CN109890846B - 抗-cd27抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗‑CD27抗体以及这些抗体用于治疗如癌症和传染病的疾病的用途。

Description

抗-CD27抗体
技术领域
本发明涉及通过刺激免疫应答改善的病症的治疗，特别是通过刺激抗原特异性的T淋巴细胞。本发明的各个方面适用于治疗已知或预期通过刺激CD27+免疫细胞或通过抑制一种或多种免疫检查点蛋白来改善的任何病症。通过本发明适当地治疗的病症是通过免疫刺激改善的那些病症，例如传染病和癌症。更具体地，本发明涉及抗-CD27抗体以及这些抗体在治疗如癌症和传染病的疾病中的用途。
背景技术
CD27，一种TNF受体家族成员，被确认为人T细胞上的膜分子(van Lier等,1987,J.Immunol.139:1589-96)。根据目前的证据，CD27具有单一配体，CD70，其也是TNF家族成员(Goodwin等,1993,Cell 73:447-56)。
CD27专门地由造血细胞表达，特别是淋巴细胞谱系的那些，即T细胞、B细胞和NK细胞。CD27最初被定义为人T细胞共刺激分子，其增加对TCR刺激的增殖反应(van Lier等,1987,J.Immunol.139:1589-96)。CD70(CD27的配体)的存在决定了CD27介导的共刺激的时机和持久性。
在未成熟树突状细胞中CD70的转基因表达足以将对病毒或肿瘤的免疫耐受转化为CD8+T细胞反应性。同样地，激动性可溶性CD70在这种肽免疫时促进CD8+T细胞反应(Rowley等,2004,J Immunol 172:6039-6046)，且在CD70转基因小鼠中，响应于TCR刺激的CD4+和CD8+效应细胞形成得到极大地促进(Arens等2001,Immunity15:801-12；Tesselaar等,2003,Nat Immunol 4:49-54；Keller等2008,Immunity 29:334-346)。在小鼠淋巴瘤模型中，肿瘤排斥在CD70转基因或抗小鼠CD27抗体注射时得到提高(Arens等,2003,J ExpMed199:1595-1605；French等,2007,Blood 109:4810-15；Sakanishi和Yagita,2010,Biochem.Biophys.Res.Comm.393:829-835；WO 2008/051424；WO 2012/004367)。
在WO2012/004367中，描述了第一抗人激动性抗体(命名为hCD27.15)，其不需要交联以激活CD27介导的免疫反应的共刺激。另外，公开了称为1F5的抗人CD27抗体，其在交联时激活CD27(WO2011/130434和Vitale等,Clin.Cancer Res,2012,18(14):3812-3821)。然而，本领域仍然需要开发具有改进特性的抗人CD27抗体，包括结合具有A59T SNP的人CD27和来自食蟹猴的CD27的能力。
发明内容
本发明提供抗-CD27抗体及其抗原结合片段，其包含下文指明的结构和功能特征。
在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或其抗原结合片段，其包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；和(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；和(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3，其中X1＝M。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段任选地具有至少一种以下特征：根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。
在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或抗原结合片段，其包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和(iii)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段任选地具有至少一种以下特征：根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27 A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。
在本发明的另一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中X1＝M，或者与所述序列相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T，或者与所述序列相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，其中X1＝M，或者与所述序列相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，其中X1＝M，或者与所述序列相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，其中X1＝D和X2＝T，或者与所述序列相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S，或者与所述序列相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段任选地具有至少一种以下特征：根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27 A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。
在本发明的另一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：结合人CD27的抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下的轻链免疫球蛋白可变区、重链免疫球蛋白可变区或轻链和重链免疫球蛋白可变区两者：包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变重链和/或含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQID NO:8相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变重链和/或含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列或与SEQ ID NO:32相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变重链和/或含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列或与SEQ ID NO:33相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列或与SEQ ID NO:34相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变重链和/或含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列或与SEQ IDNO:35相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列或与SEQ ID NO:39相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变重链和/或含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列或与SEQ ID NO:40相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含选自SEQ ID NO:10-13或与SEQID NO:10-13之一相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变重链和/或选自SEQ ID NO:15-18任一或与SEQ ID NO:15-18之一相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变重链和/或含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与SEQID NO:15相差1、2或3个保守置换的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段任选地具有至少一种以下特征：根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27 A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。
在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或抗原结合片段，其包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或抗原结合片段，其包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3，其中X1＝M；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段是人源化的。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:9、10、11、12、13、32、34和39的重链可变区；和选自SEQ ID NO:14、15、16、17、18、33、35和40的轻链可变区。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含具有与SEQ ID NO:10、11、12或13任一的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变区；和包含具有与SEQ ID NO:15、16、17或18任一的至少90％、95％、96％、97％、98％or 99％同一性的轻链可变区。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含相对于SEQ ID NO:10、11、12或13任一含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换的重链可变区；和相对于SEQ ID NO:15、16、17或18任一含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换的轻链可变区。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段任选地具有至少一种以下特征：根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27 A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。
在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或抗原结合片段，其包含具有与SEQ ID NO:10、11、12或13任一的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的重链可变区；和具有与SEQ ID NO:15、16、17或18任一的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链可变区。在一个实施方式中，所提出的序列变异仅在抗体的框架区中发生。
在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或抗原结合片段，其包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含与选自SEQ ID NO:9-13的重链可变区的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，和该轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:14-18的轻链可变区的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在这一前述实施方式中，序列变异发生在框架区中，且抗体或其抗原结合片段包含：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3，其中X1＝M；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段任选地具有至少一种以下特征：根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27 A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。
在本发明的再进一步实施方式中，提供了结合人CD27的抗体或其抗原结合片段，其包含选自以下的轻链和重链免疫球蛋白可变区两者：包含含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的可变重链和含有SEQID NO:33的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含选自SEQ ID NO:10-13的可变重链和选自SEQID NO:15-18的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的可变重链和含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的可变轻链的抗体或其抗原结合片段；包含SEQ ID NO:10-12任一的可变重链和SEQ ID NO:15-17任一的可变轻链的抗体或抗原结合片段；和包含SEQ ID NO:13的可变重链和SEQ ID NO:18的可变轻链的抗体或抗原结合片段。
在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段任选地具有至少一种以下特征：根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27 A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。
在另一实施方式中，本发明提供包含以下的抗体或其抗原结合片段：包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列的可变重链和/或包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变轻链，其中抗体或其抗原结合片段结合人CD27。在一个实施方式中，本发明涉及结合人CD27的分离的抗体或抗原结合片段，其包含：包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链或含有最多25个氨基酸置换的其变体，和/或包含含有最多25个氨基酸置换的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段任选地具有至少一种以下特征：根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27 A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。
在以上任一实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是分离的。
在以上任一实施方式中，抗体或其抗原结合片段是重组抗体。
在以上任一实施方式中，抗体可以是全长抗体。
在以上任一实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是人源化抗体。
在以上任一实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，且任选地是完整IgG抗体。在一个实施方式中，重链是IgG同种型的。在一个实施方式中，重链是IgG1同种型的。在另一实施方式中，重链是IgG2同种型的。在另一实施方式中，重链是IgG4同种型的。在另一实施方式中，重链是IgM同种型的。在一个实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:28的重链恒定域。
在本发明的另一方面，抗体或其抗原结合片段包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；(iii)包含SEQID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3，其中X1＝M；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S，且重链恒定域是IgG1或IgG4同种型。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段任选地具有至少一种以下特征：根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27 A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。
在任何上述实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含由以下组成的重链区：(a)任何上述的可变重链和(b)前导肽(例如，SEQ ID NO:26的前导肽)。在任何上述实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以包含由以下组成的轻链区：(a)任何上述的轻链和(b)前导肽(例如，SEQ ID NO:27的前导肽)。
在本发明的任何上述实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以是包含任何上述重链可变区和任何人重链恒定域的抗体。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段是IgG同种型的，且包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人重链恒定域。在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含人重链IgG1恒定域(SEQ ID NO:30)或其变体，其中该变体相对于SEQ ID NO:30包含最多20个氨基酸置换。在另一实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含人重链IgG4恒定域，其中228位的氨基酸(使用EU编号方案)从Ser置换为Pro(SEQ ID NO:28)。在另一实施方式中，重链是IgM同种型的。
在任何上述实施方式中，抗体或其抗原结合片段可以包含任何上述轻链可变区和人轻链恒定域。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的人κ轻链恒定域。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体包含具有两条轻链和两条重链的完全四聚体结构，其中各轻链包含：含有SEQ ID NO:14-18、33、35和40任一的可变区和人κ轻链或人λ轻链恒定区；且各重链包含：含有SEQ ID NO:9-13、32、34和39任一的可变区和人IgG1恒定区(SEQ ID NO:30)。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体包含具有两条轻链和两条重链的完全四聚体结构，其中各轻链包含：含有SEQ ID NO:14-18、33、35和40任一的可变区和人κ轻链或人λ轻链恒定域；且各重链包含：含有SEQ ID NO:9-13、32、34和39任一的可变区和人IgM恒定区。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体包含具有两条轻链和两条重链的完全四聚体结构，其中各轻链包含：含有SEQ ID NO:14-18、33、35和40任一的可变区和人κ轻链或人λ轻链恒定域；且各重链包含：含有SEQ ID NO:9-13、32、34和39任一的可变区和人IgG2恒定区。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体包含两条轻链和两条重链，其中各轻链由SEQ ID NO:36组成；且各重链由SEQ ID NO:37组成。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体由两条轻链和两条重链组成，其中各轻链由SEQ ID NO:36组成；且各重链由SEQ ID NO:37组成。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体包含两条轻链和两条重链，其中各轻链由SEQ ID NO:36组成；且各重链由SEQ ID NO:38组成。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体由两条轻链和两条重链组成，其中各轻链由SEQ ID NO:36组成；且各重链由SEQ ID NO:38组成。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体包含两条轻链和两条重链，其中各轻链由以下组成：包含SEQ ID NO:14-18、33、35和40任一的可变区和人κ轻链或人λ轻链恒定域；且各重链由以下组成：由SEQ ID NO:9-13、32、34和39任一组成的可变区和人IgM恒定区。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体由两条轻链和两条重链组成，其中各轻链由以下组成：包含SEQ ID NO:14-18、33、35和40任一的可变区和人κ轻链或人λ轻链恒定域；且各重链由以下组成：由SEQ ID NO:9-13、32、34和39任一组成的可变区和人IgM恒定区。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体包含两条轻链和两条重链，其中各轻链由以下组成：由SEQ ID NO:14-18、33、35和40任一组成的可变区和人κ轻链或人λ轻链恒定域；且各重链由以下组成：包含SEQ ID NO:9-13、32、34和39任一的可变区和人IgG1恒定区。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体由两条轻链和两条重链组成，其中各轻链由以下组成：由SEQ ID NO:14-18、33、35和40任一组成的可变区和人κ轻链或人λ轻链恒定域；且各重链由以下组成：包含SEQ ID NO:9-13、32、34和39任一的可变区和人IgG1恒定区。
在本发明的另一方面，任何上述抗体或抗原结合片段包含哺乳动物细胞或CHO细胞的表达特有的糖基化模式。
在某些实施方式中，抗-CD27抗体或其抗原结合片段与至少一种治疗剂缀合。在一个实施方式中，治疗剂是第二抗体或其片段、免疫调节剂、激素、细胞毒性剂、酶、放射性核素、与至少一种免疫调节剂、酶、放射性标记、激素、反义寡核苷酸或细胞毒性剂缀合的第二抗体，或其组合。
本发明还提供包含SEQ ID NO:1-18,32-40和44-45任一的氨基酸序列或任何所述序列的片段的分离的多肽。
本发明还提供编码本发明的抗-CD27抗体或抗原结合片段中的任一种的分离的核酸。在一个实施方式中，本发明提供编码SEQ ID NO:1-18、32-40和44-45的多肽中的任一种的分离的核酸，其中所述多肽可以任选地包含前导序列。在另一实施方式中，本发明提供包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47或者两者的分离的核酸。本发明还提供包含编码SEQ IDNO:1-18、32-40和44-45的多肽(其中所述多肽可以任选地包含前导序列)的任一种的核酸或者包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47或者两者的核酸的表达载体。这些分离的核酸及包含它们的表达载体可以用于在重组宿主细胞中表达本发明的抗体或其抗原结合片段。因此，本发明还提供包含编码SEQ ID NO:1-18、32-40和44-45的多肽(其中所述多肽可以任选地包含前导序列)的任一种的核酸或者包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47或者两者的核酸的宿主细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是细菌细胞、人细胞、哺乳动物细胞、毕赤酵母属细胞、植物细胞、HEK293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是酵母细胞，例如毕赤酵母属细胞或巴斯德毕赤酵母宿主细胞。
本发明还提供包含本发明的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。在一个实施方式中，组合物包含另外的治疗剂。在一个实施方式中，另外的治疗剂选自：抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；抗-TIGIT抗体或其抗原结合片段；抗-VISTA抗体或其抗原结合片段；抗-BTLA抗体或其抗原结合片段；抗-TIM3抗体或其抗原结合片段；抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段；抗-HVEM抗体或其抗原结合片段；抗-CD70抗体或其抗原结合片段；抗-OX40抗体或其抗原结合片段；抗-CD28抗体或其抗原结合片段；抗-PD1抗体或其抗原结合片段；抗-PDL1抗体或其抗原结合片段；抗-PDL2抗体或其抗原结合片段；抗-GITR抗体或其抗原结合片段；抗-ICOS抗体或其抗原结合片段；抗-SIRPα抗体或其抗原结合片段；抗-ILT2抗体或其抗原结合片段；抗-ILT3抗体或其抗原结合片段；抗-ILT4抗体或其抗原结合片段；和抗-ILT5抗体或其抗原结合片段；抗-4-1BB(CD137)抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2C抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2E抗体或其抗原结合片段；抗-TSLP抗体或其抗原结合片段；抗-IL-10抗体或其抗原结合片段；IL-10或聚乙二醇化IL-10；STING激动剂；CXCR2拮抗剂；和PARP抑制剂。
在本发明的药物组合物的一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
本发明还包括与一种、两种或更多种治疗剂组合的本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段；其中第二治疗剂选自：抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；抗-TIGIT抗体或其抗原结合片段；抗-VISTA抗体或其抗原结合片段；抗-BTLA抗体或其抗原结合片段；抗-TIM3抗体或其抗原结合片段；抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段；抗-HVEM抗体或其抗原结合片段；抗-CD70抗体或其抗原结合片段；抗-OX40抗体或其抗原结合片段；抗-CD28抗体或其抗原结合片段；抗-PD1抗体或其抗原结合片段；抗-PDL1抗体或其抗原结合片段；抗-PDL2抗体或其抗原结合片段；抗-GITR抗体或其抗原结合片段；抗-ICOS抗体或其抗原结合片段；抗-SIRPα抗体或其抗原结合片段；抗-ILT2抗体或其抗原结合片段；抗-ILT3抗体或其抗原结合片段；抗-ILT4抗体或其抗原结合片段；抗-ILT5抗体或其抗原结合片段；抗-4-1BB抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2C抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2E抗体或其抗原结合片段；抗-TSLP抗体或其抗原结合片段；抗-IL-10抗体或其抗原结合片段；IL-10或聚乙二醇化IL-10；STING激动剂；CXCR2拮抗剂；和PARP抑制剂。
在本发明的组合的一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
本发明还提供包含本发明的抗-CD27抗体或抗原结合片段中的任一种的容器或注射装置。在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或抗原结合片段，其包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3，其中X1＝M；(iv)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S。
本发明还提供产生本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段的方法，包括：在有利于多核苷酸表达的条件下培养包含编码本发明的抗体(或其抗原结合片段)的重链和/或轻链的多核苷酸的宿主细胞；和任选地从宿主细胞和/或培养基回收抗体或抗原结合片段。在一个实施方式中，编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸在单一载体中。在另一实施方式中，编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸在不同的载体中。在一个实施方式中，编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸编码包含以下的抗体或抗原结合片段：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在另一实施方式中，本发明提供编码来自结合人CD27的抗体或抗原结合片段的重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸，该抗体或抗原结合片段包含：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3，其中X1＝M；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S。
本发明还提供治疗需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段，任选地与另外的治疗剂或治疗过程相结合。在一个实施方式中，待治疗的受试者是人受试者。在一个实施方式中，另外的治疗剂选自：抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；抗-TIGIT抗体或其抗原结合片段；抗-VISTA抗体或其抗原结合片段；抗-BTLA抗体或其抗原结合片段；抗-TIM3抗体或其抗原结合片段；抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段；抗-HVEM抗体或其抗原结合片段；抗-CD70抗体或其抗原结合片段；抗-OX40抗体或其抗原结合片段；抗-CD28抗体或其抗原结合片段；抗-PD1抗体或其抗原结合片段；抗-PDL1抗体或其抗原结合片段；抗-PDL2抗体或其抗原结合片段；抗-GITR抗体或其抗原结合片段；抗-ICOS抗体或其抗原结合片段；抗-SIRPα抗体或其抗原结合片段；抗-ILT2抗体或其抗原结合片段；抗-ILT3抗体或其抗原结合片段；抗-ILT4抗体或其抗原结合片段；抗-ILT5抗体或其抗原结合片段；和抗-4-1BB抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2C抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2E抗体或其抗原结合片段；抗-TSLP抗体或其抗原结合片段；抗-IL-10抗体或其抗原结合片段；抗-IL-10抗体或其抗原结合片段；IL-10或聚乙二醇化IL-10；STING激动剂；CXCR2拮抗剂；和PARP抑制剂。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或抗原结合片段，其包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3，其中X1＝M；(iv)包含SEQID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S。
在一个实施方式中，本发明提供包含以下的组合物：(i)本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段；和(ii)包含SEQ ID NO:53的重链序列和SEQ ID NO:48的轻链序列的抗-PD1抗体。在另一实施方式中，本发明提供包含以下的组合物：(a)本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段；和(b)包含SEQ ID NO:52的重链可变序列和SEQ ID NO:78的轻链可变序列的抗-PD1抗体。在一个实施方式中，抗-PD1抗体在抗-CD27抗体的施用之前施用。在一个实施方式中，抗-PD1抗体在抗-CD27抗体的施用之前4-10天施用。在一个实施方式中，抗-PD1抗体的预处理可以调节免疫细胞，从而导致增强的抗-CD27抗体的Fc-介导的功能。在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
本发明还提供治疗受试者的感染或传染病的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗体或抗原结合片段，任选地与另外的治疗剂或治疗过程相结合。在一个实施方式中，所治疗的受试者是人受试者。在一个实施方式中，另外的治疗剂选自：抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；抗-TIGIT抗体或其抗原结合片段；抗-VISTA抗体或其抗原结合片段；抗-BTLA抗体或其抗原结合片段；抗-TIM3抗体或其抗原结合片段；抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段；抗-HVEM抗体或其抗原结合片段；抗-CD70抗体或其抗原结合片段；抗-OX40抗体或其抗原结合片段；抗-CD28抗体或其抗原结合片段；抗-PD1抗体或其抗原结合片段；抗-PDL1抗体或其抗原结合片段；抗-PDL2抗体或其抗原结合片段；抗-GITR抗体或其抗原结合片段；抗-ICOS抗体或其抗原结合片段；抗-SIRPα抗体或其抗原结合片段；抗-ILT2抗体或其抗原结合片段；抗-ILT3抗体或其抗原结合片段；抗-ILT4抗体或其抗原结合片段；抗-ILT5抗体或其抗原结合片段；和抗-4-1BB抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2C抗体或其抗原结合片段；抗-NKG2E抗体或其抗原结合片段；抗-TSLP抗体或其抗原结合片段；抗-IL-10抗体或其抗原结合片段；IL-10或聚乙二醇化IL-10；STING激动剂；CXCR2拮抗剂；和PARP抑制剂。
在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或抗原结合片段，其包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3，其中X1＝M；(iv)包含SEQID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S。
本发明还提供包含本发明的抗体或抗原结合片段的疫苗。在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或抗原结合片段，其包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3，其中X1＝M；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S。在一个实施方式中，疫苗进一步包含抗原。
本发明还提供了检测样品中CD27肽或其片段的存在的方法，包括使样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触，并检测抗体或片段与肽之间的复合物的存在；其中复合物的检测指示CD27肽的存在。在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段包含：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或抗原结合片段，其包含(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3，其中X1＝M；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和(vi)包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S。
本发明还提供了提高免疫细胞的活性的方法，包括使免疫细胞与本发明的抗体或抗原结合片段中的任一种接触。在一个实施方式中，本发明提供了提高免疫细胞的活性的方法，包括向需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或抗原结合片段。在一种实施方式中，该方法用于：治疗癌症、治疗感染或传染病或者用作疫苗佐剂。在一个实施方式中，可以通过测量免疫细胞的增殖来检测免疫细胞活性的提高。例如，可以通过测量T细胞的增殖来检测T细胞活性的提高。在一个实施方式中，可以通过测量源自受试者的样品中的离体T细胞激活来检测免疫细胞活性的提高。在一个实施方式中，T细胞活性的提高通过以下测定：(i)测量混合淋巴细胞反应或T细胞受体(TCR)信号传导的直接抗-CD3 mAb刺激以诱导选自下组的细胞因子的产生：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13；(ii)测量SEB诱导的一种或多种细胞因子的产生，所述细胞因子选自：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13；或(iii)测量TT诱导的细胞因子的产生，所述细胞因子选自：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13。在一个实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)包含SEQ IDNO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在另一实施方式中，本发明提供结合人CD27的抗体或抗原结合片段，其包含含有以下的重链可变区和轻链可变区：(i)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区CDR1，其中X1＝M；(ii)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；(iii)包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR3，其中X1＝M；(iv)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；(v)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和(vi)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S。
附图说明
图1显示抗体hCD27.15不结合CD27 A59T。CD27和CD27 A59T通过瞬时转染在CHO-K1上表达。通过流式细胞术测量hCD27.15(人源化6B)和Fc-mCD70与CD27和CD27 A59T的结合。尽管Fc-mCD70结合CD27和CD27 A59T两者，hCD27.15仅结合CD27。
图2显示抗体hCD27.15不结合猕猴(Macaca mulatta)CD27。HsCD27和MmCD27通过瞬时转染在CHO-K1上表达。通过流式细胞术测量hCD27.15(嵌合c-4)与HsCD27和MmCD27的结合。
图3A-3B显示了本发明的各种抗-CD27抗体的重链和轻链可变区与种系VH和VL序列的比对：131AVH6(SEQ ID NO:10)、131AVH7(SEQ ID NO:11)、131A亲本VH(SEQ ID NO:7)、131AVH8(SEQ ID NO:12)、131AVH9(SEQ ID NO:13)、VH1-102(SEQ ID NO:64)、VH1-146(SEQID NO:65)；131AVL6(SEQ ID NO:15)、131AVL7(SEQ ID NO:16)、131A亲本VL(SEQ ID NO:8)、131AVL8(SEQ ID NO:17)、131AVL9(SEQ ID NO:18)、VK1-O2(SEQ ID NO:66)、VK3-L6(SEQ ID NO:67)。
图4显示在具有MC38肿瘤的huCD27敲入小鼠中131AVH6VL6-huIgG1与1F5-huIgG1相比的抗肿瘤活性，如通过肿瘤体积和治疗后天数测量的。
图5显示131AVH6VL6-huIgG1与抗-PD-1组合在具有MB49肿瘤的huCD27敲入小鼠中的抗肿瘤活性。
图6A-6C.hCD27.131AVH6VL6-huIgG1在表达CD27的293FT细胞中诱导NF-κB激活。用编码人WT、A59T或恒河猴CD27的质粒瞬时转染含有NF-κB-荧光素酶报道构建体的人胚肾细胞(293FT-NF-κB-荧光素酶细胞)。细胞在存在或不存在抗人CD27抗体的情况下刺激16-20小时，然后如通过荧光素酶活性的读数测定NF-κB激活。显示了在表达(A)hCD27 WT、(B)hCD27 A59T或(C)表达恒河猴CD27的HEK293FT细胞用mAb hCD27.131AVH6VHL6huIgG1、1F5huIgG1或hCD27.15-4B IgG4刺激后相对于未刺激细胞的荧光素酶活性的倍数变化值。数据表示来自1个实验的三次重复测量(+SD)。数据代表3-6个独立实验。
图7A和7B.hCD27.131A IgG1和IgG4人源化变体在表达CD27的293FT细胞中诱导NF-κB激活。用编码人WT CD27的质粒瞬时转染含有NF-κB-荧光素酶报道构建体的人胚肾细胞(293FT-NF-κB-荧光素酶细胞)。细胞在存在或不存在抗-人CD27抗体的情况下刺激16-20小时，然后如通过荧光素酶活性的读数测定NF-κB激活。显示了在用(A)人IgG1或(B)IgG4框架上的人源化hCD27.131A抗体刺激后相对于未刺激细胞的荧光素酶活性的倍数变化值。
图8.131AVH6VL6-IgG1在原代人肿瘤TIL培养物中的生物活性。使用I型胶原酶和DNase I将从手术切除获得的人肿瘤组织(N＝20，16NSCLC，3RCC和1H&N)消化成单细胞悬液。含有各种肿瘤细胞类型的混合物的富集活细胞在10ng/ml抗-CD3存在下用0.1、1、10或20μg/mL的131AVH6VL6-hIgG1处理。处理还包括同种型对照(IgG1和IgG4,20μg/ml)和10μg/mL抗-PD-1(派姆单抗)。在第6天收集上清液用于干扰素γ(IFNγ)测量。显示了平均IFNγ水平和平均值的标准误差。用于处理组和同种型对照组之间的比较的P-值通过配对的参数双侧T-检验确定。IFNγ＝干扰素γ；IgG1＝免疫球蛋白G，亚类1；IgG4＝免疫球蛋白G，亚类4；SEM＝平均值的标准误差。
图9.比较131AVH6VL6-IgG1与hCD27.15-4BIgG4和IF5-IgG1在原代人肿瘤TIL培养物中的生物活性。来自20个肿瘤中的13个(12个NSCLC和1个H&N癌症)的消化的人肿瘤细胞还用hCD27.15-4BIgG4和IF5-IgG1同时进行测试。包含各种肿瘤细胞类型的混合物的富集活细胞用0.1、1、10或20μg/mL的131AVH6VL6-hIgG1、hCD27.15-4BIgG4和IF5-IgG1处理，包括同种型对照(IgG1和IgG4,20μg/ml)和10μg/mL抗-PD1(派姆单抗)对照。使用10ng/ml可溶性抗-CD3(BioLegend。克隆OKT3)作为刺激。在第6天收集上清液用于干扰素γ(IFNγ)测量。显示了平均IFNγ水平和平均值的标准误差。用于处理组和同种型对照组之间的比较的P-值通过配对的参数双侧T-检验确定。IFNγ＝干扰素γ；IgG1＝免疫球蛋白G，亚类1；IgG4＝免疫球蛋白G，亚类4；SEM＝平均值的标准误差。
图10.通过流式细胞术测定的小鼠hCD27.131A(小鼠IgG1)、人源化hCD27.15(人IgG4，克隆6B)、1A4(Beckman Coulter IM2034，克隆1A4CD27，小鼠IgG1)、9F4(SanquinPeliCluster CD27；Art.No.M1455,克隆CLB-CD27/1,9F4，小鼠IgG2a)和1F5IgG1与CHO-K1细胞上表达的hCD27丙氨酸突变体的结合。列出了测试的hCD27变体。氨基酸对应于UniProtP26842-1序列。氨基酸1-20构成信号肽。结合表示为FITC信号的几何平均值，其相对于设定为100％的与hCD27的抗体结合。
图11.131AVH6VL6Fab-CD27和M2177Fab-CD27复合物的结构比较(Obmolova等，MolImmunol.2017Mar；83:92-99,2017)：坐标在抗原结构叠加后显示为条带；CD27为黑色粗线，且131AVH6VL6Fab和M2177Fab的Fab分别为细线，黑色，浅灰色。M2177-CD27复合物的坐标对于Fab轻链、重链和抗原分别使用链A、B和X取自PDB5TLK。
图12A和12B.131AVH6VL6Fab-CD27(A)和M2177Fab-CD27复合物(B)的结构的比较，放大视图：输入模型和图片定向与图11相同，但该视图在Fab-抗原界面上放大以更好地显示比较。使用与图11相同的条带表示、颜色和厚度规则(除了M2177-CD27共结构是浅灰色的)，但是涉及极性相互作用的残基的侧链表示为棒。距离截止值的H键和盐桥以断线显示，使用较短的断线表示盐桥。
图13A和13B.小鼠抗-hCD27克隆hCD27.131A在基于细胞的ELISA中不与1F5IgG1交叉竞争结合hCD27。小鼠hCD27.131A和小鼠hCD27.15测试与1F5IgG1竞争结合hCD27。(A)左图：实验设置。右图：1F5IgG1的系列稀释，然后1μg/ml小鼠hCD27.131A、小鼠hCD27.15或小鼠IgG1同种型对照的交叉竞争数据。(B)左图：实验设置。右图：小鼠hCD27.131A、小鼠hCD27.15或小鼠IgG1同种型对照的系列稀释，然后1μg/ml 1F5IgG1的交叉竞争数据。具有误差条的数据点表示具有范围的重复测量的平均值。
图14.131AVH6VL6-hIgG1和1F5-hIgG1在原代CD8T细胞共刺激分析中的生物活性。
具体实施方式
缩略词
在整个本发明的详述和实施例中，将使用以下缩略词：
ADCC 抗体依赖性细胞毒性
CDC 补体依赖性细胞毒性
CDR 免疫球蛋白可变区中的互补决定区，使用Kabat编号系统定义
CHO 中国仓鼠卵巢
ELISA 酶联免疫吸附分析
FR 抗体框架区：排除CDR区的免疫球蛋白可变区
HRP 辣根过氧化物酶
IFN 干扰素
IC50 导致50％抑制的浓度
IgG 免疫球蛋白G
Kabat 通过Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.)开创的免疫球蛋白比对和编号系统mAb或Mab或MAb单克隆抗体
SEB 葡萄球菌肠毒素B
TCR T细胞受体
TT 破伤风类毒素
V区 不同抗体之间序列可变的IgG链的区段。其在轻链中延伸至Kabat残基109和在重链中延伸至Kabat残基113
VH 免疫球蛋白重链可变区
VK 免疫球蛋白κ轻链可变区
定义
为了可更容易理解本发明，在下文中具体地定义某些技术和科学术语。除非在本文件中别处具体地定义，否则本文所使用的所有其它技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。
除非上下文另外清楚地规定，否则如本文(包括随附权利要求)所用的，词语的单数形式诸如“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括其对应的复数指代物。
“施用”和“处理”在应用于动物、人类、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人类、个体、细胞、组织、器官或生物流体的接触。细胞的处理涵盖使试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中流体是与细胞接触的。“施用”和“处理”也意指通过试剂、诊断剂、结合化合物或通过另一细胞的体外和离体处理，例如细胞的处理。
“治疗”或“处理”意指在内部或外部向具有一种或多种疾病症状或怀疑患有药剂对其具有治疗活性的疾病的受试者或患者施用治疗剂，如含有本发明的任一抗体或抗原结合片段的组合物。通常，药剂以有效缓解所治疗受试者或群体中的一种或多种疾病症状的量施用，无论是以任何临床上可测量的程度诱导此类症状的消退或抑制其进展。有效缓解任何特定疾病症状的治疗剂的量可根据诸如疾病状态、患者的年龄和体重以及药物在受试者中引发所需反应的能力的因素而变化。是否疾病症状已缓解可通过医师或其它熟练医疗护理提供者通常用于评价该症状的严重程度或进展状态的任何临床测量来评价。
CD27
在本发明的实施方式中，人CD27的氨基酸序列包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20(其与SEQ ID NO:19相同，但包括SNP–A59T)的氨基酸序列。rs25680等位基因(通常称为A59T)的频率具有基于ExAC数据库的19.78％的总体平均。
在本发明的实施方式中，食蟹猴(例如，Macaca fascicularis)CD27或猕猴(Macaca Mulatta)CD27(mmCD27)的氨基酸序列包含SEQ ID NO:21中公开的氨基酸序列。
抗-CD27抗体及其抗原结合片段
本发明提供结合人CD27的抗体或其抗原结合片段，和此类抗体或片段的用途。在一些实施方案中，抗CD27抗体是分离的。
在一些实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或抗原结合片段以约5-10nM的KD结合人CD27(SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20)。在一个实施方式中，结合人CD27的本发明的抗体也与mmCD27交叉反应。如本文所用，“交叉反应性”是指抗体与来自其它物种的同源蛋白反应的能力。抗体是否特异性结合人CD27或mmCD27可使用本领域中已知的任何测定法确定。本领域中已知测定结合亲和力的分析方法的实例包括表面等离子共振(例如，BIACORE)或类似技术(例如，KinExa或OCTET)。
本发明包括抗CD27抗体和其使用方法。如本文所用，术语“抗体”是指展现所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广泛的含义使用，且特别地涵盖，但不限于，单克隆抗体(包括包含两条轻链和两条重链的全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、完全人抗体和嵌合抗体。
本发明包括抗-CD27抗原结合片段及其使用方法。如本文所用，除非另外指明，否则“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段，即保留特异性结合由全长抗体所结合的抗原的能力的抗体片段，例如保留一个或多个CDR区的片段。抗原结合片段的实例包括，但不限于，Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双体抗体(diabodies)；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的多特异性抗体。
本发明包括抗-CD27 Fab片段及其使用方法。“Fab片段”由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区组成。Fab分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。“Fab片段”可以是抗体的木瓜蛋白酶切割的产物。
本发明包括抗-CD27抗体及其包含Fc区的抗原结合片段以及其使用方法。“Fc”区含有两个包含抗体的CH3和CH2结构域的重链片段。两个重链片段通过两个或更多个二硫键和通过CH3结构域的疏水性相互作用保持在一起。
本发明包括抗-CD27 Fab’片段及其使用方法。“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的区域的一部分或片段，使得在两个Fab片段的两条重链之间可形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。
本发明包括抗-CD27 F(ab’)2片段和其使用方法。“F(ab')2片段”含有两条轻链和含有CH1结构域和CH2结构域之间的一部分恒定区的两条重链，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由通过两条重链之间的二硫键保持在一起的两个Fab'片段构成。“F(ab')2片段”可以是抗体的胃蛋白酶切割的产物。
本发明包括抗-CD27 Fv片段及其使用方法。“Fv区”包含来自重链和轻链两者的可变区，但缺乏恒定区。
本发明包括抗-CD27 scFv片段及其使用方法。术语“单链Fv”或“scFv”抗体是指包含抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽在VH与VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun(1994)The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，New York，第269-315页。还参见国际专利申请公开号WO 88/01649和美国专利号4,946,778和5,260,203。
本发明包括抗-CD27二价抗体及其使用方法。“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同抗原特异性。然而，二价抗体可以是双特异性的(参见下文)。
本发明包括抗-CD27双体抗体及其使用方法。如本文所用，术语“双体抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含与在同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用过短以使得同一链上的两个可变结构域之间不能配对的接头，迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，且产生两个抗原结合位点。对双体抗体的更全面描述在例如，EP404,097；WO 93/11161；和Holliger等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448中。关于工程化抗体变体的综述，一般参见Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23:1126-1136。
通常，以一定方式修饰的本发明的抗体或抗原结合片段在活性基于摩尔量表示时保留其结合活性的至少10％(当与亲本亲本相比时)。优选地，本发明的抗体或抗原结合片段保留亲本抗体的CD27结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多。还意欲本发明的抗体或抗原结合片段可包括不实质上改变其生物活性的保守或非保守氨基酸置换(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。
本发明包括分离的抗-CD27抗体和其抗原结合片段及其使用方法。“分离”的抗体或其抗原结合片段至少部分地不含来自产生其的细胞或细胞培养物的其它生物分子。此类生物分子包括核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其它物质，诸如细胞碎片和生长培养基。分离的抗体或抗原结合片段可进一步至少部分地不含表达系统组分，诸如来自宿主细胞或其生长培养基的生物分子。通常，术语“分离的”不意指完全不存在此类生物分子或不存在水、缓冲剂或盐，或包括抗体或片段的药物制剂的组分。
本发明包括抗-CD27嵌合抗体(例如，人恒定域/小鼠可变域)及其使用方法。如本文所用，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变域和来自第二抗体的恒定域的抗体，其中第一和第二抗体来自不同物种。(美国专利号4,816,567；和Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。通常，可变域获自来自实验动物诸如啮齿动物的抗体(“亲本抗体”)，且恒定域序列获自人抗体，使得所得嵌合抗体与亲本(例如小鼠)抗体相比，将较少可能在人类受试者中引发不良免疫反应。
本发明包括抗-CD27人源化抗体和其抗原结合片段(例如，人源化的大鼠或小鼠抗体)及其使用方法。本发明包括131A抗体的任何人源化形式。如本文所用，“131A抗体”和“hCD27.131A”可互换使用以指包含SEQ ID NO:7的VH区和SEQ ID NO:8的VL区的抗体。如本文所用，术语“人源化抗体”是指含有来自人和非人(例如，小鼠或大鼠)抗体的序列的抗体形式。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变域的基本上全部，其中所有或实质上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些且所有或基本上所有框架(FR)区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体可任选地包含人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分。关于人源化抗体的更多细节，参见例如Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Reichmann等,Nature,332:323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992)；和Clark,Immunol.Today 21:397-402(2000)。
通常，基本抗体结构单元包含四聚体。各四聚体包括两个相同的多肽链对，各对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。各链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。重链的羧基末端部分可定义主要负责效应子功能的恒定区。通常，人轻链分类为κ和λ轻链。此外，人重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε，且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区接合，其中重链还包括约10个以上氨基酸的“D”区。一般参见Fundamental Immunology第7章(Paul,W.编辑，第2版，Raven Press,N.Y.(1989))。
各轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。因此，通常，完整抗体具有两个结合位点。除了在双功能或双特异性抗体中，两个结合位点通常是相同的。
通常，重链和轻链两者的可变结构域包含三个高变区，也称为互补决定区(CDR)，其位于相对保守框架区(FR)内。CDR通常通过构架区排列，使得能够结合特异性表位。通常，从N端至C端，轻链和重链可变结构域包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸分配至各结构域通常根据以下的定义：Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Kabat等；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH公开号91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat等,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia等,(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia等,(1989)Nature342:878-883。
如本文所用，术语“框架”或“FR”残基是指除在本文中定义为CDR残基的高变区残基外的那些可变域残基。
如本文所用，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体或其抗原结合片段的氨基酸残基。高变区包含来自CDR(即轻链可变域中的CDRL1、CDRL2和CDRL3，和重链可变域中的CDRH1、CDRH2和CDRH3)的氨基酸残基。参见Kabat等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(通过序列定义抗体的CDR区)；还参见Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917(通过结构定义抗体的CDR区)。
“分离的核酸分子”或“分离的多核苷酸”意指基因组、mRNA、cDNA或合成来源的DNA或RNA或其一些组合，其不与其中该分离的多核苷酸天然存在的多核苷酸的全部或一部分关联，或连接至其在自然界中不连接的多核苷酸。出于本发明的目的，应理解“包含特定核苷酸序列的核酸分子”不涵盖完整染色体。除指定序列之外，“包含”指定核酸序列的分离的核酸分子可包括多达十种或甚至多达二十种或更多种其它蛋白质或其部分或片段的编码序列，或可包括控制所述核酸序列的编码区的表达的可操作连接的调控序列，和/或可包括载体序列。
短语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所需的DNA序列。适于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选操纵基因序列和核糖体结合位点。已知真核细胞使用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸或多核苷酸处于与另一核酸序列的功能关系中时，其为“可操作连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与该多肽的DNA可操作连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该序列可操作连接；或如果核糖体结合位点被定位以便有助于翻译，则其与编码序列可操作连接。通常，但未必总是，“可操作连接”意味着所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的和在阅读相中。然而，增强子不必是连续的。连接通过在适宜限制性位点处接合来实现。如果此类位点不存在，则根据常规操作使用合成寡核苷酸衔接体或接头。
如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用且所有此类名称均包括子代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和来源于其的培养物，而无论转移次数。还应理解，由于有意或无意突变，不是所有子代都具有准确相同的DNA内含物。包括具有与最初转化细胞中所筛选相同的功能或生物活性的突变子代。在预期不同名称的情况下，其从上下文来看将是清楚的。
如本文所用，“种系序列”是指未重排的免疫球蛋白DNA序列的序列。可使用未重排的免疫球蛋白序列的任何合适来源。人类种系序列可获得自例如美国国立卫生研究院(United States National Institutes of Health)的美国国立关节炎和肌肉骨骼和皮肤病研究所(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal andSkinDiseases)的网站上的JOINSOLVER种系数据库。小鼠种系序列可例如如Giudicelli等(2005)Nucleic Acids Res.33:D256-D261中所述获得。
示例性抗-CD27抗体的物理和功能性质
本发明提供具有指定结构和功能特征的抗-CD27抗体及其抗原结合片段，和所述抗体或其抗原结合片段用于治疗或预防疾病(例如，癌症或传染病)的使用方法。
“本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段”包括：本文中讨论的任何抗体或其抗原结合片段(例如，hCD27.131A或表12中公开的其人源化形式)或其变体(例如，序列变体或功能变体)；包含表12中所示的任何一个或多个CDR的抗体或抗原结合片段。
如上所述，与本发明的任何抗-CD27抗体或其抗原结合片段结合相同的表位的抗体和片段也形成本发明的部分。在一个实施方式中，本发明提供与包含SEQ ID NO:10的可变重链和SEQ ID NO:15的可变轻链的抗体结合相同的人CD27表位的抗体或其抗原结合片段。在另一实施方式中，本发明提供与包含SEQ ID NO:7的可变重链和SEQ ID NO:8的可变轻链的抗体结合相同的人CD27表位的抗体或其抗原结合片段。存在几种可用于定位靶抗原上的抗体表位的方法，包括：H/D-Ex质谱法、X射线晶体学、pepscan分析、丙氨酸扫描、羟自由基足迹法和定点诱变。例如，与蛋白水解和质谱法偶联的HDX(氢氘交换)可用于测定抗体在特定抗原Y上的表位。HDX-MS依赖于抗原在D2O中自身和在其抗体存在的情况下以各种时间间隔孵育时抗原的氘掺入的准确测量和比较。氘与暴露区域中蛋白质的酰胺主链上的氢交换，而与抗体结合的抗原的区域被保护并将在通过蛋白水解片段的LC-MS/MS分析之后显示较少或没有交换。在一个实施方式中，表位通过解析CD27或其片段与抗-CD27抗体或其片段之间的复合物的晶体结构并确定抗-CD27抗体残基的内的一个或多个CD27残基来确定。在另一实施方式中，表位包括例如具有与抗-CD27抗体残基的范德华力、极性相互作用、盐桥或氢键接触的CD27残基。在另一实施方式中，表位通过CD27残基的诱变(例如丙氨酸扫描)并分析由诱变导致的与抗-CD27抗体结合的丧失来确定。
本发明提供抗体或其抗原结合片段，其中当与人CD27结合时，其结合选自SEQ IDNO:19的Leu18、Asp34、Gln35和Lys38的至少一个残基。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合选自SEQ ID NO:19的Leu18、Asp34、Gln35和Lys38的至少一个、两个、三个或四个残基。本发明还提供抗体或其抗原结合片段，其中当与人CD27结合时，其结合选自SEQ IDNO:19的Gln35和Lys38的至少一个残基。在一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO:19的至少Gln35和Lys38。
在前述实施方案的另一实施方式中，抗体或抗原结合片段进一步结合选自SEQ IDNO:19的Pro8、Glu9、His11、Lys17、His36和Arg37的一个或多个残基(一个、两个、三个、四个、五个或六个残基)。在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段进一步结合选自SEQID NO:19的Glu9、Lys17、His36和Arg37的一个或多个残基(一个、两个、三个或四个残基)。在本发明的另一方面，抗体或其抗原结合片段结合SEQ ID NO:19的残基Pro8、Glu9、His11、Lys17、Leu18、Asp34、Gln35、His36、Arg37和Lys38。在进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段结合SEQ ID NO:19的残基Glu9、Lys17、Leu18、Asp34、Gln35、His36、Arg37和Lys38。
在前述实施方案的一个实施方式中，抗体或其抗原结合片段任选地具有至少一种以下特征：根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27 A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活的增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。
本发明的抗-CD27抗体的免疫球蛋白链以及它们的CDR的实例包括，但不限于表12中公开的那些(SEQ ID NO:7-18和32-40)。本发明包括包含SEQ ID NO:7-18和32-40的氨基酸序列或由其组成的任何多肽，及编码这些多肽的重组核苷酸。
本发明的范围包括分离的抗-CD27抗体及其抗原结合片段(例如人源化抗体)，其包含本文给出的免疫球蛋白链的变体，例如SEQ ID NO:7-18、32-40和44-45中的任一种；其中变体展现以下特性中的一种或多种：根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27 A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活的增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。在一个实施方式中，变体相对于SEQ ID NO:7-18、32-40和44-45中的任何一个包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸置换。
在其它实施方式中，本发明提供结合人CD27且具有与SEQ ID NO:7-18和32-40中至少一个的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的VL结构域和VH结构域的抗体或其抗原结合片段(例如，人源化抗体)；其中该变体表现出所希望的结合和性质，例如，根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于200pM的EC50结合人CD27；根据细胞ELISA分析以低于150pM或低于250pM的EC50结合人CD27 A59T；根据细胞ELISA分析以低于100pM或低于150pM的EC50结合恒河猴CD27；如通过表面等离子体共振(例如BIACORE)或类似技术(例如KinExa或OCTET)测定的以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)；与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；阻断人CD27与人CD70的结合；增加T细胞激活；刺激抗原特异性的T-细胞产生IL-2和IFNγ；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以低于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；对于与CD8+或CD4+T细胞上的人CD27的结合具有低于0.5nM的EC50；以可溶性形式增加CD8+T细胞激活；和在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。在一个实施方式中，表达人CD27、人CD27A59T或恒河猴CD27的细胞是具有瞬时转染的CD27质粒的包含NF-κB-荧光素酶报告构建体的HEK293FT人胚肾细胞。在一个实施方式中，CD8+T细胞激活通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量，且具有平均约1.5-2倍的CD8+T细胞激活的增加。在另一实施方式中，抗-CD3诱导的IFNγ产生的增加在20ug/ml的抗-CD27抗体和10ng/ml的抗-CD3抗体下是至少1.5倍。
在其它实施方式中，本发明提供结合人CD27且具有与SEQ ID NO:8、14-18、33、35和40的VL结构域中的任一个和SEQ ID NO:7、9-13、32、34和39的VH结构域中的任一个的至少95％序列同一性的VL结构域和VH结构域的抗体或其抗原结合片段(例如，人源化抗体)；在其它实施方式中，本发明提供结合人CD27且具有SEQ ID NO:8、14-18、33、35和40的VL结构域中的任一个和SEQ ID NO:7、9-13、32、34和39的VH结构域中的任一个的VL结构域和VH结构域的抗体或其抗原结合片段(例如，人源化抗体)。在其它实施方式中，本发明提供结合人CD27且具有与SEQ ID NO:8、14-18、33、35和40的VL结构域中的任一个和SEQ ID NO:7、9-13、32、34和39的VH结构域中的任一个的至少99％序列同一性的VL结构域和VH结构域的抗体或其抗原结合片段(例如，人源化抗体)。
“保守修饰变体”或“保守置换”是指蛋白质中的氨基酸被具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、骨架构象和刚性等)的其它氨基酸取代，使得可频繁进行该变化而不改变蛋白质的生物活性。本领域技术人员认识到，通常，多肽的非关键区域中的单一氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如，Watson等人(1987)Molecular Biologyof the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第4版))。另外，结构或功能上相似的氨基酸的置换不太可能破坏生物学活性。示例性保守置换示于表1中。
表1.示例性保守氨基酸置换
本发明还涵盖本发明抗体的功能保守变体。如本文所用，“功能保守变体”是指其中一个或多个氨基酸残基被改变而不改变所需特性(如抗原亲和力和/或特异性)的抗体或片段。此类变体包括，但不限于氨基酸被具有类似特性的氨基酸替代，如表1的保守氨基酸置换。还提供具有多达0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸置换的包含本发明抗CD27抗体的VL结构域(例如，SEQ ID NO:8、14-18、33、35和40)的分离的多肽和包含本发明抗CD27抗体的VH结构域(例如，SEQ ID NO:7、9-13、32、34和39)的分离的多肽。
在另一实施方式中，提供了结合CD27和具有与本文所述的VL结构域或VH结构域中的一个或多个具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％或75％序列同一性的VL结构域和VH结构域，且表现出与CD27的特异性结合的抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，本发明的结合抗体或其抗原结合片段包含具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个氨基酸置换的VL和VH结构域(具有和不具有信号序列)，且表现出与CD27的特异性结合。
多核苷酸和多肽
本发明进一步包括编码本发明的抗-CD27抗体及其抗原结合片段的多肽或免疫球蛋白链中任一种的多核苷酸。例如，本发明包括编码SEQ ID NO:1-18、32-40和44-45任一个中描述的氨基酸的多核苷酸。在另一实施方式中，本发明提供包含SEQ ID NO:46或SEQ IDNO:47或两者的分离的核酸。
在一个实施方式中，提供分离的多核苷酸，例如DNA，其编码本文中给出的分离的抗体或抗原结合片段的多肽链。在一个实施方式中，分离的多核苷酸编码包含至少一个根据本发明的成熟免疫球蛋白轻链可变(VL)结构域和/或至少一个根据本发明的成熟免疫球蛋白重链可变(VH)结构域的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，分离的多核苷酸在单一多核苷酸分子上编码轻链与重链，且在其它实施方式中，轻链和重链在单独的多核苷酸分子上编码。在另一个实施方式中，多核苷酸进一步编码信号序列。
在一个实施方式中，本发明包含分离的多核苷酸，其编码包含CDR-H1(SEQ ID NO:1)、CDR-H2(SEQ ID NO:2)和CDR-H3(SEQ ID NO:3)的VH结构域或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，本发明包含分离的多核苷酸，其编码包含CDR-L1(SEQ ID NO:4)、CDR-L2(SEQ ID NO:5)和CDR-L3(SEQ ID NO:6)的抗体轻链可变(VL)结构域或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，本发明包含分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO:7的VH结构域。
在一个实施方式中，本发明包含分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO:8的VL结构域。
在一个实施方式中，本发明包含分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO:10-13任一的VH结构域。
在一个实施方式中，本发明包含分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO:10的VH结构域。
在一个实施方式中，本发明包含分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO:15-18任一的VL结构域。
在一个实施方式中，本发明包含分离的多核苷酸，其编码SEQ ID NO:15的VL结构域。
本发明还提供载体，例如表达载体，如质粒，其包含本发明的分离的多核苷酸，其中当宿主细胞用该载体转染时，该多核苷酸可操作连接至宿主细胞识别的控制序列。还提供包含本发明的载体的宿主细胞和用于产生本文公开的抗体或其抗原结合片段或多肽的方法，所述方法包括在培养基中培养携带编码抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白链的表达载体或核酸的宿主细胞，且从宿主细胞或培养基分离抗原或其抗原结合片段。
本发明中还包括多肽，例如免疫球蛋白多肽，其氨基酸序列在通过BLAST算法进行比较时与本文提供的抗体的氨基酸序列至少约75％相同、80％相同、更优选至少约90％相同且最优选至少约95％相同(例如95％、96％、97％、98％、99％、100％)，其中选择该算法的参数以在相应参考序列的整个长度上在相应序列之间得到最大匹配(例如预期阈值：10；字长：3；查询范围中的最大匹配：0；BLOSUM62矩阵；间隙成本：存在11、延伸1；条件性组成评分矩阵调整)。
序列同一性是指当两个序列最佳比对时，两个多肽的氨基酸在等同位置相同的程度。
以下参考文献涉及经常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS:Altschul等(2005)FEBS J.272(20):5101-5109；Altschul,S.F.等,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.等,(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden,T.L.等,(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.等,(1997)Genome Res.7:649-656；Wootton,J.C.等.,(1993)Comput.Chem.17:149-163；Hancock,J.M.等,(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.等,"A model of evolutionary change inproteins."in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(ed.),pp.345-352,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等,"Matrices for detecting distant relationships."in Atlas ofProtein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3."M.O.Dayhoff(ed.),pp.353-358,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565；States,D.J.等,(1991)Methods3:66-70；Henikoff,S.等,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919；Altschul,S.F.等,(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.等,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268；Karlin,S.等,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877；Dembo,A.等,(1994)Ann.Prob.22:2022-2039；和Altschul,S.F."Evaluating the statistical significanceof multiple distinct local alignments."in Theoretical and ComputationalMethods in Genome Research(S.Suhai,ed.),(1997)pp.1-14,Plenum,New York。
结合亲和力
例如且不限于，本文公开的抗体和抗原结合片段可以如通过表面等离子共振(例如，BIACORE)或类似技术(例如，KinExa或OCTET)所测定的以10x 10-9M或更低的二价KD值结合人CD27或CD27A59T(SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20)，如用人CD27-Fc融合蛋白或人CD27A59T-Fc融合蛋白测量的。在一个实施方式中，本文公开的抗体和抗原结合片段可以如通过表面等离子共振(例如，BIACORE)或类似技术(例如，KinExa或OCTET)所测定的以约5-10x10-9M的二价KD值结合人CD27或CD27A59T，如用人CD27-Fc融合蛋白或人CD27A59T-Fc融合蛋白测量的。
免疫细胞激活
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段提高免疫细胞的活性。免疫细胞活性的提高可使用本领域中已知的任何方法检测。在一个实施方式中，免疫细胞活性的提高可通过测量免疫细胞的增殖来检测。例如，T细胞活性的提高可通过测量T细胞的增殖或信号转导事件如将信号传输至转录调节因子的免疫受体或下游激酶的酪氨酸磷酸化来检测。在其它实施方式中，免疫细胞活性的提高可通过测量特定靶细胞上的CTL或NK细胞细胞毒性功能或与抗肿瘤免疫的刺激相关的IFNγ细胞因子反应来检测。在再其它的实施方式中，免疫细胞活性的提高可通过测量来源于受试者的样品中的离体T细胞激活来检测。在一个实施方式中，T细胞活性的提高通过以下来测定：(i)测量SEB(葡萄球菌肠毒素B)诱导的一种或多种选自以下的促炎性细胞因子的产生：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13；或(ii)测量诱导选自以下的细胞因子的产生的混合淋巴细胞反应或TCR信号传导的直接抗-CD3mAb刺激：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5和IL-13。在某些实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段将使IL-2和/或IFNγ的抗原特异性T细胞产生刺激至少1.5倍。
在一些实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段提高免疫细胞活性的能力可以通过流式细胞术测定的CD25和CD69上调来检测。
抗-hCD27抗体阻断与hCD70的结合的能力
在一些实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或抗原结合片段能够阻断人CD27与人CD70的结合。阻断人CD27与人CD70的结合的能力可使用本领域中已知的任何方法测定。在一个实施方式中，抗体阻断人CD27与人CD70的结合的能力使用ELISA分析来测定。
制备抗体及其抗原结合片段的方法
因此，本发明包括用于制备本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段的方法，其包括将表达抗体或片段的杂交瘤细胞在有利于此类表达的条件下培养，且任选地从杂交瘤和/或生长培养基(例如，细胞培养基)分离抗体或片段。
本文公开的抗-CD27抗体也可以重组产生(例如，在大肠杆菌/T7表达系统、哺乳动物细胞表达系统或低等真核生物表达系统中)。在该实施方式中，编码本发明的抗体免疫球蛋白分子(例如VH或VL)的核酸可插入基于pET的质粒中并在大肠杆菌/T7系统中表达。例如，本发明包括用于在宿主细胞(例如，细菌宿主细胞，如大肠杆菌，如BL21或BL21DE3)中表达抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的方法，其包括在还包括可操作连接至T7启动子的编码免疫球蛋白链的多核苷酸的细胞中表达T7 RNA聚合酶。例如，在本发明的实施方式中，细菌宿主细胞如大肠杆菌包括编码可操作连接至lac启动子的T7 RNA聚合酶基因的多核苷酸，且聚合酶和链的表达通过宿主细胞与IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)一起孵育来诱导。
存在几种本领域中已知的通过其产生重组抗体的方法。用于重组产生抗体的方法的一个实例公开于美国专利号4,816,567中。
转化可通过任何已知用于将多核苷酸引入宿主细胞中的方法进行。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法是本领域中众所周知的，且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、多核苷酸在脂质体中的包封、基因枪注射和DNA至细胞核中的直接显微注射。另外，核酸分子可通过病毒载体引入哺乳动物细胞中。转化细胞的方法是本领域中众所周知的。参见例如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455。
因此，本发明包括用于制备本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的重组方法，其包括引入编码抗体或片段的一条或多条免疫球蛋白链(例如，免疫球蛋白重链和/或轻链)的多核苷酸；在有利于此类表达的条件下培养宿主细胞(例如，CHO或毕赤酵母或巴斯德毕赤酵母)且任选地从宿主细胞和/或宿主细胞在其中生长的培养基分离抗体或片段或链。
抗-CD27抗体也可通过美国专利号6,331,415中记载的任一方法合成。
作为用于表达本文公开的抗体或片段或免疫球蛋白链的宿主的真核和原核宿主细胞(包括哺乳动物细胞)是本领域中众所周知的，且包括许多可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)、A549细胞、3T3细胞、HEK-293细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。特别优先的细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平来选择。可使用的其它细胞系为昆虫细胞系，如Sf9细胞、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞和真菌细胞。真菌细胞包括酵母和丝状真菌细胞，包括例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、考拉姆毕赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichia minuta)(Ogataea minuta、林氏毕赤酵母(Pichia lindneri))、Pichiaopuntiae、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、Pichia salictaria、Pichiaguercuum、皮杰普氏毕赤酵母(Pichia pijperi)、Pichia stiptis、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、毕赤酵母属(Pichia sp.)、酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)、酵母属(Saccharomyces sp.)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces sp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、镰刀菌属(Fusarium sp.)、禾谷镰孢菌(Fusarium gramineum)、镰孢霉(Fusarium venenatum)、小立碗藓(Physcomitrella patens)和粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)。毕赤酵母属、任何酵母属、多形汉逊酵母、任何克鲁维酵母属、白色念珠菌、任何曲霉菌属、里氏木菌、金孢子菌、任何镰刀菌属、解脂耶氏酵母和粗糙脉孢菌。当将编码重链或其抗原结合部分或片段、轻链和/或其抗原结合片段的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞中时，抗体通过将宿主细胞培养足以允许抗体或片段或链在宿主细胞中表达或分泌至宿主细胞在其中生长的培养基中的一段时间来产生。
抗体及其抗原结合片段和免疫球蛋白链可使用标准蛋白纯化方法从培养基回收。此外，可使用许多已知的技术增强本发明的抗体及其抗原结合片段和免疫球蛋白链(或来自其的其它部分)从产生细胞系的表达。例如，谷氨酰胺合成酶基因表达系统(GS系统)为用于增强在某些条件下表达的常用方法。GS系统整体或部分地结合欧洲专利号0216846、0256055和0323997及欧洲专利申请号89303964.4进行讨论。因此，在本发明的实施方式中，哺乳动物宿主细胞(例如，CHO)缺乏谷氨酰胺合成酶基因并在培养基中不存在谷氨酰胺的情况下生长，然而其中编码免疫球蛋白链的多核苷酸包含补偿宿主细胞中该基因的缺乏的谷氨酰胺合成酶基因。
通常，在特定细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白特征性的糖基化模式。因此，抗体的特定糖基化模式将取决于用于产生抗体的特定细胞系或转基因动物。然而，由本文提供的核酸分子编码或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体均构成本发明，而无论抗体可能具有的糖基化模式。类似地，在具体实施方式中，具有仅包含非岩藻糖基化N-聚糖的糖基化模式的抗体可能是有利的，因为这些抗体已显示通常在体外和体内显示比其岩藻糖基化对应物更高的功效(参见例如Shinkawa等，J.Biol.Chem.278:3466-3473(2003)；美国专利号6,946,292和7,214,775)。具有非岩藻糖基化N-聚糖的这些抗体因为其碳糖结构为人血清IgG中存在的群体的正常组分而不太可能是免疫原性的。
本发明包括具有对CD27和另一抗原诸如例如PD-1、PD-L1或LAG-3的结合特异性的双特异性和双功能抗体和抗原结合片段，及其使用方法。在本发明的实施方式中，抗-CD27链包含表12中所述的VH/VL序列中的任一个，且抗-PD1链包含SEQ ID NO:48和53或SEQ IDNO:78和52的氨基酸序列(或任何所述序列的抗原结合片段)。双特异性或双功能抗体为具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可通过包括杂交瘤的融合或Fab’片段的连接的多种方法产生。参见例如Songsivilai等,(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315-321，Kostelny等,(1992)J Immunol.148:1547-1553。另外，双特异性抗体可形成为“双体抗体”(Holliger等,(1993)PNAS USA 90:6444-6448)或为“Janusins”(Traunecker等,(1991)EMBO J.10:3655-3659和Traunecker等,(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:51-52)。
本发明进一步包括本文公开的抗-CD27抗体的抗-CD27抗原结合片段。抗体片段包括F(ab)2片段，其可通过IgG被例如胃蛋白酶的酶促切割来产生。Fab片段可通过例如用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab)2来产生。
免疫球蛋白可根据其重链恒定域的氨基酸序列而分成不同类别。在一些实施方式中，不同恒定域可以附接于源自本文提供的CDR的人源化VL和VH区。存在至少五个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且这些中的几种可进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。本发明包含抗体的这些类别或亚类中任一种的抗体和抗原结合片段。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链恒定区，例如人恒定区，如γ1、γ2、γ3或γ4人重链恒定区或其变体。在另一实施方式中，抗体或抗原结合片段包含轻链恒定区，例如人轻链恒定区，如λ或κ人轻链区或其变体。例如且不限于，人重链恒定区可以是γ4，且人轻链恒定区可以是κ。在替代实施方式中，抗体的Fc区为具有Ser228Pro突变的γ4(Schuurman,J人,Mol.Immunol.38:1-8,2001)。
在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含IgG1亚型的重链恒定区。在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含IgG2亚型的重链恒定区。在一个实施方式中，抗体或抗原结合片段包含IgG4亚型的重链恒定区。
抗体工程
进一步包括其中抗-CD27抗体及其抗原结合片段是工程化抗体以包括对亲本hCD27.131A单克隆抗体的可变结构域内框架残基的修饰(例如，以改善抗体或片段的特性)的实施方式。通常，进行此类框架修饰以降低抗体或片段的免疫原性。这通常通过将亲本(例如，啮齿动物)抗体或片段中可变结构域中的非CDR残基(即框架残基)用来自其中抗体将使用的物种的免疫库的类似残基(例如在人类治疗剂的情况下的人残基)替换来实现。这种抗体或片段被称为“人源化”抗体或片段。在一些情况下，需要提高工程化(例如人源化)抗体的亲和力或改变其特异性。一种方法是使一个或多个框架残基“回复突变”成相应种系序列。更具体地，已经历体细胞突变的抗体或片段可含有不同于抗体所来源的种系序列的框架残基。此类残基可通过比较抗体或片段框架序列与该抗体或片段所来源的种系序列来鉴定。另一方法是在工程化(例如人源化)抗体的一个或多个位置处回复至原始亲本(例如啮齿动物)残基，例如以恢复在替换框架残基的过程中可能失去的结合亲和力(参见例如美国专利号5,693,762、美国专利号5,585,089、美国专利号5,530,101)。
在某些实施方式中，抗-CD27抗体及其抗原结合片段被工程化(例如人源化)以在框架和/或CDR中包括修饰而改善其特性。此类工程化的变化可以是基于分子建模。亲本(非人)抗体序列的可变区的分子模型可被构建以理解抗体的结构特征并用于鉴定抗体上可与抗原相互作用的潜在区域。常规CDR基于免疫球蛋白序列的比对和鉴定可变区。Kabat等，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等；NationalInstitutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH公开号91-3242；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat等，(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616。Chothia和同事仔细地检查抗体的晶体结构中环的构型且提出了高变环。Chothia等，(1987)JMol.Biol.196:901-917或Chothia等，(1989)Nature 342:878-883。归类为“CDR”和“高变环”的区域之间存在变化。后来的研究(Raghunathan等，(2012)J.Mol Recog.25,3,103-113)分析了几种抗体-抗原晶体复合物且观察到抗体中的抗原结合区不必然严格地符合“CDR”残基或“高变”环。非人抗体的可变区的分子模型可用于指导可潜在结合抗原的区域的选择。实际上，基于模型的潜在抗原结合区不同于常规“CDR”或“高变”环。商业的科学软件如MOE(Chemical Computing Group)可用于分子建模。人框架可基于框架中和CDR中与非人类序列的最佳匹配来选择。对于VH中的FR4(框架4)，将人种系的VJ区与对应非人区域相比较。在VL中的FR4(框架4)的情况下，将人种系序列的J-κ和J-λ区与对应非人区域相比较。一旦鉴定合适的人框架，将CDR嫁接至所选择的人框架中。在一些情况下，VL-VH界面中的某些残基可如非人(亲本)序列中保留。分子模型也可用于鉴定可潜在地改变CDR构型且因此改变与抗原的结合的残基。在一些情况下，这些残基如非人(亲本)序列中得到保留。分子模型也可用于鉴定溶剂暴露的氨基酸，其可导致不需要的作用，如糖基化、脱酰胺和氧化。可在设计阶段早期引入可开发性过滤器(developability filter)以消除/最小化这些潜在问题。
另一类型的框架修饰涉及将框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位，由此降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫”，且进一步详细描述于美国专利号7,125,689中。
在具体实施方式中，需要将包含暴露的侧链的某些氨基酸改变成另一氨基酸残基以提供最终抗体的更大化学稳定性，从而避免脱酰胺或异构化。天冬酰胺的脱酰胺可在NG、DG、NG、NS、NA、NT、QG或QS序列上发生，且导致产生异天冬氨酸残基(其将扭结引入多肽链中且降低其稳定性(异天冬氨酸作用))。异构化可在DG、DS、DA或DT序列处发生。在某些实施方式中，本公开的抗体不含脱酰胺或天冬酰胺异构位点。
例如，天冬酰胺(Asn)残基可改变成Gln或Ala以降低任何Asn-Gly序列处(特别是CDR内)形成异天冬氨酸的潜能。相似的问题可在Asp-Gly序列处发生。Reissner和Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60:1281。异天冬氨酸形成可减弱或完全消除抗体与其靶抗原的结合。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731第734页。在一个实施方式中，天冬酰胺改变成谷氨酰胺(Gln)。也可能需要改变与天冬酰胺(Asn)或谷氨酰胺(Gln)残基相邻的氨基酸以降低脱酰胺(其在小氨基酸与天冬酰胺或谷氨酰胺相邻出现时以较大速率发生)的可能性。参见Bischoff&Kolbe(1994)J.Chromatog.662:261。另外，CDR中任何甲硫氨酸残基(通常溶剂暴露的Met)可改变成Lys、Leu、Ala或Phe或其它氨基酸以降低甲硫氨酸硫氧化(其可降低抗原结合亲和力且还造成最终抗体制备物中的分子异质性)的可能性。同上。另外，为了防止或最小化潜在易切断的Asn-Pro肽键，可能需要将在CDR中发现的任何Asn-Pro组合改变成Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。随后筛选具有此类置换的抗体以确保该置换不使抗体对CD27的亲和力或特异性或者其它所需生物学活性降低至不可接受的水平。
表2.示例性的稳定化CDR变体
Fc区的抗体工程
本文公开的抗体(例如，人源化抗体)及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)也可以工程化以包括Fc区内的修饰，从而通常改变抗体的一种或多种特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或效应子功能(例如，抗原依赖性细胞毒性)。此外，本文公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可被化学修饰(例如，一个或多个化学部分可连接至抗体)或改变其糖基化的修饰，以再次改变抗体或片段的一种或多种特性。这些实施方式中的每一种进一步详细描述于下文中。Fc区中的残基的编号是Kabat的EU索引的编号。
本文公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)也包括具有修饰(或阻断)的Fc区以提供改变的效应子功能的抗体和片段。参见例如美国专利号5,624,821；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此类修饰可用于增强或抑制免疫系统的各种反应，其具有在诊断和疗法中的可能有益作用。Fc区的改变包括氨基酸变化(置换、缺失和插入)、糖基化或去糖基化及添加多个Fc区。Fc的变化也可改变治疗抗体中抗体的半衰期，从而能够实现不太频繁的给药且因此提高的便利性和减少的物质使用。参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731第734-35页。
在一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式)是在重链恒定区的铰链区中对应于位置228的位置处包含丝氨酸至脯氨酸的突变(S228P；EU索引)的IgG4同种型抗体或片段。该突变已报告为消除铰链区中重链间二硫桥的异质性(Angal等，同上；位置241是基于Kabat编号系统)。
在本发明的一个实施方式中，CH1的铰链区被修饰，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目增加或减少。该方法进一步描述于美国专利号5,677,425中。CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目被改变，例如以促进轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
在另一实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式)的Fc铰链区被突变以缩短抗体或片段的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面中，使得抗体或片段相对于天然Fc-铰链结构域葡萄球菌蛋白A(SpA)结合具有受损的SpA结合。此方法进一步详细描述于美国专利号6,165,745中。
在另一实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式)被修饰以增加其生物半衰期。各种方法是可能的。例如，可引入以下突变中的一种或多种：T252L、T254S、T256F，如美国专利号6,277,375中所述。或者，为了增加生物半衰期，抗体可在CH1或CL区内改变以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的拯救受体结合表位，如美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
在再其它的实施方式中，Fc区通过将至少一个氨基酸残基用不同氨基酸残基替换以改变抗体或抗原结合片段的效应子功能来改变。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可用不同氨基酸残基替换，以使得抗体具有改变的对效应子配体的亲和力且保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力对其改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法进一步详细描述于美国专利号5,624,821和5,648,260中。
在另一实例中，选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸可用不同氨基酸残基替换，以使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。此方法进一步详细描述于美国专利号6,194,551中。
在另一实例中，氨基酸位置123和239内的一个或多个氨基酸残基被改变，由此改变抗体固定补体的能力。该方法进一步描述于PCT公开WO 94/29351中。
在再另一实例中，Fc区通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸而被修饰以降低本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式)介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或降低抗体或片段对Fcγ受体的亲和力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法进一步描述于PCT公开WO 00/42072中。而且，人IgG1上对FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已定位且已描述具有提高的结合的变体(参见Shields等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。
在本发明的一个实施方式中，Fc区进行修饰以通过修饰残基243和264而降低本发明的抗体(例如，抗体131A及其人源化形式)介导效应子功能的能力和/或提高抗炎性特性。在一个实施方式中，抗体或片段的Fc区通过将位置243和264的残基改变成丙氨酸进行修饰。在一个实施方式中，Fc区通过修饰残基243、264、267和328而进行修饰以降低抗体或片段介导效应子功能的能力和/或提高抗炎性特性。
改变的效应子功能
在一些实施方式中，抗-CD27抗体的Fc区被修饰以提高或降低抗体或抗原结合片段介导效应子功能的能力和/或增加/减少其与Fcγ受体(FcγR)的结合。
如本文所用，术语“效应子功能”意指以下的一种或多种：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性活性(CDC)介导的反应、Fc介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和经由FcRn受体的抗体再循环。
据信抗原结合蛋白的恒定区和各种Fc受体(FcR)(包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))之间的相互作用介导抗原结合蛋白的效应子功能，如ADCC和CDC。Fc受体对于抗体交联也是重要的，所述抗体交联对于抗肿瘤免疫性可以是重要的。
效应子功能可用许多方式测量，包括例如经由FcγRIII与天然杀伤细胞的结合或经由FcγRI与单核细胞/巨噬细胞的结合，以测量ADCC效应子功能。例如，可在天然杀伤细胞分析中评估本发明的抗原结合蛋白的ADCC效应子功能。此类分析的实例可见于Shields等，2001J.Biol.Chem.，第276卷，第6591-6604页；Chappel等,1993J.Biol.Chem.，第268卷，第25124-25131页；Lazar等,2006PNAS,103；4005-4010。
已显示在残基Asn297上含有特定突变或改变的糖基化的人IgG1恒定区减少与Fc受体的结合。在其它情况下，突变也已显示增强ADCC和CDC(Lazar等PNAS 2006,103；4005-4010；Shields等J Biol Chem 2001,276；6591-6604；Nechansky等Mol Immunol,2007,44；1815-1817)。
在本发明的一个实施方式中，此类突变在选自239、332和330(IgG1)的一个或多个位置中或其它IgG同种型中的同等位置中。合适突变的实例为S239D和I332E和A330L。在一个实施方式中，本文所述的本发明的抗原结合蛋白在位置239和332处突变，例如S239D和I332E，或在另外的实施方式中，在选自239和332和330的三个或更多个位置处突变(例如S239D和I332E和A330L)。(EU索引编号)。
在本发明的替代实施方式中，提供了包含具有改变的糖基化模式的重链恒定区，使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能的抗体。例如，其中抗体具有增强的ADCC或增强的CDC或者其中其具有增强的ADCC和CDC效应子功能两者。产生具有改变的糖基化模式的抗原结合蛋白的合适方法的实例描述于WO2003011878、WO2006014679和EP1229125中。
在进一步的方面，本发明提供“非岩藻糖基化”或“无岩藻糖基化”抗体。非岩藻糖基化抗体带有无岩藻糖残基的Fc的复合型N-聚糖的三甘露糖基核心结构。由于FcγRIIIa结合能力的增强，这些缺乏来自Fc N-聚糖的核心岩藻糖残基的糖工程化抗体可表现出比岩藻糖基化等同物更强的ADCC。
本发明还提供产生根据本发明的抗体的方法，其包括以下步骤：a)培养包含含有如本文所述的分离的核酸的表达载体的重组宿主细胞，其中重组宿主细胞不包含α-1,6-岩藻糖基转移酶；和b)回收抗原结合蛋白。重组宿主细胞通常可不含编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的基因(例如酵母宿主细胞，如毕赤酵母属)或可被遗传修饰以使α-1,6-岩藻糖基转移酶失活。经遗传修饰以使编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因失活的重组宿主细胞是可得的。参见例如可得自BioWa,Inc.(Princeton,N.J.)的POTELLIGENTTM技术系统，其中缺乏FUT8基因的功能拷贝的CHOK1SV细胞产生具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的单克隆抗体，所述ADCC活性相对于在具有功能性FUT8基因的细胞中产生的相同单克隆抗体增加。POTELLIGENTTM技术系统的方面描述于US7214775、US6946292、WO0061739和WO0231240中。本领域技术人员也认识到其它适宜的系统。
本领域技术人员将清楚，此类修饰不仅可单独使用，而且也可彼此组合使用，以进一步增强或降低效应子功能。
具有修饰的糖基化的抗体的产生
在再另一个实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)包含特定糖基化模式。例如，可制备无岩藻糖基化或无糖基化抗体或片段(即抗体分别缺乏岩藻糖或糖基化)。抗体或片段的糖基化模式可被改变以例如提高抗体或片段对CD27抗原的亲和力或亲合力。此类修饰可通过例如改变抗体或片段序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可进行一个或多个氨基酸置换，其导致去除一个或多个可变区框架糖基化位点，由此消除该位点处的糖基化。此类无糖基化可增加抗体或片段对抗原的亲和力或亲合力。参见例如美国专利号5,714,350和6,350,861。
本文公开的抗体和抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可进一步包括在低等真核生物宿主细胞中产生的那些，特别地真菌宿主细胞如酵母和丝状真菌已被遗传工程化以产生具有哺乳动物或人样糖基化模式的糖蛋白(参见例如Choi等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100:5022-5027；Hamilton等，(2003)Science 301:1244-1246；Hamilton等，(2006)Science 313:1441-1443；Nett等，Yeast 28(3):237-52(2011)；Hamilton等，Curr Opin Biotechnol.Oct；18(5):387-92(2007))。这些遗传修饰的宿主细胞相对于当前使用的哺乳动物细胞系的特定优势是能够控制在细胞中产生的糖蛋白的糖基化模式，使得可产生其中特定N-聚糖结构占优势的糖蛋白的组合物(参见例如美国专利号7,029,872和美国专利号7,449,308)。这些遗传修饰的宿主细胞已用于产生主要具有特定N-聚糖结构的抗体(参见例如Li等(2006)Nat.Biotechnol.24:210-215)。
在具体实施方式中，本文公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)进一步包括在低等真核宿主细胞中产生的那些且其包含岩藻糖基化和非岩藻糖基化的杂合和复合N-聚糖，包括二等分和多天线种类，包括，但不限于，N-聚糖，如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。
在具体实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可以包含具有至少一个选自以下的杂合N-聚糖的抗体和片段：GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2和NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。在具体的方面，杂合N-聚糖是组合物中的主要N-聚糖种类。
在具体实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)包含具有至少一个选自以下的复合N-聚糖的抗体和片段：GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在具体的方面，复合N-聚糖组合物中的主要N-聚糖种类。在进一步的方面，复合N-聚糖是占组合物中的约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的复合N-聚糖的特定N-聚糖。在一个实施方式中，本文提供的抗体及其抗原结合片段包含复合N-聚糖，其中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的复合N-聚糖包含结构NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，其中此类结构是无岩藻糖基化的。此类结构可例如在工程化巴斯德毕赤酵母宿主细胞中产生。
在具体实施方式中，N-聚糖是岩藻糖基化的。一般地，岩藻糖处于与N-聚糖的还原末端的GlcNAc的α1,3-连接中、与N-聚糖的还原末端的GlcNAc的α1,6-连接中、与N-聚糖的非还原末端的Gal的α1,2-连接中、与N-聚糖的非还原末端的GlcNac的α1,3-连接中或与N-聚糖的非还原末端的GlcNAc的α1,4-连接中。
因此，在以上糖蛋白组合物的具体方面，糖型为α1,3-连接或α1,6-连接岩藻糖以产生选自以下的糖型：Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；为α1,3-连接或α1,4-连接岩藻糖以产生选自以下的糖型：GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或为α1,2-连接岩藻糖以产生选自以下的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在进一步的方面，抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段包含高甘露糖N-聚糖，包括但不限于Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2或由Man3GlcNAc2 N-聚糖结构组成的N-聚糖。
在以上进一步的方面，复合N-聚合还包括岩藻糖基化和非岩藻糖基化的二等分和多天线种类。
如本文所用，术语“N-聚糖”和“糖型”可互换使用且是指N-连接的寡糖，例如通过天冬酰胺-N-乙酰基葡糖胺键附接至多肽的天冬酰胺残基的N-连接的寡糖。N-连接的糖蛋白含有连接至蛋白质中天冬酰胺残基的酰胺氮的N-乙酰基葡糖胺残基。在糖蛋白上发现的主要糖为葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰基-神经氨酸(NANA))。对于N-连接的糖蛋白，糖基团的加工在ER的内腔中与翻译同时发生，并在翻译后在高尔基体中继续。
N-聚糖具有Man3GlcNAc2的共同五糖核心(“Man”是指甘露糖；“Glc”是指葡萄糖；且“NAc”是指N-乙酰基；GlcNAc是指N-乙酰基葡糖胺)。通常，N-聚糖结构以非还原末端在左侧且以还原末端在右侧出现。N-聚糖的还原末端为包含蛋白质上的糖基化位点的附接至Asn残基的末端。N-聚糖在包含添加至Man3GlcNAc2("Man3")核心结构(其也称为“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“寡甘露糖”核心)的周围糖(例如GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分枝(天线)数目方面不同。N-聚糖根据其分枝组分(例如高甘露糖、复合或杂合)分类。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型N-聚糖通常具有至少一个附接至“三甘露糖”核心的1,3甘露糖臂的GlcNAc和至少一个附接至“三甘露糖”核心的1,6甘露糖臂的GlcNAc。复合N-聚糖也可具有任选地用唾液酸或衍生物(例如“NANA”或“NeuAc”，其中“Neu”是指神经氨酸且“Ac”是指乙酰基)修饰的半乳糖(“Gal”)或N-乙酰基半乳糖胺(“GalNAc”)残基。复合N-聚糖也可具有包含“二等分”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)的链内取代。复合N-聚糖也可在“三甘露糖核心”上具有多个天线，经常被称为“多天线聚糖”。“杂合”N-聚糖在三甘露糖核心的1,3甘露糖臂的末端上具有至少一个GlcNAc且在三甘露糖核心的1,6甘露糖臂上具有零或多个甘露糖。各种N-聚糖也称为“糖型”。
关于复合N-聚糖，术语"G-2"、"G-1"、"G0"、"G1"、"G2"、"A1"和"A2"意思如下。"G-2"是指可以表征为Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语"G-1"是指可以表征为GlcNAcMan3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语"G0"是指可以表征为GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语"G1"是指可以表征为GalGlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语"G2"是指可以表征为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；术语"A1"是指可以表征为NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构；和术语"A2"是指可以表征为NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的N-聚糖结构。除非另外指明，术语"G-2"、"G-1"、"G0"、"G1"、"G2"、"A1"和"A2"是指缺乏连接到N-聚糖的还原末端的GlcNAc的岩藻糖的N-聚糖种类。当术语包括"F"时，"F"指示N-聚糖种类包含N-聚糖的还原末端的GlcNAc残基上的岩藻糖残基。例如，G0F、G1F、G2F、A1F和A2F都表明N-聚糖还包括连接到N-聚糖的还原末端的GlcNAc残基的岩藻糖残基。低等真核生物如酵母和丝状真菌通常不产生生成岩藻糖的N-聚糖。
关于多天线N-聚糖，术语“多天线N-聚糖”是指在甘露糖残基上进一步包含GlcNAc残基(其包含N-聚糖的1,6-臂或1,3-臂的非还原末端)或者每个甘露糖残基上的GlcNAc残基(其包含N-聚糖的1,6臂和1,3臂的非还原末端)的N-聚糖。因此，多天线N-聚糖可以通过下式表征：GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2。术语“1-4”是指1、2、3或4个残基。
关于二等分N-聚糖，术语“二等分N-聚糖”是指其中GlcNAc残基与N-聚糖的还原末端处的甘露糖残基连接的N-聚糖。二等分的N-聚糖可以通过式GlcNAc3Man3GlcNAc2表征，其中每个甘露糖残基在其非还原末端与GlcNAc残基连接。相反，当多天线N-聚糖被表征为GlcNAc3Man3GlcNAc2时，该式表明两个GlcNAc残基与N-聚糖的两个臂之一的非还原末端处的甘露糖残基连接，并且一个GlcNAc残基连接至N-聚糖的另一臂的非还原末端处的甘露糖残基。
抗体物理特性
本文公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可在轻链或重链免疫球蛋白可变区中进一步含有一个或多个糖基化位点。此类糖基化位点可导致抗体或片段的增加的免疫原性，或由于改变的抗原结合而导致的改变的抗体pK(Marshall等(1972)Annu Rev Biochem 41:673-702；Gala和Morrison(2004)J Immunol172:5489-94；Wallick等(1988)J Exp Med 168:1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12:43R-56R；Parekh等(1985)Nature 316:452-7；Mimura等(2000)Mol Immunol 37:697-706)。已知糖基化在含N-X-S/T序列的基序处发生。
各抗体或抗原结合片段(例如，131A或其人源化形式)具有独特的等电点(pI)，其通常落在在6和9.5之间的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，且IgG4抗体的pI通常落在6-8的pH范围内。
各抗体或抗原结合片段(例如，131A或其人源化形式)具有特征性熔融温度，其中较高熔融温度指示较高的体内总体稳定性(Krishnamurthy R和Manning MC(2002)CurrPharm Biotechnol3:361-71)。通常，TM1(初始解折叠温度)可高于60℃、高于65℃或高于70℃。抗体或片段的熔点可使用差示扫描量热法(Chen等(2003)Pharm Res 20:1952-60；Ghirlando等(1999)Immunol Lett 68:47-52)或圆二色性(Murray等(2002)J.ChromatogrSci 40:343-9)测量。
在进一步的实施方式中，选择不迅速降解的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)。可使用毛细管电泳(CE)和MALDI-MS测量抗体或片段的降解(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem 67:3626-32)。
在进一步的实施方式中，选择具有最小聚集效应的抗体(例如，抗体131A及其人源化形式)及其抗原结合片段，所述聚集效应可导致不希望的免疫反应的触发和/或改变的或不利的药代动力学特性。通常，聚集度为25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少或者5％或更少的抗体和片段是可接受的。聚集可通过几种技术测量，包括尺寸排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)和光散射。
抗体缀合物
本文公开的抗-CD27抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)也可与化学部分缀合。化学部分可尤其为聚合物、放射性核素或细胞毒性因子。在具体实施方式中，化学部分是增加抗体或片段在受试者体内的半衰期的聚合物。合适的聚合物包括，但不限于亲水性聚合物，其包括但不限于聚乙二醇(PEG)(例如分子量为2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa的PEG)、葡聚糖和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等(1999)(Bioconj.Chem.10:973-981)公开了PEG缀合的单链抗体。Wen等(2001)(Bioconj.Chem.12:545-553)公开了用连接至放射金属螯合剂(二亚乙基三胺五乙酸(DTPA))的PEG缀合抗体。
本文公开的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)也可用如以下的标记缀合：99Tc、90Y、111In、32P、14C、125I、3H、131I、11C、15O、13N、18F、35S、51Cr、57To、226Ra、60Co、59Fe、57Se、152Eu、67CU、217Ci、211At、212Pb、47Sc、109Pd、234Th和40K、157Gd、55Mn、52Tr和56Fe。
本文公开的抗体和抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)也可聚乙二醇化，例如以增加其生物(例如血清)半衰期。为了将抗体或片段聚乙二醇化，通常使抗体或片段与聚乙二醇(PEG)的反应性形式，如PEG的反应性酯或醛衍生物，在其中一个或多个PEG基团变成附接于抗体或抗体片段的条件下反应。在具体实施方式中，聚乙二醇化经由与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”意欲涵盖已用于衍生化其它蛋白质的任何PEG形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或者聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方式中，待聚乙二醇化的抗体或片段是无糖基化的抗体或片段。用于聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域中已知的，且可应用于本发明的抗体。参见例如EP 0154316和EP 0401384。
本文公开的抗体和抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)也可与荧光或化学发光标记缀合，包括荧光团如稀土螯合物、荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛、荧光胺、152Eu、丹磺酰基、伞形酮、荧光素、鲁米那标记、异鲁米那标记、芳族吖啶酯标记、咪唑标记、吖啶盐标记、草酸酯标记、水母素标记、2,3-二氢酞嗪二酮、生物素/抗生素蛋白、自旋标记和稳定自由基。
本发明的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)也可与细胞毒性因子缀合，如白喉毒素、绿脓假单胞菌外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲素A链、α-八叠球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白和化合物(例如脂肪酸)、香石竹毒蛋白、美洲商陆(Phytoiacca americana)蛋白PAPI、PAPII和PAP-S、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(Saponaria officinalis)抑制剂、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素和伊诺霉素(enomycin)。
可采用本领域中已知用于将本发明的抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与各种部分缀合的任何方法，包括由Hunter等(1962)Nature 144:945；David等(1974)Biochemistry 13:1014；Pain等(1981)J.Immunol.Meth.40:219；和Nygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30:407描述的那些方法。用于缀合抗体和片段的方法是本领域中常规和非常众所周知的。
抗-CD27抗体的治疗用途
进一步提供用于治疗需要用本文公开的分离的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)治疗的受试者(包括人受试者)的方法。在本发明的一个实施方式中，此类受试者患有感染或传染病。本发明还提供用于治疗癌症或治疗感染或传染病的本发明的抗体或抗原结合片段。本发明还提供本发明的抗体或抗原结合片段用于制造增加免疫细胞激活、治疗癌症或治疗感染或传染病的药物的用途。
在本发明的另一实施方式中，此类受试者患有癌症。在一个实施方式中，癌症是例如骨肉瘤、横纹肌肉瘤、神经母细胞瘤、肾癌、白血病、肾移行细胞癌、膀胱癌、维尔姆氏癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、胃癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、滑膜肉瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑色素瘤、肾横纹肌样瘤、尤因氏肉瘤、软骨肉瘤、脑癌、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、特发性骨髓纤维化、软组织肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、类癌瘤癌或肝癌、乳腺癌或胃癌。在本发明的实施方式中，癌症是转移性癌，例如上述种类的转移性癌。
可以通过本发明的抗体或抗原结合片段、组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：心脏癌症：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺癌症：支气管原癌(鳞状细胞癌、未分化的小细胞癌、未分化的大细胞癌、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤；胃肠道癌症：食道癌(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃癌症(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺癌症(导管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、舒血管肠肽瘤)、小肠癌症(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠癌症(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)；结肠直肠癌症；泌尿生殖道癌症：肾癌(腺癌、维尔姆斯瘤(肾胚细胞瘤)、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道癌症(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺癌症(腺癌、肉瘤)、睾丸癌症(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝脏癌症：肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞性腺瘤、血管瘤；骨骼癌症：成骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨疣)、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统癌症：颅骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤、畸形性骨炎)、脑脊膜癌症(脑脊膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤)、脑癌症(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑脊膜瘤、胶质瘤、肉瘤)；妇科癌症：子宫癌症(子宫内膜癌)、子宫颈癌症(宫颈癌、瘤前宫颈发育不良)、卵巢癌症(卵巢癌(浆液囊腺癌、粘液囊腺癌、未分类癌)、粒层-卵泡膜细胞瘤、塞-莱细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴癌症(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道癌症(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎横纹肌肉瘤)、输卵管癌症(癌)，乳腺癌症；血液系统癌症：血液癌症(髓性白血病(急性和慢性)、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(恶性淋巴瘤)；皮肤癌症：恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、牛皮癣；以及肾上腺癌症：成神经细胞瘤。因此，本文提供的术语“癌性细胞”包括遭受上述病症任一种的细胞。
在一个实施方式中，可以通过本文公开的抗体或抗原结合片段、组合物和方法治疗的癌症包括但不限于：肺癌、胰腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、髓性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性髓单核细胞性白血病、甲状腺癌、骨髓增生异常综合征、膀胱癌、表皮癌、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、头颈癌、卵巢癌、脑癌、间质源的癌症、肉瘤、畸胎瘤(tetracarcinomas)、神经母细胞瘤、肾癌、肝癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和间变性甲状腺癌。
在一个实施方式中，本发明提供了使用本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)治疗受试者的方法，其中受试者患有病毒感染。在一个实施方式中，病毒感染是选自人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、EB病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒，HTLV病毒、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒或虫媒病毒性脑炎病毒的病毒感染。
在一个实施方式中，本发明提供使用本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中受试者患有细菌感染。在一个实施方式中，细菌感染是选自以下的细菌的感染：衣原体(Chlamydia)、立克次体细菌(rickettsial bacteria)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、脑膜炎球菌(meningococci)和淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团杆菌(Legionella)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙门氏菌(Salmonella)、芽孢杆菌(bacilli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、破伤风梭菌(Clostridium tetan)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthricis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、弥漫型麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepromatosis)和包柔氏螺旋体(Borriella)。
在一个实施方式中，本发明提供使用本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中受试者患有真菌感染。在一个实施方式中，真菌感染是选自以下的真菌的感染：念珠菌(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克鲁斯念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、热带念珠菌(tropicalis)等)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、曲霉菌(Aspergillus)(烟曲霉(fumigatus)、黑曲霉(niger)等)、毛霉菌属(Mucorales)(毛霉菌(mucor)、absidia、根霉菌(rhizopus))、申克氏胞丝菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)和荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)。
在一个实施方式中，本发明提供使用本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段治疗受试者的方法，其中受试者患有寄生虫感染。在一个实施方式中，寄生虫感染是选自以下的寄生虫的感染：溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、福氏纳格里阿米巴原虫(Naegleria fowleri)、棘阿米巴虫属(Acanthamoeba)、篮氏贾第虫(Giardia lambia)、隐胞子虫属(Cryptosporidium)、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、微小巴贝虫(Babesiamicroti)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)和巴西日圆线虫(Nippostrongylus brasiliensis)。
“受试者”可以是哺乳动物，如人、犬、猫、马、奶牛、小鼠、大鼠、猴(例如猕猴，例如食蟹猴)或兔。在本发明的优选实施方式中，受试者为人受试者。
术语“与...相结合”表示在本发明的方法中施用的组分(例如，抗-CD27抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式))以及抗癌剂可以配制成单一组合物用于同时递送或单独配制成两种或更多种组合物(例如，试剂盒)。每种组分可以在与另一种组分施用不同的时间施用于受试者。例如，每次施用可以在给定的一段时间内以几个间隔非同时给予(例如，单独地或顺序地)。此外，可以通过相同或不同的途径将单独的组分施用于受试者。
在具体实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可单独或与其它另外的治疗剂和/或治疗过程相结合使用，用于在需要此类治疗或预防的受试者中治疗或预防任何疾病如癌症，例如如本文中所讨论的。包含与另外的治疗剂相结合的此类抗体和片段的组合物，例如包含药学上可接受的载体的药物组合物，也是本发明的部分。
因此，本发明提供了治疗人受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段，任选地与另外的治疗剂或治疗过程相结合。本发明还提供了治疗人受试者的感染或传染病的方法，包括向受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段，任选地与另外的治疗剂或治疗过程相结合。本发明还提供了提高免疫细胞的活性的方法，包括向需要的受试者施用有效量的本文公开的抗体或抗原结合片段。在一个实施方式中，该方法用于：治疗癌症；治疗感染或传染病；或作为疫苗佐剂。在另一实施方式中，本发明提供了本发明的抗体或抗原结合片段，其与另外的治疗剂组合用于：治疗癌症；提高免疫细胞的活性；或治疗感染或传染病；或作为疫苗佐剂。在进一步的实施方式中，本发明提供了本发明的抗体或抗原结合片段用于制备与另外的治疗剂组合增加免疫细胞激活；治疗癌症；或治疗感染或传染病的药物的用途。在另一实施方式中，本发明提供了用于治疗癌症；提高免疫细胞的活性；或治疗感染或传染病的本发明的抗体或抗原结合片段和另外的治疗剂的组合。
在其它实施方式中，本发明提供治疗人受试者的癌症或治疗感染或传染病的方法，包括向受试者施用有效量的本发明的抗体或抗原结合片段，或者根据本发明的表达载体或宿主细胞，任选地与另外的治疗剂或治疗过程相结合。
在具体实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可单独或与肿瘤疫苗相结合使用。肿瘤疫苗的实例包括但不限于用于人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的癌症的疫苗，如和/>预防乙型肝炎病毒引起的肝癌的疫苗，如Engerix-/>和/>引发免疫反应的溶瘤病毒疗法，如/>DNA疫苗如Synchotrope MA2M质粒DNA疫苗和ZYC101；乳腺珠蛋白-DNA疫苗(参见Clinical Cancer Res.2014 20(23):5964-75)；基于载体的疫苗，如PSA-TRICOM(prostvac)、PANVAC-VF、基于单核细胞增生李斯特氏菌的PSA疫苗(参见Therapeutic Advances in Vaccines,2014,2(5)137-148)、李斯特菌-间皮素Adeno-CEA；同种异体疫苗如GVAX、BLP-25(抗-Ankara-粘蛋白1)、Belagenpumatucel-L、TG4010、CIMAvax表皮生长因子疫苗、NY-ESO、GM.CD40L-CCL21；自体疫苗，如：Adeno-CD40L、BCG、INGN-225、树突细胞疫苗如/>(Sipuleucel-T)、rF-CEA-MUC1-TRICOM(panvac-DC)；抗原疫苗如MUC-1(stimuvax)、NY-ESO-1、GP-100、MAGE-A3(黑素瘤抗原编码基因A3)、INGN-225(参见Pharmacology&Therapeutics 153(2015)1-9)。
在具体实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可单独或与化疗剂相结合使用。
在具体实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可单独或与放射疗法相结合使用。
在具体实施方式中，本文公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可单独或与靶向疗法相结合使用。靶向疗法的实例包括：激素疗法、信号转导抑制剂(例如，EGFR抑制剂，如西妥昔单抗(Erbitux)和埃罗替尼(Tarceva))；HER2抑制剂(例如，曲妥珠单抗(Herceptin)和帕妥珠单抗(Perjeta))；BCR-ABL抑制剂(如伊马替尼(Gleevec)和达沙替尼(Sprycel))；ALK抑制剂(如克里唑替尼(Xalkori)和色瑞替尼(Zykadia))；BRAF抑制剂(如维罗非尼(Zelboraf)和达拉菲尼(Tafinlar))、基因表达调节剂、细胞凋亡诱导剂(例如，硼替佐米(Velcade)和卡非佐米(Kyprolis))、血管生成抑制剂(例如贝伐单抗(Avastin)和雷莫芦单抗(Cyramza))、与毒素连接的单克隆抗体(例如，本妥昔单抗(Adcetris)和阿多曲妥珠单抗恩他新(ado-trastuzumab emtansine)(Kadcyla))。
在具体实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可与抗癌治疗剂或免疫调节药物如免疫调节受体抑制剂，例如特异性结合受体的抗体或其抗原结合片段，组合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与以下一种或多种相结合使用：抗-PD1抗体、抗-PDL1抗体、抗-TIGIT抗体、抗-CTLA4抗体、抗-CS1抗体(例如，埃罗珠单抗)、抗-KIR2DL1/2/3抗体(例如，利瑞鲁单抗(lirilumab))、抗-CD137抗体(例如，乌鲁单抗(urelumab))、抗-GITR抗体(例如，TRX518)、抗-PD1抗体(例如，派姆单抗、纳武单抗、帕立珠单抗(CT-011))、抗-PD-L1抗体(例如，BMS-936559、度伐单抗、MSB0010718C或MPDL3280A)、抗-PD-L2抗体、抗-ILT1抗体、抗-ILT2抗体、抗-ILT3抗体、抗-ILT4抗体、抗-ILT5抗体、抗-ILT6抗体、抗-ILT7抗体、抗-ILT8抗体、抗-CD40抗体、抗-OX40抗体、抗-ICOS、抗-SIRPα、抗-KIR2DL1抗体、抗-KIR2DL2/3抗体、抗-KIR2DL4抗体、抗-KIR2DL5A抗体、抗-KIR2DL5B抗体、抗-KIR3DL1抗体、抗-KIR3DL2抗体、抗-KIR3DL3抗体、抗-NKG2A抗体、抗-NKG2C抗体、抗-NKG2E抗体、抗-4-1BB抗体(例如PF-05082566)、抗-TSLP抗体、抗-IL-10抗体、IL-10或聚乙二醇化的IL-10或此类靶标的任何有机小分子抑制剂。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-PD1抗体(例如，派姆单抗、纳武单抗、帕立珠单抗(CT-011))相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-PDL1抗体(例如，BMS-936559、度伐单抗、MSB0010718C或MPDL3280A)相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-CTLA4抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-CS1抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-KIR2DL1/2/3抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-CD137(例如，乌鲁单抗)抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-GITR(例如，TRX518)抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-PD-L2抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-ITL1抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-ITL2抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-ITL3抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-ITL4抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-ITL5抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-ITL6抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-ITL7抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-ITL8抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-CD40抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-OX40抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-KIR2DL1抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-KIR2DL2/3抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-KIR2DL4抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-KIR2DL5A抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-KIR2DL5B抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-KIR3DL1抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-KIR3DL2抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-KIR3DL3抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-NKG2A抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-NKG2C抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-ICOS抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-SIRPα抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-4-1BB抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-IL-10抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗-TSLP抗体相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与IL-10或PEG化IL-10相结合使用。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与一种或多种抑制剂(例如，有机小分子或者抗体或其抗原结合片段)相结合使用，如：MTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标)抑制剂、细胞毒性剂、铂试剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、微管稳定剂、紫杉烷、CD20抑制剂、CD52抑制剂、CD30抑制剂、RANK(核因子κ-B的受体激活物)抑制剂、STING激动剂、CXCR2拮抗剂、RANKL(核因子κ-B配体的受体激活物)抑制剂、ERK抑制剂、MAP激酶抑制剂、AKT抑制剂、MEK抑制剂、PARP抑制剂、PI3K抑制剂、HER1抑制剂、HER2抑制剂、HER3抑制剂、HER4抑制剂、Bcl2抑制剂、CD22抑制剂、CD79b抑制剂、ErbB2抑制剂或法呢基蛋白转移酶抑制剂。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与以下的任何一种或多种相结合使用：13-顺式-视黄酸、(3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基]-喹诺酮)、4-羟基他莫昔芬、5-脱氧尿苷、5'-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、7-羟基星孢菌素、A-443654、醋酸阿比特龙、白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、ABT-578、阿考比芬、ADS-100380、ALT-110、六甲蜜胺、阿米福汀、氨鲁米特、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、血管抑素、AP-23573、ARQ-197、阿佐昔芬、AS-252424、AS-605240、天冬酰胺酶、AT-9263、阿曲生坦、阿西替尼、AZD1152、卡介苗(BCG)疫苗、batabulin、BC-210、besodutox、贝伐单抗、比卡鲁胺、Bio111、BIO140、博莱霉素、BMS-214662、BMS-247550、BMS-275291、BMS-310705、硼替佐米、布舍瑞林、白消安、骨化三醇、喜树碱、卡奈替尼、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、CC8490、西地尼布、CG-1521、CG-781、查米多星(chlamydocin)、苯丁酸氮芥、氯毒素、西仑吉肽、西米替丁、顺铂、克拉屈滨、氯屈膦酸盐、COL-3、CP-724714、环磷酰胺、环丙孕酮、醋酸环丙孕酮、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、达卡巴嗪、达西司特、放线菌素D、dalotuzumab、达鲁舍替、达沙替尼(dasatanib)、道诺霉素、地卡塔尼(decatanib)、鱼藤素、地尼白介素、脱氧柯福霉素、缩酚肽、二芳基丙腈、二乙基己烯雌酚、diftitox、多西他赛、多韦替尼、阿霉素、屈洛昔芬、艾特咔林(edotecarin)、钇-90标记的艾多替德(yttrium-90labeled-edotreotide)、艾多替德(edotreotide)、EKB-569、EMD121974、内皮抑素、恩杂鲁胺、enzastaurin、表柔比星、埃博霉素B、ERA-923、爱必妥、埃罗替尼、雌二醇、雌氮芥、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、ficlatuzumab、非那雄胺、夫拉平度(flavopiridol)、氟尿苷、氟达拉宾、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、FOLFOX方案、氟维司群、galeterone、吉非替尼、吉西他滨、吉马替康、戈舍瑞林、乙酸戈舍瑞林、棉酚、GSK461364、GSK690693、HMR-3339、己酸羟孕酮、羟基脲、IC87114、伊达比星、idoxyfene、异环磷酰胺、IM862、伊马替尼、IMC-1C11、INCB24360、INO1001、干扰素、白介素-12、伊匹单抗、伊立替康、JNJ-16241199、酮康唑、KRX-0402、拉帕替尼、拉索昔芬、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林、乙酸亮丙瑞林、左旋咪唑、脂质体包覆的紫杉醇、洛莫司汀、洛那法尼(lonafarnib)、硫蒽酮、LY292223、LY292696、LY293646、LY293684、LY294002、LY317615、马立马司他、氮芥(mechlorethamine)、甲羟孕酮乙酸酯、甲地孕酮乙酸酯、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、陶扎色替、MLN8054、癌立消、来那替尼、neuradiab、尼罗替尼、nilutimide、诺拉曲特、NVP-BEZ235、oblimersen、奥曲肽、奥法木单抗、奥拉帕尼、奥戈伏单抗、orteronel、奥沙利铂、紫杉醇、帕博西尼、帕米膦酸、帕尼单抗、帕唑帕尼、PD0325901、PD184352、PEG-干扰素、培美曲塞、喷司他丁、哌立福新、苯丙氨酸氮芥、PI-103、pictilisib、PIK-75、哌喷昔芬、PKI-166、普卡霉素、卟吩姆(porfimer)、泼尼松、丙卡巴肼、孕酮、PX-866、R-763、雷洛昔芬、雷替曲塞、razoxin、地磷莫司、利妥昔单抗、罗米地辛、RTA744、鲁比替康、scriptaid、Sdx102、seliciclib、司美替尼、司马沙尼(semaxanib)、SF1126、西罗莫司、SN36093、索拉非尼、螺内酯、角鲨胺、SR13668、链脲菌素、SU6668、辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanalide hydroxamic acid)、舒尼替尼、合成雌激素、他仑帕奈、塔利拉维(talimogene laherparepvec)、他莫昔芬、替莫唑胺、坦罗莫司、替尼泊苷、替米利芬、睾酮(testosterone)、粉防己碱(tetrandrine)、TGX-221、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、替西单抗(ticilimumab)、替匹法尼、替沃扎尼(tivozanib)、TKI-258、TLK286、拓扑替康、柠檬酸托瑞米芬、曲贝替定(trabectedin)、曲妥珠单抗、维甲酸、曲古抑菌素A、磷酸曲西立滨单水合物、双羟萘酸曲普瑞林、TSE-424、尿嘧啶氮芥、丙戊酸、戊柔比星、凡德他尼、瓦他拉尼(vatalanib)、VEGF trap、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、vitaxin、vitespan、伏立诺他、VX-745、渥曼青霉素、Xr311、zanolimumab、ZK186619、ZK-304709、ZM336372、ZSTK474。
与本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段组合使用的合适抗癌剂的非限制性实例包括细胞生长抑制剂、细胞毒性剂、对抗癌症和肿瘤疾病的靶向治疗剂(小分子、生物制剂、siRNA和微RNA):
1)抗代谢物(如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、氟达拉滨、卡培他滨)；
2)烷化剂，如替莫唑胺、环磷酰胺；
3)DNA相互作用和DNA损伤剂，如顺铂、奥沙利铂、阿霉素；
4)电离辐射，如放射治疗；
5)拓扑异构酶II抑制剂，如依托泊苷、多柔比星；
6)拓扑异构酶I抑制剂，如伊立替康、托泊替康；
7)微管蛋白相互作用剂，如紫杉醇、多西他赛、Abraxane、埃博霉素；
8)驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂；
9)纺锤检查点抑制剂；
10)聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂，如奥拉帕尼、niraparib和维利帕尼；
11)基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂；
12)蛋白酶抑制剂，如组织蛋白酶D和组织蛋白酶K抑制剂；
13)蛋白酶体或泛素化抑制剂，如硼替佐米；
14)突变体p53恢复其野生型p53活性的激活剂；
15)腺病毒-p53；
16)Bcl-2抑制剂，如ABT-263；
17)热休克蛋白(HSP)调节剂，如格尔德霉素和17-AAG；
18)组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，如伏立诺他(SAHA)；
19)性激素调节剂，
a.抗雌激素，如他莫昔芬，氟维司群，
b.选择性雌激素受体调节剂(SERM)，如雷洛昔芬，
c.抗雄激素，如比卡鲁胺、氟他胺，
d.LHRH激动剂，如亮丙瑞林，
e.5α-还原酶抑制剂，如非那雄胺，
f.细胞色素P450 C17裂解酶(CYP450c17，也称为17αC)，
g.芳香酶抑制剂，如来曲唑、阿那曲唑、依西美坦，
20)EGFR激酶抑制剂，如吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼(laptinib)；
21)双重erbB1和erbB2抑制剂，如拉帕替尼；
22)多靶点激酶(丝氨酸/苏氨酸和/或酪氨酸激酶)抑制剂，
a.ABL激酶抑制剂，伊马替尼和尼罗替尼、达沙替尼，
b.VEGFR-1、VEGFR-2、PDGFR、KDR、FLT、c-Kit、Tie2、Raf、MEK和ERK抑制剂，如舒尼替尼、索拉非尼、凡德他尼、帕唑帕尼、PLX-4032、阿西替尼、PTK787、GSK-1120212，
c.Polo-样激酶抑制剂，
d.极光激酶抑制剂，
e.JAK抑制剂，
f.c-MET激酶抑制剂，
g.PI3K和mTOR抑制剂，如GDC-0941、BEZ-235、BKM-120和AZD-8055，
h.雷帕霉素及其类似物，例如替西罗莫司、依维莫司和42-(二甲基亚膦酰)雷帕霉素(deforolimus)，
i.STING(干扰素基因的刺激物)激动剂，
j.CXCR(CXC趋化因子受体)抑制剂，CXCR2拮抗剂
23)和其他抗癌(也称为抗肿瘤)药物，包括但不限于ara-C、亚德里亚霉素、癌得星、卡铂、尿嘧啶芥末、氮芥(Clormethine)、异环磷酰胺(Ifosfsmide)、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、达卡巴嗪、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巯嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、喷司他丁、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、替尼泊苷、阿糖胞苷、培美曲塞、伊达比星、光神霉素、脱氧同型霉素、丝裂霉素C、L-天冬酰胺酶、替尼泊苷、乙炔雌二醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、丙酸屈他雄酮、睾酮、醋酸甲地孕酮、甲基强的松龙、甲基睾酮、泼尼松龙、去炎松、氯烯雌醚(Chlorotrianisene)、羟基孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、氟他胺醋酸甲羟孕酮、托瑞米芬、戈舍瑞林、卡铂、羟基脲、安吖啶、丙卡巴肼、米托坦、米托蒽醌、左旋咪唑、屈洛昔芬(Drolloxafine)、六甲嘧胺、百克沙、泽瓦林(Zevalin)、三氧二砷(Trisenox)、卟菲尔钠(Porfimer)、噻替派、六甲蜜胺、Doxil、Ontak、Depocyt、Aranesp、Neupogen、Neulasta、Kepivance；
24)法呢基蛋白转移酶抑制剂，如SARASARTM(4-[2-[4-[(11R)-3,10-二溴-8-氯-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]]环庚并[1,2-b]吡啶-11-基-]-1-哌啶基]-2-氧代乙基]-哌啶甲酰胺，替匹法尼；
25)干扰素，如Intron A、Peg-Intron；
26)抗-erbB1抗体，如西妥昔单抗、帕尼单抗；
27)抗-erbB2抗体，如曲妥珠单抗；
28)抗-CD52抗体，如阿仑单抗；
29)抗-CD20抗体，如利妥昔单抗；
30)抗-CD33抗体，如吉妥珠单抗奥唑米；
31)抗-VEGF抗体，如阿瓦斯丁；
32)TRIAL配体，如来沙木单抗、mapatumumab和AMG-655；
33)抗-CTLA-4抗体，如伊匹单抗；
34)抗CTA1、CEA、CD5、CD19、CD22、CD30、CD44、CD44V6、CD55、CD56、EpCAM、FAP、MHCII、HGF、IL-6、MUC1、PSMA、TAL6、TAG-72、TRAILR、VEGFR、IGF-2、FGF的抗体；
35)抗-IGF-1R抗体，如dalotuzumab(MK-0646)和robatumumab(SCH 717454)。
“雌激素受体调节剂”是指干扰或抑制雌激素与受体结合的化合物，无论其机理如何。雌激素受体调节剂的实例包括但不限于他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟维司群、4-[7-(2,2-二甲基-1-氧代丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基丙酸酯、4,4'-二羟基二苯甲酮-2,4-二硝基苯基-腙和SH646。
“雄激素受体调节剂”是指干扰或抑制雄激素与受体结合的化合物，无论其机理如何。雄激素受体调节剂的实例包括非那雄胺和其他5α-还原酶抑制剂、尼鲁米特、氟他胺、比卡鲁胺、利阿唑和醋酸阿比特龙。
“类视黄醇受体调节剂”是指干扰或抑制类视黄醇与受体结合的化合物，无论其机理如何。这些类视黄醇受体调节剂的实例包括蓓萨罗丁、维甲酸、13-顺式-视黄酸、9-顺式-视黄酸、α-二氟甲基鸟氨酸、ILX23-7553、反式-N-(4'-羟基苯基)视黄酰胺和N-4-羧基苯基视黄酰胺。
“细胞毒性/细胞生长抑制剂”是指主要通过直接干扰细胞功能化性或者抑制或干扰细胞有丝分裂(cell myosis)而引起细胞死亡或抑制细胞增殖的化合物，包括烷化剂、肿瘤坏死因子、嵌入剂、缺氧可激活化合物、微管抑制剂/微管稳定剂、有丝分裂驱动蛋白抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、参与有丝分裂进程的激酶的抑制剂、参与生长因子和细胞因子信号转导途径的激酶的抑制剂、抗代谢物、生物反应调节剂、激素/抗激素治疗剂、造血生长因子、单克隆抗体靶向治疗剂、拓扑异构酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂、泛素连接酶抑制剂和极光激酶抑制剂。
细胞毒性/细胞生长抑制剂的实例包括但不限于铂配位化合物、sertenef、恶病质素、异环磷酰胺、他索纳明、氯尼达明、卡铂、六甲蜜胺、泼尼莫司汀、dibromodulitol、雷诺氮芥、福莫司汀、奈达铂、奥沙利铂、替莫唑胺、舒铂、estamustine、甲苯磺酸英丙舒凡、曲洛磷胺、尼莫司汀、二溴螺氯铵、嘌嘧替派、洛铂、赛特铂、profiromycin、顺铂、伊洛福芬、dexifosfamide、顺式-胺二氯(2-甲基-吡啶)铂、苄基鸟嘌呤、葡磷酰胺、GPX100、(反式,反式,反式)-双-mu-(己烷-1,6-二胺)-mu-[二胺-铂(II)]双[二胺(氯)铂(II)]四氯化物、二吖啶基精胺、三氧化二砷、1-(11-十二烷基氨基-10-羟基十一基)-3,7-二甲基黄嘌呤、佐柔比星、伊达比星、柔红霉素、比生群、米托蒽醌、吡柔比星、吡萘非特、戊柔比星、氨柔比星、抗瘤酮、3'-脱氨基-3'-吗啉代-13-脱氧-10-羟基卡明霉素，安霉素(annamycin)、加柔比星(galarubicin)、依利奈法德(elinafide)、MEN10755、4-去甲氧基-3-脱氨基-3-吖丙啶基-4-甲基磺酰基-柔红霉素(参见WO 00/50032)。
低氧可活化化合物的实例是替拉扎明。
蛋白酶体抑制剂的实例包括但不限于乳胞素和MLN-341(Velcade)。
微管抑制剂/微管稳定剂的实例包括总体的紫杉烷。具体化合物包括紫杉醇硫酸长春地辛，3',4'-二脱氢-4'-脱氧-8'-norvincaleukoblastine、多西他赛/>根霉素、海兔毒素、mivobulin羟乙基磺酸盐、阿里他汀、西马多丁、RPR109881，BMS184476、长春氟宁、念珠藻素、2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺酰胺、脱水长春碱、N,N-二甲基-L-缬氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-缬氨酰-L-脯氨酰-L-脯氨酸-叔丁基酰胺、(SEQ ID NO:68)、TDX258、埃博霉素(参见例如美国专利号6,284,781和6,288,237)和BMS188797。
拓扑异构酶抑制剂的一些实例是拓扑替康、hycaptamine、伊立替康、鲁吡替康、6-乙氧基丙酰基-3',4'-O-外-亚苄基-教酒菌素、9-甲氧基-N,N-二甲基-5-硝基吡唑并[3,4,5-kl]吖啶-2-(6H)丙胺、1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3',4':b,7]-indolizino[1,2b]喹啉-10,13(9H,15H)二酮、勒托替康、7-[2-(N-异丙基氨基)乙基]-(20S)喜树碱、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、索布佐生、2'-二甲氨基-2'-脱氧-依托泊苷、GL331、N-[2-(二甲基氨基)乙基]-9-羟基-5,6-二甲基-6H-吡啶并[4,3-b]咔唑-1-甲酰胺、asulacrine、(5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(二甲基氨基)乙基]-N-甲基氨基]乙基]-5-[4-羟基-3,5-二甲氧基苯基]-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并(3’,4’:6,7)萘并(2,3-d)-1,3-二氧杂环戊烯-6-酮、2,3-(亚甲二氧基)-5-甲基-7-羟基-8-甲氧基苯并[c]-菲啶鎓、6,9-双[(2-氨基乙基)氨基]苯并[g]异喹啉-5,10-二酮、5-(3-氨基丙氨基)-7,10-二羟基-2-(2-羟乙基氨基甲基)-6H-吡唑并[4,5,1-de]吖啶-6-酮、N-[1-[2-(二乙氨基)乙氨基]-7-甲氧基-9-氧代-9H-噻吨-4-基甲基]甲酰胺、N-(2-(二甲基氨基)乙基)吖啶-4-甲酰胺、6-[[2-(二甲基氨基)乙基]氨基]-3-羟基-7H-茚并[2,1-c]喹啉-7-酮和地美司钠。
有丝分裂驱动蛋白，特别是人有丝分裂驱动蛋白KSP的抑制剂的实例描述于公开WO03/039460、WO03/050064、WO03/050122、WO03/049527、WO03/049679、WO03/049678、WO04/039774、WO03/079973、WO03/099211、WO03/105855、WO03/106417、WO04/037171、WO04/058148、WO04/058700、WO04/126699、WO05/018638、WO05/019206、WO05/019205、WO05/018547、WO05/017190、US2005/0176776中。在一个实施方式中，有丝分裂驱动蛋白的抑制剂包括但不限于KSP的抑制剂、MKLP1的抑制剂、CENP-E的抑制剂、MCAK的抑制剂和Rab6-KIFL的抑制剂。
“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”的实例包括但不限于SAHA、TSA、oxamflatin、PXD101、MG98和scriptaid。其他组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的进一步参考可在以下手稿中找到：Miller,T.A.等J.Med.Chem.46(24):5097-5116(2003)。
“参与有丝分裂进展的激酶的抑制剂”包括但不限于极光激酶的抑制剂、Polo样激酶的抑制剂(PLK；特别是PLK-1的抑制剂)、bub-1的抑制剂和bub-R1的抑制剂。“极光激酶抑制剂”的实例是VX-680。
“抗增殖剂”包括反义RNA和DNA寡核苷酸如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231和INX3001，以及抗代谢物如依诺他滨、卡莫氟、替加氟、喷司他丁、多西氟尿苷、曲美沙特、氟达拉滨、卡培他滨、加洛他滨、阿糖胞苷烷磷酯(cytarabine ocfosfate)、fosteabine钠水合物、雷替曲塞、paltitrexid、乙嘧替氟、tiazofurin、地西他滨、洛拉曲塞、培美曲塞、奈拉滨、2'-脱氧-2'-亚甲基胞苷、2'-氟亚甲基-2'-脱氧胞苷、N-[5-(2,3-二氢-苯并呋喃基)磺酰基]-N'-(3,4-二氯苯基)脲、N6-[4-脱氧-4-[N2-[2(E),4(E)-十四碳二烯酰基]甘氨酰氨基]-L-甘油基-B-L-manno-heptopyranosyl]腺嘌呤、aplidine、海鞘素、曲沙他滨、4-[2-氨基-4-氧代-4,6,7,8-四氢-3H-嘧啶并[5,4-b][1,4]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2,5-噻吩酰基-L-谷氨酸、氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、阿拉诺新、11-乙酰基-8-(氨甲酰氧基甲基)-4-甲酰基-6-甲氧基-14-氧杂-1,11-二氮杂四环(7.4.1.0.0)-十四烷-2,4,6-三烯-9-基乙酸酯、苦马豆素、洛美曲索、右雷佐生、蛋氨酸酶、2'-氰基-2'-脱氧-N4-棕榈酰基-1-B-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、3-氨基吡啶-2-甲醛缩氨基硫脲和曲妥珠单抗。
单克隆抗体靶向治疗剂的实例包括具有连接于癌细胞特异性的或靶细胞特异性的单克隆抗体的细胞毒性剂或放射性同位素的那些治疗剂。实例包括百克沙。
“异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂”是指抑制异戊二烯基-蛋白转移酶的任何一种或任何组合的化合物，包括法呢基蛋白转移酶(FPTase)、香叶酰香叶基-蛋白转移酶I型(GGPTase-I)和香叶酰香叶基-蛋白转移酶II型(GGPTase-II，也称为Rab GGPTase)。
异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂的实例可以在以下出版物和专利中找到：WO 96/30343、WO 97/18813、WO 97/21701、WO 97/23478、WO 97/38665、WO 98/28980、WO 98/29119、WO 95/32987、美国专利No.5,420,245、美国专利No.5,523,430、美国专利No.5,532,359、美国专利No.5,510,510、美国专利No.5,589,485、美国专利No.5,602,098、欧洲专利公开0 618 221、欧洲专利公开0 675 112、欧洲专利公开0 604 181、欧洲专利公开0 696593、WO 94/19357、WO 95/08542、WO 95/11917、WO 95/12612、WO 95/12572、WO 95/10514、美国专利No.5,661,152、WO 95/10515、WO 95/10516、WO 95/24612、WO 95/34535、WO 95/25086、WO 96/05529、WO 96/06138、WO 96/06193、WO 96/16443、WO 96/21701、WO 96/21456、WO 96/22278、WO 96/24611、WO 96/24612、WO 96/05168、WO 96/05169、WO 96/00736、美国专利No.5,571,792、WO 96/17861、WO 96/33159、WO 96/34850、WO 96/34851、WO96/30017、WO 96/30018、WO 96/30362、WO 96/30363、WO 96/31111、WO 96/31477、WO 96/31478、WO 96/31501、WO 97/00252、WO 97/03047、WO 97/03050、WO 97/04785、WO 97/02920、WO 97/17070、WO 97/23478、WO 97/26246、WO 97/30053、WO 97/44350、WO 98/02436和美国专利No.5,532,359。关于异戊二烯基-蛋白转移酶抑制剂对血管生成的作用的实例参见European J.of Cancer,Vol.35,No.9,pp.1394-1401(1999)。
“血管生成抑制剂”是指抑制新血管形成的化合物，无论其机理如何。血管生成抑制剂的实例包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂，如酪氨酸激酶受体Flt-1(VEGFR1)和Flk-1/KDR(VEGFR2)的抑制剂、表皮源、成纤维细胞源或血小板源生长因子的抑制剂、MMP(基质金属蛋白酶)抑制剂、整联蛋白阻滞剂、干扰素-α、白介素-12、戊聚糖多硫酸盐、环加氧酶抑制剂，包括非甾体类抗炎药(NSAIDs)如阿司匹林和布洛芬，以及选择性环氧化酶-2抑制剂如塞来考昔和罗非考昔(PNAS,Vol.89,p.7384(1992)；JNCI,Vol.69,p.475(1982)；Arch.Opthalmol.,Vol.108,p.573(1990)；Anat.Rec.,Vol.238,p.68(1994)；FEBSLetters,Vol.372,p.83(1995)；Clin,Orthop.Vol.313,p.76(1995)；J.Mol.Endocrinol.,Vol.16,p.107(1996)；Jpn.J.Pharmacol.,Vol.75,p.105(1997)；Cancer Res.,Vol.57,p.1625(1997)；Cell,Vol.93,p.705(1998)；Intl.J.Mol.Med.,Vol.2,p.715(1998)；J.Biol.Chem.,Vol.274,p.9116(1999))、甾体抗炎药(如皮质类固醇、盐皮质激素、地塞米松、强的松、泼尼松龙、methylpred、倍他米松)、羧胺三唑、康普瑞汀A-4、角鲨胺、6-O-氯乙酰基-羰基)-烟霉醇、沙利度胺、血管抑素、肌钙蛋白-1、血管紧张素II拮抗剂(参见Fernandez等，J.Lab.Clin.Med.105:141-145(1985))和VEGF的抗体(参见NatureBiotechnology,Vol.17,pp.963-968(October 1999)；Kim等,Nature,362,841-844(1993)；WO 00/44777和WO 00/61186)。
血管生成抑制剂的其他实例包括但不限于内皮抑素、ukrain、ranpirnase、IM862、5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)氧杂环丙基]-1-氧杂螺[2,5]辛-6-基(氯乙酰基)氨基甲酸酯、acetyldinanaline、5-氨基-1-[[3,5-二氯-4-(4-氯苯甲酰基)苯基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲酰胺、CM101、角鲨胺、康普瑞汀、RPI4610、NX31838、硫酸化甘露五糖磷酸酯、7,7-(羰基-双[亚氨基-N-甲基-4,2-吡咯羰基亚氨基[N-甲基-4,2-吡咯]-羰基亚氨基]-双-(1,3-萘二磺酸盐)和3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-2-吲哚酮(SU5416)。
调节或抑制血管生成并且还可以与本发明的化合物组合使用的其他治疗剂包括调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解系统的药剂(参见Clin.Chem.La.Med.38:679-692(2000)中的综述)。这样的调节或抑制凝血和纤维蛋白溶解途径的药剂的实例包括但不限于肝素(参见Thromb.Haemost.80:10-23(1998))、低分子量肝素和羧肽酶U抑制剂(也称为活性凝血酶可激活的纤维蛋白溶解抑制剂[TAFIa]的抑制剂)(参见Thrombosis Res.101:329-354(2001))。TAFIa抑制剂已在美国系列No.60/310,927(2001年8月8日提交)和60/349,925(2002年1月18日提交)中描述。
“干扰受体酪氨酸激酶(RTKs)的药剂”是指抑制RTK且因此抑制涉及肿瘤发生和肿瘤进展的机制的化合物。这些药剂包括c-Kit、Eph、PDGF、Flt3和c-Met的抑制剂。其他药剂包括如Bume-Jensen和Hunter，Nature,411:355-365,2001中所述的RTK抑制剂。
“细胞增殖和存活信号传导途径的抑制剂”是指抑制细胞表面受体下游的信号转导级联的化合物。这样的药剂包括丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(包括但不限于Akt的抑制剂，如在WO 02/083064、WO 02/083139、WO 02/083140、US 2004-0116432、WO 02/083138、US2004-0102360、WO 03/086404、WO 03/086279、WO 03/086394、WO 03/084473、WO 03/086403、WO 2004/041162、WO 2004/096131、WO 2004/096129、WO 2004/096135、WO 2004/096130、WO 2005/100356、WO 2005/100344、US 2005/029941、US 2005/44294、US 2005/43361、60/734188、60/652737、60/670469中所描述的)、Raf激酶的抑制剂(例如PLX-4032)、MEK的抑制剂(例如Arry-162、RO-4987655和GSK-1120212)、mTOR的抑制剂(例如AZD-8055、BEZ-235和依维莫司)和PI3K的抑制剂(例如GDC-0941、BKM-120)。
如上所用，“整联蛋白阻滞剂”是指选择性地拮抗、抑制或抵消生理配体与αvβ3整联蛋白结合的化合物，选择性地拮抗、抑制或抵消生理配体与αvβ5整联蛋白结合的化合物，拮抗、抑制或抵消生理配体与αvβ3整联蛋白和αvβ5整联蛋白结合的化合物，以及拮抗、抑制或抵消毛细管内皮细胞上表达的特定整联蛋白活性的化合物。该术语还指αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1和α6β4整联蛋白的任何组合的拮抗剂。
酪氨酸激酶抑制剂的一些具体实例包括N-(三氟甲基苯基)-5-甲基异噁唑-4-甲酰胺、3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]二氢吲哚-2-酮、17-(烯丙基氨基)-17-去甲氧基格尔纳霉素、4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-[3-(4-吗啉基)丙氧基]喹唑啉、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)-4-氨基喹唑啉、BIBX1382、2,3,9,10,11,12-六氢-10-(羟甲基)-10-羟基-9-甲基-9,12-环氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg:3’,2’,1’-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮杂-1-酮(benzodiazocin-1-one)、SH268、染料木黄酮、STI571、CEP2563、4-(3-氯苯基氨基)-5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶甲磺酸盐、4-(3-溴-4-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、4-(4'-羟基苯基)氨基-6,7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4-氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)-1-酞嗪胺和EMD121974。
当前要求保护的抗体或抗原结合片段与PPAR-γ(即PPAR-gamma)激动剂和PPAR-δ(即PPAR-delta)激动剂的组合可用于治疗某些恶性肿瘤。PPAR-γ和PPAR-δ是核过氧物酶体增殖物激活受体γ和δ。PPAR-γ在内皮细胞上的表达及其在血管生成中的作用已在文献中报道(参见J.Cardiovasc.Pharmacol.1998；31:909-913；J.Biol.Chem.1999；274:9116-9121；Invest.Ophthalmol Vis.Sci.2000；41:2309-2317)。最近，PPAR-γ激动剂已证明在体外抑制对VEGF的血管生成反应；曲格列酮和罗格列酮马来酸盐两者抑制小鼠视网膜新生血管的形成。(Arch.Ophthamol.2001；119:709-717)。PPAR-γ激动剂和PPAR-γ/α激动剂的实例包括但不限于 niraparib、/>噻唑烷二酮(如DRF2725、CS-011、曲格列酮、罗格列酮和吡格列酮)、非诺贝特、吉非贝齐、氯贝特、GW2570、SB219994、AR-H039242、JTT-501、MCC-555、GW2331、GW409544、NN2344、KRP297、NP0110、DRF4158、NN622、GI262570、PNU182716、DRF552926、2-[(5,7-二丙基-3-三氟甲基-1,2-苯并异噁唑-6-基)氧基]-2-甲基丙酸和2(R)-7-(3-(2-氯-4-(4-氟苯氧基))苯氧基)丙氧基)-2-乙基色满-2-羧酸。
本发明的抗体或抗原结合片段也可用于与芳香酶抑制剂组合来治疗或预防乳腺癌。芳香酶抑制剂的实例包括但不限于：阿那曲唑、来曲唑和依西美坦。
本发明的抗体或抗原结合片段还可以与以下化疗剂组合用于治疗癌症：阿巴瑞克(Plenaxis )；aldesleukin/>Aldesleukin/>阿仑单抗/>阿利维甲酸/>别嘌呤醇/>六甲蜜胺氨磷汀/>阿那曲唑/>三氧化二砷/>天冬酰胺酶/>阿扎胞苷/>盐酸苯达莫司汀/>贝伐单抗贝沙罗汀胶囊/>贝沙罗汀凝胶/>博莱霉素硼替佐米/>布雷菲德菌素A；白消安静脉注射剂白消安口服剂/>卡普睾酮/>卡培他滨卡铂/>卡莫司汀/>卡莫司汀卡莫司汀与聚苯丙生20植入剂(Gliadel/>)；塞来昔布西妥昔单抗/>苯丁酸氮芥/>顺铂克拉屈滨(/>2-/>)；氯法拉滨/>环磷酰胺 环磷酰胺(Cytoxan/>)；环磷酰胺(Cytoxan)；阿糖胞苷(Cytosar-/>)；阿糖胞苷脂质体/>达卡巴嗪(DTIC-)；更生霉素、放线菌素D/>达肝素钠注射剂/>阿法达贝泊汀/>达沙替尼/>柔红霉素脂质体/>柔红霉素、道诺霉素/>柔红霉素、道诺霉素/>地加瑞克地尼白介素(Denileukin diftitox)/>右雷佐生右雷佐生盐酸盐/>膜海鞘素B；17-DMAG；多西他赛多柔比星(Adriamycin/>)；多柔比星/>多柔比星(Adriamycin PFS/>)；多柔比星脂质体/>屈他雄酮丙酸盐屈他雄酮丙酸盐(Masterone/>)；依库丽单抗注射剂Elliott’s B溶液(Elliott's B/>)；艾曲波帕/>表柔比星/>阿法依泊汀/>厄洛替尼/>雌莫司汀/>乙炔雌二醇；依托泊苷磷酸盐/>依托泊苷、VP-16依维莫司片剂/>依西美坦/>ferumoxytol(Feraheme/>)；非格司亭/>氟尿苷(动脉内)/>氟达拉滨/>氟尿嘧啶、5-FU/>氟维司群/>吉非替尼格尔德霉素；吉西他滨/>吉妥珠单抗奥唑米星/>醋酸戈舍瑞林(Zoladex/>)；醋酸戈舍瑞林/>醋酸组氨瑞林(Histrelin/>)；羟基脲/>替伊莫单抗/>依达比星异环磷酰胺/>甲磺酸伊马替尼/>干扰素α2a(Roferon/>)；干扰素α-2b(Intron/>)；碘苄胍I 123注射液/>伊立替康/>伊沙匹隆/>拉帕替尼片/>来那度胺来曲唑/>甲酰四氢叶酸/> 醋酸亮丙瑞林/>左旋咪唑/>洛莫司汀、CCNU/>二氯甲基二乙胺、氮芥/>醋酸甲地孕酮/>美法仑、L-PAM巯基嘌呤、6-MP/>美司钠/>美司钠(Mesnex)；甲氨蝶呤/>甲氧沙林/>8-甲氧基补骨脂；丝裂霉素C/>米托坦/>米托蒽醌/>光辉霉素；苯丙酸诺龙(Durabolin-/>)；奈拉滨/>尼罗替尼/>Nofetumomabofatumumab/>奥普瑞白介素/>奥沙利铂紫杉醇/>紫杉醇/>紫杉醇蛋白结合颗粒帕利夫明/>帕米膦酸盐/>帕尼单抗帕唑帕尼片剂/>培加酶/>培门冬酶/>聚乙二醇非格司亭/>培美曲塞二钠/>喷司他丁/>哌泊溴烷/>普乐沙福/>普卡霉素、光神霉素/>卟菲尔钠/>普拉曲沙注射液/>甲基苄肼奎纳克林/>雷帕霉素；拉布立酶/>雷洛昔芬盐酸盐/>利妥昔单抗/>罗米地辛/>罗米司亭/>沙格司亭/>沙格司亭/>索拉非尼/>链脲佐菌素舒尼替尼马来酸盐/>滑石粉/>他莫昔芬替莫唑胺/>替西罗莫司/>替尼泊苷、VM-26/>睾内酯/>硫鸟嘌呤、6-TG/>巯基嘌呤；噻替派/>拓扑替康/>托瑞米芬/>托西莫单抗托西莫单抗/I-131托西莫单抗/>反式-视黄酸；曲妥珠单抗维甲酸、ATRA/>曲他胺；尿嘧啶氮芥(Uracil Mustard)；戊柔比星/>长春花碱/>长春新碱/>长春瑞滨/>伏立诺他/>渥曼青霉素；和唑来膦酸
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与一种或多种止吐药相结合使用，包括但不限于：卡索匹坦(GlaxoSmithKline)、奈妥吡坦(Netupitant)(MGI-Helsinn)和其它NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼(由MGI Pharma作为Aloxi销售)、阿瑞匹坦(由Merck and Co.；Rahway,NJ作为Emend销售)、苯海拉明(由Pfizer；New York,NY作为销售)、安泰乐(由Pfizer；NewYork,NY作为/>销售)、甲氧氯普胺(由AH Robins Co.；Richmond,VA作为销售)、劳拉西泮(由Wyeth；Madison,NJ作为/>销售)、阿普唑仑(由Pfizer；New York,NY作为/>销售)、氟哌啶醇(由Ortho-McNeil；Raritan,NJ作为销售)、氟哌利多/>屈大麻酚(由Solvay Pharmaceuticals,Inc.；Marietta,GA作为/>销售)、地塞米松(由Merck and Co.；Rahway,NJ作为销售)、甲泼尼龙(由Pfizer；New York,NY作为/>销售)；丙氯拉嗪(由Glaxosmithkline；Research Triangle Park,NC作为/>销售)、格拉司琼(由Hoffmann-La Roche Inc.；Nutley,NJ作为/>销售)、昂丹司琼(由Glaxosmithkline；Research Triangle Park,NC作为/>销售)、多拉司琼(由Sanofi-Aventis；New York,NY作为/>销售)、托烷司琼(由Novartis；EastHanover,NJ作为/>销售)。
癌症治疗的其它副作用包括红细胞和白细胞缺乏。因此，在本发明的实施方式中，抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式)与治疗或预防此类缺乏的药剂(如非格司亭、PEG-非格司亭、红细胞生成素、阿法依泊汀(epoetin alfa)或阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa))结合。
在本发明的实施方式中，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)与抗癌放射疗法结合施用。例如，在本发明的实施方式中，放射疗法为外部束疗法(EBT)：用于递送一束高能X射线至肿瘤位置的方法。该束在患者外部生成(例如，通过线性加速器)且靶向在肿瘤部位。这些X射线可破坏癌细胞且小心的治疗计划允许绕过周围正常组织。没有放射性源置于患者体内。在本发明的实施方式中，放射疗法是质子束疗法：以质子代替X-射线轰击患病组织的一种保形疗法类型。在本发明的实施方式中，放射疗法是保形外部束放射疗法：使用先进技术将放射疗法针对受试者身体结构进行调整的程序。在本发明的实施方式中，放射疗法为短距离疗法：将放射性物质暂时置于体内，通常用以将超剂量或增强剂量的放射给予一定区域。
在本发明的实施方式中，与抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式)结合施用的手术程序是手术肿瘤切除术。
在进一步的实施方式中，患者与抗-CD27特异性抗体或其抗原结合片段一起输注体外扩增自体T细胞。在另一实施方式中，患者施用与抗-CD27特异性抗体或其抗原结合片段结合的自体T细胞。在再一实施方式中，患者接种癌症疫苗，并与抗-CD27特异性抗体或其抗原结合片段一起输注体外扩增自体T细胞。自体T细胞可以是自体浸润淋巴细胞、用针对肿瘤抗原的高亲和力T-细胞受体转导的T细胞或用由杂合免疫球蛋白轻链与T细胞信号传导分子的内结构域组成的嵌合抗原受体转导的T细胞。参见Kalos M.和June C.H.,Immunity,39,2013,p49-60；Wu R.等,Cancer J.2012；18(2):160-175；和June,C.H.,J.Clin.Invest.117:1466-1476(2007)。
实验和诊断用途
本文公开的抗-CD27抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式)可用作亲和纯化试剂。在该过程中，抗-CD27抗体及其抗原结合片段使用本领域中众所周知的方法固定在固相如Sephadex、玻璃或琼脂糖树脂或滤纸上。使固定的抗体或片段与待纯化的含有CD27蛋白(或其片段)的样品接触，且此后将支持物用合适溶剂洗涤，其将去除样品中除结合于固定的抗体或片段的CD27蛋白外的基本上所有物质。最后，将支持物用洗脱结合的CD27的溶剂(例如蛋白A)洗涤。这种的固定抗体和片段形成本发明的部分。
进一步提供用于产生可用于例如进行Western印迹和本文中讨论的其它免疫测定的二级抗体的抗原。
抗-CD27抗体(例如，人源化抗体)及其抗原结合片段也可用于CD27蛋白的诊断测定中，例如检测其在特定细胞、组织或血清(例如肿瘤细胞，如黑色素瘤细胞)中的表达。此类诊断方法可用于各种疾病诊断。
本发明包括ELISA分析(酶联免疫吸附分析)，其包括本文公开的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式)的使用。
例如，此类方法包括以下步骤：
(a)用抗-CD27抗体或其抗原结合片段包被基质(例如，微量滴定板孔的表面，例如塑料板)；
(b)将待测试CD27的存在的样品施加至基质；
(c)洗涤该平板，使得去除样品中未结合的物质；
(d)施加也对CD27抗原特异性的可检测地标记的抗体(例如，酶连接的抗体)；
(e)洗涤该基质，使得去除未结合的标记抗体；
(f)如果标记的抗体是酶连接的，则施加通过酶转化成荧光信号的化学物质；和
(g)检测标记抗体的存在。
检测到与基质结合的标记指示CD27蛋白的存在。
在进一步的实施方式中，标记的抗体或其抗原结合片段用过氧化酶标记，所述过氧化酶与ABTS(例如2,2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺反应，以产生可检测的颜色变化。或者，标记的抗体或片段用可检测的放射性同位素(例如，3H)标记，所述放射性同位素可在闪烁体存在的情况下通过闪烁计数器检测。
本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可用于Western印迹或免疫-蛋白印迹程序中。这种程序形成本发明的部分且包括例如：
(1)任选地使用本领域中已知的方法(例如，半干式印迹法或罐印迹法)从待测试CD27的存在的样品(例如从样品中蛋白质的PAGE或SDS-PAGE电泳分离)转移蛋白质至膜或其它固体基质上；使待测试结合的CD27或其片段的存在的膜或其它固体基质与本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段接触。
这种膜可采取硝酸纤维素或基于乙烯基的(例如，聚偏二氟乙烯(PVDF))膜的形式，在非变性PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶或SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶中待测试CD27的存在的蛋白质已转移至该膜(例如在凝胶中电泳分离后)。在膜与抗-CD27抗体或片段接触前，该膜任选地用例如脱脂奶粉等封闭以结合膜上的非特异性蛋白结合位点。
(2)将膜洗涤一次或多次以去除未结合的抗-CD27抗体或片段和其它未结合的物质；和
(3)检测结合的抗-CD27抗体或片段。
检测到结合的抗体或片段指示CD27蛋白存在于膜或基质上和样品中。结合的抗体或片段的检测可通过将抗体或片段与可检测地标记的二级抗体(抗免疫球蛋白抗体)结合，且然后检测二级抗体的存在。
本文公开的抗-CD27抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)也可用于免疫组织化学。这种方法形成本发明的部分且包括例如：
(1)使待测试CD27蛋白的存在的细胞(例如，肿瘤细胞，如黑色素瘤细胞)与本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段接触；和
(2)检测细胞上或细胞中的抗体或片段。
如果抗体或片段本身被可检测地标记，则其可直接检测。或者，抗体或片段可被可检测地标记的二级抗体结合，所述二级抗体被检测。
本文公开的某些抗-CD27抗体及其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)也可用于体内肿瘤成像。这种方法可包括将放射性标记的抗-CD27抗体或其抗原结合片段注射至待测试与CD27表达相关的肿瘤(例如，其例如在肿瘤细胞表面上表达CD27)的存在的患者体内，随后对患者身体进行核成像以检测标记的抗体或片段的存在，例如在包含与肿瘤结合的高浓度抗体或片段的位点处。检测到该位点指示CD27+肿瘤和肿瘤细胞的存在。
成像技术包括SPECT成像(单光子发射计算机断层摄影术)或PET成像(正电子发射断层摄影术)。标记包括例如碘-123(123I)和锝-99m(99mTc)，例如与SPECT成像结合，或11C、13N、15O或18F，例如与PET成像结合，或铟-111(参见例如Gordon等，(2005)InternationalRev.Neurobiol.67:385-440)。
药物组合物及施用
为了制备本发明的抗-CD27抗体和抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)的药物或无菌组合物，将抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences和U.S.Pharmacopeia:NationalFormulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)。
治疗和诊断剂的制剂可通过以例如冻干粉末、浆液、水性溶液或悬浮液的形式与可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备(参见例如Hardman等Goodman and Gilman’sThe Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,andWilkins,New York,NY；Avis等(eds.)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms:ParenteralMedications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(eds.)(1990)Pharmaceutical DosageForms:Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等(eds.)(1990)Pharmaceutical DosageForms:Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)ExcipientToxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。
单独或与另一治疗剂组合施用的本发明抗体的毒性和治疗功效可通过标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如测定LD50(群体的50％致死的剂量)和ED50(群体的50％治疗有效的剂量)。毒性和治疗作用之间的剂量比率为治疗指数(LD50/ED50)。从这些细胞培养物分析和动物研究获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选在包括ED50而具有很小或无毒性的循环浓度的范围内。剂量可根据所采用的剂型和施用途径而在该范围内变化。
在进一步的实施方式中，另外的治疗剂根据Physicians’Desk Reference 2003(Thomson Healthcare；第57版(2002年11月1日))与本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式)相结合向受试者施用。
施用模式可变化。施用途径包括经口、直肠、经粘膜、经肠、肠胃外；肌肉内、皮下、皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、经皮或动脉内。
在具体实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可通过侵入性途径如通过注射来施用。在本发明的进一步实施方式中，抗-CD27抗体或其抗原结合片段或其药物组合物静脉内、皮下、肌肉内、动脉内、肿瘤内或通过吸入、气溶胶递送来施用。通过非侵入性途径(例如经口；例如在丸剂、胶囊或锭剂中)施用也在本发明的范围内。
本发明提供容器(例如塑料或玻璃小瓶，例如具有盖，或色谱柱、中空孔针或注射器筒)，其包含本发明的任一抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)或其药物组合物。本发明还提供任一本发明的包含抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)或其药物组合物的注射装置。注射装置是经由肠胃外途径，例如肌肉内、皮下或静脉内，将物质引入患者体内的装置。例如，注射装置可以是注射器(例如，预填充有药物组合物，如自动注射器)，其例如包括用于容纳待注射的流体(例如抗体或片段或其药物组合物)的针筒或圆筒、用于刺穿皮肤和/或血管以注射流体的针；以及用于将流体从针筒推出且穿过针孔的柱塞。在本发明的实施方式中，包含本发明的抗体或其抗原结合片段或其药物组合物的注射装置为静脉内(IV)注射装置。此类装置包括套管或套管针/针中的抗体或片段或其药物组合物，所述套管或套管针/针可附接至连接于用于容纳通过套管或套管针/针引入患者体内的流体(例如，盐水；或包含NaCl、乳酸钠、KCl、CaCl2和任选地包括葡萄糖的乳酸化林格氏溶液)的袋或储器的管。在本发明的实施方式中，一旦将套管针和套管插入受试者静脉中且从插入套管移除套管针，抗体或片段或其药物组合物可引入装置中。IV装置可例如插入周围静脉(例如手或臂中)；上腔静脉或下腔静脉，或心脏右心房内(例如中央IV)；或锁骨下、颈内静脉或股静脉，且例如推进至心脏，直至其达到上腔静脉或右心房(例如中央静脉)。在本发明的实施方式中，注射装置为自动注射器；喷射注射器或外部输注泵。喷射注射器使用液体的高压窄射流，其穿透表皮以将抗体或片段或其药物组合物引入患者体内。外部输注泵为将抗体或片段或其药物组合物以受控量递送至患者体内的医学装置。外部输注泵可以是电动或机械动力的。不同泵以不同方式操作，例如注射器泵保持流体在注射器储器中，且可移动的活塞控制流体递送，弹性体泵保持流体在可伸展的球囊储器中，且来自球囊的弹性壁的压力驱动流体递送。在蠕动泵中，一组辊在柔性管道的长度上向下挤压，从而推动流体向前。在多通道泵中，流体可从多个储器以多个速率递送。
本文公开的药物组合物也可用无针皮下注射装置施用；如美国专利号6,620,135；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824或4,596,556中公开的装置。包含药物组合物的此类无针装置也是本发明的部分。本文公开的药物组合物也可通过输注施用。众所周知的用于施用药物组合物的植入物和模块的实例包括以下中公开的那些：美国专利号4,487,603，其公开以受控速率分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,447,233，其公开以精确的输注速率递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开用于连续药物递送的可变流量可植入输注设备；美国专利号4,439,196，其公开具有多腔室隔室的渗透药物递送系统。许多其它此类植入物、递送系统和模块是本领域技术人员众所周知的那些，和包含本发明的药物组合物的那些植入物、递送系统和模块在本发明的范围内。
或者，可以局部而非全身性方式，例如经由直接注射抗体或片段至肿瘤，例如CD27+肿瘤中来施用本发明的抗-CD27抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)。此外，可在靶向药物递送系统中，例如在用靶向例如肿瘤，例如CD27+肿瘤(例如通过免疫病理学表征的)的组织特异性抗体包被的脂质体中施用所述抗体或片段。将脂质体靶向至患病组织且由患病组织选择性吸收。此类方法和脂质体是本发明的部分。
施用方案取决于几个因素，包括治疗性抗体或抗原结合片段的血清或组织转换率、症状水平、治疗性抗体的免疫原性和靶细胞在生物基质中的可接近性。优选地，施用方案递送足够的治疗性抗体或片段以实现目标疾病状况的改善，则同时最小化不希望的副作用。因此，递送的生物制剂的量部分地取决于特定治疗性抗体和所治疗的病症的严重程度。可获得关于选择治疗性抗体或片段的适当剂量的指导(参见例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(ed.)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(ed.)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等(2003)NewEngl.J.Med.348:24-32；Lipsky等(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602)。
适当剂量的测定通过临床医师，例如使用本领域中已知或怀疑影响治疗的参数或因素进行。一般，剂量以略小于最佳剂量的量开始，且其随后以较小增量增加直至相对于任何负面的副作用实现所需要的或最佳的作用。重要的诊断量度包括例如炎症的症状或所产生炎性细胞因子的水平的那些量度。通常，期望的是将使用的生物制剂来源于与靶向治疗的动物相同的物种，由此最小化对药剂的任何免疫反应。在人类受试者的情况下，例如人源化和全人抗体可能是期望的。
本文公开的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可通过连续输注或按照施用的剂量提供，例如每日、每周1-7次、每周、每两周、每个月、每两个月、每季、每半年、每年等。剂量可例如静脉内、皮下、局部、经口、经鼻、经直肠、肌肉内、颅内、脊椎内或通过吸入提供。总每周剂量通常为至少0.05μg/kg体重，更通常至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更多(参见，例如Yang等(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等(20003)Cancer Immunol.Immunother.52:151-144)。也可提供剂量以实现受试者血清中抗-CD27抗体的预定目标浓度，如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更高。在其它实施方式中，本发明的抗-CD27抗体例如皮下或静脉内，每周、每两周、“每4周”、每个月、每两个月或每季以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/受试者施用。
如本文所用，术语“有效量”是指本发明的抗-CD27或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)当单独或与另外的治疗剂组合施用至细胞、组织或受试者时有效引起疾病例如癌症或癌症进展的一种或多种症状的可测量的改善的量。有效剂量进一步指抗体或片段足以导致症状的至少部分改善(例如肿瘤缩小或消除、肿瘤生长的缺乏、增加存活时间)的量。当应用于单独施用的单个活性成分时，有效剂量是指单独的该成分。当应用于组合时，有效剂量是指导致治疗效应的活性成分的组合量，无论组合、连续还是同时施用。有效量的治疗剂将导致诊断量度或参数改善至少10％；通常至少20％；优选至少约30％；更优选至少40％且最优选至少50％。在主观量度用于评价疾病严重程度的情况下，有效量也可导致主观量度的改善。
试剂盒
进一步提供了包含一种或多种组分的试剂盒，所述一种或多种组分包括但不限于与一种或多种另外的组分(包括但不限于药学上可接受的载体和/或如本文中所讨论的治疗剂)结合的如本文中所讨论的抗-CD27抗体或抗原结合片段(例如，抗体131A或其人源化形式)。抗体或片段和/或治疗剂可配制为纯组合物或在药物组合物中与药学上可接受的载体组合。
在一个实施方式中，试剂盒包括一个容器中(例如，无菌玻璃或塑料小瓶中)的本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)或其药物组合物和另一容器中(例如，无菌玻璃或塑料小瓶中)的治疗剂及其药物组合物。
在另一实施方式中，试剂盒包括在单一、共同容器中的本发明的组合，其包括本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如人源化131A)以及药学上可接受的载体，任选地与一种或多种治疗剂组合，任选地在药物组合物中。
如果试剂盒包括用于向受试者肠胃外施用的药物组合物，则所述试剂盒可包括用于进行此类施用的装置。例如，试剂盒可包括如上文所讨论的一种或多种皮下针或其它注射装置。
试剂盒可包括包装插页，其包括关于试剂盒中的药物组合物和剂型的信息。通常，此类信息帮助患者和医师有效且安全地使用包封的药物组合物和剂型。例如，以下关于本发明的组合的信息可在该插页中提供：药代动力学、药效学、临床研究、功效参数、适应症和用法、禁忌症、警告信息、注意事项、不良反应、过量、适当剂量和施用、如何供应、适当储存条件、参考文献、制造商/经销商信息和专利信息。
检测试剂盒和治疗试剂盒
为了方便起见，本发明的抗-CD27抗体或其抗原结合片段(例如，抗体131A及其人源化形式)可提供于试剂盒中，即预定量的试剂与用于进行诊断或检测分析的说明的包装组合。在抗体或片段用酶标记的情况下，试剂盒包括酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测发色团或荧光团的底物前体)。另外，可包括其它添加剂，如稳定剂、缓冲剂(例如，阻断缓冲液或裂解缓冲液)等等。各种试剂的相对量可广泛变化以提供实质上优化测定灵敏度的溶液中试剂的浓度。具体地，试剂可作为干燥粉末(通常冻干的)提供，包括在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液赋形剂。
还提供了包含用于多种检测分析中的一种或多种此类试剂的诊断或检测试剂和试剂盒，包括例如免疫测定，如ELISA(夹心型或竞争形式)。试剂盒的组分可预连接至固体支持物，或可以在使用试剂盒时施加至固体支持物的表面。在本发明的一些实施方式中，信号产生装置可与本发明的抗体或片段预缔合，或在使用前可能需要与一种或多种组分如缓冲剂、抗体-酶缀合物、酶底物等组合。试剂盒也可包括另外的试剂，例如用于减少与固相表面的非特异性结合的封闭试剂、洗涤试剂、酶底物等。固相表面可为管、珠、微量滴定板、微球或适合于固定蛋白、肽或多肽的其它材料的形式。在具体的方面，催化化学发光或发色产物形成或化学发光或发色底物的还原的酶是信号产生装置的组分。此类酶是本领域中众所周知的。试剂盒可包含本文所述的任何捕获试剂和检测试剂。任选地，试剂盒也可包含用于进行本发明的方法的说明书。
还提供了包含包装在容器如小瓶或瓶子中的抗-CD27抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段，且进一步包含附接至容器或与容器一起包装的标签的试剂盒，所述标签描述容器的内含物且提供适应症和/或关于使用容器内含物治疗如本文所述的一种或多种疾病状态的说明。
在一个方面，试剂盒用于治疗癌症且包含抗-CD27抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段和另外的治疗剂或疫苗。试剂盒可任选地进一步包括用于肠胃外，例如静脉内施用的注射器。在另一个方面，试剂盒包含抗-CD27抗体(例如，人源化抗体)或其抗原结合片段和描述抗体或片段与疫苗或另外的治疗剂的使用的附接至容器或与容器一起包装的标签。在又一个方面，试剂盒包含疫苗或另外的治疗剂和描述疫苗或另外的治疗剂与抗-CD27抗体或片段的使用的附接至容器或与容器一起包装的标签。在某些实施方式中，抗-CD27抗体和疫苗或另外的治疗剂在单独的小瓶中或在相同药物组合物中一起组合。除了上述的肿瘤疫苗外，用于传染病的疫苗可与抗-CD27抗体或其抗原结合片段组合使用，例如，M-M-/>II、Pedvax/>23、和/>
如上文在组合疗法章节中所讨论的，两种治疗剂的同时施用不要求药剂同时或通过相同途径施用，只要药剂发挥其治疗作用的时间段存在重叠。设想同时或依次施用，如在不同日或不同的周施用。
也可制备包含本文公开的抗体、肽、抗原结合片段或多核苷酸中的至少一种和关于使用组合物作为检测试剂或治疗剂的说明书的本文公开的治疗和检测试剂盒。用于此类试剂盒中的容器通常可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它合适的容器，一种或多种检测和/或治疗组合物可置于其中，且优选适当地等分。在还提供第二治疗剂的情况下，试剂盒也可含有第二不同容器，其中可放置该第二检测和/或治疗组合物。或者，多种化合物可制备成单一药物组合物，且可包装在单一容器装置如小瓶、烧瓶、注射器、瓶或其它合适的单一容器中。本文公开的试剂盒通常还包括用于将小瓶容纳用于商业销售的严密装置中，如例如其中保持期望小瓶的注塑或吹塑塑料容器。在放射性标记、发色、荧光生成或其它类型的可检测标记或检测装置包括在试剂盒内的情况下，标记试剂可提供于与检测或治疗组合物本身相同的容器中，或者可置于其中可放置且适当等分该第二组合物的第二不同容器装置中。或者，检测试剂和标记可制备于单一容器装置中，并且在大多数情况下，试剂盒也通常包括用于将小瓶容纳用于商业销售和/或便于包装和递送的严密装置中。
还提供用于进行本文所述的检测或监测方法的装置或设备。此类设备可包括其中可输入样品的腔室或管、任选地包括阀或泵以引导样品流通过装置的流体操作系统、任选从血液分离血浆或血清的过滤器、用于添加捕获剂或检测试剂的混合腔室和任选地用于检测结合捕获剂免疫复合物的可检测标记的量的检测装置。样品流可以是被动的(例如通过毛细管、流体静力学或一旦施加样品就不需要装置的进一步操纵的其它力)或主动的(例如通过施加经由机械泵、电渗泵、离心力或增加的气压所产生的力)或通过主动力和被动力的组合。
在进一步实施方式中，还提供了处理器、计算机可读存储器和存储在计算机可读存储器上且适应于在处理器上执行以进行本文所述的任一方法的例行程序。合适的计算系统、环境和/或配置的实例包括个人计算机、服务器计算机、手持式或膝上型装置、多处理器系统、基于微处理器的系统、机顶盒、可编程的消费性电子产品、网络PC、小型计算机、大型计算机、包括以上系统或装置中任一种的分布式计算环境或本领域中已知的任何其它系统。
一般方法
分子生物学中的标准方法描述于Sambrook,Fritsch和Maniatis(1982&1989 2ndEdition,2001 3rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)中。标准方法也出现于Ausbel等(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。
描述了用于蛋白纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱法、电泳、离心和结晶(Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science,第1卷,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白质的糖基化(参见例如Coligan等(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wileyand Sons,Inc.,New York；Ausubel等(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；AmershamPharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan等(2001)Current Protcols inImmunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow and Lane(1999)UsingAntibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlowand Lane,同上)。用于表征配体/受体相互作用的标准技术是可得的(参见，例如Coligan等(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New York)。
可制备单克隆、多克隆和人源化抗体(参见，例如Sheperd和Dean(eds.)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann和Dubel(eds.)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow和Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,pp.139-243；Carpenter等(2000)J.Immunol.165:6205；He等(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等(1989)Nature 342:877-883；Foote和Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；美国专利No.6,329,511)。
人源化的一种替代方案是使用在噬菌体上展示的人抗体文库或在转基因小鼠中的人抗体文库(Vaughan等(1996)Nature Biotechnol.14:309-314；Barbas(1995)NatureMedicine 1:837-839；Mendez等(1997)Nature Genetics 15:146-156；Hoogenboom和Chames(2000)Immunol.Today 21:371-377；Barbas等(2001)Phage Display:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；Kay等(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,AcademicPress,San Diego,CA；de Bruin等(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。
描述了单链抗体和双体抗体(参见，例如Malecki等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:213-218；Conrath等(2001)J.Biol.Chem.276:7346-7350；Desmyter等(2001)J.Biol.Chem.276:26285-26290；Hudson和Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231:177-189；和美国专利No.4,946,778)。提供了双功能抗体(参见，例如Mack等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods248:7-15；Volkel等(2001)Protein Engineering 14:815-823；Segal等(2001)J.Immunol.Methods 248:1-6；Brennan等(1985)Science229:81-83；Raso等(1997)J.Biol.Chem.272:27623；Morrison(1985)Science 229:1202-1207；Traunecker等(1991)EMBO J.10:3655-3659；和美国专利No.5,932,448,5,532,210和6,129,914)。
还提供了双特异性抗体(参见，例如Azzoni等(1998)J.Immunol.161:3493；Kita等(1999)J.Immunol.162:6901；Merchant等(2000)J.Biol.Chem.74:9115；Pandey等(2000)J.Biol.Chem.275:38633；Zheng等(2001)J.Biol Chem.276:12999；Propst等(2000)J.Immunol.165:2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17:875)。
抗原的纯化不是抗体产生所必需的。动物可用携带目标抗原的细胞免疫。然后可以从免疫的动物分离脾细胞，且脾细胞可与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤(参见，例如Meyaard等(1997)Immunity7:283-290；Wright等(2000)Immunity 13:233-242；Preston等,同上；Kaithamana等(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。
抗体可与例如小药物分子、酶、脂质体、聚乙二醇(PEG)缀合。抗体可用于治疗、诊断、试剂盒或其它目的，且包括与例如染料、放射性同位素、酶或金属(例如胶态金)偶联的抗体(参见，例如Le Doussal等(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibellini等(1998)J.Immunol.160:3891-3898；Hsing和Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811；Everts等(2002)J.Immunol.168:883-889)。
用于流式细胞术的方法，包括荧光活化的细胞分选(FACS)，是可得的(参见，例如Owens等(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,JohnWiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,2nd ed.；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。用作例如诊断试剂的适用于修饰核酸(包括核酸引物和探针)、多肽和抗体的荧光试剂是可得的(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。
描述了免疫系统的组织学的标准方法(参见，例如Muller-Harmelink(ed.)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams和Wilkins,Phila,PA；Louis等(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
用于测定例如抗原性片段、前导序列、蛋白质折叠、功能结构域、糖基化位点和序列比对的软件包和数据库是可得的(参见，例如GenBank,Vector Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等(2000)Bioinformatics16:741-742；Menne等(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren等(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。
实施例1:免疫和抗-CD27抗体的选择
小鼠用CD27 cDNA的免疫
为产生抗-hCD27抗体，编码hCD27的全长开放阅读框的cDNA亚克隆到pCI-neo载体(Promega,Madison,WI)中。所获得的载体的表达通过pCI-neo-hCD27在CHO-K1细胞(American Type Culture Collection,Manassas,VA)中的瞬时转染和使用10μg/ml小鼠抗-hCD27 IgG1(BD Pharmingen#555439)，接着山羊抗-小鼠IgG1-FITC(1:100)(SouthernBiotechnology,Birmingham,AL)的流式细胞分析来检验。
小鼠通过按照制造商的说明书使用Helios基因枪(BioRad,Hercules,CA)和DNA包被的金弹(BioRad)的基因枪免疫来进行免疫。简言之，1μm金颗粒用2:1:1比率的pCI-neo-hCD27 cDNA及用于小鼠Flt3L和小鼠GM-CSF的商业表达载体(两者均来自Aldevron,Fargo,ND)包被。总共1μg的质粒DNA用于包被500μg的金颗粒。
具体地，7-8周龄雌性BALB/c小鼠在耳朵中用基因枪免疫，在两个耳朵中接受3轮的发射。近似地，1:4,000的抗-hCD27滴度在两次DNA免疫后在小鼠血清中通过细胞-ELISA检测到。在细胞-ELISA中，所有孵育步骤之后是PBST(具有0.01％ Tween 20的PBS)的洗涤步骤。亲本CHO-K1或CHO-K1.hCD27细胞接种(40,000细胞/孔)在细胞培养板中并在37℃下孵育过夜。第二天，移除培养基且细胞在37℃下用小鼠血清(的稀释液)孵育1小时。接着，细胞用PBST洗涤并在37℃下用1:1,000的山羊-抗-小鼠IgG-HRP(Southern Biotechnology,#1030-05)孵育1小时。
随后，细胞用PBST洗涤6次且抗-hCD27免疫反应性用100μl OptiEIA TMB底物(BDBiosciences,Franklin Lake,NJ)显现。反应用100μl 0.5M H2SO4停止且吸光度在460和620nm处读取。显示出针对hCD27的反应性的小鼠进行最终的第四次免疫并在四天后处死。
红细胞耗竭的脾细胞群体如之前所述制备(Steenbakkers等,1992,J.Immunol.Meth.152:69-77；Steenbakkers等,1994,Mol.Biol.Rep.19:125-134)并在-140℃下冷冻。
产生抗-hCD27抗体的B细胞的选择
为选择产生抗-hCD27抗体的B细胞克隆，1.5x 107个红细胞耗竭的脾细胞进行单核细胞的耗竭。hCD27-特异性B-细胞通过在4℃或37℃下结合在辐照(3,000RAD)的CHO-K1.hCD27转染体(其已经在T25烧瓶中生长到汇合)上进行选择。在充分洗涤以消除非特异性B-细胞后，按照制造商的说明书通过胰蛋白酶处理收集结合的B-细胞(Invitrogen,目录号25200-056)。接着，B-细胞如Steenbakkers等,1994,Mol.Biol.Rep.19:125-134所述进行培养。简言之，选择的B-细胞在96-孔平底组织培养板中与200μl DMEM F12/P/S/10％BCS最终体积中的7.5％(v/v)T-细胞上清液和50,000个辐照(2,500RAD)的EL-4B5哺育细胞混合。
在第八天，上清液如上所述通过细胞-ELISA筛选对于hCD27的反应性。另外，hCD27-反应性的上清液测试与CHO-K1细胞上表达的猕猴CD27(mmCD27)[猕猴CD27 GenbankAccession No.gi109095214]]的结合。在细胞-ELISA中，所有孵育步骤之后是PBST(具有0.01％ Tween 20的PBS)的洗涤步骤。亲本CHO-K1、CHO-K1.hCD27或CHO-K1.mmCD27细胞接种(40,000细胞/孔)在细胞培养板中并在37℃下孵育过夜。第二天，移除培养基且细胞在37℃下用B-细胞上清液(的稀释液)孵育1小时。接着，细胞用PBST洗涤并在37℃下用1:1,000的山羊-抗-小鼠IgG-HRP(Southern Biotechnology,#1030-05)孵育1小时。随后，细胞用PBST洗涤6次且抗-hCD27免疫反应性用100μl TMB Stabilized Chromagen(Invitrogen,目录号SB02)显现。反应用100μl 0.5M H2SO4停止且吸光度在460和620nm处读取。
随后，来自显示出与hCD27和mmCD27的结合的上清液的64个B-细胞克隆按照公布的程序通过微型电融合(mini-electrofusion)永生化(Steenbakkers等,1992,J.Immunol.Meth.152:69-77；Steenbakkers等,1994,Mol.Biol.Rep.19:125-34)。具体地，B-细胞与106个Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞混合，并且血清通过用DMEM F12培养基洗涤除去。细胞用Pronase溶液(Calbiochem,目录号4308070.536)处理3分钟并用ElectrofusionIsomolar缓冲液(Eppendorf,目录号53702)洗涤。电融合在50μl融合室中通过30s,2MHz,400V/cm的交流电场，接着10μs,3kV/cm的方形、高场脉冲和再次30s,2MHz,400V/cm的交流电场进行。
腔室的内容物转移到杂交瘤选择培养基并在有限稀释条件下接种于96-孔板中。在融合后的第8或9天，杂交瘤上清液如上所述筛选hCD27反应性。杂交瘤上清液如上所述在细胞-ELISA实验中测试与CHO-K1.mmCD27或表达hCD27(A59T)的CHO-K1细胞的结合。另外，杂交瘤上清液与抗体hCD27.15的交叉竞争使用均相时间分辨荧光(HTRF)分析进行研究。抗体hCD27.15已描述于WO2012/004367中，一种通过以保藏号PTA-11008保藏于ATCC的杂交瘤产生的且具有SEQ ID NO:3的VH区和SEQ ID NO:4的VL区(WO2012/004367中SEQ ID NO的引用)的抗体。在这一分析中，0.6nM生物素化hCD27.15用1.2nM rhCD27-Fc(R&D systems,382-CD-100)、1.33nM链霉亲和素-K(受体)和1.25nM抗-人Fc-D2(供体)一起孵育。添加上清液的系列稀释。与hCD27.15的交叉竞争导致从供体到受体的能量转移降低并表示为ΔF((比率665/615样品–比率665/615背景)/比率665/615背景，其中背景通过不添加rhCD27-Fc确定)。荧光在Victor2分光光度计(PerkinElmer)上在615和665nM下测量。
最后，杂交瘤上清液测试其触发CD27信号传导的能力。用hCD27-pcDNA和NF-κB-荧光素酶报道构建体共转染的HEK293T细胞暴露于杂交瘤上清液的系列稀释24小时。荧光素酶活性使用Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay系统(PerkinElmer,6016757)和Victor分光光度计(PerkinElmer)测量。
接着，46个杂交瘤选择用于通过单轮的有限稀释进行亚克隆。在筛选有限稀释上清液的CHO-K1.hCD27结合后，选择克隆用于冷冻和储存。如上所述，有限稀释上清液与CHO-K1.hCD27的结合、与hCD27.15的交叉竞争和NF-κB的刺激的进一步分析允许选择16个杂交瘤用于无血清的抗体产生。
实施例2:抗-hCD27抗体的纯化和表征
稳定的杂交瘤在无血清培养基中培养7天并收获上清液。抗体通过与Mab SelectSuRe Prot A树脂(GE Healthcare 17-5438)混合并按照制造商的说明书从Poly-prep色谱柱(BioRad 731-1550)洗脱来纯化。接着，抗体使用Zeba Spin Desalting Columns(LifeTechnologies 89889)脱盐并在PBS pH 7.4(Gibco)中重新缓冲和使用分光光度法定量。
纯化的抗体随后在一系列实验中表征。如上所述，它们结合CHO-K1.hCD27和CHO-K1.mmCD27的能力通过细胞-ELISA测定。也通过HTRF分析研究了是否它们显示出与hCD27.15的交叉竞争，且在NF-κB荧光素酶报告分析中研究了它们是否能够诱导CD27信号传导。另外，是否抗体具有对于原始人CD8+T-细胞的刺激性作用如下检验。未处理的原始CD8+T-细胞使用RosetteSep人CD8+T-细胞富集混合物(StemCell 15063)和Ficoll梯度离心从血沉棕黄层分离，接着是基本上按照制造商的说明书使用BD IMagTM人原始CD8+T-细胞富集试剂盒(BD目录号558569)的基于MACS的负向选择。分离的CD8+T-细胞通过使用抗-CD8和抗-CD45RA抗体的流式细胞分析检验纯度和幼稚性。接下来，它们以1.5x 105细胞/孔的浓度接种在96孔板中。细胞在系列稀释的纯化抗体的存在下用终浓度0.125μg/ml的可溶性抗-CD3 mAb(OKT-3)和终浓度1.0μg/ml的抗-CD28 mAb(Sanquin,克隆15E8)进行刺激。4天后，细胞的活力使用碘化丙啶(PI)测定且活化细胞的数量通过流式细胞术测定。
基于以上实验获得的结果，hCD27.131A抗体被选择用于进一步的分析。抗体hCD27.131A(或“小鼠亲本131A”)是具有SEQ ID NO:7的VH区和SEQ ID NO:8的VL区的小鼠抗体。
实施例3:抗体hCD27.15对hCD27(A59T)和mmCD27的亲和力
之前，激动性hCD27.15抗体如WO2012/004367中所描述的分离。hCD27.15经人源化以产生hCD27.15-6B(具有相同CDR区的来自WO2012/004367的hCD27.15的人源化形式，SEQID NO:24和25)和嵌合hCD27.15-c4(小鼠hCD27.15可变区和人IgG4恒定区，SEQ ID NO:22和23)。分别如图1和2中所示，hCD27.15抗体的这些形式不结合hCD27(A59T)中频繁出现的SNP且不结合食蟹猴CD27(本文中也称为MmCD27或猕猴CD27)。相反，抗体hCD27.131A被特别地选择为结合hCD27(A59T)中频繁出现的SNP和食蟹猴CD27两者。
实施例4:hCD27.131A抗体的人源化
小鼠hCD27.131A抗体使用说明书中描述的方法人源化。从小鼠hCD27.131A抗体，构建以下人源化可变重链：131AVH6、131AVH7、131AVH8、131AVH9(SEQ ID NO:10-13)；并构建以下人源化可变轻链：131AVL6、131AVL7、131AVL8、131AVL9(SEQ ID NO:15-18)。制备了具有人IgG1、IgG2或IgG4恒定区的抗体131AVH6VL6、131AVH6VL7、131AVH6VL8、131AVH7VL6、131AVH7VL7、131AVH7VL8、131AVH8VL6、131AVH8VL7、131AVH8VL8和131AVH9VL9。
实施例5:与细胞表面CD27结合
131AVH6VL6-hIgG1和131AVH6VL6-hIgG2抗体在CHO-EXP1细胞或HEK293EXP1细胞中表达。1F5 hIgG1(或者“1F5”或“1F5IgG1”具有US2011/0274685中1F5的可变区)在HEK293EXP1细胞中表达。纯化的抗体使用基于细胞的ELISA形式测定与表达人CD27的CHOK1细胞、表达人CD27 A59T的CHOK1细胞的结合，以及与表达恒河猴CD27的CHOK1细胞的交叉反应性。表达人CD27的CHOK1细胞、表达人CD27 A59T的CHOK1细胞和表达恒河猴CD27的CHOK1细胞接种在96-孔组织培养板中50μl的DMEM/F12,10％ BCS和庆大霉素(CHO-K1培养基)中。细胞在分析前两天以2x104细胞/孔或在分析前一天以4x104细胞/孔接种。培养基在分析前从孔移除，之后是mAb在100μL新鲜培养基中以10μg/mL的初始浓度和8步1:4的系列稀释的孵育。抗体在室温下孵育30-60分钟并采用细胞ELISA洗涤方案在Biotek EL405x SelectCW板洗涤器上用PBS/0.05％ Tween20洗涤3次。50微升的检测抗体(HRP-偶联的山羊抗-人IgG(Jackson,cat#109-036-098))以在CHO-K1培养基中的1:5000稀释添加并在室温下孵育30-60分钟。分析平板如上洗涤并用TMB显色和用TMB终止浓度(KPL cat#50-85-06)或0.1N磷酸停止。平板在Molecular Devices VersaMax读板仪上450nm/650nm下读数。滴定曲线用于确定半最大有效浓度(EC50)。
来自人类健康志愿者的血液作为Palo Alto志愿献血者计划的部分收集到含K2-EDTA(BD vacutainer,BD Biosciences,目录号367863)的管中。来自恒河猴的血液在Bioreclamation收集到含K2-EDTA(BD vacutainer,BD Biosciences,目录号367863)的管中，轻轻倒转，在4℃下储存，且在4℃下连夜运输到Merck Research Laboratories,PaloAlto,CA。在接收时，血液目视确认没有明确的裂解或凝结的迹象。一百微升的血液在黑暗中4℃下在具有表型抗体和所示浓度的测试或对照抗体的混合物的96-孔模块(Costar,目录号3960)中孵育30分钟。红细胞(RBCs)然后通过与1.7mL的氯化铵-钾红细胞裂解溶液(Life Technologies,目录号A10492-01)孵育5分钟来裂解。裂解步骤用2ml的ACK裂解溶液再重复一次，然后再次用300ml的ACK裂解溶液重复一次。细胞然后在添加1.7ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Hyclone,目录号SH30028.02)后洗涤。细胞然后重悬在包含0.1μL FixableViability Dye eFluor506(eBioscience,目录号65-0866-18)的100μL的PBS中并在黑暗中4℃下孵育30分钟。标记的细胞通过重悬在包含2％胎牛血清(SAFC,目录号12103C)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Hyclone,目录号SH30028.02)中的2mM EDTA(Life technologies,目录号15575-038)的2mL的染色缓冲液(SB)中洗涤，接着以1300rpm离心5分钟。洗涤步骤如所述的用SB重复，然后通过在黑暗中4℃下用PBS中的1％多聚甲醛(Electron MicroscopySciences,目录号15710)孵育15分钟进行固定。在SB中的最终洗涤后，使用高通量采样器将样品采集在LSR-Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)中，且数据通过FlowJo软件(TreeStar Inc)进行分析。
表3:131AVH6VL6-hIgG1和1F5-hIgG1与细胞表面CD27的结合
与转染的CHO细胞(cELISA)或原代T细胞(流式细胞术)上的细胞表面人CD27结合的EC50对于131AVH6VL6-hIgG1与1F5-hIgG1相比低大约4倍(表3)。
人源化131A-hIgG1和131A-hIgG4变体抗体在CHO-EXP1细胞或HEK293EXP1细胞中表达。纯化的抗体使用基于细胞的ELISA形式来测定与表达人CD27的CHOK1细胞的结合。表达人CD27的CHOK1细胞接种在96-孔组织培养板中50μl的DMEM/F12,10％BCS(小牛血清)(CHO-K1培养基)中。细胞在分析前两天以2x104细胞/孔或在分析前一天以4x104细胞/孔接种。培养基在分析前从孔移除，之后是mAb在100μL新鲜培养基中以10μg/mL的初始浓度和8步1:5的系列稀释(hIgG4抗体)或50μg/mL的初始浓度和8步1:5的系列稀释(hIgG1抗体)的孵育。抗体在室温下孵育30-60分钟并采用细胞ELISA洗涤方案在Biotek EL405x SelectCW平板洗涤器上用PBS/0.05％ Tween 20洗涤3次。50微升的检测抗体(HRP-偶联的山羊抗-人IgG(Southern Biotech,Cat#2014-05))在CHO-K1培养基中以1:2000的稀释添加并在室温下孵育30-60分钟。分析平板如上洗涤并用TMB显色和用TMB终止溶液(KPL cat#50-85-06)或0.1N磷酸停止。平板在Molecular Devices VersaMax Plus 384读板仪上450nm/650nm下读数。滴定曲线用于确定半最大有效浓度(EC50)。
表4:与细胞表面CD27的结合：人源化131A抗-CD27抗体
所有人源化131A-hIgG1和131A-hIgG4变体抗体对于与转染CHO细胞上的细胞表面人CD27的结合(cELISA)的EC50是在131AVH6VL6-hIgG1的EC50的2倍内(表4)，而对于1F5-hIgG1的EC50与131AVH6VL6-hIgG1相比高大约4倍(表3)。
来自人类健康志愿者的血液作为血沉棕黄层从Stanford血液中心获得，且外周血单核细胞(PBMCs)使用Ficoll-Plaque Plus(GE healthcare,#17-1440-03)通过密度离心分离。PBMC部分中保留的红细胞(RBCs)然后通过在室温下与2mL的氯化铵-钾(ACK)红细胞裂解溶液(Life Technologies,#A10492-01)孵育5分钟来裂解，然后在包含2％胎牛血清(SAFC,#12103C)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Hyclone,#SH30028.02)中的2mM EDTA(Lifetechnologies,#15575-038)的10mL染色缓冲液(SB)中洗涤，接着以300g离心5分钟。细胞然后使用Vicell自动细胞计数仪(Beckman Coulter#383556)计数，且2x105细胞/孔分布在U形底96孔平板中。细胞然后重悬在包含0.1μL Fixable Viability Dye eFluor506(eBioscience,#65-0866-18)的100μL PBS中并在黑暗中4℃下孵育30分钟。标记的细胞通过重悬在150ul的染色缓冲液(SB)中洗涤，接着以300g离心5分钟。细胞然后重悬在包含各种浓度的初级抗-CD27抗体的100ul SB中，在黑暗中4℃下孵育30分钟，之后是如前所述的洗涤和离心步骤。接下来，细胞用第二小鼠抗-人IgG1抗体，PE偶联的(Southern biotech#HP6001)染色以检测人源化抗-CD27克隆，或用驴抗-小鼠Alexa555(Thermofisher#A-31570)染色以检测亲本小鼠抗-CD27抗体。细胞在黑暗中4℃下孵育30分钟，之后是洗涤和离心步骤。接下来，细胞用表面标志物(CD3、CD4、CD8、CD11b)的表型抗体的混合物染色并在黑暗中4℃下孵育30分钟，之后是洗涤和离心步骤。最后，细胞通过在黑暗中4℃下用100ul的BD Cytofix(BD biosciences#554655)孵育10分钟进行固定，之后是洗涤和离心步骤。使用高通量采样器将样品采集在LSR-Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)中，且数据通过FlowJo软件(Tree Star Inc)进行分析。
表5:人源化131A抗-CD27抗体与人T细胞中的细胞表面CD27的结合
EC50＝半最大有效剂量；SD＝标准偏差；MFI＝平均荧光强度*来自外周血的T细胞上的流式细胞术MFI(N＝2供体)
所有人源化131A-hIgG1变体抗体对于与原代T细胞的结合(流式细胞术)具有与131AVH6VL6-hIgG1的EC50相当(10％以内)或更低的EC50(表5)，而对于1F5-hIgG1的EC50与131AVH6VL6-hIgG1相比高大约5-倍(表3)。
实施例6:抗-CD27抗体与人CD27重组蛋白的结合的亲和力测定
抗-人CD27抗体131AVH6VL6-hIgG1和131AVH6VL6-hIgG2的动态结合活性使用Biacore T200系统(Biacore,GE Healthcare,Piscataway,NJ)通过表面等离子体共振测量。大约400RU的人CD27-Fc融合蛋白、大约2000RU的人CD27 A59T-Fc融合蛋白或大约300RU的恒河猴CD27-Fc融合蛋白通过胺偶联化学固定在Series S CM5传感芯片(目录号BR-1005-30)上。HBS-EP+缓冲液(BR-1006-69)以50μL/min的流速用作运行缓冲液。不同浓度的131AVH6VL6-hIgG1和131AVH6VL6-hIgG2(范围为4.1nM至400nM)注射到抗原表面上。抗体注射持续180秒，且在注射后监测解离900秒。在每个注射周期后，抗原表面用30秒的3M MgCl2注射再生。
传感图(sensogram)通过减去来自空白表面的反应和来自缓冲液注射的反应进行“双重参考”并用于分析结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)以及平衡解离常数KD。所得数据集使用Biacore T200评价软件(版本2.0)与1:1Langmuir结合模型拟合。表6总结了抗-人CD27抗体对于人CD27-Fc融合蛋白、人CD27 A59T-Fc融合蛋白和恒河猴CD27-Fc融合蛋白的亲和力。
表6:使用BIAcore的抗-人CD27抗体与CD27抗原的亲和力的测量
表面等离子体共振(SPR)实验使用Biacore 4000系统(Biacore,GE Healthcare,Piscataway,NJ)进行以测定人源化抗-CD27.131A hIgG1和hIgG4变体对于His9G-标记的人和食蟹猴CD27重组蛋白(公开为SEQ ID NO:69的"His9G")(内部的HEK293细胞瞬时质粒转染)的动态结合活性。Series S CM5传感芯片(GE/Biacore,Cat#BR-1005-30)的表面按照制造商的实验方案通过小鼠抗-人IgG(Fc)抗体的胺偶联(人抗体捕获试剂盒，GE/Biacore,Cat#BR-1008-39)来制备，从而产生约9000RU的固定抗体。测定在25℃下过滤和脱气的HBS-EP+运行缓冲液，pH7.4(GE/Biacore,Cat#1006-69)中进行。抗-CD27.131A嵌合体和变体在10uL/分钟的流速下以6.6nM(1ug/ml)捕获120秒。用抗-人Fc抗体修饰但缺乏CD27抗体的流动池斑点用作参考。His9G-标记的人或食蟹猴CD27蛋白(公开为SEQ ID NO:69的"His9G")的五点2-倍稀释系列(3.13nM至50nM)在抗体表面上以30uL/分钟注射180秒(结合相)，接着600秒的缓冲液流动(解离相)。芯片表面用30秒的3M MgCl2注射再生。
数据通过减去来自空白表面的反应和来自缓冲液注射的反应进行双重参考并用于分析结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)以及平衡解离常数KD。所得数据集使用Biacore 4000BIA评价软件，版本1.0(GE/Biacore)与1:1Langmuir结合模型拟合。表7总结了人源化抗-CD27.131A hIgG1和hIgG4变体对人和食蟹猴CD27/His蛋白的亲和力。
表7:人源化抗-CD27.131A hIgG1和hIgG4变体与His9G-标记的人和食蟹猴CD27("His9G"公开为SEQ ID NO:69)的相互作用的亲和力数据
实施例7:131AVH6VL6-hIgG1与1F5-hIgG1相比在小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性
小鼠：B6.Cg-Cd27tm1(CD27)Jbo/Tac小鼠(huCD27KI小鼠)通过用人CD27基因的细胞外结构域交换小鼠CD27基因的细胞外结构域，之后与C56BL6/J背景回交直到1449SNP分析显示97.95％-98.99％的C57BL/6接受体基因组来产生。平均体重20.3克(范围17.5-23.5gm)的大约八到十二周龄雌性huCD27KI小鼠从在Taconic Laboratory(Germantown,NY)饲养的Merck繁殖集落获得。常规动物饲料和水自由进食。
抗体试剂：单克隆抗体作为冷冻(-80℃)的原液从内部来源获得。131AVH6VL6-hIgG1抗体和1F5-hIgG1通过重组细胞系产生。小鼠IgG2a同种型对照(同种型对照)从杂交瘤细胞培养物产生且对于传染性法氏囊病病毒VP2-4-3_GV是特异性的。
抗体试剂的配制：制剂缓冲液对于各抗体是特异性的以稳定蛋白质和防止沉淀。制剂如下：同种型对照：20mM乙酸钠，9％蔗糖，pH 5.5；131AVH6VL6-hIgG1：20mM乙酸钠，9％蔗糖，pH 5.5；1F5-hIgG1：10mM磷酸钠+75mM NaCl+3％蔗糖，pH 7.4。
肿瘤细胞系制备和植入：MC38是源自C57BL6/J小鼠结肠腺癌的细胞系。来自冷冻原液的MC38细胞在37℃下空气中的5％ CO2气氛中作为单层培养物在补充10％胎牛血清(Hyclone Cat.SH30088.03)的DMEM培养基(Cellgro Cat.10-013CV)中体外维持。1x106个对数期和亚汇合的MC38细胞在100μL体积的DMEM基础培养基中皮下(SC)注射到各小鼠的右背侧中。小鼠首先用电推剪在将用于植入物的区域中剃毛。
肿瘤测量和体重：肿瘤在第一剂量前一天和其后一周两次测量。肿瘤长度和宽度使用电子卡尺测量且肿瘤体积使用公式体积(mm3)＝0.5x长度x宽度2确定，其中长度是较长维度。小鼠定期称重以监测总体健康。在治疗前，小鼠称重且测量个体小鼠的肿瘤。为防止偏差，除去体重或肿瘤体积的任何离群值且剩余的小鼠分配到具有等同的平均肿瘤尺寸的治疗组中。当携带MC38肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积达到～85mm3(范围70-100mm3)，植入后大约5天时，开始给药。动物如下所述施用抗体。
给药溶液制备、施用和分析：待在动物模型中测试的抗体的冷冻原液解冻并转移到冰上。为避免重复的冷冻解冻，各小瓶原液解冻一次并储存在4℃下。一旦解冻，抗体在一个月内使用。在每次给药前，各抗体的原液溶液在适宜的稀释剂中稀释到标示浓度并立即给药。等份的给药溶液在干冰中急冻并在-80℃下储存直到分析。给药溶液使用Meso ScaleDiscovery(Rockville,MD)平台评价，其是基于多阵列技术；电化学发光检测和模式化阵列的组合。
给药和结果：携带MC38肿瘤的huCD27敲入小鼠每3-4天以5mg/kg剂量，IP施用131AVH6VL6-hIgG1、1F5-hIgG1或同种型对照，总共7个剂量。在给药后，动物持续监测且肿瘤体积一周两次测量，如通过图4中显示的结果证明的，131AVH6VL6-hIgG1的抗-肿瘤反应大于1F5-hIgG1的抗-肿瘤反应。
实施例8:131AVH6VL6-hIgG1与抗-PD-1抗体组合在小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性
小鼠：平均体重21.21克(范围18.06-23.21克)的大约十到十三周龄雌性B6.Cg-Cd27tm1(CD27)Jbo/Tac(huCD27KI)小鼠从在Taconic Laboratory(Germantown,NY)饲养的繁殖集落获得。常规动物饲料和水自由进食。
抗体试剂:单克隆抗体作为冷冻(-80℃)的原液从内部来源获得。131AVH6VL6-hIgG1和抗-鼠PD-1小鼠IgG1抗体(muDX400)通过重组细胞系产生。同种型对照是对于传染性法氏囊病病毒VP2-4-3_GV特异性的小鼠IgG2a且由杂交瘤细胞培养物产生。
抗体试剂的配制：所有抗体在20mM乙酸钠，9％蔗糖，pH 5.5中配制以稳定蛋白质和防止沉淀。
肿瘤细胞系制备和植入：MB49是源自C57BL6/J小鼠膀胱癌的肿瘤细胞系。来自冷冻原液的MB49细胞在37℃下空气中的5％ CO2气氛中作为单层培养物在补充10％胎牛血清(Hyclone Cat.SH30088.03)的DMEM培养基(Cellgro Cat.10-013CV)中体外维持。5x105个对数期和亚汇合的MB49细胞在100μL体积的DMEM基础培养基中皮下(SC)注射到各小鼠的右背侧中。小鼠首先用电推剪在将用于植入物的区域中剃毛。
肿瘤测量和体重：肿瘤在第一剂量前一天和其后一周两次测量。肿瘤长度和宽度使用电子卡尺测量且肿瘤体积使用公式体积(mm3)＝0.5x长度x宽度2确定，其中长度是较长维度。小鼠定期称重以监测总体健康。在治疗前，小鼠称重且测量个体小鼠的肿瘤。为防止偏差，除去体重或肿瘤体积的任何离群值且剩余的小鼠分配到具有等同的平均肿瘤尺寸的治疗组中。当携带MB49肿瘤的小鼠的平均肿瘤体积达到～91.56mm3(范围80.94-102.89mm3)，植入后大约7天时，开始给药。动物如下所述施用抗体。
给药溶液制备、施用和分析：待在动物模型中测试的抗体的冷冻原液解冻并转移到冰上。为避免重复的冷冻解冻，各小瓶原液解冻一次且等分试样制备成足够一次使用的体积。聚丙烯、低粘附管用于这一目的。等分试样在干冰中急冻并在-80℃下储存。在每次给药前，一个等分试样解冻并在适宜的稀释剂中稀释到标示浓度和立即给药。等份的给药溶液在干冰中急冻并在-80℃下储存直到分析。给药溶液使用Meso Scale Discovery(Rockville,MD)平台评价，其是基于多阵列技术；电化学发光检测和模式化阵列的组合。
给药和结果：携带MB49肿瘤的huCD27 KI小鼠每3-4天以5mg/kg剂量，IP施用131AVH6VL6-hIgG1、muDX400、131AVH6VL6-hIgG1+muDX400或同种型对照。131AVH6VL6-hIgG1每3-4天施用，总共6个剂量。muDX400每周施用，总共4个剂量。在给药后，动物持续监测且肿瘤体积一周两次测量，如通过图4中显示的结果证明的，对于单独的131AVH6VL6-hIgG1或muDX400具有最小的抗-肿瘤反应，然而使用131AVH6VL6-hIgG1+muDX400的组合疗法导致显著增强的抗-肿瘤效能。
实施例9:NF-κB激活分析
细胞:包含NF-κB-荧光素酶报告构建体(pNiFty2-Luc,Invivogen)的HEK293FT人胚肾细胞之前通过使用Zeocin药物选择的稳定转染方法产生(293FT-NF--荧光素酶细胞)。
细胞培养物：293FT--荧光素酶细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清(Hyclone)、1X Pen/strep/谷氨酰胺(Cellgro)和200ug/mL Zeocin(Life Technologies)的DMEM+2mM谷氨酰胺(Cellgro)中生长。
抗体：hCD27.131A IgG1和IgG4抗体通过在CHO-EXPI或293-EXPI细胞中的瞬时表达产生。1F5 IgG1通过在293-EXPI细胞中的瞬时表达产生。hCD27.15-4B IgG4通过在CHO细胞中的稳定表达产生。所有抗体通过标准的蛋白A方法纯化。
转染：编码人CD27 WT(序列参考:NP_001233)、人CD27变体p.Ala59Thr(“A59T”,等位基因频率:0.2,序列参考:rs25680)或恒河猴/食蟹猴CD27(序列参考:XP_001104337.1/XP_005569963.1)的蛋白质的全长cDNA克隆到pCI-neo表达载体中。CD27质粒使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)瞬时转染到293FT--荧光素酶细胞中。流式细胞分析用于确认所有CD27构建体的表面表达。
使用抗体的刺激：CD27构建体的瞬时转染后大约16-20h，细胞用CellDissociation缓冲液(Millipore)或TyrpLE Express(Life)收获，计数并在Opti-MEM(LifeTechnologies)中以5,000-10,000细胞每孔重新接种到96-孔透明底发光板(Corning)中和允许在37℃下静止/粘附30-180分钟，之后是可溶性抗-CD27抗体的刺激。可溶性抗-hCD27hCD27.131A IgG1或hCD27.131A IgG4(最高剂量10μg/ml)、1F5IgG1(最高剂量10μg/ml)和hCD27.15-4B IgG4(最高剂量160μg/ml)抗体然后一式三份如所示的以4倍或10倍稀释系列添加到细胞，细胞在37℃下孵育16-20小时。
NF-κB活性的测定：在37℃下用抗体孵育16-20h后，细胞在添加Bright-Glo(Promega)之前在室温下静止5分钟。平板然后避光和在Luminometer/Luminescence读板仪(Molecular Device-LJL BioSystem或Envision system)上分析之前在室温下孵育10分钟。抗体的倍数变化值基于无抗体的条件计算。倍数变化值对于剂量反应用于使用GraphPad Prism软件应用的非线性曲线拟合[模型：log(激动剂)vs.反应–无施加的约束的可变斜率(四参数)]。
比较CD27同种型的可溶性活性，hCD27.131A VH6VL6 huIgG1在所有同种型中显示出诱导NF-κB活性的最高潜力(图6)。hCD27.131A VH6VL6 huIgG1显示出与WT和A59T人CD27相当的效力(平均EC50分别为2.22和4.72nM)，并且对于恒河猴CD27具有约强7倍的效力(平均0.29nM)(表8)。相反，1F5 huIgG1以可溶形式不是始终活性的，且因此不能计算1F5huIgG1的EC50值(图6)。
hCD27.15-4B IgG4(来自WO2012/004367的具有相同CDR区的hCD27.15的人源化形式，SEQ ID NO：41和42)始终显示针对表达hCD27 WT的细胞的活性，但不显示针对表达CD27A59T或表达恒河猴CD27的细胞的活性。这表明hCD27.15-4B对以20％的频率全球存在的CD27的A59T等位基因不具有活性。对于亲本hCD27.15克隆观察到相同的趋势(数据未显示)。此外，与hCD27.131AVH6VL6-huIgG1相比，hCD27.15-4B IgG4 mAb在诱导NF-κB活性方面效力较低。在这些实验中，即使在160μg/ml的剂量下，hCD27.15-4B IgG4也不诱导NF-κB信号传导的平台，因此EC50值是不可计算的。表9显示了在单一2.5μg/ml浓度下NF-κB激活的倍数变化值，以说明在较低剂量下的活性差异。例如，在WT CD27表达细胞中2.5μg/ml时，hCD27.131A VH6VL6 huIgG1相对于hCD27.15-4B IgG4(平均倍数变化：2.52±.45对1.82±.38，配对t检验p-值：0.01)或相对于1F5 huIgG1(倍数变化：1.34±.29，p-值：0.001)显示出较高的效力。总之，这些数据表明hCD27.131A VH6VL6huIgG1显示出针对WT CD27和CD27的A59T次要变体等位基因以及恒河猴CD27的明显NF-κB荧光素酶活性，并说明hCD27.131A VH6VL6 huIgG1如何显示出相对于1F5 huIgG1的更高活性和相对于hCD27.15-4B IgG4的更有效活性。
测试了几种人源化hCD27.131A变体的CD27诱导的NF-κB荧光素酶活性(图7)。所有人源化变体显示出比1F5 IgG1更高的活性。嵌合小鼠-人hCD27.131A抗体的直接比较显示嵌合huIgG1或huIgG4框架对NF-κB荧光素酶活性的类似激活(图7A)。总体而言，所有人源化hCD27.131A huIgG1变体表现得彼此相似，显示出相对于1F5huIgG1明显更高的NF-κB荧光素酶活性(10μg/ml中值倍数变化：5.32对2.23，图7A)。类似地，所有人源化hCD27.131AIgG4变体相对于1F5 huIgG1显示出更高的活性(10μg/ml中值倍数变化：3.06对1.73)，在单个131A IgG4抗体之间观察到较大的活性范围(图7B)。
表8:hCD27.131A VH6VL6 huIgG1、1F5 huIgG1、hCD27.15-4B IgG4在NF-κB-荧光素酶报告分析中的生物活性：基于拟合剂量反应曲线的EC50和Emax值。
表9:hCD27.131A VH6VL6 huIgG1、1F5 huIgG1、hCD27.15-4B IgG4在NF-κB-荧光素酶报告分析中的生物活性：2.5μg/ml下的倍数变化值。
实施例10:原代人和恒河猴T细胞共刺激分析中的生物活性
使用RosetteSep人CD8+T细胞富集混合物(StemCell Technologies,Vancouver,Canada)根据制造商的说明从血沉棕黄层获得富集的人CD8+T细胞。简言之，将血沉棕黄层与用PBS+2％FBS稀释的抗体混合物一起孵育，然后在浮力密度介质Ficoll-Paque Plus(GEHealthcare,United Kingdom)上离心以将不需要的细胞与RBC一起沉淀。然后从血浆和密度介质界面移除富集的CD8+T细胞，充分洗涤并用ACK裂解缓冲液(Thermo Fisher,MA,USA)裂解。通过使用人幼稚CD8+T细胞富集组(BD Biosciences,CA,USA)进一步处理样品来分离原始CD8+T细胞。细胞新鲜使用或冷冻用于未来的实验。
对于激活分析，将原始CD8+细胞在DMEM-F12(Gibco,CA,USA)，5％热灭活的人血清(Sigma,MO,USA)，50μM 2-巯基乙醇(Sigma,MO,USA)，100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素(Lonza,Switzerland)中重悬浮至7.5×105个细胞/ml。1.5×105个细胞在亚最佳剂量的αCD3(0.025-0.05μg/ml克隆OKT3，Biolegend，CA，USA)和αCD28(1μg/ml克隆15E8，CellSciences，MA，USA)存在下，在37℃，5％CO2培养箱中，在平底96孔板中使用单独的可溶性131AVH6VL6-hIgG1、1F5-hIgG1、同种型或抗-CD3/抗-CD28培养3天。刺激后，用PBS洗涤细胞，然后用可固定的活力染料(eBioscience,CA,USA)在4℃下染色30分钟。通过洗涤除去过量的染料，并用TruStain FcX(Biolegend,CA,USA)封闭细胞。然后将细胞与表型抗体(FITC小鼠抗-人CD69(克隆FN50 FN50,BD Biosciences,CA,USA)、PE/CF594小鼠抗-人CD4(克隆L200,BD Biosciences,CA,USA)、PE/Cy7小鼠抗-人CD25(克隆M-A251,BD Biosciences,CA,USA)和Pacific Blue小鼠抗-人CD3(克隆SP34-2,BD Biosciences,CA,USA)和APC/Cy7小鼠抗-人CD8a(克隆RPA-T8,Biolegend,CA,USA))在4℃孵育下30分钟，然后洗涤并用1％多聚甲醛固定。在BD LSRFortessaTM(BD Biosciences,CA,USA)上对于表面标志物CD25和CD69通过流式细胞术测量T细胞的激活。通过作为CD25+CD69+的％CD8+T细胞测量CD8+T细胞激活。
131AVH6VL6-hIgG1以可溶性形式在原代CD8+T细胞分析中有活性(相对于同种型对照平均2.3-倍提高)，而1F5-hIgG1没有(图14)。
表10
实施例11:原代人肿瘤培养物中的活性
来自非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)和头颈癌(H&N)患者的人肿瘤样本是根据州和联邦法规从商业供应商处获得的。
人肿瘤的消化以产生混合肿瘤TIL
在手术部位收集新鲜肿瘤组织，并在AQIX培养基(AQIX,UK)中在4℃下连夜运送至Merck Research Laboratories,Palo Alto,CA。通过用手术刀精细切割从肿瘤解离单细胞，然后在37℃下在具有100mg/mL I型胶原酶(Invitrogen,cat#17100-017)和10,000U/mLDNase I(Worthington Biochemical,cat#LS002060)的含10mL Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Cellgro,cat#10-013-CV)的消化培养基中孵育30分钟。将消化的样品上下吸打数次，通过70-μM过滤器过滤，并在DMEM完全培养基中洗涤。如果细胞活力小于30％，则进行Ficoll密度梯度分离以富集活细胞。将来自肿瘤消化的混合细胞应用于1000×g的FicollPaque Plus(GE Healthcare,Cat#17-1440-03)密度梯度离心20分钟。从培养基:Ficoll界面收集富集的活细胞，并用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤2次。
肿瘤TIL培养物上清液中针对肿瘤浸润T细胞激活的IFNγ检测
总共0.1×106/孔的肿瘤消化细胞在96孔圆底板中培养，并在指定浓度的131AVH6VL6-hIgG1(CHO-EXPI细胞-悬浮培养物的瞬时质粒转染)、抗-PD1(派姆单抗)或hCD27.15-4BIgG4、IF5-hIgG1或同种型(抗-PCSK9，IgG1和IgG4)存在下用10ng/ml可溶性抗-CD3(BioLegend,克隆OKT3,cat#371304)进行刺激。在第6天收集上清液，并使用人IFNγ组织培养试剂盒(MSD,cat#K151AEB)测量IFNγ。
由于CD27在原始T细胞以及记忆T细胞上表达，我们假设131AVH6VL6-hIgG1在肿瘤浸润记忆T细胞中具有共刺激作用。为了评估131AVH6VL6-hIgG1在人肿瘤免疫抑制环境中激活T细胞的能力，我们使用来自人肿瘤消化的混合细胞群体进行实验。在10ng/ml抗-CD3存在下，将131AVH6VL6-hIgG1 0.1、1、10和20μg/ml加入单一消化肿瘤组织细胞培养物中6天。在6天的上清液中测量IFNγ。来自20个肿瘤的结果显示在图8中。131AVH6VL6-hIgG1以剂量依赖性方式增强抗-CD3诱导的人肿瘤TIL的IFNγ产生，在10和20μg/ml下具有统计学显著的变化(分别p<0.001和p<0.01)。131AVH6VL6-hIgG1还通过在来自13个肿瘤的TIL IFNγ产生测定中与两种其他抗-CD27mAb，h27.15-4BIgG4和IF5-IgG1进行比较来研究(图9)。131AVH6VL6-hIgG1是显示抗-CD3诱导的IFNγ产生的统计学显著增加的唯一mAb(p<0.05)。
实施例12:用于鉴定抗-CD27抗体的表位的丙氨酸扫描
使用CHO-K1细胞，瞬时转染的pCI-neo空载体、pCI-neo.hCD27和几种pCI-neo.CD27Ala突变构建体测定几种抗-hCD27抗体与一系列hCD27丙氨酸突变体结合的能力。根据制造商的说明，转染在含有每孔4μg质粒DNA和10μl Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen,11668-019)的6孔板中进行，其均在OPTI-MEMI(Gibco,cat.no.31985)中稀释。
在将转染的细胞在37℃和5％CO2下在潮湿的培养箱中孵育一天后，将它们在DPBS中洗涤一次，用400μl无酶细胞解离溶液(Gibco,13151-014)脱离并收集在800μl冰冷的MACS缓冲液(Miltenyi Biotec,130-091-221)中。将脱离的细胞以约1.2×105个细胞/孔转移到96孔圆底孔板中。在离心细胞后，弃去上清液并将细胞重悬在剩余体积中，加入初级抗体并在4℃下孵育30分钟。用DPBS/BSA 1％洗涤细胞三次，然后离心，弃去上清液并重悬在剩余体积中。通过在4℃下用山羊抗-小鼠IgG-FITC(BD Bioscience,349031,2μl/孔)或山羊抗-人IgG-FITC(γ-链特异性的)(SouthernBiotech,2040-02,2μl/孔)染色30分钟来检测初级抗体的结合。洗涤一次后，使用HTS读板仪(FACS Canto II)检测抗体结合和将FlowJo软件用于数据分析。碎片、死细胞和双重峰被排除在分析之外。结合表示为相对于与hCD27结合的抗体(其设定为100％)的FITC信号的几何平均值。
如图10所示，使氨基酸P8、H36、R37和K38突变导致小鼠hCD27.131A与hCD27的结合的丧失，如暗阴影所示。hCD27.131A显示与hCD27.15、1A4和1F5IgG1不同的结合特征。
实施例13:CD27和131AVH6VL6-hIgG1通过X-射线晶体结构的表位作图
复合物形成和纯化：
通过在4℃下分别以2:1的06AOV(CD27)和01APN(Fab)的摩尔比孵育48小时来形成CD27/131AVH6VL6Fab复合物。然后将反应混合物加载到Superdex 200HiLoad 16/600(120mL)柱上，并且级分基于SEC-UPLC分析合并。然后将复合物集合针对25mM Tris，100mMNaCl，pH 8.0透析。将透析的材料离心并在22um注射器过滤器上过滤。
CD27+Fab结晶过程
通过将6.25uL的40mM氯化镉原液加入到由25mM Tris pH＝8.0和100mM氯化钠组成的缓冲液中的25μL等份的CD27-Fab复合物中来制备用于结晶的样品。最终样品蛋白质浓度为12.6mg/ml，且氯化镉浓度为8.0mM。在设置之前将样品在室温下保持约1小时。
使用Topaz自由界面扩散微流体系统、Topaz 4.96芯片(Fluidigm)和市售筛网(screen)进行初始筛选。将芯片置于室温下，然后保持在18℃下。选择以下条件用于转化为蒸汽扩散系统：
筛网：Rigaku Wizard Cryo 1-2(Cat#1008649)
条件：0.1M咪唑pH＝8.0+40％v/v PEG 400
筛网：Jena Bioscience Classic HTS1(Cat#CS-201L)
条件：0.1M Tris pH＝8.5+30％v/v PEG 3000+0.2M硫酸锂
使用坐滴蒸气扩散法制备用于X射线衍射研究的晶体。使用Formulator(Formulatrix)分配由100mM Tris pH 8.0-8.5和PEG 40030-50％v/v组成的板孔条件。在室温下使用Oryx4(Douglas Instruments)分配由等体积的孔和蛋白质(0.22uL+0.22uL)组成的液滴，随后保持在18℃下。晶体在一个月时间内生长。
也通过加入在由100mM Tris pH＝8.5和40％v/v PEG 400组成的缓冲液中制备的种子原液产生晶体。在室温下使用Oryx4(Douglas Instruments)分配由0.30uL蛋白质+0.20uL孔+0.1uL种子原液组成的液滴，和随后保持在18℃下。晶体在一个月时间内生长。
晶体收获和数据收集
使用0.3mm筛网Litholoop(Molecular Dimensions Ltd,Suffold,UK)从结晶液滴收获来自结晶试验#4482液滴F1的晶体，并在液氮中冷冻。数据收集在Argonne NationalLaboratory(ANL,Lemont,IL)的Advanced Photon Source(APS)的第17区，IndustrialMacromolecular Crystallography Association(IMCA)束线进行。使用Pilatus 6M检测器(Dectris AG,Baden-Switzerland)在/>的波长下收集数据。使用autoPROC自动化处理软件处理数据，调用XDS进行索引和积分，AIMLESS用于缩放，POINTLESS用于数据分析和STARANISO用于应用各向异性衍射极限。晶体晶胞参数是a＝114.20,b＝126.10,c＝131.600,α＝90°,β＝90°,γ＝90°,空间群C222(1)。
结构阐明和优化
使用MOLREP程序通过Molecular Replacement解析结构。PDB条目2XTJ和5TLS分别用作Fab和抗原的搜索探针。使用默认参数，首先定位VH+VL区域(Rf/sigma＝7.91,TF/sigma＝10.83)，然后使用可变区作为平移的固定输入模型定位CH1+CL片段(Rf/sigma＝11.56,TF/sigma＝23.70)。然而，在这个阶段，抗原不能明确地放置(最佳“解”Rf＝4.73,Tf/sigma＝3.77)。然后使用autoBUSTER软件对模型进行优化。虽然Rfree和Rwork的值很高(分别为41.4％和38.4％)，但电子密度图显示与用作探针的Fab和最终结构之间的大多数序列置换和插入或缺失的一致性。这些使用程序COOT进行校正。用autoBUSTER再次对所得结构进行优化至Rfree和Rwork分别为34.3％和30.8％。使用该模型作为固定坐标再次尝试分子置换，这导致对转换函数的明确解(TF/sigma＝17.67)。重建和优化的附加步骤分别导致22.4％和20.0％的最终Rfree和Rwork值。最终模型含有CD27残基6至88和94至100，Fab轻链残基1至212，Fab重链残基1至131和137至217，6个镉阳离子，一个PEG 400分子和288个水。未发现有序的糖基化位点。
Fab-抗原相互作用的分析
下表列出了Fab和抗原之间的所有接触(H键为粗体“H”，盐桥为粗体斜体(“SB”)，的截止值用于极性相互作用)：
表11
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除了许多范德瓦尔斯接触外，界面还涉及几个H键和盐桥。互补位涉及来自每个轻链和重链的所有3个互补决定区(CDR)。然而，表位限于第一富含半胱氨酸结构域(CRD)。除了N-末端附近的区段，残基8至11和残基17，所有接触都用残基34至38形成(参见图11和12)。在形成抗原-抗体复合物时包埋的表面的总量分别为CD27和Fab溶剂可及表面的和/>(参见图11)。
实施例14:抗-CD27抗体对于与hCD27结合的竞争研究
将稳定表达hCD27的CHO-K1细胞以4×104个细胞/孔接种于96孔板(Nunc,167008)中，并在潮湿的培养箱中于37℃和5％CO2下孵育。抗-hCD27抗体的系列稀释允许在37℃和5％CO2下结合2小时。接下来，以固定浓度添加第二抗-hCD27抗体，并在37℃和5％CO2下孵育1小时。使用ELx405 BioTEK洗涤器在DPBS/0.05％Tween中洗涤细胞三次。通过添加山羊抗-人-IgG-HRP(Jackson Immuno Research,109-035-088,1:1000稀释)或山羊抗-小鼠-IgG-HRP(Southern Biotech,1030-05,1:5000稀释)检测以固定浓度添加的抗-hCD27抗体的结合。如上所述，将平板在37℃和5％CO2下孵育1小时并洗涤三次。加入TMB稳定生色原(Invitrogen,SB02)并将细胞在室温下孵育约10分钟。通过加入等体积的0.5M H2SO4终止反应。最后，使用iEMS Reader MF(Labsystems)或Envision读板仪(Perkin Elmer)测量460和620nm处的吸光度。
为了确定小鼠hCD27.131A和小鼠hCD27.15是否能够与1F5IgG1交叉竞争结合hCD27，进行基于细胞的竞争ELISA。使1F5IgG1的系列稀释与CHO-K1细胞上表达的hCD27结合。接下来，检测小鼠hCD27.131A或小鼠hCD27.15的结合。还进行了反向实验，其中使小鼠hCD27.131A或小鼠hCD27.15的系列稀释结合，然后检测1F5IgG1的结合。如图13所示，小鼠hCD27.131A不干扰1F5IgG1的结合，表明这两种抗体结合hCD27上的不同表位。对于小鼠hCD27.15获得了类似数据，其显示不与1F5IgG1竞争结合hCD27。只有当允许1F5IgG1首先结合时，才能在高浓度下观察到小鼠hCD27.15结合的中度丧失。
本申请要求美国临时申请No.62/399,837和美国临时申请No.62/546,214的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。本文引用的所有参考文献均以引用方式并入，其程度如同每个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利被具体和单独地指明通过引用并入。根据37C.F.R.§1.57(b)(1)，申请人打算以引用方式并入本声明，以涉及每个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，其每个都根据37C.F.R.§1.57(b)(2)明确确认，即使此类引用不是与专门的通过引用并入的声明直接相邻。在说明书中包括专门的通过引用并入的声明(如果有的话)并不以任何方式削弱通过引用并入的一般性声明。本文对参考文献的引用并非旨在承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文献的内容或日期的任何承认。如果参考文献提供了与本说明书中提供的定义冲突的要求保护术语的定义，则本说明书中提供的定义应用于解释要求保护的发明。
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述和附图中变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
前述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施本发明。除了本文所示和所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述中变得显而易见，并且落入所附权利要求的范围内。
表12:序列信息
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表13.示例性PD-1抗体序列
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表14：来自131AVH6VL6Fab和CD27复合物的晶体结构的结构坐标(表格按照出现的顺序分别公开了SEQ ID No:70-74)
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Claims (32)

1.一种结合人CD27的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
a.氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1，其中X1＝M；
b.氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2，其中X1＝N，X2＝T，X3＝N和X4＝T；
c.氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3，其中X1＝M；
d.氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区CDR1，其中X1＝M；
e.氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的轻链可变区CDR2，其中X1＝D和X2＝T；和
f.氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区CDR3，其中X1＝W，X2＝N和X3＝S。
2.如权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:10-12的重链可变区和选自SEQ ID NO:15-17的轻链可变区；或者所述抗体或其抗原结合片段包含选自SEQ ID NO:13的重链可变区和选自SEQ ID NO:18的轻链可变区。
3.如权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区。
4.如权利要求1-3任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其片段具有以下特征中的至少一种：
a)在细胞ELISA分析中以小于100pM的EC50结合人CD27；
b)在细胞ELISA分析中以小于150pM的EC50结合人CD27(A59T)；和
c)在细胞ELISA分析中以小于100pM的EC50结合恒河猴CD27。
5.如权利要求1-3任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其片段具有以下特征中的至少一种：
a)以约5-10nM的二价KD值结合人CD27和人CD27(A59T)，如通过表面等离子体共振测定的；
b)在细胞ELISA分析中以小于200pM的EC50结合人CD27；
c)在细胞ELISA分析中以小于250pM的EC50结合人CD27(A59T)；
d)在细胞ELISA分析中以小于150pM的EC50结合恒河猴CD27；
e)与食蟹猴或恒河猴CD27交叉反应；
f)阻断人CD27与人CD70的结合；和
g)增加T细胞激活。
6.如权利要求1-3任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其片段具有以下特征中的至少一种：
a)当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以小于5nM的EC50在表达人CD27的细胞中诱导NF-κB激活；
b)当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以小于10nM的EC50在表达人CD27A59T的细胞中诱导NF-κB激活；
c)当所述抗体或其片段为可溶性形式时，以小于1nM的EC50在表达恒河猴CD27的细胞中诱导NF-κB激活；
d)对于与CD8+或CD4+ T细胞上的人CD27的结合具有小于0.5nM的EC50；
e)以可溶性形式增加CD8+ T细胞激活；和
f)在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。
7.一种结合人CD27的抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO:10的重链可变区和SEQ ID NO:15的轻链可变区。
8.如权利要求7的抗体或其抗原结合片段，其以可溶性形式增加CD8+ T细胞激活；或在人肿瘤培养物中增加抗-CD3诱导的IFNγ产生。
9.如权利要求1-3和7-8任一项的抗体或其抗原结合片段，其是包含两条重链和两条轻链的人源化抗体，且是IgG。
10.如权利要求1-3和7-8任一项的抗体或抗原结合片段，其是IgG1同种型的抗体。
11.如权利要求1-3和7-8任一项的抗体或抗原结合片段，其是IgG4同种型的抗体。
12.如权利要求1-3和7-8任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含SEQ IDNO:30的重链恒定域。
13.如权利要求1-3和7-8任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含SEQ IDNO:28的重链恒定域。
14.一种结合人CD27的抗体，其由两条轻链和两条重链组成，其中各轻链由SEQ ID NO:36组成；和各重链由SEQ ID NO:37组成。
15.如权利要求1-3、7-8和14任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含哺乳动物细胞的表达特征性的糖基化模式。
16.如权利要求1-3、7-8和14任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含CHO细胞的表达特征性的糖基化模式。
17.一种分离的核酸，其编码：权利要求1-14任一项的抗体或抗原结合片段。
18.一种分离的核酸，其包含SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47，其中所述分离的核酸编码结合人CD27的抗体或抗原结合片段。
19.一种表达载体，其包含权利要求17或18的分离的核酸。
20.一种宿主细胞，其包含权利要求1-16任一项的抗体或抗原结合片段、权利要求17或18的分离的核酸或权利要求19的表达载体，其中所述宿主细胞是细菌细胞、哺乳动物细胞或毕赤酵母属细胞。
21.如权利要求20的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
22.如权利要求20的宿主细胞，其中所述宿主细胞是HEK293细胞或中国仓鼠卵巢细胞。
23.一种组合物，其包含权利要求1-16任一项的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体或稀释剂。
24.如权利要求23的组合物，还包含选自以下的药剂：
a.抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；
b.抗-TIGIT抗体或其抗原结合片段；
c.抗-VISTA抗体或其抗原结合片段；
d.抗-BTLA抗体或其抗原结合片段；
e.抗-TIM3抗体或其抗原结合片段；
f.抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段；
g.抗-HVEM抗体或其抗原结合片段；
h.抗-CD70抗体或其抗原结合片段；
i.抗-OX40抗体或其抗原结合片段；
j.抗-CD28抗体或其抗原结合片段；
k.抗-PD1抗体或其抗原结合片段；
l.抗-PDL1抗体或其抗原结合片段；
m.抗-PDL2抗体或其抗原结合片段；
n.抗-GITR抗体或其抗原结合片段；
o.抗-ICOS抗体或其抗原结合片段；
p.抗-SIRPα抗体或其抗原结合片段；
q.抗-ILT2抗体或其抗原结合片段；
r.抗-ILT3抗体或其抗原结合片段；
s.抗-ILT4抗体或其抗原结合片段；
t.抗-ILT5抗体或其抗原结合片段；
u.抗-4-1BB抗体或其抗原结合片段；
v.抗-NK2GA抗体或其抗原结合片段；
w.抗-NK2GC抗体或其抗原结合片段；
x.抗-NK2GE抗体或其抗原结合片段；
y.抗-TSLP抗体或其抗原结合片段；和
z.抗-IL10抗体或其抗原结合片段。
25.如权利要求24的组合物，其中所述抗-PD1抗体或其抗原结合片段选自：派姆单抗或其抗原结合片段和纳武单抗或其抗原结合片段。
26.一种产生抗体或抗原结合片段的方法，包括：
a.在有利于多核苷酸表达的条件下培养包含编码权利要求1-16任一项的抗体或抗原结合片段的重链和轻链的多核苷酸的宿主细胞；和
b.任选地，从所述宿主细胞和/或培养基回收所述抗体或抗原结合片段。
27.权利要求1-16任一项的抗体或抗原结合片段、权利要求19的表达载体、权利要求20-22任一项的宿主细胞或者权利要求23的组合物用于制备增加免疫细胞激活、治疗癌症或治疗感染的药物的用途。
28.权利要求1-16任一项的抗体或抗原结合片段、权利要求19的表达载体、权利要求20-22任一项的宿主细胞或者权利要求23的组合物用于制备治疗传染病的药物的用途。
29.权利要求27或28的用途，其中所述药物还包括另外的治疗剂。
30.如权利要求29的用途，其中所述另外的治疗剂选自：
a.抗-LAG3抗体或其抗原结合片段；
b.抗-TIGIT抗体或其抗原结合片段；
c.抗-VISTA抗体或其抗原结合片段；
d.抗-BTLA抗体或其抗原结合片段；
e.抗-TIM3抗体或其抗原结合片段；
f.抗-CTLA4抗体或其抗原结合片段；
g.抗-HVEM抗体或其抗原结合片段；
h.抗-CD70抗体或其抗原结合片段；
i.抗-OX40抗体或其抗原结合片段；
j.抗-CD28抗体或其抗原结合片段；
k.抗-PD1抗体或其抗原结合片段；
l.抗-PDL1抗体或其抗原结合片段；
m.抗-PDL2抗体或其抗原结合片段；
n.抗-GITR抗体或其抗原结合片段；
o.抗-ICOS抗体或其抗原结合片段；
p.抗-SIRPα抗体或其抗原结合片段；
q.抗-ILT2抗体或其抗原结合片段；
r.抗-ILT3抗体或其抗原结合片段；
s.抗-ILT4抗体或其抗原结合片段；
t.抗-ILT5抗体或其抗原结合片段；
u.抗-4-1BB抗体或其抗原结合片段；
v.抗-NK2GA抗体或其抗原结合片段；
w.抗-NK2GC抗体或其抗原结合片段；
x.抗-NK2GE抗体或其抗原结合片段；
y.抗-TSLP抗体或其抗原结合片段；
z.抗-IL10抗体或其抗原结合片段；
aa.STING激动剂；
bb.CXCR2拮抗剂；和
cc.PARP抑制剂。
31.如权利要求29的用途，其中所述另外的治疗剂是抗-PD1抗体或其抗原结合片段。
32.如权利要求31的用途，其中所述抗-PD1抗体或其抗原结合片段是派姆单抗、纳武单抗或其抗原结合片段。
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