CN109957586A - 富含对映体的β-氨基酸衍生物的制备方法 - Google Patents

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CN109957586A CN201810667438.3A CN201810667438A CN109957586A CN 109957586 A CN109957586 A CN 109957586A CN 201810667438 A CN201810667438 A CN 201810667438A CN 109957586 A CN109957586 A CN 109957586A
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高照波
陈建华
张现毅
胡磊
贺志
郑辉
梅义将
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Abstract

本发明涉及医药合成领域，涉及高效地制备富含对映体的β‑氨基酸衍生物的方法，特别是涉及一种西格列汀的制备方法。包括布莱斯酸碱反应，任意顺序的酶法反应和缩合反应。所述酶法反应的底物为手性β‑氨基丙烯酸衍生物。三类反应的收率都非常高，生物酶法反应条件温和，绿色环保，能获得高EE值的产物。本发明的路线是一条具备工业化应用前景的路线，反应收率高，手性纯度高，适宜于商业化生产。

Description

富含对映体的β-氨基酸衍生物的制备方法
技术领域
本发明涉及医药合成领域，涉及高效地制备富含对映体的β-氨基酸衍生物的方法，特别是涉及一种西格列汀的制备方法。由手性β-氨基丙烯酸衍生物经生物催化制备。
背景技术
富含对映体的β-氨基酸衍生物具体如下的通式结构：
当R1是取代苄基而且苯环上被三个氟取代，同时，Z为杂环结构时，为西格列汀：
西格列汀磷酸盐是第一个上市的口服DPP-4抑制剂，由美国默沙东研制。2006年10月以片剂的形式在美国上市，活性成分为西格列汀磷酸盐一水合物。
在中国专利CN100339354(专利权人：Merck)中，涉及通过不对称催化氢化制备富含对映体的β-氨基酸衍生物特别是西格列汀的方法。所使用的不对称催化氢化的催化剂为[Rh(COD)Cl]2。然而，铑是一种极为罕见的金属，仅仅以4μg/kg的含量存在于地壳中。由于铑的不可再生性和稀缺性，导致西格列汀(Sitagliptin)生产成本的逐年上升。
后来，Merck公司继而选择用转氨酶法来制备西格列汀。转氨酶法是在异丙胺前体存在的条件下，直接将酮转化为所需要的手性胺。目前，转氨酶法是Merck公司工业化生产制备西格列汀的路线。
在上述研发背景的基础上，有必要开发出更多绿色环保，并且，具备工业化生产前景的工艺来制备西格列汀。
发明内容
本发明制备富含对映体的β-氨基酸衍生物的方法不同于现有技术中已知的转氨酶法，最直接的区别是底物不同，现有技术中的底物均为酮，而本发明为烯胺。本发明提供的生物催化工艺能够制备得到高EE值的手性胺。
为实现本发明的技术目的，本发明提供了如下的技术方案：
首先，本发明非常关键的提供了通过生物催化制备富含对映体的β-氨基酸衍生物的方法，由烯胺化合物在酶的作用下制备手性胺，反应式如下：
所述化合物在用*标记的立体异构中心具有R或S构型。
其中，R1是C1-8烷基、芳基、杂芳基、芳基-C1-2烷基或杂芳基-C1-2烷基；
Z是OR2、SR2或NR2R3；
R2和R3分别独立地为氢、C1-8烷基、芳基或芳基-C1-2烷基；或者R2和R3与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环系，所述杂环系任选包含选自O、S、NH和NC1-4烷基的另外的杂原子，所述杂环是未取代的或者被1-3个独立地选自氧代基、羟基、卤素、C1-4烷氧基和C1-4烷基的取代基取代，其中所述烷基和烷氧基是未取代的或者被1-5个氟取代；并且所述杂环系任选与5-6元饱和或芳族碳环系或包含1-2个选自O、S和NC0-4烷基的杂原子的5-6元饱和或芳族杂环系稠合，所述稠合的环系是未取代的或者被1-2个选自下列的取代基取代：羟基、氨基、氟、C1-4烷基、C1-4烷氧基和三氟甲基。
较优选地，R1是取代苄基，苄基的苯环上被三个卤素取代，反应式如下：
X为卤素，Z的定义与上述相同。
更优选地，R1是取代苄基，苄基的苯环上被三个氟取代，Z是如下结构片段，
其中，R8是氢原子或被1-5个氟原子取代的C1-4烷基，
另一更优选地，R1是取代苄基，苄基的苯环上被三个氟取代，Z是OR2，
R2是C1-8烷基。
最优选的是，本发明提供了西格列汀的制备方法，在酶的作用下，将烯胺化合物转化为手性胺。
本发明提供的上述通过生物催化制备富含对映体的β-氨基酸衍生物的方法中所所使用的酶包括生物酶和辅酶，所述生物酶为烯还原酶和葡萄糖脱氢酶，所述辅酶可为NAD+或NADP+。
其中，烯还原酶包括具有烯还原酶活性的基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉、固定化酶或固定化细胞。烯还原酶来源于酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，芽孢杆菌Bacillus sp或阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae。
酶法转化中使用的溶剂为缓冲溶液与有机溶剂组成的混合溶剂。
缓冲溶液选自选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或MOPS缓冲溶液中的一种。
有机溶剂选自DMSO、乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、DMF、TBME、二氯甲烷、乙酸乙烯酯中的一种或几种。
本发明提供的上述烯还原酶具有如下的氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3序列。
SEQ ID No.1
SEQ ID No.2
SEQ ID No.3
本发明提供的上述烯还原酶对应的残基位置可以为：36位为脯氨酸、38位为苏氨酸、115位为谷氨酰胺、192位为组氨酸、244位为精氨酸、326为天冬酰胺、349为精氨酸、195位为天冬酰胺。
本发明第二方面提供了上述酶法的底物烯胺化合物的制备方法，由-卤代酯与锌形成有机锌试剂与腈加成，生成β-烯胺酯或β-酮酯。生成的β-酮酯可以进一步在胺的作用下转化成烯胺。
其中，R1是C1-8烷基、芳基、杂芳基、芳基-C1-2烷基或杂芳基-C1-2烷基；
R2为氢、C1-8烷基、芳基或芳基-C1-2烷基。
较优选地，R1为取代苄基，苄基的苯环上被三个氟取代，R2为氢、C1-8烷基。
本发明第三方面提供了胺化合物或β-酮酯化合物与式a化合物经缩合反应制备β-氨基酸衍生物或二羰基化合物的方法。
其中，L为羰基，氨基或氨基保护基。R1是取代苄基，苄基的苯环上被三个氟取代，R2是C1-8烷基。
所述活化试剂为氯甲酸乙酯或草酰氯。
所述β-氨基酸衍生物较优选的为西格列汀，所述制备得到的二羰基化合物在胺源如醋酸铵存在的条件下，可以转化为烯胺化合物，即为本发明酶法的底物。
本发明提供的西格列汀的制备方法，由酮酸化合物经缩合反应，胺化反应和酶催化反应制备，反应方程式为：
所述酶与上述相同。
本发明提供的西格列汀的制备方法，由酶催化反应，缩合反应和选择性脱保护基反应制备，反应方程式为：
L1选择性为氨基或氨基保护基，所述酶上述相同。
本发明提供的β-氨基酸衍生物特别是西格列汀的制备方法包括布莱斯酸碱反应，任意顺序的生物酶法反应和缩合反应。三类反应的收率都非常高，生物酶法反应条件温和，绿色环保，能获得高EE值的产物。
本发明提供的经布莱斯酸碱反应，任意顺序的生物酶法反应和缩合反应制备β-氨基酸衍生物特别是西格列汀的方法是一条具备工业化应用前景的路线，反应收率高，手性纯度高，适宜于商业化生产。
附图说明
图1为实施例2中使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae烯还原酶转化法反应中制备得到的β-氨基酸化合物的液相色谱图；
图2为实施例6中使用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae烯还原酶转化法反应制备得到的式II化合物的液相色谱图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的富含对映体的β-氨基酸衍生物的制备方法进行详细说明。需要理解的是，这些实施例描述只是为进一步详细说明本发明的特征，而不是对本发明范围或本发明权利要求范围的限制。
实施例1：布莱斯碱反应
1000ml三口烧瓶中加入四氢呋喃(450g)和锌粉(68.4g,1050mmol)，启动磁力搅拌。氮气保护下滴入三甲基氯硅烷(5.7g,50mmol)，升温至40～45℃，搅拌。氮气保护下于40～45℃滴加溴乙酸乙酯(60.0g,350mmol)和四氢呋喃(350g)的混合溶液。滴加完成后，氮气保护下向反应液中加入2,4,5-三氟苯乙腈(60.0g,350mmol)，40～45℃反应。
反应结束后，向反应液中加入50％的碳酸钾水溶液(240mL，质量浓度50％)，搅拌。过滤，滤液减压蒸馏，冷凝管中没有馏分时停止蒸馏。残余物中加入水和乙酸乙酯，搅拌。分层，取上层有机相，弃下层水相。有机相用10％氯化钠水溶液(200mL)洗涤后，无水硫酸钠(10.0g)干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，得目标产物淡黄白色固体(81.7g,320mmol)，摩尔收率90.0％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.24～1.27(t，3H，J＝7.2Hz)，3.41(s，2H)，4.11～4.12(d，2H，J＝7.2Hz)，4.56(s，1H)，6.92～6.98(m，1H)，7.06～7.12(m，1H)。MS(ESI)：m/z260.0926[M+H]+。
实施例2：酶法反应实施例
1)来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶的基因工程菌，具体制备方法是：
(1)构建含有烯还原酶基因的表达载体：
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)购于中国微生物菌种保藏中心，将来自Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶进行随机突变，筛选酶活较高的菌株，对密码子GC含量和稀有密码子进行优化，进行全基因合成，获得烯还原酶，得到pET-28a重组质粒。优化后的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
(2)重组质粒转化至宿主细胞中
将重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布在含有50ug/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养20-24h得到初步阳性克隆。
(3)经抗性培养基筛选得到阳性克隆
分别挑取初步阳性克隆于5mL含有50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切质粒，电泳验证，并对提取质粒测序，验证无误后，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为来源于Saccharomycescerevisiae的烯还原酶基因工程菌。
(4)烯还原酶的表达方法：将烯还原酶基因工程菌接种于添加了50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以2-10％(v/v)的接种量转接到含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养5-7h后，加入IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为0.2-1mmol/L，降温至25-30℃，诱导12-20h后，离心收集菌体，即得到来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶基因工程菌全细胞。
采用超声破碎方法对得到的具有烯还原酶活性的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到烯还原酶基因工程菌全细胞破碎酶液。
所使用的葡萄糖脱氢酶为购自于sigma-aldrich的商品酶。
2)来源于Bacillus sp的烯还原酶的基因工程菌，具体制备方法是：
(1)构建含有烯还原酶基因的表达载体：
芽孢杆菌(Bacillus sp)购于中国微生物菌种保藏中心，将来自Bacillus sp的烯还原酶进行随机突变，筛选酶活较高的菌株，对密码子GC含量和稀有密码子进行优化，进行全基因合成，获得烯还原酶，得到pET-28a重组质粒。优化后的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
(2)重组质粒转化至宿主细胞中
将重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布在含有50ug/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养20-24h得到初步阳性克隆。
(3)经抗性培养基筛选得到阳性克隆
分别挑取初步阳性克隆于5mL含有50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切质粒，电泳验证，并对提取质粒测序，验证无误后，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为来源于Bacillus sp的烯还原酶基因工程菌。
(4)烯还原酶的表达方法：将烯还原酶基因工程菌接种于添加了50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以2-10％(v/v)的接种量转接到含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养5-7h后，加入IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为0.2-1mmol/L，降温至25-30℃，诱导12-20h后，离心收集菌体，即得到来源于Bacillus sp的烯还原酶基因工程菌全细胞。
采用超声破碎方法对得到的具有烯还原酶活性的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到烯还原酶基因工程菌全细胞破碎酶液。
所使用的葡萄糖脱氢酶为购自于sigma-aldrich的商品酶。
3)来源于Enterobacter cloacae的烯还原酶的基因工程菌，具体制备方法是：
(1)构建含有烯还原酶基因的表达载体：
阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)购于中国微生物菌种保藏中心，将来自Enterobacter cloacae的烯还原酶进行随机突变，筛选酶活较高的菌株，对密码子GC含量和稀有密码子进行优化，进行全基因合成，获得烯还原酶，得到pET-28a重组质粒。优化后的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
(2)重组质粒转化至宿主细胞中
将重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布在含有50ug/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养20-24h得到初步阳性克隆。
(3)经抗性培养基筛选得到阳性克隆
分别挑取初步阳性克隆于5mL含有50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切质粒，电泳验证，并对提取质粒测序，验证无误后，具有该质粒的菌落为阳性克隆，即为来源于Enterobacter cloacae的烯还原酶基因工程菌。
(4)烯还原酶的表达方法：将烯还原酶基因工程菌接种于添加了50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜；再以2-10％(v/v)的接种量转接到含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中培养5-7h后，加入IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为0.2-1mmol/L，降温至25-30℃，诱导12-20h后，离心收集菌体，即得到来源于Enterobacter cloacae的烯还原酶基因工程菌全细胞。
采用超声破碎方法对得到的具有烯还原酶活性的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到烯还原酶基因工程菌全细胞破碎酶液。
所使用的葡萄糖脱氢酶为购自于sigma-aldrich的商品酶。
2、酶转化反应1
反应在250mL摇瓶中进行，反应体系控制为50mL，在摇瓶中用25mL柠檬酸缓冲溶液悬浮3g的来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶基因工程菌全细胞，投入1.25mg的葡萄糖脱氢酶，加入0.5g的葡萄糖，0.04g的NADP+，再称取0.5g的实施例1所得的产物烯胺化合物，溶于5mL乙酸乙酯中，将溶有实施例1所得的产物的乙酸乙酯溶液缓慢倒入摇瓶中，控制转化体系的温度为37℃；转化反应在摇床中进行，控制反应体系的pH值为6.5，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为24h，得到β-氨基酸化合物的转化液，转化率为99.3％。纯化，得到β-氨基酸化合物，EE值为99.7％。
3、酶转化反应2
反应在500mL摇瓶中进行，反应体系控制为100mL，在摇瓶中加入85mL磷酸盐缓冲溶液、6g来自Bacillus sp的烯还原酶基因工程菌全细胞破碎酶液、葡萄糖脱氢酶2.5mg、1g的葡萄糖、0.08g的NADPH，再称取5g的实施例1所得的产物烯胺化合物，溶于15mL DMSO中，将溶有实施例1所得的产物的DMSO溶液缓慢倒入摇瓶中，控制转化体系的温度为37℃；转化反应在摇床中进行，控制反应体系的pH值为7，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为24h，得到β-氨基酸化合物的转化液，转化率为97.9％。纯化，得到β-氨基酸化合物，EE值为99.2％。
4、酶转化反应3
反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，在摇瓶中用285mL MOPS缓冲溶液悬浮18g的来源于Enterobacter cloacae的烯还原酶基因工程菌全细胞，投入葡萄糖脱氢酶7.5mg，加入3g的葡萄糖、0.24g的NADP+，再称取15g的实施例1所得的产物烯胺化合物，溶于15mL乙酸丁酯中，将溶有实施例1所得的产物的乙酸丁酯溶液缓慢倒入摇瓶中，控制转化体系的温度为37℃，转化反应在摇床中进行，控制反应体系的pH值为6，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为24h，得到β-氨基酸化合物的转化液，转化率为99.1％。纯化，得到β-氨基酸化合物，EE值为99.4％。
实施例3：氨基上保护基反应
500ml三口烧瓶中加入四氢呋喃(150mL)和化合物2(15.0g,57.4mmol)，搅拌溶清。降温至0～5℃，加入6％的碳酸氢钠水溶液(107g)。滴加(Boc)2O(13.8g,63.2mmol)和四氢呋喃(20mL)的混合溶液，滴加完成，升温至20～25℃，保温反应。反应完全，30～40℃减压蒸馏，冷凝管中没有馏分时停止蒸馏。残余物中加入水和乙酸乙酯，搅拌。分层，取上层有机相，下层水相用乙酸乙酯萃取产物。合并有机相，用5％氯化钠水溶液洗涤后，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，得白色固体(20.7g,57.3mmol)，摩尔收率定量。1H NMR(400MHz，CDCl3)1.26～1.29(t，3H，J＝7.2Hz)，1.38(s，9H)，2.46～2.59(m，2H)，2.83～2.87(m，2H)，4.11～4.19(m，2H)，5.12～5.14(d，1H，J＝8.4Hz)，6.87～6.93(m，1H)，7.02～7.08(m，1H)。MS(ESI)：m/z 384.1416[M+Na]+
实施例4：缩合反应
化合物a(5.6g,24.5mmol)和N,N-二异丙基乙胺(7.0g,54.2mmol)加入到二氯甲烷(90mL)中，20～25℃搅拌1小时，备用。
250ml三口烧瓶中加入β-氨基酸化合物(7.3g,21.9mmol)、N,N-二异丙基乙胺(7.0g,54.2mmol)和二氯甲烷(100mL)，20～25℃搅拌。氮气保护下降温至-25～-20℃，滴加氯甲酸乙酯(2.6g,24.0mmol)。滴加完成后，继续在-25～-20℃反应。反应完全，得活化后的产物的二氯甲烷溶液。氮气保护下，于-20～-15℃滴加式a化合物的二氯甲烷溶液，。滴加完成后，继续在-25～-20℃反应。
反应完成后，反应混合物中加入水，搅拌。分层，取下层有机相，弃上层水相。有机相用饱和硫酸氢钠水溶液洗涤后，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，残余物中加入乙酸乙酯，升温至回流。降温结晶。降温至20～25℃，抽滤，滤饼用乙酸乙酯淋洗后，60～65℃常压烘干，得目标产物白色固体(10.1g,19.9mmol)，摩尔收率90.9％。
1H NMR(400MHz，CDCl3)1.36(s，9H)，2.63～2.76(m，2H)，2.83～2.97(m，2H)，4.09～4.24(m，4H)，5.00～5.16(m，2H)，5.29(s，1H)，6.83～6.91(m，1H)，7.04～7.10(m，1H)。
实施例5：
100ml四口烧瓶中加入化合物Boc保护的化合物(5.0g,9.85mmol)和异丙醇(50mL)，搅拌溶解。滴入30％盐酸异丙醇(2.4g,54.2mmol)溶液。滴加完成后，升温。反应完成后，滴加氢氧化钠水溶液，调节pH。减压浓缩反应液。残余物中加入异丙醇，搅拌。过滤，滤饼用异丙醇淋洗。滤液中滴加80％磷酸，滴加完成后，升温，保温反应。降温，抽滤，滤饼用异丙醇淋洗后，烘干，得白色固体(4.5g,8.6mmol)，即化合物西格列汀磷酸盐一水合物，摩尔收率87.9％。
实施例6：
反应在250mL摇瓶中进行，反应体系控制为50mL，在摇瓶中用25mL柠檬酸缓冲溶液悬浮3g的来源于Saccharomyces cerevisiae的烯还原酶基因工程菌全细胞，投入1.25mg的葡萄糖脱氢酶，加入0.5g的葡萄糖，0.04g的NADP+，再称取0.5g的式I化合物，溶于5mL乙酸乙酯中，将溶有式I化合物的乙酸乙酯溶液缓慢倒入摇瓶中，控制转化体系的温度为37℃；转化反应在摇床中进行，控制反应体系的pH值为6.5，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为24h，得到含有式II化合物的转化液，转化率为98.9％。纯化，得到β-氨基酸化合物，EE值为99.5％。
实施例7：布莱斯酸反应
1000ml三口烧瓶中加入四氢呋喃(450g)和锌粉(46.09g,704mmol)，启动磁力搅拌。氮气保护下滴入三甲基氯硅烷(3.8g,35mmol)，升温至40～45℃，搅拌。氮气保护下于40～45℃滴加溴乙酸叔丁酯(78.0g,400mmol)和四氢呋喃(150g)的混合溶液，滴完。氮气保护下向反应液中加入2,4,5-三氟苯乙腈(40.0g,234mmol)，40～45℃反应。
反应结束后，过滤，滤饼用四氢呋喃(100g)淋洗。滤液中滴加入10％盐酸水溶液(200mL)，搅拌。30～35℃减压蒸馏，冷凝管中没有馏分时停止蒸馏。残余物中加入二氯甲烷(300mL)，搅拌。分层，取下层有机相，弃上层水相。有机相用10％氯化钠水溶液洗涤后，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，得桔黄色油状物(64.40g,223.4mmol)，即酮叔丁酯化合物，摩尔收率95.5％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.48(s，9H)，3.45(s，2H)，3.84(s，2H)，6.91～6.98(m，1H)，7.00～7.07(m，1H)。MS(ESI)：m/z 289.0846[M+H]+
实施例8：
100ml单口烧瓶中加入二氯甲烷(50ml)和实施例7制备得到的酮叔丁酯化合物(2.7g，9.37mmol)，搅拌溶解。于10～15℃加入三氟乙酸(5.0ml，67.31mmol)后升温至25～30℃搅拌反应。反应完全，加入水，搅拌。分层，取下层有机相，弃上层水相。有机相加入5％氯化钠水溶液洗涤后于30～40℃减压浓缩至干，得类白色固体(2.0g，8.61mmol)，即酮酸化合物，摩尔收率91.94％。
实施例9：
250ml三口瓶中加入二氯甲烷(100ml)和实施例8制备得到的酮酸化合物(10.0g，43.07mmol)，搅拌溶解。于10～15℃滴加草酰氯(6.56g，51.68mmol)，滴加完成，升温至30～35℃搅拌反应。反应完全，于30～40℃减压浓缩至干得淡黄色液体(10.91g，43.64mmol)，250ml三口烧瓶中加入二氯甲烷(100ml)，三乙胺(5.79g，57.24mmol)和上述淡黄色液体(10.0g，52.04mmol)，搅拌溶解。降温至0～5℃滴加式a化合物的游离碱(13.0g，52.04mmol)/二氯甲烷(20ml)溶液，滴加完成，滴加完成后升温至10～15℃搅拌反应。反应完成，加入水，搅拌。分层，取下层有机相，弃上层水相。有机相加入5％氯化钠水溶液洗涤后于30～40℃减压浓缩至干，得类白色固体(19.24g，47.36mmol)，即酮酰胺化合物，摩尔收率91％。
实施例10：
500ml三口烧瓶中加入甲苯(300ml)，酮酰胺化合物(19.24g，47.36mmol)和醋酸胺(50.0g)，搅拌溶解。装上分水器，升温至回流。回流保温。减压浓缩物料至干。残余物中加入乙酸乙酯和水，搅拌。分层，取上层有机相，弃下层水相。有机相减压浓缩至干，得淡黄色固体(18.47g，45.57mmol)，即烯胺化合物，摩尔收率96.2％。
序列表
<110> 浙江九洲药业股份有限公司
<120> 富含对映体的β-氨基酸衍生物的制备方法
<140> 2017114111709
<141> 2017-12-23
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 400
<212> PRT
<213> 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
Met Ser Phe Val Lys Asp Phe Lys Pro Gln Ala Leu Gly Asp Thr Asn
1 5 10 15
Leu Phe Lys Pro Ile Lys Ile Gly Asn Asn Glu Leu Leu His Arg Ala
20 25 30
Val Ile Pro Pro Leu Thr Arg Met Arg Ala Gln His Pro Gly Asn Ile
35 40 45
Phe Asn Arg Asp Trp Ala Val Glu Tyr Tyr Ala Gln Arg Ala Gln Arg
50 55 60
Pro Gly Thr Leu Ile Ile Thr Glu Gly Thr Phe Ala Ser Pro Gln Ser
65 70 75 80
Gly Gly Tyr Asp Asn Ala Pro Gly Ile Trp Ser Glu Glu Gln Ile Lys
85 90 95
Glu Trp Thr Lys Ile Phe Lys Ala Ile His Glu Lys Lys Ser Phe Ala
100 105 110
Trp Val Gln Leu Trp Val Leu Gly Trp Ala Ala Phe Pro Asp Thr Leu
115 120 125
Ala Arg Asp Gly Leu Arg Tyr Asp Ser Ala Ser Asp Asn Val Tyr Met
130 135 140
Asn Ala Glu Gln Glu Glu Lys Ala Lys Lys Ala Asn Asn Pro Gln His
145 150 155 160
Ser Ile Thr Lys Asp Glu Ile Lys Gln Tyr Val Lys Glu Tyr Val Gln
165 170 175
Ala Ala Lys Asn Ser Ile Ala Ala Gly Ala Asp Gly Val Glu Ile His
180 185 190
Ser Ala Asn Gly Tyr Leu Leu Asn Gln Phe Leu Asp Pro His Ser Asn
195 200 205
Asn Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Ile Glu Asn Arg Ala Arg Phe
210 215 220
Thr Leu Glu Val Val Asp Ala Val Val Asp Ala Ile Gly Phe Glu Lys
225 230 235 240
Val Gly Leu Arg Leu Ser Pro Tyr Gly Val Phe Asn Ser Met Ser Gly
245 250 255
Gly Ala Glu Thr Gly Ile Val Ala Gln Tyr Ala Tyr Val Leu Gly Glu
260 265 270
Leu Glu Arg Arg Ala Lys Ala Gly Lys Arg Leu Ala Phe Val His Leu
275 280 285
Val Glu Pro Arg Val Thr Asn Pro Phe Leu Thr Glu Gly Glu Gly Glu
290 295 300
Tyr Asn Gly Gly Ser Asn Glu Phe Ala Tyr Ser Ile Trp Lys Gly Pro
305 310 315 320
Ile Ile Arg Ala Gly Asn Phe Ala Leu His Pro Glu Val Val Arg Glu
325 330 335
Glu Val Lys Asp Pro Arg Thr Leu Ile Gly Tyr Gly Arg Phe Phe Ile
340 345 350
Ser Asn Pro Asp Leu Val Asp Arg Leu Glu Lys Gly Leu Pro Leu Asn
355 360 365
Lys Tyr Asp Arg Asp Thr Phe Tyr Lys Met Ser Ala Glu Gly Tyr Ile
370 375 380
Asp Tyr Pro Thr Tyr Glu Glu Ala Leu Lys Leu Gly Trp Asp Lys His
385 390 395 400
<210> 2
<211> 338
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌(Bacillus sp)
<400> 2
Met Ala Arg Lys Leu Phe Thr Pro Ile Thr Ile Lys Asp Met Thr Leu
1 5 10 15
Lys Asn Arg Ile Val Met Ser Pro Met Cys Met Tyr Ser Ser His Glu
20 25 30
Lys Asp Gly Lys Leu Thr Pro Phe His Met Ala His Tyr Ile Ser Arg
35 40 45
Ala Ile Gly Gln Val Gly Leu Ile Ile Val Glu Ala Ser Ala Val Asn
50 55 60
Pro Gln Gly Arg Ile Thr Asp Gln Asp Leu Gly Ile Trp Ser Asp Glu
65 70 75 80
His Ile Glu Gly Phe Ala Lys Leu Thr Glu Gln Val Lys Glu Gln Gly
85 90 95
Ser Lys Ile Gly Ile Gln Leu Ala His Ala Gly Arg Lys Ala Glu Leu
100 105 110
Glu Gly Asp Ile Phe Ala Pro Ser Ala Ile Ala Phe Asp Glu Gln Ser
115 120 125
Ala Thr Pro Val Glu Met Ser Ala Glu Lys Val Lys Glu Thr Val Gln
130 135 140
Glu Phe Lys Gln Ala Ala Ala Arg Ala Lys Glu Ala Gly Phe Asp Val
145 150 155 160
Ile Glu Ile His Ala Ala His Gly Tyr Leu Ile His Glu Phe Leu Ser
165 170 175
Pro Leu Ser Asn His Arg Thr Asp Glu Tyr Gly Gly Ser Pro Glu Asn
180 185 190
Arg Tyr Arg Phe Leu Arg Glu Ile Ile Asp Glu Val Lys Gln Val Trp
195 200 205
Asp Gly Pro Leu Phe Val Arg Val Ser Ala Ser Asp Tyr Thr Asp Lys
210 215 220
Gly Leu Asp Ile Ala Asp His Ile Gly Phe Ala Lys Trp Met Lys Glu
225 230 235 240
Gln Gly Val Asp Leu Ile Asp Cys Ser Ser Gly Ala Leu Val His Ala
245 250 255
Asp Ile Asn Val Phe Pro Gly Tyr Gln Val Ser Phe Ala Glu Lys Ile
260 265 270
Arg Glu Gln Ala Asp Met Ala Thr Gly Ala Val Gly Met Ile Thr Asp
275 280 285
Gly Ser Met Ala Glu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Arg Ala Asp Leu Ile
290 295 300
Phe Ile Gly Arg Glu Leu Leu Arg Asp Pro Phe Phe Ala Arg Thr Ala
305 310 315 320
Ala Lys Gln Leu Asn Thr Glu Ile Pro Ala Pro Val Gln Tyr Glu Arg
325 330 335
Gly Trp
<210> 3
<211> 365
<212> PRT
<213> 阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)
<400> 3
Met Ser Ala Glu Lys Leu Phe Thr Pro Leu Lys Val Gly Ala Val Thr
1 5 10 15
Ala Pro Asn Arg Val Phe Met Ala Pro Leu Thr Arg Leu Arg Ser Ile
20 25 30
Glu Pro Gly Asp Ile Pro Thr Pro Leu Met Gly Glu Tyr Tyr Arg Gln
35 40 45
Arg Ala Ser Ser Gly Leu Ile Ile Ser Glu Ala Thr Gln Ile Ser Ala
50 55 60
Ala Ala Lys Gly Tyr Ala Gly Ala Pro Gly Leu His Ser Pro Glu Gln
65 70 75 80
Ile Ala Ala Trp Lys Lys Ile Thr Ala Gly Val His Ala Glu Asp Gly
85 90 95
Arg Ile Ala Val Gln Leu Trp His Thr Gly Arg Ile Ser His Ser Ser
100 105 110
Ile Gln Pro Gly Gly Gln Ala Pro Val Ser Ala Ser Ala Leu Asn Ala
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Asn Thr Arg Thr Ser Leu Arg Asp Glu Asn Gly Asn Ala Ile Arg Val
130 135 140
Asp Thr Thr Met Pro Arg Ala Leu Glu Leu Asp Glu Ile Pro Gly Ile
145 150 155 160
Val Asn Asp Phe Arg Gln Ala Val Ala Asn Ala Arg Glu Ala Gly Phe
165 170 175
Asp Leu Val Glu Leu His Ser Ala His Gly Tyr Leu Leu His Gln Phe
180 185 190
Leu Ser Pro Ser Ser Asn Gln Arg Thr Asp Gln Tyr Gly Gly Ser Val
195 200 205
Glu Asn Arg Ala Arg Leu Val Leu Glu Val Val Asp Ala Val Cys Lys
210 215 220
Glu Trp Ser Ala Asp Arg Ile Gly Ile Arg Val Ser Pro Ile Gly Ser
225 230 235 240
Phe Gln Asn Val Asp Asn Gly Pro Asn Glu Glu Ala Asp Ala Leu Tyr
245 250 255
Leu Ile Glu Glu Leu Ala Lys Arg Gly Ile Ala Tyr Leu His Met Ser
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275 280 285
Lys Val Arg Glu Arg Phe His Gly Val Ile Ile Gly Ala Gly Ala Tyr
290 295 300
Thr Ala Glu Lys Ala Glu Asp Leu Ile Gly Lys Gly Leu Ile Asp Ala
305 310 315 320
Val Ala Phe Gly Arg Asp Tyr Ile Ala Asn Pro Asp Leu Val Ala Arg
325 330 335
Leu Gln Gln Lys Ala Glu Leu Asn Pro Gln Arg Pro Glu Ser Phe Tyr
340 345 350
Gly Gly Gly Ala Glu Gly Tyr Thr Asp Tyr Pro Ser Leu
355 360 365

Claims (16)

1.一种富含对映体的β-氨基酸衍生物的制备方法，其特征在于，由烯胺化合物在酶的作用下制备，
所述化合物在用*标记的立体异构中心具有R或S构型。
其中，R1是C1-8烷基、芳基、杂芳基、芳基-C1-2烷基或杂芳基-C1-2烷基；
Z是OR2、SR2或NR2R3；
R2和R3分别独立地为氢、C1-8烷基、芳基或芳基-C1-2烷基；或者R2和R3与它们所连接的氮原子一起形成4-7元杂环系，所述杂环系任选包含选自O、S、NH和NC1-4烷基的另外的杂原子，所述杂环是未取代的或者被1-3个独立地选自氧代基、羟基、卤素、C1-4烷氧基和C1-4烷基的取代基取代，其中所述烷基和烷氧基是未取代的或者被1-5个氟取代；并且所述杂环系任选与5-6元饱和或芳族碳环系或包含1-2个选自O、S和NC0-4烷基的杂原子的5-6元饱和或芳族杂环系稠合，所述稠合的环系是未取代的或者被1-2个选自下列的取代基取代：羟基、氨基、氟、C1-4烷基、C1-4烷氧基和三氟甲基,所使用的酶包括生物酶和辅酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物酶为烯还原酶和葡萄糖脱氢酶，所述辅酶为NAD+或NADP+。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，R1是取代苄基，苄基的苯环上被三个卤素取代，反应式如下：
X为卤素，Z的定义与权利要求1中的相同。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，R1是取代苄基，苄基的苯环上被三个氟取代，Z是如下结构片段，
其中，R8是氢原子或被1-5个氟原子取代的C1-4烷基。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，R1是取代苄基，苄基的苯环上被三个氟取代，Z是OR2，R2是C1-8烷基，
6.根据权利要求1-5所述的制备方法，其特征在于，所述烯还原酶包括烯还原酶基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉、固定化酶或固定化细胞。
7.根据权利要求1-5所述的制备方法，其特征在于，所述酶法反应中使用的溶剂为缓冲溶液与有机溶剂组成的混合溶剂。
8.根据权利要求1-5所述的制备方法，其特征在于，所述烯还原酶来源于酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae，芽孢杆菌Bacillus sp或阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae。
9.根据权利要求1-5所述的制备方法，其特征在于，在烯还原酶作用下，制备得到富含90％对映体过量的β-氨基酸衍生物。
10.一种烯还原酶多肽，其特征在于，所述氨基酸序列包括以下特征：36位为脯氨酸、38位为苏氨酸、115位为谷氨酰胺、192位为组氨酸、244位为精氨酸、326为天冬酰胺、349为精氨酸、195位为天冬酰胺。
11.一种烯还原酶多肽，其特征在于，所述氨基酸序列对应SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3序列。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述烯胺化合物由-卤代酯与锌形成有机锌试剂与腈加成，生成β-烯胺酯或β-酮酯，生成的β-酮酯进一步在胺的作用下转化成烯胺，
其中，R1是C1-8烷基、芳基、杂芳基、芳基-C1-2烷基或杂芳基-C1-2烷基；
R2为氢、C1-8烷基、芳基或芳基-C1-2烷基。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括胺化合物或β-酮酯化合物与式a化合物经缩合反应制备β-氨基酸衍生物或二羰基化合物的方法，二羰基化合物在胺源存在的条件下进一步制备β-氨基酸衍生物,
其中，L为羰基，氨基或氨基保护基。R1是取代苄基，苄基的苯环上被三个氟取代，R2是氢或C1-8烷基。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述缩合反应中的活化试剂为氯甲酸乙酯或草酰氯。
15.一种西格列汀的制备方法，其特征在于，由酮酸化合物经缩合反应，胺化反应和酶催化反应制备，反应方程式为：
所述酶与权利要求1中的相同。
16.一种西格列汀的制备方法，其特征在于，由酶催化反应，缩合反应和选择性脱保护基反应制备，反应方程式为：
L1选择性为氨基或氨基保护基，所述酶与权利要求1中的相同。
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