ES2262184T3 - Utilizacion de mimeticos de hojas beta como inhibidores de proteasa y de kinasa o como inhibidores de factores de transcripcion. - Google Patents

Utilizacion de mimeticos de hojas beta como inhibidores de proteasa y de kinasa o como inhibidores de factores de transcripcion.

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ES2262184T3
ES2262184T3 ES97936371T ES97936371T ES2262184T3 ES 2262184 T3 ES2262184 T3 ES 2262184T3 ES 97936371 T ES97936371 T ES 97936371T ES 97936371 T ES97936371 T ES 97936371T ES 2262184 T3 ES2262184 T3 ES 2262184T3
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Patrick Douglas Boatman, Jr.
Jan Urban
Joseph Patrick Meara
Suresh Babu
Mark D. Ferguson
Christopher Todd Lum
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Abstract

SE EXPONE MIMETICOS DE LAS LAMINAS BE Y PROCEDIMIENTOS RELACIONADOS CON LOS MISMOS. LOS MIMETICOS DE LAS LAMINAS BE TIENEN UTILIDAD COMO INHIBIDORES DE LA PROTEASA Y LA QUINASA, ASI COMO INHIBIDORES DE FACTORES DE TRANSCRIPCION. ENTRE LOS PROCEDIMIENTOS DE LA INVENCION SE INCLUYEN LA ADMINISTRACION DE UN MIMETICO DE LAMINAS BE , O EL USO DEL MISMO EN LA FABRICACION DE UN MEDICAMENTO PARA TRATAMIENTO DE UNA SERIE DE CONDICIONES ASOCIADAS A LA PROTEASA, QUINASA Y/O FACTOR DE TRANSCRIPCION QUE INTERESAN.

Description

Utilización de miméticos de hojas beta como inhibidores de proteasa y de kinasa o como inhibidores de factores de transcripción.
Esta invención se relaciona en general con los miméticos de hoja beta y, más específicamente, con los miméticos que inhiben los péptidos y las proteínas biológicamente activos.
Antecedentes de la invención
La conformación de hoja beta (a la que también se refiere como conformación de cadena beta) es una estructura secundaria que se encuentra presente en muchos polipéptidos. Esta conformación está casi completamente extendida, con distancias axiales entre aminoácidos adyacentes de aproximadamente 3.5 A. La hoja beta se estabiliza mediante puentes de hidrógeno entre los grupos NH y CO en las diferentes cadenas de polipéptidos. Además, los dipolos de los enlaces peptídicos alternan a lo largo de las cadenas lo que imparte una estabilidad intrínseca a la hoja beta. Las cadenas adyacentes de la hoja beta pueden extenderse en la misma dirección (es decir, una hoja beta paralela) o en direcciones opuestas (es decir, una hoja beta antiparalela). Aunque estas dos formas difieren ligeramente en los ángulos dihédricos, ambas son estéricamente favorables. La conformación extendida resulta en que las cadenas laterales de aminoácido sobresalgan en caras alternadas de la hoja beta.
La importancia de las hojas beta en los péptidos y las proteínas se encuentra bien establecida (por ejemplo, Richardson, Nature 268:495-499, 1977; Halverson et al., J. Am. Chem Soc. 113:6701-6704, 1991; Zhang, J. Biol. Chem. 266:15591-15596, 1991; Madden et al., Nature 353:321-325, 1991).
La hoja beta es importante en numerosos eventos biológicos de reconocimiento de proteína a proteína, incluyendo las interacciones entre las proteasas y sus sustratos, las proteínas quinasas y sus sustratos o inhibidores, el enlace de un dominio SH2 que contiene proteínas con su fosfotirosina coñada que contenga proteínas dianas, la farnesil transferasa con sus sustratos proteicos y MHC I y II y sus péptidos antigénicos y ha sido implicada en muchos estados enfermos.
Los inhibidores que simulen la estructura de hoja beta de proteínas o péptidos biológicamente activos serían útiles en el tratamiento de una amplia gama de condiciones. Por ejemplo, Ras, el producto proteico del oncógeno ras, es una proteína vinculada a una membrana implicada en la transducción de señales que regulan la división y el crecimiento celular. Las mutaciones del gene ras se encuentran entre las anormalidades genéticas más comunes asociadas con los cánceres humanos (Barbacid, M. "ras genes", 56:779-827, 1987). Estas mutaciones resultan en una señal de crecimiento que está siempre "encendida", lo que conduce a una célula cancerosa. Para localizarse en la membrana celular, Ras requiere la prenilación de la cisteína dentro de la secuencia CaaX de la terminal C por la farnesil transferasa (FTasa). (En la secuencia CaaX "a" se define como un aminoácido con una cadena lateral hidrofóbica y "X" es otro aminoácido.) Esta modificación posterior a la traducción es crucial para esta actividad. Se ha demostrado que los inhibidores peptidilo de la FTasa con la secuencia CaaX bloquean o demoran el crecimiento de tumores en los cultivos celulares y en los animales (Kohl et al., "Selective inhibition of ras-dependent transformation by a farnesyltransferase inhibitor", Science 260:1934-1937, 1993; Buss, J.E. & Marsters, Jr., J.C. "Farnesyl transferase inhibitors: the successes and surprises of a new class of potential cancer chemotherapeutics", Chemistry and Biology 2:787-791, 1995).
Los dominios SH2, identificados originalmente en la subfamilia src de las proteínas tirosina quinasas (PTK por sus siglas en inglés), son secuencias no catalíticas y consisten en aproximadamente 100 aminoácidos conservados en una diversidad de proteínas de transducción de señales (Cohen et al., Cell 80:237-248, 1995). Los dominios SH2 funcionan como módulos enlazantes de fosfotirosina y median las asociaciones proteína a proteína criticas (Pawson, Nature 573-580, 1995). En particular, el papel de los dominios SH2 ha sido claramente definido como el de transductores de señales críticos para las tirosina quinasas receptoras (las RTK tales como EGF-R, PDGF, el receptor de la insulina, etc.). Los sitios que contienen fosfotirosina de las RTK áutofosforiladas sirven como sitios de enlace para las proteínas de SH2 y por lo tanto median la activación de las rutas de señalización bioquímica (Carpenter, G., FAESEB J. 6:3283-3289, 1992; S1ierke, S. and Koland, J., Biochem. 32:10102-10108, 1993). Los dominios SH2 son responsables del acoplamiento de los receptores del factor de crecimiento activados a las respuestas celulares lo que incluye alteraciones de la expresión genética, la proliferación celular, la arquitectura citoesquelética y el metabolismo.
Se han identificado al menos 20 proteínas citosólicas que contienen dominios SH2 y que funcionan en la señalización intracelular. La distribución de los dominios SH2 no se restringe a una familia de proteínas en particular, sino que se encuentra en diversas clases de proteínas, proteínas quinasas, lípido quinasas, proteínas fosfatasas, fosfolipasas, proteínas controladoras de Ras y algunos factores de transcripción. Muchas de las proteínas que contienen SH2 tienen actividades enzimáticas conocidas, mientras que otras (Grb2 y Crk) funcionan como "vinculadores" y "adaptadores" entre los receptores de la superficie celular y las moléculas efectoras corriente abajo (Marengere, L., et al., Nature 369:502-505, 1994). Ejemplos de proteínas que contienen dominios SH2 con actividades enzimáticas que son activadas en la transducción de señales incluyen, entre otras, la subfamilia src de las proteínas tirosina quinasas (src (pp60^{c-src}), abl, lck, fyn, fgr y otras), fosfolipasa -C-\gamma (PLC-\gamma por sus siglas en inglés), fosfatidilinositol 3-quinasa (Pl-3-quinasa), proteína activadora de GTPasa (GAP, por sus siglas en inglés) p21-ras y proteínas tirosina fosfatasas que contienen SH2 (SH-PTPasa) (Songyang et al., Cell 72:767-778, 1993). Las tirosinas intracelulares son fosforiladas cuando los receptores de superficie están conectados por diversos ligandos para los receptores del factor de crecimiento, los receptores de citoquinas, los receptores de insulina y la señalización mediada por antígeno a través de los receptores de células B o T. La fosforilación de proteínas en los residuos tirosina es crítica en la transducción de señales celulares, las transformaciones neoplásicas y el control del ciclo celular. Debido al papel central que estas diversas proteínas de SH2 desempeñan en la transmisión de señales desde los receptores activados de la superficie celular en una cascada de interacciones moleculares adicionales que últimamente definen las respuestas celulares, los inhibidores que bloquean el enlace SH2-proteína específico son deseables como agentes para una diversidad de aplicaciones terapéuticas potenciales.
Los tipos de enfermedades para las cuales la fosforilación de tirosina y la inhibición del enlace SH2 representan objetivos para el desarrollo de medicamentos incluyen los siguientes:
Cáncer: Los dominios SH2 que median la señalización son claramente elementos significativos en la regulación de la actividad oncogénica y proto oncogénica de la tirosina quinasa y la proliferación celular (Carpenter, Fed. Am. Soc. Exp. Biol. J. 6:3283-3289, 1992). Los dominios SH2 definen un importante conjunto de sustratos por medio de los cuales las RTK median la señalización y por medio de los cuales las tirosina quinasas no receptoras se asocian con las RTK y son por lo tanto dianas de las drogas anticancerígenas. La capacidad de bloquear la interacción de las RTK con el sustrato que contiene SH2 utilizando un inhibidor mimético proporciona un medio para abrogar la señalización y por lo tanto eliminar la actividad oncogénica. El significado biológico se ilustra también mediante el oncógeno v-crk, una proteína compuesta casi enteramente de dominios SH, la que es capaz de llevar a cabo la transformación celular interactuando con proteínas que contienen fosfotirosina. Como antes, se esperaría que la capacidad de los inhibidores de bloquear el enlace de la v-crk a través de su dominio SH2 a otras proteínas sea efectiva como un agente anticancerígeno.
Regulación inmune: La regulación de muchas respuestas inmune es mediada a través de receptores que transmiten señales por medio de dominios SH2 que contienen tirosina quinasas. La activación de las células T por medio del receptor de células T (TCR por sus siglas en inglés) de antígeno específico inicia una cascada de transducción de señales que lleva a la secreción de linfoquina y a la proliferación celular. Una de las respuestas bioquímicas más tempranas que sigue a la activación TCR es un incremento de la actividad de las tirosina quinasas. En particular, la activación de las células T y la proliferación se controlan a través de la activación mediada por el receptor de células T de las tirosina quinasas p56^{lck} y p59^{fyn}, así como de ZAP-70 y Syk (Weiss and Litman, Cell 76:263-274, 1994) las cuales contienen dominios SH2. Otras evidencias adicionales indican que varias quinasas de la familia src (lck, blk, fyn) participan en las rutas dé transducción de señales que conducen de los receptores del antígeno de las células B y por lo tanto pueden servir para integrar los estímulos recibidos de diversas estructuras independientes de receptores. Por lo tanto, los inhibidores que bloquean las interacciones de estas quinasas de dominio SH2 con sus receptores corlados podrían servir como agentes inmunosupresores útiles en las enfermedades autoinmunes, rechazo de injertos o como agentes antiinflamatorios así como drogas anticancerosas en los casos de leucemias linfocíticas.
Además, las PTPasa no de transmembrana que contienen dominios SH2 son conocidas y se refiere a ellas como SH-PTP1 y SH-PTP2 (Neel, Cell Biology 4:419-432, 1993). La SH-PTP1 es idéntica a PTP1C, HCP o SHP, y la SH-PTP2 se conoce también cómo PTP1D o PTP2C. La SH-PTP1 se expresa a altos niveles en células hematopoyéticas de todos los linajes y de todos los estados de diferenciación. Dado que se ha identificado al gene SH-PTP1 como el responsable del fenotipo de ratones motheaten (me), éste proporciona una base para predecir los efectos de los inhibidores que bloquearían su interacción con su sustrato celular. Por lo tanto, se esperaría que la inhibición de la función SH-PTP1 resultara en respuestas de célula T menoscabadas a la estimulación mitogénica, una función celular NK disminuida y un agotamiento de los precursores de célula B con aplicaciones terapéuticas potenciales como se ha descrito anteriormente.
Diabetes: En la diabetes de tipo 2 (no dependiente de insulina), las tirosina fosfatasas (SH-PTP2) compensan el efecto de las quinasas del receptor de insulina activadas y pueden representar objetivos importantes para las drogas. Los experimentos in vitro demuestran que la inyección de PTPasa bloquea la fosforilación estimulada por la insulina de los residuos tirosilo de las proteínas endógenas. Por lo tanto, los inhibidores podrían servir para modular la acción de la insulina en la diabetes.
Regeneración neural: Los factores de crecimiento glial son ligandos que son activadores específicos de la tirosina quinasa del receptor de erb-B2 (p185^{erbB2}) para promover la fosforilación de la tirosina y las respuestas mitogénicas de las células de Schwann. Consecuentemente, la regulación de la fosforilación de la tirosina mediante la alteración de la actividad en las células de Schwann luego de una lesión nerviosa podría ser una estrategia terapéutica de importancia. Los inhibidores de la actividad de señalización de erb-B2 podrían tener un papel significativo en el tratamiento de tumores con origen en las células gliales.
Otra clase de miméticos de hoja beta son inhibidores de las proteínas quinasas, las que incluyen las proteínas tirosina quinasas y las serina/treonina quinasas.
En la actualidad, se ha caracterizado una amplia gama de sustratos celulares para los receptores del factor de crecimiento polipeptídico que poseen una actividad intrínseca de la tirosina quinasa. Aunque los numerosos miembros de la familia de los receptores tirosinaquinasas (RTK) son tremendamente diversos, los mecanismos e señalización utilizados por estos receptores comparten muchas características comunes. Los estudios bioquímicos y de genética molecular han demostrado que el enlace del ligando al dominio extracelular de los RTK activa rápidamente la actividad catalítica intrínseca de las tirosina quinasas del dominio intracelular. La actividad incrementada resulta en la fosforilación específica de la tirosina de diversos sustratos intracelulares que contienen una secuencia motif común. Por lo tanto, esto causa la activación de numerosas moléculas de señalización ubicadas corriente abajo y una cascada de rutas intracelulares que regulan el metabolismo fosfolípido, el metabolismo araquidonato, la fosforilación de proteínas (que implica otras proteínas quinasas), la movilización del calcio y la regulación transcripcional. La actividad de las tirosina quinasas dependiente del factor de crecimiento del dominio citoplásmico de los RTK es el mecanismo principal de generación de señales intracelulares que inician respuestas celulares múltiples. Por lo tanto, los inhibidores que servirían como sustratos alternativos o como inhibidores de la actividad de las tirosina quinasas tiene el potencial de bloquear esta señalización.
Se pueden reconocer muchas de las subfamilias de los RTK basándose en las similitudes arquitecturales del dominio catalítico así como en los motifs distintivos en las regiones extracelulares de enlace de ligandos. Basándose en estas consideraciones estructurales, se ha desarrollado una nomenclatura que define diversas subfamilias de los RTK, donde cada una de las cuales contiene varios miembros (Hanks, Curr. Opin. Struc. Biol. 1:369-383, 1991; Ullrich, A., and Schlessinger, J. Cell 61:203-212, 1990). Ejemplos de subfamilias de receptores a las que se refiere basándose en sus miembros prototípicos incluyen: el receptor de EGF, el receptor de insulina, el factor de crecimiento derivado de plateletas (receptor PDGF por sus siglas en inglés), los receptores, del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR por sus siglas en inglés), el receptor TRK y los receptores EPH/ECK. Los miembros de cada una de estas subfamilias representan dianas moleculares para el desarrollo de inhibidores miméticos que podrían bloquear la actividad de las tirosina quinasas y evitar la transducción de señales intracelulares. A continuación se identifican diversas áreas terapéuticas en las cuales estas dianas serían de valor.
Cáncer: Además de mediar el crecimiento celular normal, los miembros de la familia EGFR de los RTK frecuentemente se sobreexpresan en una diversidad de carcinomas epiteliales agresivos y esto se cree que contribuye directamente al desarrollo de tumores malignos. Diversos estudios han demostrado que la familia EGFR se amplifica frecuentemente en ciertos tipos de tumores, incluyendo glioblastomas, carcinomas escamosos y tumores cerebrales (Wong et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 84:6899-6903, 1987). Además, HER2/p185^{erbB2} (al que en la rata se refiere alternativamente como "neu"), HER3/p160^{erbB3}, HER4/p180^{erbB4} (Plowman, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1746-1750 (1993) son tres RTK que tienen una extensa homología de secuencia de aminoácidos a la EGFR. HER2/p185^{erbB2} es frecuentemente amplificado y sobreexpresado en los tumores de pecho y carcinomas de los ovarios en los humanos (Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6899-6903, 1987), y esta amplificación se correlaciona con una mala prognosis para el paciente. La sobreexpresión simultánea de p185^{neu} y de EGFR sinérgicamente transforme los fibroblastos de los roedores y esta condición se observa a menudo en los cánceres humanos. Finalmente, la expresión de HER3 se amplifica en una diversidad de adenocarcinomas humanos. Se conocen diversos inhibidores que demuestran una actividad inhibitoria in vitro contra EGFR y bloquean la proliferación celular dependiente de EGF lo que indica un potencial terapéutico para los compuestos con esta actividad. Además, en la leucemia miellógena crónica humana, la actividad incrementada de las tirosina quinasas subyace la enfermedad como una consecuencia de la activación del protooncógeno c-abl célular. Los inhibidores funcionarían como agentes anticancerígenos.
Angiogénesis: En la actualidad, hay al menos siete miembros de FGFR que median un arreglo variado de respuestas biológicas, incluyendo la capacidad de inducir la angiogénesis. Además, se ha propuesto que un grupo de los RTK con siete lgLs representan una subfamilia separada. Sus miembros conocidos, FLT1, FLK1 y FLT4, muestran una similitud estructural y de expresión. Estos receptores median las acciones del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF por sus siglas en inglés, Vascular Endothelial Growth Factor). Diversos tipos de evidencia indican que esta subfamilia de receptores del factor de crecimiento desempeña un papel importante en la formación de los vasos sanguíneos. Dado que la formación de vasos sanguíneos es un proceso reactivado por los tumores para poder suministrar oxígeno a estas células, los miméticos de cadena beta que inhiben estas actividades quinasa del factor de crecimiento podrían servir para suprimir el crecimiento del tumor por medio de la inhibición de la angiogénesis.
Reestenosis: El receptor PDGF es de gran interés como un objetivo para la inhibición en el campo cardiovascular ya que se cree que desempeña un papel significativo en la reestenosis, luego de angioplasias coronarias de globos, y también en la ateroesclerosis. La liberación de PDGF por las plateletas en las superficies dañadas de los vasos sanguíneos resulta en la estimulación de los receptores de PDGF en las células musculares lisas vasculares y en un eventual engrosamiento neointimal. Un inhibidor mimético de la actividad quinasa evitaría la proliferación y conduciría a un mayor número de resultados exitosos de este procedimiento quirúrgico.
Muchos componentes de las rutas de transducción de señales implican la fosforilación de residuos serina/treonina (ser/thr) de los sustratos de proteína. Alguno de estos sustratos son en sí mismos proteínas quinasas cuya actividad se modula por la fosforilación. Dos prominentes proteínas ser/thr quinasas específicas desempeñan un papel central en la transducción de señales: la proteína quinasa A (PKA, por sus siglas en inglés) dependiente de la AMP cíclica y la proteína quinasa C (familia PKC). Numerosas otras serina/treonina quinasas específicas, incluyendo la familia de proteínas quinasas activadas por mitógeno (MAP, por sus siglas en inglés) sirven como importantes proteínas de transducción de señales que se activan en la señalización tanto del receptor del factor de crecimiento como del receptor de citoquinas. Otras proteína ser/thr quinasas importantes para la señalización intracelular son la proteína quinasa dependiente del calcio (CaM-quinasa II) y el protooncógeno c-raf.
La PKC desempeña un papel crucial en la transducción de señales en la superficie celular para controlar una diversidad de procesos fisiológicos (Nishizuka, Nature 334:661-665, 1988) y representa una familia grande de isoenzimas que difieren en su estructura y expresión en los diferentes tejidos, así como en su especificidad con respecto a sustratos (Hug and Sarre, Biochem J. 291:329-343, 1993). La clonación molecular ha demostrado al menos ocho isoenzimas. Debido a esta diversidad y expresión diferenciada, la activación de las isoenzimas individuales produce diferentes respuestas específicas para cada célula: la estimulación del crecimiento, la inhibición de la diferenciación o la inducción de la misma. Debido a su capacidad de estimular la proliferación celular, representa una diana para el desarrollo de drogas anti cancerígenas (Powis, Trends. in Pharm. Sci. 12:188-194, 1991). La sobreexpresión, de las isoenzimas PKC en las células de los mamíferos se correlaciona con la expresión incrementada de protooncógenos tempranos tales como c-jun, c-fos, c-myc y una línea celular sobreexpresante ha dado lugar a tumores en ratones desnudos.
Las aplicaciones terapéuticas dentro del área de la regulación inmune son obvias dado que la activación de las células T por antígenos implica la activación de la PKC. La PKC activada subsecuentemente activa una rama de la cascada de señales que es necesaria pare la activación transcripcional de NF-\kappaB, la producción de IL-2 y, en última instancia, la proliferación de células T. Los inhibidores que bloquean la señalización a través de esta ruta han demostrado prevenir la activación de células T. Por lo tanto, los miméticos que. funcionaran como inhibidores de PKC en las células T bloquearían la señalización y servirían como posibles inmunospresores útiles en el rechazo de injertos o como agentes anticancerígenos en las leucemias linfocíticas. Los activadores de PCK causan edema e inflamación en la piel de ratones (Hennings et al., Carcinogenesis 8:1342-1346, 1987) y, por lo tanto, también se espera que los inhibidores sirvan como compuestos antiinflamatorios potentes. Estos activadores antiinflamatorios podrían ser útiles para el asma, la artritis y otros procesos mediados por inflamación. Además, la estaurosporina y sus análogos, UCN01 y CGP4125, que han sido caracterizados como inhibidores potentes de PKC in vitro, tienen actividad antitumoral en modelos animales (Powis, Trends in Pharm. Sci. 12:188-194, 1991), y ciertos compuestos relacionados están siendo considerados para realizar ensayos clínicos.
Con respecto a la inhibición de proteasas, la Catepsina B es una cisteína proteasa lisosómica normalmente implicada en el procesamiento proenzimático y en la renovación de proteínas. Niveles elevados de actividad han sido implicados en la metástasis de tumores (Sloane, B.F. et al., "Cathepsin B and its endogenous inhibitors: the role in tumor malignancy", Cancer Metastasis Rev. 5:333-352, 1990), la artritis reumatoidea (Werb, Z. "Proteinasea and matrix degradation", en Textbook de Rheumatology, Keller, W.N.; Harris, W.D.; Ruddy, S.; Sledge, C.S., Eds., 1989, W.B. Saunder Co., Philadelphia, PA, pp. 300-321) y la distrofia muscular (Katunuma N. & Kominami E., "Abnormal expression of lysosomal cysteine proteinases in muscle wasting diseases", Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 108:1-20, 1987).
Las calpaínas son proteasas citosólicas o vinculadas a una membrana activadas por Ca^{++} que son responsables del deterioro de las proteínas citoesqueléticas en respuesta a un cambio de los niveles de calcio dentro de la célula. Las mismas contribuyen al deterioro de los tejidos en la artritis y la distrofia muscular (see Wang K.K. & Yuen P.W., "Calpain inhibition: an overview ofits therapeutic potential", Trends Pharmacol. Sci. 15:412-419, 1994).
La enzima convertidora de interleucina (ICE por sus siglas en inglés, Interleukin Converting Enzyme) escinde pro- IL-1 beta a IL-1 beta, un mediador clave de la inflamación y, por lo tanto, los inhibidores de ICE pueden probar ser útiles en el tratamiento de la artritis (véase, por ejemplo, Miller B.E. et al., "Inhibition of mature IL-1 beta production in murine macrophages and a murine model of inflammation by WIN 67694, an inhibitor of IL-1 beta converting enzyme", J. Immunol. 154:1331-1338, 1995). Las proteasas ICE o similares a ICE pueden también operar en la apoptosis (la muerte celular programada) y, por consiguiente, desempeñar un papel en el cáncer, el SIDA, la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades en las cuales se encuentra implicada una apoptosis sin regulación (véase, Barr, P.J.; Tomei, L.D., "Apoptosis and its Role in Human Disease", Biotechnol. 12:487-493, 1994).
La proteasa del VIH desempeña un papel clave en el ciclo de vida del VIH, el virus del SIDA. En las etapas finales de la maduración vírica, esta proteasa escinde los precursores poliproteicos a las enzimas funcionales y proteínas estructurales del núcleo del virión. Los inhibidores de la proteasa del VIH fueron identificados rápidamente como un objetivo terapéutico excelente para el tratamiento del SIDA (véase Huff, J.R., "HIV protease: a novel chemotherapeutic target for AIDS", J. Med. Chem. 34:2305-2314) y ya han demostrado ser útiles en dicho tratamiento como lo prueba la reciente aprobación de ritonavir, Crixivan, y saquinavir por parte de la FDA.
La enzima convertidora de angiotensina (ACE por sus siglas en inglés, Angiotensin converting enzyme) es parte del sistema renina-angiotensina que desempeña un papel central en la regulación de la presión sanguínea. La ACE escinde la angiotensina I al octapéptido angiotensina II, un agente potente de presión debido a su actividad vasoconstrictora. La inhibición de la ACE ha demostrado ser terapéuticamente útil en el tratamiento de la hipertensión (Williams, G.H., "Converting-enzyme inhibitors in the treatment of hypertension", N. Engl. J. Med. 319:1517-1525, 1989.
Las colagenasas escinden el colágeno, el constituyente principal de la matriz extracelular (por ejemplo, el tejido conectivo, la piel, los vasos sanguíneos). Una actividad elevada de colagenasa contribuye a la artritis (Krane S.M. et al., "Mechanisms of matrix degradation in rheumatoid arthritis", Ann. N.Y. Acad. Sci. 580:340-354, 1990.), la metástasis de tumores (Flug M. & Kopf-Maier P., "The basement membrane and its involvement in carcinoma cell invasion", Acta Anat. Basel 152:69-84, 1995), y otras enfermedades que implican el deterioro del tejido conectivo.
Las serina proteasas similares a la tripsina forman una familia grande de enzimas altamente selectivas implicadas en la hemostasis/coagulación (Davie, E.W. and K. Fujikawa, "Basic mechanisms in blood coagulation", Ann. Rev. 799-829, 1975) y la activación del complemento (Muller-Eberhard, H.J., "Complement", Ann. Rev. Biochem. 44:697-724, 1975). El secuenciamiento de estas proteasas ha demostrado la presencia de un núcleo homólogo similar a la tripsina con inserciones de aminoácidos que modifican la especificidad y que son generalmente responsables de las interacciones con otros componentes macromoleculares (Magnusson et al., "Proteolysis and Physiological Regulation", Miami Winter Symposia 11:203-239, 1976).
La trombina, una serina proteasa similar a la tripsina, actúa para proporcionar una proteiólisis limitada, tanto en la generación de fibrina a partir de fibrinógeno como en la activación del receptor de plateletas y, por lo tanto, desempeña un papel crítico en la trombosis y la hemostasis (Mann, K.G., "The assembly of blood clotting complexes on membranes", Trends Biochem. Sci. 12:229-233, 1987). La trombina exhibe una especificidad destacada en la separación de los fibrinopéptidos A y B del fibrinógeno por medio de la escisión selectiva df sólo dos enlaces Arg-Gly de las 181 secuencias Arg- o Lys-Xaa en el fibrinógeno (Blomback, H., Blood Clotting Enzymology, Seeger, W.H. (ed.), Academic Press, New York, 1967, pp. 143-215).
Muchos estados enfermos de importancia están relacionados con la hemostasis anormal, incluyendo los síndromes coronarios agudos. La aspirina y la heparina son ampliamente utilizadas en el tratamiento de pacientes con síndromes coronarios agudos. Sin embargo, estos agentes tienen varias limitaciones intrínsecas. Por ejemplo la trombosis que complica la ruptura de las placas ateroescleróticas tiende a ser un proceso mediado por trombina y dependiente de las plateletas que es relativamente resistente a la inhibición por parte de la aspirina y la heparina (Fuster et al., "The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes", N. Engl. J. Med. 326:242-50, 1992).
Los inhibidores de la trombina evitan in vivo la formación del trombo en los sitios de la lesión vascular. Más aún, ya que la trombina es también un factor de crecimiento potente que inicia la proliferación celular en los músculos lisos en los sitios de la lesión mecánica de la arteria coronaria, los inhibidores bloquean esta respuesta proliferativa celular del músculo liso y reduce la reestenosis. Los inhibidores de la trombina también reducirían la respuesta inflamatoria en las células vasculares (Harker et al., Am. J. Cardiol. 75:12B-16B, 1995).
Más aún, al menos dos factores de transcripción bien definidos, el factor nuclear (NF, por sus siglas en inglés) \kappaB y la proteína activadora (AP-1), están regulados por el estado de oxidación-reducción (redox) intracelular. La regulación de la expresión génica por el estado redox presenta implicancias terapéuticas prometedoras. Por ejemplo, los sitios de enlace de los factores de transcripcign NF-\kappaB y AP-1 regulados por el estado redox están ubicados en la región promotora de una amplia gama de genes que se encuentran directamente implicados en la patogénesis de enfermedades tales como el SIDA, el cáncer, la ateroesclerosis y las complicaciones diabéticas (Sen and Packer, FASEB Journal 10:709-720, 1996). Más específicamente, el enlace de los factores de transcripción tales como NF-\kappaB y AP-1 a los sitios consenso del ADN está conducida por la homeostasis oxidante-antioxidante, especialmente por el equilibrio tiol-disulfuro.
En el caso de NF-\kappaB, un tiol fisiológicamente relevante que desempeña un papel crucial en la regulación de la función NF-\kappaB es la tioredoxina reducida. La tioredoxina es una proteína oxidoreductasa importante con funciones antioxidantes. Se ha encontrado que la misma regula hacia arriba el enlace al ADN del NF-\kappaB activado y por lo tanto aumenta la expresión génica (Schenk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1672-1676, 1994). La tioredoxina ha sido implicada en la reducción del NF-\kappaB citosólico activado (específicamente, la reducción de cys-62), lo que puede entonces contribuir a su translocación nuclear y al enlace al ADN (Hayashi et at., J. Biol. Chem. 268:11380-11388, 1993).
Se ha determinado también que la actividad enlazante al ADN de Fos y Jun en el complejo AP-1 está regulada por el estado redox (Abate et al., Science 249:1157-1162, 1990). Cada proteína contiene una única cisteína conservada (flanqueada por lisina y arginina) en su dominio de enlace al ADN. Este tiol no parece ser parte de un enlace disulfuro y puede existir como ácido sulfénico o sulfínico en, su forma oxidada. Ref-1, una proteína nuclear bifuncional que también posee actividad endonucleasa reparadora de ADN, estimula el enlace de AP-1 al ADN mediante la reducción de esta cisteína regulatoria. Un Fos mutante en el cual se reemplazó la cisteína crítica con serina indujo la triplicación de la actividad de enlace al ADN de AP-1 y no estuvo más sujeto al control redox (Okuno et al., Oncogene 8:695-701, 1993). Por lo tanto, dado que al menos cuatro miembros de la familia fos, tres de la familia jun y al menos 4 de la familia ATF/CREB de los factores de transcripción contienen esta cisteína conservada, el control redox de los factores de transcripción parece ser ampliamente difundido.
Como se ha mencionado anteriormente, la regulación de los factores de transcripción tales como NF-\kappaB y AP-1 tienen importantes implicancia terapéuticas. Por ejemplo, AP-1 es un mediador importante de la producción de tumores )Yoshioka et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 92:4972- 4976, 1995). Por lo tanto, los compuesto que reprimen la actividad transcripcional del AP-1 son útiles en el tratamiento del cáncer. Más aún, debido a sutpapel directo en la regulación de las respuestas a las citoquinas y endotoxinas inflamatorias, la activación de NF-\kappaB desempeña un importante papel en el desarrollo de enfermedades crónicas tales como la artritis reumatoidea y condiciones agudas tales como el shock séptico. Se cree que enfermedades autoinmunes tales como el lupus sistémic eritromatoso (SLE por sus siglas en inglés) y la enfermedad de Alzheimer también están implicadas en la activación del NF-\kappaB. Similarmente, el NF-\kappaB desempeña un papel importante en la activación de la expresión génica del VIH. Además, otras condiciones que se creen implican al NF-\kappaB incluyen la gripe (flu), la ateroesclerosis, la oncogénesis y la ataxia-telangiectasia (AT).
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Las proteínas que contienen dominios PDZ constituyen un objetivo potencial adicional para los miméticos de hoja beta. Estos dominios de 80 a 100 residuos de aminoácidos median las interacciones de proteína a proteína uniéndose a una secuencia consenso X-Ser/Thr-X-Val en la misma terminal carboxilo de las proteínas. Hay también ejemplos de interacciones de proteínas por medio de dominios PDZ que son internas (no en la terminal C). Se ha determinado la estructura cristalina de los dominios PDZ ligantes y no ligantes, los que demostraron tener una estructura de seis cadenas beta y dos hélices alfa que se une a la secuencia consenso del polipéptido de reconocimiento a través de una conformación de hoja beta. Por lo tanto, la evaluación de los miméticos de hoja beta apropiados debería ser una estrategia válida para dirigirse a proteínas que contengan dominios PDZ. Las dianas de las proteínas que contienen dominios PDZ son diversas pero importantes en la transducción de señales. La PSD-95, una guanilato quinasa asociada a membranas contiene tres dominios PDZ, dos de los cuales tienen como objetivo el canal tipo K de Shaker y el receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA por sus siglas en inglés) lo que resulta en su aglomeración que es requerida para su funcionamiento. La PTPLl/FAPl, una proteína tirosina fosfatasa, tiene cinco dominios PDZ, dos de los cuales interactúan con Fas, una proteína de transmembrana de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral que media la apoptosis en muchos tipos de células. Por lo tanto los compuestos que tengan como objetivo proteínas que contengan los dominios PDZ pueden probar ser útiles como agentes
anticancerígenos.
WO 95/35308 divulga inhibidores de la enzima que convierte la interleuquina-1 \beta.
WO 96/19483 divulga inhibidores de la trombina bicíclicos de bajo peso molecular.
WO 96/20705 divulga imidas/amidas immunoterapeuticas y su uso para reducir los niveles de TNF\alpha.
WO 95/01348 divulga imidas conio inhibidores del TNF\alpha.
US-A-4 230 709 divulga un método para tratar el asma con hidantoínas de alquilo, alquilideno y alquileno.
EP-A-0 229 370 divulga un derivado éster del ácido guanidinonbenzoico, un proceso para preparar el mismo y composiciones farmacéuticas que lo contienen.
EP-A-0 024 309 divulga la preparación de medicamentos para la inhibición de la enzima que convierte la angiotensina (A0E por sus siglas en inglés).
EP-A-0 133 038 divulga derivados del ácido octahidroindolizinpropanoico como inhibidores de enzimas.
Merck Index 1989, p.353, 2276 divulga Cilazapril para la inhibición de la enzima que convierte la angiotensina (ACE).
J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1984, (2), 155 divulga el diseño y la síntesis de derivados nuevos de la triazol, pirazol y piridazo-piridazina como inhibidores de las enzimas que convierten la angiotensina.
FEBS Lett. 1984, 165(2), 201 divulga inhibidores de la enzima que convierte la angiotensina.
WO 97/05160 divulga derivados bicyclic lactamo bicíclicos, como inhibidores de la trombina.
WO 96/30035 divulga miméticos de hoja beta como inhibidores de péptidos o proteínas biológicamente activos.
WO 96/30396 divulga miméticos de hoja beta y el uso de los mismos como inhibidores de proteasas.
En vista del importante papel biológico desempeñado por la hoja beta, se necesitan en la técnica compuestos que puedan estabilizar la estructura intrínseca de hoja beta de péptidos, proteínas o moléculas sintéticas o que ocurran naturalmente. Existe también la necesidad en la técnica de producir estructuras de hoja beta estables, así como del uso de dichas estructuras estabilizadas para efectuar o modificar eventos biológicos de reconocimiento que impliquen las estructuras de hoja beta. La presente invención llena esas necesidades y proporciona ventajas adicionales
conexas.
Resumen de la divulgación
Brevemente, la presente divulgación está dirigida a miméticos de hoja beta y al uso de los mismos, incluido el uso para la fabricación de un medicamento para lograr efectos terapéuticos en un animal de sangre caliente por medio de la inhibición de la proteasa, la inhibición de la quinasa y/o la regulación de un factor de transcripción. Los efectos terapéuticos se logran mediante la administración al animal de sangre caliente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un mimético de hoja beta incluyendo un sistema de anillos bicíclico, caracterizado en que el mimético de hoja beta tiene la estructura general (I) (incluyendo las sales farmacéuticamente aceptables del mismo):
1 
\vskip1.000000\baselineskip
caracterizado en que
A se selecciona de -C(=O)-, -(CH_{2})_{0-4}-, -C(=O)(CH_{2})_{1-3}-, -(CH_{2})_{1-2}O- y -(CH_{2})_{1-2}S-;
B se selecciona de N y CH;
C se selecciona de -C(=O)-, -C (=O)(CH_{2})_{1-3}-, -(CH_{2})_{0-3}-, -O-, -S-, -O-(CH_{2})_{1-2}- y -S(CH_{2})_{1-2}-;
D se selecciona de N y C(R_{4});
E se selecciona de 
\hskip0.5cm
--- 
\delm{C}{\delm{\para}{NHZ}}
(R_{1}) ---, 
\hskip0.5cm
--- 
\delm{N}{\delm{\para}{Z}}
--- 
\hskip0.5cm
y 
\hskip0.5cm
--- 
\delm{C}{\delm{\para}{Z}}
--- ( R_{1})
F es una porción carbonilo opcional;
R_{1}, R_{2}' y R_{4} se seleccionan independientemente de porciones de cadena lateral de aminoácidos y derivados de las mismas;
R_{2} se selecciona de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de la misma, o tomado en conjunto con C forma un anillo fusionado homocíclico o heterocíclico, sustituido o no sustituido;
R_{3} se selecciona de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de la misma, o tomado en conjunto con C forma una porción fuente seleccionada de -(CH_{2})_{1-2} -, -O- y -S-;
Y y Z representa el resto del la molécula; y dos grupos CH adyacentes cualesquiera del anillo bicíclico pueden formar un doble enlace.
En un aspecto donde F (es decir, la porción carbonilo opcional) está presente y E es -N(Z)-, los compuestos de esta invención incluyen la siguiente estructura (II):
2
caracterizada en que A, B, C, D, R_{2}, R_{2}', R_{3}, Y y Z son como se define anteriormente con relación a la estructura (I).
En un aspecto preferido, A es ya sea -C(=O)- o - (CH_{2}) - y C es - (CH_{2})_{2}-, como se representa por las siguientes estructuras (IIa) y (IIb):
3
En este aspecto, el anillo de seis miembros puede ser saturado o no saturado (incluso aromático). Por ejemplo, cuando B y D de las estructuras (IIa) y (IIb) son ambas - CH- (y por lo tanto constituyen grupos CH adyacentes que pueden formar un doble enlace), los compuestos de este invención incluyen las siguientes estructuras aromáticas (IIc) y (IId):
\vskip1.000000\baselineskip
4
Similarmente, los siguientes compuestos no saturados que tienen las estructuras (IIe) y (IIf) son también representativos de los compuestos de estructuras (IIa) y (IIb):
\vskip1.000000\baselineskip
5
En otro aspecto donde F está presente y E es - C(R_{1})(NHZ)-, los compuestos de este invención incluyen la siguiente estructura (III):
\vskip1.000000\baselineskip
6
caracterizada en que A, B, C, D, R_{1}, R_{2}, R_{2}', R_{3}, Y y Z son como se definen anteriormente con relación a la estructura (I).
En un aspecto preferido, A ese ya sea -C(=O)- o -(CH_{2})- y C es -(CH_{2})_{2}-, como se representa mediante las siguientes estructuras (IIIa) y (IIIb):
\vskip1.000000\baselineskip
7
En este aspecto, el anillo de seis miembros puede ser saturado o no saturado (incluso aromático). Por ejemplo, cuando B y D de las estructuras (IIIa) y (IIIb) son ambas -CH- (y por lo tanto constituyen grupos CH adyacentes que pueden formar un doble enlace), los compuestos de esta invención incluyen las siguientes estructuras aromáticas (IIIc) y (IIId):
\vskip1.000000\baselineskip
8
Similarmente, los siguientes compuestos no saturados que tienen las estructuras (IIIe) y (IIIf) son también representativos de los compuestos de las estructuras (IIIa) y (IIIb):
\vskip1.000000\baselineskip
9
En otro aspecto, A es -(CH_{2})_{0}-, D es N y la porción carbonilo opcional F está preente, como se representa por la siguiente estructura (IIIg):
\vskip1.000000\baselineskip
10
caracterizada en que B, C, R_{1}, R_{2}, R_{3}, Y y Z son como se definen anteriormente.
En aún otro aspecto adicional, A es -(CH_{2})-, C es -(CH_{2})_{2}-, D es N y F está presente, como se representa mediante la siguiente estructura (IIIh):
\vskip1.000000\baselineskip
11
En un aspecto adicional donde F está presente y E es -C(R_{1})(Z)-, los compuestos de este invención incluyen la siguiente estructura (IV):
\vskip1.000000\baselineskip
12
caracterizada en que A, B, C, D, R_{1}, R_{2}, R_{2}', R_{3}, Y y Z son como se definen anteriormente en relación con la estructura (I).
En un aspecto preferido, A es ya sea -(C=O)- o -(CH_{2})- y C es -(CH_{2})_{2}-, como se representa mediante las siguientes estructuras (IVa) y (IVb):
\vskip1.000000\baselineskip
13
En este aspecto, el anillo de seis miembros puede ser saturado o no saturado (incluso aromático). Por ejemplo, cuando B y D de las estructuras (IVa) y (IVb) son ambas -CH- (y por lo tanto constituyen grupos CH adyacentes que pueden formar un doble enlace), los compuestos de este invención incluyen las siguientes estructuras aromáticas (IVc) y (IVd):
\vskip1.000000\baselineskip
14
Similarmente, los siguientes compuestos no saturados que tienen las estructuras (IVe) y (IVf) son también representativos de los compuestos de las estructuras (IVa) y (IVb):
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\newpage
En un aspecto adicional donde F no está presente y E es ya sea -N(Z)-, -C(R_{1})(NHZ)- o -C(R_{1})(Z)-, los compuestos de este invención incluyen las siguientes estructuras (V), (VI) y (VII):
16
caracterizadas en que A, B, C, D, R_{1}, R_{2}, R_{2}', R_{3}, Y y Z son como se definen anteriormente en relación con la estructura (I).
En todavía otro aspecto adicional donde R_{3} tomado conjuntamente con C forma una porción puente, los compuestos de esta invención incluyen la siguiente estructura (VIII):
17
donde X es una porción puente seleccionada de -(CH_{2})_{1-2}-, -O- y -S-, y A, B, C, D, E, F, R_{2}, R_{2}', Y y Z son como se definen anteriormente en relación con la estructura (I).
En un aspecto donde F está presente, A es -C(=O)-, C es -(CH_{2})_{2}- y E es ya sea -N(Z) - o -C(R_{1})(NHZ)-, los compuestos incluyen aquellos de las siguientes estructuras (VIIIa) y (VIIIb):
18
En todavía otro aspecto adicional, R_{2} tomado conjuntamente con C forma un anillo fusionado como se representa mediante la estructura (IX):
19
caracterizada en que A, B, C, D, E, R_{2}, R_{2}' y R_{3} y Y son como se definen anteriormente.
\newpage
En un aspecto, R_{2} y C tomados en conjunto forman un anillo fusionado de 5, 6 o siete miembros como se representa mediante las estructuras (IXa) y (IXb):
20
caracterizadas en que A, B, D, E, R_{2}', R_{3} y Y son como se definen anteriormente.
Estos y otros aspectos de esta invención serán evidentes por referencia a la descripción detallada siguiente.
De acuerdo con la presente invención, se proporcionó un compuesto que tiene la estructura siguiente:
21 
\vskip1.000000\baselineskip
y sales farmacéuticamente aceptables del mismo,
caracterizado en que
B se selecciona de N y CH; G es CH2;
D se selecciona de N y C(R_{4});
R se selecciona de 
\hskip0.5cm
--- 
\delm{N}{\delm{\para}{Z}}
--- 
\hskip0.5cm
y 
\hskip0.5cm
--- 
\delm{C}{\delm{\para}{Z}}
--- (R_{1});
R_{1} y R_{4} son independientemente seleccionados de porciones de cadena lateral de aminoácidos y derivados de las mismas;
R_{2}' se selecciona de (=O) y porciones de cadena lateral de aminoácidos y derivados de los mismos;
R_{2} se selecciona de una porción de cadena lateral de aminoácidos de las mismas, o conjuntamente con G forma un anillo fusionado homocíclico o heterocíclico, sustituido o no sustituido;
R_{3} se selecciona independientemente de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de la misma, o conjuntamente con G forma una porción puente seleccionada de -(CH_{2})_{1-2}, -O- y -S-;
Y y Z representan el resto de la molécula; y dos grupos CH adyacentes cualesquiera del anillo bicíclico pueden formar un doble enlace;
donde Z se selecciona a partir de una porción de cadena lateral de aminoácidos y derivados de la misma, un aminoácido, un péptido, una proteína, un mimético de hoja beta, una porción terminal o un grupo protector; y
donde Y se selecciona de fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo y derivados substituidos de porciones alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}, donde el sustituyente se selecciona de una o más de las siguientes porciones químicas: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, -SO_{2}H, -SOR y halógeno, donde en cada una de sus apariciones R se selecciona independientemente de porciones alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}; o
Y se selecciona de -H, -R, -SO_{2}R, -SOR, -SO_{2}NHR, -CF_{3}, -C_{2}F_{5}, -NHOH, -NHNHR, -C(=O)H, -C(=O)R, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)OR, -C(=O)CH_{2}OR, -C(=O)NHR, -CH_{2}X', -C(=O)CH_{2}X', 2200 2201 2202 2203 2204
2205 2206 2207 2208
-C(=O)CH=CHC(=O)OH, -C(=O)CH=CHC(=O)R, -C(=O)CH=CHC(=O)OR, -C(=O)CH=CHC(=O)NRR, -CH(OH)CH=CHC(=O)OH, -CH(OH)CH=CHC(=O)R, -CH(OH)CH=CHC(=O)OR, -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR, -CH=CH SO_{2}R y -SO_{2}CH=CHR (donde X' es Cl, F, Br o I, y en cada una de sus apariciones R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, una porción arilo C_{6-12} o una porción aralquilo C_{7-12} o una porción heterocíclica; o
los grupos Y tiene la estructura:
23
donde los grupos R_{4} son porciones organoaminas que tienen de 2 a 10 átomos de carbono y al menos un átomos de nitrógeno; y
R_{5} se selecciona de (a) alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con de uno a cuatro sustituyentes halógeno, alcoxi C_{1-5} y nitro, (b) -C(=O)NH-alquilo C_{1-5}, donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido con halógeno o alcoxi C_{1-5}, (c) -C(=O)NH-aralquilo C_{1-10} donde el grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta cinco grupos independientemente seleccionados de nitro, halógeno, -NH-(C=O) alquilo C_{1-5}, -NH- (C=O) arilo C_{6-10}, alquilo C_{1-5} y alcoxi C_{1-5}, y (d)heteroarilo mono y bicíclico de cuatro a 11 átomos en el anillo, donde los átomos en el anillo se seleccionan de carbono y los heteroátomos oxígeno, nitrógeno y azufre, y donde el anillo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta cuatro sustituyentes halógeno, alquilo C_{1-5}, alcoxi C_{1-5}, -C(=O)NH-alquilo C_{1-5}, -(C=O)NHarilo C_{6-10}, amino, -C(=O)O alquilo C_{1-5} y -C(-=O)Oarilo C_{6-10};
o Y es una porción química seleccionada a partir de un aminoácido, un péptido, una proteína, un mimético de hoja beta o un grupo protector,
donde el compuesto no es:
24
la invención también proporciona el uso de un compuesto de acuerdo con la presente invención para la fabricación de un medicamento para inhibir una proteasa o quinasa en un animal de sangre caliente que lo necesite.
Además, la presente invención proporciona el uso de un compuesto da acuerdo con esta invención para la fabricación de un medicamento para regular un factor de transcripción en un animal de sangre caliente que lo necesite.
Realizaciones preferidas adicionales de la presente invención se especifican en las reivindicaciones dependientes.
Descripción detallada de la invención
Como se ha mencionado con anterioridad, la hoja beta es un componente estructural importante para muchos eventos de reconocimiento biológico. Los miméticos de hoja beta de esta invención sirven para impartir y/o estabilizar la estructura de hoja beta de péptidos, proteínas o moléculas naturales o sintéticos, particularmente con respecto a la estabilidad conformacional. Además, los miméticos de hoja beta de esta invención son más resistente a la ruptura proteolítica, por lo tanto, haciendo al péptido, proteína o molécula que los contienen más resistente al deterioro. El mimético de hoja beta puede posicionarse tanto en la terminal C como en la terminal N de la proteína, péptido o molécula, o puede ubicarse dentro de la proteína, péptido o molécula misma, y se puede incorporar más de un mimético de hoja beta de la presente invención en una proteína, péptido o molécula.
Los miméticos de hoja beta de esta divulgación están representados en general por la estructura (I) precedente como en las estructuras (II) a (IX) que representan realizaciones más específicas. Los miméticos de hoja beta de esta invención pueden construirse para simular la conformación tridimensional de una hoja beta que comprenda aminoácidos L que ocurran en la naturaleza así como la estructura de una hoja beta que comprenda uno o más aminoácidos D. Por lo tanto, todas las estereoconformaciones de los miméticos de hoja beta de estructura (I) se encuentran dentro del alcance de esta invención.
Por ejemplo, los miméticos de hoja beta de estructura (II) incluyen las siguientes estructuras (II') y (II''):
25
Similarmente, los miméticos de hoja beta de la estructura (III) incluyen las siguientes estructuras (III') a (III''''):
26
Los miméticos de hoja beta de la estructura (IV) incluyen estas mismas configuraciones estéricas, pero con la porción "Z-NH" de la estructuras (III') a (III'''') reemplazadas por una porción "Z".
De la manera en que se usa en este documento, la expresión "porción de cadena lateral de aminoácidos" usada para definir las porciones R_{1}, R_{2}, R_{2}', R_{3} y R_{4} representa cualquier porción de cadena lateral de aminoácidos que se encuentre presente en las proteínas que ocurren naturalmente, incluyendo (entre otras) las porciones de cadena lateral de aminoácidos que ocurren naturalmente identificadas en la Tabla 1 a continuación. Otras porciones de cadena lateral que ocurren naturalmente de esta invención incluyen (entre otras) las porciones de cadena lateral de fenil-glicina, 3,5-dibromotirosina, 3,5-diyodotirosina, hidroxilisina, naftilalanina, tienilalanina, \gamma-carboxiglutamato, fosfotirosina, fosfoserina y aminoácidos glicosilados tales como la serina, asparagina y treonina glicosiladas.
TABLA 1
27
Además de las porciones de cadena lateral de aminiácido que ocurren en la naturaleza, las porciones de cadena lateral de aminiácido de esta invención también incluyen diversos derivados de las mismas. De la manera en que se usa en este documento, un "derivado" de una porción de cadena lateral de aminoácido incluye todas las modificaciones y/o variaciones de porciones de cadena lateral de aminoácido que ocurran naturalmente. Por ejemplo, las porciones de cadena lateral de aminoácido de alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilglicina y fenilalanina puede generalmente clasificarse como porciones alquilo, arilo o aralquilo de cadena corta. Los derivados de porciones de cadena lateral de aminoácido incluyen otras porciones alquilo, arilo o aralquilo de cadena corta, lineales o ramificadas, cíclicas o no cíclicas, sustituidas o no sustituidas, saturadas o no saturadas.
Como se usa en este documento, las "porciones alquilo de cadena corta" contienen de 1 a 12 átomos de carbono, las "porciones arilo de cadena corta" contienen de 6 a 12 átomos de carbono, y las "porciones aralquilo de cadena corta" contienen de 7 a 12 átomos de carbono. Por lo tanto, en una realización, el derivado de cadena lateral de aminoácido se selecciona de un alquilo C_{1-12}, un arilo C_{6-12} y un aralquilo C_{7-12} y, en una realización más preferida, de un alquilo C_{1-7}, un arilo C_{6-10} y un aralquilo C_{7-11}.
Los derivados de cadena lateral de aminoácido de esta invención incluyen además derivados sustituidos de porciones alquilo, arilo y aralquilo de cadena corta, donde el sustituyente se selecciona de (entre otras) una o más de los siguientes porciones químicas: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, -SO_{2}H, -SOR y halógeno (incluidos F, Cl, Br e I), donde en cada una de sus apariciones R se selecciona independientemente de una porción alquilo, arilo o aralquilo de cadena corta. Más aún, las porciones alquilo, arilo y aralquilo de cadena corta cíclicos de esta invención incluyen tanto naftaleno como compuestos heterocíclicos tales como tiofeno, pirrol, furano, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, 3-pirrolina, pirrolidina, piridina, pirimidina, purina, quinolina, isoquinolina y carbazol. Los derivados de cadenas laterales de aminoácidos incluyen además derivados heteroarlquilos de la parte alquilo de las porciones alquilo y aralquilo de cadena corta, incluyendo (entre otros) fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo.
De la manera en que se usa en el contexto de esta invención, el término "resto de la molécula" (como se representa mediante Y y Z) puede ser cualquier porción química, incluyendo (entre otras) porciones de cadena lateral de aminoácido y derivados de las mismas como se ha definido precedentemente. Por ejemplo, cuando el mimético de hoja beta está ubicado dentro de la extensión de un péptido o proteína, Y y Z pueden representar aminoácidos del péptido o proteína. Alternativamente, si dos o más miméticos de hoja beta están unidos, la porción Y de un primer mimético de hoja beta puede representar un segundo mimético de hoja beta mientras que, a la inversa, la porción Z del segundo mimético de hoja beta representa el primer mimético de hoja beta.
Cuando, el mimético de hoja beta está ubicado al final de un péptido o proteína, o cuando el mimético de hoja beta no está asociado con un péptido o proteína, Y y/o Z pueden representar una porción de terminación apropiada. Por ejemplo, porciones de terminación representativas para la porción Z incluyen -H, -OH, -R, -C(=O)R y -SO_{2}R (donde R se selecciona de una porción alquilo de cadena corta, una porción arilo de cadena corta y una porción aralquilo de cadena corta), o puede ser un grupo protector apropiado para la síntesis de proteínas, como BOC, FMOC y CBZ (es decir, terc-butiloxicarbonilo, 9-fluorenilmetoxicarbonilo y benciloxicarbonilo, respectivamente).
Similarmente, las porciones de treminación representativas para la porción Y incluyen -H, -OH, -R, -SO_{2}R, -SOR, -SO_{2}NHR, -CF_{3}, -C_{2}F_{5}, -NHOH, -NHNHR, - C(=O)H, -C(=O)R, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)OR, -C(=O)CH_{2}OR, -C(=O)NHR, -CH_{2}X', -C(=O)CH_{2}X', -C(=O)C(=O)NRR, -C(=O)CHN_{2},
\hskip0.3cm
28
2800 29
2900 30 -C(=O=CH=CHC(=O)H, -C(=O)CH=CHC(=O)OR, -C(=O=CH=CHC(=O)OR, -C(=O)CH=CHC(=O)NRR, -CH(OH)CH=CHC(=O)OH, -CH(OH)CH=CHC(=O)R, -CH(OH)CH=CHC(=O)OR, -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR, -CH=CHSO_{2}R Y -SO_{2}CH=CHR (dibde X' es Cl, F, Br o I, y en cada una de sus apariciones R se selecciona independientemente de una porción alquilo de cadena corta, una porción arilo de cadena corta y una porción aralquilo de cadena corta), o una porción heterocíclica tal como piridina, pirano, tiofano, pirrol, furano, tiofeno, tiazol, benzotiazol, oxazol, benzoxazol, imidazol y bencimidazol.
En el contexto de la estructura (I) precedente, dos grupos CH adyacentes cualesquiera del anillo bicíclico pueden formar un doble enlace. Dichos enlaces dobles pueden ser aislados o estar conjugados con uno o más enlaces dobles adicionales, incluyendo sistemas de anillos aromáticos. Por ejemplo, enlaces dobles aislados representativos incluyen los compuestos de las estructuras (IIe), (IIf), (IIIe), (IIIf), (VIe), (IVf), (VIIa) y (VIIb) precedentes. Los compuestos aromáticos representativos resultantes de enlaces dobles conjugados están representados por las estructuras (IIc), (IId), (IIIc), (IIId), (IVc) y (IVd) anteriores.
\newpage
Dentro de un aspecto específico de esta divulgación, se divulgan miméticos de hoja beta que tienen la estructura (II) precedente, donde A es -C(=O)-, B es N, C es -(CH_{2})_{2}- o -C(=O)CH_{2}-, D es N, y la porción carbonilo opcional F está presente, como se representan por las siguientes estructuras (IIg) (IIh) y (IIh'):
\vskip1.000000\baselineskip
31 
\vskip1.000000\baselineskip
Similarmente, cuando B y D son ambos CH, los miméticos de hoja beta representativos de esta divulgación incluyen compuestos de las siguientes estructuras (IIi), (IIj) y (IIj'):
32
Dentro de otro aspecto específico de esta divulgación, se divulgan miméticos de hoja beta que tienen la estructura (III) precedente. En otro aspecto, D es N y el compuesto tiene la siguiente estructura (IIIi):
33
donde A se selecciona de -C(=O)-, -(CH_{2})_{0-4}- y -C(=O)(CH_{2})_{1-3}-; B se selecciona de N y CH; C se selecciona de -C(=O)- y -(CH_{2})_{0-3}-; y el sistema de anillo bicíclico es saturado (es decir, no contiene ningún doble enlace entre grupos CH adyacentes del sistema de anillos bicíclico).
En este aspecto donde B es CH y R_{3} es hidrógeno, se divulgan compuestos que tienen las siguientes estructuras (IIIj), (IIIk) y (III1):
34 
\newpage
En un aspecto de la estructura (IIIi) donde B es N y R_{3} es hidrógeno, se divulgan compuestos que tienen las siguientes estructuras (IIIm), (IIIn) y (IIIo):
\vskip1.000000\baselineskip
35
En aspectos preferidos de la divulgación, se divulgan compuestos que tienen las siguientes estructuras (IIIp), (IIIq), (IIIr) y (IIIr'):
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36
En otro aspecto de la estructura (IIIi) anterior, se divulgan compuestos que tiene la siguiente estructura (IIIs):
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37
donde A se selecciona de -(CH_{2})_{0-4}-, -(CH_{2})_{1-2}O- y - (CH_{2})_{1-2}S-; C se selecciona de -(CH_{2})_{0-3}-, -O-, -S-, - O(CH_{2})_{1-2}- y -S(CH_{2})_{1-2}-; y el sistema de anillos bicíclico es saturado.
En un aspecto de la estructura (IIIs) donde A es -(CH_{2})_{0-4}-, se divulgan compuestos que tienen la siguiente estructura (IIIf):
\vskip1.000000\baselineskip
38 
\newpage
En un aspecto de la estructura (IIIs) donde A es -(CH_{2})_{1-2}O- o -(CH_{2})_{1-2}S-, se divulgan compuestos que tienen las siguientes estructuras (IIIu) y (IIIv):
39
En un aspecto de la estructura (IIIs) donde C es -(CH_{2})_{1-3}-, se divulgan compuestos que tienen la siguiente estructura (IIIw):
40
donde A se selecciona de -(CH_{2})_{1-4}-, -(CH_{2})_{1-2}O- y - (CH_{2})_{1-2}S-.
En un aspecto de la estructura (IIIs) donde C es -O- o -S-, se divulgan compuestos que tienen las siguientes estructuras (IIIx) y (IIIy):
41
En un aspecto de la estructura (IIIs) donde C es -O(CH_{2})_{1-2}- o -S(CH_{2})_{1-2}-, se divulgan compuestos que tienen la siguientes estructuras (IIIz) y (IIIza):
42
Dentro de un aspecto adicional de esta divulgación, se divulgan miméticos de hoja beta que tiene la estructura (IV) anterior. En un aspecto de esta realización, A es -C(=O)-, B es CH o N, C es -(CH_{2})_{2}- o -C(=O)CH_{2}-, D es N y la porción carbonilo opcional se encuentra presente, como se representa en las siguientes estructuras (IVg), (IVg'), (IVh) y (IVh'):
43 
\newpage
En aspectos de esta divulgación donde F no está presente, se divulgan compuestos que tienen las estructuras (V), (VI) y (VII). Con respecto a los compuestos de estructura (V), cuando A es -C(=O)-, B y D son ambos CH o N, y C es -(CH_{2})_{2}-, los compuestos representativos incluyen las siguientes estructuras (Va), (Vb) y (Vc):
44
45
Similarmente, en la estructura (VI), cuando A es -C(=O)-, B y D son ambos CH o N y C es - (CH_{2})_{2}-, los compuestos representativos incluyen las siguientes estructuras (VIa), (VIb) y (VIc):
46
47
Con respecto a la estructura (VII), cuando A es -C(=O)-, B y D son ambos CH o N, y C es -(CH_{2})_{2}-, los compuestos representativos incluyen las siguientes estructuras (VIIa), (VIIb) y (VIIc):
48
49
Con respecto a la estructura (VIII), en un aspecto B y D de las estructuras (VIIIa) y (VIIIb) son ambos CH o N y X es -S-, -O- o -(CH_{2})_{2}-, produciendo compuestos de estructuras (VIIIc), (VIIId), (VIIIe) y (VIIIf):
50
51
En un aspecto de la estructura (IX), donde A es -C(=O)-, B y D son ambos N, E es -N(Z)-, -C(R_{1})(NHZ)- o -C(R_{1})(Z)-, y p está presente, los compuestos incluyen las estructuras (IXc) a (IXh).
52
53
Una persona capacitada en la técnica puede sintetizar los miméticos de hoja beta de esta invención mediante técnicas de síntesis orgánica conocidas. Por ejemplo, los diversos compuestos de la (I) pueden sintetizarse de acuerdo con los siguientes esquemas de reacción.
Los compuestos representativos de la estructura (III) pueden sintetizarse de acuerdo con los siguientes esquemas de reacción (donde n = 0-4, p = 0-3 y m = 0-2):
Esquema de reacción (1)
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54 
\newpage
Esquema de reacción (2)
La estructura (IIIk) puede sintetizarse de acuerdo con el siguiente esquema de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
56 
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema de reacción (3)
Los compuestos representativos de la estructura (III1) que tienen la estructura (III1') pueden sintetizarsen de acuerdo con el siguiente esquema de reacción, donde la estructura (III1'') en el esquema (3) es una estructura representativa de la invención que tiene un enlace doble en el sistema de anillos bicíclico:
\vskip1.000000\baselineskip
57 
\newpage
Además, los compuestos representativos de la estructura (IIIl) que tienen la estructura (IIIl''') pueden sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción, y cuando A de la estructura (IIIl) es -C(=O)(CH_{2})_{1-3}-, un compuesto relacionado (al que se designa como (IIIi') a continuación) puede sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
58
Esquema de reacción (4)
Los compuestos representativos de la estructura (IIIm)que tienen las estructuras (IIIm') y (IIIm'') que se muestran a continuación, donde R_{3} es hidrógeno, pueden sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción (véase Holmes y Neel, Tet. Lett. 31:5567-70, 1990):
59 
\newpage
Los compuestos representativos de la estructura (IIIi) donde R_{3} es una porción de cadena lateral de aminoácido o un derivado de la misma también pueden prepararse de acuerdo con el esquema (4) anterior.
Esquema de reacción (5)
Los compuestos representativos de la estructura (IIIn) que tienen la estructura (IIIn') pueden sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
60
Esquema de reacción (6)
La estructura (IIIo) puede sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
61 
\newpage
Esquema de reacción (7)
Los compuestos representativos de la estructura (IIIp) que tienen las estructuras (IIIp') y (IIIp'') que se muestran a continuación, pueden sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
62
Esquema de reacción (8)
Los compuestos representativos de la estructura (IIIq) que tienen las estructuras (IIIq') y (IIIq'') pueden sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción (véase Jungheim & Sigmund, J. Org. Chem. 52:4007-4013, 1987):
63
Esquema de reacción (9)
La estructura (IIIr) puede sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción (véase Perkin, J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1:155-164, 1984):
64
Esquema de reacción (10)
La estructura (IIIt) puede sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
65 
\newpage
Esquema de reacción (11)
Las estructuras (IIIu) y (IIIv) pueden sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
66 
\newpage
Esquema de reacción (12)
La estructura (IIIw) puede sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
67 
\newpage
Esquema de reacción (13)
Las estructuras (IIIx) y (IIIy) pueden sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
68
69 
\newpage
Esquema de reacción (14)
Las estructuras (IIIz) y de (IIIza) pueden sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
70
De acuerdo con la definición de la estructura (I) anterior, el sistema de anillos bicíclico puede contener grupos CH adyacentes (es decir, el sistema de anillos bicíclico puede formarse, al menos en parte, mediante un grupo -CH-CH-). Los compuestos donde dicho grupo -CH-CH- se reemplaza con un -C=C- también están incluidos dentro del alcance de la estructura (I) (es decir, dos grupos CH adyacentes cualesquiera del anillo bicíclico juntos pueden formar un doble enlace).
\newpage
Los esquemas de reacción (15), (16) y (17) ilustran métodos adicionales de síntesis para preparar los compuestos representativos de la estructura (III).
Esquema de reacción (15)
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72 
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Esquema de reacción (16)
73 
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Esquema de reacción (17)
74
Los compuestos representativos de la estructura (IV) pueden prepararse mediante los esquemas de reacción (18) a (21).
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Esquema de reacción (18)
75 
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Esquema de reacción (19)
Material de partida según el método de Miller y Watkins, J. Am. Chem. Soc. 90:1515, 1976.
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76 
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77 
\newpage
En la alternativa, las estructuras (IVc) y (IVd) pueden prepararse mediante el esquema de reacción (19-1).
Esquema de reacción (19-1)
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78 
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Esquema de reacción (20)
79 
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Esquema de reacción (21)
80 
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En la alternativa, la estructura (IVf) puede prepararse mediante el siguiente esquema de reacción (21-1).
Esquema de reacción (21-1)
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81 
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Los compuestos representativos de la estructura (VIII) pueden sintetizarse de urazoles o pirazolidina dionas mediante los esquemas de reacción (22) y (23).
Esquema de reacción (22)
La estructura (VIIIc) puede sintetizarse a partir de urazoles mediante el siguiente esquema de reacción:
82 
\newpage
Esquema de reacción (23)
La estructura (VIIId) puede sintetizarse a partir de pirazolidina dionas mediante el siguiente esquema de reacción:
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83 
\newpage
Alternativamente, el material de partida pyrazolidina diona puede sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
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84 
\newpage
Los compuestos representativos de la estructura (II) pueden sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción (24):
Esquema de reacción (24)
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85 
\newpage
Además, los compuestos representativos de la estructura (II) pueden prepararse mediante el siguiente esquema de reacción (25):
Esquema de reacción (25)
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850 
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Además, los compuestos representativos de la estructura (III) pueden prepararse mediante el siguiente esquema de reacción (26):
Esquema de reacción (26)
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86
Los compuestos de las estructuras (V), (VI) y (VII) pueden prepararse mediante las mismas técnicas generales que se divulgaron anteriormente para los compuestos de las estructuras (II), (III) and (IV), excepto que el intermediario precursor respectivo no contiene una porción carbonilo en la posición F.
\newpage
Además, los compuestos de la estructura (IX) pueden prepararse de acuerdo con el esquema de reacción (27):
Esquema de reacción (27)
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87 
\newpage
Los compuestos representativos de la estructura (IIe) pueden prepararse mediante el siguiente esquema de reacción (28):
Esquema de reacción (28)
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88
En una realización de los miméticos de hoja beta de esta invención, los grupos Y tienen la estructura:
89
donde una estereoquímica preferida es:
90
Los grupos R_{4} preferidos son porciones organoamina que tienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 átomos de carbono y al menos un átomo de nitrógeno. Las porciones organoamina apropiadas tienen la fórmula química C_{2-10}H_{4-20}N_{1- 6}O_{0-2}; y preferentemente tienen la fórmula química C_{3-7}H_{7-14}N_{1-4}O_{0- 1}. Porciones organoamina ejemplares de la invención son (donde R se selecciona de hidrógeno, halógeno (por ejemplo, fluor), alquilo de cadena corta (por ejemplo, metilo) e hidroxialquilo de cadena corta (por ejemplo, hidroximetilo); y X se selecciona de CH_{2}, NH, S y O):
91
92
En la estructura anterior, R_{5} se selecciona de (a) alquilo de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, optionalmente substituido con 1-4 sustituyentes haluro, alcoxi C_{1-5} y nitro, (b) -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, donde el grupo alquilo se encuentra opcionalmente sustituido con haluro o alcox C_{1-5}, (c) -C(=O)NH-aralquiloC_{1-10} donde el grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta cinco grupos independientemente seleccionados de nitro, haluro, -NH-(C=O)alquiloC_{1-5}, -NH-(C=O)ariloC_{6-10}, alquilo C_{1-5} y alcoxi C_{1-5}, y (d) heteroarilo monocíclico y bicíclico de 4 a aproximadamente 11 átomos en el anillo, donde los átomos del anillo se seleccionan de carbono y los heteroátomos oxígeno, nitrógeno y azufre, y donde el anillo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta aproximadamente cuatro sustituyentes de haluro, alquiloC_{1-5}, alcoxi C_{1-5}, -C(=O)NHalquiloC_{1-5}, -C(=O)NHariloC_{6-10}, amino, -C(=O)OalquiloC_{1-5} y -C(=O)OariloC_{6- 10}.
Los grupos R_{5} preferidos son:
93
donde R_{6} es hidrógeno, nitro, haluro, NH-C(=O)-alquiloC_{1-5}, NH-C(=O)-ariloC_{6-10}, alquilo C_{1}-C_{5} y alcoxi C_{1}-C_{5};
94
donde X es haluro;
95
donde E es -O-, -NH- o -S- y R_{7} y R_{8} se seleccionan independientemente de hidrógeno, alquilo C_{1-5}, -C(=O)Oalquilo
C_{1-5}, -C(=O)OariloC_{6-10}, -C(=O)NHalquiloC_{1-5} y -C(=O)NHariloC_{6-10}; y
96
donde E y R_{6} son como se ha definido anteriormente.
Los miméticos de hoja beta de la presente invención pueden utilizarse en protocolos estándar de síntesis de péptidos, incluyendo la síntesis automatizada de péptidos en fase sólida. La síntesis de péptidos es un proceso en etapas donde se forma un péptido por elongación de la cadena peptídica mediante el agregado en etapas de los aminoácidos individuales. Los aminoácidos se unen a la cadena peptídica a través de la formación de un enlace péptídico (amida). El vínculo peptídico se forma mediante el acoplamiento del grupo amino del péptido al grupo carboxílico del aminoácido. Por lo tanto, el péptidos se sintetiza de la terminal carboxilo a la terminal amino. Las etapas individuales del agregado de aminoácidos se repiten hasta que se sintetice un péptido (o proteína) de la longitud y secuencia de aminoácidos deseadas.
Para lograr la síntesis de péptido (o proteína o molécula) que se describe anteriormente, el grupo amino del aminoácido que se agrega al péptido no debe interferir con la formación del enlace péptido entre la aminoácido y el péptido (es decir, el acoplamiento del grupo carboxilo del aminoácido al grupo amino del péptido). Para evitar tal interferencia, los grupos amino de los aminoácidos utilizados en la síntesis de péptidos se protegen con grupos protectores apropiados. Los grupos protectores amino típicos incluyen, por ejemplo, los grupos BOC y FMOC. Por lo tanto, en una realización de la presente invención, los miméticos de hoja beta de la invención acarrean un grupo carboxílico libre y un grupo amino protegido, y son por lo tanto apropiados para incorporarse al péptido mediante técnicas de síntesis estándar.
Los miméticos de hoja beta de esta invención puede sintetizarse sobre un soporte sólido, típicamente mediante un vinculador apropiado. Los miméticos de hoja beta pueden luego ser escindidos del soporte sólido mediante, por ejemplo, aminólisis, y evaluados como sustratos competitivos contra agentes apropiados, tales como el sustrato cromogénico BAPNA (benzoilarginina paranitroanalida)(véase Eichler and Houghten, Biochemistry 32:11035-11041, 1993)(incorporado a este documento por referencia). Alternativamente, mediante el empleo de una porción vinculante apropiada, dichas evaluaciones pueden llevarse a cabo mientras los miméticos de hoja beta están todavía unidos al soporte sólido.
Una vez que un sustrato se selecciona mediante el análisis cinético precedente, el mimético de hoja beta puede ser convertido en un inhibidor mediante modificaciones a la terminal C -esto es, modificando la porción Y. Por ejemplo, la porción Y terminal puede ser reemplazada por -CH_{2}C1, -CF_{3}, -H, o -C(O)NHR. Las porciones R apropiadas pueden seleccionarse utilizando una biblioteca de sustratos, o utilizando una biblioteca de inhibidores generada mediante una modificación del procedimiento de Wasserman y Ho (J. Org. Chem. 59:4364-4366, 1994) (incorporado a este documento por referencia).
Se pueden construir bibliotecas de compuestos que contienen patrones de cadena beta para determinar la secuencia óptima para el reconocimiento o unión del sustrato. A continuación se tratan las estrategias representativas para utilizar dichas bibliotecas.
Una biblioteca de sustratos de miméticos de hoja beta representativos puede construirse de la siguiente manera. Se debe entender que el siguiente es un ejemplo de la metodología que puede utilizarse para preparar una biblioteca de sustratos de miméticos de hoja beta y que pueden prepararse otras bibliotecas de una manera análoga.
En una primera etapa, una biblioteca del siguiente tipo:
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97 
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R_{1}, R_{3}, R =
porciones de cadena lateral de aminoácido o derivados de las mismas; Y = H, Ac, SO_{2}R; y el "P" encerrado en un círculo representa un soporte sólido.
puede ser construida sobre un soporte sólido (resina PEGA, Meldal, M. Tetrahedron Lett. 33:3077-80, 1992; vidrio de poros controlados, Singh et al., J. Med. Chem. 38:217-19, 1995). El soporte sólido pueden entonces ser colocado en una bolsa de diálisis (Bednarski et al., J. Am. Chem. Soc. 109:1283-5, 1987) con la enzima (por ejemplo, una proteasa) en una solución amortiguadora apropiada. Se coloca entonces la bolsa en un vaso de laboratorio con la solución amortiguadora. La reacción enzimática se sigue como una función del tiempo mediante HPLC y se analizan los materiales escindidos del polímero mediante MS/MS. Esta estrategia proporciona información concerniente a los mejores sustratos para un objetivo en particular.
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La síntesis del mimético de hoja beta se ilustra mediante el procedimiento retrosintético que se muestra continuación:
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98 
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La complejidad de la biblioteca generada por esta técnica es (R_{1}) (R_{3}) (R) (Y). Suponiendo que R_{1}, R_{3} y R se seleccionen de porciones de cadenas laterales de aminoácidos que ocurran en la naturaleza, n sea una constante, e Y sea H, Ac o - SO_{2}R como se define anteriormente, se genera una biblioteca que tiene del orden de 24,000 miembros [(20)(20)(20)(3)].
Luego de evaluar la biblioteca contrastándola con un objetivo específico (por ejemplo, un enzima), se puede luego recuperar y evaluar la misma con un segundo objetivo y así en más.
Además, se puede construir una biblioteca de inhibidores y evaluarla mediante una prueba cromogénica estándar. Por ejemplo, la biblioteca puede construirse como se detalla a continuación, donde el ejemplo siguiente es simplemente representativo de las bibliotecas de inhibidores que pueden prepararse de una manera análoga al procedimiento específico que se proporciona seguidamente.
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(Esquema pasa a página siguiente)
99
(Véase Wasserman et al., J. Org. Chem. 59:4364-6, 1994.)
Una estrategia alternativa adicional es unir la biblioteca a través del grupo R de cadena lateral como se muestra más abajo.
100 
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Se puede construir una biblioteca de inhibidores de las aspártico proteasas que tengan la siguiente estructura ejemplar, y luego escindirla de la resina y evaluarla:
101
Similarmente, para las metaloproteasas, se puede construir una biblioteca que tenga la estructura ejemplar que se muestra a continuación y luego, mediante escisión de la resina, obtenerse una biblioteca de ácidos hidroxámicos:
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102 
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Se puede ilustrar en más detalles la actividad de los miméticos de hoja beta de invención por referencia a la Tabla 2 que lista diversos péptidos biológicamente activos. Específicamente, los péptidos de la Tabla 2 son conocidos por tener actividad biológica como sustratos o inhibidores.
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TABLA 2 Péptidos biológicamente activos
Inhibidores de proteasas:
(a)
(D)FPR (Trombina)
Enzyme 40:144-48, 1988
(b)
(D)IEGR (Factor X)
Handbook of Synthetic Substrates for the Coagulation and Fibronlytic Systems, H.C. Hemker, pp. 1-175, 1983, Martinus Nijhoff Publishers, The Hague.
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Sustratos e inhibidores de la proteína quinasa:
(c)
LRRASLG (Serina quinasa)
Biochem. Biophys. Res. Commun. 61:559, 1974
(d)
LPYA (Tirosina quinasa)
J. Bio. Chem. 263:5024, 1988
(e)
PKI (Serina quinasa)
Science 253:1414-20, 1991
\newpage
TABLA 2 (continuación)
Inhibidores de CAAX:
(f)
(H)-CVIM-(OH)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:732-36, 1991
(g)
(H)-CVFM-(OH)
Bioorg. Med. Chem. Letters 4:887-92, 1994
(h)
(H)-CIT-(homoserina lactona)
Science 260:1934-37, 1993
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Análogos de péptidos SH2:
(i)
^{P}YZPZS^{P}YZPZS (análogo de IRS 1)
Biochemistry 33:9376-81, 1994
(j)
EPQ^{P}YEEIPIYL (motif enlazante de SH_{2} Src)
Cell 72:767-68, 1993
^{P}Y = Y fosforilado
Z = norleucina
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Péptidos de clase MHC I:
(k)
TYQRTRALV (Nucleoproteína de la influenza)
J. Exp. Med. 175:481-87, 1991
(l)
RGYVYQGL (VSV)
Ann. Rev. Imm. 11:211-44, 1993
Más generalmente, los miméticos de hoja beta de invención pueden sintetizarse para simular cualquier número de péptidos biológicamente activos mediante la elección apropiada de las porciones R_{2}, R_{2}', R_{3}, F, Y y Z (así como de las porciones A, B, C, D y E de la estructura (I) misma). Esto se ilustra además mediante la Tabla 3 que divulga diversas modificaciones que pueden hacerse a los miméticos de hoja beta de la estructura (I) para generar compuestos biológicamente activos. En la Tabla 3, R_{2} y R_{3} se eligen independientemente de los átomos o grupos que muestran en la columna "R_{2}/R_{3}".
TABLA 3 Modificaciones a la estructura (7) para generar compuestos biológicamente activos 
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113 
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Cuando los miméticos de hoja beta de esta invención se sustituyen por uno o más de los aminoácidos de un péptido biológicamente activo, la estructura del péptido modificado de hoja beta resultante (antes de la escisión del soporte sólido, tal como PAM) puede representarse mediante el siguiente diagrama, donde AA_{1} a AA_{3} representan el mismo aminoácido o uno distinto:
114
Se puede elegir el mimético de hoja beta preciso mediante cualquiera de las diversas técnicas existentes, incluyendo modelado por computadoras, técnicas aleatorias y/o la utilización de pruebas de selección de sustratos naturales. El mimético de hoja beta también puede generarse mediante la síntesis de una biblioteca de miméticos de hoja beta y la evaluación de los miembros de dicha biblioteca para identificar a los que sean activos como se divulga anteriormente.
Una vez que se ha elegido el mimético de hoja beta optimizado, se pueden modificar entonces los diversos aminoácidos unidos al mismo. Se escinde entonces del soporte sólido una serie de péptidos modificados de hoja beta que tengan una diversidad de sustituciones de aminoácidos y se los ensaya para identificar un sustrato preferido. Se debe entender que la generación de tales sustratos puede implicar la síntesis y la evaluación de un número de péptidos modificados de hoja beta, donde cada péptido modificado de hoja beta tiene una diversidad de sustituciones de aminoácidos en combinación con una diversidad de distintos miméticos de hoja beta. Además, debe y la porción Y es AA_{2} y AA_{1} en el diagrama precedente. (Mientras que este diagrama se presenta como una ilustración, más o menos aminoácidos pueden estar unidos al mimético de hoja beta -esto es, AA_{3} puede estar ausente o aminoácidos adicionales pueden estar unidos al mismo; y AA_{2} y/o AA_{1} pueden ser omitidos o aminoácidos adicionales pueden estar unidos).
Una vez que se identificó un sustrato preferido mediante los procedimientos divulgados precedentemente, se puede convertir fácilmente el sustrato a un inhibidor mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, el aminoácido de terminal C (en este caso AA_{1}) puede modificarse mediante la adición de un número de porciones que se conocen que imparten una actividad inhibitoria a un sustrato, incluyendo (entre otras) -CF_{3} (un conocido inhibidor reversible de la serina proteasa), -CH_{2}Cl (un conocido inhibidor irreversible de la serina proteasa), -CH_{2}N_{2}+ y -CH_{2}S(CH_{3})_{2}^{+} (conocidos inhibidores de la cisteinilo proteasa), -NHOH (un conocido inhibidor de las metaloproteasas),
115
(un conocido inhibidor de la cysteinilo proteasa), y
116
117
(un conocido inhibidor de la aspartilo protease).
Mientras que la utilidad de los miméticos de hoja beta de esta invención ha sido divulgada con respecto a ciertas realizaciones, se deberá entender que se pueden hacer una amplia diversidad y tipos de compuestos que incluyen los miméticos de hoja beta de la presente invención. Por ejemplo, un mimético de hoja beta de esta invención puede ser sustituido por dos o más aminoácidos de un péptido o proteína. Además de mejorar y/o modificar la estructura de hoja beta de un péptido o proteína, particularmente con respecto a la estabilidad conformacional, los miméticos de hoja beta de esta invención también sirven para inhibir la ruptura proteolítica. Esto resulta en la ventaja adicional de que los péptidos o proteínas son menos propensos a la ruptura proteolítica debido a la incorporación de los miméticos de hoja beta de esta invención.
Más específicamente, los miméticos de hoja beta de esta invención tienen una utilidad amplia en péptidos, proteínas y moléculas sintéticas o que ocurran naturalmente. Por ejemplo, los miméticos de hoja beta divulgados en este documento son activos como inhibidores de quinasas y proteasas, así como inhibidores de MHC II. Por ejemplo, los miméticos de hoja beta de esta invención son activos como inhibidores de la gran familia de serina proteasas similares a la tripsina, incluyendo aquellos que prefieren a la arginina o la lisina como un sustituyente P'. Estas enzimas están implicadas en la hemostasis e incluyen (entre otras) al Factor VIIa, Factor IXa, Factor Xa, Factor XIa, trombina, kallikrein, uroquinasa (que también está implicada en la metástasis del cáncer) y plasmina. Una enzima relacionada, la triptasa, está implicada en las respuestas inflamatorias. Por lo tanto, la capacidad de inhibir selectivamente estas enzimas tiene una utilidad amplia en las aplicaciones terapéuticas que impliquen la enfermedad cardiovascular, las enfermedades inflamatorias y la oncología.
Por ejemplo, los compuestos de las siguientes estructuras representan realizaciones adicionales de esta invención en el contexto de los inhibidores del Factor VIIa y de la trombina.
Inhibidores del Factor VIIa
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Inhibidores de la trombina
121 
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En otro aspecto, la presente invención abarca composiciones farmacéuticas preparadas para el almacenamiento o la administración que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un mimético de hoja beta o un compuesto de la presente- invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La terapia anticoagulante está indicada para el tratamiento y la prevención de una variedad de condiciones trombóticas, especialmente enfermedades de las arterias coronarias y cerebrovasculares. Aquellos con experiencia en este campo se darán cuenta fácilmente de las circunstancias en que se requiere una terapia anticoagulante.
La "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto de la presente invención dependerá de la vía de administración, del tipo de animal de sangre caliente que está siendo tratado y de las características físicas del animal específico bajo tratamiento. Estos factores y su relación para determinar esta cantidad son bien conocidos por los practicantes capacitados en las ciencias médicas. Esta cantidad y el método de administración pueden ser especificados a la medida para lograr una eficacia óptima pero dependerán de factores tales como el peso, la dieta, la medicación concurrente y otros factores que, como ya se ha notado, son conocidos por las personas capacitadas en las ciencias
médicas.
La "cantidad terapéuticamente eficaz" del compuesto de la presente invención puede oscilar ampliamente según los efectos deseados y la indicación terapéutica. Típicamente, la dosificación será entre aproximadamente 0.01 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre cerca de 0.01 y 10 mg/kg de peso corporal.
Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" para uso terapéutico son bien conocidos en las artes farmacéuticas y se describen, por ejemplo, en Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro editor, 1985). Por ejemplo, se pueden utilizar soluciones salinas estériles y soluciones salinas amortiguadas con fosfatos a un pH fisiológico. En la composición farmacéutica se pueden proporcionar agentes conservativos, estabilizantes, colorantes y aún saborizantes. Por ejemplo, se pueden agregar, benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres del ácido p-hidroxibenzoico como agentes conservativos. Además se pueden utilizar antioxidantes y agentes de
suspensión.
La inhibición de la trombina es útil no sólo en la terapia anticoagulante de individuos con condiciones trombóticas, sino que también es útil cuando se requiera inhibir la coagulación de la sangre como, por ejemplo, para prevenir la coagulación de sangre entera almacenada y prevenir la coagulación en otras muestras biológicas para ensayo o almacenaje. Por lo tanto, los inhibidores de trombina se pueden agregar o contactar con cualquier medio que contenga o del que se sospeche que contenga trombina y en el que se desee inhibir la coagulación de la sangre (por ejemplo, cuando se contacta la sangre del mamífero con un material seleccionado a partir del grupo consistente en injertos vasculares, tallos, prótesis ortopédicas, prótesis cardíacas y sistemas circulatorios extra corporales).
Los inhibidores de la trombina pueden ser coadministrados con agentes anticoagulantes o agentes trombolíticos apropiados tales como activadores de plasminógeno o estreptoquinasa para lograr efectos sinérgicos en el tratamiento de diversas patologías vasculares. Por ejemplo, los inhibidores de la trombina incrementan la eficacia de la reperfusión trombolítica mediada por el activador de plasminógeno de tejidos. Los inhibidores de trombina pueden administrarse primero luego de la formación del trombo, seguido luego por la administración del activador de plasminógeno de tejidos u otro activador de plasminógeno. También pueden combinarse con heparina, aspirina o
warfarina.
Los inhibidores de trombina de la invención pueden administrarse en formas orales tales como tabletas, cápsulas (cada una de las cuales incluyen formulaciones de liberación sostenida o programada en el tiempo), píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes y emulsiones. De la misma manera, los inhibidores pueden ser administrados en forma intravenosa (bolo o infusión), intraperitoneal, subcutánea o intramuscular, formas todas ellas bien conocidas por aquellos con capacitación normal en las artes farmacéuticas. Se puede emplear una cantidad eficaz pero no tóxica del compuesto deseado como un agente antiaglutinante para tratar la acumulación ocular de fibrina. Los compuestos pueden administrarse de manera intraocular o tópica así como en forma oral o parenteral.
Los inhibidores de la trombina pueden administrarse en la forma de una inyección de depósito o una preparación de implante que puede formularse de manera tal de permitir una liberación sostenida del ingrediente activo. Este ingrediente activo puede comprimirse en pellotillas o cilindros pequeños e implantarse subcutánea o intramuscularmente como implantes o inyecciones de depósito. Los implantes pueden emplear materiales inertes tales como polímeros biodegradables o siliconas sintéticas, por ejemplo, Silastic, goma silicona u otros polímeros fabricados por Dow-Corning Corporation.
Los inhibidores de trombina también pueden administrarse en la forma de sistemas liposómicos de entrega como por ejemplo vesículas unilaminares grandes y pequeñas y vesículas multilaminares. Se pueden formar liposomas a partir de una variedad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.
Los inhibidores de trombina también puede ser entregados mediante el uso de anticuerpos monoclonales como vehículos individuales a los cuales se acoplan las moléculas del compuesto. Los inhibidores de trombina también pueden acoplarse con polímeros solubles como vehículos direccionables de drogas. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímeros del pirano, polihidroxi-propilmetacrilamida-fenol, polihidroxietil-aspartarmida-fenol, o polietilenóxido-polilisina sustituidos con residuos palmitoílo. Además, los inhibidores de la trombina pueden acoplarse a una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr una liberación controlada de una droga, por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de los ácidos poliláctico y poliglicólico, poliepsilon caprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos o copolímeros en bloque anfipáticos o de unión entrecruzada de hidrogeles.
La dosis y el método de administración pueden hacerse a la medida para lograr una eficacia óptima pero dependerán de factores tales como el peso, la dieta, la medicación concurrente y otros factores que podrán reconocer aquellos individuos capacitados en las ciencias médicas. Cuando la administración sea parenteral, tal como una administración intravenosa diaria, se pueden preparar composiciones farmacéuticas inyectables de manera convencional, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, como formas sólidas apropiadas para ser disueltas o suspendidas en un líquido antes de la inyección o como emulsiones.
Las tabletas apropiadas para una administración oral de los componentes activos de la invención pueden prepararse de la siguiente manera:
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Cant.-mg
Compuesto activo 25.0 50.0 100.0
Celulosa microcristalina 37.25 100.0 200.0
Almidón de maíz alimenticio modificado 37.25 4.25 8.5
Estearato de magnesio 0.50 0.75 1.5
Se mezclan todo el componente activo, la celulosa y una porción de la almidón de maíz y se granula a una pastarme almidón de maíz al 10%. La granulación resultante se tamiza, se seca y se mezcla con el resto del almidón de maíz y el estearato de magnesio. Se comprime entonces la granulación resultante en tabletas que contienen 25.0, 50.0 y 100.0 mg, respectivamente, del ingrediente activo por tableta.
\newpage
Una forma de dosificación intravenosa del compuesto activo precedentemente indicado puede prepararse de la siguiente manera:
Compuesto activo 0.5-10.0 mg
Citrato de sodio 5-50 mg
Ácido cítrico 1-15 mg
Cloruro de sodio 1-8 mg
Agua para inyección (USP) Cantidad suficiente para 1 ml
Utilizando estas cantidades, se disuelve el compuesto activo a temperatura ambiente en una solución previamente preparada de cloruro de sodio, ácido cítrico y citrato de sodio en agua para inyección (USP, véase página 1636 del United States Pharmacopoeia/National Formulary de 1995, publicado por United States Pharmacopoeia Convention, Inc., Rockville, Maryland, copyright 1994).
Los compuestos de la presente invención cuando se preparan y seleccionan de la manera divulgada son potentes inhibidores de la trombina in vitro e in vivo. Como tales, estos compuestos son útiles como reactivos de diagnóstico in vitro para evitar la coagulación de la sangre y como agentes farmacéuticos in vivo para prevenir la trombosis en los mamíferos de los que se sospeche que tengan una condición caracterizada por una trombosis anormal.
Los compuesto de la presente invención son útiles como reactivos de diagnóstico in vitro para inhibir la coagulación en los tubos de extracción de sangre. El uso de tubos de ensayo tapados que tengan un vacío en el mismo como un medio para extraer dentro del tubo la sangre obtenida por punción de las venas es muy conocido en las ciencias médicas (Kasten, B.L., "Specimen Collection", Laboratory Test Handbook, 2nd Edition, Lexi-Comp Inc., Cleveland pp. 16-17, Edits. Jacobs, D.S. et al. 1990). Tales tubos de vacío pueden estar libres de aditivos que inhiban la formación de coágulos, en cuyo caso, son útiles para aislar el suero de la sangre de los mamíferos. En la alternativa, pueden contener aditivos que inhiban la formación de coágulos (tales como sales de heparina, EDTA, citratos o oxalatos), en cuyo caso, los mismos son útiles para el aislamiento del plasma a partir de la sangre en los mamíferos. Los compuestos de la presente invención son inhibidores potentes del factor Xa o de la trombina, y como tales, pueden incorporarse en los tubos de recolección de sangre para evitar la coagulación de la sangre extraída de los mamíferos y recolectada en los tubos.
Con respecto a la regulación de los factores de transcripción, los compuestos de esta invención regulan los factores de transcripción cuya capacidad de unirse al ADN esté controlada por la reducción de un residuo cisteína mediante una oxidoreductasa celular. En una realización, el factor de transcripción es NF-\kappaB y la oxidoreductasa celular es tioredoxina. En esta realización, los compuestos de este invención son activos como mediadores de las respuestas inmune y/o inflamatoria, o sirven para controlar el crecimiento celular. En otra realización, el factor de transcripción es AP-1 y la oxidoreductasa celular es ref-1. En esta realización, los compuestos de esta invención son activos como agentes antiinflamatorios y/o anticancerígenos. En todavía otra realización adicional, el factor de transcripción se selecciona de myb y el elemento de respuesta glucocorticoide (FRE por sus siglas en inglés) y la oxidoreductasa incluye la glutaredoxina.
Los compuestos de esta invención pueden administrarse a un animal de sangre caliente que haya sido diagnosticado como sufriendo, o que se encuentra a riesgo de desarrollar, una condición seleccionada de la enfermedad de Chrohn, asma, artritis reumatoidea, isquemia, lesión de reperfusión, enfermedad del injerto contra huésped (GVHD por sus siglas en inglés), esclerosis lateral amiotrópica (ALS por sus siglas en inglés), enfermedad de Alzheimer, rechazo de aloinjerto y leucemia de las células T de los adultos.
Los compuestos de la presente invención se utilizan solos, en combinación con otros compuestos de esta invención o en combinación con otros inhibidores de la coagulación conocidos, en los tubos de recolección de sangre. La cantidad a añadirse a estos tubos es la suficiente para inhibir la formación de un coágulo cuando se extrae sangre de un mamífero dentro del tubo. La adición de los compuestos a dichos tubos puede lograrse mediante métodos. conocidos en la técnica, tales como la introducción en los mismos en una composición líquida, una composición sólida o una composición líquida que haya sido liofilizada a un sólido. Los compuestos de la presente invención se añaden a los tubos de recolección de sangre en cantidades tales que, cuando se combinan con 2 a 10 mL de sangre de mamífero, la concentración de tales compuestos será suficiente para inhibir la formación de coágulos. Típicamente, la concentración requerida será de aproximadamente 1 a 10,000 nM, con 10 a 1000 nM siendo preferida.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para fines ilustrativos.
Ejemplos Ejemplo 1 Síntesis de un mimético de hoja beta representativo Este ejemplo ilustra la síntesis de un mimético de hoja beta representativo de esta invención Síntesis de la estructura (1)
123
Se sintetizó la benzaldimina de fenilalanina, la estructura (1), de la siguiente manera. A una mezcla de clorhidrato del éster metilo de la L-fenilalanina (7.19 g, 33.3 mmol) y benzaldehído (3.4 ml, 33.5 mmol) agitada en CH_{2}Cl_{2} (150 ml) se agregó trietilamina (7.0 ml, 50 mmol) a temperatura ambiente. Se agregó sulfato de magnesio anhidro (2 g) a la solución resultante y la mezcla se agitó durante 14 h y luego se filtró a través de una almohadilla de 1 pulgada de Celita con CH_{2}Cl_{2}. El filtrado se concentró bajo presión reducida a aproximadamente una mitad de su volumen inicial y se diluyó luego con un volumen igual de hexanos. La mezcla se extrajo dos veces con solución acuosa saturada de NaHCO_{3}, H_{2}O y salmuera, se secó entonces sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se filtró. La concentración del filtrado bajo vacío rindió 8.32 g (93% de rendimiento) de un aceite incoloro. El análisis ^{1}H RMN indicó benzaldimina de fenilalanina casi pura (>95%) El producto crudo se utilizó sin ninguna purificación adicional.
Síntesis de la estructura (2)
124
Se sintetizó benzaldimina de \alpha-alilfenilalanina, la estructura (2), de la siguiente manera. A una solución de diisopropilaimina (4.3 ml, 33 mmol) agitada era, THF (150 ml) a - 78°C se agregó por goteo una solución de n-butillitio (13 ml de una solución 2.5 M en hexano, 33 mmol). La solución resultante se agitó durante 20 min. y luego se agregó lentamente una solución de benzaldimina de fenilalanina (7.97 g, 29.8 mmol) en THF (30 ml). La solución rojo anaranjada obscura resultante se agitó durante 15 min. Se agregó entonces bromuro de alilo (3.1 ml, 36 mmol). La solución amarillo pálido se agitó durante 30 min. a -78°C y luego se permitió que se entibiara a temperatura ambiente y se agitó por 1 h. más. Se agregó cloruro de amonio acuoso saturado y la mezcla se virtió en acetato de etilo. La fase orgánica se separó y se lavó con agua y salmuera, luego se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. La concentración del filtrado bajo vacío produjo 8.54 g de un aceite amarillo viscoso. La purificación mediante cromatografía en columna produjo 7.93 g (87%) de benzaldimina de \alpha-alilfenilalanina como un aceite incoloro viscoso.
Síntesis de la estructura (3)
125 
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Se sintetizó clorhidrato de \alpha-alilfenilalanina, la estructura (3), de la siguiente manera. A una solución de benzaldimina de \alpha-alilfenilalanina (5.94 g, 19.3 mmol) agitada en metanol (50 ml) se agregó ácido clorhídrico acuoso al 5% (10 ml). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 h y luego se concentró bajo vacío a una sustancia caramelo de color marrón anaranjada. El producto crudo se disolvió en CHCl_{3} (10 ml) y la solución se calentó a ebullición. Se agregaron hexanos (\sim150 ml) y se dejó enfriar la mezcla ligeramente nebulosa. El sólido cristalizado se separó del líquido por decantación, se enjuagó con hexanos y se recogió. La separación de los solventes residuales bajo vacío produjo 3.56 g (72%) de clorhidrato de \alpha-alilfenilalanina puro como un sólido cristalino blanco.
^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 8.86 (3 H, br s), 7.32-7.26 (5H, m), 6.06 (1 H, dddd, J = 17.5, 10.5, 7.6, 7.3 Hz), 5.33 (1H, d, J = 17.5 Hz), 5.30 (1 H, d, J = 10.5 Hz), 3.70 (3 H, s), 3.41 (1 H, d, J = 14.1 Hz), 3.35 (1 H, d, J = 14.1 Hz), 2.98 (1 H, dd, J = 14.5, 7.3 Hz), 2.88 (1 H, dd, J = 14.5, 7.6 Hz).
Síntesis de la estructura (4)
126
Se sintetizó N-terc-butiloxicarbonil-\alpha-alilfenilalanina, la estructura (4) de la siguiente manera. A una solución de clorhidrato de D,L \alpha-alilfenilalanina (565 mg, 2.21 mmol) agitada en una mezcla de THF (15 ml) y agua (5 ml) se agregó dicarbonato de di-terc-butilo seguido por el agregado cuidadoso de bicarbonato de sodio sólido en pequeñas porciones. La mezcla de dos fases resultante se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante 2 días y luego se diluyó con acetato de etilo. Se separó la fase orgánica y se lavó con agua y salmuera y luego se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. La concentración del filtrado bajo vacío rindió un aceite incoloro que se purifico mediante cromatografía en columna (elución con un gradiente de 5 a 10% de EtOAc en hexanos) para dar 596 mg (86%) de N-terc-butiloxicarbonil-\alpha-alilfenilalanina.
CCF R_{f} = 0.70 (gel de sílice, EtOAc al 20% en hexanos); ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 7.26-7.21 (3 H, m), 7.05 (2 H, d, J = 6.1 Hz), 5.64 (1 H, dddd, J = 14.8, 7.6, 7.2, 7.2 Hz), 5.33 (1 H, br s), 5.12-5.08 (2 H, m), 3.75 (3 H, s), 3.61 (1 H, d, J = 13.5 Hz), 3.21 (1 H, dd, J = 13.7, 7.2 Hz), 3.11 (1 H, d, J = 13.5 Hz), 2.59 (1 H, dd, J = 13.7, 7.6 Hz), 1.47 (9 H, s).
Síntesis de la estructura (5)
127
Se sintetizó un aldehído de estructura (5) de la siguiente manera. Se burbujeó ozono en una solución de 2.10 g (6.57 mmol) de la olefina de la estructura (4) agitada a -78°C en una mezcla de CH_{2}Cl_{2} (50 ml) y metanol (15 ml) hasta que la solución tomó un color distintivamente azul. La solución se agitó unos 15 min. adicionales y entonces se agregó lentamente sulfuro de dimetilo. La solución incolora resultante se agitó a -78°C por 10 min. y luego se dejó que se entibiara a temperatura ambiente y se agitó durante 6 h. La solución se concentró bajo vacío a 2.72 g de un aceite viscoso de color amarillo pálido que se purifico mediante cromatografía en columna (gradiente de elución de 10 a 20% EtOAc en hexanos) para dar 1.63 g del aldehído puro como un aceite incoloro viscoso.
CCL (TLC por sus siglas en inglés) es R_{f} = 0.3 (gel de sílice, 20% de EtOAc en hexanos); ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 9.69 (1 H, br s), 7.30-7.25 (3 H, m,), 7.02 (2 H, m,), 5.56 (1 H, br s), 3.87 (1 H, d, J = 17.7 Hz,), 3.75 (3 H, s,), 3.63 (1 H, d, J = 13.2 Hz), 3.08 (1 H, d, J = 17.7 Hz), 2.98 (1 H, d, J = 13.2 Hz,), 1.46 (9 H, s,).
Síntesis de la estructura (6)
128
Una hidrazona de la estructura (6) se sintetizó de la siguiente manera. A una solución del aldehído de la estructura (5) (1.62 g, 5.03 mmol) agitada en THF (50 ml) a temperatura ambiente se agregó hidrato de hidrazina (0.32 ml, 6.5 mmol). La solución resultante se agitó a temperatura ambiente por 10 min. y luego se calentó a reflujo durante 3 días. La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente y luego se concentró bajo vacío a 1.59 g (rendimiento del 105% de crudo) de una espuma incolora. El producto hidrazona crudo, la estructura (6), se utilizó sin ninguna purificación.
TLC R_{f} = 0.7 (50% de EtOAc en hexanos); ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 8.55 (1 H, br s), 7.32-7.26 (3 H, m), 7.17 (1 H, br s), 7.09 (2H, m), 5.55 (1 H, br s), 3.45 (1 H, d, J = 17.7 Hz), 3.29 (1 H, d, J = 13.5 Hz), 2.90 (1 H, d, J = 13.5 Hz), 2.88 (1 H, dd, J = 17.7, 1.3 Hz), 1.46 (9 H, s); MS (CI+, NH_{3}) m/z 304.1 (M + H^{+}).
Síntesis de La estructura (7) 
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129
Una hidrazida cíclica de la estructura (7) se sintetizó de la siguiente manera. Se tomaron la hidrazona cruda de la estructura (6) (55 mg, 0.18 mmol) y óxido de platino (5 mg, 0.02 mmol) en metanol y el matraz se equipó con un tapón de tres vías unido a un globo de goma. Se hizo fluir hidrógeno gas tres veces en el matraz, se infló el globo con hidrógeno y la mezcla se agitó vigorosamente bajo una atmósfera de hidrógeno durante 17 horas. La mezcla se filtró a través de Celita con acetato de etilo y el filtrado se concentró bajo vacío a una espuma blanca. La purification de la espuma blanca mediante cromatografía rápida (flash) rindió 44 mg de la hidrazida cíclica pura de la estructura (7) (80%).
^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 7.34-7.28 (3 H, m), 7.21 (2 H, m), 6.95 (1 H, br s), 5.29 (1 H, br s), 3.91 (1 H, br s), 3.35 (1 H, d, J = 12.9 Hz), 3.00 (1 H, ddd, J = 13.9, 5.3, 5.0 Hz), 2.96 (1 H, d, J = 12.9 Hz), 2.67 (1 H, br m), 2.38 (1 H, br m), 2.30 (1 H, ddd, J = 13.9, 5.4, 5.0 Hz), 1.45 (9 H, s); MS (CI+, NH_{3}) m/z 306.2 (M + H^{+}).
Síntesis de la estructura (8) 
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130 
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La estructura (8) se sintetizó de la siguiente manera. A una solución de la hidrazida cíclica de la estructura (7) (4.07 g, 13.32 mmol) agitada en acrilato de etilo (200 ml) a 90°C se agregó formaldehído (1.2 mL de una solución acuosa al 37%). La mezcla se calentó a reflujo durante 15 h y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente y se concentró bajo vacío a una espuma blanca. Se separaron los productos mediante cromatografía en columna (5% y luego 10% de acetona/cloroformo) para dar 0.851 g del diaestereómero menos polar del éster bicíclico, la estructura (8b), y un diaestereómero más polar (8a). Las fracciones impuras se sujetaron a un segundo tratamiento cromatográfico para dar la estructura (8b) más pura, con un rendimiento combinado del 25%.
^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 7.27-7.21 (3 H, m), 7.09 (2 H, d, J = 6.5 Hz), 5.59 (1 H, br s), 4.52 (1 H, dd, J = 9.1, 3.4 Hz), 4.21 (2 H,- m), 3.40 (1 H, d, J = 12.5 Hz), 3.32 (1 H, d, J = 12.5 Hz), 3.10 (2 H, m), 2.79 (1 H, br m), 2.66 (1 H, br m),2.79 (1 H, br m), 2.66 (1 H, br m), 2.54 (1 H, br m), 2.46 (1 H, m), 2.18 (1 H, m), 1.44 (9 H, s), 1.28 (3 H, t, J = 7.0 Hz) ; MS (CI+, NH_{3}) 418.4 (M + H^{+}).
131
Síntesis de la estructura (9b)
132
La estructura (9b) se sintetizó de la siguiente manera. A una solución del éster etílico menos polar (es decir, la estructura (8b)) (31 mg, 0.074 mmol) agitada en THF (1 ml) se agregó hidróxido de litio acuoso (1 M, 0.15 ml). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h y luego se apagó la reacción con ácido cítrico acuoso al 5%. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (2 veces) y los extractos combinados se lavaron luego con agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró bajo vacío a un vidrio incoloro. El ácido crudo, la estructura (9b), se utilizó en los experimentos subsiguientes sin ninguna purificación adicional.
Síntesis de la estructura (10b)
133
La estructura (10b) se sintetizó de la siguiente manera. El ácido crudo de la estructura (9b) (30 mg, 0.074 mmol), HArg(PMC)pNA (41 mg, 0.074 mmol) y HOBt (15 mg, 0.098 mmol) se disolvieron en THF (1 ml) y se agregó entonces diisopropiletilamina (0.026 ml, 0.15 mmol) seguido de EDC (16 mg, 0.084 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 4 h, se diluyó luego con acetato de etilo y se extrajo con ácido cítrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio acuoso saturado, agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró bajo vacío a 54 mg de un vidrio amarillo pálido. Los productos se separaron mediante cromatografía en columna para dar 33 mg (50%) de una mezcla de diaestereómeros del producto acoplado (es decir, protegido), la estructura (10b). MS (CI+, NH_{3}) m/z 566.6 (M + H^{+}).
Síntesis de la estructura (11b)
134
Un mimético de hoja beta de la estructura (11b) se sintetizó de la siguiente manera. Se preparó una solución de 0.25 ml de H_{2}O, 0.125 ml de 1,2-etanoditiol y 360 mg de fenol en 5 ml de TFA y el producto protegido de la estructura (10b) (33 mg, 0.035 mmol) se disolvió en 2 ml de esta solución. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 h y luego se concentró a presión reducida. Se agregó éter al concentrado y el precipitado resultante se recogió por centrifugación. Se trituró él precipitado con éter y se centrifugó dos veces más, secándose luego en un desecador al vacío durante 14 h. El producto crudo (14 mg) se purificó mediante chromatography HPLC para dar el mimético de hoja beta de la estructura (11b). MS (CI+, NH_{3}) m/z 954.8 (M + Na^{+}).
Síntesis de la estructura (12b)
135
La estructura (12b) se sintetizó de la siguiente manera. A una solución del ácido crudo de la estructura (9b) (24 mg, 0.062 mmol) y N-metilmorfolina (0.008 ml), agitada en THF (1 ml) a -50°C, se agregó cloroformiato de isobutilo. La mezcla nebulosa resultante se agitó durante 10 min. y luego se agregaron 0.016 ml (0.14 mmol) de N-metilmorfolina seguido de una solución de HArg(Mtr)CH_{2}Cl (50 mg, 0.068 mmol) en THF (0.5 ml). La mezcla se mantuvo a -50°C durante 20 min. y luego se la dejó entibiar a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se diluyó con acetato de etilo y se extrajo con ácido cítrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio acuoso saturado y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró bajo vacío para dar 49 mg de un vidrio incoloro, la estructura (12). Una separación mediante cromatografía en columna rindió 12 mg de un diaestereómero menos polar y 16 mg de un diaestereómero más polar.
^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 7.93 (1 H, br s), 7.39-7.31 (3 H, m), 7.16 (-2 H, d, J = 6.9 Hz), 6.52 (1 H, s), 6.30 (1 H, br s), 5.27 (1 H, s), 4.74 (1 H, dd, J = 9.1, 6.9 Hz), 4.42 (1 H, br d, J = 6.8 Hz), 4.33 (1 H, d, J = 6.8 Hz), 3.82 (3 H, s), 3.28 (1 H, d, J = 13.3 Hz), 3.26-3.12 (4 H, m), 2.98 (1 H, d, J = 13.3 Hz), 2.69 (3 H, s), 2.60 (3 H, s), 2.59-2.33 (4 H, m), 2.25- 2.10 (3 H, m), 2.11 (3 H, s), 1.77 (1 H, br m), 1.70-1.55 (3 H, br m), 1.32 (9 H, s).
Síntesis de la estructura (13b)
136
Un mimético de hoja beta de la estructura (13b) se sintetizó de la siguiente manera. El diaestereómero más polar de la estructura (12b) (16 mg, 0.021 mmol) se disolvió en TFA/H_{2}O al 95% (1 ml), la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 h y luego se concentró bajo vacío a 11 mg del material crudo. Se trituró el producto crudo con éter, se lavó dos veces el precipitado con éter y luego se secó bajo alto vacío durante 14 h. Un análisis ^{1}H RMN indicó una mezcla 1:1 del producto desprotegido y del producto que contenía el grupo protector Mtr. La mezcla se disolvió en TFA/H_{2}O al 95%, se agitó durante 2 días y se recuperó el producto como anteriormente. Una purificación del producto mediante HPLC rindió 5 mg del compuesto puro de la estructura (13b). MS (EI+) m/z 477.9 (M^{+}).
Ejemplo 2 Síntesis de un mimético de hoja beta representativo
Este ejemplo es una ilustración de la síntesis de un mimético de floja beta representativo de esta invención.
Síntesis de la estructura (14)
137
Se sintetizó hidroxamato de N,O-dimetilo, la estructura (14), de la siguiente manera. A una mezcla de Boc-N^{g}-4-metoxi-2,3,6-trimetilbencensulfonil-L-arginina (8.26 g, 14.38 nmol), clorhidrato de N,O-dimetilhidroxilimina (2.78 g, 28.5 mmol) e hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (2.45 g, 16.0 mmol) agitada en THF (150 ml) a temperatura ambiente se agregó N,N-diisopropiletilimina (7.5 ml, 43 mmol) seguido de EDC sólido (3.01 g, 15.7 mmol). La solución resultante se agitó durante 16 h, se diluyó luego con acetato de etilo (200 ml) y se extrajo secuencialmente con ácido cítrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio acuoso saturado, agua y salmuera. La solución orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. La concentración del filtrado bajo vacío rindió 7.412 g de una espuma blanca.
^{1}H RMN (500Mhz, CDCl_{3}): \delta 6.52 (1 H, s), 6.17 (1 H, br s), 5.49 (1 H, d, J=8.8Hz), 4.64 (1 H, br t), 3.82 (3H, s), 3.72 (3H, s), 3.36 (1 H, br m), 3.18 (3H, s), 3.17 (1 H, br m), 2.69 (3H, s), 2.61 (3H, s), 2.12 (3H, 2), 1.85-1.55 (5 H, m), 1.41 (9 H, s); MS (FB+): m/z 530.5 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (15)
138
La estructura (15) se sintetizó de la siguiente manera. A una solución de amida de arginina (7.412 g, 13.99 mmol) agitada en diclorometano (150 ml) a temperatura ambiente se agregó N,N-diisopropiletilamina (2.9 ml, 17 mmol) seguido de dicarbonato de di-terc-butilo (3.5 ml, 15.4 mmol) y N,N-dimetilaminopiridina (0.175 g, 1.43 mmol). La solución resultante se agitó durante 1.5 h y luego se virtió en agua. Se separó la capa acuosa y se extrajo con dos porciones de 100 ml de diclorometano. Los extractos combinados se sacudieron con salmuera, se secaron luego sobre sulfato de sodio anhidro y se filtraron. La concentración del filtrado bajo vacío produjo una espuma blanca que se purificó mediante cromatografía rápida (flash) para dar 8.372 g de una espuma blanca.
^{1}H RMN (500MHz, CDCl_{3}): \delta 9.79 (1 H, s), 8.30 (1 H, t, J=4.96), 6.54 (1 H, s), 5.18 (1 H, d, J=9.16 Hz), 4.64 (1 H, m), 3.83 (3 H, s), 3.74 (3 H, s), 3.28 (2 H, dd, J=12.6, 6.9 Hz), 3.18 (3 H, s), 2.70 (3 H, s), 2.62 (3 H, s), 2.14 (3 H, s), 1.73-1.50 (5 H, m), 1.48 (9H, s), 1.42 (9 H, s); MS (FB+): m/z 630.6 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (16)
139
Se sintetizó el arginal, la estructura (16), de la siguiente manera. A una solución de la amida de arginina, la estructura (15), agitada en tolueno a -78°C bajo una atmósfera de argón seco, se agregó por goteo una solución de hidruro de diisobutilaluminio en tolueno (1.0 M, 7.3 ml) por un período de 15 minutos. La solución resultante se agitó durante 30 minutos, se agregó luego una segunda porción de hidruro de diisobutilaluminio (3.5 ml) y se continuó agitando durante 15 minutos. Se agregó por goteo metanol (3 ml) y la solución se agitó a -78°C durante 10 minutos y luego se la dejó entibiar a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (100 ml) y se agitó vigorosamente con 50 ml de tartrato de potasio y sodio saturado acuoso durante 2.5h. La fase acuosa se separó se extrajo con acetato de etilo (2 veces, 100 ml cada vez). Se combinaron los extractos con la solución orgánica original, se sacudieron con salmuera, se secaron luego sobre sulfato de sodio anhidro y se filtraron. La concentración del filtrado bajo vacío produjo una espuma blanca que se separó mediante cromatografía rápida (flash) para dar 1.617 g del aldehído como una espuma blanca.
^{1}H RMN (500MHz, CDCl_{3}): \delta 9.82 (1 H, s), 9.47 (1 H, s), 8.35 (1 H, br t), 6.55 (1 H, s), 5.07 (1 H, d, J=6.9 Hz), 4.18 (1 H, br m), 3.84 (3 H, s), 3.25 (2 H, m), 2.70 (3 H, s), 2.62 (3 H, s), 2.14 (3 H, s), 1.89 (1 H, m), 1.63- 1.55 (4 H, m), 1.49 (9H, s), 1.44 (9 H, s); MS (FB+): m/z 571.6 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (17)
140
Se sintetizó hidroxibenzotiazol, la estructura (17), de la siguiente manera. A una solución de benzotiazol (1.55 ml, 14 mmol) agitada en éter dietílico anhidro (60 ml) a -78°C bajo una atmósfera de argón seco se agregó por goteo una solución de n-butillitio (2.5 M en hexano, 5.6 ml, 14 mmol) durante un período de 10 minutos. La solución resultante de color naranja se agitó durante 45 minutos y entonces se agregó lentamente una solución del arginal de la estructura (16) (1.609 g, 2.819 mmol) en éter dietílico (5 ml). La solución se agitó durante 1.5 h, se agregó entonces una solución acuosa saturada de cloruro de amonio y se dejó que la mezcla se entibiara a temperatura ambiente. La mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 veces, 100 ml cada vez); los extractos combinados se extrajeron con agua y salmuera, se secaron entonces sobre sulfato de sodio anhidro y se filtraron. La concentración del filtrado bajo vacío y rindió un aceite amarillo que se purificó mediante cromatografía rápida (flash) (eluyente: acetato de etilo/hexanos al 30% y luego al 40%) para dar 1.22 g de los hidroxibenzotiazoles (aproximadamente una mezcla 2:1 de diaestereómeros) como una espuma blanca.
La mezcla de hidroxibenzotiazoles (1.003 g, 1.414 mmol) se agitó en CH_{2}Cl_{2} (12 ml) a temperatura ambiente y se agregó ácido trifluoroacético (3 ml). La solución resultante se agitó durante 1.5 h y luego se concentró a presión reducida para dar 1.22 g de la sal benzotiazolilarginol del ácido trifluoroacético como una espuma amarilla.
MS (EI+): m/z 506.2 (M + H^{+}).
Síntesis de la estructura (18b)
141
El compuesto bicíclico, la estructura (18b) se sintetizó de la siguiente manera. El ácido bicíclico de la estructura (9b) del Ejemplo 1 (151 mg, 0.387 mmol) y el hidrato de HOBt (71 mg, 0.46 mmol) se disolvieron en THF (5 ml) y se agregó diisopropiletilimina (0.34 ml, 1.9 mmol) seguido de EDC (89 mg, 0.46 mmol). Luego de agitar durante 10 minutos se agregó una solución de la sal benzotiazolilarginol del ácido trifluoroacético (la estructura (17) 273 mg, 0.372 mmol) en THF (1 ml) junto con un enjuague de THF (0.5 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 h, se diluyó entonces con acetato de etilo y se extrajo secuencialmente con ácido cítrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio acuoso saturado, agua y salmuera. La solución orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro se filtró y se concentró bajo vacío para dar 297 mg de un vidrio amarillo. Un análisis ^{1}H RMN indicó una mezcla de cuatro amidas diaestereoméricas que incluyen la estructura (18b).
MS (ES+): m/z 877 (M^{+}).
Síntesis de la estructura (19b)
142
La estructura (19b) se sintetizó de la siguiente manera. El hidroxibenzotiazol crudo 247 mg, 0.282 mmol) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) y periodinano de Dess-Martin (241 mg, 0.588 mmol) se agregó. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6h, se diluyó entonces con acetato de etilo y se agitó vigorosamente con tiosulfato de sodio acuoso al 10% durante 10 minutos. Se separó la solución orgánica, se extrajo con bicarbonato de sodio acuoso saturado, agua y salmuera, se secó entonces sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. La concentración del filtrado bajo vacío rindió 252 mg de un vidrio amarillo. Un análisis 1H RMN indicó una mezcla de dos cetobenzotiazoles diaestereoméricos que incluyen la estructura (19b).
Síntesis de la estructura (20b)
143
Se sintetizó el cetobenzotiazol, la estructura (20), de la siguiente manera. Se disolvió cetobenzotiazol (19) (41 mg, 0.047 mmol) en ácido trifluoroacético acuoso al 95% (0.95 ml) y se agregó tioanisol (0.05 ml). La solución oscura resultante se agitó durante 30 horas a temperatura ambiente y luego se concentró bajo vacío a una goma de color marrón oscuro. La goma se trituró con éter dietílico y se centrifugó. Se separó la solución y el sólido remanente se trituró y se recogió dos veces más de la manera indicada anteriormente. El sólido amarillo se secó en un desecador al vacío durante 2 horas y luego se purificó mediante HPLC (columna C-4 de fase inversa de Vydac (22 x 250 mm ID)). Fase-móvil: A = 0.05% TFA en agua; B = 0.05% TFA en acetonitrilo. El caudal fue de 10.0 mL/min. El gradiente utilizado fue de 8% B a 22% B en un período de 25 min e isocrático al 22% después. El pico de interés (la estructura (20b)) se eluyó a los 42 minutes para dar 2.5 mg del producto desprotegido, la estructura (20b).
MS (ES+) : 563.5 (M + H^{+}).
Ejemplo 3 Actividad de un mimético de hoja beta representativo como sustrato proteolítico
Este ejemplo muestra la capacidad de un mimético de hoja beta representativo de esta invención para servir selectivamente como un sustrato para la trombina y el factor VII. El mimético de hoja beta de estructura (11b) anterior se sintetizó de acuerdo con los procedimientos divulgados en el Ejemplo 1 y se utilizó en este experimento sin ninguna modificación adicional.
Tanto la prueba de trombina como la del factor VII de este experimento se llevarán a cabo a 37°C utilizando un espectrofotómetro UV/Visible Hitachi (modelo U-3000). La estructura (11b) se disolvió en agua desionizada. La concentración se determinó a partir de la absorbancia a 342 nm. Se empleó un coeficiente de extinción de 8270 litros/mol/cm. Se determinó la velocidad de hidrólisis de la estructura (11b) a partir del cambio en la absorbancia a 405 nm utilizando un coeficiente de extinción para la p-nitroanilina de 9920 litros/mol/cm para el buffer de reacción. Las velocidades iniciales se calcularon de la porción lineal inicial de la curva de avance de la reacción. Los parámetros cinéticos se determinaron mediante un ajuste por cuadrados mínimos no lineal y no ponderado de la ecuación de Michaelis-Menten simple a los datos experimentales utilizando GraFit (Versión 3.0, Erithacus Software Limited).
Para la prueba de la trombina, los experimentos se llevaron a cabo en una solución amortiguadora Tris de pH 8.4 (Tris, 0.05 M; NaCl, 0.15 M). Se disolvieron 6.4 unidades NIH de trombina bovina (de Sigma) en 10 ml del buffer de la prueba para dar una solución de trombina 10 nM. En una cubeta UV se agregaron de 130 a 148 \mul de la solución amortiguadora y 100 \mul de la solución de trombina, se preincubó a 37°C durante 2 minutos y, finalmente, para iniciar la reacción, se agregaron de 2 a 20 microlitros (para llevar el volumen final a 250 \mul) de una solución 0.24 mM de la estructura (11b). Se registraron los dos primeros minutos de las reacciones para determinar la velocidad inicial. Se recogieron ocho puntos de concentración de la estructura (11b) para obtener los parámetros cinéticos. Se calculó que k_{cat} y K_{M} eran 50 s^{-1} y 3 \muM, respectivamente. Se determinó que k_{cat}/K_{M} era 1.67x10^{7} M^{-1} s^{-1}.
Para la prueba del factor VII se utilizó una solución amortiguadora Tris de pH 8.0 (Tris 0.05 M, 5 CaCl_{2} mM, NaCl 0.15 M, TWEEN 20 al 0.1%, BSA al 0.1%). Se agregaron 10 \mul de factor VIIa (FVIIa) humano 20 \muM y de factor de tejido (TF) humano 22 \muM al amortiguador de prueba para preparar soluciones de FVIIa y TF 160 nM, respectivamente. Se agregaron de 40 a 48 \mul del buffer, 25 \mul de la solución de FVIIa y 25 \mul de la solución de TF a una cubeta, se incubó a 37°C durante 5 minutos y se agregaron entonces a la cubeta de 2 a 10 \mul de una solución 2.4 mM de la estructura (11b) para iniciar la reacción (el volumen final fue de 100 ml). Se registraron las curvas de avance de la reacción durante los tres minutos iniciales. Se recogieron cinco puntos de concentración para la estructura (11b). Las velocidades iniciales se determinaron mediante un ajuste lineal por cuadrados mínimos contra las concentraciones de la estructura (11b) con GraFit. Se calculó k_{cat}/K_{M} de la pendiente y se encontró que era 17,500 M^{-1}s^{-1}.
Tanto en la prueba de la trombina como en la del factor VII de este experimento, se corrió una prueba de (D)FPR-PNA como control. La actividad de la estructura (11b) comparada con el control fue de 0.76 y 1.38 para la trombina y el factor VII, respectivamente. (Factor VII: K_{cat}/K_{M} = 1.27 x 10^{4} M^{-1} S^{-1}; trombina: K_{cat}/K_{M} = 2.20 x 10^{7} M^{-1} S^{-1}).
Ejemplo 4 Actividad de un mimético de hoja beta como inhibidor de la proteasa
Este ejemplo muestra la capacidad de un mimético de hoja beta representativo de esta invención para funcionar como un inhibidor de la proteasa para la trombina, el factor VII, el factor X, la uroquinasa, el activador del plasminógeno tisular (t-PA), la proteína C, la plasmina y la tripsina. El mimético de hoja beta de la estructura (13b) anterior se sintetizó de acuerdo con los procedimientos divulgados en el Ejemplo 1 y se utilizó en este experimento.
Todas las pruebas de inhibición de este experimento se llevaron a cabo a temperatura ambiente en microplacas de 96 pocillos utilizando una lectora de microplaca Bio-Rad (Modelo 3550). Se disolvieron 0.29 mg de la estructura (13b) en 200 ml de una solución de ácido clorhídrico 0.02 N en agua desionizada. Esta solución (2.05 mM) sirvió como solución stock para todas las pruebas de inhibición. La hidrólisis de los sustratos cromogénicos se siguió a 405 nm. Se registraron las curvas de avance de la reacción mediante la lectura de las placas, típicamente unas 90 veces, a intervalos entre 30 segundos y dos minutos. Las velocidades iniciales se determinaron mediante un ajuste por cuadrados mínimos no lineal y no ponderado a una reacción de primer orden en GraFit. Las velocidades iniciales así determinadas fueron entonces ajustadas no linealmente por cuadrados mínimos contra las concentraciones de la estructura (13b) utilizando GraFit para obtener IC_{50}. Típicamente, se emplearon ocho puntos de concentración de la estructura (13b) para determinar CI_{50}.
Para la prueba de la trombina, se utilizó N-p-tosil-Gly-Pro-Arg-pNA (de Sigma) a una concentración de 0.5 mM en DMSO 1% (v/v) en un buffer Tris de pH 8.4-como sustrato. Se llevaron a cabo dos etapas de dilución de la solución stock de la estructura (13b). Primero, se llevó a cabo una dilución 1:2000 en una solución de ácido clorhídrico 0.02 N, y luego una dilución 1:100 dilution en buffer Tris de pH 8.4. La dilución final de la estructura (13b) sirvió como el primer punto (10 nM). Se preparó una secuencia de siete diluciones a partir del primer punto con un factor de dilución de 2. En cada pocillo de reacción se agregaron 100 \mul de una solución 10 nM de trombina y 50 \mul de una solución de la estructura (13b). Se incubó la mezcla de la enzima y el inhibidor durante 20 mininos y entonces se agregaron 100 \mul de una solución 0.5 mM de sustrato para iniciar la reacción. Se encontró que la CI_{50} de la estructura (13b) contra la trombina era de 1.2\pm0.2 nM.
En la prueba del factor VII, S-2288 (de Pharmacia), como sustrato se utilizó D-Ile-Pro-Arg-pNA 20 \muM en agua desionizada. De la solución stock de la estructura (13b), se preparó una dilución 1:100 en buffer Tris de pH 8.0. Esta dilución sirvió como el primer punto del inhibidor (20 \muM). A partir de este punto de concentración se preparó una secuencia de seis diluciones adicionales con un factor de dilución de 2. Se agregaron a cada pocillo 50 \mul de una solución compleja 16 nM de FVIIa y TF y 40 \mul de las soluciones del inhibidor y las mezclas se incubaron durante 20 minutos antes de añadir 10 \mul de S-2288 20 mM. Se encontró que la CI50 de la estructura (13b) contra el factor VII era de 140\pm3 nM.
En la prueba del factor X assay, el buffer y el sustrato fueron los mismos que se utilizaron para la prueba de la trombina. Se preparó una dilución 1:100 en buffer Tris de pH 8.4 para servir como primer punto. Se prepararon siete diluciones con un factor de dilución de 2. El protocolo de la prueba es el mismo que para la trombina excepto que se utilizó factor Xa bovino (de Sigma) 25 nM en un buffer Tris de pH 8.4 en lugar de trombina. Se encontró que la IC_{50} de la estructura (13b) contra el factor X era de 385\pm17 nM.
En la prueba de la uroquinasa, el buffer fue Tris 0.05 M de pH 8.8 y NaCl 0.05 M en agua desionizada. Como sustrato se utilizó S-2444 (de Sigma), pyroGlu-Gly-Arg-pNA 0.5 mM en agua. Se utilizó el mismo procedimiento de dilución que para el factor VII y el factor X. El protocolo de la prueba es el mismo que para la trombi,na excepto que se utilizó uroquinasa humana 18.5 nM (de Sigma). Se encontró que la IC_{50} es de 927\pm138 nM.
Activador del plasminaógeno tisular (t-PA): El buffer, el sustrato y el esquema de dilución de la estructura (13b) fueron los mismos que se utilizaron para la prueba del factor VII.
Proteína C activada (aPC): El buffer fue el mismo que se utilizó en la prueba de la trombina. Como sustrato, se utilizó S-2366 1.25 mM en el buffer de la prueba. Las diluciones de la estructura (13b) fueron las mismas que para la prueba de la uroquinasa.
Plasminaa: Buffer (véase prueba de la trombina); como sustrato se utilizó S-2551 (de Pharmacia), D-Val-Leu-Lys-pNA, 1.25 mM en el buffer de la prueba. Para las diluciones de la estructura (13b), véase la prueba de la uroquinasa.
En la prueba de la tripsina, se utilizó Tris de pH 7.8 (Tris 0.10 M y CaCl_{2} 0.02 M) como buffer. Como sustrato se utilizó BAPNA (de Sigma) a una concentración de 1 mg/ml en una solución de DMSO 1% (v/v) en agua desionizada. Se prepararon las mismas diluciones de la estructura (13b) que en el caso de la prueba del factor VII. A un pocillo de reacción, se agregaron 40 \mul de tripsina bovina 50 \mug/ml (de Sigma) y 20 \mul de una solución de la estructura (13b) y la mezcla se incubó durante cinco minutos antes de que se añadieran 40 \mul de BAPNA 1 mg/ml para iniciar la reacción. Se encontró que la IC_{50} de la estructura (13b) contra la tripsina es de 160\pm8 nM.
En las pruebas anteriores se corrió una prueba de (D)FPR-CH_{2}Cl ("PPACK") como control. La actividad de la estructura (13b) en comparación con el control fue mayor (véase la Tabla 4).
TABLA 4
IC_{50} (nM)
Enzima PPACK Estructura (13b)
Trombina 1.5 1.2
Factor VII 200 140
Factor X 165 385
Proteína C 281 528
Plasminaa 699 978
Tripsina 212 16
Uroquinasa 508 927
t-PA 106 632
Con respecto al tiempo de protrombina (PT), éste se determinó incubando (durante 30 minutos a 37°C) 100 \mul de plasma de control (de Sigma) con 1-5 \mul de buffer (Tris 0.05 M, NaCl 0.15 M, pH=8.4) o el compuesto de prueba (es decir, PPACK o la estructura (13b)) en el buffer. A la muestra de plasma se agregaron rápidamente 200 \mul de tromboplastina previamente entibiada (a 37°C durante \sim10 minutes) con calcio (de Sigma). Se registró el tiempo requerido para coagular mediante un cronómetro (véase Tabla 5) y se encontró que era comparable con PPACK.
TABLA 5
PT (segundos)
Concentración PPACK Estructura (13b)
0 (Control) 13 13
1 pM - - 13
10 pM - - 17
50 pM - - 18
100 pM - - 23
200 pM - - 24
500 pM 15 27
1 nM 18 30
10 nM 22 31
20 nM 25 - -
30 nM - - 31
40 nM 28 - -
50 nM - - 30
60 nM 30 - -
80 nM 31 33
Ejemplo 5 Actividad de un mimético de hoja beta representativo como inhibidor de la proteasa
Este ejemplo muestra la capacidad de otro mimético de hoja beta representativo de esta invención para funcionar como un inhibidor para la trombina, el factor VII, el factor X, la uroquinasa, el activador del plasminaógeno tisular, la proteína C, la plasmina, la triptasa y la tripsina. El mimético de hoja beta de la estructura (20b) anterior se sintetizó de acuerdo con los procedimientos divulgados en el Ejemplo 2 y se utilizó en este experimento.
Todas las pruebas de inhibición se llevaron a cabo a temperatura ambiente en microplacas de 96 pocillos utilizando una lectora de microplacas Bio-Rad (Modelo 3550). Una solución 1 mM de la estructura (20b) en agua sirvió como solución stock para todas las pruebas de inhibición. La hidrólisis de los sustratos cromogénicos se siguió a 405 nm. Se registraron las curvas de avance de la reacción mediante la lectura de las placas, típicamente unas 60 veces, a intervalos de 30 segundos a dos minutos. Las velocidades iniciales se determinaron mediante un ajuste por cuadrados mínimos no lineal y no ponderado a una reacción de primer orden en GraFit(Erithacus Software Limited, London, England). Las velocidades iniciales así determinadas fueron entonces ajustadas no linealmente por cuadrados mínimos contra las concentraciones de la estructura (20b) utilizando GraFit para obtener Ki. El formato general de estas pruebas fue el siguiente: se colocaron 100 ml de una solución del sustrato y 100 ml de una solución de la estructura (20b) en un pocillo de una microplaca y entonces se añadieron 50 ml de una solución de enzima para iniciar la reacción. Típicamente, se emplearon ocho puntos de concentración de la estructura (20b) para determinar Ki. Los valores de Ki de la estructura (20b) contra nueve serina proteasas se presentan en la Tabla 6.
Trombina: Se utilizó N-p-tosil-Gly-Pro-Arg-pNA (de Sigma) a una concentración 0.5 mM en DMSO 1% (v/v) en buffer Tris de pH 8.0 (Tris, 50 mM, TWEEN 20, 0.1%, BSA, 0.1%, NaCl, 0.15 M, CaCl_{2}, 5 mM) como sustrato. Se realizaron dos etapas de dilución a partir de la solución stock de la estructura (20b), primero, una dilución 1:100 en agua y, luego, una dilución 1:50 en el buffer Tris de pH 8.0 para servir con el primer punto (200 nM). Para la prueba, se realizó una secuencia de siete diluciones a partir del primer punto.
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Factor VII: Se utilizó S-2288 (de Pharmacia), D-Ile-Pro-Arg-pNA, a una concentración 2.05 mM en el buffer Tris de pH 8.0 (véase prueba de la trombina). A partir de la solución stock de la estructura (20b) se preparó una dilución 1:100 en el buffer Tris. A partir de este punto de concentración se realizó una secuencia de siete diluciones adicionales para la prueba.
Factor X: El buffer y el sustrato fueron los mismos que se utilizaron para la prueba de la trombina. Para que sirva como primer punto se realizó una dilución 1:100 en el buffer Tris de pH 8.0. A partir del primer punto se realizaron otras siete diluciones para la prueba.
Uroquinasa: Buffer, Tris 50 mM, NaCl 50 mM, pH=8.8. Como sustrato se utilizó S-2444 (de Sigma), pyroGlu-Gly-Arg-pNA a una concentración de 0.25 mM en el buffer. A partir de la solución stock de la estructura (20b) se realizó una dilución 1:10 en el buffer para que sirva como el primer punto y luego se hicieron, para la prueba, siete diluciones adicionales a partir del primer punto.
Activador del plasminaógeno tisular (t-PA): El buffer, el sustrato y el esquema de dilución de la estructura (20b) fueron los mismo que se utilizarón para la prueba del factor VII.
Proteína C activada (aPC): El buffer fue el mismo que se utilizó en la prueba de trombina. Como sustrato, se utilizó S-2366 a una concentración de 1.25 mM en el buffer de la prueba. Las diluciones de la estructura (20b) fueron las mismas que en la prueba de la uroquinasa.
Plasmina: El buffer (véase la prueba de la trombina); como sustrato se utilizó S-2251 (de Pharmacia), D-Val-Leu-Lys-pNA, a una concentración de 1.25 mM en el buffer de la prueba. Para las diluciones de la estructura (20b), véase la prueba de la uroquinasa.
Triptasa: Como buffer se utilizó Tris 0.1 M, NaCl 0.2 M, heparina 0.1 mg/ml, pH=8.0. S-2366 (de Pharmacia), L-piroGlu-Pro-Arg-pNA, 0.5 mM en el buffer se utilizó como sustrato. A partir de la solución stock 1 mM de la estructura (20b), se preparó una solución 10 mM en agua; entonces se preparó una solución 1 mM en el buffer a partir de la solución 10 mM para que sirva como el primer punto de concentración. A partir de esta concentración se prepararon siete diluciones adicionales para la prueba.
Tripsina: El buffer, el sustrato y el esquema de dilución de la estructura (20b) fueron los mismos que se utilizaron para la trombina.
TABLA 6
Ki (nM)
Enzima Fuente Conc.(nM) de la prueba Estructura (20b)
Trombina Plasma bovino 2 0.66
Factor VII Humano 4 270
Factor X Plasma bovino 8 966
Uroquinasa Riñón humano 3.7 600
t-PA Humano 10 495
APC Plasma humano 1 3320
Plasminaa Plasma bovino 4 415
Triptasa Pulmón humano 2 12.4
Tripsina Páncreas bovino 5 0.64
Como lo muestran ser los datos presentados en la Tabla 6 anterior la estructura (20b) funcionó como un buen inhibidor de la trombina, con buena especificidad contra las enzimas fibrinolíticas.
Ejemplo 6 Síntesis de un mimético de hoja beta representativo
Este ejemplo muestra la síntesis de un mimético de hoja beta representativo de esta invención que tiene la siguiente estructura (21):
144
La estructura (21) se sintetizó de la siguiente manera. Una solución de 48 mg (0.859 mmol) de N^{a}-FMOC-N^{e}-Cbz-a-etanal- Lys-OMe [sintetizado a partir de N^{e}-Cbz-Lys-OMe por el mismo método utilizado para la preparación de la estructura (5) a partir de Phe-OMe], 15.9 mg (0.0859 mmol) de Cys-OEt.HCl y 13.2 \muL (0.0945 mmol) de TEA se agitó en 0.43 mL de CH_{2}Cl_{2} bajo Ar durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió bis(bis(trimetilsilil)amino) estaño(II) (39.8 \muL) y la reacción se agitó durante toda la noche. La solución reaccionante se diluyó con 10 mL de EtOAc y se lavó con citrato al 10%, agua y salmuera, con 6 mL de cada uno de ellos, respectivamente. La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró. El residuo resultante se purificó mediante cromatografía rápida (flash) sobre gel de sílice utilizando 40% EtOAc/hexanos para dar, luego de un secado al vacío, 12.9 mg de un aceite incoloro (23%) como una mezcla de diasteroisómeros por ^{1}H RMN (CDCl_{3}). MS ES(+) m/z 658.2 (MH^{+}, 30), 675.3 (M + Na^{+}, 100), 696.1 (M + K^{+}, 45).
Ejemplo 7 Síntesis de un mimético de hoja beta representativo
Este ejemplo muestra la síntesis de otro mimético de hoja beta de esta invención.
Síntesis de la estructura (22)
145
La estructura (22) se sintetizó de la manera siguiente: A una solución agitada de Cbz-Glu(OBn)-OH (5 g, 13.5 mmol) con DMAP (270 mg) y metanol (3 ml) en diclorometano (100 ml) se agregó EDCI (3g) a 0°C. Luego de agitar a 0°C durante 3h, la solución se agitó a temperatura ambiente (rt) durante toda la noche. Después de concentrar, el residuo se tomó en EtOAc (100 ml) y HCl 1N (100 ml). La fase acuosa se separó y se extrajo con EtOAc (100 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con una solución saturada de NaHCO_{3} (100 ml) y con salmuera (100 ml), se secaron (MgSO_{4}), se pasaron a través de una almohadilla corta de gel de sílice y se concentraron para dar 4.95 g de un aceite (95%). El producto era lo suficientemente puro como para ser utilizado en la próxima reacción sin ninguna purificación adicional. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 2.00 (m, 1H), 2.25 (m, 1H), 2.50 (m, 2H), 3.74 (s, 3H, OCH_{3}), 4.42 (m, 1H, CHNH), 5.10 y 5.11 (dos s, 4H, CH_{2}Ph), 5.40 (d, 1H, NH), 17.35 (s, 10H, phenyls); MS CI(isobutano) m/z 386 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (23)
146
La estructura (23) se sintetizó de la manera siguiente: A una solución agitada de L-Glu-OH (4.41 g, 30 mmol) con trietilamina (8.4 ml, 60 mmol) en 1,4-dioxano (40 ml) y H_{2}O (20 ml) se agregó Boc_{2}O (7 g, 32 mmol) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 1.5h, la solución se acidificó con HCl 6N (pH 2) y se extrajo con EtOAc (3x100 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con H_{2}O (100 ml) y con salmuera (50 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se concentraron para dar un aceite (9.5 g). Sin ninguna purificación adicional, el aceite se utilizó en la próxima reacción.
Una mezcla del aceite anterior (9.5 g) con paraformaldehído (5 g) y p-TsOH\cdotH_{2}O (400 mg) en 1,2-dicloroetano (200 ml) se calentó a reflujo con un condensador de Dean-Stark, el que estaba relleno con un tamiz molecular 4A, durante 6h. Luego de agregar EtOAc (100 mi) y solución saturada de NaHCO_{3} (50 ml), la solución se extrajo con sat. NaHCO_{3} (3x50 ml). Los extractos acuosos combinados se acidificaron con HC1 6N (pH 2) y se extrajeron con EtOAc (3x100 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera (100 m1), se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se concentraron para dar un aceite. El aceite crudo se purificó por cromatografía rápida (flash) (hexano:EtOAc = 80:20 a 70:30 a 60:40) para dar un aceite (4.04 g, 52%) que se solidificó lentamente al quedar estacionario. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1.49 (s, 9H, C(CH_{3})_{3}), 2.18 (m, 1H, -CH_{2}CH_{2}), 2.29 (m, 1H, CH_{2}CH_{2}), 2.52 (m, 2H, -CH_{2}CH_{2}-), 4.33 (m, 1H, NHCHCH_{2}), 5.16 (d, 1H, J = 4.5 Hz, NCH_{2}O), 5.50 (br, 1H, NCH_{2}O); ^{13}C RMN (CDCl_{3}) \delta 25.85, 28.29, 29.33, 54.16, 79.10, 82.69, 152.47, 172.37, 178.13; MS (ES+) m/z 260 (M+H^{+}), 282 (M+Na^{+}), 298 (M+K^{+}).
Síntesis de la estructura (24)
147
La estructura (24) se sintetizó de la manera siguiente: A una solución agitada de 1,1,1,3,3,3-hexametildisilazano (2.1 ml, 10 mmol) en THF (10 ml) se agregó n-BuLi (4 ml de solución 2.5 M en hexano, 10 mmol) a 0°C. La solución resultante se agitó a la misma temperatura durante 30 min. Después de enfriar a -78°C, a esta solución agiltada se agregó una solución de ácido carboxílico (23) (1.02 g, 3.94 mmol) en THF (10 ml) seguido de enjuagues de la jeringa de adición con 5 ml de THF. La solución resultante se agitó a -78°C durante 1h y se agregó PhCH_{2}Br (0.46 ml, 3.9 mmol). Después de agitar a -30°C durante 3 h, a esta solución se agregó HCl 1 N (50 ml) y la solución resultante se extrajo con EtOAc (100 ml). El extracto orgánico se lavó con salmuera (50 ml), se lo secó (Na_{2}O_{4}) y se lo concentró para dar un aceite. El producto crudo se purificó mediante cromatografía rápida (flash) (hexano:EtOAc = 80:20 a 60:40 a 50:50) para dar un sólido esponjoso (1.35 g, 98%): ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1.55 y 1.63 (dos s, 9H, relación 1.5:1 por rotámero, OC(CH_{3})_{3}), 2.2-2.4 (m, 3H, -CH_{2}CH_{2}-), 2.6-2.9 (conjunto de m, 1H, -CH_{2}CH_{2}-), 3.04 (d, 1H, J = 13.5Hz, -CH_{2}Ph), 3.33 y 3.58 (dos d, 1H, J = 13 Hz, relación 2:1, -CH_{2}Ph), 4.03 (dos d, 1H, J = 4Hz, A de ABq, -NCH_{2}O-), 4.96 (dos d, 1H, J = 4Hz, B de ABq, -NCH_{2}O-); MS (ES-) m/z 348 (M-H^{+}).
Síntesis de la estructura (25)
148
La síntesis de la estructura (25) se llevó a cabo de la manera siguiente: A una solución agitada de ácido carboxílico (24) (1.05 g, 3.0 mmol) en THF seco (5 ml) se agregó 1,1'-carbonildiimidazol (500 mg, 3.1 mmol)a temperatura ambiente. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. La solución de acil imidazol se utilizó en la próxima reacción sin ser purificada.
Mientras tanto, a una solución agitada de 1,1,1,3,3,3-hexametildisilazano (1.6 ml, 7.5 mmol) en THF (5 ml) se agregó n-BuLi (3 ml de solución 2.5 M en hexano, 7.5 mmol) a 0°C. Después de agitar a la misma temperatura durante 30 min, la solución se enfrió a -78°C. A la solución agitada se agregó una solución de Cbz-Glu(OBn)-OMe (1.16 g, 3 mmol) en THF (5 ml) seguido de enjuagues de la jeringa de adición con 2 ml de THF. La solución resultante se agitó a la misma temperatura durante 15 min. A esta solución agitada se agregó la acil imidazol anterior en 3 ml de THF. Después de agitar 30 min. a -78°C, a esta solución se agregó NH_{4}Cl sat. (50 ml) y se extrajo con EtOAc (2x75 ml). Los extractos orgánicos combinados se lavaron con NaHCO_{3} sat. (50 ml) y con salmuera (50 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}), se pasaron a través de una almohadilla corta de gel de sílice y se concentraron para dar un aceite. El producto crudo se purificó mediante cromatografía rápida (flash) (hexano: EtOAc = 90:10 a 80:20 a 70:30 a 60:40) para dar un aceite (1.48 g, 69%) : MS (ES+) m/z 734.4 (M+NH_{4}^{+}).
Síntesis de la estructura (26a) 
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149 
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La estructura (26a) se sintetizó de la manera siguiente: Una solución agitada del ceto éster (25) (530 mg, 0.7 mmol) en EtOH/AcOH (10/1 ml), se trató con 10% Pd/C (cerca de 100 mg) bajo una presión de H_{2} de 20 atm durante 2 días. Después de filtrar a través de una almohadilla corta de Celita, el filtrado se concentró y se disolviel en EtOAc (50 ml). La solución se lavó con HCl 1N (30 ml), NaHCO_{3} sat. (30 ml) y con salmuera (30 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró para dar un aceite. El producto crudo se purificó mediante cromatografía rápida (flash) (hexano: EtOAc = 80:20 a 60:40 a 50:50 a 20:80 a 0:100) para dar un sólido esponjoso (95 mg, 34%). TLC (EtOAc) R_{f} 0.68; RMN (CDCl_{3}) \delta 1.38 (dos s, 9H, OC(CH_{3})_{3}), 1.63 (s, 1H), 1.75 (m, 2H), 2.05 (m, 5H), 2.1-2.3 (conjunto O e m, 1H), 3.00 (d, 1H, J = 14 Hz, CH_{2}Ph), 3.21 (d, 1H, J = 13.5 Hz, CH_{2}Ph), 3.74 (collapsado dos s, 4H, OCH_{3} y NCH), 4.53 (d, 1H, J = 9.5 Hz), 5.01 (br, 1H, NH) ; MS (ES+) m/z 403 (M+H^{+}), 425 (M+Na^{+}). Se asignó la éstereoquímica por 2D RMN.
Síntesis de la estructura (27a) 
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La estructura (27a) se sintetizó de la manera siguiente: A una solución de 28 mg (0.070 mmol) del éster bicíclico (26a) agitada en 1 ml de THF a temperatura ambiente, se agregaron 0.14 ml de una solución acuosa de hidróxido de litio 1.0 M. a mezcla se agitó vigorosamente durante 20 h y entonces se la apagó con ácido cítrico acuoso al 5% (1 ml). La mezcla se extrajo con acetato de étilo (3 veces con 25 ml cada vez) y los extractos combinados se lavaron entonces con agua y salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. La filtración y la concentración del filtrado bajo vacío dieron 26 mg de una espuma blance, la que se utilizó sin ninguna purificación adicional.
Síntesis de la estructura (28a)
151
La estructura (28a) se sintetizó de la manera siguiente: Se disolvieron el ácido bicíclico (27a) (26 mg, 0.067 mmol), sal benzotiazolilarginol del ácido trifluoroacético (estructura (17) 61 mg, 0.083 mmol) EDC (9. mg, 0.11 mmol) e hidrato HOBt (16 mg, 0.10 mmol) en THF (5 ml) y se agregó diisopropiletilamina (0.34 ml, 1.9 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 h y luego se la diluyó con acetato de etilo y se extrajo secuencialmente con ácido cítrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio acuoso saturado, agua y salmuera. La solución orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró bajo vacío a 60 mg de un vidrio amarillo. El análisis ^{1}H RMN indicó una mezcla de cuatro amidas diaestereoisoméricas. MS (ES+): m/z 898 (M + Na^{+}).
Síntesis de la estructura (29a)
152
Un mimético de hoja beta de estructura (29a) se sintetizó de la manera siguiente: El hidroxibenzotiazol crudo (28a) (60 mg, 0.068 mmol) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) y se agregó periodinano de Dess-Martin (58 mg, 0.14 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 6h, se diluyó entonces con acetato de etilo y se agitó vigorosamente con tiosulfato de sodio acuoso al 10% durante 10 minutos. Se separó la solución orgánica y se extrajo con bicarbonato de sodio acuoso saturado, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. La concentración del filtrado bajo vacío rindió 42 mg de un vidrio amarillo. El análisis ^{1}H RMN indicó una mezcla de dos cetobenzotiazoles diasteroisoméricos.
Se disolvió el cetobenzotiazol (42 mg, 0.048 mmol) en ácido trifluoroacético acuoso al 95% (0.95 ml) y se agregó tioanisol (0.05 ml). Se agitó la solución oscura resultante durante 18 horas a temperatura ambiente y entonces se concentró bajo vacío a una goma marrón oscuro. Se trituró la goma con éter dietílico y se centrifugó. Se separó la solución y el sólido remanente se trituró y se recogió dos veces más de la misma manera que antes. El sólido amarillo se secó en un desecador al vacío durante dos horas y se purificó entonces mediante HPLC para dar 1.4 mg del producto desprotegido. MS (ES+): 562.4 (M + H^{+}). HPLC: (t_{R}=21.17 min.).
Síntesis de la estructura (26b)
153
La estructura (26b) se sintetizó de la manera siguiente. Una solución agitada del ceto éster (25) (615 mg, 0.86 mmol) en MeOH/AcOH (10/1 ml) se trató con Pd/C (10% cerca de 60 mg) bajo una presión de hidrógeno de 20 atm durante 3 días. Después de filtrar a través de una almohadilla corta de Celita, el filtrado se concentró para dar un aceite. El producto crudo se purificó mediante cromatografía rápida (flash) (hexano : EtOAc =80:20 a 60:40 a 50:50 a 0:100) para recoger la fracción más polar (50 mg). Rf 0.12 (hexano: EtOAc=60:40); MS (ES+) m/z 433 (M+H+).
El aceite anterior se trató con p-TsOH\cdotH_{2}O (5 mg) en 1,2-dicloroetano (10 ml) a la temperatura de reflujo durante 2 días. Después de concentrar, se purificó el producto aceitoso mediante cromatografía de capa fina (TLC por sus siglas en inglés, Thin Layer Chromatography) preparativa (hexano: EtOAc = 80:20 a 60:40) para dar un aceite (10 mg). TLC Rf 0.36 (hexano : EtOAc =60:40); ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1.43 (s, 9H), 1.66 (m, 3H), 1.89 (m, 3H), 2.14 (m, 1H), 2.75 (m, 1H), 2.98 (m, 1H, CHN), 3.72 (s, 3H, Me), 4.30 (m, 1H), 5.59 (d, 1H, NH), 7.1-7.3 (m, 5H, phenyl); MS CI(NH_{3}) 403.2 (M+H+). Se asignó la éstereoquímica por 2D RMN.
Síntesis de la estructura (28b)
154
La estructura (28b) se sintetizó de la manera siguiente: A una solución de 12 mg (0.030 mmol) del éster bicíclico (26b) er 1 ml de THF agitada a temperatura ambiente, se agregó 0.060 ml de una solución acuosa de hidróxido de litio 1.0 M. La mezcla se agitó vigorosamente durante 25 h y luego se la apagó con ácido cítrico acuoso al 5% (1 ml). La mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 veces con 25 ml cada vez) y los extractos combinados se lavaron entonces con agua y salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. La filtration y concentración del filtrado bajo vacío dio 19 mg de una espuma blanca.
Se disolvieron la espuma, la sal lde benzotiazolilarginol del ácido trifluoroacético (30 mg, 0.041 mmol), EDC (10 mg, 0.052 mmol) e hidrato de HOBt (9 mg, 0.059 mmol) en THF (2 ml) y se agregó diisopropiletilamina (0.026 ml, 0.15 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 h, se diluyó entonces con acetato de etilo y se extrajo secuencialmente con ácido cítrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio acuoso saturado, agua y salmuera. La solución orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró bajo vacío para dar 28 mg de un vidrio amarillo. El análisis ^{1}H RMN indicó una mezcla de cuatro amidas diaestereoisoméricas. MS (ES+): m/z 898 (M + Na^{+}).
Síntesis de la estructura (29b)
155
La estructura (29b) se sintetizó de la manera siguiente. The hidroxibenzotiazol crudo (28b) (28 mg) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) y se agregó periodinano de Dess-Martin (29 mg, 0.071 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 18h, se diluyó entonces con acetato de etilo y se agitó vigorosamente con tiosulfato de sodio acuoso al 10% por 10 minutes. La solución orgánica se separó y se extrajo con bicarbonato de sodio acuoso saturado, agua y salmuera, se secó entonces sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. La concentración del filtrado bajo vacío rindió 32 mg de glass amarillo. Un análisis ^{1}H RMN indicó una mezcla de dos cetobenzotiazoles diaestereoisoméricos.
El cetobenzotiazol (32 mg) se disolvió en ácido trifluoroacético acuoso al 95% (0.95 ml) y se agregó tioanisol (0.05 ml). La solución oscura resultante se agitó durante 20 horas a temperatura ambiente y entonces se concentró bajo vacío para dar una goma marrón oscuro. La goma se trituró con éter dietílico y se centrifugó. Se separó la solución y el sólido remanente se trituró y se recogió dos veces más de la misma manera que antes. El sólido amarillo se secó en un desecador al vacío durante 2 horas y entonces se lo purificó mediante HPLC para dar 1.3 m del producto desprotegido. MS (FB+): 562.36 (M + H^{+}); HPLC: t_{R}=21.51 min. (Gradiente de 0 a 90% de TFA al 0.1% en CH_{3}CN/TFA al 0.1% en H_{2}O durante 40 min.).
Ejemplo 8 Actividad de un mimético de hoja beta como inhibidor de la proteasa
Este ejemplo ilustra la capacidad de oro mimético de hoja beta representativos de funcionar como inhibidor para la trombina, el factor VII, el factor X, el factor XI y la tripsina. Los miméticos de hoja beta de las estructuras (29a) y (29b) anteriores se sintetizaron de acuerdo con los procedimientos divulgados en el Ejemplo 7 y se utilizaron en este experimento.
Las pruebas del inhibidor de la proteinasa se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 5 excepto como se describe a continuación para el factor XI. Los resultados se presentan en la Tabla 7.
Factor XI. Se utilizó en esta prueba el mismo buffer que para la prueba de la trombina. Como sustrato se utilizó una solución 1 mM de S-2366 (de Pharmacia), L-piroGlu-Pro-Arg-pNA, en agua. A partir de una solución stock 1mM de la estructura (29a) o (29b) en agua, se realizó una disolución 1:10 en el buffer. Partiendo de esta solución 100 \muM, se realizó una serie de siete diluciones 1:5 en el buffer para la prueba.
TABLA 7
Ki(nM)
Enzimas Estructura (29a) Estructura (29b)
Trombina 10.4 0.085
Tripsina 0.54 0.20
Factor VII 1800 -
Factor X 4600 17
Factor XI 391 -
Ejemplo 9 Actividad de un mimético de hoja beta como inhibidor de la proteasa
Este ejemplo ilustra la capacidad de otros miméticos de hoja beta representativos de esta invención para funcionar como inhibidores para la trombina, el factor VII, el factor X, el factor XI, la triptasa, el aPC, la plasmina, el tPA, la uroquinasa y la tripsina. Los miméticos de hoja beta de las estructuras (20) y (29b) anteriores se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento divulgado en los Ejemplos 2 y 7, respectivamente, y fueron utilizadas en este
experimento.
Las pruebas del inhibidor de la proteinasa se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 5 excepto como se describe en el Ejemplo 8 para el factor XI. Los resultados se presentan en la Tabla 8.
TABLA 8 
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156 
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Ejemplo 10 Síntesis miméticos de hoja beta representativos
Este ejemplo ilustra la síntesis de otro mimético de hoja beta representativo de esta invención.
Síntesis de la estructura (30)
157
La estructura (30) se sintetizó de la manera siguiente: Se agregó n-Butillitio (700 \muL, 1.75 mmol, 2.5 M en hexanos) durante un período de 5 min a una solución de tris(metiltio)metano (256 \muL, 1.95 mmol) en THF (1 ml) a -78ºC. La mezcla se agitó durante 40 min y luego se la trató con a solución de bis-Boc-argininal (estructura (16) del Ejemplo 2) (100 mg, 1.75 mmol) en 2 ml de THF, por goteo, durante un período de 5 min. Después de agitar durante 1.5 h, la reacción se apagó con una solución de NH_{4}Cl saturado y se dejó entibiar a temperatura temperatura ambiente. Se separaron las capas y la capa acuosa se extrajo con EtOAc (3 veces), se lavó con salmuera (1 vez), se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró. Una purificación por cromatografía rápida (flash) (EtOAc:Hexano 1:4) rindió 93 mg (73%) del éster ortotiometílico (estructura (30)) y 8 mg de aldehído recuperado (estructura (16)). ^{1}\cdotH RMN (500 MHz, CDCl_{3}.) \delta 9.80 (s, 1H), 8.32 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.23 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.0 (m, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.64 (br s, 1H), 3.38 (br s, 1H), 3.31 (m, 2H), 2.70 (s, 3H), 2.62 (s, 3H), 2.19 (s, 9H), 2.14 (s, 3H), 1.68-1.50 (m, 4H), 1.49 (s, 9H), 1.43 (s, 9H).
Síntesis de la estructura (31)
158
La estructura (31) se sintetizó de la manera siguiente: Se agitó a temperatura ambiente durante 4 h una mezcla de 77 mg (0.11 mmol) del éster ortotiometílico (estructura (30)), 117 mg (0.43 mmol) de cloruro mercúrico y 39 mg (0.18 mmol) de óxido mercúrico en 2.5 ml de metanol/agua en una proporción 12:1. La mezcla se filtró a través de Celita y el residuo se lavó con EtOAc (3 veces). El filtrado se diluyó con agua y se extrajo con EtOAc (3 veces). La capa orgánica se lavó dos veces con 75% NH_{4}OAc/NH_{4}Cl y luego con NH_{4}Cl y se secó (Na_{2}SO_{4}). El solvente se separó al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía rápida (flash) (EtOAc/Hex, 1:3) para dar 48 mg (72%) de los dos diaestereoisómeros de la estructura (31) en una proporción de 1:2.7. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) (diaestereoisómero principal) \delta 9.80 (s, 1H), 8.33 (t, J = 5.0 Hz, 1H), 6.54 (s, 1H), 4.66 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.08 (dd, J = 5.0, 0 Hz, 1H), 3.97 (m, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.30 (m, 2H), 3.06 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 2.70 (s, 3H), 2.63 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 1.68-1.50 (m, 4H), 1.49 (s, 9H), 1.40 (s, 9H); MS (ES+) m/z 631.5 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (32) 
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159 
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La estructura (32) se sintetizó de la manera siguiente: Una solución de 32 mg del éster metílico (estructura (31)) (0.051 mmol) en THF/agua (4 ml, 1:3) se trató con 5 mg (0.119 mmol) de LiOH\cdotH_{2}O. Después de agitar durante 45 min, la reacción se diluyó con ácido cítrico al 5% y se extrajo con acetato de etilo (3 veces). Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron para dar 30 mg (96%) de la estructura (32) como un sólido blanco. El producto se utilizó sin ninguna purificación adicional. ^{1}H RMN 500 MHz, CDCl_{3}) \delta 9.80 (br s, 1H), 8.29 (br s, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.62 (br s, 1H), 4.08 (m, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.27 (br s, 3H), 2.69 (s, 3H), 2.62 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 1.65-1.50 (m, 4H), 1.48 (s, 9H), 1.37 (s, 9H); MS (ES-) m/z 615.5 (M-H^{+}).
Síntesis de la estructura (33) 
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La estructura (33) se sintetlizó de la manera siguiente. A una solución del compuesto de la estructura (32) (29 mg, 0.047 mmol), HOBt (8 mg, 0.056 mmol) y EDC (11 mg, 0.056 mmol) en THF (5 ml), se agregó fenetilamina (7 ml, 0.056 mmol) seguido de diisopropiletilamina (12 \muL, 0.071 mmol). La mezcla reaccionante se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche y se diluyó con ácido cítrico al 5%. Se separó la capa orgánica y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 veces). Los extractos combinados se lavaron con una solución saturada de NaHCO_{3} y con salmuera, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se filtraron. Luego de la concentración, el producto crudo se purificó por cromatografía (EtOAc/Hex, 1:1) para dar 26 mg (77%) de la estructura (33) en dos etapas. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 9.84 (s, 1H), 8.34 (t, J = 5 Hz, 1H), 7.28 (m, 3H), 7.21 (m, 2 H), 7.04 (m, 1H), 6.55 (s, 1H), 5.16 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 5 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 5.0, 3.0 Hz, 1H), 3.98 (m, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.66 (m, 1H), 3.51 (m, 2H), 3.17 (m, 1H), 2.81 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.71 (s, 3H), 2.65 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 1.68-1.52 (m, 4H), 1.49 (s, 9H), 1.39 (s, 9H); MS (FAB+) m/z 720.6 (M+H^{+}) (FAB-) m/z 718.5 (M-H^{+}).
Síntesis de la estructura (34) 
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La estructura (34) se sintetizó de la manera siguiente. A una solución de fenetilamida (estructura (33), 25 mg, 0.035 mmol) en THF (5 ml) se agregaron 18 mg del monohidrato del ácido p-toluensulfónico (0.093 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche para dar un punto base por TLC. La solución se concentró al vacío, y el residuo se lavó dos veces con éter quitándose así el exceso de pTsOH para dar, la estructura (34) como un sólido blanco amarillento que se utilizó sin ninguna purificación adicional. Los resultados de la 1H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) fueron consistentes con el producto esperado aunque la asignación de picos individuales fue difícil debido al ensanchamiento. MS (ES+) m/z 520.4 (M+H^{+}).
Se hizo reaccionar la estructura (34) con la estructura (9a) del Ejemplo 1 (de una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 2 para la síntesis de la estructura (18)), seguido por la oxidación y la desprotección (de una manera análoga a la que se describe con respecto a la oxidación y desprotección de las estructuras (18) y (19), respectivamente) para dar la estructura (35) como se identifica en la Tabla 9 que se presenta más abajo.
Ejemplo 11 Síntesis de miméticos de hoja beta representativos
Este ejemplo ilustra la síntesis de otro mimético de hoja beta representativo de esta invención.
Síntesis de la estructura (36)
162
La estructura (36) se sintetizó de una manera análoga al compuesto (34) partiendo de bencilannina y la estructura (32). La ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) fue consistente con el producto esperado aunque la asignación de picos individuales fue difícil debido al ensanchamiento. MS (FAB+) m/z 506.4 (M+H^{+}).
Se hizo reaccionar la estructura (36) con la estructura (9a) del Ejemplo 1 (de una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 2 para la síntesis de la estructura (18)), seguido por la oxidación y la desprotección (de una manera análoga a la que se describe con respecto a la oxidación y desprotección de las estructuras (18) y (19), respectivamente) para dar la estructura (37) como se identifica en la Tabla 9 que se presenta más abajo.
Ejemplo 12 Síntesis de miméticos de hoja beta representativos
Este ejemplo ilustra la síntesis de otro mimético de hoja beta representativo de esta invención.
Síntesis de la estructura (38)
163
La estructura (38) se sintetizó de una manera similar a la estructura (34) partiendo de p-clorofenetilamina y la estructura (32). El resultado de la ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) fue consistente con el producto esperado; la asignación de picos individuales fue difícil debido al ensanchamiento. MS (ES+) m/z 554.5 (M+H^{+}).
Se hizo reaccionar la estructura (38) con la estructura (9a) del Ejemplo 1 (de una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 2 para la síntesis de la estructura (18)), seguido por la oxidación y la desprotección (de una manera análoga a la que se describe con respecto a la oxidación y desprotección de las estructuras (18) y (19), respectivamente) para dar la estructura (39) como se identifica en la Tabla 9 que se presenta más abajo.
Ejemplo 13 Síntesis de miméticos de hoja beta representativos
Este ejemplo ilustra la síntesis de otro mimético de hoja beta representativo de esta invención.
Síntesis de la estructura (40)
164
La estructura (40) se sintetizó de una manera similar al compuesto (34) utilizando p-metoxifenetilamina y la estructura (32). La ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) fue consistente con el producto esperado; sin embargo, la asignación individual fue difícil debido al ensanchamiento. MS (ES+) m/z 550.5 (M+H^{+}).
Se hizo reaccionar la estructura (40) con la estructura (9a) del Ejemplo 1 (de una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 2 para la síntesis de la estructura (18)), seguido por la oxidación y la desprotección (de una manera análoga a la que se describe con respecto a la oxidación y desprotección de las estructuras (18) y (19), respectivamente) para dar la estructura (41) como se identifica en la Tabla 9 que se presenta más abajo.
Ejemplo 14 Síntesis de Representativo \beta-Miméticos de hoja beta
Este ejemplo ilustra la síntesis de otro mimético de hoja beta representativo de esta invención.
Síntesis de la estructura (42)
165
La estructura (42) se preparó de la manera siguiente. En un matraz de fondo redondo de 10 ml se agregaron CH_{2}Cl_{2} (10 ml), diclorhidrato de 2,3-dimetilaminopropionato de metilo (19.9 mg, 0.103 mmol, 1.5 eq), y diisopropiletilamina (53 ml, 0.304 mmol, 4.4 eq). Esta suspensión se agitó magnéticamente a temperatura ambiente durante 1 h y en ese momento se agregó el compuesto de la estructura (30) (50 mg, 0.068 mmol, 1 eq), cloruro de mercurio(II) (82.4 mg, 0.304 mmol, 4.4 eq), y óxido de mercurio(II) (25.7 mg, 0.120 mmol, 1.7 eq). La suspensión resultante amarilla se agitó por 16.5 h, tiempo durante el cual la suspensión se volvió gris. La reacción se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (50 ml), se lavó con NH_{4}Cl acuoso saturado (5 ml), NaCl acuoso saturado (5 ml) y se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La suspensión nebulosa se filtró y el solvente se separó al vacío. El sólido blanco se purificó mediante cromatografía de capa fina preparativa para dar la imidazolina de la estructura (42) (25.3 mg, 52% de rendimiento) como un sólido amorfo claro: R_{f} 0.11 (10% MeOH/CHCl_{3}); ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 9.82 (s, 0.6H, N'H, mezcla de tautómeros), 9.78 (s, 0.4H, N''H), 8.35 (dd, J=4.3, 11 Hz, ^{1}H, N-5), 6.54 (s, 1H, ArH), 5.08 (d, J=11 Hz, 1H, CHOH), 4.52 (m, 1H, imidazolina CH_{2}), 4.38 (d, J=21 Hz, 1H), 3.8-4.0 (m, 2H), 3.86 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3.767 (s, 3H, ArOCH_{3}), 3.5-3.7 (m, 2H, C-5 CH_{2}), 3.16-3.27 (m, C-5 CH_{2}), 2.70 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.63 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.14 (s, 3H, ArCH_{3}), 1.5-1.7 (m, 4H, C-3 y C-4 CH_{2}), 1.49 (s, 9H, Boc), 1.46 (s, 9H, Boc); IR (film) 1725.56, 1685.68, 1618.36, 1585.45, 1207.09, 1148.85 cm^{-1}; MS (ES+) m/e 699.4 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (43)
166
La estructura (43) se sintetizó de la manera siguiente. En un matraz de fondo redondo de 25 ml se colocó el compuesto de la estructura (42) (230 mg, 0.33 mmol), CHCl_{3} (5 ml) y MnO_{2} (500 mg, 5.75 mmol, 17.4 eq). Después de agitar la suspensión durante 5 h, se filtró V el sólido se lavó con metanol. El solvente se separó al vacío y el residuo se disolvió en acetato de etilo (5 ml) y metanol (1 ml) y se introdujo una nueva porción de MnO_{2} (500 mg); la reacción se agitó durante 15 h a temperatura ambiente. El sólido se filtró y el solvente se separó al vacío. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo:hexano 1:1, luego con acetato de etilo puro y finalmente con metanol:acetato de etilo 1:9 para obtener el producto deseado (la estructura (43), 190 mg, 83% de rendimiento) como un sólido amorfo.: R_{f} 0.64 (70:30-acetato de etilo:hexano); ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 10.70 (bs, 1H, imidazol NH), 9.70 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 6.54 (s, 1H, ArH), 5.35 (m, 1H, aH), 5.25 (s, 1H, BocNH), 3.926 (s, 3H), 3.840 (s, 3H), 3.15-3.40 (m, 2H), 2.682 (s, 3H), 2.133 (s, 3H), 1.52-1.70 (m, 4H), 1.470 (s, 9H), 1.424 (s, 9H); IR (film) 1724.68, 1619.03, 1277.72, 1151.93, 1120.61 cm^{-1}; MS (ES+) m/e 695.2 (M+H^{+}, 22), 717.2 (M+Na^{+}, 100).
Síntesis de la estructura (44)
167
La estructura (44) se sintetizó mediante el mismo método que se utilizó para transformar la estructura (33) en la estructura (34). El producto se utilizó en el acoplamiento sin ninguna purificación adicional.
Se hizo reaccionar la estructura (44) con la estructura (9a) del Ejemplo 1 (de una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 2 para) la síntesis de la estructura (18)), seguido por la desprotección (de una manera análoga a la que se describe con respecto a la desprotección de la estructura (19)) para dar la estructura (45) como se identifica en la Tabla 9 que se presenta más abajo. En la preparación de la estructura (45), la etapa de acoplamiento se realizó con el compuesto carbonilo de la estructura (44) en lugar de hacerlo con el compuesto 1idroxi análogo.
Ejemplo 15 Síntesis de miméticos de hoja beta representativos
Este ejemplo ilustra la síntesis de otro mimético de hoja beta representativo de esta invención.
Síntesis de la estructura (46)
168
La estructura (46) se sintetizó de una manera similar a la estructura (17) partiendo de la estructura (16) y tiazol. Este compuesto se utilizó en el paso de acoplamiento sin ninguna purificación adicional.
Se hizo reaccionar la estructura (46) con la estructura (9a) del Ejemplo 1 (de una manera análoga al procedimiento descrito en el Ejemplo 2 para la síntesis de la estructura (18)), seguido por la oxidación y la desprotección (de una manera análoga a la que se describe con respecto a la oxidación y desprotección de las la estructuras (18) y (19), respectivamente) para dar la estructura (47) como se identifica en la Tabla 9 que se presenta más abajo.
Ejemplo 16 Síntesis de miméticos de hoja beta representativos
Este ejemplo ilustra la síntesis de otro mimético de hoja beta representativo de esta invención.
Síntesis de la estructura (48)
169
A una solución de ácido \alpha-Boc-\beta-Fmoc-2,3-diaminopropiónico (818 mg, 1.92 mmol) agitada en THF (5 ml) a -25°C se agregó 4-metilmorfolina (0.23 ml, 2.1 mmol) seguido por isobutilcloroformiato (0.25 ml, 1.9 mmol). La suspensión resultante se agitó durante 5 minutes y entonces se filtró con la ayuda de 5 ml de THF. El filtrado se enfrió en un baño de hielo y agua y entonces se agregó por goteo borohidruro de sodio (152 mg, 0.40 mmol) disuelto en agua (2.5 ml). La mezcla se agitó durante 15 minutes, se agregó entonces agua (50 ml) y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 x 50 ml). Los extractos combinados se lavaron con salmuera; se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se filtraron. El filtrado se concentró bajo vacío lo que produjo un sólido amarillo pálido que se purificó mediante cromatografía rápida (flash) (acetato5de etilo/hexanos al 50% como eluyente) para dar 596 mg del alcohol como un sólido blanco.
El alcohol (224 mg, 0.543 mmol) se disolvió en cloruro de metileno y se agregó Periodinano de Dess-Martin (262 mg, 0.64 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, se diluyó entonces con acetato de etilo (50 ml) y se extrajo secuencialmente con Na_{2}S_{2}O_{3} acuoso al 10%, NaHCO_{3} acuoso saturado y salmuera. La solución orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró bajo vacío a un sólido blanco. La purificación del sólido por cromatografía rápida (flash) rindió 169 mg del aldehído de estructura (48) como un sólido blanco.
Síntesis de la estructura (49)
170
La estructura (49) se sintetizó de una manera similar a la estructura (17) partiendo de la estructura (48) y benzotiazol. Este compuesto se utilizó como una mezcla 1:1 de diaestereoisómeros en el paso de acoplamiento (que se describe más abajo) sin ninguna purificación adicional. MS (EI+): m/z 446.4 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (50)
171
La estructura (49), el ácido bicíclico de la estructura (9a) (27 mg, 0.069 mmoi) e hidrato de HOBt (71 mg, 0.46 mmol) se disolvieron en THF (1 ml) y se agregó diisopropiletilamina (0.0.059 ml, 0.34 mmol) seguido de EDC (19 mg, 0.099 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 h y luego se diluyó con acetato de etillo y se extrajo secuencialmente con ácido cítrico acuoso al 5%, bicarbonato de sodio acuoso saturado, agua y salmuera. La solución orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró bajo vacío para dar 61 mg de una espuma amarilla. El análisis ^{1}H RMN indicó una mezcla de amidas diaestereoisoméricas.
La espuma se disolvió en CH_{3}CN y se agregó dietilamina. La solución se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos y se concentró bajo vacío á una espuma amarilla. La espuma se enjuagó con hexanos y se disolvió en DMF (0.5 ml). En un matraz separado, se disolvieron carbonildiimidazol (16 mg, 0.99 mmol) y clorhidrato de guanidina (10 mg, 0.10 mmol) en DMF (1 ml) y se agregó diisopropiletilamina (0.035 ml, 0.20 mmol) seguido de DMAP (1 mg). La solución se agitó durante 1.5 h a temperatura ambiente, se agregó entonces la solución de amina y se continuó agitando durante 16 h. La solución se concentró bajo vacío, se agregó entonces agua al residuo y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (3 x 25 ml). Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se filtraron. La concentración del filtrado bajo vacío produjo 58 mg de la estructura (50) como una espuma amarilla. MS (ES+): m/z 680.6 (M+H^{+}).
La estructura (50) se oxidó para dar la correspondiente cetona de la estructura (51).
Ejemplo 17 Actividades de un mimético de hoja beta representativo como inhibidor de la proteasa
Este ejemplo ilustra la capacidad de un mimético de hoja beta adicional representativo de esta invención para funcionar como un inhibidor de trombina, Factor VII, Factor X, Factor XI, triptasa, aPC, piasmina, tPA, uroquinasa, complejo trombina-trombomodulina y tripsina. Los miméticos de hoja beta de las estructuras listadas en la Tabla 9 presentan la inhibición de actividades que se muestra en la Tabla 10.
Las pruebas del inhibidor de la proteinasa se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 9. La prueba para el complejo trombina-trombomodulina se realizó de la misma manera que para la trombina excepto que, antes de añadir el inhibidor y el sustrato, se preincubó la trombina con trombomodulina 4 nM durante 20 minutos a temperatura ambiente.
TABLA 9 Estructuras, precursore sintéticos y datos físicos para diversos inhibidores de serina proteasa
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174
175
Ejemplo 18 Efecto de un mimético de hoja beta representativo sobre la deposición de plateletas en un injerto vascular
Se midió el efecto de los compuestos de la invención sobre la deposición de plateletas en un injerto vascular, de acuerdo con el procedimiento de Hanson et al. "Interruption of acute plateletdependent thrombosis by synthetic antithrombine D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginyl clorometilketone" Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:3148-3188, (1988), excepto que el compuesto se introdujo cerca de la derivación como se describe en Kelly et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:6040-6044 (1992). Los resultados se muestran en las Figuras 1, 2 y 3 para las estructuras (20b), (39) y (29b), respectivamente.
Ejemplo 19 Síntesis de un mimético de hoja beta representativo
Este ejemplo ilustra la síntesis de otro mimético de hoja beta representativo de esta invención que tiene la estructura que se muestra a continuación.
176
La estructura (52) puede sintetizarse empleando el siguiente producto intermedio (53) en lugar del producto intermedio (16) del Ejemplo 2:
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(Esquema pasa a página siguiente)
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El producto intermedio (53) puede sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
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Alternativamente, el producto intermedio (53) puede sintetizarse mediante el siguiente esquema de reacción:
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Ejemplo 20 Mimético de hoja beta representativo que se une a MHC I y MHC II
Las siguientes estructuras (54), (55) y (56) se sintetizaron mediante las técnicas que se divulgan en este documento.
Se puede demostrar la capacidad de las estructuras (54) y (55) de unirse a las moléculas MHC I como se describe por Elliot et al. (Nature 351:402-406, 1991). Similarmente, la capacidad de la estructura (56) de unirse a las moléculas MHC II puede demostrarse mediante el procedimiento de Kwok et al. (J. Immunol. 155:2468-2476, 1995).
180
181
Ejemplo 21 Mimético de hoja beta representativo que se une al dominio SH2
La siguiente estructura (57) se sintetizó, y la estructura (58) puede sintetizarse, mediante las técnicas divulgadas en este documento.
SH-PTP1
182
MS ES(-) 104.3 (M-H^{+})^{-}; HPLC temperatura ambiente 17.28' (0-90% acetonitrilo/H_{2}O, 0.1% TFA)
STAT6
183
La capacidad de la estructura (58) de unirse al dominio SH2 de STAT6, o de la estructura (57) de unirse al dominio SH2 de la proteína tirosina fosfatasa SH-PTP1, puede demostrarse mediante los procedimientos divulgados por Payne et al. (PNAS 90:4902-4906, 1993). Las bibliotecas de miméticos enlazantes de SH2 pueden evaluarse mediante el procedimiento de Songyang et al. (Cell 72:767-778, 1993).
Ejemplo 22 Mimético de hoja beta representativo que se une a las proteínas quinasas
La siguiente estructura (59) puede sintetizarse mediante las técnicas divulgadas en este documento.
184
La capacidad de la estructura (59) de funcionar como un sustrato o inhibidor de las proteínas quinasas puede demostrarse mediante el procedimiento de Songyang et al. (Current Biology 4:973-982, 1994).
Ejemplo 23 Síntesis de un mimético de hoja beta representativo
Este ejemplo ilustra la síntesis de un mimético de hoja beta representativo de esta invención que tiene las siguientes estructuras (60) a (63), donde B es N o CH:
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Síntesis de la estructura (60) 
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Síntesis de la estructura (61) 
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Síntesis alternativa de la estructura (61) 
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Síntesis de la estructura (62) 
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Síntesis alternativa de la estructura (62) 
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Síntesis de la estructura (63) 
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Ejemplo 24 Biodisponibilidad de un miméticos de hoja beta representativo
Este ejemplo ilustra la biodisponibilidad del compuesto de la estructura (20b) sintetizado en el Ejemplo 2 anterior y que tiene la actividad biológica de la que se informó en el Ejemplo 9 anterior.
Específicamente, un estudio farmacodinámico y farmacocinético de la estructura (20b) se realizó en ratas macho Sprague Dawley. Se administró a las ratas una solución salina de la estructura (20b) a una razón de 4 mg/kg intravenosamente (IV) o 10 mg/kg por vía oral (PO). Se sacrificaron y desangraron grupos de ratas (n = 3 o 4) a las 0.25, 0.5, 1, 2, 4 y 8 horas de la dosificación. Se midieron los parámetros de eficacia, aPTT y TT, para cada muestra de plasma. Se determinaron las concentraciones de la estructura (20b) en el plasma mediante una prueba de inhibición de la tripsina. Los resultados de este experimento se presentan en las Figuras 4A y 4B para dosificaciones de 4 mg/kg IV y 10 mg/kg PO, respectivamente. Los datos presentados en las Figuras 4A y 4B ilustran la eficacia in vivo de la estructura (20b) tanto para una administración intravenosa como para una por vía oral. Un análisis farmacocinético no compartamentalizado de los valores de la concentración media de la estructura (20b) demostraron una vida media terminal de 7.5 hr (intravenosa) y 4.5 hr (oral). La biodisponibilidad de la estructura (20b) administrada por vía oral es aprox. del 27%.
Ejemplo 25 Síntesis de un miméticos de hoja beta representativo
Este ejemplo ilustra la síntesis de un mimético de hoja beta representativo adicional de esta invención que tiene la estructura que se muestra a continuación.
Síntesis de la estructura (64): (Ej. comparativo) 
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La estructura (64) se sintetizó de la manera siguiente. Un matraz de fondo redondo de 150 ml se cargó con 5.19 gramos (24.7 mmol) de triácido 1,2,3-benceno carboxílico, 75 ml de tolueno y 3.3 mL (24.7 mmol) de trietilamina. La reacción se calentó a reflujo durante 3 horas con separación azeotrópica del agua. En este momento se agregaron 2.07 ml de anilina y la reacción se mantuvo nuevamente a reflujo por seis horas con separación azeotrópica del agua. Luego de que se enfriara la solución reaccionante, se formó un producto cristalino (4.68 g) que se eliminó mediante filtrado. La solución se extrajo entonces con NaHCO_{3} y acetato de etilo y la capa bicarbonato se acidificó y se reextrajo con un segundo lavado de EtOAc. La capa orgánica se secó sobre NaSO_{4}, se filtró y se separó el solvente para dar 1.24 gramos adicionales de producto. El rendimiento total fue de 5.92 g (82%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 7.41, (d, 2H, J = 10 Hz), 7.48 (t, 1H, J = 10 Hz), 7.55 (t, 2H, J = 10 Hz), 7.98 (t, 1H, J = 10 Hz), 8.20 (d, 1H, J = 10 Hz), 8.70 (d, 1H, J = 10 Hz); MS (ES-): 266 (M - H^{+}).
Síntesis de la estructura (65) 
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La estructura (65) se sintetizó de la manera siguiente. La imida del ácido de la estructura (64) (53.4 mg, 0.2 mmol) en THF (2 ml) se enfrió a -40ºC y se trató con 24.2 \mul (0.22 mmol) de NMM y 28.2 \mul de IBCF (0.22 mmol). La reacción se agitó durante 3 minutos y entonces se agregaron 0.69 ml (0.69 mmol) de una solución 1 M de diazometano en éter. Se subió lentamente la temperatura a -20 degrees y se agitó la reacción durante 2 h a esta temperatura. La reacción se entibió a 0ºC y se agitó por otras 3 h.
La reacción se diluyó con EtOAc (30 ml) y la fase orgánica se lavó con ácido cítrico al 5%, NaHCO_{3}, y NaCl saturado. Se secó entonces sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para dar 62.4 mg de residuo. Este producto crudo se disolvió en THF, se enfrió a -40ºC y se trató con 74 ul de una solución 4 M de HCl en dioxano. La reacción se entibió a -20ºC y se agitó durante 1 h. Subsecuentemente, la reacción se agitó por 2 h a 0ºC. En este momenmto, una CCF (cromatografía de capa fina) de la mezcla de reacción demostró la desaparición de la diazocetona de partida. Se separó el solvente y el producto se purificó mediante CCF preparativa (EtOAc/hexanos, 7/3) para dar 22.6 mg (38%) de clorometilcetona pura. 1H RMN (CDCl_{3}) \delta 4.93 (s, 2H), 7.35-7.60 (m, 5H), 7.9 (m, 2H), 8.12 (dd, 1H, J = 9, 1.8 Hz); MS (El): 299.1 (M^{+}), 264.0 (M^{+} - Cl), 250.2 (M^{+} - CH_{2}Cl).
Síntesis de la estructura (66): (Ej. comparativo) 
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La estructura (66) se sintetizó de la manera siguiente. A una suspensión agitada de 910 mg (5.14 mmol) de 4-fenilurazol en 50 ml de cloruro de metileno, se agregaron 1.654 g (5.14 mmol) de diacetato de yodobenceno. Se desarrolló un color rojo profundo y, agitando, se disolvió todo el material. Después de agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente, se agregaron 560 mg de ácido 2,4-pentadienoico de 90% de pureza y el color se redujo gradualmente hasta que se formó un sólido blanco. Luego de quince minutos se agregaron 70 mg adicionales de ácido pentadienoico. Después de agitar durante 2 h a temperatura ambiente, se quitó el cloruro de metileno a presión reducida. Se agregó éter (25 ml) y la suspensión resultante se enfrió a -20ºC y se separó por filtración un material sólido (1.41 g, 100%). El producto se pudo recristalizar de EtOAc/ ciclohexano. 1H RMN (CDCl_{3}) \delta 4.04, (d, 1H, J = 20 Hz), 4.40 (d, 1H, J = 20 Hz), 5.17 (s, 1 H), 6.13 (m, 2H) 7.4-7.5 (m, 5H); MS (ES-): 271.9 (M - H^{+}), 228.1 (M - CO_{2}H).
Síntesis de la estructura (67): (Ej. comparativo) 
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La estructura (67) se sintetizó de la manera siguiente. El aducto de Diels-Alder de la estructura (66) (432 mg, 1.57 mmol) se mezcló con 150 mg de Pd/C 10% en 50 ml de MeOH. La reacción se agitó durante toda la noche bajo una atmósfera de hidrógeno (globo de hidrógeno). Luego de 18 h, se tomó una alícuota (1 ml) y se evaporó el solvente a presión reducida. El análisis 1H RMN del residuo mostró una conversión mayor del 95% al producto saturado. La mezcla de reacción se filtró a través de celita y se quitó el solvente mediante un evaporador rotatorio, para dar 424 mg de un producto cristalino. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1.72 (m, 1H), 1.91 (m, 1H), 2.02 (m, 1H), 2.31 (m, 1H) 3.18 (m, 1H), 4.18 (d, 1H, J = 10 Hz), 4.88 (d, 1H, J = 12 Hz), 7.35-7.5 (m, 5H); MS (ES-) 274 (M - H^{+}).
Síntesis de la estructura (68) 
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La estructura (68) se sintetizó de la manera siguiente. A una solución de 450 mg (1.64 mmol) de (67) en 40 ml de cloruro de metileno se agregaron 142 \muL de cloruro de oxalilo (1.64 mmol) y una gota de DMF. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche bajo Ar. El cloruro de metileno se separó mediante un evaporador rotatorio y se agregaron 30 ml de THF. Esta solución se enfrió a -20 degrees y se agregaron 2 ml de una solución 1 M de diazometano en éter. Esta mezcla se agitó durante 4 h mientras se entibiaba gradualmente a la temperatura ambiente. La reacción se enfrió entonces a -78 grados y se agregaron 500 uL de HC1 4 M en dioxano. Se volvió a agitar la reacción bajo Ar al tiempo que se entibiaba gradualmente a la temperatura ambiente. Se separaron los solventes a presión reducida para dar una mezcla (según un análisis ^{1}H RMN) de clorometilcetona y éster metílico. La misma se cromatografió en gel de sílice (EtOAc) para dar 185 mg (36%) de clorometilcetona. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1.62 (m, 1H), 1.86 (m, 1H), 2.08 (m, 1H), 2.39 (m, 1H), 3.26 (m, 1H), 3.97 (m, 1H), 4. 20 (1/2 de quarteto AB, 1H, J = 15 Hz), 4.26 (1/2 de quarteto AB, 1H, J = 15 Hz), 4.94 (m, 1H), 7.35-7.55 (m, 5H); MS (ES+): 308 (M + H^{+}), 330 (M + Na^{+}).
Síntesis de la estructura (69) 
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198 
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La estructura (69) se sintetizó de la manera siguiente. A 4-fenil urazol (1.179 g, 6.65 mmol) en 60 ml cloruro de metileno se agregaron 2.14 g diacetato de yodobenceno (6.64 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente. Se desarrolló un color rojo profundo a medida de que se disolvieron gradualmente todos los sólidos. Luego de aproximadamente 15 minutos, se agregaron 640 mg de sorbinal (6.66 mmol) en 10 ml cloruro de metileno al matraz de reacción y el color rojo desapareció lentamente. Luego de dos horas, se separó el cloruro de metileno a presión reducida. Se agregó éter (30 ml) al residuo resultante y se enfrió a -20 degrees durante toda la noche. El material sólido (1.55 g, 86% de rendimiento) formado se recogió sobre papel de filtro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1.54 (d, 3H, J = 7.5 Hz), 4.57 (m, 1H), 4.90 (m, 1H) 5.86 (m, 1 H), 6.09 (m, 1 H), 7.38 (m, 1H), 7.50 (t, 2H), 7.58, (m, 2H), 9.6 (s, 1H); MS (Cl, NH_{3}): 272 (M + H^{+}), 289 (M + NH_{4}^{+}).
Síntesis de la estructura (70) 
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199 
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A 0.78 gramos (3.0 mmol) del ácido de la estructura (64) en un matraz de fondo redondo de 100 ml se agregaron 20 ml THF y la mezcla de la reacción se enfrió a -20ºC. Se agregó 4-metil morfolina (0.34 ml, 3.0 mmol), lo que fue seguido por la adición de 0.42 ml (3.3 mmol) de cloroformiato de isobutilo. La suspensión resultante se agitó durante 5 min y, entonces, se agregó rápidamente una suspensión de 0.34 gramos (9.0 mmol) de borohidruro de sodio en 0.9 ml de agua. Luego de 4-5 min, se agregaron 40 ml de agua y se extrajo la suspensión con 125 ml de acetato de etilo. Se lavo entonces la capa de EtOAc con agua y salmuera y se secó sobre MgSO_{4}. Una filtration y evaporación del solvente proporcionó el alcohol crudo.
Se disolvió el alcohol crudo en 40 ml de diclorometano y se agregaron 2.0 gramos (4.7 mmol) del reactivo Periodinano de Dess-Martin a temperatura ambiente. La reacción se agitó durante 2 h, se diluyó con 40 ml de diclorometano y se lavó con solución bicarbonato de sodio al 10% y tiosulfato de sodio al 10% en una proporción de 1:1 (en volumen) (3 veces, 20 ml cada una), agua (una vez, 40 ml) y salmuera (1 vez, 40 ml) y se secó sobre sulfato de magnesio. Luego de una filtración, evaporación del solvente y cromatografía rápida (flash) utilizando 30% EtOAc/hexanos se obtuvo el aldehído puro (0.5 g, 67% en 2 etapas). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 Mhz) \delta 11.09 (s, 1H), 8.33 (dd, 1H, J = 8, 1 Hz), 8.20 (dd, 1H, J = 8, 1 Hz), 7.93 (t, 1H, J = 8 Hz), 7.54 (m, 2H), 7.45 (m, 3H).
Síntesis de la estructura (71) 
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200 
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A 3 ml de tetrahidrofurano en un matraz de fondo redondo de 25 ml se agregó 0.066 ml (0.69 mmol) propiolato de metilo y la solución se enfrió a -78°C. Se agregó n-butillitio por goteo (0.28 ml, 0.69 mmol) y la reacción se agitó por 7-10 min y, en ese momento, se agrgegaron rápidamente 3 ml de una solución en diclorometano de 0.15 g (0.6 mmol) del aldehído de la estructura (70). La reacción se agitó a -78°C por 35-45 min y se apagó entonces con 1.5 ml de solución saturada de cloruro de amonio. Los solventes orgánicos se separaron a presión reducida y la capa acuosa se extrajo con 24 ml de EtOAc, el que a su vez se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se evaporó el solvente a una presión reducida para dar el producto crudo. Una purificación mediante TLC preparativa utilizando 40% EtOAc/hexanos dio el producto (107 mg, 47%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 7.98 (dd, 1H, J = 7.0, 1.0 Hz), 7.88 (dd, 1H, J = 7.5, 1 Hz), 7.83 (d, 1H, J = 7.0 Hz), 7.54 (m, 2H), 7.45 (m, 3H), 6.01 (d, 1H, J = 9 Hz), 5.02 (d, 1H, J = 9 Hz), 3.78 (s, 3H). MS (EI) 335 (M+), 275.
Ejemplo 26 Actividad de miméticos de hoja beta representativos
En este ejemplo, se ensayaron los compuestos del Ejemplo 25 por la inhibición de la expresión de V-CAM inducida por el TNF en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC por sus siglas en inglés). Luego de una estimulación con citoquinas inflamatorias, las HUVEC expresan moléculas de adhesión de la superficie celular, incluso E-selectina, V-CAM e I-CAM. Los antagonistas de los proteasomas inhiben la expresión inducida por el TNF\alpha de estas moléculas de adhesión, proporcionando así un mecanismo para regular la adhesión de leucocitos y la respuesta inflamatoria.
Más específicamente, se probaron los compuestos (65), (68), (69) y (71) mediante los procedimientos establecidos por Deisher, Kaushansky y Harlan ("Inhibitors of Topoisomerase II Prevent Cytokine-Induced Expression of Vascular Cell Adhesion Molecule-1, While Augmenting the Expression of Endothelial Leukocyte Adhesion Molecule-1 on Human Umbilical Vein Endothelial Cells", Cell Adhesion Commun. 1:133-42, 1993) (publicación que se incorpora a este documento por esta referencia), excepto que se utilizó tetrametilbenzidina en lugar de peróxido de o-fenilenediamina.
Los resultados de este experimento son los siguientes: compuesto (65), 9.6\pm0.1 \muM; compuesto (68), 14.2\pm0.8 \muM; compuesto (69), 32.4\pm1.7 \muM; y compuesto (71) 4.9\pm0.18 \muM.
Ejemplo 27 Síntesis de vinculantes representativos utilizados en la síntesis en fase sólida de los miméticos de hoja beta
Este ejemplo ilustra la síntesis de vinculantes utilizados en la síntesis en fase sólida de los miméticos de hoja beta.
201
202
Síntesis de la estructura (72)
203
En un matraz de fondo redondo de 500 mL se colocaron tris(metiltio)metilarginol (30) (10.70 g, 14.8 mmol) y CH_{2}Cl_{2} (20 mL) y se agitó mágneticamente. En un matraz de Erlenmeyer de 125 mL se colocaron clorhidrato del éster metilo de la cisteína (3.81 g, 22.2 mmol), CH_{2}Cl_{2} (50 mL) y diisopropiletilamina (8.5 mL, 6.3 g, 48.7 mmol). Esta mezcla se agitó hasta que se hubo disuelto el éster metilo de la cisteína (25 min) y la solución tomara la apariencia de una suspensión vagamente nebulosa de clorhidrato de diisopropiletilamina. Esta suspensión se agregó al matraz que contenía el arginol y se agregó CH_{2}Cl_{2} adicional (100 mL) a la reacción. Se agregaron HgCl_{2} (17.7 g, 65.1 mmol) y HgO (5.46 g, 25.2 mmol) a la mezcla de la reacción y la suspensión se agitó lo suficientemente rápido como para que las sales de mercurio permanecieran suspendidas. El matraz fue ligeramente cubierto y agitado a temperatura ambiente por 22 h, tiempo al que se había consumido el material de partida. La solución de color amarillo se apagó con cloruro de amonio saturado y se diluyó con CH_{2}Cl_{2}. Se separaron las capas y se extrajo la capa acuosa (2 veces) con CH_{2}Cl_{2}. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na_{2}SO_{4}/MgSO_{4} y se filtraron a través de una almohadilla de gel de sílice. Los solventes se separaron al vacío y el residuo se purificó dos veces consecutivas sobre gel de sílice, la primera vez eluyendo con acetato de etilo/hexano en una proporción 7:3 y la segunda vez eluyendo con acetato de etilo/hexanol 1:1 y luego acetato de etilo/hexano 7:3. Las purificaciones combinadas rindieron 7.97 g (75% de rendimiento) del N\alpha,N_{G}-bisBoc-N_{G}'-Mtr-1-[(4'-carboximetil)tiazolin-2-il]arginol como una espuma de color amarillo pálido.: ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 9.81 (s, 1H, N_{G}-H), 8.30 (t, J = 5.5 Hz, 1H, N_{d}-H), 6.54 (s, 1H, ArH), 5.12 (t, J = 8.5 Hz, 1H, CHOH), 4.95 (d, J = 8.0 Hz, 1H, BocNH), 4.45 (bs, 1H, NCHCO2Me), 3.83 (s, 3H, ArOCH_{3}), 3.80 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3.64 (dd, J = 11.5, 9.0 Hz, 1H, CH_{2}S), 3.58 (t, J = 8.5 Hz, 1H, CH_{2}S), 3.37-3.31 (m, 1H, CH_{2}-guanidina), 3.31-3.25 (m, 1H, CH_{2}-guanidina), 2.70 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.63 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.14 (s, 3H, ArCH_{3}), 1.54-1.70 (m, 4H, C\betaH y C\gamma H), 1.49 (s, 9H, N_{G} Boc), 1.40 (s, 9H, N\alpha Boc), no se observó C\alphaH.
Síntesis de la estructura (73)
204
Se cargó un matraz de fondo redondo de 300 mL con cloroformo (20 mL) y arginol (72) (7.97 g, 11.1 mmol), y se lo equipó para una agitación magnética. Se agregó dióxido de manganese(IV) (9.65 g, 111 mmol, 10 eq.) y se taponó el matraz. Se agregó cloroformo adicional (10 mL) y se agitó vigorosamente la suspensión durante 8 h a temperatura ambiente luego de lo cual se filtró a través de gel de sílice y se enjuagó con acetato de etilo. El solvente se separó al vacío y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice, (45:55 EtOAc/hexano) para dar N\alpha,N_{G}-bisBoc-N_{G}'-Mtr-1-[(4'-carboximetil)tiazol-2-il]arginol (4.83 g, 61% de rendimiento) como un sólido amorfo amarillo pálido y 1.89 g (24%) de material de partida recuperado.: ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 9.84 (s, 1H, N_{G}-H), 8.36 (bs, 1H, N\delta-H), 8.15 (s, 1H, SCH=C), 6.54 (s, 1H, ArH), 5.10 (d, J = 8.5 Hz, 1H, BocN\alphaH), 3.95 (s, 3H, ArOCH_{3}), 3.95-3.87 (m, 1H, C_{a}H), 3.83 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3.43-3.33 (m, 1H, CH_{2}-guanidina), 3.33-3.25 (m, 1H, CH_{2}-guanidina), 2.70 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.63 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.14 (s, 3H, ArCH_{3}), 1.80-1.55 (m, 4H, C\betaH y C\gammaH), 1.50 (s, 9H, N_{G}Boc), 1.35 (s, 9H, N_{G}Boc); IR (neat) 3328, 1727, 1619, 1566, 1278, 1242, 1152, 1121 cm^{-1}; MS (ES+) m/z 714 (M+H^{+},100)736 (M+Na^{+}, 9), 716 (35), 715 (45).
Síntesis de la estructura (74)
205
A un matraz cónico de 25 mL que contenía H_{2}O (1 mL) se agregó una solución de LiOH 2.0N (0.25 mL, 0.50 mmol, 1.5 eq.) y N\alpha,N_{G}-bisBoc-N_{G}'-Mtr-1-[(4'-carboximetil)tiazol-2-il]arginol (238 mg, 0.33 mmol) en THF (1 mL). Se utilizó una segunda porción de THF (1 mL) para enjuagar el matraz que contenía el arginol y se agregó a la reacción. La mezcla homogénea se agitó magnéticamente a temperatura ambiente por 6.5 h y, en ese momento, se agregaron HCl al 5% (0.34 mL, 0.55 mmol) y acetato de etilo (10 mL). Se separó la capa orgánica y se extrajo la acuosa 2 veces con 10 mL de acetato de etilo cada vez. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaCl saturado y se secaron sobre Na_{2}SO_{4}. El solvente se separó para dar 212 mg (92% de rendimiento) de N\alpha,N_{G}-bisBoc-N_{G}'-Mtr-1-[(4'-ácido carboxílico) tiazol-2-yil]arginol como una espuma de color amarillo pálido.: ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 9.84 (s, 1H, NG-H), 8.39 (t, J = 5.0 Hz, 1H, N_{\delta}5-H), 8.22 (s, 1H, SCH=C), 6.54 (s, 1H, ArH), 5.11 (d, J = 8.0 Hz, 1H, BocN\alphaH), 4.02-3.95 (m, 1H, C_{\alpha}H), 3.95 (s, 3H, ArOCH_{3}), 3.45-3.36 (m, 1H, CH_{2}-guanidina), 3.36-3.27 (m, 1H, CH_{2}-guanidina), 2.69 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.63 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.14 (s, 3H, ArCH_{3}), 1.83-1.62 (m, 4H, C\betaH y C\gammaH), 1.50 (s, 9H, N_{G}Boc), 1.34 (s, 9H, N\alphaBoc); MS (ES+) m/z 700.3 (M+H^{+}, 100), 722.3 (M+Na^{+}, 10), 702.3 (20), 701.3 (38).
Síntesis de la estructura (75)
206
Se cargó un matraz de fondo redondo de 250 mL, equipado para agitación magnética, con CH_{2}Cl_{2} (10 mL), el ácido (74) (3.40 g, 4.86 mmol) y ácido trifluoroacético (2 mL). Luego de 1.5 h la reacción no se había completado. Se agregó ácido trifluoroacético adicional (5 mL) y la solución se agitó otras 4 h. Se separó el solvente al vacío y el residuo se tomó en THF (50 mL). Se agregó solución saturada de NaHCO_{3} (50 mL) (pH\sim7-8) seguido de carbonato de 9-fluorenilmetil-N-succinimidilo (1.97 g, 5.83 mmol, 1.2 eq.) en THF (20 mL). Luego de agitar por 16 h a temperatura ambiente, el material de partida todavía se encontraba presente y el pH era 7.0. Se agregó una solución de Na_{2}CO_{3} 2M (\sim3 mL) (pH=8.5) seguido de una segunda porción de FmocONSu (328 mg, 0.97 mmol, 0.2 eq.). La solución se agitó por otras 2 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavó con hexano (2 veces, 100 mL cada vez). Se agregó acetato de etilo (100 mL) y la mezcla de la reacción se acidificó a un pH=0 con HCl 6 N. Se separó la capa orgánica y se extrajo la capa acuosa con acetato de etilo (2 veces, 100 mL cada vez). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con NaCl saturado y se secaron sobre Na_{2}SO_{4}. Se separó el solvente para dar el ácido Fmoc crudo como una espuma de color marrón. Esta espuma se disolvió en una cantidad mínima de acetato de etilo y se pipeteó en etiléter (250 mL). Se centrifugó el precipitado y se lo recogió. Se concentró el sobrenadante y se lo volcó en etiléter (50 mL). El precipitado de color blanco se centrifugó y los precipitados combinados se secaron al vacío para dar 3.42 g (98% de rendimiento) de N\alpha-Fmoc-N_{G}'-Mtr-1-[(4'-ácido carboxílico)tiazol-2-il]arginol como un polvo blanco.: ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 8.07 (s, 1H, SCH=C), 7.70 (d, J = 7.0 Hz, 2H, Fmoc ArH), 7.46 (dd, J = 5.0, 7.5 Hz, 2H, Fmoc ArH), 7.34 (dd, J = 4.0, 7.5 Hz, 2H, Fmoc ArH), 7.23 (d, J = 7.5 Hz, 2H, Fmoc ArH), 6.49 (s, 1H, ArH), 4.94 (s, 1H, FmocN_{a}H), 4.32-4.23 (m, 2H, FmocCH_{2}), 4.07 (t, J = 5.5 Hz, 1H, FmocCH), 4.02-3.95 (m, 1H, C_{a}H), 3.78 (s, 3H, ArOCH_{3}), 3.27-3.17 (m, 1H, CH_{2}-guanidina), 3.17-3.10 (m, 1H, CH_{2}-guanidina), 2.64 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.57 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.08 (s, 3H, ArCH_{3)}, 1.74-1.49 (m, 4H, C_{b}H y C_{g} H); MS (ES+) m/z 722.3 (M+H^{+}, 85), 736.3 (M+Na^{+}, 21), 723.2 (35).
Síntesis de la estructura (76)
207
Se disolvió el derivado del éster de arginol (42) (1.35 g, 1.93 mmol) en 70 mL de EtOAc a temperatura ambiente. A la solución se agregó dióxido de manganeso (IV) (5 g, 89.2 mmol) y la suspensión se agitó vigorosamente durante 5 h a temperatura ambiente, luego de lo cual se filtró a través de gel de sílice. Se separó el solvente y se purificó el residuo mediante cromatografía rápida (flash) (hexano/EtOAc 30%) para dar el alcohol (76) deseado (0.23 g, 18%) y la cetona (0.153 g, 11.5%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 9.80 (s, 1H, N_{G}-H), 8.34 (bs, 1H, N\delta-H), 7.65 (s, 1H, NCH=C), 6.54 (s, 1H, ArH), 5.20 (b, 1H, BocN\alphaH), 4.89(s, 1H, CHOH), 4.15 (b, 1H, c_{\alpha}H), 3.84 (s, 3H, ArOCH_{3}), 3.83 (s, 3H, CO_{2}CH_{3}), 3.70-3.6 (b, 1H, CH_{2}- guanidina), 3.25-3.15 (m, 1H, CH_{2}-guanidina), 2.70 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.63 (s, 3H, ArCH_{3)}, 2.14 (s, 3H, ArCH_{3}), 1.80-1.55 (m, 4H, C\betaH y C\gamma H), 1.50 (s, 9H, N_{G}Boc), 1.35 (s, 9H, N\alphaBoc); MS (ES+) m/e 697 (M+H^{+}, 100).
Síntesis de la estructura (77)
208
Se disolvió el éster (76) (70 mg, 0.1 mmol) en una mezcla de THF (10 mL) y agua (10 mL). Se agregó LiOH (18 mg, 4.3 mmol) a la solución y la misma se calentó a reflujo por 7 h. Se evaporó la solución resultante. El residuo se disolvió en agua y se extrajo con éter. Se evaporó la capa acuosa. El residuo resultante se disolvió en MeOH y se agregó resina Dowex (50Wx8, forma H^{+}) para acidificar la solución. La resina se separó por filtración y el filtrado se evaporó para proporcionar el ácido (35 mg, 60%). ^{1}H RMN (500 MHz, CD_{3}OD) \delta 7.7(s, 1H, NCH=C), 6.70 (s, 1H, ArH), 4.3 (m, 1H, C\alphaH), 3.87 (s, 3H, ArOCH_{3}), 3.34 (m, 1H, CH_{2}-guanidina), 3.3-3.2 (m, 1H, CH_{2}-guanidina), 2.69 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.61 (s, 3H, ArCH_{3}), 2.14 (s, 3H, ArCH_{3}), 1.73-1.62 (m, 4H, C\betaH y C\gammaH), 1.34 (s, 9H, N\alphaBoc); MS (ES+) m/z 583.3 (M+H^{+}, 100).
Síntesis de la estructura (78)
209
A ácido 4-(cloroetil)benzoico (8.0 g, 0.046 mol) en CH_{3}CN/DMF (80 mL:80 mL) se agregaron NaN_{3} (6.0 g, 0.092 mol), azida de tetra-n-butilamonio (cat.), yoduro de tetra-n-butilamonio (cat.) y se calentó la reacción a un reflujo suave por 7-9 h y, en ese momento, la mezcla de la reacción se transformó en un bloque sólido. Se agregaron agua (350 mL) y EtOAc (500 mL) y la capa acuosa se extrajo con EtOAc(2x400 mL). La capa orgánica se lavó con H_{2}O (250 mL) y con salmuera (300 mL) y se secó sobre Na_{2}SO_{4}. Luego de filtrar y evaporar el solvente se obtuvo un sólido amarillento (9.4 g) que era lo suficientemente puro como para ser utilizado en el paso siguiente. IR (CDCl_{3}) v^{-1} 2111.
Síntesis de la estructura (79)
210
A una solución de (78) (9.4 g, 0.053 mol) en THF/DME (175 mL:60 mL) se agregó trifenilfosfina (15.2 g, 0.058 mol) y la reacción se agitó por 10 m. Se agregó H_{2}O (1.2 mL) y se agitó vigorosamente la reacción a temperatura ambiente por 22-24 h, momento en el que la solución se convirtió en una suspensión espesa. El sólido blanquecino se filtró y se lavó con THF (3x40 mL) para dar, luego de ser secado, 16.4 g de iminofosforano puro. MS (ES+) (M+H^{+}) 426.1.
Síntesis de la estructura (80)
211
Se suspendió el iminofosforano (79) en THF/H_{2}O (320 mL : 190 mL), se agregó HCl 2N (64 mL) y la reacción se calentó a reflujo por 5 h. Se agregó HCl concentrado (11 mL) y se continuó con el reflujo por otras 20 h. Los solventes se separaron bajo vacío y el sólido blanquecino resultante se secó a alto vacío por 2 h (18.0 g) y se utilizó en el paso siguiente sin ninguna purificación adicional.
Síntesis de la estructura (81)
212
A una suspensión de 4 ácido -(aminoetil)benzoico.HCl (80) (9.0 g, 0.019 mol, teórico) en CH_{3}CN (320 mL) se agregó TEA (7.7 mL, 0.053 mol) y la suspensión se enfrió a 0ºC. Se agregó Fmoc-ONSu (9.3 g, 0.026 mol) en una porción y la reacción se dejó entibiar a temperatura ambiente por el espacio de 1 h y se agitó por 1 h más. El solvente se separó a presión reducida y el residuo se disolvió en EtOAc (1200 mL), se lavó con ácido cítrico al 10% (220 mL) y con salmuera (220 mL) y se secó sobre Na_{2}SO_{4}. Luego de filtrar y evaporar el solvente se obtuvo el producto crudo que se purificó mediante cromatografía rápida (flash) utilizando MeOH/CHCl_{3} 8% obteniéndose el producto puro (2.4 g). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 2.81 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.36 (m, 2H), 4.15 (t, 1H, J.= 6.5 Hz), 4.36 (d, 2H, J = 7.0 Hz), 5.24 (br s, 1H), 7.18 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.26 (m, 2H), 7.35 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 7.52 (d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.71(d, 2H, J = 7.5 Hz), 7.92 (d, 2H, J = 8.0 Hz). MS (ES+) (M+H^{+}) 387.7.
213
214
Síntesis de la estructura (82)
215
A 2.20 g (8.4 mmol) de 4-yodo-metilbenzoato bajo nitrógeno se agregaron 1.95 g (12.26 mmol) de Boc-propargilamina, 0.33 g (1.26 mmol) de trifenilfosfina, 0.08 g (0.42 mmol) yoduro de cobrer(I), 2.11 mL (15.1 mmol) de trietilamina y 250 mL de DMF. La solución se agitó y se desgasificó con nitrogen por el espacio de 15 min seguido de la adición de 0.10 g (0.42 mmol) de acetato de paladio(II) y se agitó a temperatura ambiente por 18 h. La solución se diluyó con EtOAc, se lavó 4 veces con ácido cítrico al 5% y 2 veces con salmuera y se secó sobre MgSO_{4}. Una purificación por cromatografía en columna (gel de sílice, hexanos/EtOAc9:1) produjo el éster (82) (2.37 g, 98%) como un sólido anaranjado: ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 1.47 (s, 9H), 3.91 (s, 3H), 4.17 (m, 2H), 4.80 (broad s, 1H), 7.46 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.97 (d, J = 8.5 Hz, 2H).
Síntesis de la estructura (83)
216
A 2.86 g (9.88 mmol) de alquino (82) bajo 1 atm de H_{2} se agregaron 40 mL de dietiléter anhidro y una cantidad catalítica de óxido de platino(IV). Se siguió la reacción mediante cromatografía de capa fina (TLC por sus siglas en inglés), completándose la reacción luego de 13 h. La mezcla se filtró a través de una almohadilla de Celita, se lavó con dietiléter y se separó el solvente al vacío para dar el éster (83) (2.72 g 94%) como un aceite anaranjado: ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 500 MHz) \delta 1.44 (s, 9H), 1.82 (m, 2H), 2.69 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 3.89 (s, 3H), 4.55 (broad s, 1H), 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.94 (d, J = 8.0 Hz, 2H) ; MS (ES+) m/z 294 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (84)
217
A 2.72 g (9.27 mmol) de éster (83) se agregaron 1.17 g (27.18 mmol) de monohidrato de hidróxido de litio, 50 mL de THF y 50 mL de H_{2}O. La solución se agitó a temperatura ambiente por 16 h y se apagó con ácido cítrico al 5%. La reacción se extrajo con EtOAc (4x) y los extractos combinados se lavaron con salmuera y se secaron sobre MgSO_{4}. La separación del solvente produjo el ácido (84)(2.38 g, 92%) como un sólido amarillo pálido: ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 500 MHz) \delta 1.44 (s, 9H), 1.80 (m, 2H), 2.70 (m, 2H), 3.07 (m, 2H), 7.30 (d, J = 8.0 Hz), 7.92 (d, J = 8.0 Hz).
Síntesis de la estructura (85)
218
A 2.38 g de ácido (84) se agregaron 20 mL de diclorometano y 20 mL de TFA. La solución se agitó por 2 h a temperatura ambiente y el solvente se separó al vacío para dar el aminoácido (85) (3.57 g) como un sólido color naranja pálido: ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 500 MHz) \delta 1.98 (m, 2H), 2.79 (m, 2H), 2.95 (m, 2H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz), 7.97 (d, J = 8.0 Hz).
Síntesis de la estructura (86)
219
A 3.57 g (12.20 mmol) del aminoácido (85) se agregaron 70 mL de 1,4 dioxano, 70 de H_{2}O, 1.29 g (12.20 mmol) y 4.93 g (14.6 mmol) de N-(9-fluorenilmetoxicarboniloxi)succinimida. La mezcla nebulosa se agitó por 48 h, se diluyó con un volumen grande de EtOAc y se lavó con cloruro de amonio saturado. La mezcla se extrajo con EtOAc (3 veces) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con bicarbonato saturado y con salmuera y se secaron sobre sulfato de sodio. La separación del solvente al vacío produjo un sólido amarillo pálido que se lavó con éter para dar el ácido (86) (2.85 g 58%; rendimiento del 83% basado en (75)) como un polvo blanco: ^{1}H RMN (CD_{3}OD, 500 MHz) \delta 1.81 (m, 2H), 2.68 (m, 2H), 3.12 (m, 2H), 4.37 (m, 2H), 7.30 (m, 4H), 7.38 (m, 2H), 7.65 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.0 Hz, 2H); MS (ES+) m/z 402 (M+H^{+}).
220
Síntesis de la estructura (87)
221
Se reparó una solución de cloruro de cianometiltrifenilfosfonio (CMTPP por sus siglas en inglés) (8.2 g, 24 mmol) en 75 mL de diclorometano y se agitó por 10 m. on la adición de Fmoc-Lys(Boc) (10 g, 21.3 mmol), clorhidrato de 1-(dimetilaminopropil)-3-etil carbodiimida (EDCI) (4.9 g, 25.6 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP por sus siglas en inglés) (2.2 mmol). Se selló el recipiente de la reacción y se agitó durante doce horas a temperatura ambiente. El solvente se concentró al vacío a un aceite que se disolvió en 300 mL de acetato de etilo y 100 mL de HC1 1N con agitación. Se separaron las capas, y la fase orgánica se extrajo con salmuera (2x50 mL). El acetato de etilo se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró a un sólido. Este material se utilizó sin ninguna purificación adicional. MS (ES+) 752 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (88)
222
El compuesto de la estructura (87) (16 g, 21.3 mmol) se disolvió en 101 mL de MeOH y se enfrió a -78°C. Se hizo burbujear ozono a través de la solución de la reacción con un tubo de dispersión de gases por 3 h. El producto se aisló mediante la separación del MeOH a presión reducida y se purificó en una columna de gel de sílice (200 g de peso seco) equilibrada en una fase movil de acetato de etilo/hexano (3:7). El producto se eluyó con acetato de etilo/hexano (4:6) y, luego de ser secado, dio 5.1 g (47% para los dos pasos). MS (ES+) 511 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (89)
223
El ceto éster (88) (5.1 g, 9.8 mmol) se disolvió en 100 mL de THF. Luego del agregado de borohidruro de tetrametilamonio (1.4 g, 11.8 mmol) a la solución, se selló el recipiente y se agitó por 4 h. La reacción no se había completado hasta ese momento; se agregó más borohidruro (0.21 g, 2.4 mmol) y se continuó agitando por una hora más. La mezcla del la reacción se concentró bajo vacío a un aceite y se la hizo pasar por una columna de gel de sílice (150g de peso en seco) equilibrada y eluida con acetato de etilo/hexano (4:6) para dar 2.7 g (53%) del producto. MS (ES+) 513 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (90)
224
El hidroxiéster (89) (2.7 g, 5.3 mmol) se disolvió en 100 mL de THF y se enfrió a 0° - 5°C. Se agregó LiOH 0.2N (66.5 mL, 13.3 mmol) a la solución refrigerada y se agitó por treinta minutos. La reacción no se había completado hasta ese momento y se agregó más LiOH 0.2N (10.4 mL, 2.1 mmol). La reacción se agitó otros treinta minutos y luego se apagó con 300 mL de acetato de etilo/HCl 0.2N (2:1). Se separó la fase acuosa, se lavó con 100 mL de acetato de etilo y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de magnesio y se filtraron. El filtrado se evaporó al vacío a un aceite y se secó a un sólido (2.0 g, 78%) CDCl_{3} \delta 1.2-1.8 (m,15H), 3.1 (m,2H), 4.1-4.5 (m,5H), 4.6 (m,1H), 5.4 (m,1H), 7.2 (m,2H), 7.4 (m,2H), 7.6 (m,2H), 7.8 (m,2H); MS (ES+) 501 (M+H^{+}).
Síntesis de la estructura (91)
La estructura (91) se sintetizó mediante procedimientos estándar como se muestra en el esquema siguiente.
225
Ejemplo 28 Síntesis de componentes representativos para la síntesis en fase sólida de los miméticos de hoja beta Síntesis de urazol
Las siguientes síntesis son representativas de los procedimientos utilizados para preparar los componentes urazol utilizados en la síntesis. en fase sólida de los miméticos de hoja beta de esta invención.
Síntesis de la estructura (92)
226
La estructura (92) se sintetizó mediante una modificación secundaria del método de Cookson y Gupte (Org. Syntheses, Vol. VI (1988), 936). Mediante un embudo de adición, se agregó 2-n-butilanilina (12.0 mL, 76.6 mmol) en 160 mL de EtOAc a 324 mL de 20% fosgeno en tolueno a temperatura ambiente durante un período de 30 min. La solución se mantuvo a reflujo por 30 min y el solvente se separó por destilación. El aceite residual se disolvió en 75 mL de cloroformo y se agregó mediante un embudo de adición, durante un período de 15 min, a una suspensión de hidrazincarboxilato de metilo (6.90 g, 76.6 mmol) en tolueno a temperatura ambiente La mezcla se mantuvo a reflujo por 1.5 h, tiempo durante el cual se disolvieron todos los sólidos. Luego de enfriar a temperatura ambiente, se formó un precipitado que se recogió por filtración al vacío. Se lavó con tolueno y se secó al vacío para dar 18.17 g de un polvo blanquecino (89%). El producto se utilizó en el siguiente paso sin ninguna purificación adicional. TLC (CH_{2}Cl_{2}/MeOH, 95/5) R_{f} 0.12; ^{1}H RMN (CD_{3}OD) \delta 0.94 (t, 3 H, J = 7.4 Hz), 1.39 (m, 2 H), 1.56 (m, 2 H), 2.61 (m, 2 H), 3.74 (s, 3 H), 7.09-7.21 (m, 4 H); MS (ES+) m/z 265.8 (M+H^{+}, 100).
Síntesis de la estructura (93)
227
El compuesto de la estructura (92) (18.03 g, 68.0 mmol) se suspendió en 190 mL de KOH 4 N y se calentó a reflujo durante 2 horas. Luego de enfriar, la solución clara de color rosado resultante se extrajo con éter (6 veces) y se acidificó con HCl concentrado. El precipitado se recogió por filtración al vacío, se lavó con agua y EtOAc y se secó al vacío durante toda la noche para producir 14.00 g de un sólido blanco (88%). [De ser necesario, los urazoles pueden recristalizarse de MeOH u otro sistema de solventes apropiado.] TLC (CH_{2}Cl_{2}/MeOH/AcOH, 94/4/2) R_{f} 0.63; Pureza* mediante UV: \geq97%; ^{1}H RMN (CD_{3}OD) \delta 0.89 (t, 3 H, J = 7.3 Hz), 1.32 (m, 2 H), 1.51 (m, 2 H), 7.18-7.42 (m, 4 H) ; MS (ES-) m/z 232 (M-H^{+}). Nota: los urazoles generalmente producen un espectro de masas deficiente.
\text{*}Una verificación aproximada de la pureza puede obtenerse midiendo la absorbancia UV de la triazolina derivada de la oxidación del urazol de la siguiente manera. Urazol (5-10 mg) y bis(trifluoroacetoxi)yodobenceno (40 mg) se disuelven en DMF a 5 mL en un matraz aforado. La absorbancia de esta solución rosada se mide a 520 nm (\varepsilon\approx 177) en una cubeta con una longitud de paso de 1 cm en contraste con una referencia de obtiene mediante la siguiente ecuación: Pureza = 2.82(A) (MW)/(m), donde A es la absorbancia, MW es el peso molecular del urazol, y m es el peso en mg de la muestra de urazol.
Síntesis de la estructura (94)
228
Se agregó 4-(fluorometil)-bencilamina (4.1 mL, 28.5 mmol) a una solución agitada de hidrazincarboxilato de metilo (2.56 g, 28.5 mmol) y 1,1'-carbonildiimidazol (4.62 g, 28.5 mmol) en THF (25 mL). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. Se formó un precipitado blanco que se recogió por filtración al vacío, se lavó con THF frío y se secó al vacío para dar 3.22 g de (94) (39%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) \delta 3.57 (s, 3H), 4.26 (d, 2H, J = 6.0 Hz), 7.44 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.64 (d, 2H, J = 8.0 Hz); MS (ES+) m/z 292 (M+H^{+}, 100).
Síntesis de la estructura (95)
229
El compuesto de la estructura (94) (3.22 g, 11.0 mmol) se suspendió en 20 mL de 4 KOH N y sé calentó a reflujo por 3 horas. Luego de enfriar, la solución se acidificó con HCl concentrado. Se formó un precipitado blanco que se recogió por filtración al vacío, se lavó con agua fría y se secó al vacío durante toda la noche para dar 2.45 g de un sólido blanco (86%). Pureza por UV: \geq83%; ^{1}H RMN (DMSO) \delta 4.62 (s, 2H), 7.46 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 7.70 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 10. 29 (bs, 2H); MS (ES-) m/z 258 (M-H^{+}, 100).
Síntesis de dienos
Las síntesis siguientes son representativas de los procedimientos utilizados para preparar los componentes dieno usados en la síntesis en fase sólida de los miméticos de hoja beta de esta invención.
Síntesis de la estructura (95)
230
Una solución de metacroleína (7.01 g, 100 mmol) y (trifenilfosforaniliden)acetato de metilo (35.11 g, 105 mmol) en 150 mL de dicl~orometano seco se mantuvo bajo reflujo por 2 h bajo una atmósfera de nitrógeno. El solvente se evaporó a presión reducida, y el producto selpurificó por cromatografía en una columna corta de gel de sílice (EtOAc-hexanos, 1:9). Luego de evaporar las fracciones que contenían el producto, se obtuvo el compuesto (95) como un aceite claro (8.71 g, 69%). TLC (EtOAc-hexanos, 1:4) R_{f} 0.59 ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1.89 (s, 3 H), 3.76 (s, 3 H), 5.33-5.37 (m, 2 H), 5.87 (d, J = 16 Hz, 1 H), 7.37 (d, J = 16 Hz, 1H).
Síntesis de la estructura (96)
231
El compuesto (96) se sintetizó mediante una modificación del procedimiento de K. Sato et al. (J. Org. Chem. 32:177, 1967). A una suspensión de NaH (60% en aceite mineral, 0.40 g, 10 mmol) en 25 mL de THF seco, enfriada a 0° bajo una atmósfera de nitrógeno, se agregó por goteo fosfonocrotonato de trietilo (2.50 g, 10 mmol) con agitación. Luego de la adición, la solución se agitó a 0ºC por 1.5 h. A la solución de color marrón rojizo, mantenida a 0ºC, se agregó por oteo 3,3-dimetilbutiraldehído (1.00 g, 10 mmol). La solución se dejó entibiar a temperatura ambiente y se agitó por 1 h a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (75 mL) y agua (75 mL) y se separaron las dos capas. La capa orgánica se lavó con agua (2x50 mL) y salmuera (75 mL) y se secó sobre sulfato de sodio. El solvente se separó a presión reducida; una cromatografía rápida (flash) sobre gel de sílice (EtOAc/hexanos, 1:9) rindió 1.00 g (51%) de (96) como un sólido amarillo pálido. CCF (TLC por sus siglas en inglés) (EtOAc/hexanos, 1:9) R_{f} 0.60 ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 0.90 (s, 9 H), 1.29 (t, J = 7 Hz, 3H), 2.04 (d, J = 6 Hz, 2 H), 4.19 (q, J = 7 Hz, 2H), 5.80 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 6.13-6.17 (m, 2H), 7.24-7.39 (m, 2H).
Síntesis de la estructura (97)
232
Una solución de 7,7-dimetil-2,4-octadienoato de metilo (96) (0.99 g, 5 mmol) e hidróxido de sodio (0.60 g, 15 mmol) en metanol (15 mL) y agua (5 mL) se mantuvo a reflujo por 30 m. Después de enfriar a temperatura ambiente, el solvente se separó al vacío y el residuo se disolvió en agua (30 mL). La solución resultante se acidificó a pH 2 con HCl conc.; el precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua (10 mL) y se secó al vacío para dar 0.84 (99%) del ácido como un sólido blanco. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 0.92 (s, 3 H), 2.07 (d, J = 6.5 Hz, 2 H), 5.80 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 6.19-6.23 (m, 2H), 7.34-7.40 (m, 2H).
Ejemplo 29 Síntesis en fase sólida de miméticos de hoja beta representativos
Este ejemplo ilustra la síntesis en fase sólida de los miméticos de, hoja beta representativos (100) a (227) (Tablas 11-15). Los compuestos de este ejemplo se sintetizaron de acuerdo con el siguiente esquema de reacción:
233 
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Procedimiento general: La síntesis de los miméticos de cadena beta se inició mediante la desprotección de la resina Fmoc PAL utilizando piperidina al 25% en DMF. Luego de un lavado abundante con DMF, la resina se trató con el fluoruro ácido del ácido N-Fmoc-4-aminometilbenzoico (81) o (86) y base de Hunigs en DMF hasta que la prueba de Kaiser diera resultados negativos. Alternativamente, los vinculadores protegidos con Fmoc basados en tiazol (75) o imidazol (77) se acoplaron a la resina utilizando BOP, HOBt y DIEA. En algunos casos, se unió Fmoc-Leu u otro aminoácido a la resina antes de hacerlo a los vinculadores basados en tiazol (75) o imidazol (77) mediante la misma metodología. En el caso de las estructuras (217)-(221), el isocianato (91) se acopló a la resina de wang durante toda la noche en la presencia de HCl catalítico en diclorometano. La desprotección de todos los vinculadores protegidos por Fmoc se efectuó mediante el tratamiento con piperidina al 25% en DMF, y la desprotección del vinculador protegido por Boc (77) se efectuó mediante TMS-Cl (1 M) y fenol (3 M) en diclorometano por 30 min. El derivado de lisinol (90) se acopló a los vinculadores N-Fmoc-4-aminometilbenzoic, (81) o (86) ligados a la resina ácido utilizando PyBOP, HOBt y base de Hunigs en DMF hasta que se obtuvieron resultados negativos en la prueba de Kaiser. El tratamiento de la resina con piperidina al 25% en DMF escindió entonces el grupo FMOC. Luego de un lavado con DDIF, se acopló un ácido dienoico a los vinculadores ligados a la resina utilizando PyBOP, HOBt y base de Hunigs en DMF hasta que el resultado de una prueba de Kaiser fue negativo. La cicloadición se llevó a cabo mediante el tratamiento de una solución de una pirazolidindiona (que no s muestra) o urazol en DMF con una solución de [bis(trifluoroacetoxi)yodo]benceno en DMF. El dieno con soporte en el polímero se trató con la solución resultante por 2-16 horas. Se lavó entonces la resina con DMF y CH_{2}Cl_{2}. La oxidación de la cetoamida se efectuó mediante el tratamiento de la resina con una solución de Periodinano de Dess-Martin en DMSO por 60 min. La resina se lavó con CH_{2}Cl_{2} y el producto se escindió de la resina mediante el tratamiento de la misma con 95:5 TFA:H_{2}O por 1-12 h. Se recogió el sobrenadante y la resina se lavó con TFA adicional. Los filtrados combinados se concentraron al vacío. El residuo se precipitó con dietiléter y se decantó el éter. Se reconstituyó el sólido resultante en CH_{3}CN:H_{2}O 1:1 y se liofilizó. Cada uno de los compuestos (100) a (227) de las Tablas 11-15 dio el pico esperado (M+H^{+}) cuando fueron sujetos a un análisis LCMS (ES+). Para las pruebas de inhibición de las enzimas coagulantes, los compuestos se ensayaron como mezclas de diaestereoisómeros.
Todos los compuestos listados en las Tablas 11-15 tuvieron un Ki < 100 nM como inhibidores de la trombina o fueron activos como inhibidores del Factor VIIa (Tabla 15). Los compuestos marcados con un "*" en las Tablas 11-15 tuvieron un Ki < 10 nM como inhibidores de la tromina y representan realizaciones preferidas.
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TABLA 11 
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234
235
236
237
238
239
240
241
242
243
244 
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TABLA 12
245
246
247 
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TABLA 13
249
250 
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TABLA 14
251 
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TABLA 15 
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253 
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254 
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Ejemplo 30 Síntesis de miméticos de hoja beta representativos
Este ejemplo es una ilustración adicional de la síntesis de miméticos de hoja beta representativos de esta invención.
255
Síntesis de la estructura (228)
256
Se disolvieron metil-2,4-dioxo-pentanoato (14.4 g, 0.10 mol) y 10.6 g de ortoacetato de trimetilo en 100 mL de metanol seguido de la adición de 300 \muL de cloruro de acetilo. Se agitó entonces esta solución a temperatura ambiente por 6 h. Se tomó luego una alícuota y se separó el solvente utilizando a evaporador rotatorio. El análisis ^{1}H RMN del residuo sugirió una conversión completa al éter enol metílico. La solución de la reacción se evaporó al vacío. Mediante ^{1}H RMN, se determinó que la pureza era del 90% y el material se usó en el paso siguiente sin ninguna purificación.
Se disolvieron 2-metoxi-4-oxo-2-pentenona (1.58 g, 10 mmol) y 1.63 g de cloruro de t-butildimetilsililo (11 mmol) en 15 mL de DMF. Se agregó trietilamina (1.553 mL, 12 mmol) y la reacción se agitó durante toda la noche bajo argón a temperatura ambiente. A la mañana siguiente se agregó 50 mL de hexano y la reacción se extrajo con una solución de NaHCO_{3} fría. La capa de hexano se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se separó l hexano bajo vacío para dar 2.01 g del dieno como un aceite (78%), el cual se utilizó sin ninguna purificación adicional. RMN (CDCl_{3}) \delta 0.16 (s, 6H), 0.94 (s, 9H), 3.53 (s, 3H),3.73 (s, 3H),4.32 (bs, 1H), 4.6 (bs,1H), 6.21 (s,1H).
Síntesis de la estructura (229)
257 
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A una mezcla de 4-fenil urazol (177 mg, 1 mmol) y diacetato de yodobenceno (322 mg, 1 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (5 mL) se agregó una solución del dieno (228) (269 mg, 1.05 mmol) en CH_{2}Cl_{2}. La mezcla de la reacción se agitó 30 min y se la enfrió entonces a 0°C. Se agregó por goteo BF_{3}. OEt_{2} (141 mg, 1 mmol), la reacción se agitó por 30 min, se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (50 mL), se lavó con solución de NaHCO_{3} (2x15 mL), agua (15 mL) y salmuera, se secó y se evaporó. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (EtOAc/hexano, 1:3, v/v) para dar el producto puro (97 mg, 32%). ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) \delta 7.53-7.42 (m, 5H),6.30 (s, 1H), 4.47 (s, 2H), 3:97 (s, 3H); MS (EI, 12 eV) 301 (M^{+}, 100), 273.4, 246.3, 1154.4, 119.5.
Ejemplo 31 Síntesis de miméticos de hoja beta representativos
Este ejemplo es una ilustración adicional de la síntesis de miméticos de hoja beta representativos de esta invención.
Síntesis de la estructura (24)
258
A un matraz de fondo redondo de 250 mL secado a la llama se agregaron 130 mL de THF seco. El matraz se enfrió a -78°C bajo una atmósfera de argón y se agregaron 10 mL de n-BuLi 2.5 M seguido de 5.3 mL de hexametildisilazano. Esta solución se agitó a -78°C por 30 min. y se agregaron entonces 2.2 mL de propiolato de metilo. Después de agitar a -78°C por 50 min., se agregaron 2.5 mL (22 mmol) de hexadienal. La reacción se entibió entonces lentamente a -30°C durante un período de 4 h. Luego de una hora a -30°C, la reacción se apagó mediante la adición de una solución acuosa de ácido tartárico. La mezcla de la reacción se particionó entonces entre EtOAc y agua y la capa acuosa se lavó con acetato de etilo adicional. Las capas orgánicas combinadas se lavaron entonces con cloruro de sodio saturado, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron para dar aproximadamente 4.1 g de un aceite rojizo. Una cromatografía rápida (flash) en gel de sílice (20% acetato de etilo/80% hexano) dio 3.1 g de un aceite amarillento (78%). ^{1}H NRM (CDCl_{3}) \delta 1.78 (d, 3H, J=9), 3.79, (s, 3H), 5.01 (bs, 1H), 5.63 (dd, 1H, J=9, 16), 5.84 (m, 1H), 6.06 (m, 1H), 6.38 (dd, 1H, J=16, 9).
Síntesis de la estructura (25)
259
Un matraz de fondo redondo de 500 mL se cargó con fenilurazol (4.91 g) y 150 mL de cloruro de metileno. Se agregó diacetato de yodobenceno (8.94 g) al matraz y la reacción se agitó por 10 min., desarrollándose un color rojo profundo. Se agregó entonces una solución de 5.0 g del compuesto (230) disuelto en 50 mL de cloruro de metileno y la reacción se descoloró instantáneamente. La reacción se agitó a temperatura ambiente por 3 horas adicionales. Se separó el solvente en un evaporador rotatorio y el residuo se colocó bajo alto vacío durante toda la noche. El residuo se purificó via cromatografía rápida (flash) en gel de sílice (40% EtOAc/hexano) para dar 8.3 g de una mezcla \sim60/40 de los alcoholes epiméricos (84%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) (isómero 1): \delta 1.474 (d, 3H, J=7), 3.773 (s, 3H), 4.66 (m, 2H), 4.83 (s, 1H), 5.73 (d, 1H, J=10), 6.19 (bd, 1H, J=10), 7.4=7.56 (m, 5H); (isómero 2): S 1.53 (d, 3H, J=7), 3.77 (s, 3H), 4.64 (m, 1H, 4.72 (m, 1H), 5.18 (bs, 1H), 6.1 (s, 2H) 7.36-7.56 (m, 5H); MS (ES+): 356 (M+1), 378 (M+Na).
Síntesis de la estructura (26)
260
Una solución de 1.0 g de (231) como una mezcla diaestereoisomérica de alcoholes de acetileno se disolvió en 40 mL de MeOH y se enfrió a 0°C en baño de hielo. A la mezcla de reacción se agregó, agitando, 80 mg (\sim3 equivalentes de hidruro) de borohidruro de sodio en polvo. Luego de una hora a 0°C, la reacción se entibió a temperatura ambiente y se agitó por una hora adicional. Se apagó mediante la adición de 100 mL de EtOAc y 60 mL de agua. Las capas se separaron en un embudo de separación y la fase acuosa se extrajo dos veces con EtOAc adicional. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con cloruro de sodio saturado y se secaron sobre sulfato de sodio. Se separó el solvente orgánico mediante un evaporador rotatorio y el residuo se purificó por cromatografía rápida (flash) (40/60 EtOAc/hexanos) para dar 630 mg de una mezcla diaestereoisomérica de alcoholes (\sim63%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) isómero 1: \delta 1.39 (d, 3H, J=11), 3.78 (s, 3H), 4.68 (m, 1H), 4.71 (m, 1H), 4.75 (m, 1H), 5.81 (d, 1H, J=10), 6.16 (dm, 1H, J=10), 6.26 (d, 1H, J=9), 7.01 (d, J=9), 7.01 (d, J=9), 7.35=7.5 (m, 5H). isómero 2: 1.43 (d, 3H, j=10), 3.72 (s, 3H), 4.5 (m, 2H), 5.53 (d, 1H, J=12), 5.86 (m, 2H), 6.12 (d, 1H, J=10), 6.89 (d, 1H, J=10), 7.35-7.5 (m, 5H). MS (ES+) 358 (M+1).
Síntesis de la estructura (27)
261
A una solución de 357 mg del compuesto (231) como una mezcla diaestereoisomérica en 50 mL de cloruro de metileno se agregaron 424 mg del reactivo de Dess-Martin en polvo. Se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 6 h. Se agitó entonces durante cinco minutos con una solución de tiosulfato de sodio y se extrajo con una solución acuosa de bicarbonato. La fase orgánica se lavó con cloruro de sodio saturado y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Se separó el cloruro de metileno por evaporación rotatoria para dar 348 mg de un residuo sólido (97%). \delta 1.61 (d, 3H, J=9Hz), 3.82 (s, 3H), 4.52 (bm, 1H), 5.16 (s, 1H), 5.93 (bd, 1H, J=10Hz), 6.01 (bd, 1H, J=10Hz), 6.88 (d, 1H, J=15Hz), 7.29 (d, 1H, J=15Hz), 7.35-7.55 (m, 5H); MS (EI) 355 (M°).
Síntesis de la estructura (28) 
\vskip1.000000\baselineskip
262
Un matraz de fondo redondo de 100 mL se cargó con 357 mg del compuesto (232) como una mezcla isomérica de alcoholes y 25 mL de THF. La solución reaccionante se enfrió a 0°C, se dejó que la reacción se entibiara a la temperatura ambiente y se agitó durante una hora adicional. Se extrajo entonces con 40 mL de EtOAc y 30 mL de agua. La fase acuosa se acidificó con 1 mmol de ácido tartárico y se volvió a extraer con 40 mL de EtOAc fresco. Se secó la fase orgánica sobre NaSO_{4} anhidro, se filtró y se separó el solvente mediante un evaporador rotatorio para dar 328 mg de un residuo sólido. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) isómero 1: \delta 1.37 (d, 3H, J=6.5), 4.61 (m, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.68 (m, 1H), 5.77 (d, 1H, J=11), 6.12 (d, 1H, J=11), 6.23 (d, 1H, J=15), 7.083 (d, 1H, J=15), 7.35-7.54 (m, 5H); isómero 2: 1.47 (d, 3H, J=6.5), 4.5 (m, 1H), 4.58 (m, 1H), 4.96 (m, 1H), 5.9 (m, 2H), 6.12 (d, 1H, J=16), 6.98 (d, 1H, J=16) 7.35=7.54 (m, 5H).
Ejemplo 32
En este ejemplo, se ensayó la capacidad de los compuestos (231) y (233) del Ejemplo 31 de bloquear la reducción del disulfuro de insulina por la tiooredoxina. Se ha demostrado que la tioredoxina regula hacia arriba NF-kB con respecto a la unión al ADN mediante la reducción de un enlace disulfuro que implica la Cys62 de la subunidad p50 de NF-kB. La tioredoxina también se conoce por reducir los enlaces disulfuro de la insulina 10^{4} veces más rápido que los tioles de bajo peso molecular (Holmgren, J. Biol. Chem. 254:9627-9632, 1979) (publicación que se incorpora a este documento mediante esta referencia). Por lo tanto, si un inhibidor de la activación de NF-kB actúa mediante la inhibición de la tioredoxina, también será capaz de bloquear la reducción de la insulina por la tioredoxina. El ensayo siguiente mide espectrofotométricamente el aumento de la turbidez de la insulina a 650 nm a medida que sus enlaces disulfuro se reducen en presencia de la tioredoxina.
Se utilizó una ligera variante del método de Holmgren. En una placa de microtitulación de 96 pocillos se preactivaron soluciones de tioredoxina en un buffer de fosfato de potasio 0.1 M de pH 6.5 durante 15 minutos en la presencia de ditiotreitol (DTT) 0.33 mM y EDTA 2 mM. Se agregaron soluciones del sustrato y del inhibidor a una concentración final de 8 \muM de tioredoxina, 0.13 mM de insulina, y 0-100 \muM de cualquiera de los compuestos (231) o (233). La turbidez de las soluciones se midió a 650 nM durante el transcurso de 60 minutos en una lectora de placas de absorbancia Spectra Max 250 (Molecular Devices). Los resultados demuestran que la turbidez disminuye con el aumento de la concentración de los compuestos (231) o (233).
Como un control negativo, el inhibidor en la presencia de DTT y EDTA, pero sin que hubiera tioredoxina presente, no exhibió turbidez (el DTT no redujo la tioredoxina durante el período de tiempo examinado). Como un control positivo, se ensayaron en la prueba anterior los productos naturales estructuralmente relacionados partenolida y santonina en lugar de los inhibidores. La partenolida, que contiene una exometileno lactona no saturada y de la que se sabe que inhibe la activación NF-kB de una manera dependiente de la concentración (Bork et al., FEBS Lett. 402: 85-90, 1997), bloqueó de una manera similar la turbidez de la insulina inducida por la tioredoxina. La santonina, que contiene un grupo lactona saturado y que no inhibe la activación de NF-kB, no bloqueó la turbidez de la insulina inducida por la tioredoxina. Tomados en conjunto, estos resultados son prueba de que los compuestos (231) y (233) previenen la activación de NF-kB mediante la inhibición de la tioredoxina.
Ejemplo 33 Actividad de un mimético de hoja beta representativo como un inhibidor de proteasas
263 
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo es una ilustración adicional de la actividad de un mimético de hoja beta de la estructura (234) (preparado mediante los métodos divulgados en el esquema de reacción 20) como un inhibidor de las metaloproteinasas leucina aminopeptidasa M y termolisina. El método es una modificación del método de Spungin-Bialik et al. FEBS Lett. (1996) 380, 79-82.
Se utilizó el siguiente protocolo: Se prepara una solución buffer que contenga Tris-Cl 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl_{2} 1 mM y Triton X-100 al 0.005% (pH=7.5). A partir de esta solución, se prepara una segunda solución buffer de 40 mM en EDTA. Se prepara entonces una solución 750 \muM de sustrato, Suc-Ala-Ala-Phe-pNA, en agua a partir de una solución stock 50 mM de DMSO. Se prepara también una solución 15 nM de termolisina diluyendo con buffer una solución stock 200 \muM de termolisina en glicerina/H_{2}O al 20%. Se diluye una solución de leucina aminopeptidasa M comercialmente disponible (Sigma, 2.6 mg/ml stock en H_{2}O) a 50 \mug/ml con buffer. El inhibidor en EtOH/H_{2}O al 50% se diluye con agua a 3 veces los niveles de concentración deseados. Se agrega 50 \mul de enzima, sustrato e inhibidor por pocillo (placa de microtitulación de 96 pocillos) en el número deseado de tiras de microtitulación. Esto producirá concentraciones finales de 5 nM para la termolisina y de 250 \muM para el sustrato. Los pocillos se incubaron entonces a temperatura ambiente por 20 minutos. Luego de 20 minutos, se agrega EDTA en la solución buffer a todos los pocillos, 50 \mul por pocillo. Esto producirá una concentración final de 10 \mug/ml. La placa debe leerse 100 veces a 405 nm a intervalos de 21 segundas. Se calculan los valores de K_{i} como se indicó anteriormente (Ejemplo 5). Se obtuvieron valores de K_{i} para el compuesto (234) de 6 y 11 \muM para la termolisina y la leucina aminopeptidasa M, respectivamente. Estos resultados demuestran que un mimético de hoja beta de esta invención puede funcionar como un inhibidor de metaloproteinasas.
Ejemplo 34 Actividad de a Representativo \beta-Sheet Mimetic como un Protease Inhibidor
264
Este ejemplo es una ilustración adicional de la actividad de un mimético de hoja beta de la estructura (235) (preparado por los métodos divulgados en el esquema de reacción 15) como un inhibidor de cisteina proteinasa, papaína. El método de ensayo es una modificación del método de Mellor et al. Biochem. J. (1993) 290, 289.
La prueba se realizó en una placa de microtitulación como en el Ejemplo 4. Se utilizó el siguiente protocolo: Se prepara un buffer que contenga citrato de sodio 0.05 M, NaCl 0.15 M, DTT 2 mM, EDTA 1 mM (pH=6.5). Se diluye con el buffer una solución stock 2 mM de sustrato (Ac-Phe-Gly-pNA) a 200 \muM. Una solución stock 5 mM (en EtOH/H_{2}O al 50%) del inhibidor se diluye a 500 \muM en el buffer y se hacen seis diluciones 1:5 en serie. Se agregan alícuotas de 100 \muL cada una de buffer, sustrato e inhibidor (a las concentraciones apropiadas) por pocillo a una tira de microtitulación de ocho pocillos. Una solución stock 1.0 mM de papaína se diluye a 200 \muM en el buffer y se incuba por 5 min antes de añadir una alícuota de 100 \muL a los pocillos de prueba. La placa debe leerse 100 veces a 405 nm a intervalos de 21 segundos. Los valores de CI_{50} se calculan como se hizo anteriormente (Ejemplo 4). El compuesto (234) exhibió un valor de CI_{50} de 8 \muM. Este resultado demuestra que un mimético de hoja beta de esta invención puede funcionar como un inhibidor de cisteina proteinasas.

Claims (61)

1. Un compuesto que tiene la estructura:
265
y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, donde
B se selecciona de N y CH; G es CH_{2};
D se selecciona de N y C (R_{4});
E se selecciona de 
\hskip0.5cm
--- 
\delm{N}{\delm{\para}{Z}}
--- 
\hskip0.5cm
y 
\hskip0.5cm
--- 
\delm{C}{\delm{\para}{Z}}
--- (R_{1});
R_{1} y R_{4} se seleccionan independientemente de porciones de cadena lateral de aminoácido y derivados de las mismas;
R_{2}' se selecciona de (=0) y porciones de cadena lateral de aminoácido y derivados de las mismas;
R_{2} se selecciona de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de la misma o, tomado en conjunto con G forma un anillo fusionado homocíclico o heterocíclico sustituido o no sustituido;
R_{3} se selecciona independientemente de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de la misma o, tomado en conjunto con G, forma una porción puente seleccionada de -(CH_{2})_{1-2}-, -O- y -S-;
Y y Z representan el resto de la molécula; y dos grupos CH cualesquiera adyacentes del anillo bicíclico pueden formar un doble enlace;
donde Z se selecciona de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de las mismas, un aminoácido, un péptido, una proteína, un mimético de hoja beta, una porción terminal o un grupo protector; y
donde Y se selecciona de fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo y derivados sustituidos de porciones de alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}, donde el sustituyente se selecciona de una o más de las siguientes porciones químicas: -OH, -OR, -COOH, -COOOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, - SO_{2}H, -SOR y halógeno, donde, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{1-12} y aralquilo C_{7-12}; o
Y se selecciona de -H, -R, -SO_{2}R, -SOR, -SO_{2}NHR; -CF_{3}, -C_{2}F_{5}, -NHOH, -NHNHR, -C(=O) H, -C(=O)R, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)OR, C(=O)CH_{2}OR, -C(=O)NHR, -CH_{2}X', -C(=O)CH_{2}X', -C(=O)CH_{2}X', 2200
2201 2202 2203 3204
2205 2206 2207 2208
-C(=O)CH=CHC(=O)OH, -C(=O)CH=CHC(=O)R, -C(=O)CH=CHC(=O)OR, -C(=O)CH=CHC(=O)NRR, -CH(OH)CH=CHC(=O)OH, -CH(OH) CH=CHC(=O)R, -CH(OH)CH=CHC(=O)OR, -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR, -CH=CH
SO_{2}R y -SO_{2} CH=CHR (donde X^{1} es Cl, F, Br o I y, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}), o una porción heterocíclica; o
\newpage
los grupos Y tienen la estructura:
267
donde los grupos R_{4} son porciones organoamina que contienen de 2 a 10 átomos de carbono y al menos un átomo de nitrógeno; y
R_{5} se selecciona de (a) un alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, optionalmente sustituidos con 1-4 sustituyentes halo, alcoxi C_{1-5} y nitro, (b) -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido con halógeno o alcoxi C_{1-5}, (c) -C(=O)NH-aralquilo C_{1-10} donde el grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta cinco grupos independientemente seleccionados de nitro, halógeno, -NH-(C=O)alquilo C_{1-5}, -NH-(C=O)arilo C_{6-10}, alquilo C_{1-5} y alcoxi C_{1-5} y (d) heteroarilo monocíclico y bicíclico de 4 a 11 átomos en el anillo, donde los átomos del anillo se seleccionan de carbono y los heteroátomos oxígeno, nitrógeno y azufre, y donde el anillo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta 4 sustituyentes halógeno, alquilo C_{1-5}, alcoxi C_{1-5}, -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, -C(=O)NH- ariloC_{6-10}, amino, -C(=O)OalquiloC_{1-5} y -C(=O)O-ariloC_{6-10};
o Y es una porción química seleccionada de un aminoácido, un péptido, una proteína, un mimético de hoja beta o un grupo protector,
donde el compuesto no es
268
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde E es
--- 
\delm{N}{\delm{\para}{Z}}
---
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde E es
--- 
\delm{C}{\delm{\para}{Z}}
--- (R_{1})
\newpage
4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
269
5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructuras es
270
6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4 donde B y D son N.
7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4 donde B y D son C.
8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde Y se selecciona de fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo, y derivados sustituidos de porciones alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}, donde el sustituyente se selecciona de una o más de las siguientes porciones químicas: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, -SO_{2}H, -SOR y halógeno, donde, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}.
9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1
donde Y se selecciona de -H, -R, -SO_{2}R, -SOR, -SO_{2}NHR, -CF_{3}, -C_{2}F_{5}, -NHOH, -NHNHR, -C (=O)H, -C(=O)R, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)OR, -C(=O)CH_{2}OR, -C(=O)NHR, -CH_{2}X', -C(=O)CH_{2}X', -C(=O)C(=O)NRR, -C(=O)CH_{2}N_{2}^{+} 2202 2203 2204
2205 2206 2207 2208
-C(=O)CH=CHC(=O)OH, -C(=O)CH=CHC(=O)-R, -C-(=O)CH=CHC(=O)OR, -C(=O)CH=CHC(O) NRR, -CH(OH)CH=CHC(=O)OH, -CH(OH)CH=CHC(=O)R, -CH(OH) CH=CHC(=O)OR, -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR, -CH=
CHSO_{2}R y -SO_{2}CH=CHR (donde X' es Cl, F, Br o I y, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}), o de una porción heterocíclica.
10. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1
donde los grupos Y tienen la estructura:
274 
\newpage
donde los grupos R_{4} son porciones organoamina que tienen de 2 a 10 átomos de carbono y al menos un átomo de nitrógeno; y
R_{5} se selecciona de (a) alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con 1-4 sustituyentes halógeno, alcoxi C_{1-5} y nitro, (b) -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido con halógeno o alcoxi C_{1-5}, (c) -C(=O)NH-aralquilo C_{1-10} donde el grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta cinco grupos independientemente seleccionados de nitro, halógeno, -NH-(C=O)alquilo C_{1-5}, -NH-(C=O)arilo C_{6-10}, alquilo C_{1-5} y alcoxi C_{1-5}, y (d) heteroariloo onocíclico y bicíclico de 4 a 11 átomos en el anillo, donde los átomos del anillo se seleccionan de carbono y los heteroátomos oxígeno, nitrógeno y azufre, y donde el anillo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta 4 sustituyentes halógeno, alquilo C_{1-5}, alcoxi C_{1-5}, -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, -C(=O)NH-ariloC_{6-10}, amino, -C(=O)OalquiloC_{1- 5} y -C(=O)O-ariloC_{6-10}.
11. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
275
12. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
276
13. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 11 donde la estructura es
277
14. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 12 donde la estructura es
278
15. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14 donde B y D son N.
16. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 13 donde B y D son C.
\newpage
17. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12 donde Y se selecciona de fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo, y sustituidos derivados sustituidos de porciones alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}, donde el sustituyente se selecciona de una o más de las siguientes porciones químicas: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, - NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, -SO_{2}H, -SOR y halógeno, donde en cada una de sus apariciones R se selecciona independientemente de uña porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} o aralquilo C_{7-12}.
18. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12 donde Y se selecciona de -H, -R, -SO_{2}R, -SOR, -SO_{2}NHR, -CF_{3}, -C_{2}F_{5}, -NHOH, -NHNHR, -C(=O)H, -C(=O)R, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)OR, -C(=O)CH_{2}OR, -C(=O)NHR, -CH_{2}X', -C(=O)CH_{2}X', -C(=O)C(=O)NRR, -C(=O)CH_{2}N_{2}^{+} 3202 2203 2204 2205 2206
2207 2208 -C(=O)CH=CHC(=O)OH, -C(=O)CH=CHC(=O)-R,
-C-(=O)CH=CHC(=O)OR, -(=O)CH=CHC(=O)NRR, -CH(OH) CH=CHC(=O)OH, -CH(OH)CH=CHC(=O)R, -CH(OH}CH=CHC(=O) OR, -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR, -CH=CHSO_{2}R y -SO_{2} CH=CHR (donde X' es Cl, F, Br o I y, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}), o de una porción heterocícllica.
19. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12 donde los grupos Y tienen la estructura:
282
donde los grupos R_{4} son porciones organoamina que tienen de 2 a 10 átomos de carbono y al menos un átomo de nitrógeno; y
R_{5} se selecciona de (a) alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con 1-4 sustituyentes halógeno, alcoxi C_{1-5} y nitro, (b) -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido con halógeno o alcoxi C_{1-5}, (c) -C(=O)NH-aralquilo C_{1-10} donde el grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta cinco grupos independientemente seleccionados de nitro, halógeno, -NH-(C=O)alquilo C_{1-5}, -NH-(C=O) arilo C_{6-10}, alquilo C_{1-5} y alcoxi C_{1-5}, y (d) heteroarilo monocíclico y bicíclico de 4 a 11 átomos en el anillo, donde los átomos del anillo se seleccionan de carbono y los heteroátomos oxígeno, nitrógeno y azufre, y donde el anillo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta 4 sustituyentes halógeno, alquilo C_{1-5}, alcoxi C_{1-5}, -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, -C(=O)NH-ariloC_{6-10}, amino, -C(=O)OalquiloC_{1-5} y -C(=O)O-ariloC_{6-10}.
20. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
283
21. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
284
22. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 20 donde la estructura es
285
23. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 21 donde la estructura es
286
24. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21 donde Y se selecciona de fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo, y derivados sustituidos de porciones alquilo C_{1-12} alquilo, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}, donde el sustituyente se selecciona de una o más de las siguientes porciones químicas: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, -SO_{2}H, -SOR y halógeno, donde, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}.
25. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21, donde Y se selecciona de -H, -R, -SO_{2}R, -SOR, -SO_{2}NHR, -CF_{3}, -C_{2}F_{5}, -NHOH, -NHNHR, -C(=O)H, -C(=O)R, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)OR, -C(=O)CH_{2}OR, -C(=O)NHR, -CH_{2}X', -C(=O)CH_{2}X', -C(=O)C(=O)NRR, -C(=O)CH_{2}N_{2}^{+}, -C(=O)CH_{2}X',
-C(=O)C(=O)NRR, -C(=O)CH_{2}N_{2}^{+} 2202 2203
2204 2205 2206 2207
2208 -C(=O)CH=CHC(=O)OH, -C(=O)CH=CHC(=O)-R, -C-(=O)CH=CHC(=O)OR,
-C(=O)CH=CHC(=O)NRR, -CH(OH)CH=CHC(=O)OH, -CH(OH)CH=CHC(=O)R, -CH(OH) CH=CHC(=O)OR, -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR, -CH=CHSO_{2}R y -SO_{2}CH=CHR (donde X' es C1, F, Br o I y, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}), o de una porción heterocícllica.
26. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21 donde los grupos Y tienen la estructura:
290
donde los R_{4} grupos son porciones organoamina que tienen de 2 a 10 átomos de carbono y al menos un átomo de nitrógeno; y
R_{5} se selecciona de (a) alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con 1-4 sustituyentes halógeno, alcoxi C_{1-5} y nitro, (b) -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido con halógeno o alcoxi C_{1-5}, (c) -C(=O)NH-aralquilo C_{1-10} donde el grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta cinco grupos independientemente seleccionados de nitro, halógeno, -NH-(C=O)alquilo C_{1-5}, -NH-(C=O)arilo C_{6-10}, alquilo C_{1-5} y alcoxi C_{1-5}, y (d) heteroarilo monocíclico y bicíclico de 4 a 11 átomos en el anillo, donde los átomos del anillo se seleccionan de carbono y los heteroátomos oxígeno, nitrógeno y azufre, y donde el anillo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta 4 sustituyentes halógeno, alquilo C_{1-5}, alcoxi C_{1-5}, -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, -C(=O)NH-ariloC_{6-10}, amino, - C(=O)OalquíloC_{1-5} y -C(=O)O-ariloC_{6-10}.
27. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
291
28. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
292
29. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
293
30. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
294
31. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30 donde Y se selecciona de fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo, y derivados sustituidos de porciones alquilo C_{1-12} alquilo, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}, donde el sustituyente se selecciona de una o más de las siguientes porciones químicas: -OH, -OR, -OOOH, -COOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, -SO_{2}H, -SOR y halógeno, donde, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6- 12} y aralquilo C_{7-12}.
\newpage
32. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 30 donde Y se selecciona de -H, -R, -SO_{2}R, -SOR, -SO_{2}NHR, -CF_{3}, -C_{2}F_{5}, -NHOH, -NHNHR, -C(=O)H, -C(=O)R, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)OR, -C(=O)CH_{2}OR, -C(=O)NHR, -CH_{2}X', -C(=O)CH_{2}X', -C(=O)C (=O)NRR, -C(=O)CH_{2}N_{2}^{+}, 2202 2203 2204 2205 2206
2207 2208 -C(=O)CH=CHC(=O)OH, -C(=O)CH=CHC(=O)R, -C(=O)
CH=CHC(=O)OR, -C(=O)CH=CHC(=O)NRR, -CH(OH)CH=CHC(=O)OH, -CH(OH)CH=CHC(=O)R, -C(=O)
CH=CHC(=O) -R, -C- (=O)CH=CHC(=O)OR, -C(SO)CH=CHC(=O)NRR, -CH(OH)CH=CHC(=O)OH, -CH(OH)CH=CHC(=O)R, -CH(OH)CH=CHC(=O)OR, -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR, -CH=CHSO_{2}R y -SO_{2}CH=CHR (donde X' es Cl, F, Br o I y, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}), o de una porción heterocíclica.
33. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaiones 7 a 30 donde los grupos Y tienen la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
298 
\vskip1.000000\baselineskip
donde los R_{4} grupos son porciones organoamina que tienen de 2 a 10 átomos de carbono y al menos un átomo de nitrógeno; y
R_{5} se selecciona de (a) alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con 1-4 sustituyentes halógeno, alcoxi C_{1-5} y nitro, (b) -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido con halógeno o alcoxi C_{1-5}, (c) -C(=O)NH-aralquilo C_{1-10} donde el grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta cinco grupos independientemente seleccionados de nitro, halógeno, -NH-(C=O)alquilo C_{1-5}, -NH-(C=O)arilo C_{6-10}, alquilo C_{1-5} y alcoxi C_{1-5}, y (d) heteroarilo monocíclico y bicíclico de 4 a 11 átomos en el anillo, donde los átomos del anillo se seleccionan de carbono y los heteroátomos oxígeno, nitrógeno y azufre, y donde el anillo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta 4 sustituyentes halógeno, alquilo C_{1-5}, alcoxi C_{1-5}, -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, -C(=O)NH-ariloC_{6-10}, amino, -C(=O)Oalquilo C_{1-5} y -C(=O)O-ariloC_{6-10}.
34. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
\vskip1.000000\baselineskip
299 
\vskip1.000000\baselineskip
y donde X se selecciona de -(CH_{2})_{1-2}-, -O- y -S-.
\newpage
35. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
\vskip1.000000\baselineskip
300
y donde X se selecciona de -(CH_{2})_{1-2}-, -O- y -S-.
36. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la estructura es
\vskip1.000000\baselineskip
301
y donde X se selecciona de -(CH_{2})_{1-2}-, -O- y -S-.
37. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36 donde Y se selecciona de fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo, y derivados sustituidos de porciones alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}, donde el sustituyente se selecciona de una o más de las siguientes porciones químicas: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, -SO_{2}H, -SOR y halógeno, donde, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}.
38. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36 donde Y se selecciona de -H, -R, -SO_{2}R, -SOR, -SO_{2}NHR, -CF_{3}, -C_{2}F_{5}, -NHOH, -NHNHR, -C(=O)H, -C(=O)R, -(=O)CF_{3}, -C(=O)OR,
-C(=O)CH_{2}OR, -C(=O)NHR, -CH_{2}X', 2202 2203
4204 2205 2206 2207
2208 -C(=O)CH=CHC(=O)-R, -C-(=O)CH=CHC(=O)OR, -C(=O)CH=CHC(=O)NRR,
-CH(OH)CH=CHC(=O)OH, -CH(OH)CH=CHC(=O)R, -CH(OH)CH=CHC(=O)OR, -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR, -CH=CHSO_{2}R y -SO_{2}CH=CHR (donde X' es Cl, F, Br o I y, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}), o de una porción heterocíclica.
\newpage
39. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36 donde los grupos Y tienen la estructura:
304
donde los grupos R_{4} son porciones organoamina que tienen de 2 a 10 átomos de carbono y al menos un átomo de nitrógeno; y
R_{5} se selecciona de (a) alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con 1-4 sustituyentes halógeno, alcoxi C_{1-5} y nitro, (b) -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido con halógeno o alcoxi C_{1-5}, (c) -C(=O)NH-aralquilo C_{1-10} donde el grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta cinco grupos independientemente seleccionados de nitro, halógeno, -NH-(C=O)alquilo C_{1-5}, NH-(C=O)arilo C_{6-10}, alquilo C_{1-5} y alcoxi C_{1-5}, y (d) heteroarilo monocíclico y bicíclico de 4 a 11 átomos en el anillo, donde los átomos del anillo se seleccionan de carbono y los heteroátomos oxígeno, nitrógeno y azufre, y donde el anillo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta 4 sustituyentes halógeno, alquilo C_{1-5}, alcoxi C_{1-5}, C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, -C(=O)NH-ariloC_{6-10}, amino, -C(=O)OalquiloC_{1- 5} y -C(=O)O-ariloC_{6-10}.
40. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 donde Y se selecciona de
2205 2206 2207 2208
-CH(OH)CH=CHC(=O)OR y -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR.
41. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 40 donde Y se selecciona de
307
y -CH(OH)CH=CHC(=O)OR.
42. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 40 donde Y se selecciona de
308
y -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR.
43. Una composición que comprende el compuesto de las reivindicaciones 1 a 42 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
44. El uso de un compuesto para la fabricación de un medicamento para inhibir una proteasa o quinasa en un animal de sangre caliente que lo necesita, donde el compuesto tiene la estructura:
309
y sales farmacéuticamente acepotables del mismo, donde
B se selecciona de N y CH; G es CH_{2};
D se selecciona de N y C(R_{4});
E se selecciona de
--- 
\delm{N}{\delm{\para}{Z}}
--- 
\hskip0.5cm
y 
\hskip0.5cm
---
\delm{C}{\delm{\para}{Z}}
--- (R_{1})
R_{1} y R_{4}, se seleccionan independientemente de porciones de cadena lateral de aminoácido y derivados de las mismas;
R_{2}' se selecciona de (=O) y porciones de cadena lateral de aminoácido y derivados de las mismas;
R_{2} se selecciona de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de la misma o, tomado en conjunto con G, forma un anillo fusionado homocíclico o heterocíclico, saturado o no saturado;
R_{3} se selecciona independientemente de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de la misma o tomado en conjunto con G, forma una porción puente seleccionada de -(CH_{2})_{1-2}-, -O- y -S-;
Y y Z representan el resto de la molécula; y dos grupos CH adyacentes cualesquiera del anillo bicíclico pueden formar un doble enlace;
donde Z se selecciona de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de la misma, un aminoácido, un péptido, una proteína, un mimético de hoja beta, una porción terminal o un grupo protector grupo; y
donde Y se selecciona de fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo, y derivados sustituidos de porciones alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}, donde el sustituyente se selecciona de una o más de las siguientes porciones químicas: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, - SO_{2}H, -SOR y halógeno, donde, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}; o
Y se selecciona de -H, -R, -SO_{2}R, -SOR, -SO_{2}NHR, -CF_{3}, - C_{2}F_{5}, -NHOH, -NHNHR, -C(=O)H, -C(=O)R, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)OR, -C(=O)CH_{2}OR, -C(=O)NHR, -CH_{2}X', -C(=O)CH_{2}X', -C(=O)C(=O)NRR, -C(=O)CH_{2}N_{2}^{+}, 2202 2203 2204
2205 2206 2207 2208
-C(=O)CH=CHC(=O)OH, -C(=O)CH=CHC(=O)R, -C(=O)CH=CHC(=O)OR, -C(=O)CH=CHC(=O)NRR, -CH(OH)CH=CHC(=O)OH, -CH(OH)CH=CHC(=O)R, -CH(OH)CH=CHC(=O)OR, -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR,
-CH=CHSO_{2}R y -SO_{2}CH=CHR (donde X' es Cl, F, Br o I y, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}), o de una porción heterocícllica; o
los grupos Y tienen la estructura:
313
donde los grupos R_{4} son porciones organoamina que tienen de 2 a 10 átomos de carbono y al menos un átomo de nitrógeno; y
R_{5} se selecciona de (a) alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con 1-4 sustituyentes halógeno, alcoxi C_{1-5} y nitro, (b) -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido con halógeno o alcoxi C_{1-5}, (c) -C(=O)NH-a-ralquilo C_{1-10} donde el grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta cinco grupos independientemente seleccionados de nitro, halógeno, -NH- C=O)alquilo C_{1-5}, -NH-(C=O)arilo C_{6-10}, alquilo C_{1-5} y alcoxi C_{1-5}, y (d) heteroarilo monocíclico y bicíclico de 4 a 11 átomos en el anillo, donde los átomos del anillo se seleccionan de carbono y los heteroátomos oxígeno, nitrógeno y azufre, y donde el anillo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta 4 sustituyentes halógeno, alquilo C_{1-5}, alcoxi C_{1-5}, -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, -C(=O)NH-ariloC_{6-10}, amino, -C(=O)OalquiloC_{1-5} y -C(=O)O-ariloC_{6-10};
\newpage
o Y es una porción química seleccionada de un aminoácido, un péptido, una proteína, un mimético de hoja beta o un grupo protector grupo.
45. El uso de acuerdo con 1 reivindicación 44 donde el medicamento es para inhibir una proteasa.
46. El uso de acuerdo con la reivindicación 45 donde la proteasa es una serina proteasa.
47. El uso de acuerdo con la reivindicación 46 donde la serina proteasa se selecciona de trombina, Factor Xa, Factor IXa, Factor VIIa, Factor XIa, uroquinasa, triptasa y kallikrein.
48. El uso de acuerdo con la reivindicación 47 donde la serina proteasa es la trombina.
49. El uso de acuerdo con la reivindicación 47 donde la serina proteasa es el Factor VIIa.
50. El uso de acuerdo con la reivindicación 47 donde la serina proteasa es la triptasa.
51. El uso de acuerdo con la reivindicación 45 donde la proteasa se selecciona de una asparto proteasa, cisteina proteasa y metaloproteasa.
52. El uso de acuerdo con la reivindicación 44 donde el medicamento es para inhibir una quinasa.
53. El uso de acuerdo con la reivindicación 52 donde la quinasa es una serina/treonina o tirosina quinasa.
54. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 44 a 53 donde el animal de sangre caliente ha sido diagnosticado como sufriendo de una condición, o se encuentra a riesgo de desarrollar dicha condición, seleccionada de cáncer, enfermedades autoimmune, rechazos de transplantes, diabetes, reestenosis, ateroesclerosis, hipertensión, artritis reumatoidea, distrofia muscular, SIDA, enfermedad de Alzheimer, condiciones trombóticas, enfermedad de las arterias coronarias y enfermedad cerebrovascular.
55. El uso de un compuesto para la fabricación de un medicamento para regular un factor de transcripción en un animal de sangre caliente que lo necesita, donde el compuesto tiene la siguiente, estructura:
314
y sales farmacéuticamente acepotables del mismo, donde
B se selecciona de N y CH; G es CH_{2};
D se selecciona de N y C(R_{4});
E se selecciona de
R_{1} y R_{4}, se seleccionan independientemente de porciones de cadena lateral de aminoácido y derivados de las mismas;
R_{2}' se selecciona de (=O) y porciones de cadena lateral de aminoácido y derivados de las mismas;
R_{2} se selecciona de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de la misma o, tomado en conjunto con G, forma un anillo fusionado homocíclico o heterocíclico, saturado o no saturado;
R_{3} se selecciona independientemente de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de la misma o tomado en conjunto con G, forma una porción puente seleccionada de -(CH_{2})_{1-2}-, -O- y -S-;
Y y Z representan el resto de la molécula; y dos grupos CH adyacentes cualesquiera del anillo bicíclico pueden formar un doble enlace;
donde Z se selecciona de una porción de cadena lateral de aminoácido y derivados de la misma, un aminoácido, un péptido, una proteína, un mimético de hoja beta, una porción terminal o un grupo protector grupo; y
donde Y se selecciona de fosfonatos y silanos de alquilo y aralquilo, y derivados sustituidos de porciones alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}, donde el sustituyente se selecciona de una o más de las siguientes porciones químicas: -OH, -OR, -COOH, -COOR, -CONH_{2}, -NH_{2}, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO_{2}R, - SO_{2}H, -SOR y halógeno, donde, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6- 12} y aralquilo C_{7-12}; o
Y se selecciona de -H, -R, -SO_{2}R, -SOR, -SO_{2}NHR, -CF_{3}, - C_{2}F_{5}, -NHOH, -NHNHR, -C(=O)H, -C(=O)R, -C(=O)CF_{3}, -C(=O)OR, -C(=O)CH_{2}OR, -C(=O)NHR, -CH_{2}X', -C(=O)CH_{2}X', 2202
2203 2204 2205 2206
2207 2208 -C(=O)CH=CHC(=O)OH, -C(=O)CH=CHC(=O)R,
-C(=O)CH=CHC(=O)OR, -C(=O)CH=CHC(=O)NRR, -CH(OH)CH=CHC(=O)OH, -CH(OH)CH=CHC(=O)R, -CH(OH)CH=CHC(=O)OR, -CH(OH)CH=CHC(=O)NRR, -CH=CHSO_{2}R y -SO_{2}CH= CHR (donde X' es Cl, F, Br o I y, en cada una de sus apariciones, R se selecciona independientemente de una porción alquilo C_{1-12}, arilo C_{6-12} y aralquilo C_{7-12}), o de una porción heterocíclica; o los grupos Y tienen la estructura:
318
donde los grupos R_{4} son porciones orgarnoamina que tienen de 2 a 10 átomos de carbono y al menos un átomo de nitrógeno; y
R_{5} se selecciona de (a) alquilo de 1 a 12 átomos de carbono, opcionalmente sustituido con 1-4 sustituyentes halógeno, alcoxi C_{1-5} y nitro, (b) -C(=O)NH-alquiloC_{1-5}, donde el grupo alquilo está opcionalmente sustituido con halógeno o alcoxi C_{1-5}, (c) -C(=O)NH-aralquilo C_{1-10} donde el grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta cinco grupos independientemente seleccionados de nitro, halógeno, -NH-(C=O)alquiloC_{1-5}, -NH-(C=O)ariloC_{6-10}, alquilo C_{1-5} y alcoxi C_{1-5}, y (d) heteroarilo monocíclico y bicíclico de 4 a 11 átomos en el anillo, donde los átomos del anillo se seleccionan de carbono y los heteroátomos oxígeno, nitrógeno y azufre, y donde el anillo heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con hasta 4 sustituyentes halógeno, alquilo C_{1-5}, alcoxi C_{1-5}, -C(=O)NH- alquiloC_{1-5}, -C(=O)NH-ariloC_{6-10}, amino, -C(=O)OalquiloC_{1-5} y -C(=O)O-ariloC_{6-10};
o Y es una porción química seleccionada de un aminoácido, un péptido, una proteína, un mimético de hoja beta o un grupo protector.
56. El uso de acuerdo con la reivindicación 55 donde la capacidad de un factor de transcripción de unirse al ADN es controlada mediante la reducción de un residuo cisteína por una oxidoreductasa celular.
57. El uso de acuerdo con la reivindicación 56 donde el factor de transcripción se selecciona de NF-\kappaB, AP-1, myb y GRE.
58. El uso de acuerdo con la reivindicación 57 donde el factor de transcripción es NF-\kappaB.
59. El uso de acuerdo con la reivindicación 57 donde el factor de transcripción es AP-1.
60. El uso de acuerdo con la reivindicación 56 donde la oxidoreductasa celular se selecciona de tioredoxina, ref-1 y glutaredoxina.
61. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 55 a 60 donde el animal de sangre caliente ha sido diagnosticado como sufriendo de una condición, o se encuentra a riesgo de desarrollar dicha condición, seleccionada de la enfermedad de Crohns, asma, artritis reumatoidea, isquemia-lesión de reperfusión, enfermedad injerto contra huésped, esclerosis lateral amitrópica, enfermedad de Alzheimer, rechazo de aloinjerto y leucemia de las células T de adultos.
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