495；RT＝0.94min。
将于HCl/EtOAc(15mL)中的35.3(80mg,232.95μmol)在25℃下搅拌14小时。过滤反应混合物并在减压下浓缩以产生化合物35(50mg,205.51μmol,88％产率)；LCMS[M+H]：244；RT＝0.104min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.51-1.65(m,2H),1.67-1.87(m,3H),2.05-2.18(m,1H),2.95(br d,J＝5.29Hz,2H),4.90-4.95(m,1H),4.95-5.07(m,2H),6.96-7.02(m,2H),7.03-7.12(m,1H),7.22(t,J＝8.82Hz,2H),7.92(dd,J＝8.82,5.29Hz,2H)。
实施例32.N-(7-氨基-1,1,1-三氟-2-氧代庚-3-基)苯甲酰胺(36)的制备
在N2下在0℃下向于H2O(6mL)中的ε-Cbz赖氨酸(2.4g,8.56mmol,1当量)一次性添加NaOH(684.93mg,17.12mmol,2当量)。将混合物在0℃下搅拌1小时。然后向混合物逐滴添加化合物苯甲酰氯(1.20g,8.56mmol,994.64μL,1当量)，并将混合物搅拌9小时。过滤反应混合物并将固体用EtOAc(10ml)洗涤，以产生呈白色固体的36.1(4g)；LCMS[M+H]：385；RT＝0.77min。
在N2下在18℃下向于DCM(40mL)中的36.1(4g,10.41mmol,1当量)一次性添加EDCI(2g,10.41mmol,1当量)。将混合物在18℃下搅拌0.5小时。通过添加H2O(40mL)使反应混合物淬灭，然后用DCM(20mL×3)萃取。将合并的有机层用NaHCO3(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生36.2(5g)；LCMS[M+H]：367；RT＝0.87min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.33-2.02(m,7H),3.10-3.17(m,2H),4.35-4.54(m,1H),4.98-5.06(m,2H),7.28-7.38(m,5H),7.42-7.50(m,2H),7.52-7.58(m,1H),7.76-7.86(m,2H)。
向36.2(3g,8.19mmol,1当量)添加TFAA(2.06g,9.83mmol,1.37mL,1.2当量)；将其在40℃下搅拌10小时。将反应混合物在减压下浓缩以产生36.3(3.5g,7.57mmol,92％产率)；LCMS[M+H]：463；RT＝0.96min。
向36.3(3g,6.49mmol,1当量)添加草酸(934.53mg,10.38mmol,916μL,1当量)。将混合物在120℃下搅拌5min。然后通过添加H2O(20mL)使其淬灭，并用EtOAc(20mL×2)萃取。将合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。残余物通过半制备型HPLC(TFA条件)进行纯化以产生36.4(200mg,458.27μmol,7％产率)；LCMS[M+H]：437；RT＝0.9min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.21-1.96(m,7H),3.04-3.16(m,2H),4.30-4.51(m,1H),4.99(s,1H),7.27-7.34(m,3H),7.40-7.47(m,1H),7.48-7.56(m,1H),7.74-7.83(m,1H)。
在N2下向于i-PrOH(10mL)及HCl(1M,2mL,8.73当量)中的36.4(100mg,229.14μmol,1.00当量)添加Pd-C(10％,0.02g)。将悬浮液在真空下脱气并用H2吹扫若干次。将混合物在H2(50psi)下在18℃下搅拌10小时。过滤反应混合物并在减压下浓缩。残余物通过半制备型HPLC(中性条件)进行纯化，以产生化合物36(20mg,66.16μmol,29％产率)；LCMS[M+H]：303；RT＝1.73min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.27-2.04(m,6H),2.88(br s,1H),4.50(br t,J＝12.04Hz,1H),7.44-7.52(m,2H),7.53-7.61(m,1H),7.73-7.90(m,2H)。
实施例33.N-(7-氨基-1,1-二氟-2-氧代庚-3-基)苯甲酰胺(37)的制备
将于二氟乙酸酐(1.71g,9.83mmol,3当量)中的36.2(1.2g,3.28mmol,1当量)在40℃下搅拌2小时。将反应混合物在减压下浓缩以产生37.1(1.2g，粗制)；LCMS[M+H]：445；RT＝0.91min。
/>
将37.1(1.2g,2.70mmol,1当量)及草酸(486.18mg,5.40mmol,476.64μL,2当量)在N2下在120℃下搅拌10min。将混合物在减压下浓缩并通过管柱层析(SiO2,乙酸乙酯)进行纯化以产生粗制品37.2，然后通过半制备级HPLC(中性条件)进行进一步纯化以产生纯37.2(120mg,286.79μmol,80％产率)；LCMS[M+H]：419；RT＝0.79min。
将于HCl(1mL)及二噁烷(1mL)中的37.2(10mg,23.9μmol,1当量)在50℃下搅拌2小时。将混合物在减压下浓缩，并通过半制备级HPLC(中性条件)进行纯化以产生化合物37(120mg,287μmol,80％产率)；LCMS[M+H]：285；RT＝2.0min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.38-1.57(m,1H),1.72-1.97(m,5H),2.01-2.14(m,1H),3.70-3.85(m,1H),4.05(br dd,J＝12.35,6.84Hz,1H),5.95-6.29(m,1H),7.44-7.60(m,4H),7.81-7.90(m,2H)。
实施例34.具有可裂解的淬灭剂(S,E)-N-(7-氨基-1-(4-((4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰氨基)甲基)-2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-(4-((3-(5,5-二氟-7,9-二甲基-5H-5l4,6l4-二吡咯并[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]二氮杂硼环三烯-3-基)丙酰氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酰胺(38)的荧光牙龈蛋白酶活性探针的制备
向2,6-二氟-4-氰基苯酚(2.5g,16.12mmol,1当量)添加BH3-THF(1M,64.48mL,4当量)。将混合物在70℃下搅拌10小时。通过在25℃下添加HCl(6M,5mL)使反应淬灭，然后将其在减压下浓缩，以产生呈白色固体的38.1(7.1g，粗制)。
向于DMF(15mL)中的38.2(6.09g,22.62mmol,1当量)添加HOBt(3.36g,24.88mmol,1.1当量)及EDCI(4.77g,24.88mmol,1.1当量)。将混合物在0℃下搅拌1小时，然后添加38.1(3.60g,22.62mmol,1当量)及DIEA(11.70g,90.48mmol,15.81mL,4.00当量)；将此混合物在25℃下搅拌11小时。用H2O(20mL)稀释反应，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/1)对其进行纯化，以产生呈红色固体的38.3(400mg,974.6μmol)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 3.11(s,6H),4.48(s,2H),6.84(d,J＝9.29Hz,2H),6.90-6.98(m,2H),7.78-7.90(m,4H),7.94-8.01(m,2H)。
在N2下在20℃下向于DMF(10mL)中的33.4(1g,2.36mmol,1当量)及38.3(100mg,243.65μmol,0.1当量)一次性添加DIPEA(1.22g,9.44mmol,1.65mL,4当量)。将混合物在20℃下搅拌10小时。用H2O(10mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/1)对其进行纯化，以产生呈红色固体的38.4(250mg,313.34μmol)。
在N2下在18℃下向38.4(220mg,275.74μmol,1当量)及丙-2-炔-1-胺(15.19mg,275.74μmol,17.66μL,1当量)于DMSO(2mL)中的混合物一次性添加CuSO4(8.8mg,55.15μmol,8.46μL,0.2当量)于H2O(100μL)中的溶液及抗坏血酸钠(109.25mg,551.48μmol,2当量)。将此混合物在18℃下搅拌5min。用H2O(5mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(5mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以产生呈棕色固体的38.5(250mg)；LCMS[M+H]：853；RT＝1.14min。
在N2下在50℃下向于THF(60mL)中的2-甲酰基吡咯(5g,52.58mmol,1当量)及2-二乙氧基磷酰基乙酸甲酯(11.05g,52.58mmol,1当量)添加K2CO3(14.53g,105.16mmol,2当量)。将混合物在50℃下搅拌10小时。用H2O(50mL)稀释反应，并用EtOAc(50mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。此材料通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝5/1)进行纯化，以产生呈白色固体的38.6(8.6g,57mmol)；LCMS[M+H]：152；RT＝0.68min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 3.69-3.76(m,3H),6.04-6.13(m,1H),6.15-6.21(m,1H),6.31(dt,J＝3.91,2.12Hz,1H,)6.45-6.57(m,1H),6.92(br d,J＝1.32Hz,1H),6.98-7.21(m,1H),7.44-7.59(m,1H)。
在N2下向于MeOH(100mL)中的38.6(8.6g,56.89mmol)添加Pd-C(10％,0.9g)。将悬浮液在真空下脱气并用H2吹扫若干次。将混合物在H2(50psi)下在18℃下搅拌10小时。将反应混合物过滤并浓缩。此材料通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝5/1)进行纯化，以产生38.6(5g,32.64mmol)；LCMS[M+H]：154；RT＝0.55min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 2.66(t,J＝6.78Hz,2H),2.93(t,J＝6.71Hz,2H),3.62-3.78(m,3H),5.80-5.99(m,1H),6.12(q,J＝2.76Hz,1H)6.60-6.76(m,1H),8.54(br s,1H)。
在N2下在18℃下向于DCM(60mL)中的38.6(3g,19.58mmol,1当量)及化合物2-甲酰基-3,5-二甲基吡咯(2.65g,21.54mmol,1.1当量)一次性添加POCl3(3.3g,21.54mmol,2mL,1.1当量)。将混合物在18℃下搅拌10小时，然后在18℃下逐滴添加BF3.Et2O(11.12g,78.32mmol,9.67mL,4当量)及DIEA(10.63g,82.24mmol,14.36mL,4.2当量)。将此混合物在18℃下搅拌10小时。将反应混合物过滤，然后用H2O(50mL)稀释，并用DCM(50mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1/4)对其进行纯化，以产生38.7(3g,9.80mmol)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 2.25(s,3H),2.57(s,3H),2.78(t,J＝7.59Hz,2H),3.30(t,J＝7.65Hz,2H),3.67-3.78(m,3H),6.11(s,1H),6.27(d,J＝3.89Hz,1H),6.88(d,J＝3.89Hz,1H),7.08(s,1H)。
将于THF(120mL)及H2O(80mL)中的38.7(1.2g,3.92mmol,1当量)及HCl(50mL,37％)在18℃下搅拌24小时。利用DCM(80mL)分配反应混合物并用DCM(100mL×2)萃取水层。将合并的有机层用盐水(300mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。此材料通过制备级TLC(SiO2,DCM:MeOH＝10:1)进行纯化，以产生呈红色固体的38.8(700mg,2.4mmol)。
在N2下在0℃下向38.8(109.59mg,375.18μmol,2当量)及HOBt(152.08mg,1.13mmol,6当量)于DMF(2mL)中的混合物添加EDCI(215.76mg,1.13mmol,6当量)。将混合物在0℃下搅拌10min。向此混合物添加38.5(160mg,187.59μmol,1当量)及DIPEA(145.46mg,1.13mmol,196.57μL,6当量)，将此混合物在0℃下搅拌20min。用H2O(5mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(5mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。残余物通过制备级TLC(SiO2,EtOAc)进行纯化，以产生38.9(60mg,53.24μmol)；LCMS[M+H]：1128；RT＝1.45min。
将38.9(50mg,44.37μmol,1当量)添加至HCl/EtOAc(5mL)，并将混合物在18℃下搅拌10min。将反应在减压下浓缩，然后通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生化合物38(10mg,9.74μmol)；LCMS[M+H]：1027；RT＝2.82min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.23-1.59(m,4H),1.67(br d,J＝9.48Hz,1H),1.85(br d,J＝6.62Hz,1H),2.21(s,2H),2.42(s,3H),2.53(br d,J＝7.94Hz,2H),2.74(br d,J＝6.39Hz,2H),3.04(s,5H),3.06-3.11(m,1H),4.39(br d,J＝5.51Hz,5H),4.64(br s,1H),4.99-5.20(m,2H),6.25(s,1H),6.32(brd,J＝3.97Hz,1H),6.81(br d,J＝9.04Hz,2H),6.96-7.10(m,2H),7.52-7.62(m,3H),7.68(br t,J＝8.05Hz,1H),7.79(br dd,J＝8.60,4.41Hz,3H),7.90-8.01(m,2H),8.04(d,J＝7.72Hz,1H),8.36(s,1H),8.47-8.58(m,1H),8.64(s,1H),8.96(br d,J＝7.50Hz,1H),9.07-9.20(m,1H)。
实施例35.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(6-氧代嘧啶-1(6H)-基)庚-3-基)环戊烷甲酰胺(39)的制备
向于DMF(2mL)中的1.2(150mg,357.7μmol,1当量)添加K2CO3(148.31mg,1.07mmol,3当量)及4-羟基嘧啶(34.37mg,357.7μmol,1当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生39.1(40mg,92.05μmol)；LCMS[M+H]：435；RT＝0.76min。
将于DCM(5mL)及TFA(1mL)中的39.1(40mg,92.05μmol,1当量)在25℃下搅拌15小时。将混合物在减压下浓缩以产生化合物39(20mg,59.8μmol,65％产率)；LCMS[M+H]：335；RT＝0.25min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.37-1.57(m,2H),1.57-1.81(m,10H),1.83-2.06(m,3H),2.63-2.83(m,1H),2.94(br t,J＝7.50Hz,2H),4.52(dd,J＝8.49,5.40Hz,1H),4.95-4.99(m,1H),4.97(s,1H),6.51(d,J＝6.61Hz,1H),8.00(d,J＝6.61Hz,1H),8.32(s,1H)。
实施例36.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(4-氧代嘧啶-1(4H)-基)庚-3-基)环戊烷甲酰胺(40)的制备
向于DMF(3mL)中的1.2(100mg,238.46μmol,1当量)添加Ag2CO3(197.27mg,715.38μmol,32.45μL,3.00当量)及4-羟基嘧啶(22.91mg,238.46μmol,1当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈白色固体的40.1(30mg,69.04μmol,29％产率)；LCMS[M+H]：435；RT＝0.74min。
将于TFA(1mL)及DCM(5mL)中的40.1(30mg,69μmol,1当量)在25℃下搅拌15小时。将混合物在减压下浓缩以产生化合物40(2mg,6μmol)；LCMS[M+H]：335；RT＝0.43min。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.24-1.57(m,4H),1.58-1.81(m,10H),1.82-2.03(m,4H),2.66-2.84(m,1H),2.86-3.03(m,2H),4.31-4.48(m,1H),4.95-5.19(m,2H),6.30(d,J＝7.58Hz,1H),7.62(br d,J＝7.34Hz,1H),8.23(br s,1H)。
实施例37.(S)-N-(7-氨基-1-(5-氟-6-氧代嘧啶-1(6H)-基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(41)的制备
向于DMF(2mL)中的1.2(150mg,357.7μmol,1当量)添加K2CO3(148.31mg,1.07mmol,3当量)及5-氟嘧啶-4-醇(40.81mg,357.7μmol,1当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。残余物通过半制备级HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈白色固体的41.1(50.00mg,110.49μmol,30.89％产率)；LCMS[M+H]：453；RT＝0.8min。
将于DCM(5mL)及TFA(1mL)中的41.1(50mg,110.49μmol,1当量)在25℃下搅拌15小时。将混合物在减压下浓缩，以产生呈白色固体的化合物41(30mg,85.13μmol,77％产率)；LCMS[M+H]：353；RT＝0.16min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.28-1.47(m,2H),1.48-1.73(m,9H),1.75-1.98(m,3H),2.56-2.73(m,1H),2.86(br t,J＝7.52Hz,2H),4.44(dd,J＝8.56,5.50Hz,1H),4.90-5.04(m,2H),7.95(d,J＝2.45Hz,1H),8.05(s,1H)。
实施例38.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(2,3,6-三氟苯氧基)庚-3-基)烟酰胺(42)的制备
向于DMF(10mL)中的烟碱酸(497.86mg,4.04mmol,339μL,1.2当量)添加HOBt(501mg,3.71mmol,1.1当量)及EDCI(710.5mg,3.71mmol,1.1当量)。将混合物在0℃下搅拌1小时。然后将混合物添加至DIPEA(1.74g,13.48mmol,2.35mL,4当量)及26.1(1g,3.37mmol,1.00当量，HCl盐)，并在25℃下搅拌11小时。用H2O(20mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝20/1至0/1)进行纯化，以产生呈无色油状物的42.1(800mg,2.19mmol,65％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.41(br s,10H),1.54(br d,J＝6.11Hz,3H),1.81-2.06(m,3H),3.14(br s,2H),3.80(br d,J＝2.69Hz,3H),4.06-4.20(m,1H),7.04(br s,1H),7.40(br d,J＝5.14Hz,1H),8.16(br s,1H),8.76(br s,1H),9.07(brs,1H)。
向DIPA(648mg,6.4mmol,9μL,6当量)于THF(5mL)中的溶液添加n-BuLi(2.5M,2.56mL,6当量)；将其在0℃下搅拌1小时。向于THF(5mL)中的42.1(390mg,1.07mmol,1当量)添加氯(碘)甲烷(1.13g,6.4mmol,464.8μL,6当量)；将其在-78℃下搅拌30min。然后将两种混合物合并并在-78℃下搅拌2小时。通过添加NH4Cl溶液(15mL)使反应淬灭，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用Na2SO3溶液(15mL)、NaHCO3溶液(15mL)及盐水(15mL)洗涤；使其经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生42.2(410mg)；LCMS[M+H]：384；RT＝0.79min。
向于DMF(5mL)中的42.2(410mg,1.07mmol,1当量)添加DIPEA(553.15mg,4.28mmol,747.5μL,4当量)及2,3,6-三氟苯酚(158.45mg,1.07mmol,1当量)。将混合物在25℃下搅拌12小时。残余物通过半制备级HPLC(管柱：Waters Xbridge 150×25×5μ；移动相：[A：水(0.1％TFA)；B：AcN]；B的梯度：24％-65％经12min)进行纯化，以产生42.3(40mg,90μmol)；LCMS[M+H]：496；RT＝0.80min。
向于CH2Cl2(5mL)中的42.3(40.00mg,80.73μmol)添加TFA(1mL)，并在25℃下搅拌12小时。将反应混合物在减压下浓缩以去除溶剂，产生化合物42(20mg,50.59μmol,63％产率)；LCMS[M+H]：396；RT＝0.76min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.48-1.67(m,2H),1.70-1.91(m,3H),2.08-2.19(m,1H),2.91-3.03(m,1H),2.97(br t,J＝7.03Hz,1H),4.95-5.01(m,1H),5.05-5.25(m,2H),6.94-7.09(m,2H),7.68-7.81(m,1H),8.39-8.51(m,1H),8.75-8.85(m,1H),9.01-9.14(m,1H)。
实施例39.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)烟酰胺(43)的制备
向于DMF(10mL)中的烟碱酸(497.86mg,4.04mmol,338.68μL,1.2当量)添加HOBt(500.8mg,3.71mmol,1.1当量)及EDCI(710.5mg,3.71mmol,1.1当量)。将混合物在0℃下搅拌1小时。向该混合物添加DIPEA(1.74g,13.48mmol,2.35mL,4当量)及26.1(1g,3.37mmol,1当量,HCl)；将其在25℃下搅拌11小时。用H2O(20mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝20:1至0:1)进行纯化，以产生43.1(800mg,2.19mmol)；LCMS[M+H]：366；RT＝0.69min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm1.39(s,9H),1.49-1.59(m,2H),1.78-2.05(m,5H),3.12(br d,J＝5.70Hz,2H),3.79(s,2H),3.78-3.81(m,1H),4.65(br s,1H),4.79(br d,J＝5.26Hz,1H),7.02(br d,J＝5.70Hz,1H),7.39(dd,J＝7.67,5.04Hz,1H),8.15(br d,J＝7.89Hz,1H),8.74(br d,J＝4.38Hz,1H),9.06(br s,1H)。
向DIPA(662mg,6.54mmol,919μL,6当量)于THF(5mL)中的溶液添加n-BuLi(2.5M,2.62mL,6当量)；将其在0℃下搅拌1小时。向于THF(5mL)中的43.1(400mg,1.09mmol,1当量)添加氯(碘)甲烷(1.15g,6.54mmol,474.7μL,6当量)，并在-78℃下搅拌30min。然后向该混合物添加前述混合物，并在-78℃下搅拌2小时。通过在25℃下添加15mL NH4Cl溶液使反应混合物淬灭，并用EtOAc(15mL×3)萃取。将合并的有机层用Na2SO3溶液(15mL)、NaHCO3溶液(15mL)及盐水(15mL)洗涤；然后经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以产生43.2(500mg)。
向于DMF(5mL)中的43.3(500mg,1.30mmol,1当量)添加DIPEA(672.05mg,5.2mmol,908.18μL,4当量)及2,6-二氟苯酚(186.03mg,1.43mmol,1.1当量)。将混合物在25℃下搅拌12小时。残余物通过制备型HPLC(管柱：Waters Xbridge 150×25×5μ；移动相：[A：水(0.1％TFA)，B：AcN]；B的梯度：23％至63％，经12min)进行纯化，以产生43.4(40mg,86.30μmol)。
将于CH2Cl2(5mL)及TFA(1mL)中的43.4(40mg,83.77μmol)在25℃下搅拌7小时。将反应混合物在减压下浓缩以产生化合物43(15mg)；LCMS[M+H]：378；RT＝0.61min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.51-1.68(m,2H),1.72-1.90(m,3H),2.08-2.24(m,1H),2.97(brt,J＝6.60Hz,2H),4.97-5.12(m,3H),6.95-7.06(m,2H),7.06-7.15(m,1H),7.71-7.83(m,1H),8.50(br d,J＝7.95Hz,1H),8.82(br d,J＝3.67Hz,1H),9.03-9.17(m,1H)。
实施例40.(S,E)-N-(7-氨基-1-(4-((4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰氨基)甲基)-2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-叠氮基苯甲酰胺(44)的制备
向38.4(100mg,125.34umol,1当量)于CH2Cl2(5mL)中的溶液添加TFA(1.54g,13.51mmol,1mL,107.76当量)，并在25℃下搅拌12小时。残余物通过制备型HPLC(WatersXbridge 150×25×5μ；移动相：[A：水(0.1％TFA)及B：ACN]；B％：31％-61％,12min)进行纯化，以产生呈红色固体的化合物44(40mg,57.33umol,46％产率)；LCMS[M+H]：698；RT＝2.764min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.29-1.46(m,2H),1.52(dt,J＝14.28,7.30Hz,2H),1.63-1.74(m,1H),1.79-1.91(m,1H),2.71-2.81(m,2H),3.07(s,5H),4.42(br d,J＝5.73Hz,2H),4.54-4.67(m,1H),4.95-5.19(m,2H),6.84(br d,J＝9.04Hz,2H),7.01-7.11(m,2H),7.30(br d,J＝7.94Hz,1H),7.52(br t,J＝7.83Hz,1H),7.57(s,1H),7.63(br s,2H),7.68(br d,J＝7.72Hz,1H),7.82(dd,J＝8.71,4.74Hz,3H),7.94-8.10(m,1H),8.85(br d,J＝7.50Hz,1H),9.11-9.24(m,1H)。
实施例41.(S,E)-N-(7-氨基-1-(4-(2-(4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰氨基)乙基)-2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-(4-((3-(5,5-二氟-7,9-二甲基-5H-5l4,6l4-二吡咯并[1,2-c:2’,1’-f][1,3,2]二氮杂硼环三烯-3-基)丙酰氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酰胺(45)的制备
向3,5-二氟-4-羟基苯甲醛(5g,31.63mmol,1当量)于乙酸(50.00mL)中的溶液添加硝基甲烷(11.58g,189.78mmol,10.25mL,6.00当量)及CH3COONH4(9.75g,126.52mmol,4.00当量)。将混合物在110℃下搅拌1.5小时。用H2O(20mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝20/1至1:1)进行纯化，以产生呈黄色固体的45.1(4.60g,22.87mmol,72％产率)。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 7.33-7.40(m,2H)，7.77-7.89(m,1H),7.90-8.01(m,1H)。
在Ar气氛下在0℃下向45.1(2.10g,10.44mmol,1.00当量)于EtOH(200.00mL)中的溶液添加HCl(6M,12.60mL,7.24当量)及Pd/C(10％,1.5g)。使悬浮液脱气，并用H2吹扫3次。将混合物在H2(15Psi)下在0℃下搅拌3小时。将反应混合物在减压下浓缩以去除EtOH，产生呈棕色固体的45.2(2.00g，粗制)；LCMS[M+H]：174；RT＝0.102min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 2.88(t,J＝7.52Hz,2H)3.08-3.20(m,2H)，6.85-6.93(m,2H)。
向重氮化合物(3.11g,11.55mmol,1.00当量)于DMF(20.00mL)中的溶液添加EDCI(2.44g,12.71mmol,1.10当量)及HOBt(1.72g,12.71mmol,1.10当量)，并在0℃下搅拌1小时。然后向混合物添加45.2(2.00g,11.55mmol,1.00当量)及DIPEA(5.97g,46.20mmol,8.07mL,4.00当量)，并在25℃下搅拌11小时。用H2O(20mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝20/1至1:1)进行纯化，以产生45.3(600mg,1.41mmol)。LCMS[M+H]：425；RT＝0.848min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm3.04-3.09(m,6H),3.43-3.51(m,1H)，4.37(br d,J＝5.99Hz,1H)，4.54(br d,J＝5.75Hz,1H)，6.76-7.02(m,3H)，6.79(br s,1H)，7.71-7.85(m,4H)7.88-8.01(m,2H)。
向45.3(310.00mg,730.37μmol,0.18当量)于DMF(10.00mL)中的溶液添加33.4(1.70g,4.01mmol,1.00当量)及DIPEA(2.07g,16.04mmol,2.80mL,4.00当量)。将混合物在25℃下搅拌12小时。用H2O(20mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝20/1至1:1)进行纯化，以产生45.4(350mg)LCMS[M+H]：813；RT＝1.393min。
向45.4(200.00mg,246.34μmol,1.00当量)于DMSO(2.00mL)中的溶液添加于H2O(200.00μL)中的化合物14A(13.57mg,246.34μmol,15.78μL,1.00当量)及CuSO4(1.97mg,12.32μmol,1.89μL,0.05当量)以及抗坏血酸钠(97.61mg,492.68μmol,2.00当量)。将混合物在25℃下搅拌1小时。用H2O(20mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝20/1至1:1)进行纯化，以产生45.5(130mg)。
在0℃下向二氟硼酸盐染料(48.18mg,164.95μmol,1.10当量)于DMF(2.00mL)中的混合物添加EDCI(31.62mg,164.95μmol,1.10当量)及HOBt(22.29mg,164.95μmol,1.10当量)，并搅拌1小时。然后向混合物添加45.5(130.00mg,149.95μmol,1.00当量)及DIPEA(77.52mg,599.80μmol,104.76μL,4.00当量)，并在25℃下搅拌11小时。用H2O(20mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，乙酸乙酯)进行纯化，以产生45.6(120.00mg)；LCMS[M+H]：1142；RT＝1.461min。
将化合物15(120.00mg,105.17μmol,1.00当量)于HCl/EtOAc(5.00mL)中的溶液在25℃下搅拌0.1小时。残余物通过制备型HPLC(管柱：Luna C18 100×30×5u；移动相：A：水(0.1％TFA)，B：ACN；B％：30％-60％,10min)进行纯化，以产生呈红色固体的化合物45(20.00mg,19.21μmol,18.27％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm1.33-1.51(m,2H)，1.56(dt,J＝14.00,7.06Hz,2H)，1.73(br dd,J＝9.29,4.40Hz,1H)，1.90(br d,J＝6.24Hz,1H)，2.25(s,3H)，2.46(s,3H)，2.74-2.87(m,5H)，3.08(s,6H)，3.46-3.55(m,2H)，4.44(brd,J＝5.01Hz,2H)，4.64-4.73(m,1H)，5.01-5.18(m,2H)，6.30(s,1H)，6.36(d,J＝4.03Hz,1H)，6.86(d,J＝9.17Hz,2H)，7.01-7.11(m,3H)，7.62-7.76(m,4H)，7.78-7.87(m,4H)，7.92-8.11(m,4H)，8.40(s,1H)，8.57(br t,J＝5.50Hz,1H)，8.61-8.70(m,2H)，8.99(br d,J＝7.34Hz,1H)。
实施例42.具有可裂解的淬灭剂(S,E)-N-(7-氨基-1-(4-(2-(4-((4-(二甲基氨基)苯基)二氮烯基)苯甲酰氨基)乙基)-2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-叠氮基苯甲酰胺(46)的荧光牙龈蛋白酶活性探针的制备
将45.5(150.00mg,188.01μmol,1.00当量)于HCl/EtOAc(5.00mL)中的溶液在25℃下搅拌0.2小时。残余物通过制备型HPLC(管柱：Waters Xbridge Prep OBD C18 150×30×5u；移动相：A：水(0.1％TFA)，B：ACN；B％：26％-66％,12min)进行纯化，以产生呈红色固体的化合物46(10.00mg,14.33μmol,7.62％产率)；LCMS[M+H]：712；RT＝2.76min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.52-1.60(m,2H)，1.67-1.85(m,4H)，2.09(br s,1H)，2.85-3.00(m,4H)，3.13(s,6H)，3.61(br t,J＝7.24Hz,2H)，4.52(s,1H)，4.92-5.04(m,2H)，6.87(d,J＝8.77Hz,2H)，6.95(br d,J＝9.21Hz,1H)，7.03(br d,J＝9.65Hz,1H)，7.27(br d,J＝7.89Hz,1H)，7.47-7.53(m,1H)，7.55(br s,1H)，7.65(br d,J＝7.02Hz,1H)，7.80-7.91(m,5H)，7.98(d,J＝8.77Hz,1H)。
实施例43.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(2,3,6-三氟苯氧基)庚-3-基)-2-甲氧基-2-甲基丙酰胺(47)的制备
向2-甲氧基-2-甲基-丙酸(398.03mg,3.37mmol,1.00当量)于DMF(15.00mL)中的溶液添加HOBt(500.89mg,3.71mmol,1.10当量)及EDCI(710.63mg,3.71mmol,1.10当量)，将混合物在25℃下搅拌1小时。然后向该混合物添加DIPEA(1.74g,13.48mmol,2.35mL,4.00当量)及26.4(1.00g,3.37mmol,1.00当量，HCl)。将混合物在25℃下搅拌14小时。用H2O(20mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝2:1)进行纯化，以产生呈黄色油状物的47.1(1.00g,2.77mmol,82.33％产率)；LCMS[M+H]：361；RT＝0.780min。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 1.20-1.58(m,17H),1.60-1.75(m,1H),1.81-1.94(m,1H),3.09(br d,J＝6.17Hz,2H),3.29(s,3H),3.74(s,3H),4.45-4.73(m,2H),7.09(br d,J＝8.38Hz,1H)。
向DIPA(1.54g,15.24mmol,2.14mL,5.50当量)于THF(10mL)中的溶液添加n-BuLi(2.5M,6.09mL,5.50当量)。将混合物在N2下在0℃下搅拌0.5小时。然后将混合物添加至化合物2(1.00g,2.77mmol,1.00当量)及氯(碘)甲烷(2.69g,15.24mmol,1.11mL,5.50当量)于THF(10mL)中的溶液，并在-78℃下搅拌0.5小时。用H2O(20mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物，产生呈棕色油状物的47.2(1.30g，粗制)。
向47.2(650.00mg,1.72mmol,1.00当量)于DMF(10.00mL)中的溶液添加DIPEA(666.88mg,5.16mmol,901.19μL,3.00当量)及2,3,6-三氟苯酚(280.17mg,1.89mmol,1.10当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈黄色油状物的47.3(50.00mg,128.07μmol,7.45％产率)；LCMS[M+H]：391；RT＝0.877min。
将47.3(50.00mg,101.93μmol,1.00当量)于DCM(5.00mL)及TFA(1.00mL)中的混合物在25℃下搅拌15小时。将混合物在减压下浓缩，以产生呈棕色油状物的化合物47(30.00mg,76.84μmol,75.39％产率)；LCMS[M+H]：391；RT＝0.681min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.26-1.39(m,6H),1.39-1.56(m,2H),1.57-1.84(m,3H),1.96-2.12(m,1H),2.82-3.01(m,2H),3.27-3.31(m,3H),4.68(dd,J＝9.60,4.34Hz,1H),4.95-5.15(m,1H),6.89-7.12(m,2H)。
实施例44.(S)-N-(7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-2-甲氧基-2-甲基丙酰胺(48)的制备
向47.2(650.00mg,1.72mmol,1.00当量)于DMF(10.00mL)中的溶液添加DIPEA(666.88mg,5.16mmol,901.19μL,3.00当量)及2,6-二氟苯酚(246.13mg,1.89mmol,1.10当量)。将混合物在25℃下搅拌14小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈黄色油状物的48.1(50.00mg,134.26μmol,7.81％产率)；LCMS[M+H]：473；RT＝0.864min。
将于DCM(5.00mL)及TFA(1.00mL)中的48.1(50.00mg,105.82μmol,1.00当量)在25℃下搅拌15小时。将混合物在减压下浓缩，以产生化合物48(30.00mg,80.56μmol,76.13％产率)；LCMS[M+H]：373；RT＝0.671min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.18-1.39(m,6H),1.41-1.56(m,2H),1.57-1.82(m,3H),1.88-2.15(m,1H),2.78-3.03(m,2H),3.25-3.31(m,3H),4.74(dd,J＝9.54,4.28Hz,1H),4.90-5.03(m,2H),6.89-7.20(m,3H)。
实施例45.(S)-N-(7-氨基-1-(异噁唑-3-基氧基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(49)的制备
向1.2(0.3g,715.39μmol,1当量)于DMF(5mL)中的溶液添加K2CO3(296.62mg,2.15mmol,3当量)及异噁唑(66.94mg,786.92μmol,1.1当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。通过在25℃下添加H2O(10mL)使反应混合物淬灭，并用乙酸乙酯(15mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(10mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩以产生粗产物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝2:1)进行纯化，以产生呈黄色固体的49.1(100mg,236.13μmol,33.01％产率)；LCMS[M+H+Na]:446；RT＝1.443min。
向49.1(0.1g)于DCM(5mL)中的溶液添加TFA(1mL)。将混合物在25℃下搅拌14小时。将混合物在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈黄色油状物的化合物49(20mg,61.85μmol,26.19％产率)；LCMS[M+H]：324；RT＝2.072min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.37-1.55(m,2H),1.57-1.80(m,10H)1.89,(brdd,J＝12.68,5.62Hz,3H),2.73(quin,J＝7.77Hz,1H),2.93(br t,J＝6.84Hz,2H),4.52(dd,J＝9.04,5.07Hz,1H),4.96-5.17(m,2H),6.17(d,J＝1.54Hz,1H),8.38(d,J＝1.54Hz,1H)。
实施例46.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(2,3,6-三氟苯氧基)庚-3-基)吡啶甲酰胺(50)的制备
50.1是以与34.2相同的方式来制备，但用吡啶-2-甲酸替代2-溴烟碱酸。
向于DMF(5.00mL)中的50.1(600.00mg,1.56mmol,1.00当量)添加DIPEA(606.02mg,4.69mmol,818.94μL,3.00当量)及2,3,6-三氟苯酚(231.45mg,1.56mmol,1.00当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈黄色油状物的化合物50.2(50.00mg,100.91μmol,6.47％产率)；LCMS[M+H]：496；RT＝1.302min。
此反应是以与化合物34相同的方式运行。所获得的产物是通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生化合物50(10mg)；LCMS[M+H]：396；RT＝2.187min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.43-1.62(m,2H),1.62-1.93(m,3H),2.06-2.24(m,1H),2.93(br t,J＝7.28Hz,2H),4.97(br dd,J＝9.48,4.19Hz,1H),5.03-5.21(m,2H),6.91-7.07(m,2H),7.60(dd,J＝6.95,5.40Hz,1H),8.00(td,J＝7.66,1.65Hz,1H),8.12(d,J＝7.72Hz,1H),8.60-8.74(m,1H)。
实施例47.生物素化牙龈蛋白酶活性探针N-((S)-7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-(4-((5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰氨基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酰胺(51)的制备
在N2下在20℃下向于DMF(10.00mL)中的51.1(2.00g,4.72mmol,1.00当量)及苯酚(613.79mg,4.72mmol,1.00当量)一次性添加DIPEA(2.44g,18.87mmol,3.30mL,4.00当量)。将混合物在20℃下搅拌10小时。用10mL H2O稀释反应混合物，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝1:1)进行纯化，以产生呈黄色油状物的51.2(160.00mg,309.17μmol,6.55％产率)；LCMS[M+H]：518；RT＝0.909min。
向于DMSO(3.00mL)中的51.2(140.00mg,270.52μmol,1.00当量)及氨基丙炔(14.90mg,270.52μmol,17.33μL,1.00当量)添加CuSO4(8.64mg,54.10μmol,8.31μL,0.20当量)于H2O(100.00μL)中的溶液。将混合物在18℃下搅拌5min。用10mL H2O稀释反应混合物，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以产生呈红色固体的51.3(150.00mg，粗制)。
在N2下在0℃下向51.4(64.00mg,261.96μmol,1.00当量)及HOBt(38.94mg,288.16μmol,1.10当量)于DMF(2.00mL)中的混合物一次性添加EDCI(55.24mg,288.16μmol,1.10当量)。将混合物在0℃下搅拌1小时，然后在0℃下向该混合物一次性添加51.3(150.00mg,261.96μmol,1.00当量)及DIPEA(101.57mg,785.88μmol,137.26μL,3.00当量)，并将混合物在0℃下搅拌1小时。用10mL H2O稀释反应混合物，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以产生呈黄色固体的51.5(200.00mg,250.34μmol,95.57％产率)；LCMS[M+H]：799；RT＝1.373min。
将51.5(200mg)溶解至HCl/EtOAc(5mL)中，并将混合物在18℃下搅拌1min。将反应混合物在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈白色固体的化合物51(40mg)；LCMS[M+H]：699；RT＝2.391min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.34-1.46(m,2H),1.48-1.63(m,3H),1.64-1.77(m,4H),1.77-1.91(m,2H),2.08-2.20(m,1H),2.27(t,J＝7.17Hz,2H),2.62(d,J＝12.79Hz,1H),2.80-2.89(m,1H),2.95(br t,J＝6.50Hz,2H),3.11-3.19(m,1H),4.24(dd,J＝7.94,4.41Hz,1H),4.43(dd,J＝7.50,4.63Hz,1H),4.53(s,2H),4.98(br d,J＝3.75Hz,1H),5.00-5.10(m,2H),6.96-7.05(m,2H),7.06-7.13(m,1H),7.68-7.74(m,1H),7.95-8.00(m,1H),8.02-8.08(m,1H),8.35(t,J＝1.76Hz,1H),8.46(s,1H)。
实施例48.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(2,3,6-三氟苯氧基)庚-3-基)异烟酰胺(52)的制备
52.1是以与34.2相同的方式来制备，但用吡啶-4-甲酸替代2-溴烟碱酸。
向于DMF(10.00mL)中的52.1(783.60mg,2.04mmol,1.00当量)添加DIPEA(791.46mg,6.12mmol,1.07mL,3.00当量)及三氟苯酚(302.28mg,2.04mmol,1.00当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。用H2O(10mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1/1)进行纯化，以产生52.2(50.00mg)；LCMS[M+H]：496；RT＝0.777min。
向于DCM(500.00μL)中的52.2(10.00mg,20.18μmol,1.00当量)添加TFA(154.00mg,1.35mmol,100.00μL,66.93当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。将反应混合物在减压下浓缩以产生化合物52(7.50mg,18.97μmol)；LCMS[M+H]：397；RT＝2.128min。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.49-1.66(m,2H),1.67-1.92(m,3H),2.04-2.21(m,1H),2.94(br t,J＝7.61Hz,2H),4.95(dd,J＝9.70,4.41Hz,1H),5.05-5.18(m,2H),6.88-7.13(m,2H),7.86-8.00(m,2H),8.79(br d,J＝4.19Hz,2H)。
实施例49.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(2H-四唑-2-基)庚-3-基)-6-氟烟酰胺(53)的制备
向于DMF(10.00mL)中的29.2(1.70g,4.23mmol,1.00当量)添加四唑(0.45M,10.34mL,1.10当量)及DIPEA(2.19g,16.92mmol,2.96mL,4.00当量)。将混合物在10℃下搅拌12小时。用H2O(10mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过制备型HPLC(管柱：LunaC18 100×30×5u；移动相：A：水(0.1％TFA)及B：ACN；B％：20％-60％,10min)进行纯化，以产生53.1(10.00mg)。
向于DCM(2.50mL)中的53.1(10.00mg)添加TFA(0.5mL)。将混合物在10℃下搅拌12小时。将反应混合物在减压下浓缩以产生化合物53(2.00mg,5.96μmol)；LCMS[M+H]：336；RT＝0.593min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.49-1.66(m,2H),1.67-1.80(m,2H),1.83-1.93(m,1H),2.06-2.16(m,1H),2.89-3.00(m,2H),4.79(br s,1H),5.87-6.01(m,2H),7.15-7.24(m,1H),8.35-8.46(m,1H),8.68-8.79(m,2H)。
实施例50.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(2H-四唑-2-基)庚-3-基)-2-氟烟酰胺(54)的制备
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向于DMF(10.00mL)中的32.2(1.70g,4.23mmol,1.00当量)添加四唑(0.45M,10.34mL,1.10当量)及DIPEA(2.19g,16.92mmol,2.96mL,4.00当量)。将混合物在10℃下搅拌12小时。用H2O(10mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过制备型HPLC(管柱：LunaC18 100×30×5u；移动相：A：水(0.1％TFA)，B：ACN；B％：20％-60％,10min)进行纯化，以产生54.1(5.00mg)。
向于DCM(2.50mL)中的54.1(5.00mg)添加TFA(0.5mL)。将混合物在10℃下搅拌12小时。将反应混合物在减压下浓缩，以产生化合物54(2.00mg)；LCMS[M+H]：336；RT＝3.720min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.51-1.66(m,2H),1.70-1.79(m,2H),1.81-1.91(m,1H),2.03-2.19(m,1H),2.96(br t,J＝7.61Hz,2H),3.77(s,1H),4.84(br d,J＝4.85Hz,1H),5.96(d,J＝2.65Hz,2H),7.46(ddd,J＝7.22,5.13,1.76Hz,1H),8.25-8.41(m,2H),8.68-8.80(m,1H)。
实施例51.(S)-N-(7-氨基-1-(异噁唑-3-基氧基)-2-氧代庚-3-基)-6-氟烟酰胺(55)的制备
将55.1(10.00g,101.94mmol,10.00mL,1.00当量)、盐酸羟胺(9.21g,132.52mmol,1.30当量)、NaOH(15.25g,381.26mmol,3.74当量)于H2O(150.00mL)及MeOH(170.00mL)中的混合物在25℃下搅拌100小时。利用浓盐酸将混合物酸化至pH 2，且然后利用氯化钠饱和。用DCM(8×150ml)萃取溶液，合并萃取物，干燥并将溶剂蒸发。将固体残余物用热异己烷(3×100ml)洗涤，并使最终悬浮液冷却且通过过滤收集所得固体，在真空下干燥以产生呈黄色固体的55.2(4.00g,47.03mmol,46.13％产率)。1H NMR(400MHz，氯仿-d)δppm 6.04(d,J＝1.76Hz,1H),8.10(d,J＝1.76Hz,1H),11.11(br s,1H)。
向于DMF(3.00mL)中的29.2(200.00mg,497.69μmol,1.00当量)添加K2CO3(206.36mg,1.49mmol,3.00当量)及55.2(55.03mg,647.00μmol,1.30当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。用H2O(10mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝2:1)进行纯化，以产生呈黄色油状物的55.3(0.1g,222.00μmol,44.61％产率)；LCMS[M+H]：451；RT＝1.145min。
向55.3(0.1g)于DCM(5mL)中的溶液添加TFA(1mL)。将混合物在25℃下搅拌15小时。将混合物在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生化合物55(20mg)；LCMS[M+H]：351；RT＝0.850min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.44-1.66(m,2H),1.67-1.90(m,3H),2.00-2.18(m,1H),2.82-3.09(m,2H),4.79(dd,J＝9.26,4.85Hz,1H),5.06-5.22(m,2H),6.18(d,J＝1.10Hz,1H),7.07-7.27(m,1H),8.30-8.47(m,2H),8.72(d,J＝1.98Hz,1H)。
实施例52.(S)-N-(7-氨基-1-(异噁唑-3-基氧基)-2-氧代庚-3-基)-2-氟烟酰胺(56)的制备
向于DMF(15.00mL)中的32.2(1.40g,3.48mmol,1.00当量)添加K2CO3(1.44g,10.44mmol,3.00当量)及异噁唑-3-醇(55.2,296.01mg,3.48mmol,1.00当量)。将混合物在25℃下搅拌15小时。用H2O(10mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝2:1)进行纯化，以产生56.1(300mg)；LCMS[M+H]：453；RT＝1.379min。
向于DCM(5mL)中的56.1(0.3g)添加TFA(1mL)。将混合物在25℃下搅拌15小时。将混合物在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生化合物56(20mg)；LCMS[M+H]：351；RT＝0.730min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.45-1.64(m,2H),1.65-1.89(m,3H),1.96-2.18(m,1H),2.95(br t,J＝7.50Hz,2H),4.81(br dd,J＝9.15,4.74Hz,1H),5.16(s,2H),6.19(s,1H),7.46(br t,J＝6.06Hz,1H),8.14-8.50(m,3H)。
实施例53.(S)-N-(7-氨基-1-(异噁唑-3-基氧基)-2-氧代庚-3-基)-2-甲氧基-2-甲基丙酰胺(57)的制备
向47.2(893mg,2.36mmol,1当量)及异噁唑-3-醇(200.48mg,2.36mmol,1当量)于DMF(8mL)中的溶液添加DIPEA(913.83mg,7.07mmol,1.23mL,3当量)。将混合物在25℃下搅拌10小时。用H2O(10mL)稀释反应混合物，并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(30mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1/1)进行纯化，以产生57.1(130mg)；LCMS[M+H]：428；RT＝0.649min。
向于DCM(5mL)中的57.1(50mg)添加TFA(1mL)。将混合物在25℃下搅拌10小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生化合物57(10mg)；LCMS[M+H]：328；RT＝2.430min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.38(s,7H),1.45(br d,J＝6.84Hz,2H),1.58-1.80(m,4H),2.01(br s,1H),2.92(br d,J＝7.28Hz,2H),3.31-3.33(m,3H),4.53-4.62(m,1H),4.99-5.14(m,2H),6.17(s,1H),8.38(s,1H)。
实施例54.(S)-N-(7-氨基-1-(二甲基(氧代)-λ6-亚硫基)-2-氧代庚-3-基)环戊烷甲酰胺(58)的制备
在25℃下将2-甲基丙-2-醇钾(1M,5.87mL,2.99当量)逐滴添加至BLAH氯甲烷(896.67mg,6.97mmol,3.55当量)的甲苯(17mL)悬浮液中。将混合物加热至70℃持续4小时，且然后冷却至0℃。在0℃下逐滴添加58.1(0.7g,1.96mmol,1当量)的THF(15mL)悬浮液，并将所得溶液在0℃下搅拌16小时。通过MTBE将溶液洗涤三次。将滤饼在减压下浓缩，以产生呈白色固体的58.2(630mg,1.51mmol,38.51％产率)；LCMS[M+H]：417；RT＝0.910min。
在N2下在18℃下向58.2(50mg)于DCM(2mL)中的溶液一次性添加TFA(0.4mL)。将混合物在18℃下搅拌30min。将反应混合物在减压下浓缩，以产生呈黄色油状物的化合物58(50mg)；LCMS[M+H]：317；RT＝1.782min。1H NMR(400MHz，乙腈-d3)δppm 1.39-1.51(m,2H),1.56(br d,J＝6.60Hz,2H),1.67(br d,J＝4.77Hz,6H),1.75-1.89(m,4H),2.70(dt,J＝15.68,7.75Hz,1H),2.94(br s,2H),3.63(s,8H),4.17-4.26(m,1H)。
实施例55.N-((S)-7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-(4-(15-氧代-19-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-2,5,8,11-四氧杂-14-氮杂十九烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酰胺(59)的制备
将生物素(159.29mg,982.36μmol,1.2当量)于DMF(2mL)中的混合物在25℃下搅拌12小时。将混合物过滤并在减压下浓缩，以产生呈白色固体的59.1(200mg，粗制)；LCMS[M+H]：295；RT＝0.298min。
将59.1(127.28mg,432.36μmol,1当量)、59.2(100mg,432.36μmol,1当量)、DIPEA(167.64mg,1.30mmol,225.93μL,3当量)于DMF(3mL)中的混合物在25℃下搅拌12小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈白色固体的59.3(100mg,218.54μmol,50.55％产率)；LCMS[M+H]：458；RT＝1.052min。
向59.3(80mg,174.83μmol,1当量)于DMSO(2mL)及H2O(0.2mL)中的溶液添加33.5(90.48mg,174.83μmol,1当量)及CuSO4(5.58mg,34.97μmol,5.37μL,0.2当量)及抗坏血酸钠(69.27mg,349.66μmol,2当量)。将混合物在25℃下搅拌10min。通过在25℃下添加10mLH2O使反应混合物淬灭，并用乙酸乙酯(10mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和盐水(5mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，以产生粗产物。残余物通过制备型TLC(SiO2,DCM:MeOH＝10:1)进行纯化，以产生呈黄色油状物的59.4(90mg,92.30μmol,52.79％产率)；LCMS[M+H]：951；RT＝1.160min。
将于DCM(5mL)及TFA(1mL)中的59.4(90mg,92.30μmol)在N2气氛下在25℃下搅拌12小时。将反应混合物在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈白色固体的化合物59(20mg,22.86μmol)；LCMS[M+H]：875；RT＝0.870min。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.25-1.46(m,2H),1.47-1.95(m,9H),2.02-2.29(m,3H),2.68(d,J＝12.57Hz,1H),2.82-3.04(m,3H),3.07-3.22(m,1H),3.31-3.35(m,2H),3.43-3.54(m,2H),3.54-3.66(m,8H),3.67-3.78(m,4H),4.18-4.35(m,1H),4.47(dd,J＝7.72,4.85Hz,1H),4.75(s,2H),4.92-5.17(m,3H),6.88-7.18(m,2H),7.72(t,J＝7.94Hz,1H),7.89-8.13(m,2H),8.30-8.43(m,1H),8.62(s,1H)。
实施例56.N-((S)-7-氨基-1-(2,6-二氟苯氧基)-2-氧代庚-3-基)-3-(4-(3,43-二氧代-47-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39-十二氧杂-2,42-二氮杂四十七烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯甲酰胺(60)的制备
向丙-2-炔-1-胺(21.29mg,386.46μmol,24.75μL,1当量)及33.5(200mg,386.46μmol,1当量)于DMSO(2mL)中的溶液添加于H2O(0.1mL)中的CuSO4(362.30ug,2.27μmol,3.48μL,0.2当量)及抗坏血酸钠(153.12mg,772.91μmol,2当量)。将混合物在25℃下搅拌15min。通过在25℃下添加10mL H2O使反应混合物淬灭，并用乙酸乙酯(10mL×3)萃取。将合并的有机层用饱和盐水(5mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩，以产生粗产物。残余物通过管柱层析(SiO2,DCM:MeOH＝0:1)进行纯化，以产生呈黄色固体的60.1(140mg,244.50μmol,63.27％产率)；LCMS[M+H]：573；RT＝0.991min。
向60.2(200mg,236.96μmol,1当量)于DMF(5mL)中的溶液添加HOBt(35.22mg,260.66μmol,1.1当量)及EDCI(49.97mg,260.66μmol,1.1当量)。将混合物在25℃下搅拌1小时。然后向该混合物添加60.1(135.69mg,236.96μmol,1当量)及DIPEA(122.50mg,947.85μmol,165.10μL,4当量)。将混合物在25℃下搅拌11小时。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈黄色固体的60.3(55mg,39.32μmol,16.60％产率)；LCMS[M+H]：700；RT＝1.225min。
60.3(50mg,35.75μmol)于DCM(5mL)及TFA(1mL)中的混合物，将该混合物在25℃下搅拌12小时。将混合物在真空中浓缩以产生粗产物。残余物通过制备型HPLC(TFA条件)进行纯化，以产生呈黄色油状物的化合物60(15mg,11.55μmol)；LCMS[M+H]：1299；RT＝1.06min。1HNMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.32-1.93(m,12H),2.06-2.27(m,3H),2.52(t,J＝5.95Hz,2H),2.70(d,J＝12.79Hz,1H),2.86-3.05(m,3H),3.14-3.24(m,1H),3.32-3.38(m,2H),3.45-3.68(m,49H),3.77(t,J＝5.84Hz,2H),4.30(dd,J＝7.83,4.52Hz,1H),4.49(dd,J＝7.72,4.63Hz,1H),4.56(s,2H),4.96-5.13(m,2H),6.94-7.14(m,3H),7.64-7.77(m,1H),7.91-8.10(m,2H),8.28-8.39(m,1H),8.44-8.52(m,1H)。
实施例57.(S)-5-((7-氨基-1-(异噁唑-3-基氧基)-2-氧代庚-3-基)胺甲酰基)-N,N,N-三甲基吡啶-2-氯化铵(61)的制备
在18℃下向N,N-二甲基甲胺(2M,4.44mL,20当量)于THF(0.5mL)中的溶液一次性添加55.3(0.2g,443.99μmol,1当量)。将混合物在18℃下搅拌10小时。将反应混合物在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过制备型HPLC(HCl条件)进行纯化，以产生呈白色固体的61.1(20mg,40.77μmol,9.18％产率)及62.1(20mg,42.06μmol,9.47％产率)；C24H37N5O6+的LCMS[M+H]；RT＝1.136min。
将61.1(20mg)溶解于HCl/MeOH(2mL)中，并将混合物在25℃下搅拌10min。将反应混合物在减压下浓缩，以产生呈黄色油状物的化合物61(15mg)；C19H29N5O4+的LCMS[M+H]：391；RT＝0.149min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.47-1.66(m,2H),1.68-1.82(m,2H),1.84-1.97(m,1H),2.01-2.16(m,1H),2.97(br t,J＝7.45Hz,2H),3.67-3.74(m,9H),4.81(dd,J＝9.43,4.60Hz,1H),5.15-5.21(m,2H),6.17-6.23(m,1H),8.10-8.19(m,1H),8.39(d,J＝1.75Hz,1H),8.64(dd,J＝8.77,2.19Hz,1H),9.11(d,J＝1.75Hz,1H)。
实施例58.(S)-N-(7-氨基-1-(异噁唑-3-基氧基)-2-氧代庚-3-基)-6-(二甲基氨基)烟酰胺(62)的制备
将62.1(20mg)溶解于HCl/MeOH(2mL)中，并将混合物在25℃下搅拌10min。将反应混合物在减压下浓缩，以产生呈黄色油状物的化合物62(15mg)；C18H26N5O4的LCMS[M+H]：376；RT＝2.077min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.46-1.67(m,2H),1.75(br d,J＝7.02Hz,2H),1.87(dtd,J＝14.25,9.65,9.65,4.60Hz,1H),2.00-2.11(m,1H),2.97(br t,J＝7.45Hz,2H),3.34-3.41(m,6H),4.74(dd,J＝9.21,4.82Hz,1H),5.16(d,J＝1.75Hz,2H),6.19(d,J＝1.75Hz,1H),7.33(d,J＝9.65Hz,1H),8.39(d,J＝1.75Hz,1H),8.43(dd,J＝9.65,1.75Hz,1H),8.52(d,J＝1.75Hz,1H)。
实施例59.(S)-N-(7-氨基-1-((2,6-二甲基吡啶-4-基)氧基)-2-氧代庚-3-基)-2-甲氧基-2-甲基丙酰胺(63)的制备
在N2下在25℃下向于DMF(9mL)中的47.2(423mg,1.12mmol,1当量)及2,6-二甲基-4-羟基吡啶(137.49mg,1.12mmol,1当量)一次性添加K2CO3(462.89mg,3.35mmol,3当量)及KI(185.33mg,1.12mmol,1当量)。然后将混合物搅拌2小时。通过添加H2O(20mL)使反应混合物淬灭，且然后用EtOAc(20mL)稀释并用EtOAc(10mL×3)萃取。将合并的有机层用H2O(10mL×3)洗涤，经干燥，过滤并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝3:1)进行纯化，以产生呈白色固体的63.1(85mg,182.57μmol)；LCMS[M+H]：466；RT＝1.155min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.38(d,J＝5.51Hz,8H),1.43(s,11H),1.50(dt,J＝13.67,6.84Hz,3H),1.64-1.77(m,2H),1.88-1.99(m,2H),2.41-2.46(m,6H),2.99-3.09(m,3H),3.31-3.32(m,3H),4.55-4.62(m,2H),4.92-5.04(m,3H),6.66(s,2H)。
将于DCM(5mL)及TFA(1mL)中的63.1(85mg)搅拌0.5小时。将反应混合物在减压下浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝2:1)进行纯化，以产生化合物63(50mg)；LCMS[M+H]：366；RT＝1.517min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.25-1.40(m,6H),1.46-1.59(m,2H),1.67-1.80(m,3H),1.94-2.05(m,1H),2.61-2.66(m,6H),2.93(br t,J＝7.58Hz,2H),3.30-3.32(m,3H),4.47(dd,J＝9.66,4.40Hz,1H),5.22-5.40(m,2H),7.13-7.22(m,2H)。
实施例60.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(吡啶-3-基氧基)庚-3-基)-2-甲氧基-2-甲基丙酰胺(64)的制备
化合物64是通过与用于化合物63相同的方法来制备，其中使用3-羟基吡啶代替2,6-二甲基-4-羟基吡啶；LCMS[M+H]：338；RT＝4.585min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm1.21-1.40(m,6H),1.42-1.58(m,2H),1.64-1.80(m,3H),1.95-2.05(m,1H),2.93(br t,J＝7.64Hz,2H),3.30-3.32(m,3H),4.51(dd,J＝9.66,4.40Hz,1H),5.14-5.29(m,2H),7.86(dd,J＝8.80,5.38Hz,1H),7.98-8.03(m,1H),8.41(br d,J＝5.14Hz,1H),8.51(br d,J＝2.08Hz,1H)。
实施例61.(S)-N-(7-氨基-1-((2-甲基嘧啶-5-基)氧基)-2-氧代庚-3-基)-2-甲氧基-2-甲基丙酰胺(65)的制备
化合物65是通过与用于化合物63相同的方法来制备，其中使用5-羟基嘧啶代替2,6-二甲基-4-羟基吡啶；LCMS[M+H]：353；RT＝1.98min。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 1.24(br s,1H),1.31(s,7H),1.34(br s,1H),1.45-1.58(m,2H),1.65(dtd,J＝14.00,9.48,9.48,4.71Hz,1H),1.78-1.89(m,1H),2.55(s,3H),2.72-2.85(m,2H),3.20(s,3H),4.19-4.61(m,1H),5.18(br s,2H),7.68(br s,2H),8.21(d,J＝7.70Hz,1H),8.36(s,2H)。
实施例62.(S)-N-(7-氨基-2-氧代-1-(吡啶-3-基硫基)庚-3-基)-2-甲氧基-2-甲基丙酰胺(66)的制备
向于二噁烷(20mL)中的66.1(2g,12.66mmol,1.22mL,1当量)添加66.2(2.90g,13.29mmol,1.05当量)、DIPEA(3.27g,25.32mmol,4.41mL,2当量)及Xantphos(732.45mg,1.27mmol,0.1当量)、Pd2(dba)3(579.58mg,632.93μmol,0.05当量)。将混合物在100℃下搅拌2小时。通过添加H2O(20mL)使反应混合物淬灭，并用EtOAc(20mL×3)萃取。将合并的有机层用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过MPLC(SiO2，石油醚/乙酸乙酯＝10/1至1:1)进行纯化，以产生呈黄色油状物的66.3(3.6g,12.19mmol,96.26％产率)。
向于THF(10mL)中的66.3(800mg,2.71mmol,1当量)添加t-BuOK/THF(1M,4.06mL,1.5当量)。将混合物在-78℃下搅拌1h。将反应混合物在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过管柱层析(SiO2,EtOAc/MEOH＝10/1至1:1)进行纯化，以产生呈黄色油状物的66.4(80mg)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 8.53(d,J＝1.75Hz,1H),8.31(dd,J＝4.82,1.32Hz,1H),7.83-7.91(m,1H),7.30(dd,J＝7.45,4.82Hz,1H),3.58(br s,8H)3.38-3.73(m,1H)。
向于DMF(5mL)中的47.2(500mg,1.32mmol,1当量)添加66.4(80mg,719.65μmol,5.45当量)、K2CO3(547.15mg,3.96mmol,3当量)及KI(219.06mg,1.32mmol,1当量)。将混合物在25℃下搅拌5h。过滤反应混合物，且所期望的化合物是在滤液中。通过制备型HPLC(管柱：Phenomenex Luna C18 200×40mm×10um；移动相：A：水(0.1％TFA)-B：ACN；B％：15％-35％,8min)纯化滤液，以产生66.5(40mg,88.18μmol)。
向于DCM(5mL)中的66.5添加TFA(1mL)。将混合物在25℃下搅拌1h。将反应混合物在减压下浓缩以产生残余物，产生化合物66(12mg)；LCMS[M+H]：354；RT＝1.83min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 8.62(br s,1H),8.49(br s,1H),8.14(d,J＝8.33Hz,1H),7.62(dd,J＝8.33,4.82Hz,1H),4.60(dd,J＝9.43,4.17Hz,1H),4.10-4.21(m,1H),3.29(br s,3H),2.90(br t,J＝7.45Hz,2H),1.97(br d,J＝10.09Hz,1H),1.62-1.74(m,3H),1.42(brd,J＝4.39Hz,1H),1.36(d,J＝4.38Hz,8H),1.27-1.33(m,1H)。
实施例63.(S)-N-(7-氨基-1-((2,6-二甲基吡啶-4-基)硫基)-2-氧代庚-3-基)-2-甲氧基-2-甲基丙酰胺(67)的制备
向于DMF(20mL)中的2,6-二甲基-4-氯吡啶(2g,14.12mmol,1当量)添加NaSH(1.98g,35.31mmol,2.5当量)。将混合物在140℃下搅拌2h。将反应混合物在减压下浓缩以产生残余物。残余物通过MPLC(二氯甲烷:甲醇SiO2,＝10/1至1:1)进行纯化，以产生呈黄色固体的67.1(2.7g)。
向于DMF(7mL)中的67.1(367.44mg,2.64mmol,1当量)添加47.2(1g,2.64mmol,1当量)、K2CO3(1.09g,7.92mmol,3当量)及KI(438.12mg,2.64mmol,1当量)。将混合物在25℃下搅拌2h。过滤反应混合物，且所期望的化合物是在滤液中。通过制备型HPLC(管柱：Phenomenex Luna(2)C18,250×50×10u；移动相A：水(0.1％TFA)及B：ACN；梯度B％：10％-40％经20min)纯化滤液，以产生67.2(353mg)。
向于DCM(5mL)中的67.2(353mg)添加TFA(1mL)。将混合物在25℃下搅拌1h。将反应混合物在减压下浓缩以产生化合物67(350mg)；LCMS[M+H]：382；RT＝1.799min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 7.40-7.52(m,2H),4.32-4.57(m,3H),3.32(br s,3H),2.94(br t,J＝7.64Hz,2H),2.63(s,6H),1.95-2.08(m,1H),1.65-1.83(m,3H),1.43-1.57(m,2H),1.39(d,J＝5.62Hz,6H)。
实施例64.(S)-N-(7-氨基-1-((2-甲基嘧啶-5-基)硫基)-2-氧代庚-3-基)-2-甲氧基-2-甲基丙酰胺(68)的制备
化合物68是通过与用于化合物66相同的方法来制备，其中使用2-甲基-5-溴嘧啶代替3-溴吡啶；LCMS[M+H]：369；RT＝2.0min。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 1.36(s,8H),1.38-1.48(m,2H),1.60-1.74(m,3H),1.90-2.01(m,1H),2.65(s,3H),2.90(br t,J＝6.80Hz,2H),3.29(s,3H),3.91-4.10(m,2H),4.62(dd,J＝9.43,4.60Hz,1H),8.68(s,2H)。
实施例65.(S)-N-(7-氨基-1-((1,1,1,3,3,3-六氟丙-2-基)氧基)-2-氧代庚-3-基)-2-甲氧基-2-甲基丙酰胺(69)的制备
将化合物1.2(1.0g,2.36mmol,1.0当量)、1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇(595mg,3.54mmol,1.5当量)、KF(411mg,7.09mmol,3.0当量)于DMF(7mL)中的悬浮液脱气并用N2吹扫3次，且然后将该悬浮液在N2气氛下在25℃下搅拌2小时。LCMS指示化合物1.2完全消耗。用水(21mL)使反应缓慢淬灭，且然后用EtOAc(20mL×2)萃取。将合并的有机相用盐水(10mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。残余物通过管柱层析(SiO2，石油醚:乙酸乙酯＝15:1至3:1)进行纯化，以产生呈无色胶状物的69.1(0.90g,1.67mmol,70％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)(d,J＝8.4Hz,1H),6.73(broad s,1H),5.42-5.50(m,1H),4.65(dd,J＝1.2Hz,J＝1.2Hz,2H),4.26-4.32(m,1H),3.15(s,3H),2.80-2.91(m,2H),1.67-1.75(m,1H),1.52-1.58(m,1H),1.33(s,11H),1.25(s,6H)ppm。
在0℃下向化合物3(0.90g,1.76mmol,1.0当量)于EtOAc(10mL)中的溶液添加HCl/EtOAc(4M,10mL,22当量)。将溶液在0℃下搅拌1小时。LCMS指示化合物69.1完全消耗。将反应混合物在减压下浓缩以产生残余物。通过冷冻干燥器使其干燥以产生呈黄色胶状物的化合物化合物69(0.78g，总产率：63.7％，HCl盐)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.09(d,J＝8.4Hz,1H),7.91(br。s,3H),5.47-5.54(m,1H),4.61-4.79(m,2H),3.15(s,3H),2.64-2.72(m,2H),1.58-1.74(m,1H),1.52-1.58(m,3H),1.33-1.34(m,2H),1.33(s,6H)ppm。
实施例66.青色素牙龈蛋白酶活性探针70、71及72的制备
探针化合物70是根据以下方案来制备。
探针化合物71是根据以下方案来制备。
探针化合物72是根据以下方案来制备。
实施例67.赖氨酸牙龈蛋白酶的抑制
本发明的化合物抑制赖氨酸牙龈蛋白酶的活性的能力是在与Barret(Biochemical Journal.1980,187(3),909)中所述的那些类似的荧光分析中测量。具体分析条件是如下。缓冲液：在所有添加后，pH＝7.5，100mM Tris-HCl、75mM NaCl、2.5mMCaCl2、10mM半胱氨酸、1％DMSO。蛋白质：0.1nM Kgp，自牙龈卟啉单胞菌的培养物分离，如Pike等人(J.Biol.Chem.1994,269(1),406)以及Potempa及Nguyen(Current Protocols inProtein Science.2007,21.20.1-21.20.27)所阐述。荧光底物：10μM Z-His-Glu-Lys-MCA。时间＝90分钟。温度＝37℃。每一化合物：10个浓度，以100μM或100nM开始，较低浓度由连续3倍稀释产生。通过测试每一化合物的浓度范围，确定将赖氨酸牙龈蛋白酶的活性抑制50％所需的浓度(“IC50”)。在所述的分析条件下，信号噪声比是优异的，且Z因子大于0.6。测试表1中的化合物以及下表2中所示的化合物。
在类似分析中测量本发明的化合物抑制组织蛋白酶B、H、K、L及S的活性的能力。使用于含有DTT(1mM)及EDTA(2mM)的乙酸钠缓冲液(50mM,pH 5.5)中的Boc-Leu-Arg-Arg-AMC(20μM)用于组织蛋白酶B分析。使用于含有DTT(1mM)及EDTA(2mM)的乙酸钠缓冲液(50mM,pH5.5)中的L-Arg-AMC(20μM)用于组织蛋白酶H分析。使用于含有DTT(2.5mM)及EDTA(1mM)的HEPES缓冲液(50mM,pH 7.4)中的Z-Phe-Arg-AMC(10μM)用于组织蛋白酶K分析。使用于含有DTT(1mM)及EDTA(2mM)的乙酸钠缓冲液(50mM,pH 5.5)中的Z-Phe-Arg-AMC(20μM)用于组织蛋白酶L分析。使用于含有DTT(2.5mM)及NaCl(50mM)的乙酸钠缓冲液(25mM,pH 4.5)中的Z-Leu-Arg-AMC(10μM)用于组织蛋白酶S分析。亦测量化合物抑制组织蛋白酶F、V及Z的活性的能力。测试表1中的化合物以及下表2中所示的化合物。
表2.比较性赖氨酸牙龈蛋白酶抑制剂
本发明的化合物抑制Kgp及组织蛋白酶的IC50值示于表3中。结果显示，本发明的化合物与参考化合物73关于Kgp抑制活性是相当的，均具有亚纳摩尔Kgp IC50值。令人惊讶的是，本发明的化合物展现对Kgp的优异选择性。举例而言，化合物2的CatH及CatS IC50值较参考化合物73的IC50值高十倍以上，表明化合物2是有效性低于参考化合物73的组织蛋白酶抑制剂。化合物2的CatB IC50值较参考化合物73的CatB IC50值高20倍以上。化合物2的CatK及CatL IC50值较参考化合物73的IC50值高100倍以上。
化合物的组织蛋白酶抑制活性降低是有利的，因为组织蛋白酶是涉及许多重要生理过程的溶酶体蛋白酶，该生理过程包括MHC-II介导的抗原呈递、骨重塑、角质细胞分化及前激素活化。因此，本发明的化合物可用于选择性地抑制个体中由侵入性牙龈卟啉单胞菌所产生的Kgp，而不扰乱个体中的内源性组织蛋白酶活性。
表3.本发明的化合物对赖氨酸牙龈蛋白酶及组织蛋白酶的抑制
实施例68.本发明的化合物的神经保护效应
于5％CO2孵育器(Thermal Fisher 371)中将处于第13代的人类神经胚细胞瘤SH-SY5Y细胞接种并培养于补充有2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen 25030164)、10％热不活化胎牛血清(Invitrogen-10099141)及1％青霉素-链霉素(Pen/Strep；Invitrogen-15140122)的完全培养基DMEM/F12(Invitrogen 11330-032)中。将细胞以2×104个细胞/孔-4×104个细胞/孔(200μl，1×105个细胞/mL-2×105个细胞/mL)的密度接种于经I型胶原手动涂覆的96孔黑色/平底板(Greiner-655090)中。将板在37℃下于CO2孵育器中孵育。
当孔中的细胞培养物达到70-80％融合(约6×104个细胞/孔)时，在存在各种浓度的测试化合物下或不存在测试化合物下，用牙龈卟啉单胞菌对其进行攻击。经由在无菌v形底96孔板中用DMSO连续稀释来制备化合物储备溶液(2.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05及0mg/ml)。然后将储备溶液(6μL)转移至填充有594μL完全培养基-Pen/Strep的96深孔板中以提供用于进一步测试的工作溶液(128、64、32、16、8、4、2、1、0.5及0μg/mL)。
将菌株牙龈卟啉单胞菌ATCC BAA-308自-80℃储备液划线至脑心浸液琼脂(brainheart infusion agar，BHA)(BD-211065)上。将板在厌氧工作台(Shanghaiyuejin,YQX-II)中在37℃下孵育72h。使气氛保持在80％N2、10％CO2及10％H2。在测试时，将板自厌氧工作台取出并在环境气氛中处理。收获细菌并悬浮于完全培养基-Pen/Strep(不含Pen/Strep)中。通过Siemens浊度计(Siemens)将悬浮液的浊度调整至0.5，其相当于约6×108cfu/mL。将细菌悬浮液在完全培养基-Pen/Strep中稀释至最终细菌密度为6×108cfu/ml(对于MOI 1:1000)，包括一个不含细菌的孔作为阴性对照。
将测试板中的细胞用200μL完全培养基-Pen/Strep洗涤一次。然后添加100μL工作溶液。在此步骤之后立即添加100μL细菌悬浮液。测试化合物的最终浓度是64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.025及0μg/mL，且含有1％DMSO。将测试板在5％CO2孵育器中在37℃下孵育24小时。
使用AlamarBlue(Invitrogen-527026)测定细胞存活率。使用完全培养基-Pen/Strep将测试板中的细胞洗涤两次以自悬浮液去除细菌。在此之后立即使用多移液管将220μL AlamarBlue/培养基混合物(由200μL完全培养基-Pen/Strep及20μL AlamarBlue组成)添加至测试板的每一孔。然后将测试板在37℃CO2孵育器中孵育以使荧光减少的AlamarBlue显影，其可在不经饱和的情形下在显影5-6小时之后使用SpectraMax M2e读板仪(Molecular Devices)读取。根据供货商手册(Invitrogen)，将激发及发射波长分别设定为530nm及590nm。
本发明的Kgp抑制剂保护SH-SY5Y神经胚细胞瘤细胞免于牙龈卟啉单胞菌诱导的细胞死亡，如图1中所显示。
实施例69.防止牙龈卟啉单胞菌获取铁
在测试日前三天，将细菌菌株自-80℃甘油储备液划线至脑心浸液琼脂(BHA)(BD-211065)板上，并在YQX-II厌氧工作台中在37℃下孵育72h。使用接种环(Greiner-731175)挑取单菌落并悬浮至5ml无菌盐水中。将悬浮液的浊度调整至0.2(Siemens MicroScan浊度计)，其等于约2×108cfu/mL。然后将细菌悬浮液在测试培养基中稀释100×。其被用于接种子板。
将细菌悬浮液的100μl的等分试样接种至子板的每一孔中。每一孔含有约1.0×106cfu/mL细菌、1％DMSO及于200μL布氏肉汤(Brucella Broth，BRU)中的连续稀释的化合物。将板在YQX-II厌氧工作台中在37℃下孵育6天。通过细菌色彩至黑色的可视化转换来读取铁获取的结果。
图2显示本发明的化合物在防止血红素分解及铁获取(牙龈卟啉单胞菌的关键存活机制)方面与参考化合物73相比有效性大约为两倍。
实施例70.Kgp抑制剂的改良的药代动力学性质
使用异氟醚(2％,800mL/min O2)使成年雄性Balb/C小鼠(20-25克，HarlanLaboratories,USA)麻醉。使用布比卡因(bupivacaine)/肾上腺素用于局部止痛且使用卡洛芬(carprofen)用于围手术期及手术后止痛。将动物置于立体定位架(Kopfinstruments,USA)中。将MetaQuant(MQ)微透析探针(再生纤维素膜，3mm暴露表面，BrainLink,the Netherlands)插入至海马体中并将套管插至颈静脉中。海马体探针尖端的坐标为：前-后(AP)＝自前囟-3.1mm，横向(L)＝自中线-2.8mm且腹侧(V)＝自硬脑膜-4.1mm，搂齿梁设定在0mm。手术后，将动物分别地饲养在笼中且随时自由地提供食物及水。
化合物1及参考化合物73是以2mg/mL于2％DMSO及98％盐水中新鲜制备，并以5mL/kg p.o.投用，使得最终投用浓度为10mg/kg。
手术后一天开始微透析取样。在实验当天，将探针与柔性PEEK管连结至微灌注泵(Harvard PHD 2000注射器泵，Holliston,MA或类似物)。将微透析探针用含有147mM NaCl、3.0mM KCl、1.2mM CaCl2、1.2mM MgCl2及0.15％BSA的CSF以0.15μL/min的缓慢流速及载剂流(以水补足(UP water)，0.04％抗坏血酸及0.15％BSA)以0.8μL/min流速来灌注。通过自动化部分收集器(820Microsampler,Univentor,Malta)将微透析样品收集15或30分钟的时期，至300μL。稳定化之后，收集一个基线样品，并向所有动物施用参考化合物73(10mg/kg；PO)。将样品再收集8小时。亦在施用参考化合物73后15、30、60、120、240、360、480及720分钟时经由尾静脉采集血浆。将所有样品储存在-80℃下等待Brains On-Line分析。实验完成之后，处死小鼠，收集脑部用于探针验证。
通过具有串联质谱(MS/MS)检测的HPLC测定透析液及血浆中的药物浓度。通过自动化样品注射器(Sil20ACHT,Shimadzu,Japan)将微透析样品在不进行任何样品预处理的情形下注射至LC系统(LC20XR,Shimadzu,Japan)上。用含有80％ACN的混合物沉淀血浆样品。将样品用含有0.1％甲酸的水进一步稀释。
层析分离是在反相管柱(2.1×50mm，粒径：2.5μm,Xbridge C8,Waters,USA)上实施。使用于含有0.1％甲酸的超纯H2O中的含有0.1％甲酸的乙腈的线性梯度分离各组分(流速0.2mL/min)。
MS分析是使用由API 4000三相四极杆检测器及Turbo Ion Spray接口(二者均来自Applied Biosystems,USA)组成的API 4000三相四极杆系统来实施。以正电离模式实施获取，对分析物进行优化设置。仪器是以多反应-监测(multiple-reaction-monitoring，MRM)模式使用405.2至221.3的质量转变来运行。使用AnalystTM数据系统(AppliedBiosystem)，使用分析物对浓度的反应来校准并量化数据。
本发明的化合物在小鼠中提供增加的血浆浓度及游离脑浓度，如图3及图4中所分别显示。
实施例71.赖氨酸牙龈蛋白酶的抑制
测量本发明的化合物针对Kgp及组织蛋白酶B、H、K、L及S的抑制活性的其他分析是以如实施例66中所阐述的那样来进行。亦测量该化合物抑制组织蛋白酶F、V及Z的活性的能力。总之，实施例66及实施例70的结果显示，本文中所述的化合物是极有效的Kgp抑制剂，其展现纳摩尔及皮摩尔IC50值。此外，如表4中所示，与参考化合物73相比，多个化合物(包括化合物1、2、7及50)显示较内源性组织蛋白酶对于Kgp的增加的选择性。与参考化合物73相比，尤其化合物18、47、55及69对于Kgp的选择性远高于内源性组织蛋白酶。
这些化合物亦展示其他重要优点。举例而言，与参考化合物73相比，在施用于雄性CD-1小鼠(以10mg/kg p.o.投用)之后，化合物1、47、48及69展现经改良的经口利用度及增加的血浆浓度。与参考化合物73相比，化合物47及69在脑及脑脊髓液(CSF)中产生增加的浓度，其尤其可用于治疗诸如阿兹海默氏病的脑病状。其他化合物(包括化合物49)在脑和/或脑脊髓液中展现降低的浓度。此类化合物可用于治疗不影响脑的外围病状，例如牙周疾病或关节炎。
表4.本发明的化合物对赖氨酸牙龈蛋白酶及组织蛋白酶的抑制
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实施例72.通过探针化合物测量Kgp抑制活性。
本发明的化合物抑制赖氨酸牙龈蛋白酶(Kgp)的活性的能力是在与Barret(Biochemical Journal.1980,187(3),909)中所述的那些类似的荧光分析中在37℃下使用10μM Z-His-Glu-Lys-MCA作为荧光底物来测量。通过测试每一化合物的浓度范围，确定将赖氨酸牙龈蛋白酶的活性抑制50％所需的浓度(“IC50”)，如表5中所述。
表5.比较性赖氨酸牙龈蛋白酶抑制剂
化合物 Kgp IC50(nM)
15a 4
38a 12
44a 3
45a 54
46a 13
51a 0.4
73 <0.05
实施例73.使用牙龈蛋白酶活性探针分析细菌涂片。
将W83细菌或细菌的W83Kgp剔除菌株与1μM活性探针15a或活性探针38a在37℃下一起孵育1小时。然后使细菌粒化并重新悬浮于20μL PBS中，将其滴加至经聚-L-赖氨酸涂覆的载玻片上并在室温下保持在暗箱中约2小时以使液滴干燥。然后将载玻片在PBS中洗涤3次。用含有用于细菌DNA的DAPI染色剂的封固介质将载玻片封固并在荧光显微镜下可视化。基于活性Kgp的表达，在暴露于活性探针15a或活性探针38a之后，W83细菌发荧光。Kgp剔除细菌及未暴露于活性探针的细菌仅显示蓝色DAPI荧光，证实细菌核的存在(图5A)。此实施例证明，活性探针可通过与Kgp的特异性共价反应使细菌染色，而使其被检测到。
实施例74.使用牙龈蛋白酶活性探针分析牙龈组织样品。
将新鲜冷冻的牙龈组织载玻片(5微米厚)自-80℃冰箱移除并在RT下解冻10min。然后，将组织立即与活性探针15a(于PBS中1μM)一起浸入加湿室中，并将该室覆盖避光且在37℃下孵育1小时。然后将载玻片在PBS中洗涤3次，每次5min，然后在RT下于新鲜4％PFA中固定15min，然后再在PBS中洗涤3次。然后将载玻片与1×工作Trueblack溶液(Biotium)一起在RT下孵育30min。然后将载玻片在PBS中洗涤3次，并用含有DAPI的抗褪色封固介质封固(图5B)。所得显微照片展示，活性探针可用于使人类组织样品中的活性Kgp的存在可视化。
实施例75.使用牙龈蛋白酶活性探针分析受感染细胞。
使经及不经牙龈卟啉单胞菌W83或W83Kgp剔除菌株感染的人类Jurkat细胞暴露于活性探针15a。在暴露于活性探针15a之前，使一些受感染细胞与非荧光活性位点Kgp抑制剂73(N-[7-氨基-2-氧代-1-(2,3,5,6-四氟苯氧基)庚-3-基]环戊烷甲酰胺)一起预孵育1小时。如图6A中所显示，探针15a不可逆地结合至经纯化的Kgp及受感染细胞中对应于Kgp大小的蛋白质。经牙龈卟啉单胞菌感染的细胞中的此经标记蛋白质的身份通过蛋白质印迹证实为Kgp。另外，在添加活性探针15a之前使化合物70(N-[7-氨基-2-氧代-1-(2,3,5,6-四氟苯氧基)庚-3-基]环戊烷甲酰胺)与受感染细胞一起预孵育，阻断探针15a与Kgp的结合，证实探针对于Kgp具特异性。
对Jurkat细胞生长中的细菌滴定容许定量测定受感染细胞中的Kgp含量(图6B)。此实施例展示，Kgp可在细菌及细菌感染的细胞中定量地检测到，且其亦可用于测量抑制剂的靶标接合。
实施例76.使用牙龈蛋白酶活性探针分析颊细胞样品。
将利用无菌环自若干人类供体收获的颊细胞悬浮于活性探针15a的溶液(于PBS中1μM)中。将细胞在37℃下孵育1小时并粒化。将细胞重新悬浮于20μL PBS中并置于经聚-L-赖氨酸涂覆的载玻片上，洗涤并干燥。利用含有DAPI的抗褪色封固介质将载玻片封固，并在荧光显微镜下可视化。与活性探针15a一起孵育的一些颊细胞显示明显的点状染色，而其他者则无(图7)，指示在一些细胞中存在Kgp。此实施例展示，牙龈卟啉单胞菌及Kgp的存在可在人类口腔颊细胞样品中检测到。
实施例77.生物素化活性探针用于分离及分析牙龈蛋白酶的用途。
在4℃下将牙龈卟啉单胞菌W83用B-Per缓冲液溶解15min。将所得上清液掺加2mM生物素Kgp活性探针51a，并在室温下孵育1小时。使5mg链霉抗生物素蛋白-珠粒与所有样品一起在室温下在翻转平台上孵育1小时。1小时之后收集珠粒，并在100℃下与0.1％SDS一起加热5min以破坏生物素-链霉抗生物素蛋白结合。通过SDS-PAGE及蛋白质印迹法分析所得上清液，以利用CAB102特异性检测Kgp(图8)。此实施例展示，生物素探针可用于活性Kgp的下拉及量化。
实施例78.使用基于Cy5活性的探针检测Kgp。
此实施例展示利用探针化合物71(不可逆地结合至Kgp的基于Cy5缀合活性的探针)检测活性Kgp。其具有结合至Kgp活性位点的弹头，基于肽的核心及用于检测的Cy5荧光团。经标记的靶标蛋白质可通过利用2-D凝胶电泳分级的样品生物化学分离和在适当激发及发射波长下检测来自Cy5的荧光信号来可视化。在使Kgp与测试化合物(例如，候选Kgp抑制剂)结合之后，孵育固定浓度的探针导致活性探针与尚未由测试化合物结合的Kgp活性位点结合。
牙龈卟啉单胞菌溶解物的制备。收集108个细菌且在4℃下在5000g下离心10min，且弃掉上清液。将细菌细胞团粒在冰上用1mL B-Per溶解缓冲液(Thermo Fischer)溶解10min，然后在4℃下在14000g下离心10min。收集含有蛋白质溶解物的上清液。将生物样品在4℃下用B-Per溶解缓冲液溶解10min。
Kgp的Cy5直接标记。将生物样品、牙龈卟啉单胞菌溶解物或经纯化的Kgp与可淬灭的Cy5探针化合物71(1μM)一起在振荡下在37℃下孵育1h。然后，利用含有50mM DTT的NUPAGE LDS样品缓冲液(Thermo Fisher)使样品在95℃下变性10min，并使用Criterion4-15％预制凝胶(Bio-Rad)及Tris/甘氨酸/SDS运行缓冲液(Bio-Rad)而经受SDS-PAGE电泳。使凝胶在75V下运行10min且然后在125V下运行1.5h。然后将凝胶自塑料盒移除，并利用ChemiDoc成像系统(Bio-Rad)而经受Cy5可视化。
经Cy5探针标记的Kgp的免疫沉淀。将样品在振荡下在37℃下用可淬灭的Cy5探针化合物71(1μM)标记1h。为免疫沉淀经Cy5标记的Kgp，则使样品与10μg兔多克隆CAB102抗体一起在4℃下在旋转下孵育过夜。然后，使样品与预洗涤的Dynabead蛋白质G珠粒在室温下在旋转下一起孵育20min。使用磁性架将样品用200μL洗涤缓冲液洗涤4次。将珠粒悬浮于20μL洗脱缓冲液及10μL NUPAGE LDS样品缓冲液(50mM DTT)中，在70℃下加热10min。然后使用磁性架自磁性珠粒洗脱经免疫沉淀的蛋白质。然后使样品经受SDS-PAGE电泳并利用ChemiDoc成像系统(Bio-Rad)使Cy5信号可视化。
经Cy5标记的样品的蛋白质印迹分析。用Cy5检测成像后，通过使用Trans-blotTurbo转移系统(Bio-Rad)以将蛋白质转移至PVDF膜使SDS-PAGE凝胶经受蛋白质印迹分析。然后将膜用TBS洗涤5min并用于TBST缓冲液中的3％BSA封阻1h或更久。然后于封阻缓冲液中使印记与1:1000一级抗体CAB102一起在RT下孵育2h或在4℃下孵育过夜。然后将印记用TBST缓冲液洗涤3次，每次5min，然后在RT下与于TBST中的1:50,000山羊抗兔IgG吸收的HRP缀合抗体(Thermo Fisher，编号31462)一起孵育45min。然后将印记用TBST洗涤4次，并使用SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo Fisher)及ChemiDoc成像系统经受化学发光成像。
结果。使用探针化合物71检测Kgp是敏感的，表观检测极限为500CFU。检测对于Kgp具有特异性，如由三个实验所证明。首先，如图9A中所显示，在野生型W83牙龈卟啉单胞菌细菌培养物样品中存在Kgp蛋白的单一条带(分子量50kDa)的特异性检测，而在来自牙龈卟啉单胞菌的Kgp剔除菌株的样品中未检测到。
其次，探针化合物71标记的Kgp是通过用CAB102(Kgp特异性多克隆抗体)预孵育及免疫清除而特异性地清除。图9B中的泳道1显示用探针化合物71对野生型牙龈卟啉单胞菌的标记，而图9B中的泳道2显示利用兔多克隆抗体CAB102缀合珠粒免疫清除经标记的Kgp后的样品分析。泳道1及2等同地装载十分之一的总样品体积。图9B的泳道3显示来自CAB102缀合珠粒的经标记的Kgp的洗脱液。在泳道3中装载三分之二的总洗脱体积。
最后，通过与化合物1(100nM)一起预孵育来完成检测，该浓度对于Kgp具有选择性且不会抑制同源精氨酸牙龈蛋白酶Rgp。图9C显示对不同浓度的野生型牙龈卟啉单胞菌的标记及检测以确定标记分析的检测限。亦将CFU(菌落形成单位)最高的样品与100nM的化合物1一起孵育。样品是通过蛋白质印迹法利用CAB102抗体以及通过可视化Cy5信号来检测。此最后一项研究展示，化合物1与探针化合物71竞争活性位点结合，使得能够检测Kgp小分子抑制剂(例如化合物1)的Kgp靶标接合程度。这些数据确立通过探针化合物71标记完整细菌培养物中的Kgp蛋白及经纯化的蛋白质，且确立评价经化合物处理的样品中的靶标接合的方法。
实施例79.通过抑制Kgp治疗牙龈卟啉单胞菌感染的多个方面。
经数周直接施用于小鼠牙龈的牙龈卟啉单胞菌已用作牙周炎模型。当采用此模型时典型地观察到牙槽骨再吸收(牙周炎进展的标志)。最近，使用该模型已经致使发现在脑部中的显著量的牙龈卟啉单胞菌，其伴随口腔定殖而积累并且随后导致诸如炎症和海马神经元损失的有害效应。如以下所述，本文中公开的化合物1及其他化合物当用于治疗感染有牙龈卟啉单胞菌的个体时可以防止这些效应。
在研究开始时，八周龄BALB/C雌性小鼠接受在饮用水中的抗生素(磺胺甲基异噁唑0.87mg/mL，甲氧苄啶(trimethoprimum)0.17mg/mL)10天以降低免于实验感染的微生物群系防护。实验牙周炎通过结扎布置、随后多次暴露于牙龈卟啉单胞菌而诱发。在结扎程序期间，将小鼠经由腹膜内注射氯胺酮(200mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)而麻醉，并且使用油膏(Puralube Vet；Pharmaderm,Melville,NY)润滑眼部。接下来，绕着第二磨牙的左侧和右侧的上颌骨系上5-0结扎丝线(Roboz Surgical Instrument Co.,)。施用并轻轻地系上缝合线以防止对牙周组织的损伤。使结扎在整个实验期间置于合适位置，使得通过其内部的细菌定殖可以不断地诱发炎症。
将小鼠(n＝8-10/arm)每隔一天受到感染，持续6周。对于感染，向上颌骨的颊表面局部施用100μL细菌溶液。对于细菌制备，将牙龈卟啉单胞菌W83(ATCC,Rockville,MD)划线至胰腺大豆肉汤(TSB)琼脂板(5％绵羊血，补充有0.5mg/mL L-半胱氨酸、5μg/mL血晶素和0.5μg/mL维生素K)上并且在37℃下在厌氧条件下生长5-7天。然后将样品接种于具有血晶素、维生素K和L-半胱氨酸的TSB(TSB-HKC)中，直至对数中期(OD600＝0.5-0.7)。将细菌在PBS中洗涤并且以1×1010个细胞/mL的最终浓度在PBS+2％甲基纤维素(CMC)中制备。
使小鼠接收媒剂或化合物1，持续5周(第36-70天)。化合物1在PBS中以3、10或30mg/kg每天两次经口施用于口腔中。媒剂治疗的动物仅接收PBS。在5周时，将一子组的动物(n＝16)实施安乐死以收集基线测量值，然后开始治疗。在10周时，对小鼠实施安乐死并且收取脑部、血清和上颌骨组织并在液氮中冷冻。
使用OsiriX MD软件(PixmeoSARL,Bernex,Switzerland)活体外盲测上颌骨中的骨损失。使用3D多平面重建(MPR)视图获得测量点，其中沿着第二磨牙的表面根及第一磨牙的后根以第一磨牙的前根的切线对上颌骨直线切片。根据CEJ至ABC上的参考线，测量牙骨质釉质交界(CEJ)与牙槽嵴顶(ABC)之间的距离，所述参考线布置为垂直于第二磨牙的每一侧上的表面根。图10显示在10周结束时于由媒剂或化合物1治疗的小鼠中的感染诱导的齿槽骨损失(###p<0.0001)。在第5-10周期间，骨损失通过使用化合物1(30mg/kg或10mg/kg)的治疗得以改善。使用3mg/kg的化合物1的治疗趋于改善，但相较于媒剂治疗的小鼠并未导致显著的改善。(ANOVA:F(5,24)＝15.71,p<0.0001；采用邦费罗尼校正的t-检验:**p<0.005,***p<0.001)。
使用DNeasyBLOOD&TISSUE KIT(Qiagen,Germany)根据制造商的协议从脑组织提取DNA。Taqman qPCR采用在Bio-Rad CFX96实时系统C1000Touch ThermalCycler上的KapaProbe fast qPCR Mix(Rox Low)进行，其中使用正向引物和反向引物(分别为5′-AGCAACCAGCTACCG-TTTAT-3′和5′-GTACCTGTCGGTTTACCATCTT-3′)以及检测探针(6-FAM-TACCATGTTTCGCAGAAGCCCTGA-TAMRA)。引物基于牙龈卟啉单胞菌精氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶基因的单拷贝。复制样品以10μL的总体积分析，包含100ng模板脑基因组DNA溶液、TaqMan Universal PCR Master Mix(2x)(Kapa Biosystems,USA)以及引物(最终浓度5μM)及探针(最终浓度4μM)的特定集(GenoMed,Poland)(相当于：对于正向引物和反向引物为562.5nM及对于探针引物为100nM)。在50℃下2分钟的最初孵育步骤及在95℃下的20秒变性之后，实施40PCR循环(95℃持续20秒，60℃持续30秒)。牙龈卟啉单胞菌基因组的拷贝数通过使Cq值与通过连续稀释培养的牙龈卟啉单胞菌W83(WT)而制备的标准曲线相匹配而计算。如图11中显示，在感染的5周和10周之后在脑组织中发现牙龈卟啉单胞菌特异性RgpB基因的大量拷贝数。在5周与10周之间使用30mg/kg化合物1的治疗导致DNA拷贝数的约80％的降低(***p<0.001)。使用10mg/kg或3mg/kg的治疗导致拷贝数的约50％的降低(**p<0.01,***p<0.001)。ANOVA:F(6,59)＝23.31,p<0.0001；采用邦费罗尼校正的t-检验。
使用CellSens 1.5.软件实施GAD67正中间神经元的量化。门区面积定义为在开口面上由直线连接的齿状回的片(blades)之间的面积。计数通过海马结构的每第40个节段上的细胞数。如图12中显示，与模拟受感染对照相比，在齿状回中GAD67正中间神经元的量化显示在10周时于受感染小鼠中的中间神经元的约25％损失(*p<0.05)。相反，在使用化合物1治疗的小鼠中的GAD67+细胞与在模拟受感染的小鼠中的GAD67+细胞处于相同水平。图12中的结果展现为每体积组织的细胞数。
总之，该实施例中的结果显示化合物1治疗牙龈卟啉单胞菌感染的多个方面，包括齿槽骨损失、脑组织的细菌含量和海马神经元损失。还观察到化合物1在相关研究中降低脑abeta42和神经炎症的诱导。通过抑制Kgp，本文中公开的化合物可以治疗牙龈卟啉单胞菌感染自身，以及神经病学疾病和其他感染相关病状的有害效应。
尽管出于清晰及理解的目的，已通过说明及实例相当详细地阐述上述发明，但本领域技术人员应了解可在随附权利要求的范围内实践某些变化及修改。另外，本文中所提供的每一参考文献是以全文援引的方式并入，其并入程度如同将每一参考文献单独地并入一般。

Claims (49)

1.式I的化合物，
或其药学上可接受的盐，其中：
A为-CH2-；
R1a及R1b各自为氢；
R2a及R2b各自为氢；
R3选自由以下组成的群：C3-8环烃基、C3-8烷基和吡啶基，其中R3任选地经一个或多个R3a取代基取代；
每一R3a独立地选自由以下组成的群：卤素、-CN、-NO2、-N3、-OH、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、-N(Rc)2、-N+(Rb)3、-(CH2)kC(O)Rb、-NRcC(O)Rb、-NRc(CH2)uC(O)Rb、-O(CH2)uC(O)Rb、-(CH2)kCONRcRc、-(CH2)kNRcC(O)Rb、-NRc(CH2)uCONRcRc、-NRc(CH2)uNRcC-(O)Rb、-O(CH2)uCONRcRc及-O(CH2)uNRcC(O)Rb；
每一Rb独立地选自由C1-4烷基、C1-4卤代烷基及C1-4氘代烷基组成的群；
每一Rc独立地选自由氢及C1-8烷基组成的群；
每一下标k独立地选自0、1、2、3、4、5及6；
每一下标u独立地选自1、2、3、4、5及6；
R4为氢；
R5选自由-CH2R5a和-CHS(O)(R5b)2组成的群；
R5a选自由以下组成的群：-O-R6、-S-R7、-SO-R7、-SO2-R7、-N(R8)2、咪唑基、吲哚基、异吲哚基、异噁唑基、噁嗪基、噁唑基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹啉基、四唑基、三嗪基和三唑基，
其中咪唑基、吲哚基、异吲哚基、异噁唑基、噁嗪基、噁唑基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹啉基、四唑基、三嗪基和三唑基任选地经一个或多个独立地选自由氧代、卤素、C1-3烷基和C1-3卤代烷基组成的群的成员取代；
每一R5b是独立选择的C1-6烷基；
R6及R7选自由以下组成的群：C1-6烷基、C1-6卤代烷基、异噁唑基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、噁嗪基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基，
其中异噁唑基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、噁嗪基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基任选地经一个或多个卤素、C1-3烷基或C1-3卤代烷基取代；以及
每一R8是独立选择的C1-6烷基。
2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3选自由以下组成的群：C3-8环烃基、C3-8烷基、吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基，其各自任选地经一个或多个R3a取代基取代。
3.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3为环戊基，其任选地经一个或多个R3a取代基取代。
4.如权利要求2或3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中每一R3a独立地选自由以下组成的群：卤素、-N3、C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷氧基、-N(Rc)2、-N+(Rb)3及-NRcC(O)Rb。
5.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3是环戊基。
6.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3是经C1-4烷氧基取代的C3-8烷基。
7.如权利要求6所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3是甲氧基丙基。
8.如权利要求1或2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其具有式Ia的结构：
9.如权利要求8所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5是-CH2R5a，R5a是-O-R6，且R6是C1-6卤代烷基。
10.如权利要求9所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R6选自由三氟乙基及六氟丙基组成的群。
11.如权利要求8所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5是-CH2R5a，R5a是-O-R6，且R6选自由以下组成的群：异噁唑基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、噁嗪基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基，其任选地经一个或多个独立地选自由卤素及C1-3烷基组成的群的成员取代。
12.如权利要求11的化合物，其中R6选自由异噁唑基及吡啶基组成的群。
13.如权利要求8所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5a选自由以下组成的群：-N(R8)2、咪唑基、吲哚基、异吲哚基、异噁唑基、噁嗪基、噁唑基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹啉基、四唑基、三嗪基和三唑基，
其中咪唑基、吲哚基、异吲哚基、异噁唑基、噁嗪基、噁唑基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹啉基、四唑基、三嗪基和三唑基任选地经一个或多个独立地选自由氧代、卤素、C1-3烷基及C1-3卤代烷基组成的群的成员取代。
14.如权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5a选自由四唑基及氧代嘧啶基组成的群。
15.如权利要求8所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
R5选自由-CH2R5a及-CHS(O)(R5b)2组成的群，
R5a选自由-S-R7及-S-(O)2R7组成的群，且
R7选自由以下组成的群：C1-6烷基、C1-6卤代烷基、异噁唑基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、噁嗪基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基。
16.如权利要求15所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R5是-CH2R5a；R5a选自由-S-R7及-S-(O)2R7组成的群；且R7是C1-6烷基。
17.如权利要求15所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中：R5是-CH2R5a；R5a是-S-R7；且R7选自由异噁唑基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、噁嗪基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基组成的群。
18.如权利要求17所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7选自由以下组成的群：异噁唑基、吡啶基及嘧啶基。
19.如权利要求15所述的化合物，其中R5是-CHS(O)(R5b)2。
20.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的群：
21.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其为
22.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其选自由以下组成的群：
23.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其为
24.药物组合物，其包含权利要求1至23中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐及药学上可接受的赋形剂。
25.权利要求1至23中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求24所述的组合物在制备用于治疗有需要的个体的与牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)感染相关的疾病或病状的药物中的用途。
26.如权利要求25所述的用途，其中所述疾病或病状选自由以下组成的群：脑病症、牙周疾病、糖尿病、心血管疾病、关节炎、升高的早产风险、肺炎、癌症、肾病、肝病、视网膜病症及青光眼。
27.如权利要求26所述的用途，其中所述疾病或病状是脑病症。
28.如权利要求27所述的用途，其中所述脑病症选自由以下组成的群：阿兹海默氏病、唐氏综合征、癫痫、自闭症、帕金森氏病、特发性震颤、额-颞叶痴呆、进行性核上性麻痹、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症、亨廷顿氏症、多发性硬化、轻度认知损害、年龄相关性记忆损害、慢性创伤性脑病、中风、脑血管疾病、路易氏体病、多重系统萎缩、精神分裂症及抑郁症。
29.如权利要求28所述的用途，其中所述脑病症是阿兹海默氏病。
30.如权利要求29所述的用途，其进一步包含向所述个体施用一种或多种选自由以下组成的群的活性剂：胆碱酯酶抑制剂、血清素调节剂、NMDA调节剂、Aβ靶向疗法、ApoE靶向疗法、小神经胶质细胞靶向疗法、血脑障壁靶向疗法、tau靶向疗法、补体靶向疗法及抗炎药。
31.如权利要求26所述的用途，其中所述疾病或病状是牙周疾病。
32.如权利要求26所述的用途，其中所述疾病或病状是肝病。
33.如权利要求32所述的用途，其中所述肝病是非酒精性脂肪性肝炎。
34.如权利要求26所述的用途，其中所述疾病或病状是视网膜病症。
35.如权利要求34所述的用途，其中所述视网膜病症是年龄相关性黄斑变性。
36.如权利要求26所述的用途，其中所述疾病或病状是癌症。
37.如权利要求36所述的用途，其中所述癌症选自由以下组成的群：口腔癌、乳癌、胰脏癌及多形性成胶质细胞瘤。
38.如权利要求26所述的用途，其中所述疾病或病状是升高的早产风险。
39.如权利要求26所述的用途，其中所述疾病或病状是关节炎。
40.如权利要求39所述的用途，其中所述关节炎是类风湿性关节炎、骨关节炎、感染性关节炎或银屑病性关节炎。
41.如权利要求40所述的用途，其中所述关节炎是类风湿性关节炎或骨关节炎。
42.如权利要求26所述的用途，其中所述疾病或病状是心血管疾病。
43.如权利要求26所述的用途，其中所述疾病或病状是糖尿病。
44.如权利要求25至43中任一项所述的用途，其中将所述化合物施用于所述个体至少一个月。
45.如权利要求44所述的用途，其中将所述化合物施用于所述个体至少一年。
46.如权利要求44所述的用途，其中将所述化合物施用于所述个体至少10年。
47.如权利要求44所述的用途，其中将所述化合物施用于所述个体至少60年。
48.如权利要求25至43中任一项所述的用途，其中所述个体是人类、犬或猫。
49.如权利要求48所述的用途，其中所述个体是人类。
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