KR20210040465A - 항-cd27 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항-CD27 항체, 뿐만 아니라 질환 예컨대 암 및 감염성 질환의 치료에서의 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

항-CD27 항체{ANTI-CD27 ANTIBODIES}
본 발명은 면역 반응의 자극, 특히 항원-특이적 T-림프구의 자극에 의해 호전되는 상태의 치료에 관한 것이다. 본 발명의 다양한 측면은 CD27+ 면역 세포의 자극에 의해 또는 1종 이상의 면역 체크포인트 단백질(들)의 억제에 의해 호전되는 것으로 공지되어 있거나 또는 호전될 것으로 예상되는 임의의 상태의 치료에 적합하다. 본 발명에 의해 적합하게 치료되는 상태는 면역 자극에 의해 호전되는 것, 예컨대 감염성 질환 및 암이다. 보다 구체적으로 본 발명은 항-CD27 항체, 뿐만 아니라 질환 예컨대 암 및 감염성 질환의 치료에서의 이들 항체의 사용에 관한 것이다.
TNF 수용체 패밀리 구성원인 CD27은 인간 T 세포 상의 막 분자로서 확인되었다 (van Lier et al., 1987, J. Immunol. 139:1589-96). 현재의 증거에 따르면, CD27은 단일 리간드, CD70을 갖고, 이것 또한 TNF 패밀리 구성원이다 (Goodwin et al., 1993, Cell 73:447-56).
CD27은 조혈 세포, 특히 림프구 계통의 조혈 세포, 즉 T-, B- 및 NK 세포에 의해 독점적으로 발현된다. CD27은 원래 TCR 자극에 대한 증식 반응을 증대시키는 인간 T-세포 공동-자극 분자로서 정의되었다 (van Lier et al., 1987, J. Immunol. 139:1589-96). CD27의 리간드인 CD70의 존재는 CD27-매개 공동-자극의 시기 및 지속성을 좌우한다.
미성숙 수지상 세포에서의 CD70의 트랜스제닉 발현은 바이러스 또는 종양에 대한 면역학적 관용을 CD8+ T 세포 반응성으로 전환시키는데 충분하였다. 마찬가지로, 효능작용 가용성 CD70은 이러한 펩티드 면역화 시 CD8+ T 세포 반응을 촉진하였고 (Rowley et al., 2004, J Immunol 172:6039-6046), CD70 트랜스제닉 마우스에서, TCR 자극에 대한 반응으로 CD4+ 및 CD8+ 이펙터 세포 형성이 매우 용이해졌다 (Arens et al. 2001, Immunity 15:801-12; Tesselaar et al., 2003, Nat Immunol 4:49-54; Keller et al. 2008, Immunity 29: 334-346). 마우스 림프종 모델에서, CD70 유전자도입 또는 항-마우스 CD27 항체의 주사 시 종양 거부가 개선되었다 (Arens et al., 2003, J Exp Med 199:1595-1605; French et al., 2007, Blood 109: 4810-15; Sakanishi and Yagita, 2010, Biochem. Biophys. Res. Comm. 393: 829-835; WO 2008/051424; WO 2012/004367).
WO2012/004367에서, 면역 반응의 CD27-매개 공동-자극을 활성화하기 위해 가교를 필요로 하지 않는 최초의 항-인간 효능작용 항체 (hCD27.15로 지정됨)가 기재되었다. 또한, 가교 시 CD27을 활성화하는 1F5로 지정된 항-인간 CD27 항체가 개시되었다 (WO2011/130434 및 Vitale et al., Clin. Cancer Res, 2012, 18(14): 3812-3821). 그러나, A59T SNP를 갖는 인간 CD27 및 시노몰구스 원숭이로부터의 CD27에 결합할 수 있는 능력을 포함하여, 개선된 특징을 갖는 항-인간 CD27 항체를 개발할 필요가 여전히 관련 기술분야에 존재한다.
본 발명은 하기 명시된 구조적 및 기능적 특색을 포함하는 항-CD27 항체 및 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및 (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및 (iii) X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합함, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합함; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 CD27에 결합함; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어(BIACORE)) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사(KinExa) 또는 옥테트(OCTET))에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합함; 시노몰구스 또는 레서스 CD27과 교차반응함; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단함; T 세포 활성화를 증가시킴; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 가짐; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시킴; 및 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킴. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (iii) X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합함, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합함; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 CD27에 결합함; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합함; 시노몰구스 또는 레서스 CD27과 교차반응함; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단함; T 세포 활성화를 증가시킴; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 가짐; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시킴; 및 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킴. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열; 또는 상기 서열과 1, 2 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 1, 2 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 1, 2 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 1, 2 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 1, 2 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 1, 2 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합함, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합함; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 CD27에 결합함; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합함; 시노몰구스 또는 레서스 CD27과 교차반응함; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단함; T 세포 활성화를 증가시킴; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 가짐; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시킴; 및 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킴. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 7과 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및/또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 8과 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 9의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 9와 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및/또는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 14와 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 32의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 32와 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및/또는 서열식별번호: 33의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 33과 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 34의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 34와 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및/또는 서열식별번호: 35의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 35와 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 39와 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및/또는 서열식별번호: 40의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 40과 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 10-13 또는 서열식별번호: 10-13 중 하나와 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 및/또는 서열식별번호: 15-18 중 어느 하나 또는 서열식별번호: 15-18 중 하나와 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 10의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 10과 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및/또는 서열식별번호: 15의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 15와 1, 2, 또는 3개의 보존적 치환만큼 상이한 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 이뮤노글로불린 가변 영역, 중쇄 이뮤노글로불린 가변 영역, 또는 경쇄 및 중쇄 이뮤노글로불린 가변 영역 둘 다를 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합함, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합함; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 CD27에 결합함; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합함; 시노몰구스 또는 레서스 CD27과 교차반응함; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단함; T 세포 활성화를 증가시킴; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 가짐; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시킴; 및 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킴. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간화 항체 또는 그의 항원 결합 단편이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 9, 10, 11, 12, 13, 32, 34 및 39로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 14, 15, 16, 17, 18, 33, 35 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 10, 11, 12 또는 13 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 15, 16, 17 또는 18 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 10, 11, 12 또는 13 중 어느 하나와 관련하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 15, 16, 17 또는 18 중 어느 하나와 관련하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합함, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합함; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 CD27에 결합함; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합함; 시노몰구스 또는 레서스 CD27과 교차반응함; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단함; T 세포 활성화를 증가시킴; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 가짐; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시킴; 및 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킴. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 10, 11, 12 또는 13 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열식별번호: 15, 16, 17 또는 18 중 어느 하나에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 제안되는 서열 변경은 오직 항체의 프레임워크 영역에서만 일어난다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며; 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 9-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 14-18로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이러한 상기 언급된 실시양태에서, 서열 변경은 프레임워크 영역에서 일어나고, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합함, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합함; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 CD27에 결합함; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합함; 시노몰구스 또는 레서스 CD27과 교차반응함; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단함; T 세포 활성화를 증가시킴; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 가짐; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시킴; 및 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킴. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 32의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 10-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 중쇄 및 서열식별번호: 15-18로 이루어진 군으로부터 선택된 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 서열식별번호: 10-12 중 어느 하나의 가변 중쇄 및 서열식별번호: 15-17 중 어느 하나의 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편; 및 서열식별번호: 13의 가변 중쇄 및 서열식별번호: 18의 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 및 중쇄 이뮤노글로불린 가변 영역 둘 다를 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 제공된다.
한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합함, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합함; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 CD27에 결합함; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합함; 시노몰구스 또는 레서스 CD27과 교차반응함; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단함; T 세포 활성화를 증가시킴; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 가짐; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시킴; 및 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킴. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 및/또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하며, 여기서 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 CD27에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 또는 최대 25개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체, 및/또는 최대 25개의 아미노산 치환을 포함하는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 인간 CD27에 결합하는 단리된 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합함, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합함; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 CD27에 결합함; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합함; 시노몰구스 또는 레서스 CD27과 교차반응함; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단함; T 세포 활성화를 증가시킴; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 가짐; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시킴; 및 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킴. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다.
임의의 상기 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 단리될 수 있다.
임의의 상기 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 재조합 항체이다.
임의의 상기 실시양태에서, 항체는 전장 항체일 수 있다.
임의의 상기 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간화 항체일 수 있다.
임의의 상기 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 인간화 항체일 수 있고, 임의로 무손상 IgG 항체이다. 한 실시양태에서, 중쇄는 IgG 이소형을 갖는다. 한 실시양태에서, 중쇄는 IgG1 이소형을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄는 IgG2 이소형을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄는 IgG4 이소형을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄는 IgM 이소형을 갖는다. 한 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 30 또는 서열식별번호: 28의 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 불변 도메인은 IgG1 또는 IgG4 이소형이다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합함, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합함; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 CD27에 결합함; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합함; 시노몰구스 원숭이 또는 레서스 원숭이 CD27과 교차반응함; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단함; T 세포 활성화를 증가시킴; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27-발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T-발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 원숭이 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 가짐; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시킴; 및 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킴. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다.
임의의 상기 언급된 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 상기 기재된 가변 중쇄 중 임의의 것 및 (b) 리더 펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 26의 리더 펩티드)로 이루어진 중쇄 영역을 포함할 수 있다. 임의의 상기 언급된 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 (a) 상기 기재된 경쇄 중 임의의 것 및 (b) 리더 펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 27의 리더 펩티드)로 이루어진 경쇄 영역을 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 상기 언급된 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 기재된 중쇄 가변 영역 중 임의의 것 및 임의의 인간 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체일 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 IgG 이소형을 갖고, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 인간 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 중쇄 IgG1 불변 도메인 (서열식별번호: 30) 또는 그의 변이체를 포함하며, 여기서 변이체는 서열식별번호: 30 대비 최대 20개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 인간 중쇄 IgG4 불변 도메인을 포함하며, 여기서 위치 228 (EU 넘버링 스킴을 사용함)의 아미노산은 Ser에서 Pro로 치환되었다 (서열식별번호: 28). 또 다른 실시양태에서, 중쇄는 IgM 이소형을 갖는다.
임의의 상기 언급된 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상기 기재된 경쇄 가변 영역 중 임의의 것 및 인간 경쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 29의 아미노산 서열을 포함하는 인간 카파 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전 사량체 구조를 포함하며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 14-18, 33, 35 및 40 중 어느 하나를 포함하는 가변 영역 및 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 영역을 포함하고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 9-13, 32, 34 및 39 중 어느 하나를 포함하는 가변 영역, 및 인간 IgG1 불변 영역을 포함한다 (서열식별번호: 30).
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전 사량체 구조를 포함하며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 14-18, 33, 35 및 40 중 어느 하나를 포함하는 가변 영역 및 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 도메인을 포함하고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 9-13, 32, 34 및 39 중 어느 하나를 포함하는 가변 영역, 및 인간 IgM 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전 사량체 구조를 포함하며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 14-18, 33, 35 및 40 중 어느 하나를 포함하는 가변 영역 및 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 도메인을 포함하고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 9-13, 32, 34 및 39 중 어느 하나를 포함하는 가변 영역, 및 인간 IgG2 불변 영역을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 36으로 이루어지고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 37로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어지며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 36으로 이루어지고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 37로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 36으로 이루어지고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 38로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어지며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 36으로 이루어지고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 38로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 14-18, 33, 35 및 40 중 어느 하나를 포함하는 가변 영역 및 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 도메인으로 이루어지고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 9-13, 32, 34 및 39 중 어느 하나로 이루어진 가변 영역 및 인간 IgM 불변 영역으로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어지며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 14-18, 33, 35 및 40 중 어느 하나를 포함하는 가변 영역 및 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 도메인으로 이루어지고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 9-13, 32, 34 및 39 중 어느 하나로 이루어진 가변 영역 및 인간 IgM 불변 영역으로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 14-18, 33, 35 및 40 중 어느 하나로 이루어진 가변 영역 및 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 도메인으로 이루어지고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 9-13, 32, 34 및 39 중 어느 하나를 포함하는 가변 영역, 및 인간 IgG1 불변 영역으로 이루어진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어지며, 여기서 각각의 경쇄는 서열식별번호: 14-18, 33, 35 및 40 중 어느 하나로 이루어진 가변 영역 및 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄 불변 도메인으로 이루어지고; 각각의 중쇄는 서열식별번호: 9-13, 32, 34 및 39 중 어느 하나를 포함하는 가변 영역, 및 인간 IgG1 불변 영역으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편 중 임의의 것은 포유동물 세포 또는 CHO 세포에 의한 발현의 글리코실화 패턴 특징을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-CD27 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 적어도 1종의 치료제에 접합된다. 한 실시양태에서, 치료제는 제2 항체 또는 그의 단편, 면역조정제, 호르몬, 세포독성제, 효소, 방사성핵종, 적어도 1종의 면역조정제, 효소, 방사성 표지, 호르몬, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 세포독성제에 접합된 제2 항체, 또는 그의 조합이다.
본 발명은 또한 서열식별번호: 1-18, 32-40 및 44-45 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 서열 중 임의의 것의 단편을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 1-18, 32-40 및 44-45의 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 단리된 핵산을 제공하며, 여기서 상기 폴리펩티드는 임의로 리더 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 46 또는 서열식별번호: 47, 또는 둘 다를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 서열식별번호: 1-18, 32-40 및 44-45의 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 (여기서 상기 폴리펩티드는 임의로 리더 서열을 포함할 수 있음) 또는 서열식별번호: 46 또는 서열식별번호: 47, 또는 둘 다를 포함하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 이들 단리된 핵산 및 그를 포함하는 발현 벡터는 재조합 숙주 세포에서 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 발현시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 서열식별번호: 1-18, 32-40 및 44-45의 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 (여기서 상기 폴리펩티드는 임의로 리더 서열을 포함할 수 있음) 또는 서열식별번호: 46 또는 서열식별번호: 47, 또는 둘 다를 포함하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아 세포, 인간 세포, 포유동물 세포, 피키아(Pichia) 세포, 식물 세포, HEK293 세포, 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 효모 세포, 예를 들어 피키아 세포 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 숙주 세포이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 조성물은 추가의 치료제를 포함한다. 한 실시양태에서, 추가의 치료제는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TIGIT 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-VISTA 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-BTLA 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TIM3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-HVEM 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CD70 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-OX40 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CD28 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PDL1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PDL2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ICOS 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 항-ILT5 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항 4-1BB (CD137) 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2A 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2C 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2E 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TSLP 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-IL-10 항체 또는 그의 항원 결합 단편; IL-10 또는 PEG화 IL-10; STING 효능제; CXCR2 길항제; 및 PARP 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제약 조성물의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 1, 2종 또는 그 초과의 치료제와 조합된, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조합물을 포함하며; 여기서 제2 치료제는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TIGIT 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-VISTA 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-BTLA 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TIM3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-HVEM 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CD70 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-OX40 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CD28 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PDL1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PDL2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ICOS 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT5 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항 4-1BB 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2A 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2C 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2E 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TSLP 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-IL-10 항체 또는 그의 항원 결합 단편; IL-10 또는 PEG화 IL-10; STING 효능제; CXCR2 길항제; 및 PARP 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 조합물의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나를 포함하는 용기 또는 주사 장치를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 (또는 그의 항원 결합 단편)의 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를, 폴리뉴클레오티드의 발현에 유리한 조건 하에 배양하는 단계; 및 임의로, 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 항체 또는 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 단일 벡터 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상이한 벡터 내에 있다. 한 실시양태에서, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편으로부터의, 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편을, 임의로 추가의 치료제 또는 치료 절차와 연합하여 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 치료될 대상체는 인간 대상체이다. 한 실시양태에서, 추가의 치료제는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TIGIT 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-VISTA 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-BTLA 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TIM3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-HVEM 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CD70 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-OX40 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CD28 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PDL1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PDL2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ICOS 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT5 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 항-4-1BB 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2A 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2C 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2E 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TSLP 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-IL-10 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-IL-10 항체 또는 그의 항원 결합 단편; IL-10 또는 PEG화 IL-10; STING 효능제; CXCR2 길항제; 및 PARP 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 (i) 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편; 및 (ii) 서열식별번호: 53의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 48의 경쇄 서열을 포함하는 항-PD1 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편; 및 (b) 서열식별번호: 52의 중쇄 가변 서열 및 서열식별번호: 78의 경쇄 가변 서열을 포함하는 항-PD1 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 항-PD1 항체는 항-CD27 항체를 투여하기 전에 투여된다. 한 실시양태에서, 항-PD1 항체는 항-CD27 항체를 투여하기 4-10일 전에 투여된다. 한 실시양태에서, 항-PD1 항체에 의한 전처리는 면역 세포를 조정하여 항-CD27 항체의 증진된 Fc-매개 기능을 발생시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을, 임의로 추가의 치료제 또는 치료 절차와 연합하여 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 감염 또는 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 치료될 대상체는 인간 대상체이다. 한 실시양태에서, 추가의 치료제는 항-LAG3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TIGIT 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-VISTA 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-BTLA 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TIM3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CTLA4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-HVEM 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CD70 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-OX40 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-CD28 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PD1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PDL1 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-PDL2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-GITR 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ICOS 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-SIRPα 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT2 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT3 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT4 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-ILT5 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 항-4-1BB 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2A 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2C 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-NKG2E 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-TSLP 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 항-IL-10 항체 또는 그의 항원 결합 단편; IL-10 또는 PEG화 IL-10; STING 효능제; CXCR2 길항제; 및 PARP 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 백신을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 백신은 추가로 항원을 포함한다.
본 발명은 또한 샘플을 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계 및 항체 또는 단편과 펩티드 사이의 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플에서 CD27 펩티드 또는 그의 단편의 존재를 검출하는 방법을 제공하며; 여기서 복합체의 검출은 CD27 펩티드의 존재를 나타낸다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 면역 세포를 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 중 어느 하나와 접촉시키는 것을 포함하는, 면역 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 면역 세포의 활성의 증가를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함하는, 면역 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 암의 치료, 감염 또는 감염성 질환의 치료를 위해, 또는 백신 보조제로서 사용된다. 한 실시양태에서, 면역 세포의 활성의 증가는 면역 세포의 증식을 측정하는 것에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, T 세포의 활성의 증가는 T 세포의 증식을 측정하는 것에 의해 검출될 수 있다. 한 실시양태에서, 면역 세포의 활성의 증가는 대상체로부터 유래된 샘플에서 T 세포 활성화를 생체외 측정하는 것에 의해 검출될 수 있다. 한 실시양태에서, T 세포의 활성의 증가는 (i) IL-2, TNFα, IL-17, IFNγ, IL-1β, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인의 생산을 유도하는 T 세포 수용체 (TCR) 신호전달에 대한 혼합 림프구 반응 또는 직접 항-CD3 mAb 자극을 측정하는 것; (ii) IL-2, TNFα, IL-17, IFNγ, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 시토카인의 SEB 유도된 생산을 측정하는 것; 또는 (iii) IL-2, TNFα, IL-17, IFNγ, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인의 TT 유도된 생산을 측정하는 것에 의해 결정된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편은 (i) 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (ii) X1= N, X2= T, X3=N 및 X4=T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (iii) X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (iv) X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (v) X1= D 및 X2=T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (vi) X1= W, X2=N 및 X3=S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
도 1은 항체 hCD27.15가 CD27 A59T에 결합하지 않는다는 것을 보여준다. CD27 및 CD27 A59T를 일시적 형질감염에 의해 CHO-K1 상에 발현시켰다. CD27 및 CD27 A59T에 대한 hCD27.15 (인간화 6B) 및 Fc-mCD70의 결합을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. Fc-mCD70은 CD27 및 CD27 A59T 둘 다에 결합하는 반면에, hCD27.15는 단지 CD27에만 결합한다.
도 2는 항체 hCD27.15가 마카카 물라타(Macaca mulatta) CD27에 결합하지 않는다는 것을 보여준다. HsCD27 및 MmCD27을 일시적 형질감염에 의해 CHO-K1 상에 발현시켰다. HsCD27 및 MmCD27에 대한 hCD27.15 (키메라 c-4)의 결합을 유동 세포측정법에 의해 측정하였다.
도 3a-3b는 본 발명의 다양한 항-CD27 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 배선 VH 및 VL 서열과의 정렬을 보여준다: 131AVH6 (서열식별번호: 10), 131AVH7 (서열식별번호: 11), 131A 모 VH (서열식별번호: 7), 131AVH8 (서열식별번호: 12), 131AVH9 (서열식별번호: 13), VH1-102 (서열식별번호: 64), VH1-146 (서열식별번호: 65); 131AVL6 (서열식별번호: 15), 131AVL7 (서열식별번호: 16), 131A 모 VL (서열식별번호: 8), 131AVL8 (서열식별번호: 17), 131AVL9 (서열식별번호: 18), VK1-O2 (서열식별번호: 66), VK3-L6 (서열식별번호: 67).
도 4는 종양 부피 및 치료 후 일수에 의해 측정된 바와 같은, MC38 종양을 갖는 huCD27 녹-인 마우스에서의 1F5-huIgG1과 비교한 131AVH6VL6-huIgG1의 항종양 활성을 보여준다.
도 5는 MB49 종양을 갖는 huCD27 녹-인 마우스에서의 항-PD-1과 조합된 131AVH6VL6-huIgG1의 항종양 활성을 보여준다.
도 6a-6c. hCD27.131AVH6VL6-huIgG1은 CD27 발현 293FT 세포에서 NF-κB 활성화를 유도한다. NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 인간 배아 신장 세포 (293FT-NF-κB-루시페라제 세포)를 인간 WT, A59T 또는 레서스 CD27을 코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 항-인간 CD27 항체의 존재 또는 부재 하에 16-20시간 동안 자극한 다음 루시페라제 활성에 의해 판독되는 바와 같은 NF-κB 활성화를 검정하였다. mAb hCD27.131AVH6VHL6 huIgG1, 1F5 huIgG1, 또는 hCD27.15-4B IgG4에 의한 (a) hCD27 WT, (b) hCD27 A59T, 또는 (c) 레서스-발현 HEK293FT 세포의 자극 후 루시페라제 활성에 대한 비자극 세포 대비 배수 변화 값을 보여준다. 데이터는 1개의 실험으로부터의 삼중 측정치를 나타낸다 (+SD). 데이터는 3-6회의 독립적 실험을 대표한다.
도 7a 및 7b. hCD27.131A IgG1 및 IgG4 인간화 변이체는 CD27 발현 293FT 세포에서 NF-κB 활성화를 유도한다. NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 인간 배아 신장 세포 (293FT-NF-κB-루시페라제 세포)를 인간 WT CD27을 코딩하는 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 항-인간 CD27 항체의 존재 또는 부재 하에 16-20시간 동안 자극한 다음 루시페라제 활성에 의해 판독되는 바와 같은 NF-κB 활성화를 검정하였다. (a) 인간 IgG1 또는 (b) IgG4 프레임워크에 대한 인간화 hCD27.131A 항체에 의한 자극 후의 루시페라제 활성에 대한 비자극 세포 대비 배수 변화 값을 보여준다.
도 8. 원발성 인간 종양 TIL 배양물에서의 131AVH6VL6-IgG1의 생물활성. 외과적 절제로부터 수득한 인간 종양 조직 (N=20, 16개의 NSCLC, 3개의 RCC, 및 1개의 H&N)을 콜라게나제 유형 I 및 DNase I을 사용하여 단세포 현탁액으로 소화시켰다. 종양의 다양한 세포 유형의 혼합물을 함유하는 풍부화된 살아있는 세포를 10 ng/ml 항-CD3의 존재 하에 131AVH6VL6-hIgG1 0.1, 1, 10, 또는 20 μg/mL로 처리하였다. 처리는 또한 이소형 대조군 (IgG1 및 IgG4, 20μg/ml) 및 10 μg/mL 항-PD-1 (펨브롤리주맙)을 포함한다. 제6일에 인터페론 감마 (IFNγ) 측정을 위해 상청액을 수집하였다. 평균 IFNγ 수준 및 평균의 표준 오차를 보여준다. 처리군 및 이소형 대조군 사이의 비교를 위한 P-값을 대응표본, 파라미터, 양측 T-검정에 의해 결정하였다. IFNγ = 인터페론 감마; IgG1 = 이뮤노글로불린 G, 하위부류 1; IgG4 = 이뮤노글로불린 G, 하위부류 4; SEM = 평균의 표준 오차.
도 9. 원발성 인간 종양 TIL 배양물에서의 hCD27.15-4BIgG4 및 IF5-IgG1을 사용한 131AVH6VL6-IgG1의 생물활성의 비교. 20개 중 13개의 종양 (12개의 NSCLC 및 1개의 H&N 암)으로부터 소화시킨 인간 종양 세포를 또한 hCD27.15-4BIgG4 및 IF5-IgG1을 사용하여 동시에 시험하였다. 종양의 다양한 세포 유형의 혼합물을 함유하는 풍부화된 살아있는 세포를, 이소형 대조군 (IgG1 및 IgG4, 20μg/ml) 및 10 μg/mL 항-PD1 (펨브롤리주맙) 대조군을 포함하여, 131AVH6VL6-hIgG1, hCD27.15-4BIgG4, 및 IF5-IgG1 0.1, 1, 10, 또는 20 μg/mL로 처리하였다. 10 ng/ml 가용성 항-CD3 (바이오레전드(BioLegend), 클론 OKT3)을 자극제로서 사용하였다. 제6일에 인터페론 감마 (IFNγ) 측정을 위해 상청액을 수집하였다. 평균 IFNγ 수준 및 평균의 표준 오차를 보여준다. 처리군 및 이소형 대조군 사이의 비교를 위한 P-값을 대응표본, 파라미터, 양측 T-검정에 의해 결정하였다. IFNγ = 인터페론 감마; IgG1 = 이뮤노글로불린 G, 하위부류 1; IgG4 = 이뮤노글로불린 G, 하위부류 4; SEM = 평균의 표준 오차.
도 10. CHO-K1 세포 상에 발현된 hCD27 알라닌 돌연변이체에 대한 유동 세포측정법에 의한 마우스 hCD27.131A (마우스 IgG1), 인간화 hCD27.15 (인간 IgG4, 클론 6B), 1A4 (베크만 쿨터(Beckman Coulter) IM2034, 클론 1A4CD27, 마우스 IgG1), 9F4 (산퀸 펠리클러스터(Sanquin PeliCluster) CD27; Art. No. M1455, 클론 CLB-CD27/1, 9F4, 마우스 IgG2a) 및 1F5IgG1의 결합. 시험된 hCD27 변이체를 열거한다. 아미노산은 유니프롯(UniProt) P26842-1 서열에 상응한다. 아미노산 1-20은 신호 펩티드를 구성한다. 결합은 100%로 설정된 hCD27에 대한 항체 결합 대비, FITC 신호의 기하 평균으로서 표현된다.
도 11. 131AVH6VL6Fab-CD27 및 M2177Fab-CD27 복합체 (Obmolova et al. Mol Immunol. 2017 Mar; 83:92-99, 2017)의 구조의 비교: 배위는 항원 구조의 중첩 후에 리본으로 제시되고; CD27은 흑색 진한 선으로, Fab는 얇은 선으로 131AVH6VL6Fab 및 M2177Fab의 경우 각각 흑색, 담회색으로 제시된다. M2177-CD27 복합체에 대한 배위는 PDB 5TLK로부터 각각 Fab 경쇄, 중쇄, 및 항원에 대해 쇄 A, B 및 X를 사용하여 취하였다.
도 12a 및 12b. 131AVH6VL6Fab-CD27 (a) 및 M2177Fab-CD27 복합체 (b)의 구조의 비교, 클로즈-업 뷰: 입력 모델 및 도면 배향은 도 11과 동일하지만, 비교를 더 잘 나타내기 위해 뷰를 Fab-항원 계면으로 확대하였다. 도 11과 동일한 리본 표시, 색 및 두께 표현을 사용하되 (M2177-CD27 공동-구조가 담회색으로 색표시된 것 제외), 극성 상호작용에 수반된 잔기의 측쇄는 스틱으로 나타낸다. 3.30Å의 거리 컷-오프를 갖는 H-결합 및 염 가교는 파선으로 제시하고, 염 가교의 경우 보다 짧은 파선을 사용하였다.
도 13a 및 13b. 마우스 항-hCD27 클론 hCD27.131A는 세포-기반 ELISA에서 hCD27에의 결합에 대해 1F5IgG1과 교차-경쟁하지 않는다. 마우스 hCD27.131A 및 마우스 hCD27.15를 1F5IgG1과 hCD27에 대한 경쟁적 결합에 대해 시험하였다. (a) 좌측 패널: 실험 설정. 우측 패널: 1F5IgG1의 연속 희석물에 이은 1 μg/ml 마우스 hCD27.131A, 마우스 hCD27.15 또는 마우스 IgG1 이소형 대조군의 교차-경쟁 데이터. (b) 좌측 패널: 실험 설정. 우측 패널: 마우스 hCD27.131A, 마우스 hCD27.15 또는 마우스 IgG1 이소형 대조군의 연속 희석물에 이은, 1 μg/ml 1F5IgG1의 교차-경쟁 데이터. 오차 막대를 갖는 데이터 포인트는 이중 측정치의 평균을 범위와 함께 나타낸다.
도 14. 1차 CD8 T 세포 공동-자극 검정에서의 131AVH6VL6-hIgG1 및 1F5-hIgG1의 생물활성.
약어
본 발명의 상세한 설명 및 실시예 전반에 걸쳐 하기 약어가 사용될 것이다:
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정의
본 발명이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 기술 과학 용어가 하기 구체적으로 정의되어 있다. 이 문헌의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
첨부된 청구범위를 포함하여, 본원에 사용된 단수 형태 단어는, 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 그의 상응하는 복수 지시대상을 포함한다.
동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체에 적용된 바와 같은 "투여" 및 "치료"는 외인성 제약, 치료제, 진단제, 또는 조성물과 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관, 또는 생물학적 유체의 접촉을 지칭한다. 세포의 치료는 세포에의 시약의 접촉, 뿐만 아니라 세포와 접촉하고 있는 유체에의 시약의 접촉을 포괄한다. "투여" 및 "치료"는 또한, 예를 들어, 세포의, 시약, 진단, 결합 화합물에 의한, 또는 또 다른 세포에 의한, 시험관내 및 생체외 치료를 의미한다.
"치료하다" 또는 "치료하는"은 치료제, 예컨대 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 중 임의의 것을 함유하는 조성물을, 내적으로 또는 외적으로, 그에 대해 작용제가 치료 활성을 갖는 1종 이상의 질환 증상을 갖거나, 또는 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상체 또는 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 작용제는 임의의 임상적으로 측정가능한 정도만큼 1종 이상의 질환 증상의 퇴행을 유도하거나 또는 그의 진행을 억제함으로써, 치료된 대상체 또는 집단에서 이러한 증상(들)을 완화시키는데 효과적인 양으로 투여된다. 임의의 특정한 질환 증상을 완화시키는데 효과적인 치료제의 양은 인자 예컨대 환자의 질환 상태, 연령, 및 체중, 및 대상체에서 목적하는 반응을 도출하기 위한 약물의 능력에 따라 달라질 수 있다. 질환 증상이 완화되었는지 여부는 그러한 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 다른 숙련된 건강관리 제공자에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 임상 측정에 의해 평가될 수 있다.
CD27
본 발명의 한 실시양태에서, 인간 CD27의 아미노산 서열은 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 20 (서열식별번호: 19와 동일하지만 SNP - A59T를 포함함)의 아미노산 서열을 포함한다. rs25680 대립유전자 (통상적으로 A59T로 지칭됨)의 빈도는 ExAC 데이터베이스에 기초하여 19.78%의 전체 평균을 갖는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 시노몰구스 원숭이, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) CD27 또는 마카카 물라타(Macaca Mulatta) CD27 (mmCD27)의 아미노산 서열은 서열식별번호: 21에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.
항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편
본 발명은 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 이러한 항체 또는 단편의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-CD27 항체는 단리된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 CD27 (서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 20)에 약 5-10 nM의 KD로 결합한다. 한 실시양태에서, 인간 CD27에 결합하는 본 발명의 항체는 또한 mmCD27과 교차-반응한다. 본원에 사용된 "교차-반응성"은 다른 종으로부터의 상동 단백질과 반응하는 항체의 능력을 지칭한다. 항체가 인간 CD27 또는 mmCD27에 결합하는지 여부는 관련 기술분야에 공지된 임의의 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 결합 친화도를 결정하는 것에 대해 관련 기술분야에 공지된 검정의 예는 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)을 포함한다.
본 발명은 항-CD27 항체 및 그의 사용 방법을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 임의의 형태의 항체를 지칭한다. 따라서, 이는 가장 넓은 의미로 사용되고 구체적으로 모노클로날 항체 (2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하는 전장 모노클로날 항체를 포함함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 인간화 항체, 완전 인간 항체, 및 키메라 항체를 포괄하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 항-CD27 항원-결합 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 항체의 항원-결합 단편, 즉, 전장 항체에 의해 결합되는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체 단편, 예를 들어 1개 이상의 CDR 영역을 보유하는 단편을 지칭한다. 항원-결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일쇄 항체 분자, 예를 들어, sc-Fv; 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 항-CD27 Fab 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "Fab 단편"은 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다. "Fab 단편"은 항체의 파파인 절단의 생성물일 수 있다.
본 발명은 Fc 영역을 포함하는 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "Fc" 영역은 항체의 CH3 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 함유한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디술피드 결합 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.
본 발명은 항-CD27 Fab' 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "Fab' 단편"은 1개의 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인 및 또한 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 1개의 중쇄의 부분 또는 단편을 함유하며, 이에 따라 쇄간 디술피드 결합이 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
본 발명은 항-CD27 F(ab')2 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 불변 영역의 부분을 함유하는 2개의 중쇄를 함유하며, 이에 따라 쇄간 디술피드 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성된다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이의 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 2개의 Fab' 단편으로 구성된다. "F(ab')2 단편"은 항체의 펩신 절단의 생성물일 수 있다.
본 발명은 항-CD27 Fv 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역이 결여되어 있다.
본 발명은 항-CD27 scFv 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. 용어 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 scFv가 항원-결합을 위한 목적하는 구조를 형성하게 할 수 있는 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌 [Pluckthun (1994) The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]을 참조한다. 또한, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 88/01649 및 미국 특허 번호 4,946, 778 및 5,260,203을 참조한다.
본 발명은 항-CD27 2가 항체 및 그의 사용 방법을 포함한다. "2가 항체"는 2개의 항원-결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 그러나, 2가 항체는 이중특이적일 수 있다 (하기 참조).
본 발명은 항-CD27 디아바디 및 그의 사용 방법을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 지칭하며, 여기서 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 내에 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다 (VH-VL 또는 VL-VH). 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍형성을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍형성하도록 강제되고 2개의 항원-결합 부위를 생성한다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448]에 보다 상세하게 기재되어 있다. 조작된 항체 변이체의 검토를 위해 일반적으로 문헌 [Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136]을 참조한다.
전형적으로, 일부 방식으로 변형된 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 그의 결합 활성이 몰 기준으로 표현된 경우에, (모 항체와 비교할 경우) 그의 결합 활성의 적어도 10%를 보유한다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 모 항체의 CD27 결합 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 초과를 보유한다. 또한 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 실질적으로 그의 생물학적 활성을 변경시키지 않는 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환 (항체의 "보존적 변이체" 또는 "기능 보존된 변이체"로 지칭됨)을 포함할 수 있는 것으로 의도된다.
본 발명은 단리된 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편 및 그의 사용 방법을 포함한다. "단리된" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 이들이 생산된 세포 또는 세포 배양물로부터의 다른 생물학적 분자가 적어도 부분적으로 없다. 이러한 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질 예컨대 세포 파편 및 성장 배지를 포함한다. 단리된 항체 또는 항원-결합 단편은 추가로 발현 시스템 성분 예컨대 숙주 세포로부터의 또는 그의 성장 배지의 생물학적 분자가 적어도 부분적으로 없을 수 있다. 일반적으로, 용어 "단리된"은 이러한 생물학적 분자의 완전한 부재 또는 물, 완충제, 또는 염의 부재, 또는 항체 또는 단편을 포함하는 제약 제제의 성분을 지칭하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명은 항-CD27 키메라 항체 (예를 들어, 인간 불변 도메인/마우스 가변 도메인) 및 그의 사용 방법을 포함한다. 본원에 사용된 "키메라 항체"는 제1 항체로부터의 가변 도메인 및 제2 항체로부터의 불변 도메인을 갖는 항체이며, 여기서 제1 및 제2 항체는 상이한 종으로부터의 것이다. (미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855]). 전형적으로, 가변 도메인은 실험 동물, 예컨대 설치류로부터의 항체 ("모 항체")로부터 수득되고, 불변 도메인 서열은 인간 항체로부터 수득되므로, 이에 따라 생성되는 키메라 항체는 모 (예를 들어, 마우스) 항체보다 인간 대상체에서 불리한 면역 반응을 아마도 덜 도출할 것이다.
본 발명은 항-CD27 인간화 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간화시킨 래트 또는 마우스 항체) 및 그의 사용 방법을 포함한다. 본 발명은 131A 항체의 인간화 버전을 포함한다. 본원에 사용된 "131A 항체" 및 "hCD27.131A"는 서열식별번호: 7의 VH 영역 및 서열식별번호: 8의 VL 영역을 포함하는 항체를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 인간 및 비-인간 (예를 들어, 마우스 또는 래트) 항체 둘 다로부터의 서열을 함유하는 항체의 형태를 지칭한다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 (FR) 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 인간 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부를 임의로 포함할 수 있다. 인간화 항체에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 예를 들어 문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); 및 Clark, Immunol. Today 21: 397-402 (2000)]을 참조한다.
일반적으로, 기본 항체 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄를 포함하고, 각각의 쌍은 1개의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 중쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의할 수 있다. 전형적으로, 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 게다가, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 항체의 이소형을 정의한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)]을 참조한다.
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 일반적으로, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이중기능적 또는 이중특이적 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는, 일반적으로, 동일하다.
전형적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR) 내에 위치하는, 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 불리는 3개의 초가변 영역을 포함한다. CDR은 통상적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되며, 이는 특이적 에피토프에 대한 결합을 가능하게 한다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다는, N-말단으로부터 C-말단으로, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각 도메인에의 아미노산의 할당은, 일반적으로, 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 또는 Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883]의 정의에 따른다.
본원에 사용된 용어 "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 CDR 잔기로 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 항원-결합을 담당하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 CDR (즉 경쇄 가변 도메인 내의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 및 중쇄 가변 도메인 내의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3)로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 문헌 [Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (서열에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)]을 참조하고; 또한 문헌 [Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (구조에 의해 항체의 CDR 영역을 정의함)]을 참조한다.
"단리된 핵산 분자" 또는 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 단리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 회합되지 않거나, 또는 자연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 연결된 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 또는 합성 기원 또는 그의 일부 조합을 의미한다. 본 개시내용의 목적상, 특정한 뉴클레오티드 서열을 "포함하는 핵산 분자"는 무손상 염색체를 포괄하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 명시된 핵산 서열을 "포함하는" 단리된 핵산 분자는, 명시된 서열에 더하여, 최대 10개 또는 심지어 최대 20개 또는 그 초과의 다른 단백질 또는 그의 부분 또는 단편에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있거나, 또는 열거된 핵산 서열의 코딩 영역의 발현을 제어하는 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/거나, 벡터 서열을 포함할 수 있다.
어구 "제어 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 사용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치되는 경우에 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프리서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드에 대한 DNA에, 그가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리단백질로서 발현되는 경우에, 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열에, 그가 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에, 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 코딩 서열에, 그가 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우에, 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우에, 인접하고 리딩 상 내에 있다는 것을 의미하지만, 항상 그러한 것은 아니다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실시에 따라 사용된다.
본원에 사용된 표현 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되고 모든 이러한 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 1차 대상 세포 및 전달의 수와 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 고의적이거나 또는 우발적인 돌연변이로 인해, 모든 자손이 정확하게 동일한 DNA 내용물을 갖지 않을 것으로 또한 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우에, 이는 문맥으로부터 분명할 것이다.
본원에 사용된 "배선 서열"은 재배열되지 않은 이뮤노글로불린 DNA 서열의 서열을 지칭한다. 재배열되지 않은 이뮤노글로불린 서열의 임의의 적합한 공급원이 사용될 수 있다. 인간 배선 서열은, 예를 들어, 미국 국립 보건원 산하 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 웹사이트 상의 조인솔버(JOINSOLVER) 배선 데이터베이스로부터 수득할 수 있다. 마우스 배선 서열은, 예를 들어, 문헌 [Giudicelli et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:D256-D261]에 기재된 바와 같이 수득할 수 있다.
예시적인 항-CD27 항체의 물리적 및 기능적 특성
본 발명은 명시된 구조적 및 기능적 특색을 갖는 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편, 및 질환 (예를 들어, 암 또는 감염성 질환)의 치료 또는 예방에 있어서 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 사용 방법을 제공한다.
"본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편"은 본원에 개시된 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, hCD27.131A 또는 표 12에 개시된 그의 인간화 버전) 또는 그의 변이체 (예를 들어, 서열 변이체 또는 기능적 변이체); 표 12에 제시된 CDR 중 어느 하나 이상을 포함하는 임의의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 중 임의의 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 단편도 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 10의 가변 중쇄 및 서열식별번호: 15의 가변 경쇄를 포함하는 항체와 인간 CD27의 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7의 가변 중쇄 및 서열식별번호: 8의 가변 경쇄를 포함하는 항체와 인간 CD27의 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. H/D-Ex 길량 분광측정, X선 결정학, 펩스캔 분석, 알라닌 스캐닝, 히드록실 라디칼 풋프린팅 및 부위 지정 돌연변이유발을 포함한, 표적 항원 상의 항체 에피토프를 맵핑하는데 이용가능한 여러 방법이 존재한다. 예를 들어, 단백질분해 및 질량 분광측정법과 커플링된 HDX (수소 중수소 교환)는 특이적 항원 Y 상의 항체의 에피토프를 결정하는데 사용될 수 있다. HDX-MS는 D2O 중에서 인큐베이션한 경우에 스스로 및 그의 항체의 존재 하에 항원에 의한 중수소 혼입의 정도의 다양한 시간 간격으로의 정확한 측정 및 비교에 의존한다. 중수소는 노출된 구역의 단백질의 아미드 백본 상의 수소와 교환되는 반면에 항체에 결합된 항원의 영역은 보호될 것이고 단백질분해 단편의 LC-MS/MS에 의한 분석 후 교환을 거의 또는 전혀 나타내지 않을 것이다. 한 실시양태에서, 에피토프는 CD27 또는 그의 단편과 항-CD27 항체 또는 그의 단편 사이의 복합체의 X선 결정 구조를 해석하고 항-CD27 항체 잔기의 4 Å 내의 1개 이상의 CD27 잔기를 확인함으로써 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 예를 들어 항-CD27 항체 잔기와 반 데르 발스, 극성 상호작용, 염 가교 또는 수소 결합 접촉을 갖는 CD27 잔기를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 CD27 잔기의 돌연변이유발 (예를 들어 알라닌 스캐닝) 및 돌연변이유발의 결과로서 항-CD27 항체에 대한 결합의 상실을 분석하는 것에 의해 결정된다.
본 발명은, 인간 CD27에 결합하는 경우에, 서열식별번호: 19의 Leu18, Asp34, Gln35, 및 Lys38로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 잔기에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 19의 Leu18, Asp34, Gln35, 및 Lys38로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3 또는 4개의 잔기에 결합한다. 본 발명은 또한, 인간 CD27에 결합하는 경우에, 서열식별번호: 19의 Gln35 및 Lys38로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 잔기에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 19의 적어도 Gln35 및 Lys38에 결합한다.
상기 실시양태의 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 추가로, 서열식별번호: 19의 Pro8, Glu9, His11, Lys17, His36, 및 Arg37로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 잔기 (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 잔기)에 결합한다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 추가로, 서열식별번호: 19의 Glu9, Lys17, His36, 및 Arg37로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 잔기 (1, 2, 3, 또는 4개의 잔기)에 결합한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 19의 잔기 Pro8, Glu9, His11, Lys17, Leu18, Asp34, Gln35, His36, Arg37 및 Lys38에 결합한다. 추가 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열식별번호: 19의 잔기 Glu9, Lys17, Leu18, Asp34, Gln35, His36, Arg37 및 Lys38에 결합한다.
상기 실시양태의 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 임의로 하기 특징 중 적어도 1개를 갖는다: 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합함, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합함; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 CD27에 결합함; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합함; 시노몰구스 또는 레서스 CD27과 교차반응함; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단함; T 세포 활성화를 증가시킴; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 CD27 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 가짐; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시킴; 및 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킴. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다.
본 발명의 항-CD27 항체의 이뮤노글로불린 쇄뿐만 아니라 그의 CDR의 예는 표 12에 개시된 것 (서열식별번호: 7-18 및 32-40)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 서열식별번호: 7-18 및 32-40, 및 44-45의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 임의의 폴리펩티드, 및 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 범주는 본원에 제시된 이뮤노글로불린 쇄 변이체, 예를 들어 서열식별번호: 7-18, 32-40, 및 44-45 중 임의의 것을 포함하는 단리된 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간화 항체)을 포함하며; 여기서 변이체는 하기 특성 중 1개 이상을 나타낸다: 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합함, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합함; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 CD27에 결합함; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합함; 시노몰구스 원숭이 또는 레서스 원숭이 CD27과 교차반응함; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단함; T 세포 활성화를 증가시킴; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27-발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T 발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 원숭이 CD27-발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도함; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 가짐; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시킴; 및 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킴. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다. 한 실시양태에서, 변이체는 서열식별번호: 7-18, 32-40 및 44-45 중 어느 하나와 관련하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 아미노산 치환을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD27 (예를 들어, 인간화 항체)에 결합하고 서열식별번호: 7-18 및 32-40 중 적어도 1개와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 및 VH 도메인을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며; 여기서 변이체는 목적하는 결합 및 특성을 나타내고, 예를 들어, 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 200 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27에 결합하고, 세포 ELISA 검정에 따라 150 pM 미만, 또는 250 pM 미만의 EC50으로 인간 CD27 A59T에 결합하고; 세포 ELISA 검정에 따라 100 pM 미만, 또는 150 pM 미만의 EC50으로 레서스 원숭이 CD27에 결합하고; 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정된 바와 같이, 약 5-10 nM의 2가 KD 값으로 인간 CD27 및 인간 CD27 (A59T)에 결합하고; 시노몰구스 원숭이 또는 레서스 원숭이 CD27과 교차반응하고; 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단하고; T 세포 활성화를 증가시키고; IL-2 및 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 자극하고; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 5 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27-발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도하고; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 10 nM 미만의 EC50으로 인간 CD27A59T-발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도하고; 항체 또는 그의 단편이 가용성 형태로 존재할 경우 1 nM 미만의 EC50으로 레서스 원숭이 CD27-발현 세포에서 NF-κB 활성화를 유도하고; CD8+ 또는 CD4+ T 세포 상의 인간 CD27에의 결합에 대해 0.5 nM 미만의 EC50을 갖고; 가용성 형태에서 CD8+ T 세포 활성화를 증가시키고; 인간 종양 배양물에서 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 증가시킨다. 한 실시양태에서, 인간 CD27, 인간 CD27A59T, 또는 레서스 CD27 발현 세포는 일시적으로 형질감염된 CD27 플라스미드를 갖는 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포이다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정되고, CD8+ T 세포 활성화에서 평균 약 1.5-2-배 증가가 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 증가는 항-CD27 항체 20 ug/ml 및 항-CD3 항체 10 ng/ml에서 적어도 1.5배이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD27 (예를 들어, 인간화 항체)에 결합하고 서열식별번호: 8, 14-18, 33, 35 및 40의 VL 도메인 중 어느 하나, 및 서열식별번호: 7, 9-13, 32, 34, 및 39의 VH 도메인 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 및 VH 도메인을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD27 (예를 들어, 인간화 항체)에 결합하고 서열식별번호: 8, 14-18, 33, 35 및 40의 VL 도메인 중 어느 하나, 및 서열식별번호: 7, 9-13, 32, 34, 및 39의 VH 도메인 중 어느 하나를 갖는 VL 도메인 및 VH 도메인을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD27 (예를 들어, 인간화 항체)에 결합하고 서열식별번호: 8, 14-18, 33, 35 및 40의 VL 도메인 중 어느 하나, 및 서열식별번호: 7, 9-13, 32, 34, 및 39의 VH 도메인 중 어느 하나와 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 및 VH 도메인을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 치환"은 단백질의 생물학적 활성을 변경시키지 않으면서 변화가 빈번하게 발생할 수 있도록 단백질의 아미노산을 유사한 특징 (예를 들어 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 백본 입체형태 및 강성 등)을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 이러한 기술분야의 통상의 기술자는, 일반적으로 폴리펩티드의 비-필수 영역 내 단일 아미노산 치환은 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다 (예를 들어, 문헌 [Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)] 참조). 또한, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산의 치환은 생물학적 활성을 방해할 가능성이 적다. 예시적인 보존적 치환이 표 1에 제시된다.
표 1. 예시적인 보존적 아미노산 치환
Figure pat00002
본 발명의 항체의 기능-보존적 변이체가 또한 본 발명에 의해 고려된다. 본원에 사용된 "기능-보존적 변이체"는 1개 이상의 아미노산 잔기가 항원 친화도 및/또는 특이성과 같은 목적하는 특성을 변경시키지 않으면서 변화된 항체 또는 단편을 지칭한다. 이러한 변이체는 아미노산의 유사한 특성을 갖는 것으로의 대체, 예컨대 표 1의 보존적 아미노산 치환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 최대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 갖는, 본 발명의 항-CD27 항체의 VL 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 8, 14-18, 33, 35 및 40), 및 본 발명의 항-CD27 항체의 VH 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 7, 9-13, 32, 34, 및 39)가 제공된다.
또 다른 실시양태에서, CD27에 결합하고, 본원에 기재된 VL 도메인 또는 VH 도메인 중 1개 이상에 대해 적어도 99% 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80% 또는 75% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 및 VH 도메인을 갖고, CD27에 대해 결합 특이성을 나타내는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 제공된다. 또 다른 실시양태에서 본 발명의 결합 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25개 또는 그 초과의 아미노산 치환을 갖는 VL 및 VH 도메인 (신호 서열을 갖거나 갖지 않음)을 포함하고, CD27에 대해 특이적 결합을 나타낸다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드
본 발명은 추가로, 본 발명의 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편의 폴리펩티드 또는 이뮤노글로불린 쇄 중 임의의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 서열식별번호: 1-18, 32-40, 및 44-45 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 46 또는 서열식별번호: 47, 또는 둘 다를 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
한 실시양태에서, 본원에 제시된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 DNA가 제공된다. 한 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본 발명에 따른 적어도 1개의 성숙 이뮤노글로불린 경쇄 가변 (VL) 도메인 및/또는 본 발명에 따른 적어도 1개의 성숙 이뮤노글로불린 중쇄 가변 (VH) 도메인을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩한다. 일부 실시양태에서 단리된 폴리뉴클레오티드는 단일 폴리뉴클레오티드 분자 상의 경쇄 및 중쇄 둘 다를 코딩하고, 다른 실시양태에서 경쇄 및 중쇄는 별개의 폴리뉴클레오티드 분자 상에 코딩된다. 또 다른 실시양태에서 폴리뉴클레오티드는 추가로 신호 서열을 코딩한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CDR-H1 (서열식별번호: 1), CDR-H2 (서열식별번호: 2) 및 CDR-H3 (서열식별번호: 3)을 포함하는 VH 도메인 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 CDR-L1 (서열식별번호: 4), CDR-L2 (서열식별번호: 5) 및 CDR-L3 (서열식별번호: 6)을 포함하는 VL 도메인 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 7의 VH 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 8의 VL 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 10-13 중 어느 하나의 VH 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 10의 VH 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 15-18 중 어느 하나의 VL 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 서열식별번호: 15의 VL 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 예를 들어, 발현 벡터, 예컨대 플라스미드를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포가 벡터로 형질감염된 경우에 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 또한, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 발현 벡터 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 핵산을 보유하는 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하고, 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 항원 또는 그의 항원-결합 단편을 단리하는 것을 포함하는, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 폴리펩티드를 생산하는 방법이 제공된다.
또한, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 75% 동일한, 80% 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95% (예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 예를 들어, 이뮤노글로불린 폴리펩티드가 본 발명에 포함되며, 이 때 비교는 BLAST 알고리즘에 의해 수행되고, 여기서 알고리즘의 파라미터는 각각의 참조 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 가장 큰 매치를 제공하도록 선택된다 (예를 들어 예상 역치: 10; 워드 크기: 3; 질의 범위 내의 최대 매치: 0; BLOSUM 62 매트릭스; 갭 코스트: 실존 11, 연장 1; 조건부 구성 스코어 매트릭스 조정).
서열 동일성은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 경우에 2개의 폴리펩티드의 아미노산이 동등한 위치에서 동일한 정도를 지칭한다.
하기 참고문헌은 서열 분석에 종종 사용되는 BLAST 알고리즘: BLAST 알고리즘: 문헌 [Altschul et al. (2005) FEBS J. 272(20): 5101-5109; Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70]; 정렬 스코어링 시스템: 문헌 [Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300]; 정렬 통계학: 문헌 [Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; and Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." in Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York]에 관한 것이다.
결합 친화도
예로서, 및 비제한적으로, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시, 인간 CD27-Fc 융합 단백질 또는 인간 CD27A59T-Fc 융합 단백질을 사용하여 측정된 바와 같이 10 x 10-9 M 또는 그 미만의 2가 KD 값으로 인간 CD27 또는 CD27A59T (서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 20)에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편은 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 비아코어) 또는 유사한 기술 (예를 들어 키넥사 또는 옥테트)에 의해 결정 시, 인간 CD27-Fc 융합 단백질 또는 인간 CD27A59T-Fc 융합 단백질을 사용하여 측정된 바와 같이 약 5-10 x 10-9 M의 2가 KD 값으로 인간 CD27 또는 CD27A59T에 결합할 수 있다.
면역 세포 활성화
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 면역 세포의 활성을 증가시킨다. 면역 세포의 활성의 증가는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 한 실시양태에서, 면역 세포의 활성의 증가는 면역 세포의 증식을 측정함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, T 세포의 활성의 증가는 T 세포의 증식 또는 신호 전달 사건, 예컨대 신호를 전사 조절인자에 전달하는 면역 수용체 또는 하류 키나제의 티로신 인산화를 측정함으로써 검출될 수 있다. 다른 실시양태에서, 면역 세포의 활성의 증가는 항종양 면역의 자극과 연관되는, 특이적 표적 세포 또는 IFNγ 시토카인 반응에 대한 CTL 또는 NK 세포 세포독성 기능을 측정함으로써 검출될 수 있다. 또한 다른 실시양태에서, 면역 세포의 활성의 증가는 대상체로부터 유래된 샘플에서 T 세포 활성화를 생체외 측정함으로써 검출될 수 있다. 한 실시양태에서, T 세포의 활성의 증가는 (i) IL-2, TNFα, IL-17, IFNγ, IL-1β, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염증유발 시토카인의 SEB (스타필로코쿠스 장독소 B) 유도된 생산을 측정하거나; 또는 (ii) IL-2, TNFα, IL-17, IFNγ, IL-1β, GM-CSF, RANTES, IL-6, IL-8, IL-5 및 IL-13으로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인의 생산을 유도하는 TCR 신호전달에 대한 혼합 림프구 반응 또는 직접 항-CD3 mAb 자극을 측정함으로써 결정된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 IL-2 및/또는 IFNγ의 항원-특이적 T-세포 생산을 적어도 1.5배만큼 자극할 것이다.
일부 실시양태에서, 면역 세포의 활성을 증가시키는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 능력은 유동 세포측정법에 의해 CD25 및 CD69 상향조절에 의해 검출될 수 있다.
hCD70에 결합하는 것을 차단하는 항-hCD27 항체의 능력
일부 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단할 수 있다. 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단하는 능력은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 CD27이 인간 CD70에 결합하는 것을 차단하는 항체의 능력은 ELISA 검정을 사용하여 결정된다.
항체 및 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법
따라서, 본 발명은 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 하이브리도마 세포를, 이러한 발현에 유리한 조건 하에 배양하는 단계 및, 임의로, 하이브리도마 및/또는 성장 배지 (예를 들어 세포 배양 배지)로부터 항체 또는 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 포함한다.
본원에 개시된 항-CD27 항체는 또한, 재조합적으로 생산될 수 있다 (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)/T7 발현 시스템, 포유동물 세포 발현 시스템 또는 하등 진핵생물 발현 시스템에서). 이러한 실시양태에서, 본 발명의 항체 이뮤노글로불린 분자 (예를 들어, VH 또는 VL)를 코딩하는 핵산은 pET-기반 플라스미드 내로 삽입되고 이. 콜라이/T7 시스템에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 또한 T7 프로모터에 작동가능하게 연결된 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포에서 T7 RNA 폴리머라제를 발현시키는 것을 포함하는, 숙주 세포 (예를 들어, 박테리아 숙주 세포 예컨대 이. 콜라이 예컨대 BL21 또는 BL21DE3)에서 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 이뮤노글로불린 쇄를 발현시키는 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 박테리아 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이는 lac 프로모터에 작동가능하게 연결된 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 폴리머라제 및 쇄의 발현은 숙주 세포를 IPTG (이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)와 함께 인큐베이션하는 것에 의해 유도된다.
관련 기술분야에 공지된 재조합 항체를 생산하는 여러 방법이 존재한다. 항체의 재조합 생산을 위한 방법의 한 예가 미국 특허 번호 4,816,567에 개시되어 있다.
형질전환은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 임의의 공지된 방법에 의해 이루어질 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜 내의 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 바이오리스틱 주사 및 핵 내로의 DNA의 직접 미세주사를 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포 내로 도입될 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,399,216; 4,912,040; 4,740,461 및 4,959,455를 참조한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 1개 이상의 이뮤노글로불린 쇄 (예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄 이뮤노글로불린)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계; 숙주 세포 (예를 들어, CHO 또는 피키아 또는 피키아 파스토리스)를 이러한 발현에 유리한 조건 하에 배양하는 단계 및, 임의로, 숙주 세포 및/또는 숙주 세포가 성장하는 배지로부터 항체 또는 단편 또는 쇄를 단리하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 이뮤노글로불린 쇄를 제조하는 재조합 방법을 포함한다.
항-CD27 항체는 또한, 미국 특허 번호 6,331,415에 제시된 방법 중 임의의 것에 의해서도 합성할 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 단편 또는 이뮤노글로불린 쇄의 발현을 위한 숙주로서, 포유동물 세포를 포함하는 진핵 및 원핵 숙주 세포는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 입수가능한 많은 불멸화 세포주를 포함한다. 이들은, 특히, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, NSO, SP2 세포, HeLa 세포, 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포, 원숭이 신장 세포 (COS), 인간 간세포성 암종 세포 (예를 들어, Hep G2), A549 세포, 3T3 세포, HEK-293 세포 및 수많은 다른 세포주를 포함한다. 포유동물 숙주 세포는 인간, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말 및 햄스터 세포를 포함한다. 특히 바람직한 세포주는 어느 세포주가 높은 발현 수준을 갖는지 결정하는 것을 통해 선택된다. 사용될 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 세포, 양서류 세포, 박테리아 세포, 식물 세포 및 진균 세포이다. 진균 세포는, 예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 핀란디카(Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피키아 코클라마에(Pichia koclamae), 피키아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피키아 미누타(Pichia minuta) (오가타에아 미누타(Ogataea minuta), 피키아 린드네리(Pichia lindneri)), 피키아 오푼티아에(Pichia opuntiae), 피키아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피키아 구에르쿠움(Pichia guercuum), 피키아 피즈페리(Pichia pijperi), 피키아 스팁티스(Pichia stiptis), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 종, 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스 종, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로미세스 종(Kluyveromyces sp.), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae), 트리코더마 레에세이(Trichoderma reesei), 크리소스포리움 룩크노웬세(Chrysosporium lucknowense), 푸사리움 종(Fusarium sp.), 푸사리움 그라미네움(Fusarium gramineum), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens), 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)를 포함한 효모 및 사상 진균 세포를 포함한다. 피키아 종, 임의의 사카로미세스 종, 한세눌라 폴리모르파, 임의의 클루이베로미세스 종, 칸디다 알비칸스, 임의의 아스페르길루스 종, 트리코더마 레에세이, 크리소스포리움 룩크노웬세, 임의의 푸사리움 종, 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 및 뉴로스포라 크라사. 중쇄 또는 그의 항원-결합 부분 또는 단편, 경쇄 및/또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입된 경우에, 항체는 숙주 세포에서 항체 또는 단편 또는 쇄의 발현 또는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 내로의 분비를 가능하게 하는데 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다.
항체 및 그의 항원-결합 단편 및 이뮤노글로불린 쇄는 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 추가로, 생산 세포주로부터의 본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편 및 이뮤노글로불린 쇄 (또는 그로부터의 다른 모이어티)의 발현은 다수의 공지된 기술을 사용하여 증진될 수 있다. 예를 들어, 글루타민 신테타제 유전자 발현 시스템 (GS 시스템)은 특정 조건 하에 발현을 증진시키기 위한 통상의 접근법이다. GS 시스템은 유럽 특허 번호 0 216 846, 0 256 055, 및 0 323 997 및 유럽 특허 출원 번호 89303964.4와 관련하여 전체적으로 또는 부분적으로 논의된다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포 (예를 들어, CHO)는 글루타민 신테타제 유전자가 결여되고 배지에서 글루타민의 부재 하에 성장되지만, 이뮤노글로불린 쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 글루타민 신테타제 유전자를 포함하고, 이는 숙주 세포에서의 유전자의 결여를 보완한다.
일반적으로, 특정한 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 당단백질은 세포주 또는 트랜스제닉 동물에서 생산된 당단백질에 대해 특징적인 글리코실화 패턴을 가질 것이다. 따라서, 항체의 특정한 글리코실화 패턴은 항체를 생산하는데 사용되는 특정한 세포주 또는 트랜스제닉 동물에 좌우될 것이다. 그러나, 본원에 제공된 핵산 분자에 의해 코딩되거나, 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체가 가질 수 있는 글리코실화 패턴과 무관하게 본 발명을 구성한다. 유사하게, 특정한 실시양태에서, 단지 비-푸코실화 N-글리칸만을 포함하는 글리코실화 패턴을 갖는 항체는 이들 항체가 전형적으로 시험관내 및 생체내 둘 다에서 그의 푸코실화 대응물보다 더 강력한 효능을 나타내는 것으로 밝혀졌기 때문에, 유리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003)]; 미국 특허 번호 6,946,292 및 7,214,775 참조). 비-푸코실화 N-글리칸을 갖는 이들 항체는 그의 탄수화물 구조가 인간 혈청 IgG에 존재하는 집단의 정상 성분이기 때문에 면역원성일 가능성이 없다.
본 발명은 CD27 및 또 다른 항원, 예컨대, 예를 들어 PD-1, PD-L1 또는 LAG-3에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이적 및 이중기능적 항체 및 항원-결합 단편, 및 그의 사용 방법을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항-CD27 쇄는 표 12에 기재된 VH/VL 서열 중 어느 하나를 포함하고, 항-PD1 쇄는 서열식별번호: 48 및 53 또는 서열식별번호: 78 및 52의 아미노산 서열 (또는 상기 서열 중 임의의 것의 항원 결합 단편)을 포함한다. 이중특이적 또는 이중기능적 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함한 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai, et al., (1990) Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321, Kostelny, et al., (1992) J Immunol. 148:1547-1553]을 참조한다. 또한, 이중특이적 항체는 "디아바디" (Holliger, et al., (1993) PNAS USA 90:6444-6448)로서 또는 "야누신" (Traunecker, et al., (1991) EMBO J. 10:3655-3659 및 Traunecker, et al., (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:51-52)으로서 형성될 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에 개시된 항-CD27 항체의 항-CD27 항원-결합 단편을 포함한다. 항체 단편은, 예를 들어, 펩신에 의한 IgG의 효소적 절단에 의해 생산될 수 있는 F(ab)2 단편을 포함한다. Fab 단편은, 예를 들어, 디티오트레이톨 또는 메르캅토에틸아민에 의한 F(ab)2의 환원에 의해 생산될 수 있다.
이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류로 할당될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상이한 불변 도메인이, 본원에 제공된 CDR로부터 유래된 인간화 VL 및 VH 영역에 첨부될 수 있다. 적어도 5가지의 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 추가로 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; IgA1 및 IgA2로 나뉠 수 있다. 본 발명은 이들 부류 또는 하위부류의 항체 중 임의의 것의 항체 및 항원-결합 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 불변 영역, 예컨대 γ1, γ2, γ3 또는 γ4 인간 중쇄 불변 영역 또는 그의 변이체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 경쇄 불변 영역, 예컨대 람다 또는 카파 인간 경쇄 영역 또는 그의 변이체를 포함한다. 예로서, 및 비제한적으로 인간 중쇄 불변 영역은 γ4일 수 있고 인간 경쇄 불변 영역은 카파일 수 있다. 대안적 실시양태에서, 항체의 Fc 영역은 Ser228Pro 돌연변이를 갖는 γ4이다 (Schuurman, J et al., Mol. Immunol. 38: 1-8, 2001).
한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG1 하위유형의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG2 하위유형의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG4 하위유형의 중쇄 불변 영역을 포함한다.
항체 조작
예를 들어 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 특성을 개선시키기 위해, 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편이 모 hCD27.131A 모노클로날 항체의 가변 도메인 내의 프레임워크 잔기에 대한 변형을 포함하도록 조작된 항체인 실시양태가 추가로 포함된다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체 또는 단편의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 이는 통상적으로, 모 (예를 들어, 설치류) 항체 또는 단편의 가변 도메인 내의 비-CDR 잔기 (즉, 프레임워크 잔기)를, 항체가 사용될 종의 면역 레퍼토리로부터의 유사한 잔기, 예를 들어 인간 치료제의 경우에 인간 잔기로 대체함으로써 달성된다. 이러한 항체 또는 단편은 "인간화" 항체 또는 단편으로 지칭된다. 일부 경우에, 조작된 (예를 들어, 인간화) 항체의 친화도를 증가시키거나 또는 특이성을 변경시키는 것이 바람직하다. 하나의 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 배선 서열로 "복귀돌연변이"시키는 것이다. 보다 구체적으로, 체세포 돌연변이를 거친 항체 또는 단편은, 항체가 유래된 배선 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 또는 단편 프레임워크 서열을, 항체 또는 단편이 유래된 배선 서열과 비교함으로써 확인할 수 있다. 또 다른 접근법은 조작된 (예를 들어 인간화) 항체의 1개 이상의 위치에서 원래의 모 (예를 들어, 설치류) 잔기로 복귀시키는 것, 예를 들어 프레임워크 잔기를 대체하는 과정에서 손실될 수 있는 결합 친화도를 복원하는 것이다. (예를 들어, 미국 특허 번호 5,693,762, 미국 특허 번호 5,585,089 및 미국 특허 번호 5,530,101 참조).
특정 실시양태에서, 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편은 그의 특성을 개선시키기 위해 프레임워크 및/또는 CDR에서 변형을 포함하도록 조작된다 (예를 들어, 인간화된다). 이러한 조작된 변화는 분자 모델링에 기초할 수 있다. 모 (비-인간) 항체 서열에 대한 가변 영역에 대한 분자 모델을 구축하여 항체의 구조적 특색을 이해할 수 있고, 이를 사용하여 항원과 상호작용할 수 있는 항체 상의 잠재적 영역을 확인할 수 있다. 통상적인 CDR은 이뮤노글로불린 서열의 정렬 및 가변 영역 확인에 기초한다. 문헌 [Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md. ; 5th ed.; NIH Publ. No. 91-3242; Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616]. 코티아(Chothia) 및 동료들은 항체의 결정 구조에서 루프의 입체형태를 세심하게 검사하고 초가변 루프를 제안하였다. 문헌 [Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 또는 Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883]. "CDR" 및 "초가변 루프"로서 분류된 영역들 사이에는 변동이 존재한다. 나중의 연구 (Raghunathan et al., (2012) J. Mol Recog. 25, 3, 103-113)는 여러 항체-항원 결정 복합체를 분석하였고, 항체의 항원 결합 영역이 "CDR" 잔기 또는 "초가변" 루프와 반드시 엄격하게 일치하지 않는다는 것을 관찰하였다. 비-인간 항체의 가변 영역에 대한 분자 모델을 사용하여, 항원에 잠재적으로 결합할 수 있는 영역의 선택을 가이드할 수 있다. 실제로, 모델에 기초한 잠재적 항원 결합 영역은 통상적인 "CDR" 또는 "초가변" 루프와 상이하다. 분자 모델링을 위해 MOE (케미칼 컴퓨팅 그룹(Chemical Computing Group))와 같은 상업용 과학 소프트웨어를 사용할 수 있다. 프레임워크 및 CDR 둘 다에서 비-인간 서열과 가장 잘 매칭되는 것에 기초하여 인간 프레임워크를 선택할 수 있다. VH 내 FR4 (프레임워크 4)의 경우에는, 인간 배선에 대한 VJ 영역을 상응하는 비-인간 영역과 비교한다. VL 내 FR4 (프레임워크 4)의 경우에는, 인간 배선 서열의 J-카파 및 J-람다 영역을 상응하는 비-인간 영역과 비교한다. 일단 적합한 인간 프레임워크가 확인되면, CDR을 선택된 인간 프레임워크 내로 그라프팅한다. 일부 경우에, VL-VH 계면 내의 특정 잔기가 비-인간 (모) 서열 내에서와 같이 보유될 수 있다. 또한, CDR 입체형태를 잠재적으로 변경시킬 수 있으므로 항원에 대한 결합을 변경시킬 수 있는 잔기를 확인하기 위해 분자 모델을 사용할 수 있다. 일부 경우에, 이들 잔기가 비-인간 (모) 서열 내에서와 같이 보유된다. 분자 모델은 또한, 원치 않는 효과, 예컨대 글리코실화, 탈아미드화 및 산화를 초래할 수 있는, 용매 노출된 아미노산을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 개발가능성 필터는 이들 잠재적 문제를 제거/최소화하기 위해 설계 단계에서 초기에 도입될 수 있다.
또 다른 유형의 프레임워크 변형은 프레임워크 영역 내의, 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거함으로써 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이러한 접근법은 또한 "탈면역화"로서 지칭되고, 미국 특허 번호 7,125,689에 추가로 상세히 기재되어 있다.
특정한 실시양태에서, 최종 항체의 보다 큰 화학적 안정성을 제공하기 위해 노출된 측쇄를 함유하는 특정 아미노산을 또 다른 아미노산 잔기로 변화시켜 탈아미드화 또는 이성질화를 회피하는 것이 바람직할 것이다. 아스파라긴의 탈아미드화는 NG, DG, NG, NS, NA, NT, QG 또는 QS 서열에서 일어날 수 있고, 폴리펩티드 쇄 내로 킹크를 도입하고 그의 안정성을 감소시키는 이소아스파르트산 잔기의 생성을 발생시킬 수 있다 (이소아스파르트산 효과). 이성질화는 DG, DS, DA 또는 DT 서열에서 일어날 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 탈아미드화 또는 아스파라긴 이성질현상 부위를 함유하지 않는다.
예를 들어, 아스파라긴 (Asn) 잔기는 Gln 또는 Ala로 변화되어 특히 CDR 내의 임의의 Asn-Gly 서열에서의 이소아스파르테이트의 형성에 대한 잠재력을 감소시킬 수 있다. 유사한 문제가 Asp-Gly 서열에서 일어날 수 있다. 문헌 [Reissner and Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281]. 이소아스파르테이트 형성은 그의 표적 항원에 대한 항체의 결합을 약화시키거나 또는 완전히 제거할 수 있다. 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734]을 참조한다. 한 실시양태에서, 아스파라긴은 글루타민 (Gln)으로 변화된다. 소형 아미노산이 아스파라긴 또는 글루타민에 인접하여 존재하는 경우에 보다 큰 비율로 발생하는 탈아미드화의 가능성을 감소시키기 위해 아스파라긴 (Asn) 또는 글루타민 (Gln) 잔기에 인접한 아미노산을 변경시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 문헌 [Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261]을 참조한다. 또한, CDR 내의 임의의 메티오닌 잔기 (전형적으로 용매 노출된 Met)는 항원-결합 친화도를 감소시키고 또한 최종 항체 제제에서 분자 불균질성에 기여할 수 있는, 메티오닌 황이 산화될 가능성을 감소시키기 위해 Lys, Leu, Ala, 또는 Phe 또는 다른 아미노산으로 변화될 수 있다. Id. 부가적으로, 잠재적으로 절단가능한 Asn-Pro 펩티드 결합을 방지하거나 또는 최소화하기 위해, CDR에서 발견되는 임의의 Asn-Pro 조합을 Gln-Pro, Ala-Pro, 또는 Asn-Ala로 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 치환을 갖는 항체는, 치환이 CD27에 대한 항체의 친화도 또는 특이성, 또는 다른 목적하는 생물학적 활성을 허용되지 않는 수준으로 감소시키지 않는다는 것을 확실하게 하기 위해 후속적으로 스크리닝된다.
표 2. 예시적인 안정화 CDR 변이체
Figure pat00003
Fc 영역의 항체 조작
본원에 개시된 항체 (예를 들어, 인간화 항체) 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 또한, 전형적으로 항체의 1종 이상의 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 이펙터 기능 (예를 들어, 항원-의존성 세포성 세포독성)을 변경시키기 위해, Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 더욱이, 본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 그의 글리코실화를 변경시켜 항체 또는 단편의 1종 이상의 특성을 다시 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 각각의 이들 실시양태가 하기에 추가로 상세하게 기재된다. Fc 영역에서의 잔기의 넘버링은 카바트의 EU 인덱스의 것이다.
본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 또한 변경된 이펙터 기능을 제공하도록 변형된 (또는 차단된) Fc 영역을 갖는 항체 및 단편을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,624,821; WO2003/086310; WO2005/120571; WO2006/0057702를 참조한다. 이러한 변형은 진단 및 요법에서 가능한 유익한 효과를 갖는 면역계의 다양한 반응을 증진시키거나 또는 억제하는데 사용될 수 있다. Fc 영역의 변경은 아미노산 변화 (치환, 결실 및 삽입), 글리코실화 또는 탈글리코실화, 및 다중 Fc 영역의 부가를 포함한다. Fc에 대한 변화는 또한 치료 항체에서 항체의 반감기를 변경시킬 수 있고, 이는 보다 덜 빈번한 투여를 가능하게 하고 따라서 편의성을 증가시키고 물질의 사용을 감소시킨다. 문헌 [Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734-35]을 참조한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 중쇄 불변 영역의 힌지 영역 내의 위치 228에 상응하는 위치에서 세린에서 프롤린으로의 돌연변이 (S228P; EU 인덱스)를 포함하는 IgG4 이소형 항체 또는 단편이다. 이러한 돌연변이는 힌지 영역 내의 중쇄간 디술피드 가교의 불균질성을 제거하는 것으로 보고되어 있다 (상기 문헌 [Angal et al.]; 위치 241은 카바트 넘버링 시스템을 기초로 함).
본 발명의 한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 증가 또는 감소되도록 변형된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)의 Fc 힌지 영역은 항체 또는 단편의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체 또는 단편이 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 1개 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역 내로 도입된다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 그의 생물학적 반감기를 증가시키기 위해 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 하기 돌연변이: 미국 특허 번호 6,277,375에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F 중 1개 이상이 도입될 수 있다. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 CH1 또는 CL 영역 내에서, 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 유도된 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 변경될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, Fc 영역은 항체 또는 항원-결합 단편의 이펙터 기능(들)을 변경시키기 위해 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것에 의해 변경된다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 1개 이상의 아미노산은 항체가 이펙터 리간드에 대한 변경된 친화도를 갖고 모 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소 또는 제거된 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 1개 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 6,194,551에 추가로 상세히 기재되어 있다.
또 다른 예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 1개 이상의 아미노산 잔기가 변경되어 그에 의해 보체를 고정시키는 항체의 능력이 변경된다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 94/29351에 추가로 기재되어 있다.
또 다른 예에서, Fc 영역은 하기 위치: 238, 239, 243, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439의 1개 이상의 아미노산을 변형시킴으로써 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)의 능력을 감소시키고/거나 Fcγ 수용체에 대한 항체 또는 단편의 친화도를 감소시키도록 변형된다. 이러한 접근법은 PCT 공개 WO 00/42072에 추가로 기재되어 있다. 또한, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되어 있고, 개선된 결합을 갖는 변이체가 기재되어 있다 (문헌 [Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 참조).
본 발명의 한 실시양태에서, Fc 영역은 잔기 243 및 264를 변형시킴으로써 이펙터 기능을 매개하는 본 발명의 항체 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)의 능력을 감소시키고/거나 항염증 특성을 증가시키도록 변형된다. 한 실시양태에서, 항체 또는 단편의 Fc 영역은 위치 243 및 264의 잔기를 알라닌으로 변화시킴으로써 변형된다. 한 실시양태에서, Fc 영역은 잔기 243, 264, 267 및 328을 변형시킴으로써 이펙터 기능을 매개하는 항체 또는 단편의 능력을 감소시키고/거나 항염증 특성을 증가시키도록 변형된다.
변경된 이펙터 기능
일부 실시양태에서, 항-CD27 항체의 Fc 영역은 이펙터 기능을 매개하는 항체 또는 항원-결합 단편의 능력을 증가 또는 감소시키고/거나 Fc감마 수용체 (FcγR)에 대한 그의 결합을 증가/감소시키도록 변형된다.
본원에 사용된 용어 "이펙터 기능"은 항체 의존성 세포 매개 세포독성 활성 (ADCC), 보체-의존성 세포독성 활성 (CDC) 매개된 반응, Fc-매개된 식세포작용 또는 항체 의존성 세포성 식세포작용 (ADCP) 및 FcRn 수용체를 통한 항체 재순환 중 1종 이상을 지칭하는 것으로 의도된다.
항원 결합 단백질의 불변 영역과 Fc감마RI (CD64), Fc감마RII (CD32) 및 Fc감마RIII (CD16)을 포함한 다양한 Fc 수용체 (FcR) 사이의 상호작용은 항원 결합 단백질의 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 및 CDC를 매개하는 것으로 여겨진다. Fc 수용체는 또한 항종양 면역에 중요할 수 있는 항체 가교에 중요하다.
이펙터 기능은 ADCC 이펙터 기능을 측정하기 위해, 예를 들어 자연 킬러 세포에 대한 Fc감마RIII의 결합을 통한 방식 또는 단핵구/대식세포에 대한 Fc감마RI의 결합을 통한 방식을 포함한 수많은 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항원 결합 단백질은 자연 킬러 세포 검정에서 ADCC 이펙터 기능에 대해 평가될 수 있다. 이러한 검정의 예는 문헌 [Shields et al., 2001 J. Biol. Chem., Vol. 276, p 6591-6604; Chappel et al., 1993 J. Biol. Chem., Vol 268, p 25124-25131; Lazar et al., 2006 PNAS, 103; 4005-4010]에서 찾을 수 있다.
잔기 Asn297 상의 특정 돌연변이 또는 변경된 글리코실화를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역은 Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 다른 경우에, 돌연변이는 또한 ADCC 및 CDC를 증진시키는 것으로 밝혀졌다 (Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604; Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817).
본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 돌연변이는 239, 332 및 330 (IgG1)으로부터 선택된 위치 중 1개 이상, 또는 다른 IgG 이소형의 동등한 위치에 존재한다. 적합한 돌연변이의 예는 S239D 및 I332E 및 A330L이다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 본 발명의 항원 결합 단백질은 위치 239 및 332에서, 예를 들어 S239D 및 I332E로 돌연변이되거나 또는 추가 실시양태에서 이는 239 및 332 및 330으로부터 선택된 3개 이상의 위치에서, 예를 들어 S239D 및 I332E 및 A330L로 돌연변이된다. (EU 인덱스 넘버링).
본 발명의 대안적 실시양태에서, 항원 결합 단백질이 증진된 이펙터 기능을 갖도록 변경된 글리코실화 프로파일을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체가 제공된다. 예를 들어, 여기서 항체는 증진된 ADCC 또는 증진된 CDC를 갖거나 또는 증진된 ADCC 및 CDC 이펙터 기능 둘 다를 갖는다. 변경된 글리코실화 프로파일을 갖는 항원 결합 단백질을 생산하는데 적합한 방법론의 예가 WO2003011878, WO2006014679 및 EP1229125에 기재되어 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 "비-푸코실화" 또는 "비-푸코실화" 항체를 제공한다. 비-푸코실화 항체는 푸코스 잔기가 없는 Fc의 복합-유형 N-글리칸의 트리-만노실 코어 구조를 보유한다. Fc N-글리칸으로부터의 코어 푸코스 잔기가 결여된 이들 당조작된 항체는 Fc감마RIIIa 결합 능력의 증진으로 인해 푸코실화 등가물보다 더 강력한 ADCC를 나타낼 수 있다.
본 발명은 또한 a) 본원에 기재된 바와 같은 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계이며, 여기서 재조합 숙주 세포는 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 포함하지 않는 것인 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항체의 생산 방법을 제공한다. 재조합 숙주 세포는 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자를 정상적으로 함유하지 않을 수 있거나 (예를 들어 효모 숙주 세포 예컨대 피키아 종) 또는 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 불활성화시키도록 유전자 변형될 수 있다. 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 FUT8 유전자를 불활성화시키도록 유전자 변형된 재조합 숙주 세포가 이용가능하다. 예를 들어, FUT8 유전자의 기능적 카피가 결여된 CHOK1SV 세포가 기능적 FUT8 유전자를 갖는 세포에서 생산된 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가된, 증진된 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는, 바이오와, 인크.(BioWa, Inc.) (뉴저지주 프린스턴)로부터 입수가능한 포텔리젠트(POTELLIGENT)™ 기술 시스템을 참조한다. 포텔리젠트™ 기술 시스템의 측면은 US7214775, US6946292, WO0061739 및 WO0231240에 기재되어 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 또한 다른 적절한 시스템을 인식할 것이다.
이러한 변형이 단독으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 이펙터 기능을 추가로 증진시키거나 또는 감소시키기 위해 서로 조합되어 사용될 수 있다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
변형된 글리코실화를 갖는 항체의 생산
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 특정한 글리코실화 패턴을 포함한다. 예를 들어, 비-푸코실화 또는 비-글리코실화 항체 또는 단편이 제조될 수 있다 (즉, 항체는 각각 푸코스 또는 글리코실화가 결여됨). 항체 또는 단편의 글리코실화 패턴은, 예를 들어, CD27 항원에 대한 항체 또는 단편의 친화도 또는 결합력을 증가시키도록 변경될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어, 항체 또는 단편 서열 내의 글리코실화 부위 중 1개 이상을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 아미노산 치환은 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위 중 1개 이상을 제거하는 결과를 만들고, 그에 의해 그 부위에서 글리코실화를 제거할 수 있다. 이러한 비-글리코실화는 항원에 대한 항체 또는 단편의 친화도 또는 결합력을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,714,350 및 6,350,861을 참조한다.
본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 추가로 포유동물- 또는 인간-유사 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질을 생산하도록 유전자 조작된 하등 진핵생물 숙주 세포, 특히 진균 숙주 세포 예컨대 효모 및 사상 진균에서 생산된 것을 포함할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Choi et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 5022-5027; Hamilton et al., (2003) Science 301: 1244-1246; Hamilton et al., (2006) Science 313: 1441-1443; Nett et al., Yeast 28(3):237-52 (2011); Hamilton et al., Curr Opin Biotechnol. Oct;18(5):387-92 (2007)] 참조). 현재 사용되는 포유동물 세포주에 비해 이들 유전자 변형된 숙주 세포의 특정한 이점은 세포에서 생산되는 당단백질의 글리코실화 프로파일을 제어할 수 있는 능력으로, 이로써 특정한 N-글리칸 구조가 우세한 당단백질의 조성물이 생산될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,029,872 및 미국 특허 번호 7,449,308 참조). 이들 유전자 변형된 숙주 세포는 우세하게 특정한 N-글리칸 구조를 갖는 항체를 생산하는데 사용되어 왔다 (예를 들어, 문헌 [Li et al., (2006) Nat. Biotechnol. 24: 210-215] 참조).
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 추가로, 하등 진핵 숙주 세포에서 생산되고 푸코실화 및 비-푸코실화 하이브리드, 및 GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2; NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2와 같은 N-글리칸을 포함하나 이에 제한되지는 않는 이등분된 종 및 다중안테나 종을 포함한 복합 N-글리칸을 포함하는 것을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 GlcNAcMan5GlcNAc2; GalGlcNAcMan5GlcNAc2; 및 NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 하이브리드 N-글리칸을 갖는 항체 또는 단편을 포함할 수 있다. 특정한 측면에서, 하이브리드 N-글리칸은 조성물에서 우세한 N-글리칸 종이다.
특정한 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 GlcNAcMan3GlcNAc2; GalGlcNAcMan3GlcNAc2; NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2; GlcNAc2Man3GlcNAc2; GalGlcNAc2Man3GlcNAc2; Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2; 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 복합 N-글리칸을 갖는 항체 및 단편을 포함한다. 특정한 측면에서, 복합 N-글리칸은 조성물에서 우세한 N-글리칸 종이다. 추가 측면에서, 복합 N-글리칸은 조성물에서 복합 N-글리칸의 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 포함하는 특정한 N-글리칸 종이다. 한 실시양태에서, 본원에 제공된 항체 및 그의 항원 결합 단편은 복합 N-글리칸을 포함하며, 여기서 복합 N-글리칸의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%는 구조 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2를 포함하고, 여기서 이러한 구조는 비-푸코실화된다. 이러한 구조는, 예를 들어, 조작된 피키아 파스토리스 숙주 세포에서 생산될 수 있다.
특정한 실시양태에서, N-글리칸은 푸코실화된다. 일반적으로, 푸코스는 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc를 갖는 α1,3-연결, N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc를 갖는 α1,6-연결, N-글리칸의 비-환원 말단에서 Gal을 갖는 α1,2-연결, N-글리칸의 비-환원 말단에서 GlcNac를 갖는 α1,3-연결, 또는 N-글리칸의 비-환원 말단에서 GlcNAc를 갖는 α1,4-연결로 존재한다.
따라서, 상기 당단백질 조성물의 특정한 측면에서, 당형태는 Man5GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc), Man3GlcNAc2(Fuc), GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc), GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc), 및 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)로 이루어진 군으로부터 선택된 당형태를 생산하는 α1,3-연결 또는 α1,6-연결 푸코스; GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2, GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2, GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 당형태를 생산하는 α1,3-연결 또는 α1,4-연결 푸코스; 또는 Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2, Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2, 및 NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2로 이루어진 군으로부터 선택된 당형태를 생산하는 α1,2-연결 푸코스로 존재한다.
추가 측면에서, 항체 (예를 들어, 인간화 항체) 또는 그의 항원-결합 단편은 Man8GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man5GlcNAc2, Man4GlcNAc2, 또는 Man3GlcNAc2 N-글리칸 구조로 이루어진 N-글리칸을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고 만노스 N-글리칸을 포함한다.
상기의 추가 측면에서, 복합 N-글리칸은 추가로, 푸코실화 및 비-푸코실화 이등분된 종 및 다중안테나 종을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "N-글리칸" 및 "당형태"는 상호교환가능하게 사용되고 N-연결된 올리고사카라이드, 예를 들어, 아스파라긴-N-아세틸글루코사민 연결에 의해 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기에 부착된 것을 지칭한다. N-연결된 당단백질은 단백질 내의 아스파라긴 잔기의 아미드 질소에 연결된 N-아세틸글루코사민 잔기를 함유한다. 당단백질 상에서 발견되는 우세한 당은 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, N-아세틸갈락토사민 (GalNAc), N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 및 시알산 (예를 들어, N-아세틸-뉴라민산 (NANA))이다. 당 기의 프로세싱은 ER의 내강에서 번역과 동시에 일어나고, N-연결된 당단백질의 경우 골지체에서 번역 후 계속된다.
N-글리칸은 Man3GlcNAc2 ("Man"은 만노스를 지칭하고; "Glc"는 글루코스를 지칭하고; "NAc"는 N-아세틸을 지칭하고; GlcNAc는 N-아세틸글루코사민을 지칭함)의 공통 펜타사카라이드 코어를 갖는다. 통상적으로, N-글리칸 구조는 비-환원 말단이 왼쪽으로 및 환원 말단이 오른쪽으로 제시된다. N-글리칸의 환원 말단은 단백질 상의 글리코실화 부위를 포함하는 Asn 잔기에 부착된 말단이다. N-글리칸은 또한 "트리만노스 코어", "펜타사카라이드 코어" 또는 "소수-만노스 코어"로 지칭되는 Man3GlcNAc2 ("Man3") 코어 구조에 부가된 말초 당 (예를 들어, GlcNAc, 갈락토스, 푸코스 및 시알산)을 포함하는 분지 (안테나)의 수와 관련하여 상이하다. N-글리칸은 그의 분지형 구성성분 (예를 들어, 고 만노스, 복합 또는 하이브리드)에 따라 분류된다. "고 만노스" 유형 N-글리칸은 5개 이상의 만노스 잔기를 갖는다. "복합" 유형 N-글리칸은 전형적으로 "트리만노스" 코어의 1,3 만노스 아암에 부착된 적어도 1개의 GlcNAc 및 1,6 만노스 아암에 부착된 적어도 1개의 GlcNAc를 갖는다. 복합 N-글리칸은 또한 시알산 또는 유도체 (예를 들어, "NANA" 또는 "NeuAc", 여기서 "Neu"는 뉴라민산을 지칭하고 "Ac"는 아세틸을 지칭함)로 임의로 변형된 갈락토스 ("Gal") 또는 N-아세틸갈락토사민 ("GalNAc") 잔기를 가질 수 있다. 복합 N-글리칸은 또한 "이등분" GlcNAc 및 코어 푸코스 ("Fuc")를 포함하는 쇄내 치환을 가질 수 있다. 복합 N-글리칸은 또한 "트리만노스 코어" 상에 다중 안테나를 가질 수 있고, 이는 종종 "다중 안테나 글리칸"으로 지칭된다. "하이브리드" N-글리칸은 트리만노스 코어의 1,3 만노스 아암의 말단에 적어도 1개의 GlcNAc 및 트리만노스 코어의 1,6 만노스 아암에 0개 이상의 만노스를 갖는다. 다양한 N-글리칸이 또한 "당형태"로 지칭된다.
복합 N-글리칸과 관련하여, 용어 "G-2", "G-1", "G0", "G1", "G2", "A1", 및 "A2"는 하기를 의미한다. "G-2"는 Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "G-1"은 GlcNAcMan3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "G0"은 GlcNAc2Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "G1"은 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "G2"는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "A1"은 NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭하고; 용어 "A2"는 NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있는 N-글리칸 구조를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 용어 G-2", "G-1", "G0", "G1", "G2", "A1", 및 "A2"는 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기에 부착된 푸코스가 결여된 N-글리칸 종을 지칭한다. 용어가 "F"를 포함하는 경우에, "F"는 N-글리칸 종이 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기 상에 푸코스 잔기를 함유한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, G0F, G1F, G2F, A1F, 및 A2F는 모두 N-글리칸이 N-글리칸의 환원 말단에서 GlcNAc 잔기에 부착된 푸코스 잔기를 추가로 포함한다는 것을 나타낸다. 하등 진핵생물 예컨대 효모 및 사상 진균은 푸코스를 생산하는 N-글리칸을 정상적으로는 생산하지 않는다.
다중안테나 N-글리칸과 관련하여, 용어 "다중안테나 N-글리칸"은 N-글리칸의 1,6 아암 또는 1,3 아암의 비-환원 말단을 포함하는 만노스 잔기 상에 GlcNAc 잔기 또는 N-글리칸의 1,6 아암 및 1,3 아암의 비-환원 말단을 포함하는 각각의 만노스 잔기 상에 GlcNAc 잔기를 추가로 포함하는 N-글리칸을 지칭한다. 따라서, 다중안테나 N-글리칸은 화학식 GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2, Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2, 또는 NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있다. 용어 "1-4"는 1, 2, 3, 또는 4개의 잔기를 지칭한다.
이등분된 N-글리칸과 관련하여, 용어 "이등분된 N-글리칸"은 GlcNAc 잔기가 N-글리칸의 환원 말단에서 만노스 잔기에 연결되어 있는 N-글리칸을 지칭한다. 이등분된 N-글리칸은 화학식 GlcNAc3Man3GlcNAc2를 특징으로 할 수 있고 여기서 각각의 만노스 잔기는 그의 비-환원 말단에서 GlcNAc 잔기에 연결된다. 대조적으로, 다중안테나 N-글리칸이 GlcNAc3Man3GlcNAc2를 특징으로 하는 경우에, 화학식은 2개의 GlcNAc 잔기가 N-글리칸의 2개의 아암 중 1개의 비-환원 말단에서 만노스 잔기에 연결되어 있고 1개의 GlcNAc 잔기는 N-글리칸의 다른 아암의 비-환원 말단에서 만노스 잔기에 연결되어 있다는 것을 나타낸다.
항체 물리적 특성
본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 추가로, 경쇄 또는 중쇄 이뮤노글로불린 가변 영역 내에 1개 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 이러한 글리코실화 부위는 변경된 항원-결합으로 인해 항체 또는 단편의 증가된 면역원성 또는 항체의 pK의 변경을 발생시킬 수 있다 (Marshall et al. (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 함유하는 모티프에서 발생하는 것으로 공지되어 있다.
각각의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 131A 또는 그의 인간화 버전)은 고유한 등전점 (pI)을 가질 것이고, 이는 일반적으로, 6 내지 9.5의 pH 범위 내에 속한다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로, 7-9.5의 pH 범위 내에 속하고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로, 6-8의 pH 범위 내에 속한다.
각각의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 131A 또는 그의 인간화 버전)은 특징적인 용융 온도를 가질 것이고, 용융 온도가 보다 높다는 것은 전반적인 생체내 안정성이 더 크다는 것을 나타낸다 (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 일반적으로, TM1 [초기 언폴딩 온도]은 60℃ 초과, 65℃ 초과, 또는 70℃ 초과일 수 있다. 항체 또는 단편의 융점은 시차 주사 열량측정 (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52) 또는 원형 이색성 (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)을 사용하여 측정할 수 있다.
추가 실시양태에서, 신속하게 분해되지 않는 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)을 선택한다. 항체 또는 단편의 분해는 모세관 전기영동 (CE) 및 MALDI-MS를 사용하여 측정될 수 있다 (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
추가 실시양태에서, 불필요한 면역 반응의 촉발 및/또는 변경되거나 또는 불리한 약동학적 특성을 초래할 수 있는 응집 효과를 최소한으로 갖는 항체 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전) 및 그의 항원-결합 단편을 선택한다. 일반적으로, 항체 및 단편은 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 또는 5% 이하의 응집은 허용된다. 응집은 크기 배제 칼럼 (SEC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 및 광 산란을 포함한 여러 기술에 의해 측정될 수 있다.
항체 접합체
본원에 개시된 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 또한, 화학적 모이어티에 접합될 수 있다. 화학적 모이어티는 특히, 중합체, 방사성뉴클레오티드 또는 세포독성 인자일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 화학적 모이어티는 대상체의 체내에서 항체 또는 단편의 반감기를 증가시키는 중합체이다. 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (예를 들어, 2 kDa, 5 kDa, 10 kDa, 12 kDa, 20 kDa, 30 kDa 또는 40 kDa의 분자량을 갖는 PEG), 덱스트란 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 친수성 중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [Lee, et al., (1999) (Bioconj. Chem. 10:973-981)]에는 PEG 접합된 단일 쇄 항체가 개시되어 있다. 문헌 [Wen, et al., (2001) (Bioconj. Chem. 12:545-553)]에는 방사성금속 킬레이트화제 (디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA))에 부착되는 PEG와 항체를 접합시키는 것이 개시되어 있다.
본원에 개시된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 또한, 표지, 예컨대 99Tc, 90Y, 111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S, 51Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67CU, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, 및 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr, 및 56Fe와 접합될 수 있다.
본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 또한, 예를 들어 그의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 PEG화될 수 있다. 항체 또는 단편을 PEG화하기 위해, 이러한 항체 또는 단편을 전형적으로, 1개 이상의 PEG 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되도록 하는 조건 하에, 반응성 형태의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 특정한 실시양태에서, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통하여 수행된다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용되어 왔던 PEG의 형태 중 임의의 것을 포괄한다. 특정 실시양태에서, PEG화될 항체 또는 단편은 비-글리코실화 항체 또는 단편이다. 단백질을 PEG화하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이를 본 발명의 항체에 적용할 수 있다. 예를 들어, EP 0 154 316 및 EP 0 401 384를 참조한다.
본원에 개시된 항체 및 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 또한, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트, 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 플루오레사민, 152Eu, 단실, 움벨리페론, 루시페린, 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 에쿼린 표지, 2,3-디히드로프탈라진디온, 비오틴/아비딘, 스핀 표지 및 안정한 자유 라디칼을 포함한, 형광 또는 화학발광 표지와 접합될 수 있다.
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 또한, 세포독성 인자, 예컨대 디프테리아 독소, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질 및 화합물 (예를 들어, 지방산), 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolacca americana) 단백질 PAPI, PAPII, 및 PAP-S, 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사포나리아 오피시날리스(saponaria officinalis) 억제제, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신 및 에노마이신과 접합될 수 있다.
본 발명의 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)을 다양한 모이어티와 접합시키기 위해, 문헌 [Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; 및 Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407]에 기재된 방법을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 항체 및 단편을 접합시키는 방법은 관련 기술분야에 통상적이고 매우 널리 공지되어 있다.
항-CD27 항체의 치료 용도
추가로, 본원에 개시된 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)을 사용한 치료를 필요로 하는, 인간 대상체를 포함한 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 대상체는 감염 또는 감염성 질환을 앓고 있다. 본 발명은 또한 암의 치료; 또는 감염 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명은 또한 면역 세포 활성화를 증가시키기 위한; 암을 치료하기 위한; 또는 감염 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 이러한 대상체는 암을 앓고 있다. 한 실시양태에서 암은, 예를 들어 골육종, 횡문근육종, 신경모세포종, 신장암, 백혈병, 신장 이행 세포암, 방광암, 윌름스 암, 난소암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 골암, 폐암 (예를 들어, 비소세포 폐암), 위암, 결장직장암, 자궁경부암, 활막 육종, 두경부암, 편평 세포 암종, 다발성 골수종, 신세포암, 망막모세포종, 간모세포종, 간세포성 암종, 흑색종, 신장의 횡문근양 종양, 유잉 육종, 연골육종, 뇌암, 교모세포종, 수막종, 뇌하수체 선종, 전정 슈반세포종, 원시 신경외배엽 종양, 수모세포종, 성상세포종, 역형성 성상세포종, 핍지교종, 상의세포종, 맥락총 유두종, 진성 다혈구혈증, 혈소판혈증, 특발성 골수섬유증, 연부 조직 육종, 갑상선암, 자궁내막암, 카르시노이드암 또는 간암, 유방암 또는 위암이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 암은 예를 들어 상기 기재된 다양한 것의 전이성 암이다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편, 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 암은 심장: 육종 (혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종; 폐: 기관지원성 암종 (편평 세포, 미분화 소세포, 미분화 대세포, 선암종), 폐포 (세기관지) 암종, 기관지 선종, 육종, 림프종, 연골성 과오종, 중피종; 위장: 식도 (편평 세포 암종, 선암종, 평활근육종, 림프종), 위 (암종, 림프종, 평활근육종), 췌장 (관 선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 카르시노이드 종양, VIP종), 소장 (선암종, 림프종, 카르시노이드 종양, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종), 대장 (선암종, 관상 선종, 융모성 선종, 과오종, 평활근종) 결장직장; 비뇨생식기: 신장 (선암종, 윌름스 종양 [신모세포종], 림프종, 백혈병), 방광 및 요도 (편평 세포 암종, 이행 세포 암종, 선암종), 전립선 (선암종, 육종), 고환 (정상피종, 기형종, 배아성 암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 간질 세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 선종양 종양, 지방종); 간: 간세포암 (간세포성 암종), 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 간세포 선종, 혈관종; 골: 골원성 육종 (골육종), 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 연골육종, 유잉 육종, 악성 림프종 (세망 세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거대 세포 종양 척삭종, 골연골종 (골연골성 외골종), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 유골 골종 및 거대 세포 종양; 신경계: 두개골 (골종, 혈관종, 육아종, 황색종, 변형성 골염), 수막 (수막종, 수막육종, 신경교종증), 뇌 (성상세포종, 수모세포종, 신경교종, 상의세포종, 배세포종 [송과체종], 다형성 교모세포종, 핍지교종, 슈반세포종, 망막모세포종, 선천성 종양), 척수 신경섬유종, 수막종, 신경교종, 육종); 부인과: 자궁 (자궁내막 암종), 자궁경부 (자궁경부 암종, 종양-전 자궁경부 이형성증), 난소 (난소 암종 [장액성 낭선암종, 점액성 낭선암종, 미분류 암종], 과립막 난포막 세포 종양, 세르톨리-라이디히 세포 종양, 미분화배세포종, 악성 기형종), 외음부 (편평 세포 암종, 상피내 암종, 선암종, 섬유육종, 흑색종), 질 (투명 세포 암종, 편평 세포 암종, 포도상 육종 (배아성 횡문근육종), 난관 (암종), 유방; 혈액: 혈액 (골수성 백혈병 [급성 및 만성], 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질환, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군), 호지킨병, 비-호지킨 림프종 [악성 림프종]; 피부: 악성 흑색종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 카포시 육종, 이형성 모반, 지방종, 혈관종, 피부섬유종, 켈로이드, 건선; 및 부신: 신경모세포종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본원에 제공된 용어 "암성 세포"는 상기 확인된 상태 중 어느 하나에 의해 피해를 입은 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 암은 폐암, 췌장암, 결장암, 결장직장암, 골수성 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 만성 골수단핵구성 백혈병, 갑상선암, 골수이형성 증후군, 방광 암종, 표피 암종, 흑색종, 유방암, 전립선암, 두경부암, 난소암, 뇌암, 중간엽 기원의 암, 육종, 기형암종, 신경모세포종, 신장 암종, 간세포암, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 및 역형성 갑상선 암종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)을 사용하여 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 바이러스 감염은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 간염 바이러스 (A형, B형, 또는 C형), 포진 바이러스 (예를 들어, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파르보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 또는 아르보바이러스 뇌염 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스에 의한 감염이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 박테리아 감염을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 박테리아 감염은 클라미디아(Chlamydia), 리케치아 박테리아, 미코박테리움, 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스(streptococcus), 뉴모노코쿠스, 메닝고코쿠스(meningococcus) 및 고노코쿠스(gonococcus), 클레브시엘라(klebsiella), 프로테우스(proteus), 세라티아(serratia), 슈도모나스(pseudomonas), 레지오넬라(Legionella), 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 살모넬라(Salmonella), 바실루스(bacillus), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 미코박테리움 레프로마토시스(Mycobacterium lepromatosis), 및 보리엘로(Borriello)로 이루어진 군으로부터 선택된 박테리아에 의한 감염이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 진균 감염을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 진균 감염은 칸디다(Candida) (알비칸스(albicans), 크루세이(krusei), 글라브라타(glabrata), 트로피칼리스(tropicalis) 등), 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 아스페르길루스(Aspergillus) (푸미가투스(fumigatus), 니거(niger) 등], 속 뮤코랄레스(Mucorales) (무코르(mucor), 압시디아(absidia), 리조푸스(rhizopus)), 스포로트릭스 쉔크키이(Sporothrix schenckii), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 콕시디오이데스 임미티스(Coccidioides immitis) 및 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum)으로 이루어진 군으로부터 선택된 진균에 의한 감염이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 기생충 감염을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 기생충 감염은 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 발란티디움 콜라이(Balantidium coli), 네글레리아 포울렐리(Naegleria fowleri), 아칸트아메바(Acanthamoeba), 지아르디아 람블리아(Giardia lamblia), 크립토스포리디움(Cryptosporidium), 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 바베시아 미크로티(Babesia microti), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii) 및 니포스트롱길루스 브라실리엔시스(Nippostrongylus brasiliensis)로 이루어진 군으로부터 선택된 기생충에 의한 감염이다.
"대상체"는 포유동물, 예컨대 인간, 개, 고양이, 말, 소, 마우스, 래트, 원숭이 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 예를 들어 마카카 파시쿨라리스) 또는 토끼일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
용어 "와 연합하여"는 항암제와 함께 본 발명의 방법에서 투여되는 성분 (예를 들어, 항-CD27 항체 (예를 들어, 인간화 항체) 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전))이 동시 전달을 위해 단일 조성물로 제제화될 수 있거나 또는 2개 이상의 조성물 (예를 들어, 키트)로 개별적으로 제제화될 수 있다는 것을 나타낸다. 각각의 성분은 다른 성분이 투여되는 시간과 상이한 시간에 대상체에게 투여될 수 있고; 예를 들어, 각각의 투여는 주어진 기간에 걸쳐 여러 간격으로 비-동시적으로 (예를 들어, 개별적으로 또는 순차적으로) 제공될 수 있다. 더욱이, 별개의 성분은 동일하거나 또는 상이한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은, 임의의 질환 예컨대, 예를 들어 본원에 논의된 바와 같은 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 이를 치료 또는 예방하기 위해, 단독으로 사용될 수 있거나 또는 다른 추가의 치료제 및/또는 치료 절차와 연합되어 사용될 수 있다. 이러한 항체 및 단편을 추가의 치료제와 연합하여 포함하는 조성물, 예를 들어 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 또한 본 발명의 일부이다.
따라서, 본 발명은 인간 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편을, 임의로 추가의 치료제 또는 치료 절차와 연합하여 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명 또한 인간 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편을, 임의로 추가의 치료제 또는 치료 절차와 연합하여 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 감염 또는 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명 또한 면역 세포의 활성의 증가를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편을 투여하는 것을 포함하는, 면역 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 암의 치료; 감염 또는 감염성 질환의 치료; 또는 백신 보조제로서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 추가의 치료제와 조합하여, 암의 치료; 면역 세포의 활성의 증가; 또는 감염 또는 감염성 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 추가의 치료제와 조합하여, 면역 세포 활성화를 증가시키거나; 암을 치료하거나; 또는 감염 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 용도를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 암의 치료; 면역 세포의 활성의 증가; 또는 감염 또는 감염성 질환의 치료를 위한, 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 및 추가의 치료제의 조합물을 제공한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 대상체에게 유효량의 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편 또는 본 발명에 따른 발현 벡터 또는 숙주 세포를, 임의로 추가의 치료제 또는 치료 절차와 연합하여 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법 또는 감염 또는 감염성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 단독으로, 또는 종양 백신과 연합되어 사용될 수 있다. 종양 백신의 예는 인간 유두종바이러스 (HPV) 감염 유발 암에 대한 백신 예컨대 가르다실(Gardasil)®, 가르다실® 및 서바릭스(Cervarix)®; B형 간염 바이러스 유발 간암을 방지하는 백신 예컨대 엔게릭스-B(Engerix-B)® 및 레콤비박스 HB(Recombivax HB)®; 면역 반응을 촉발하는 종양용해 바이러스 요법 예컨대 임리직(Imlygic)®; DNA 백신 예컨대 싱코트로프 MA2M(Synchotrope MA2M) 플라스미드 DNA 백신 및 ZYC101; 맘마글로빈-a DNA 백신 (문헌 [Clinical Cancer Res. 2014 20(23):5964-75] 참조); 벡터 기반 백신 예컨대 PSA-TRICOM (프로스트박(prostvac)), PANVAC-VF, 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)-기반 PSA 백신 (문헌 [Therapeutic Advances in Vaccines, 2014, 2(5) 137-148] 참조), 리스테리아-메소텔린 아데노-CEA; 동종 백신 예컨대 GVAX, BLP-25 (항-앙카라-뮤신 1), 벨라젠푸마투셀-L, TG4010, CIMAvax 표피 성장 인자 백신, NY-ESO, GM.CD40L-CCL21; 자가 백신 예컨대: 아데노-CD40L, BCG, INGN-225, 수지상 세포 백신 예컨대 프로벤지(Provenge)®(시푸류셀-T(Sipuleucel-T)), rF-CEA-MUC1-TRICOM (판박-DC(panvac-DC)); 항원 백신 예컨대 MUC-1 (스티무박스(stimuvax)), NY-ESO-1, GP-100, MAGE-A3 (흑색종 항원 코딩 유전자 A3), INGN-225 (문헌 [Pharmacology & Therapeutics 153 (2015) 1-9] 참조)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 단독으로, 또는 화학요법제와 연합되어 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 단독으로, 또는 방사선 요법과 연합되어 사용될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 단독으로, 또는 표적화 요법과 연합되어 사용될 수 있다. 표적화 요법의 예는 호르몬 요법, 신호 전달 억제제 (예를 들어, EGFR 억제제, 예컨대 세툭시맙 (에르비툭스(Erbitux)) 및 에를로티닙 (타르세바(Tarceva))); HER2 억제제 (예를 들어, 트라스투주맙 (헤르셉틴(Herceptin)) 및 페르투주맙 (페르제타(Perjeta))); BCR-ABL 억제제 (예컨대 이마티닙 (글리벡(Gleevec)) 및 다사티닙 (스프리셀(Sprycel))); ALK 억제제 (예컨대 크리조티닙 (잘코리(Xalkori)) 및 세리티닙 (지카디아(Zykadia))); BRAF 억제제 (예컨대 베무라페닙 (젤보라프(Zelboraf)) 및 다브라페닙 (타핀라(Tafinlar))), 유전자 발현 조정제, 아폽토시스 유도제 (예를 들어, 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)) 및 카르필조밉 (키프롤리스(Kyprolis))), 혈관신생 억제제 (예를 들어, 베바시주맙 (아바스틴(Avastin)) 및 라무시루맙 (시람자(Cyramza)), 독소에 부착된 모노클로날 항체 (예를 들어, 브렌툭시맙 베도틴 (애드세트리스(Adcetris)) 및 아도-트라스투주맙 엠탄신 (카드실라(Kadcyla)))를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 항암 치료제 또는 면역조정 약물, 예컨대 면역조정 수용체 억제제, 예를 들어 이러한 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 하기 중 1종 이상과 연합되어 사용된다: 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체, 항-TIGIT 항체, 항-CTLA4 항체, 항-CS1 항체 (예를 들어, 엘로투주맙), 항-KIR2DL1/2/3 항체 (예를 들어, 리릴루맙), 항-CD137 항체 (예를 들어, 우렐루맙), 항-GITR 항체 (예를 들어, TRX518), 항-PD1 항체 (예를 들어, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙 (CT-011)), 항-PD-L1 항체 (예를 들어, BMS-936559, 두르발루맙, MSB0010718C 또는 MPDL3280A), 항-PD-L2 항체, 항-ILT1 항체, 항-ILT2 항체, 항-ILT3 항체, 항-ILT4 항체, 항-ILT5 항체, 항-ILT6 항체, 항-ILT7 항체, 항-ILT8 항체, 항-CD40 항체, 항-OX40 항체, 항-ICOS, 항-SIRPα, 항-KIR2DL1 항체, 항-KIR2DL2/3 항체, 항-KIR2DL4 항체, 항-KIR2DL5A 항체, 항-KIR2DL5B 항체, 항-KIR3DL1 항체, 항-KIR3DL2 항체, 항-KIR3DL3 항체, 항-NKG2A 항체, 항-NKG2C 항체, 항-NKG2E 항체, 항-4-1BB 항체 (예를 들어, PF-05082566), 항-TSLP 항체, 항-IL-10 항체, IL-10 또는 PEG화 IL-10, 또는 이러한 표적의 임의의 유기 소분자 억제제.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-PD1 항체 (예를 들어, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 피딜리주맙 (CT-011))와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-PDL1 항체 (예를 들어, BMS-936559, 두르발루맙, MSB0010718C 또는 MPDL3280A)와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-CTLA4 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-CS1 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-KIR2DL1/2/3 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-CD137 (예를 들어, 우렐루맙) 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-GITR (예를 들어, TRX518) 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-PD-L2 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-ITL1 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-ITL2 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-ITL3 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-ITL4 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-ITL5 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-ITL6 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-ITL7 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-ITL8 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-CD40 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-OX40 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-KIR2DL1 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-KIR2DL2/3 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-KIR2DL4 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-KIR2DL5A 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-KIR2DL5B 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-KIR3DL1 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-KIR3DL2 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-KIR3DL3 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-NKG2A 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-NKG2C 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-ICOS 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-SIRPα 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-4-1BB 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-IL-10 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항-TSLP 항체와 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 IL-10 또는 PEG화 IL-10과 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 억제제 (예를 들어, 유기 소분자 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편) 예컨대: MTOR (포유동물 라파마이신 표적) 억제제, 세포독성제, 백금 작용제, EGFR 억제제, VEGF 억제제, 미세관 안정화제, 탁산, CD20 억제제, CD52 억제제, CD30 억제제, RANK (핵 인자 카파-B의 수용체 활성화제) 억제제, STING 효능제, CXCR2 길항제, RANKL (핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성화제) 억제제, ERK 억제제, MAP 키나제 억제제, AKT 억제제, MEK 억제제, PARP 억제제, PI3K 억제제, HER1 억제제, HER2 억제제, HER3 억제제, HER4 억제제, Bcl2 억제제, CD22 억제제, CD79b 억제제, ErbB2 억제제, 또는 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제 하기 중 1종 이상과 연합되어 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 하기 중 어느 하나 이상과 연합되어 사용된다: 13-시스-레티노산, 3-[5-(메틸술포닐피페라딘메틸)-인돌릴]-퀴놀론, 4-히드록시타목시펜, 5-데옥시우리딘, 5'-데옥시-5-플루오로우리딘, 5-플루오로우라실, 6-메르캅토퓨린, 7-히드록시스타우로스포린, A-443654, 아비라테론아세테이트, 아브락산, ABT-578, 아콜비펜, ADS-100380, ALT-110, 알트레타민, 아미포스틴, 아미노글루테티미드, 암루비신, 암사크린, 아나그렐리드, 아나스트로졸, 안지오스타틴, AP-23573, ARQ-197, 아르족시펜, AS-252424, AS-605240, 아스파라기나제, AT-9263, 아트라센탄, 악시티닙, AZD1152, 바실루스 칼메트-게랭 (BCG) 백신, 바타불린, BC-210, 베소두톡스, 베바시주맙, 비칼루타미드, Bio111, BIO140, 블레오마이신, BMS-214662, BMS-247550, BMS-275291, BMS-310705, 보르테지밉, 부세렐린, 부술판, 칼시트리올, 캄프토테신, 카네르티닙, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, CC8490, 세디라닙, CG-1521, CG-781, 클라미도신, 클로람부실, 클로로톡신, 실렌기티드, 시미티딘, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, COL-3, CP-724714, 시클로포스파미드, 시프로테론, 시프로테론아세테이트, 시타라빈, 시토신아라비노시드, 다카르바진, 다시노스타트, 닥티노마이신, 달로투주맙, 다누세르팁, 다사타닙, 다우노루비신, 데카타닙, 데구엘린, 데니류킨, 데옥시코포르마이신, 뎁시펩티드, 디아릴프로피오니트릴, 디에틸스틸베스트롤, 디프티톡스, 도세탁셀, 도비티닙, 독소루비신, 드롤록시펜, 에도테카린, 이트륨-90 표지된-에도트레오티드, 에도트레오티드, EKB-569, EMD121974, 엔도스타틴, 엔잘루타미드, 엔자스타우린, 에피루비신, 에피틸론 B, ERA-923, 에르비툭스, 에를로티닙, 에스트라디올, 에스트라무스틴, 에토포시드, 에베롤리무스, 엑세메스탄, 피클라투주맙, 피나스테리드, 플라보피리돌, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 폴폭스 요법, 풀베스트란트, 갈레테론, 게피티닙, 겜시타빈, 기마테칸, 고세렐린, 고세렐린 아세테이트, 고시폴, GSK461364, GSK690693, HMR-3339, 히드록시프로게스테론카프로에이트, 히드록시우레아, IC87114, 이다루비신, 이독시펜, 이포스파미드, IM862, 이마티닙, IMC-1C11, INCB24360, INO1001, 인터페론, 인터류킨-12, 이필리무맙, 이리노테칸, JNJ-16241199, 케토코나졸, KRX-0402, 라파티닙, 라소폭시펜, 레트로졸, 류코보린, 류프롤리드, 류프롤리드 아세테이트, 레바미솔, 리포솜 포획된 파클리탁셀, 로무스틴, 로나파르닙, 루칸톤, LY292223, LY292696, LY293646, LY293684, LY294002, LY317615, 마리마스타트, 메클로레타민, 메드록시프로게스테론아세테이트, 메게스트롤아세테이트, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 토자세르팁, MLN8054, 네오바스타트, 네라티닙, 뉴라디압, 닐로티닙, 닐루티미드, 놀라트렉세드, NVP-BEZ235, 오블리메르센, 옥트레오티드, 오파투무맙, 올라파립, 오레고보맙, 오르테로넬, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 팔보시클립, 파미드로네이트, 파니투무맙, 파조파닙, PD0325901, PD184352, PEG-인터페론, 페메트렉세드, 펜토스타틴, 페리포신, 페닐알라닌머스타드, PI-103, 픽틸리십, PIK-75, 피펜독시펜, PKI-166, 플리카마이신, 포르피머, 프레드니손, 프로카르바진, 프로게스틴, PX-866, R-763, 랄록시펜, 랄티트렉세드, 라족신, 리다포롤리무스, 리툭시맙, 로미뎁신, RTA744, 루비테칸, 스크립타이드, Sdx102, 셀리시클립, 셀루메티닙, 세막사닙, SF1126, 시롤리무스, SN36093, 소라페닙, 스피로노락톤, 스쿠알라민, SR13668, 스트렙토조신, SU6668, 수베로일아날리드 히드록삼산, 수니티닙, 합성 에스트로겐, 탈람파넬, 탈리모겐 라허파렙벡, 타목시펜, 테모졸로미드, 템시롤리무스, 테니포시드, 테스밀리펜, 테스토스테론, 테트란드린, TGX-221, 탈리도미드, 티오구아닌, 티오테파, 티실리무맙, 티피파르닙, 티보자닙, TKI-258, TLK286, 토포테칸, 토레미펜 시트레이트, 트라벡테딘, 트라스투주맙, 트레티노인, 트리코스타틴 A, 트리시리빈포스페이트 1수화물, 트립토렐린 파모에이트, TSE-424, 우라실 무스타드, 발프로산, 발루비신, 반데타닙, 바탈라닙, VEGF 트랩, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 비탁신, 비테스판, 보리노스타트, VX-745, 워트만닌, Xr311, 자놀리무맙, ZK186619, ZK-304709, ZM336372, ZSTK474.
본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 조합하여 사용하기에 적합한 항암제의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 세포증식억제제, 세포독성제, 암 및 신생물성 질환에 대한 표적화된 치료제 (소분자, 생물제제, siRNA 및 마이크로RNA),
1) 항대사물 (예컨대 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 겜시타빈, 플루다라빈, 카페시타빈);
2) 알킬화제, 예컨대 테모졸로미드, 시클로포스파미드,
3) DNA 상호작용 및 DNA 손상 작용제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴, 독소루비신,
4) 이온화 조사, 예컨대 방사선 요법,
5) 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 에토포시드, 독소루비신,
6) 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대 이리노테칸, 토포테칸,
7) 튜불린 상호작용제, 예컨대 파클리탁셀, 도세탁셀, 아브락산, 에포틸론,
8) 키네신 스핀들 단백질 억제제,
9) 스핀들 체크포인트 억제제,
10) 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 (PARP) 억제제, 예컨대 올라파립, 니라파립 및 벨리파립
11) 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP) 억제제
12) 프로테아제 억제제, 예컨대 카텝신 D 및 카텝신 K 억제제
13) 프로테오솜 또는 유비퀴틴화 억제제, 예컨대 보르테조밉,
14) 그의 야생형 p53 활성을 복원하기 위한 돌연변이체 p53의 활성화제
15) 아데노바이러스-p53
16) Bcl-2 억제제, 예컨대 ABT-263
17) 열 쇼크 단백질 (HSP) 조정제, 예컨대 겔다나마이신 및 17-AAG
18) 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제, 예컨대 보리노스타트 (SAHA),
19) 성 호르몬 조정제,
a. 항에스트로겐, 예컨대 타목시펜, 풀베스트란트,
b. 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM), 예컨대 랄록시펜,
c. 항안드로겐, 예컨대 비칼루타미드, 플루타미드
d. LHRH 효능제, 예컨대 류프롤리드,
e. 5α-리덕타제 억제제, 예컨대 피나스테리드,
f. 시토크롬 P450 C17 리아제 (CYP450c17, 또한 17αC로도 불림);
g. 아로마타제 억제제, 예컨대 레트로졸, 아나스트로졸, 엑세메스탄,
20) EGFR 키나제 억제제, 예컨대 게프티닙, 에를로티닙, 라프티닙
21) 이중 erbB1 및 erbB2 억제제, 예컨대 라파티닙
22) 다중-표적화된 키나제 (세린/트레오닌 및/또는 티로신 키나제) 억제제,
a. ABL 키나제 억제제, 이마티닙 및 닐로티닙, 다사티닙
b. VEGFR-1, VEGFR-2, PDGFR, KDR, FLT, c-Kit, Tie2, Raf, MEK 및 ERK 억제제, 예컨대 수니티닙, 소라페닙, 반데타닙, 파조파닙, PLX-4032, 악시티닙, PTK787, GSK-1120212
c. 폴로-유사 키나제 억제제
d. 오로라 키나제 억제제
e. JAK 억제제
f. c-MET 키나제 억제제
g. PI3K 및 mTOR 억제제, 예컨대 GDC-0941, BEZ-235, BKM-120 및 AZD-8055
h. 라파마이신 및 그의 유사체, 예컨대 템시롤리무스, 에베롤리무스, 및 데포롤리무스
i. STING (인터페론 유전자의 자극제) 효능제
j. CXCR (CXC 케모카인 수용체) 억제제, CXCR2 길항제
23) 및 ara-C, 아드리아마이신, 시톡산, 카르보플라틴, 우라실 머스타드, 클로르메틴, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 피포브로만, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌티오포스포르아민, 부술판, 카르무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신, 다카르바진, 플록수리딘, 시타라빈, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 플루다라빈 포스페이트, 펜토스타틴, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 나벨빈, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 테니포시드, 시타라빈, 페메트렉세드, 이다루비신, 미트라마이신, 데옥시코포르마이신, 미토마이신-C, L-아스파라기나제, 테니포시드, 에티닐에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 테스토스테론, 프레드니손, 플루옥시메스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 테스토락톤, 메게스트롤아세테이트, 메틸프레드니솔론, 메틸테스토스테론, 프레드니솔론, 트리암시놀론, 클로로트리아니센, 히드록시프로게스테론, 아미노글루테티미드, 에스트라무스틴, 플루타미드 메드록시프로게스테론아세테이트, 토레미펜, 고세렐린, 카르보플라틴, 히드록시우레아, 암사크린, 프로카르바진, 미토탄, 미톡산트론, 레바미솔, 드롤록사핀, 헥사메틸멜라민, 벡사르, 제발린, 트리세녹스, 프로피메르, 티오테파, 알트레타민, 독실, 온탁, 데포사이트, 아라네스프, 뉴포젠, 뉴라스타, 케피반스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다른 항암 (또한 항신생물성으로도 공지됨) 작용제,
24) 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제, 예컨대, 사라사르(SARASAR)™(4-[2-[4-[(11R)-3,10-디브로모-8-클로로-6,11-디히드로-5H-벤조[5,6]시클로헵타[1,2-b]피리딘-11-일-]-1-피페리디닐]-2-옥소에틸]-피페리딘카르복스아미드, 티피파르닙
25) 인터페론, 예컨대 인트론 A, Peg-인트론,
26) 항-erbB1 항체, 예컨대 세툭시맙, 파니투무맙,
27) 항-erbB2 항체, 예컨대 트라스투주맙,
28) 항-CD52 항체, 예컨대 알렘투주맙,
29) 항-CD20 항체, 예컨대 리툭시맙
30) 항-CD33 항체, 예컨대 겜투주맙 오조가미신
31) 항-VEGF 항체, 예컨대 아바스틴,
32) TRIAL 리간드, 예컨대 렉사투무맙, 마파투무맙, 및 AMG-655
33) 항-CTLA-4 항체, 예컨대 이필리무맙
34) CTA1, CEA, CD5, CD19, CD22, CD30, CD44, CD44V6, CD55, CD56, EpCAM, FAP, MHCII, HGF, IL-6, MUC1, PSMA, TAL6, TAG-72, TRAILR, VEGFR, IGF-2, FGF에 대한 항체,
35) 항-IGF-1R 항체, 예컨대 달로투주맙 (MK-0646) 및 로바투무맙 (SCH 717454).
"에스트로겐 수용체 조정제"는 메카니즘에 상관없이, 에스트로겐이 수용체에 결합하는 것을 방해하거나 억제하는 화합물을 지칭한다. 에스트로겐 수용체 조정제의 예는 타목시펜, 랄록시펜, 이독시펜, LY353381, LY117081, 토레미펜, 풀베스트란트, 4-[7-(2,2-디메틸-1-옥소프로폭시-4-메틸-2-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-2H-1-벤조피란-3-일]-페닐-2,2-디메틸프로파노에이트, 4,4'-디히드록시벤조페논-2,4-디니트로페닐-히드라존 및 SH646을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"안드로겐 수용체 조정제"는 메카니즘에 상관없이, 안드로겐이 수용체에 결합하는 것을 방해하거나 억제하는 화합물을 지칭한다. 안드로겐 수용체 조정제의 예는 피나스테리드 및 다른 5α-리덕타제 억제제, 닐루타미드, 플루타미드, 비칼루타미드, 리아로졸 및 아비라테론 아세테이트를 포함한다.
"레티노이드 수용체 조정제"는 메카니즘에 상관없이, 레티노이드가 수용체에 결합하는 것을 방해하거나 억제하는 화합물을 지칭한다. 이러한 레티노이드 수용체 조정제의 예는 벡사로텐, 트레티노인, 13-시스-레티노산, 9-시스-레티노산, α-디플루오로메틸오르니틴, ILX23-7553, 트랜스-N-(4'-히드록시페닐) 레틴아미드 및 N-4-카르복시페닐 레틴아미드를 포함한다.
"세포독성제/세포증식억제제"는 알킬화제, 종양 괴사 인자, 삽입제, 저산소증 활성화가능한 화합물, 미세관 억제제/미세관-안정화제, 유사분열 키네신의 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 유사분열 진행에 관련된 키나제의 억제제, 성장 인자 및 시토카인 신호 전달 경로에 관련된 키나제의 억제제, 항대사물, 생물학적 반응 조절제, 호르몬/항호르몬 치료제, 조혈 성장 인자, 모노클로날 항체 표적화된 치료제, 토포이소머라제 억제제, 프로테오솜 억제제, 유비퀴틴 리가제 억제제, 및 오로라 키나제 억제제를 포함한, 세포 사멸을 유발하거나, 또는 주로 세포의 기능을 직접적으로 방해하여 세포 증식을 억제하거나, 또는 세포 유사분열을 억제하거나 또는 방해하는 화합물을 지칭한다.
세포독성제/세포증식억제제의 예는 백금 배위 화합물, 세르테네프, 카켁틴, 이포스파미드, 타소네르민, 로니다민, 카르보플라틴, 알트레타민, 프레드니무스틴, 디브로모둘시톨, 라니무스틴, 포테무스틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 테모졸로미드, 헵타플라틴, 에스트라무스틴, 임프로술판 토실레이트, 트로포스파미드, 니무스틴, 디브로스피듐 클로라이드, 푸미테파, 로바플라틴, 사트라플라틴, 프로피로마이신, 시스플라틴, 이로풀벤, 덱스이포스파미드, 시스-아민디클로로(2-메틸-피리딘)백금, 벤질구아닌, 글루포스파미드, GPX100, (트랜스, 트랜스, 트랜스)-비스-뮤-(헥산-1,6-디아민)-뮤-[디아민-백금(II)]비스[디아민(클로로)백금 (II)]테트라클로라이드, 디아리지디닐스페르민, 삼산화비소, 1-(11-도데실아미노-10-히드록시운데실)-3,7-디메틸크산틴, 조루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 비산트렌, 미톡산트론, 피라루비신, 피나피드, 발루비신, 암루비신, 안티네오플라스톤, 3'-데아미노-3'-모르폴리노-13-데옥소-10-히드록시카르미노마이신, 안나마이신, 갈라루비신, 엘리나피드, MEN10755, 4-데메톡시-3-데아미노-3-아지리디닐-4-메틸술포닐-다우노루비신 (WO 00/50032 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
저산소증 활성화가능한 화합물의 예는 티라파자민이다.
프로테오솜 억제제의 예는 락타시스틴 및 MLN-341 (벨케이드(Velcade))을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
미세관 억제제/미세관-안정화 작용제의 예는 일반적으로 탁산을 포함한다. 구체적 화합물은 파클리탁셀 (탁솔(Taxol)®), 빈데신 술페이트, 3',4'-디데히드로-4'-데옥시-8'-노르빈카류코블라스틴, 도세탁솔 (탁소테레(Taxotere)®), 리족신, 돌라스타틴, 미보불린 이세티오네이트, 아우리스타틴, 세마도틴, RPR109881, BMS184476, 빈플루닌, 크립토피신, 2,3,4,5,6-펜타플루오로-N-(3-플루오로-4-메톡시페닐) 벤젠 술폰아미드, 안히드로빈블라스틴, N,N-디메틸-L-발릴-L-발릴-N-메틸-L-발릴-L-프롤릴-L-프롤린-t-부틸아미드, (서열식별번호: 68), TDX258, 에포틸론 (예를 들어 미국 특허 번호 6,284,781 및 6,288,237 참조) 및 BMS188797을 포함한다.
토포이소머라제 억제제의 일부 예는 토포테칸, 하이캅타민, 이리노테칸, 루비테칸, 6-에톡시프로피오닐-3',4'-O-엑소-벤질리덴-카르트레우신, 9-메톡시-N,N-디메틸-5-니트로피라졸로[3,4,5-kl]아크리딘-2-(6H) 프로판아민, 1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-히드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':b,7]-인돌리지노[1,2b]퀴놀린-10,13(9H,15H)디온, 루르토테칸, 7-[2-(N-이소프로필아미노)에틸]-(20S)캄프토테신, BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드, 소부족산, 2'-디메틸아미노-2'-데옥시-에토포시드, GL331, N-[2-(디메틸아미노)에틸]-9-히드록시-5,6-디메틸-6H-피리도[4,3-b]카르바졸-1-카르복스아미드, 아술라크린, (5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-메틸아미노]에틸]-5-[4-히드로옥시-3,5-디메톡시페닐]-5,5a,6,8,8a,9-헥사히드로푸로(3',4':6,7)나프토(2,3-d)-1,3-디옥솔-6-온, 2,3-(메틸렌디옥시)-5-메틸-7-히드록시-8-메톡시벤조[c]-페난트리디늄, 6,9-비스[(2-아미노에틸)아미노]벤조 [g]이소퀴놀린-5,10-디온, 5-(3-아미노프로필아미노)-7,10-디히드록시-2-(2-히드록시에틸아미노메틸)-6H-피라졸로[4,5,1-de]아크리딘-6-온, N-[1-[2(디에틸아미노)에틸아미노]-7-메톡시-9-옥소-9H-티오크산텐-4-일메틸]포름아미드, N-(2-(디메틸아미노)에틸)아크리딘-4-카르복스아미드, 6-[[2-(디메틸아미노)에틸]아미노]-3-히드록시-7H-인데노[2,1-c] 퀴놀린-7-온 및 디메스나이다.
유사분열 키네신, 특히 인간 유사분열 키네신 KSP의 억제제의 예는 공보 WO03/039460, WO03/050064, WO03/050122, WO03/049527, WO03/049679, WO03/049678, WO04/039774, WO03/079973, WO03/099211, WO03/105855, WO03/106417, WO04/037171, WO04/058148, WO04/058700, WO04/126699, WO05/018638, WO05/019206, WO05/019205, WO05/018547, WO05/017190, US2005/0176776에 기재되어 있다. 한 실시양태에서 유사분열 키네신의 억제제는 KSP의 억제제, MKLP1의 억제제, CENP-E의 억제제, MCAK의 억제제 및 Rab6-KIFL의 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"히스톤 데아세틸라제 억제제"의 예는 SAHA, TSA, 옥삼플라틴, PXD101, MG98 및 스크립타이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 히스톤 데아세틸라제 억제제에 대한 추가의 참조는 하기 문서; Miller, T.A. et al. J. Med. Chem. 46(24):5097-5116 (2003)에서 찾아볼 수 있다.
"유사분열 진행에 수반되는 키나제의 억제제"는 오로라 키나제의 억제제, 폴로-유사 키나제의 억제제 (PLK; 특히 PLK-1의 억제제), bub-1의 억제제 및 bub-R1의 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "오로라 키나제 억제제"의 예는 VX-680이다.
"항증식제"는 안티센스 RNA 및 DNA 올리고뉴클레오티드 예컨대 G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 및 INX3001, 및 항대사물 예컨대 에노시타빈, 카르모푸르, 테가푸르, 펜토스타틴, 독시플루리딘, 트리메트렉세이트, 플루다라빈, 카페시타빈, 갈로시타빈, 시타라빈 옥포스페이트, 포스테아빈 소듐 수화물, 랄티트렉세드, 팔티트렉시드, 에미테푸르, 티아조푸린, 데시타빈, 놀라트렉세드, 페메트렉세드, 넬자라빈, 2'-데옥시-2'-메틸리덴시티딘, 2'-플루오로메틸렌-2'-데옥시시티딘, N-[5-(2,3-디히드로-벤조푸릴)술포닐]-N'-(3,4-디클로로페닐)우레아, N6-[4-데옥시-4-[N2-[2(E), 4(E)-테트라데카디에노일]글리실아미노]-L-글리세로-B-L-만노-헵토피라노실]아데닌, 아플리딘, 엑테이나시딘, 트록사시타빈, 4-[2-아미노-4-옥소-4,6,7,8-테트라히드로-3H-피리미디노[5,4-b][1,4]티아진-6-일-(S)-에틸]-2,5-티에노일-L-글루탐산, 아미노프테린, 5-플루오로우라실, 알라노신, 11-아세틸-8-(카르바모일옥시메틸)-4-포르밀-6-메톡시-14-옥사-1,11-디아자테트라시클로(7.4.1.0.0)-테트라데카-2,4,6-트리엔-9-일 아세트산 에스테르, 스와인소닌, 로메트렉솔, 덱스라족산, 메티오니나제, 2'-시아노-2'-데옥시-N4-팔미토일-1-B-D-아라비노 푸라노실 시토신, 3-아미노피리딘-2-카르복스알데히드 티오세미카르바존 및 트라스투주맙을 포함한다.
모노클로날 항체 표적화된 치료제의 예는 암 세포 특이적 또는 표적 세포 특이적 모노클로날 항체에 부착된 세포독성제 또는 방사성동위원소를 갖는 그러한 치료제를 포함한다. 예는 벡사르(Bexxar)를 포함한다.
"프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제"는 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 (FPTase), 게라닐게라닐-단백질 트랜스퍼라제 유형 I (GGPTase-I), 및 게라닐게라닐-단백질 트랜스퍼라제 유형-II (GGPTase-II, 또한 Rab GGPTase로도 불림)를 포함한 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 효소 중 어느 하나 또는 그의 임의의 조합을 억제하는 화합물을 지칭한다.
프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제의 예는 하기 공보 및 특허에서 찾아볼 수 있다: WO 96/30343, WO 97/18813, WO 97/21701, WO 97/23478, WO 97/38665, WO 98/28980, WO 98/29119, WO 95/32987, 미국 특허 번호 5,420,245, 미국 특허 번호 5,523,430, 미국 특허 번호 5,532,359, 미국 특허 번호 5,510,510, 미국 특허 번호 5,589,485, 미국 특허 번호 5,602,098, 유럽 특허 공개 0 618 221, 유럽 특허 공개 0 675 112, 유럽 특허 공개 0 604 181, 유럽 특허 공개 0 696 593, WO 94/19357, WO 95/08542, WO 95/11917, WO 95/12612, WO 95/12572, WO 95/10514, 미국 특허 번호 5,661,152, WO 95/10515, WO 95/10516, WO 95/24612, WO 95/34535, WO 95/25086, WO 96/05529, WO 96/06138, WO 96/06193, WO 96/16443, WO 96/21701, WO 96/21456, WO 96/22278, WO 96/24611, WO 96/24612, WO 96/05168, WO 96/05169, WO 96/00736, 미국 특허 번호 5,571,792, WO 96/17861, WO 96/33159, WO 96/34850, WO 96/34851, WO 96/30017, WO 96/30018, WO 96/30362, WO 96/30363, WO 96/31111, WO 96/31477, WO 96/31478, WO 96/31501, WO 97/00252, WO 97/03047, WO 97/03050, WO 97/04785, WO 97/02920, WO 97/17070, WO 97/23478, WO 97/26246, WO 97/30053, WO 97/44350, WO 98/02436, 및 미국 특허 번호 5,532,359. 혈관신생에 대한 프레닐-단백질 트랜스퍼라제 억제제의 역할의 예에 대해서는 문헌 [European J. of Cancer, Vol. 35, No. 9, pp.1394-1401 (1999)]을 참조한다.
"혈관신생 억제제"는 메카니즘에 상관없이, 새로운 혈관의 형성을 억제하는 화합물을 지칭한다. 혈관신생 억제제의 예는 티로신 키나제 억제제, 예컨대 티로신 키나제 수용체 Flt-1 (VEGFR1) 및 Flk-1/KDR (VEGFR2)의 억제제, 표피-유래, 섬유모세포-유래, 또는 혈소판 유래 성장 인자의 억제제, MMP (매트릭스 메탈로프로테아제) 억제제, 인테그린 차단제, 인터페론-α, 인터류킨-12, 펜토산 폴리술페이트, 시클로옥시게나제 억제제, 예컨대 아스피린 및 이부프로펜과 같은 비스테로이드성 항염증제 (NSAID) 뿐만 아니라 셀레콕시브 및 로페콕시브와 같은 선택적 시클로옥시게나제-2 억제제 (PNAS, Vol. 89, p. 7384 (1992); JNCI, Vol. 69, p. 475 (1982); Arch. Opthalmol., Vol. 108, p.573 (1990); Anat. Rec., Vol. 238, p. 68 (1994); FEBS Letters, Vol. 372, p. 83 (1995); Clin, Orthop. Vol. 313, p. 76 (1995); J. Mol. Endocrinol., Vol. 16, p.107 (1996); Jpn. J. Pharmacol., Vol. 75, p. 105 (1997); Cancer Res., Vol. 57, p. 1625 (1997); Cell, Vol. 93, p. 705 (1998); Intl. J. Mol. Med., Vol. 2, p. 715 (1998); J. Biol. Chem., Vol. 274, p. 9116 (1999)), 스테로이드성 항염증제 (예컨대 코르티코스테로이드, 미네랄로코르티코이드, 덱사메타손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드, 베타메타손), 카르복시아미도트리아졸, 콤브레타스타틴 A-4, 스쿠알라민, 6-O-클로로아세틸-카르보닐)-푸마길롤, 탈리도미드, 안지오스타틴, 트로포닌-1, 안지오텐신 II 길항제 (문헌 [Fernandez et al., J. Lab. Clin. Med. 105:141-145 (1985)] 참조), 및 VEGF에 대한 항체 (문헌 [Nature Biotechnology, Vol. 17, pp.963-968 (October 1999); Kim et al., Nature, 362, 841-844 (1993)]; WO 00/44777; 및 WO 00/61186 참조)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
혈관신생 억제제의 다른 예는 엔도스타틴, 우크라인, 란피르나제, IM862, 5-메톡시-4-[2-메틸-3-(3-메틸-2-부테닐)옥시라닐]-1-옥사스피로[2,5]옥트-6-일(클로로아세틸)카르바메이트, 아세틸디나날린, 5-아미노-1-[[3,5-디클로로-4-(4-클로로벤조일)페닐]메틸]-1H-1,2,3-트리아졸-4-카르복스아미드, CM101, 스쿠알라민, 콤브레타스타틴, RPI4610, NX31838, 황산화 만노펜타오스 포스페이트, 7,7-(카르보닐-비스[이미노-N-메틸-4,2-피롤로카르보닐이미노[N-메틸-4,2-피롤]-카르보닐이미노]-비스-(1,3-나프탈렌 디술포네이트) 및 3-[(2,4-디메틸피롤-5-일)메틸렌]-2-인돌리논 (SU5416)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
혈관신생을 조정 또는 억제하며 본 발명의 화합물과 조합되어 또한 사용될 수 있는 다른 치료제는 응고 및 섬유소용해 시스템을 조정 또는 억제하는 작용제를 포함한다 (종설 문헌 [Clin. Chem. La. Med. 38:679-692 (2000)] 참조). 응고 및 섬유소용해 경로를 조정 또는 억제하는 이러한 작용제의 예는 헤파린 (문헌 [Thromb. Haemost. 80:10-23 (1998)] 참조), 저분자량 헤파린 및 카르복시펩티다제 U 억제제 (또한 활성 트롬빈 활성화가능한 섬유소용해 억제제 [TAFIa]의 억제제로도 공지됨) (문헌 [Thrombosis Res. 101:329-354 (2001)] 참조)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. TAFIa 억제제는 미국 일련 번호 60/310,927 (filed August 8, 2001) 및 60/349,925 (2002년 1월 18일 출원됨)에 기재되어 있다.
"수용체 티로신 키나제 (RTK)를 방해하는 작용제"는 RTK를 억제하고 이에 따라 종양발생 및 종양 진행에 수반되는 메카니즘을 억제하는 화합물을 지칭한다. 이러한 작용제는 c-Kit, Eph, PDGF, Flt3 및 c-Met의 억제제를 포함한다. 추가의 작용제는 문헌 [Bume-Jensen and Hunter, Nature, 411:355-365, 2001]에 기재된 바와 같은 RTK의 억제제를 포함한다.
"세포 증식 및 생존 신호전달 경로의 억제제"는 세포 표면 수용체의 신호 전달 캐스케이드 하류를 억제하는 화합물을 지칭한다. 이러한 작용제는 세린/트레오닌 키나제의 억제제 (WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140, US 2004-0116432, WO 02/083138, US 2004-0102360, WO 03/086404, WO 03/086279, WO 03/086394, WO 03/084473, WO 03/086403, WO 2004/041162, WO 2004/096131, WO 2004/096129, WO 2004/096135, WO 2004/096130, WO 2005/100356, WO 2005/100344, US 2005/029941, US 2005/44294, US 2005/43361, 60/734188, 60/652737, 60/670469에 기재된 바와 같은 Akt의 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않음), Raf 키나제의 억제제 (예를 들어, PLX-4032), MEK의 억제제 (예를 들어, Arry-162, RO-4987655 및 GSK-1120212), mTOR의 억제제 (예를 들어, AZD-8055, BEZ-235 및 에베롤리무스), 및 PI3K의 억제제 (예를 들어, GDC-0941, BKM-120)를 포함한다.
상기에 사용된 "인테그린 차단제"는 αvβ3 인테그린에 대한 생리학적 리간드의 결합을 선택적으로 길항작용하거나, 억제하거나 또는 상쇄시키는 화합물, αvβ5 인테그린에 대한 생리학적 리간드의 결합을 선택적으로 길항작용하거나, 억제하거나 또는 상쇄시키는 화합물, αvβ3 인테그린 및 αvβ5 인테그린 둘 다에 대한 생리학적 리간드의 결합을 길항작용하거나, 억제하거나 또는 상쇄시키는 화합물, 및 모세관 내피 세포 상에서 발현되는 특정한 인테그린(들)의 활성을 길항작용하거나, 억제하거나 또는 상쇄시키는 화합물을 지칭한다. 상기 용어는 또한 αvβ6, αvβ8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1 및 α6β4 인테그린의 길항제를 지칭한다. 상기 용어는 또한 αvβ3, αvβ5, αvβ6, αvβ8, α1β1, α2β1, α5β1, α6β1 및 α6β4 인테그린의 임의의 조합의 길항제를 지칭한다.
티로신 키나제 억제제의 일부 구체적 예는 N-(트리플루오로메틸페닐)-5-메틸이속사졸-4-카르복스아미드, 3-[(2,4-디메틸피롤-5-일)메틸리데닐)인돌린-2-온, 17-(알릴아미노)-17-데메톡시겔다나마이신, 4-(3-클로로-4-플루오로페닐아미노)-7-메톡시-6-[3-(4-모르폴리닐)프로폭실]퀴나졸린, N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)-4-퀴나졸린아민, BIBX1382, 2,3,9,10,11,12-헥사히드로-10-(히드록시메틸)-10-히드록시-9-메틸-9,12-에폭시-1H-디인돌로[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]피롤로[3,4-i][1,6]벤조디아조신-1-온, SH268, 게니스테인, STI571, CEP2563, 4-(3-클로로페닐아미노)-5,6-디메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘메탄 술포네이트, 4-(3-브로모-4-히드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린, 4-(4'-히드록시페닐)아미노-6,7-디메톡시퀴나졸린, SU6668, STI571A, N-4-클로로페닐-4-(4-피리딜메틸)-1-프탈라진아민 및 EMD121974를 포함한다.
본 발명의 청구된 항체 또는 항원 결합 단편과 PPAR-γ (즉, PPAR-감마) 효능제 및 PPAR-δ (즉, PPAR-델타) 효능제의 조합물은 특정 악성종양의 치료에 유용할 수 있다. PPAR-γ 및 PPAR-δ는 핵 퍼옥시솜 증식자-활성화된 수용체 γ 및 δ이다. 내피 세포 상에서의 PPAR-γ의 발현 및 혈관신생에의 그의 수반이 문헌에 보고되어 있다 (문헌 [J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998; 31:909-913; J. Biol. Chem. 1999;274:9116-9121; Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 2000; 41:2309-2317] 참조). 보다 최근에는, PPAR-γ 효능제가 시험관내에서 VEGF에 대한 혈관신생 반응을 억제하는 것으로 제시된 바 있고; 트로글리타존 및 로시글리타존 말레에이트 둘 다는 마우스에서 망막 신생혈관화의 발달을 억제한다. (Arch. Ophthamol. 2001; 119:709-717). PPAR-γ 효능제 및 PPAR-γ/α 효능제의 예는 린파르자(Lynparza)®, 루카파립(Rucaparib)®, 탈라조파립(Talazoparib)®, 니라파립, 벨리파립(Veliparib)®, 티아졸리딘디온 (예컨대 DRF2725, CS-011, 트로글리타존, 로시글리타존, 및 피오글리타존), 페노피브레이트, 겜피브로질, 클로피브레이트, GW2570, SB219994, AR-H039242, JTT-501, MCC-555, GW2331, GW409544, NN2344, KRP297, NP0110, DRF4158, NN622, GI262570, PNU182716, DRF552926, 2-[(5,7-디프로필-3-트리플루오로메틸-1,2-벤즈이속사졸-6-일)옥시]-2-메틸프로피온산, 및 2(R)-7-(3-(2-클로로-4-(4-플루오로페녹시) 페녹시)프로폭시)-2-에틸크로만-2-카르복실산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 아로마타제 억제제와 조합하여 유방암을 치료하거나 예방하는데 유용할 수 있다. 아로마타제 억제제의 예는 아나스트로졸, 레트로졸 및 엑세메스탄을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 또한 하기 화학요법제와 조합하여 암을 치료하는데 유용할 수 있다: 아바렐릭스 (플레낙시스(Plenaxis) 데포®); 알데스류킨 (프로킨(Prokine)®); 알데스류킨 (프로류킨(Proleukin)®); 알렘투주맙 (캄파트(Campath)®); 알리트레티오인 (판레틴(Panretin)®); 알로퓨리놀 (질로프림(Zyloprim)®); 알트레타민 (헥살렌(Hexalen)®); 아미포스틴 (에티올(Ethyol)®); 아나스트로졸 (아리미덱스(Arimidex)®); 삼산화비소 (트리세녹스(Trisenox)®); 아스파라기나제 (엘스파르(Elspar)®); 아자시티딘 (비다자(Vidaza)®); 벤다무스틴 히드로클로라이드 (트레안다(Treanda)®); 베바시주맙 (아바스틴(Avastin)®); 벡사로텐 캡슐 (탈그레틴(Targretin)®); 벡사로텐 겔 (탈그레틴®); 블레오마이신 (블레녹산(Blenoxane)®); 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)®); 브레펠딘 A; 부술판 정맥내 (부술펙스(Busulfex)®); 부술판 경구 (밀레란(Myleran)®); 칼루스테론 (메토사르브(Methosarb)®); 카페시타빈 (젤로다(Xeloda)®); 카르보플라틴 (파라플라틴(Paraplatin)®); 카르무스틴 (BCNU®, BiCNU®); 카르무스틴 (글리아델(Gliadel)®); 폴리페프로산(Polifeprosan) 20 임플란트를 포함하는 카르무스틴 (글리아델 웨이퍼(Gliadel Wafer)®); 셀레콕시브 (셀레브렉스®); 세툭시맙 (에르비툭스(Erbitux)®); 클로람부실 (류케란(Leukeran)®); 시스플라틴 (플라티놀(Platinol)®); 클라드리빈 (류스타틴(Leustatin)®, 2-CdA®); 클로파라빈 (클로라르(Clolar)®); 시클로포스파미드 (시톡산(Cytoxan)®, 네오사르(Neosar)®); 시클로포스파미드 (시톡산 인젝션(Cytoxan Injection)®); 시클로포스파미드 (시톡산 태블릿(Cytoxan Tablet)®); 시타라빈 (시토사르-U(Cytosar-U)®); 시타라빈 리포솜 (데포사이트(DepoCyt)®); 다카르바진 (DTIC-돔(Dome)®); 닥티노마이신, 악티노마이신 D (코스메겐(Cosmegen)®); 달테파린 소듐 주사 (프라그민(Fragmin)®); 다르베포에틴 알파 (아라네스프(Aranesp)®); 다사티닙 (스프리셀(Sprycel)®); 다우노루비신 리포솜 (다우녹솜(DanuoXome)®); 다우노루비신, 다우노마이신 (다우노루비신(Daunorubicin)®); 다우노루비신, 다우노마이신 (세루비딘(Cerubidine)®); 데가렐릭스 (피르마곤(Firmagon)®); 데니류킨 디프티톡스 (온탁(Ontak)®); 덱스라족산 (지네카드(Zinecard)®); 덱스라족산 히드로클로라이드 (토텍트(Totect)®); 디뎀닌 B; 17-DMAG; 도세탁셀 (탁소테레®); 독소루비신 (아드리아마이신 PFS(Adriamycin PFS)®); 독소루비신 (아드리아마이신®, 루벡스(Rubex)®); 독소루비신 (아드리아마이신 PFS 인젝션®); 독소루비신 리포솜 (독실(Doxil)®); 드로모스타놀론 프로피오네이트 (드로모스타놀론(Dromostanolone)®); 드로모스타놀론 프로피오네이트 (마스테론 인젝션(Masterone Injection)®); 에쿨리주맙 주사 (솔리리스(Soliris)®); 엘리엇(Elliott) B 용액 (엘리엇스 B 솔루션(Elliott's B Solution)®); 엘트롬보팍 (프로막타(Promacta)®); 에피루비신 (엘렌스(Ellence)®); 에포에틴 알파 (에포젠(epogen)®); 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)®); 에스트라무스틴 (엠사이트(Emcyt)®); 에티닐 에스트라디올; 에토포시드 포스페이트 (에토포포스(Etopophos)®); 에토포시드, VP-16 (베페시드(Vepesid)®); 에베로리무스 정제 (아피니토르(Afinitor)®); 엑세메스탄 (아로마신(Aromasin)®); 페루목시톨 (페라헴 인젝션(Feraheme Injection)®); 필그라스팀 (뉴포젠(Neupogen)®); 플록수리딘 (동맥내) (FUDR®); 플루다라빈 (플루다라(Fludara)®); 플루오로우라실, 5-FU (아드루실(Adrucil)®); 풀베스트란트 (파슬로덱스(Faslodex)®); 게피티닙 (이레사(Iressa)®); 겔다나마이신; 겜시타빈 (겜자르(Gemzar)®); 겜투주맙 오조가미신 (밀로타르그(Mylotarg)®); 고세렐린 아세테이트 (졸라덱스 임플란트(Zoladex Implant)®); 고세렐린 아세테이트 (졸라덱스®); 히스트렐린 아세테이트 (히스트렐린 임플란트(Histrelin implant)®); 히드록시우레아 (히드레아(Hydrea)®); 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린(Zevalin)®); 이다루비신 (이다마이신(Idamycin)®); 이포스파미드 (이펙스(IFEX)®); 이마티닙 메실레이트 (글리벡(Gleevec)®); 인터페론 알파 2a (로페론 A(Roferon A)®); 인터페론 알파-2b (인트론 A(Intron A)®); 이오벤구안 I 123 주사 (아드레뷰(AdreView)®); 이리노테칸 (캄프토사르(Camptosar)®); 익사베필론 (익셈프라(Ixempra)®); 라파티닙 정제 (타이커브(Tykerb)®); 레날리도미드 (레블리미드(Revlimid)®); 레트로졸 (페마라(Femara)®); 류코보린 (웰코보린(Wellcovorin)®, 류코보린(Leucovorin)®); 류프롤리드 아세테이트 (엘리가드(Eligard)®); 레바미솔 (에르가미솔(Ergamisol)®); 로무스틴, CCNU (CeeBU®); 메클로레타민, 질소 머스타드 (머스타르겐(Mustargen)®); 메게스트롤 아세테이트 (메게이스(Megace)®); 멜팔란, L-PAM (알케란(Alkeran)®); 메르캅토퓨린, 6-MP (퓨린톨(Purinethol)®); 메스나 (메스넥스(Mesnex)®); 메스나 (메스넥스 탭스(Mesnex tabs)®); 메토트렉세이트 (메토트렉세이트(Methotrexate)®); 메톡살렌 (우바덱스(Uvadex)®); 8-메톡시프소랄렌; 미토마이신 C (뮤타마이신(Mutamycin)®); 미토탄 (리소드렌(Lysodren)®); 미톡산트론 (노반트론(Novantrone)®); 미트라마이신; 난드롤론 펜프로피오네이트 (듀라볼린-50(Durabolin-50)®); 넬라라빈 (아라논(Arranon)®); 닐로티닙 (타시그나(Tasigna)®); 노페투모맘 (베르루마(Verluma)®); 오파투무맙 (아르제라(Arzerra)®); 오프렐베킨 (뉴메가(Neumega)®); 옥살리플라틴 (엘록사틴(Eloxatin)®); 파클리탁셀 (팍센(Paxene)®); 파클리탁셀 (탁솔®); 파클리탁셀 단백질-결합 입자 (아브락산(Abraxane)®); 팔리페르민 (케피반스(Kepivance)®); 파미드로네이트 (아레디아®); 파니투무맙 (벡티빅스(Vectibix)®); 파조파닙 정제 (보트리엔틈(Votrienttm)®); 페가데마제 (아다겐(Adagen) (페가데마제 보빈(Pegademase Bovine))®); 페가스파르가제 (온카스파르(Oncaspar)®); 페그필그라스팀 (뉴라스타(Neulasta)®); 페메트렉세드 디소듐 (알림타(Alimta)®); 펜토스타틴 (니펜트(Nipent)®); 피포브로만 (베르사이트(Vercyte)®); 플레릭사포르 (모조빌(Mozobil)®); 플리카마이신, 미트마이신 (미트라신(Mithracin)®); 포르피머 소듐 (포토프린(Photofrin)®); 프랄라트렉세이트 주사 (폴로틴(Folotyn)®); 프로카르바진 (마툴란(Matulane)®); 퀴나크린 (아타브린(Atabrine)®); 라파마이신; 라스부리카제 (엘리텍(Elitek)®); 랄록시펜 히드로클로라이드 (에비스타(Evista)®); 리툭시맙 (리툭산(Rituxan)®); 로미뎁신 (이스토닥스(Istodax)®); 로미프롤스팀 (엔플레이트(Nplate)®); 사르그라모스팀 (류킨(Leukine)®); 사르그라모스팀 (프로킨(Prokine)®); 소라페닙 (넥사바르(Nexavar)®); 스트렙토조신 (자노사르(Zanosar)®); 수니티닙 말레에이트 (수텐트(Sutent)®); 활석 (스클레로솔(Sclerosol)®); 타목시펜 (놀바덱스(Nolvadex)®); 테모졸로미드 (테모다르(Temodar)®); 템시롤리무스 (토리셀(Torisel)®); 테니포시드, VM-26 (부몬(Vumon)®); 테스토락톤 (테슬락(Teslac)®); 티오구아닌, 6-TG (티오구아닌(Thioguanine)®); 티오퓨린; 티오테파 (티오플렉스(Thioplex)®); 토포테칸 (하이캄틴(Hycamtin)®); 토레미펜 (파레스톤(Fareston)®); 토시투모맙 (벡사르®); 토시투모맙/I-131 토시투모맙 (벡사르®); 트랜스-레티노산; 트라스투주맙 (헤르셉틴(Herceptin)®); 트레티노인, ATRA (베사노이드(Vesanoid)®); 트리에틸렌멜라민; 우라실 머스타드 (우라실 머스타드 캡슐즈(Uracil Mustard Capsules)®); 발루비신 (발스타(Valstar)®); 빈블라스틴 (벨반(Velban)®); 빈크리스틴 (온코빈(Oncovin)®); 비노렐빈 (나벨빈(Navelbine)®); 보리노스타트 (졸린자(Zolinza)®); 워트만닌; 및 졸레드로네이트 (조메타®).
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 항구토제와 연합되어 사용된다: 카소피탄트 (글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), 네투피탄트 (MGI-헬신(MGI-Helsinn)) 및 다른 NK-1 수용체 길항제, 팔로노세트론 (MGI 파마(MGI Pharma)에 의해 알록시(Aloxi)로서 판매됨), 아프레피탄트 (머크 앤 캄파니(Merck and Co.); 미국 뉴저지주 로웨이에 의해 에멘드(Emend)로서 판매됨), 디펜히드라민 (화이자(Pfizer); 미국 뉴욕주 뉴욕에 의해 베나드릴(Benadryl)®로서 판매됨), 히드록시진 (화이자; 미국 뉴욕주 뉴욕에 의해 아타락스(Atarax)®로서 판매됨), 메토클로프라미드 (AH 로빈스 캄파니(AH Robins Co.); 미국 버지니아주 리치먼드에 의해 레글란(Reglan)®으로서 판매됨), 로라제팜 (와이어쓰(Wyeth); 미국 뉴저지주 매디슨에 의해 아티반(Ativan)®으로서 판매됨), 알프라졸람 (화이자; 미국 뉴욕주 뉴욕에 의해 자낙스(Xanax)®로서 판매됨), 할로페리돌 (오르토-맥네일(Ortho-McNeil); 미국 뉴저지주 라리탄에 의해 할돌(Haldol)®로서 판매됨), 드로페리돌 (이납신(Inapsine)®), 드로나비놀 (솔베이 파마슈티칼스, 인크.(Solvay Pharmaceuticals, Inc.); 미국 조지아주 마리에타에 의해 마리놀(Marinol)®로서 판매됨), 덱사메타손 (머크 앤 캄파니; 미국 뉴저지주 라흐웨이에 의해 데카드론(Decadron)®으로서 판매됨), 메틸프레드니솔론 (화이자; 미국 뉴욕주 뉴욕에 의해 메드롤(Medrol)®로서 판매됨), 프로클로르페라진 (글락소스미스클라인; 미국 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크에 의해 콤파진(Compazine)®으로서 판매됨), 그라니세트론 (호프만-라 로슈 인크.(Hoffmann-La Roche Inc.); 미국 뉴저지주 너틀리에 의해 키트릴(Kytril)®로서 판매됨), 온단세트론 (글락소스미스클라인; 미국 노스캐롤라이나주 리서치 트라이앵글 파크에 의해 조프란(Zofran)®으로서 판매됨), 돌라세트론 (사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis); 미국 뉴욕주 뉴욕에 의해 안제메트(Anzemet)®로서 판매됨), 트로피세트론 (노파르티스(Novartis); 미국 뉴저지주 이스트 하노버에 의해 나보반(Navoban)®으로서 판매됨).
암 치료의 다른 부작용은 적혈구 및 백혈구 결핍을 포함한다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 이러한 결핍을 치료 또는 예방하는 작용제, 예컨대, 예를 들어 필그라스팀, PEG-필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파 또는 다르베포에틴 알파와 연합된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 항암 방사선 요법과 연합되어 투여된다. 예를 들어, 본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 외부 빔 요법 (EBT)으로: 이는 고-에너지 X선의 빔을 종양 위치에 전달하는 방법이다. 빔은 환자 외부에서 생성되며 (예를 들어, 선형 가속기에 의함), 종양 부위를 표적으로 한다. 이들 X선은 암 세포를 파괴할 수 있고 조심스럽게 치료 계획을 세우면 주변의 정상 조직을 보호할 수 있다. 어떠한 방사선원도 환자의 신체 내부에 있지 않다. 본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 양성자 빔 요법으로: 이는 X선 대신 양성자를 사용하여 이환 조직에 충격을 가하는 일종의 입체조형 요법이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 입체조형 외부 빔 방사선 요법으로: 이는 방사선 요법을 개체의 신체 구조에 맞추기 위해 첨단 기술을 사용하는 절차이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 방사선 요법은 근접요법으로: 이는 방사성 물질을 신체 내에 일시적으로 배치하는 것으로, 통상적으로 한 구역에 방사선의 추가 선량- 또는 부스트-를 제공하기 위해 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)과 연합되어 투여되는 외과적 절차는 외과적 종양절제술이다.
추가 실시양태에서, 항-CD27 특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 생체외 확장된 자가 T 세포가 환자에 주입된다. 또 다른 실시양태에서, 항-CD27 특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 조합된 자가 T 세포가 환자에 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 환자는 암 백신으로 백신접종되고, 항-CD27 특이적 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 함께 생체외 확장된 자가 T 세포를 주입받는다. 자가 T-세포는 자가 침윤 림프구, 종양 항원에 대한 고친화도 T-세포 수용체로 형질도입된 T-세포 또는 T-세포 신호전달 분자의 엔도-도메인을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 경쇄로 구성된 키메라 항원 수용체로 형질도입된 T 세포일 수 있다. 문헌 [Kalos M. and June C. H., Immunity, 39, 2013, p49-60; Wu R. et al., Cancer J. 2012; 18(2): 160-175; 및 June, C. H., J. Clin. Invest. 117:1466-1476 (2007)]을 참조한다.
실험 및 진단 용도
본원에 개시된 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 친화도 정제 작용제로서 사용될 수 있다. 이러한 과정에서, 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편을 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 고체 상, 예컨대 세파덱스, 유리 또는 아가로스 수지 또는 여과지 상에 고정시킨다. 고정된 항체 또는 단편을, 정제하고자 하는 CD27 단백질 (또는 그의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉시킨 후, 지지체를 적합한 용매로 세척하며, 이로써 고정된 항체 또는 단편에 결합된 CD27 단백질을 제외한 샘플 내의 실질적으로 모든 물질이 제거될 것이다. 최종적으로, 지지체를 용매로 세척하여, 결합된 CD27 (예를 들어, 단백질 A)를 용리한다. 이러한 고정된 항체 및 단편은 본 발명의 일부를 형성한다.
추가로, 예를 들어 웨스턴 블롯 및 본원에 논의된 다른 면역검정을 수행하는데 유용한 2차 항체를 생성하기 위한 항원이 제공된다.
*항-CD27 항체 (예를 들어, 인간화 항체) 및 그의 항원-결합 단편은 또한, CD27 단백질에 대한 진단 검정에 유용할 수 있고, 예를 들어 특이적 세포, 조직 또는 혈청, 예를 들어 종양 세포, 예컨대 흑색종 세포에서의 그의 발현을 검출하는데 유용할 수 있다. 이러한 진단 방법은 각종 질환 진단에 유용할 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)의 사용이 혼입된 ELISA 검정 (효소-연결된 면역흡착 검정)을 포함한다.
예를 들어, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
*(a) 기질 (예를 들어, 마이크로타이터 플레이트 웰, 예를 들어 플라스틱 플레이트의 표면)을 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 코팅하는 단계;
(b) CD27의 존재를 시험할 샘플을 기질에 적용하는 단계;
(c) 플레이트를 세척하여, 샘플 중의 미결합 물질을 제거하는 단계;
(d) CD27 항원에 대해 또한 특이적인, 검출가능하게 표지된 항체 (예를 들어, 효소-연결된 항체)를 적용하는 단계;
(e) 기질을 세척하여, 미결합, 표지된 항체를 제거하는 단계;
(f) 표지된 항체가 효소 연결된 경우, 효소에 의해 형광 신호로 전환되는 화학물질을 적용하는 단계; 및
(g) 표지된 항체의 존재를 검출하는 단계.
기질과 회합된 표지의 검출은 CD27 단백질의 존재를 나타낸다.
추가 실시양태에서, 표지된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, ABTS [예를 들어, 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산)] 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘과 반응하여 검출가능한 색 변화를 발생시키는 퍼옥시다제로 표지된다. 대안적으로, 표지된 항체 또는 단편은 섬광제의 존재 하에 섬광 계수기에 의해 검출될 수 있는, 검출가능한 방사성동위원소 (예를 들어, 3H)로 표지된다.
본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 웨스턴 블롯 또는 면역-단백질 블롯 절차에 사용될 수 있다. 이러한 절차는 본 발명의 일부를 형성하고, 예를 들어 하기를 포함한다:
(1) 임의로, CD27의 존재를 시험할 샘플로부터의 단백질을 (예를 들어, 샘플 중 단백질의 PAGE 또는 SDS-PAGE 전기영동 분리로부터) 관련 기술분야에 공지된 방법 (예를 들어, 반-건조 블롯팅 또는 탱크 블롯팅)을 사용하여 막 또는 다른 고체 기질 상으로 옮기는 단계; 결합된 CD27 또는 그의 단편의 존재를 시험할 막 또는 다른 고체 기질을 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계.
이러한 막은 비-변성 PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 겔 또는 SDS-PAGE (소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 겔에서 CD27의 존재를 시험할 단백질을 옮겨 놓았던 (예를 들어, 겔에서의 전기영동 분리 후) 니트로셀룰로스 또는 비닐-기반 (예를 들어, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF)) 막의 형태를 취할 수 있다. 막을 항-CD27 항체 또는 단편과 접촉시키기 전에, 막을 임의로, 예를 들어 탈지 분유 등으로 차단시켜 막 위에 비-특이적 단백질 결합 부위를 결합시킨다.
(2) 막을 1회 이상 세척하여 미결합 항-CD27 항체 또는 단편, 및 다른 미결합 물질을 제거하는 단계; 및
(3) 결합된 항-CD27 항체 또는 단편을 검출하는 단계.
결합된 항체 또는 단편의 검출은 CD27 단백질이 막 또는 기질 상에 및 샘플 중에 존재한다는 것을 나타낸다. 결합된 항체 또는 단편의 검출은, 검출가능하게 표지된 2차 항체 (항-이뮤노글로불린 항체)를 항체 또는 단편과 결합시킨 다음, 2차 항체의 존재를 검출함으로써 이루어질 수 있다.
본원에 개시된 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 또한, 면역조직화학에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 본 발명의 일부를 형성하고, 예를 들어 하기를 포함한다:
(1) CD27 단백질의 존재를 시험할 세포 (예를 들어, 종양 세포, 예컨대 흑색종 세포)를, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
(2) 세포 상의 또는 세포 내의 항체 또는 단편을 검출하는 단계.
항체 또는 단편 그 자체가 검출가능하게 표지된 경우에, 이를 직접적으로 검출할 수 있다. 대안적으로, 항체 또는 단편은 검출가능하게 표지된 2차 항체에 의해 결합될 수 있고, 이것이 검출된다.
본원에 개시된 특정 항-CD27 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 또한, 생체내 종양 영상화에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 방사성표지된 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편을, CD27 발현과 연관된 종양 (예를 들어, 종양 세포 표면 상에서, 예를 들어 CD27을 발현함)의 존재를 시험할 환자의 체내로 주사한 다음, 환자의 신체를 핵 영상화하여, 예를 들어 종양에 결합된 고 농도의 항체 또는 단편을 포함하는 유전자좌에서 표지된 항체 또는 단편의 존재를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 유전자좌의 검출은 CD27+ 종양 및 종양 세포의 존재를 나타낸다.
영상화 기술은 SPECT 영상화 (단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영) 또는 PET 영상화 (양전자 방출 단층촬영)를 포함한다. 표지는, 예를 들어 SPECT 영상화와 관련하여 아이오딘-123 (123I) 및 테크네튬-99m (99mTc), 또는 예를 들어, PET 영상화와 관련하여 11C, 13N, 15O 또는 18F, 또는 인듐-111을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Gordon et al., (2005) International Rev. Neurobiol. 67:385-440] 참조).
제약 조성물 및 투여
본 발명의 항-CD27 항체 및 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)의 제약 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합한다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]을 참조한다.
치료제 및 진단제의 제제는 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써, 예를 들어 동결건조 분말, 슬러리, 수용액 또는 현탁액 형태로 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY] 참조).
단독으로 투여되거나 또는 또 다른 치료제와 조합되어 투여되는 본 발명의 항체의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어 LD50 (집단의 50%에서 치사성 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료상 유효한 용량)을 결정하기 위한, 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 제약 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 용량 비가 치료 지수 (LD50/ED50)이다. 이들 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터가 인간에게 사용하기 위한 투여량 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는, 독성을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는 ED50을 포함하는 순환성 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 투여 경로에 따라 이러한 범위 내에서 달라질 수 있다.
추가 실시양태에서, 추가의 치료제는 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)과 연합되어 의사용 탁상 편람 2003 (Thomson Healthcare; 57th edition (November 1, 2002))에 따라 대상체에게 투여된다.
투여 방식은 다양할 수 있다. 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장, 비경구; 근육내, 피하, 피내, 수질내, 척추강내, 직접 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 안내, 흡입, 취입, 국소, 피부, 경피 또는 동맥내를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 침습성 경로, 예컨대 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추가의 실시양태에서, 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 그의 제약 조성물은 정맥내로, 피하로, 근육내로, 동맥내로, 종양내로 투여되거나, 또는 흡입, 에어로졸 전달에 의해 투여된다. 비-침습성 경로 (예를 들어, 경구로; 예를 들어, 환제, 캡슐 또는 정제)에 의한 투여가 또한, 본 발명의 범주 내에 있다.
본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전) 중 임의의 것 또는 그의 제약 조성물을 포함하는 용기 (예를 들어, 캡 또는 크로마토그래피 칼럼, 중공 구멍 바늘 또는 시린지 실린더를 갖는, 예를 들어 플라스틱 또는 유리 바이알)를 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전) 중 임의의 것 또는 그의 제약 조성물을 포함하는 주사 장치를 제공한다. 주사 장치는 물질을 비경구 경로, 예를 들어 근육내, 피하 또는 정맥내를 통해 환자의 신체 내로 도입하는 장치이다. 예를 들어, 주사 장치는, 예를 들어 주사하고자 하는 유체 (예를 들어, 항체 또는 단편 또는 그의 제약 조성물)를 보유하기 위한 실린더 또는 배럴, 피부를 찌르기 위한 바늘 및/또는 유체를 주사하기 위한 혈관; 및 실린더로부터 그리고 바늘 구멍을 통해 유체를 밀어내기 위한 플런저를 포함하는 시린지 (예를 들어, 제약 조성물로 사전-충전된 것, 예컨대 자동 주사기)일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 제약 조성물을 포함하는 주사 장치는 정맥내 (IV) 주사 장치이다. 이러한 장치는 캐뉼라 또는 투관침/바늘을 통해 환자의 체내로 도입되는 유체 (예를 들어, 염수; 또는 NaCl, 락트산나트륨, KCl, CaCl2를 포함하고 임의로 글루코스를 포함하는, 락테이트화 링거 용액)를 보유하기 위한 백 또는 저장소에 부착될 수 있는 튜브에 부착될 수 있는 캐뉼라 또는 투관침/바늘 내에 항체 또는 단편 또는 그의 제약 조성물을 포함한다. 항체 또는 단편 또는 그의 제약 조성물은 본 발명의 한 실시양태에서, 일단 투관침 및 캐뉼라가 대상체의 정맥 내로 삽입되고 삽입된 캐뉼라로부터 투관침이 제거되면, 상기 장치 내로 도입될 수 있다. IV 장치는, 예를 들어 말초 정맥 (예를 들어, 손 또는 팔) 내로; 상대 정맥 또는 하대 정맥, 또는 심장의 우심방 내에 (예를 들어, 중앙 IV); 또는 쇄골 하, 내부 경정맥 또는 대퇴 정맥 내로, 및 예를 들어, 상대 정맥 또는 우심방 (예를 들어, 중앙 정맥 라인)에 도달할 때까지 심장쪽으로 전진시켜 삽입할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 주사 장치는 자동 주사기; 제트 주사기 또는 외부 주입 펌프이다. 제트 주사기는 항체 또는 단편 또는 그의 제약 조성물을 환자의 체내에 도입하기 위해 표피를 침투하는 액체의 고압의 좁은 제트를 사용한다. 외부 주입 펌프는 항체 또는 단편 또는 그의 제약 조성물을 환자의 체내로 제어된 양으로 전달하는 의료 장치이다. 외부 주입 펌프는 전기적으로 또는 기계적으로 구동될 수 있다. 상이한 펌프는 상이한 방식으로 작동되며, 예를 들어 시린지 펌프는 시린지의 저장소에 유체를 보유하고, 움직일 수 있는 피스톤은 유체 전달을 제어하며, 엘라스토머 펌프는 신축성 있는 풍선 저장소에 유체를 보유하며, 풍선의 탄성 벽으로부터의 압력은 유체 전달을 구동시킨다. 연동식 펌프에서는, 롤러 세트가 유연한 튜빙의 길이에 끼어 유체를 앞으로 밀어낸다. 다중 채널 펌프에서는, 유체가 여러 속도로 다수의 저장소로부터 전달될 수 있다.
본원에 개시된 제약 조성물은 또한, 무바늘 피하 주사 장치; 예컨대 미국 특허 번호 6,620,135; 6,096,002; 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 또는 4,596,556에 개시된 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 제약 조성물을 포함하는 이러한 무바늘 장치는 또한, 본 발명의 일부이다. 본원에 개시된 제약 조성물은 또한, 주입에 의해 투여될 수 있다. 제약 조성물을 투여하기 위한 널리 공지된 체내 임플란트 및 모듈의 예는 제어된 속도로 의약을 분배하기 위한 이식가능한 마이크로-주입 펌프가 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,487,603; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프가 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,447,233; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식형 주입 장치가 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,447,224; 다중 챔버 구획을 갖는 삼투압 약물 전달 시스템이 개시되어 있는 미국 특허 번호 4,439,196에 개시된 것을 포함한다. 많은 다른 상기 체내 임플란트, 전달 시스템, 및 모듈이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 본 발명의 제약 조성물을 포함하는 것이 본 발명의 범주 내에 있다.
대안적으로, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)은 전신 방식 보다는 오히려 국부 방식으로, 예를 들어 항체 또는 단편을 종양, 예를 들어 CD27+ 종양 내로 직접 주사하는 것을 통해 투여될 수 있다. 더욱이, 항체 또는 단편은 표적화 약물 전달 시스템으로, 예를 들어 종양, 예를 들어 면역병리상태를 특징으로 하는 예를 들어 CD27+ 종양을 표적화하는 조직-특이적 항체로 코팅된 리포솜으로 투여될 수 있다. 리포솜은 이환 조직을 표적화할 것이고 이러한 조직에 의해 선택적으로 받아들여질 것이다. 이러한 방법 및 리포솜은 본 발명의 일부이다.
투여 요법은 치료 항체 또는 항원-결합 단편의 혈청 또는 조직 전환율, 증상의 수준, 치료 항체의 면역원성, 및 생물학적 매트릭스 내에서의 표적 세포의 접근성을 포함한, 여러 인자에 좌우된다. 바람직하게는, 투여 요법은 바람직하지 않은 부작용은 최소화하면서, 이와 동시에 표적 질환 상태의 개선의 발생시키기에 충분한 치료 항체 또는 단편을 전달한다. 따라서, 전달되는 생물제제의 양은 부분적으로, 특정한 치료 항체 및 치료할 상태의 중증도에 좌우된다. 치료 항체 또는 단편의 적절한 용량을 선택하는데 있어서의 안내가 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert, et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602] 참조).
적절한 용량의 결정은, 예를 들어 치료에 영향을 미치는 것으로 관련 기술분야에서 공지되거나 또는 의심되는 파라미터 또는 인자를 사용하여, 임상의에 의해 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적 용량보다 다소 적은 양으로 시작하고, 그 후에 임의의 부정적 부작용과 비교해서 목적하거나 최적 효과가 달성될 때까지 소량씩 증가된다. 중요한 진단 척도는, 예를 들어 염증의 증상들, 또는 생성된 염증성 시토카인의 수준을 포함한다. 일반적으로, 사용될 생물제제는 치료를 목표로 하는 동물과 동일한 종으로부터 유래됨으로써, 시약에 대한 어떠한 면역 반응도 최소화하는 것이 바람직하다. 인간 대상체의 경우에, 예를 들어 인간화 및 완전 인간 항체가 바람직할 수 있다.
본원에 개시된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)은 연속 주입에 의해, 또는 예를 들어, 매일, 1주에 1-7회, 매주, 격주, 매월, 격월, 분기마다, 반년마다, 매년 등으로 투여되는 용량에 의해 제공될 수 있다. 용량은, 예를 들어 정맥내로, 피하로, 국소로, 경구로, 비강으로, 직장으로, 근육내, 뇌내로, 척수내로 또는 흡입에 의해 제공될 수 있다. 매주 총 용량은 일반적으로, 적어도 0.05 μg/체중 kg, 보다 일반적으로 적어도 0.2 μg/kg, 0.5 μg/kg, 1 μg/kg, 10 μg/kg, 100 μg/kg, 0.25 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/ml, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg 또는 그 초과이다 (예를 들어, 문헌 [Yang, et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et al. (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:151-144] 참조). 용량은 또한, 대상체의 혈청에서 항-CD27 항체의 미리 결정된 표적 농도, 예컨대 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/ml 또는 그 초과를 달성하도록 제공될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-CD27 항체는, 10, 20, 50, 80, 100, 200, 500, 1000 또는 2500 mg/대상체로 매주, 격주, "4주마다", 매월, 격월, 또는 분기마다, 예를 들어 피하로 또는 정맥내로 투여된다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 세포, 조직 또는 대상체에게 단독으로 또는 추가의 치료제와 조합되어 투여되는 경우에, 질환, 예를 들어 암의 1종 이상의 증상, 또는 암의 진행에 있어서 측정가능한 개선을 발생시키기에 유효한, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)의 양을 지칭한다. 유효 용량은 추가로, 증상의 적어도 부분적 호전, 예를 들어 종양 수축 또는 제거, 종양 성장의 결여, 증가된 생존 시간을 발생시키기에 충분한 항체 또는 단편의 양을 지칭한다. 단독으로 투여된 개개의 활성 성분에 적용되는 경우, 유효 용량은 그러한 성분 단독을 지칭한다. 조합물에 적용되는 경우, 유효 용량은 조합되어, 연속으로 또는 동시에 투여되는지에 관계없이 치료 효과를 발생시키는 활성 성분의 합한 양을 지칭한다. 치료의 유효량은 진단 척도 또는 파라미터의 적어도 10%; 통상적으로 적어도 20%; 바람직하게 적어도 약 30%; 보다 바람직하게 적어도 40%, 및 가장 바람직하게 적어도 50% 개선을 발생시킬 것이다. 유효량은 또한, 주관적 척도를 사용하여 질환 중증도를 평가하는 경우에, 주관적 척도의 개선을 발생시킬 수 있다.
키트
추가로, 본원에 논의된 바와 같은 항-CD27 항체 또는 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 성분을, 본원에 논의된 바와 같은 제약상 허용되는 담체 및/또는 치료제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 성분과 연합하여 포함하는 키트가 제공된다. 항체 또는 단편 및/또는 치료제는 순수한 조성물로서 제제화될 수 있거나 또는 제약상 허용되는 담체와 조합되어 제약 조성물로 제제화될 수 있다.
한 실시양태에서, 키트는 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 또는 그의 인간화 버전) 또는 그의 제약 조성물을 하나의 용기 (예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알)에 포함하고/거나 치료제 및 그의 제약 조성물을 또 다른 용기 (예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알)에 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 인간화 131A)을 제약상 허용되는 담체와 함께, 단일의 공통 용기 내에, 임의로 제약 조성물로 함께 제제화된 1종 이상의 치료제와 임의로 조합하여 포함하는 본 발명의 조합물을 포함한다.
키트가 대상체에게 비경구 투여를 위한 제약 조성물을 포함하는 경우, 이러한 키트는 이러한 투여를 수행하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 상기 논의된 바와 같은 하나 이상의 피하 바늘 또는 다른 주사 장치를 포함할 수 있다.
키트는 키트 내에 제약 조성물 및 투여 형태에 관한 정보를 포함하는 패키지 삽입물을 포함한다. 일반적으로, 이러한 정보는 동봉된 제약 조성물 및 투여 형태를 효과적이고도 안전하게 사용하는데 있어서 환자 및 의사에게 도움을 준다. 예를 들어, 본 발명의 조합물에 관한 다음의 정보가 상기 삽입물에 제공될 수 있다: 약동학, 약력학, 임상 연구, 효능 파라미터, 적응증 및 용법, 금기, 경고, 예방조치, 유해 반응, 과다 복용, 적절한 투여량 및 투여, 공급 방법, 적절한 저장 조건, 참고사항, 제조업자/판매업자 정보 및 특허 정보.
검출 키트 및 치료 키트
편의상, 본 발명의 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, 항체 131A 및 그의 인간화 버전)이 키트에 제공될 수 있고, 즉 진단 또는 검출 검정을 수행하기 위한 지침과 함께 미리 결정된 양의 시약의 패키지된 조합물로 제공될 수 있다. 항체 또는 단편을 효소로 표지하는 경우에, 키트는 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조인자 (예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 다른 첨가제, 예컨대 안정화제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등을 포함할 수 있다. 다양한 시약의 상대량은 검정의 민감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 특히, 시약은 통상적으로 동결건조된 건조 분말로서 제공될 수 있고, 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공할 부형제를 포함할 수 있다.
또한, 예를 들어 면역검정, 예컨대 ELISA (샌드위치-유형 또는 경쟁적 포맷)를 포함한 다양한 검출 검정에 사용하기 위한, 진단 또는 검출 시약 및 1종 이상의 이러한 시약을 포함하는 키트가 제공된다. 키트의 성분은 고체 지지체에 사전-부착될 수 있거나, 또는 키트가 사용될 때 고체 지지체의 표면에 적용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 신호 생성 수단은 사용 전에 본 발명의 항체 또는 단편과 사전-연합될 수 있거나, 또는 1종 이상의 성분, 예를 들어 완충제, 항체-효소 접합체, 효소 기질 등과의 조합을 필요로 할 수 있다. 키트는 또한, 추가의 시약, 예를 들어 고체 상 표면에 대한 비특이적 결합을 감소시키기 위한 차단 시약, 세척 시약, 효소 기질 등을 포함할 수 있다. 고체 상 표면은 튜브, 비드, 마이크로타이터 플레이트, 마이크로구체, 또는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 고정시키기에 적합한 다른 물질의 형태일 수 있다. 특정한 측면에서, 화학발광성 또는 발색원성 생성물의 형성을 촉매하거나 또는 화학발광성 또는 발색원성 기질의 환원을 촉매하는 효소가 신호 생성 수단의 한 성분이다. 이러한 효소는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 키트는 본원에 기재된 포획제 및 검출 시약 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 임의로, 키트는 또한, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지침을 포함할 수 있다.
또한, 용기, 예컨대 바이알 또는 병 내에 패키지된 항-CD27 항체 (예를 들어, 인간화 항체) 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하고, 추가로 용기에 부착되거나 그와 패키지된 표지를 포함하는 키트가 제공되며, 표지는 용기의 내용물을 설명하고 용기의 내용물을 본원에 기재된 바와 같은 1종 이상의 질환 상태를 치료하기 위해 사용하는 것에 관한 표시 및/또는 지침을 제공한다.
한 측면에서, 키트는 암을 치료하기 위한 것이고, 항-CD27 항체 (예를 들어, 인간화 항체) 또는 그의 항원-결합 단편 및 추가의 치료제 또는 백신을 포함한다. 키트는 임의로, 비경구, 예를 들어 정맥내 투여용 시린지를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 키트는 항-CD27 항체 (예를 들어, 인간화 항체) 또는 그의 항원-결합 단편 및 항체 또는 단편을 백신 또는 추가의 치료제와 함께 사용하는 것을 설명하는, 용기에 부착되거나 또는 그와 패키지된 표지를 포함한다. 또 다른 측면에서, 키트는 백신 또는 추가의 치료제 및 백신 또는 추가의 치료제를 항-CD27 항체 또는 단편과 함께 사용하는 것을 설명하는, 용기에 부착되거나 또는 그와 패키지된 표지를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항-CD27 항체 및 백신 또는 추가의 치료제는 개별 바이알 내에 있거나 또는 동일한 제약 조성물로 함께 조합된다. 상기 기재된 종양 백신에 더하여, 감염성 질환을 위한 백신, 예를 들어 콤박스(COMVAX)®, M-M-R® II, 페드박스 HIB(Pedvax HIB)®, 뉴모박스(PNEUMOVAX)® 23, 프로쿼드(ProQuad)®, 토라텍(RotaTeq)®, 바리박스(VARIVAX)®, 및 조스타박스(ZOSTAVAX)®가 항-CD27 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 조합되어 사용될 수 있다.
상기 조합 요법 섹션에서 논의된 바와 같이, 2종의 치료제의 공동 투여는 작용제가 그의 치료 효과를 발휘하는 기간에서 중첩이 존재하는 한, 동일한 시간에 또는 동일한 경로에 의해 작용제가 투여될 필요는 없다. 동시 또는 순차적 투여가 고려되고, 상이한 날 또는 주에 투여하는 것이 고려된다.
본원에 개시된 항체, 펩티드, 항원-결합 단편, 또는 폴리뉴클레오티드 중 적어도 하나 및 검출 시약 또는 치료제로서의 조성물을 사용하는 것에 대한 지침을 포함하는 본원에 개시된 치료 및 검출 키트가 또한 제조될 수 있다. 이러한 키트에 사용하기 위한 용기는 전형적으로, 이들 내로 검출 및/또는 치료 조성물(들) 중 하나 이상을 놓아둘 수 있는, 바람직하게는 적합하게 등분할 수 있는 적어도 1개의 바이알, 시험 튜브, 플라스크, 병, 시린지 또는 다른 적합한 용기를 포함할 수 있다. 제2 치료제가 또한 제공되는 경우, 키트는 또한, 제2의 검출 및/또는 치료 조성물을 놓아둘 수 있는 제2의 별개의 용기를 함유할 수 있다. 대안적으로, 복수 개의 화합물이 단일 제약 조성물로 제조될 수 있고, 단일 용기 수단, 예컨대 바이알, 플라스크, 시린지, 병, 또는 다른 적합한 단일 용기에 패키지될 수 있다. 본원에 개시된 키트는 또한 전형적으로, 상업적 판매를 위해 가까이 국한되어 유지되는 바이알(들)을 함유하기 위한 수단, 예컨대 예를 들어, 주사 또는 블로우 성형된 플라스틱 용기를 포함할 것이고, 그 내에 목적하는 바이알(들)이 보유된다. 방사성표지, 발색원성, 형광발생, 또는 다른 유형의 검출가능한 표지 또는 검출 수단이 키트 내에 포함되는 경우, 표지제를 검출 또는 치료 조성물 자체와 동일한 용기 내에 제공할 수 있거나, 또는 대안적으로, 제2 조성물을 놓아둘 수 있고 적합하게 등분될 수 있는 제2의 별개의 용기 수단 내에 놓아둘 수 있다. 대안적으로, 검출 시약 및 표지를 단일 용기 수단 내에서 제조할 수 있고, 대부분의 경우에는 키트가 또한 전형적으로, 상업적 판매 및/또는 편리한 패키징 및 운반을 위해 가까이 국한되어 유지되는 바이알(들)을 함유하기 위한 수단을 포함할 것이다.
본원에 기재된 검출 또는 모니터링 방법을 수행하기 위한 장치 또는 기구가 또한 제공된다. 이러한 기구는 샘플을 유입할 수 있는 챔버 또는 튜브; 장치를 통한 샘플의 유동을 지시하기 위한 밸브 또는 펌프를 임의로 포함한 유체 취급 시스템; 임의로, 혈액으로부터 혈장 또는 혈청을 분리하기 위한 필터; 포획제 또는 검출 시약을 부가하기 위한 혼합 챔버; 및 임의로, 포획제 면역복합체와 결합된 검출가능한 표지의 양을 검출하기 위한 검출 장치를 포함할 수 있다. 샘플의 유동은 수동적 (예를 들어, 샘플이 일단 적용되면, 상기 장치의 추가 조작을 필요로 하지 않는 모세관, 정압 또는 다른 힘에 의함) 또는 능동적 (예를 들어, 기계적 펌프, 전기삼투 펌프, 원심력, 또는 증가된 공기압을 통해 발생된 힘의 적용에 의함)일 수 있거나, 또는 능동적 힘과 수동적 힘의 조합에 의할 수 있다.
추가 실시양태에서, 또한 프로세서, 컴퓨터 판독가능 메모리, 및 컴퓨터 판독가능 메모리에 저장되고 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 수행하도록 프로세서 상에 실행되도록 적합화된 루틴이 제공된다. 적합한 컴퓨팅 시스템, 환경 및/또는 구성의 예는 퍼스널 컴퓨터, 서버 컴퓨터, 휴대용 또는 랩톱 장치, 멀티프로세서 시스템, 마이크로프로세서 기반 시스템, 셋톱 박스, 프로그램 가능한 가전 제품, 네트워크 PC, 미니 컴퓨터, 메인프레임 컴퓨터를 포함하고, 상기 시스템 또는 장치 중 임의의 것, 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 시스템을 포함하는 분산 컴퓨팅 환경을 포함한다.
일반적 방법
분자 생물학의 표준 방법은 문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2nd Edition, 2001 3rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; [Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA]에 기재되어 있다. 표준 방법은 또한, 박테리아 세포에서의 클로닝 및 DNA 돌연변이유발 (Vol. 1), 포유동물 세포 및 효모에서의 클로닝 (Vol. 2), 당접합체 및 단백질 발현 (Vol. 3) 및 생물정보학 (Vol. 4)이 기재되어 있는 문헌 [Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에 제시되어 있다.
면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 및 결정화를 포함한, 단백질 정제 방법은 문헌 [Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York]에 기재되어 있다. 화학적 분석, 화학적 변형, 번역 후 변형, 융합 단백질의 생성, 단백질의 글리코실화가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391] 참조). 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 생산, 정제 및 단편화는 문헌 [Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, 상기 참조]에 기재되어 있다. 리간드/수용체 상호작용을 특징화하기 위한 표준 기술이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).
모노클로날, 폴리클로날 및 인간화 항체가 제조될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499]; 미국 특허 번호 6,329,511 참조).
인간화에 대한 대안은 파지 상에 디스플레이된 인간 항체 라이브러리, 또는 트랜스제닉 마우스에서 인간 항체 라이브러리를 사용하는 것이다 (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399).
단일 쇄 항체 및 디아바디가 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Malecki et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson and Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231:177-189]; 및 미국 특허 번호 4,946,778 참조). 이중기능적 항체가 제공된다 (예를 들어, 문헌 [Mack, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel, et al. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal, et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan, et al. (1985) Science 229:81-83; Raso, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker, et al. (1991) EMBO J. 10:3655-3659]; 및 미국 특허 번호 5,932,448, 5,532,210, 및 6,129,914 참조).
이중특이적 항체가 또한 제공된다 (예를 들어, 문헌 [Azzoni et al. (1998) J. Immunol. 161:3493; Kita et al. (1999) J. Immunol. 162:6901; Merchant et al. (2000) J. Biol. Chem. 74:9115; Pandey et al. (2000) J. Biol. Chem. 275:38633; Zheng et al. (2001) J. Biol Chem. 276:12999; Propst et al. (2000) J. Immunol. 165:2214; Long (1999) Ann. Rev. Immunol. 17:875] 참조).
항원의 정제는 항체의 생성에 필요하지 않다. 동물은 관심 항원을 보유하는 세포로 면역화될 수 있다. 이어서, 비장세포를 면역화 동물로부터 단리할 수 있고, 비장세포를 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마를 생산할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston et al., supra; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164] 참조).
항체는, 예를 들어 작은 약물 분자, 효소, 리포솜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 접합될 수 있다. 항체는 치료, 진단, 키트 또는 다른 목적에 유용하고, 예를 들어 염료, 방사성동위원소, 효소 또는 금속, 예를 들어 콜로이드성 금에 커플링된 항체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889] 참조).
형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 포함한, 유동 세포측정을 위한 방법이 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ] 참조). 예를 들어, 진단 시약으로서 사용하기 위한, 핵산 프라이머 및 프로브를 포함한 핵산, 폴리펩티드 및 항체를 변형시키는데 적합한 형광 시약이 이용가능하다 (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).
면역계의 조직학의 표준 방법이 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY] 참조).
예를 들어, 항원 단편, 리더 서열, 단백질 폴딩, 기능적 도메인, 글리코실화 부위, 및 서열 정렬을 결정하기 위한 소프트웨어 패키지 및 데이터베이스가 이용가능하다 (예를 들어, 진뱅크(GenBank), 벡터 NTI® 스위트 (인포맥스, 인크. (Informax, Inc.); 메릴랜드주 베데스다); GCG 위스콘신 패키지 (엑셀리스, 인크. (Accelrys, Inc.); 캘리포니아주 샌디에고); DeCypher® (타임로직 코포레이션(TimeLogic Corp.); 네바다주 크리스털 베이); 문헌 [Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690] 참조).
실시예 1: 면역화 및 항-CD27 항체의 선택
CD27 cDNA에 의한 마우스의 면역화
항-hCD27 항체를 생성하기 위해, hCD27의 전장 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 cDNA를 pCI-네오 벡터 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 내로 서브클로닝하였다. 수득한 벡터의 발현을 CHO-K1 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), 버지니아주 마나사스)에서의 pCI-네오-hCD27의 일시적 형질감염 및 10 μg/ml 마우스 항-hCD27 IgG1 (비디 파밍겐(BD Pharmingen) #555439)에 이어 염소 항-마우스 IgG1-FITC (1:100) (서던 바이오테크놀로지(Southern Biotechnology), 알라바마주 버밍햄)를 사용한 유동 세포측정법에 의해 체크하였다.
마우스를 헬리오스 유전자 총 (바이오라드(BioRad), 캘리포니아주 허큘레스) 및 DNA 코팅된 금 총알 (바이오라드)을 사용한 유전자 총 면역화에 의해 제조업체의 지침에 따라 면역화하였다. 간략하게, 1 μm 금 입자를 pCI-네오-hCD27 cDNA, 및 마우스 Flt3L 및 마우스 GM-CSF에 대한 상업적 발현 벡터로 2:1:1 비로 코팅하였다 (둘 다 노스 다코타주 파고 소재의 알데브론(Aldevron)으로부터의 것). 금 입자 500 μg을 코팅하기 위해 총 1 μg의 플라스미드 DNA를 사용하였다.
구체적으로, 7-8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 유전자 총을 사용하여 귀로 면역화하였고, 둘 다의 귀에 3 사이클의 샷을 제공하였다. 대략, 2회 DNA 면역화 후 마우스 혈청에서 세포-ELISA에 의해 1:4,000 항-hCD27 역가가 검출되었다. 세포-ELISA에서, 모든 인큐베이션 단계 후에 PBST (PBS, 0.01% 트윈(Tween) 20 함유)에 의한 세척 단계가 이어졌다. 모 CHO-K1 또는 CHO-K1.hCD27 세포를 조직 배양 플레이트에 시딩하고 (40,000개 세포/웰), 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 배양 배지를 제거하고, 세포를 37℃에서 마우스 혈청(의 희석물)과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBST로 세척하고, 1:1,000 염소-항-마우스 IgG-HRP (서던 바이오테크놀로지, # 1030-05)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
후속해서, 세포를 PBST로 6회 세척하고, 항-hCD27 면역반응성을 100 μl 옵티EIA TMB 기질 (비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 뉴저지주 프랭클린 레이크)로 시각화하였다. 100 μl 0.5 M H2SO4로 반응을 정지시키고, 460 및 620 nm에서 흡광도를 판독하였다. hCD27에 대한 반응성을 입증한 마우스를 최종, 제4회 면역화하고, 4일 후에 희생시켰다.
적혈구-고갈된 비장 세포 집단을 이전에 기재된 바와 같이 제조하고 (Steenbakkers et al., 1992, J. Immunol. Meth. 152: 69-77; Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134), -140℃에서 동결시켰다.
항-hCD27 항체 생산 B 세포의 선택
항-hCD27 항체를 생산하는 B 세포 클론을 선택하기 위해, 1.5 x 107개의 적혈구-고갈된 비장세포에서 단핵구를 고갈시켰다. T25-플라스크에서 전면생장률로 성장시킨, 방사선조사된 (3,000 RAD) CHO-K1.hCD27 형질감염체 상에서 4℃ 또는 37℃에서 결합시킴으로써 hCD27-특이적 B-세포를 선택하였다. 비-특이적 B-세포를 제거하기 위한 광범위한 세척 후에, 결합된 B-세포를 트립신 처리에 의해 제조업체의 지침 (인비트로젠(Invitrogen), cat. no. 25200-056)에 따라 수집하였다. 다음으로, B-세포를 문헌 [Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19: 125-134]에 기재된 바와 같이 배양하였다. 간략하게, 선택된 B-세포를 96-웰 편평-바닥 조직 배양 플레이트에서 200 μl DMEM F12/P/S/10%BCS 최종 부피 중의 7.5% (v/v) T-세포 상청액 및 50,000개의 방사선조사된 (2,500 RAD) EL-4 B5 영양 세포와 혼합하였다.
제8일에, 상청액을 상기 기재된 바와 같이 hCD27에 대한 반응성에 대해 세포-ELISA에 의해 스크리닝하였다. 또한, hCD27-반응성 상청액을 CHO-K1 세포 상에 발현된 마카카 물라타 CD27 (mmCD27)에 대한 결합에 대해 시험하였다. [마카카 물라타 CD27 진뱅크 수탁 번호 gi109095214]] 세포-ELISA에서, 모든 인큐베이션 단계 후 PBST (PBS, 0.01% 트윈 20 포함)에 의한 세척 단계가 이어졌다. 모 CHO-K1, CHO-K1.hCD27, 또는 CHO-K1.mmCD27 세포를 조직 배양 플레이트에 시딩하고 (40,000개 세포/웰) 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 배양 배지를 제거하고, 세포를 37℃에서 B-세포 상청액(의 희석물)과 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBST로 세척하고, 1:1,000 염소-항-마우스 IgG-HRP (서던 바이오테크놀로지, # 1030-05)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 후속해서, 세포를 PBST로 6회 세척하고, 항-hCD27 면역반응성을 100 μl TMB 안정화된 크로마겐 (인비트로젠, cat. no. SB02)으로 시각화하였다. 반응을 100 μl 0.5 M H2S04로 정지시키고, 흡광도를 460 및 620 nm에서 판독하였다.
후속해서, hCD27 및 mmCD27에 대한 결합을 나타내는 상청액으로부터의 64개의 B-세포 클론을 공개된 절차 (Steenbakkers et al., 1992, J. Immunol. Meth. 152: 69-77; Steenbakkers et al., 1994, Mol. Biol. Rep. 19:125-34)에 따라 미니-전기융합에 의해 불멸화하였다. 구체적으로, B-세포를 106개의 Sp2/0-Ag14 골수종 세포와 혼합하고, DMEM F12 배지로 세척하여 혈청을 제거하였다. 세포를 프로나제 용액 (칼바이오켐(Calbiochem), cat. no. 4308070.536)으로 3분 동안 처리하고, 전기융합 등몰 완충제 (에펜도르프(Eppendorf), cat. no. 53702)로 세척하였다. 전기융합은 50 μl 융합 챔버에서 30 s, 2 MHz, 400 V/cm의 교류 전기장에 이어 10 μs, 3 kV/cm의 정방, 고자장 펄스, 및 다시 30 s, 2 MHz, 400 V/cm의 교류 전기장에 의해 수행하였다.
챔버의 내용물을 하이브리도마 선택 배지로 옮기고, 한계 희석 조건 하에 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 융합 후 제8일 또는 제9일에, 하이브리도마 상청액을 상기 기재된 바와 같이 hCD27 반응성에 대해 스크리닝하였다. 하이브리도마 상청액을 상기 기재된 바와 같이, 세포-ELISA 실험에서 CHO-K1.mmCD27 또는 CHO-K1 세포 발현 hCD27 (A59T)에 대한 결합에 대해 시험하였다. 또한, 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정을 사용하여 하이브리도마 상청액과 항체 hCD27.15의 교차-경쟁을 조사하였다. 항체 hCD27.15는 ATCC에 기탁된, 기탁 수탁 번호 PTA-11008을 갖고 서열식별번호: 3의 VH 영역 및 서열식별번호: 4의 VL 영역을 갖는 (WO2012/004367의 서열식별번호 참조) 하이브리도마에 의해 생산된 항체로 WO2012/004367에 기재되어 있다. 이러한 검정에서 0.6 nM 비오티닐화된 hCD27.15를 1.2 nM rhCD27-Fc (알앤디 시스템즈(R&D systems), 382-CD-100), 1.33 nM 스트렙타비딘-K (수용자) 및 1.25 nM 항-인간 Fc-D2 (공여자)와 함께 인큐베이션하였다. 상청액의 연속 희석물을 첨가하였다. hCD27.15와의 교차-경쟁은 공여자로부터 수용자로의 감소된 에너지 전달을 발생시켰고, 이는 델타 F로 표현된다 ((비 665/615 샘플 - 비 665/615 배경) / 비 665/615 배경, 여기서 배경은 rhCD27-Fc의 무첨가에 의해 결정됨). 형광을 빅터2(Victor2) 분광광도계 (퍼킨엘머(PerkinElmer)) 상에서 615 및 665 nM에서 측정하였다.
마지막으로, 하이브리도마 상청액을 CD27 신호전달을 촉발하는 그의 능력에 대해 시험하였다. hCD27-pcDNA 및 NF-κB-루시페라제 리포터 구축물로 공동-형질감염된 HEK293T 세포를 하이브리도마 상청액의 연속 희석물에 24시간 동안 노출시켰다. 루시페라제 활성을 스테디 라이트 플러스 고감도 발광 리포터 유전자 검정 시스템 (퍼킨엘머, 6016757) 및 빅터 분광광도계 (퍼킨엘머)를 사용하여 측정하였다.
다음으로, 46개의 하이브리도마를 선택하여 단일 라운드의 한계 희석에 의해 서브클로닝하였다. CHO-K1.hCD27에 대한 결합에 대해 한계 희석 상청액을 스크리닝한 후, 클론을 선택하여 동결하고 저장하였다. 상기 기재된 바와 같은, CHO-K1.hCD27에 대한 결합, hCD27.15와의 교차-경쟁, 및 NF-κB의 자극에 대한 한계 희석 상청액의 추가의 분석은 무혈청 항체 생산을 위한 16개의 하이브리도마의 선택을 가능하게 하였다.
실시예 2: 항-hCD27 항체의 정제 및 특징화
안정한 하이브리도마를 무혈청 배지에서 7일 동안 배양하고, 상청액을 수거하였다. 항체를 제조업체의 지침에 따라, Mab 셀렉트 슈어 프롯 A(Mab Select SuRe Prot A) 수지 (지이 헬스케어(GE Healthcare) 17-5438)와의 혼합 및 폴리-정제용 크로마토그래피 칼럼 (바이오라드 731-1550)으로부터의 용리에 의해 정제하였다. 이어서, 항체를 탈염시키고, PBS pH 7.4 (깁코(Gibco)) 중에서 제바 스핀 탈염 칼럼 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 89889)을 사용하여 재완충시키고, 분광광도측정법을 사용하여 정량화하였다.
정제된 항체를 후속해서 일련의 실험에서 특징화하였다. 상기 기재된 바와 같이, CHO-K1.hCD27 및 CHO-K1.mmCD27에 결합하는 그의 능력을 세포-ELISA에 의해 결정하였다. 또한 HTRF 검정에 의해 hCD27.15와 교차-경쟁을 나타내는지 여부 및 NF-κB 루시페라제 리포터 검정에서 CD27 신호전달을 유도할 수 있는지 여부를 조사하였다. 또한, 항체가 나이브 인간 CD8+ T-세포에 대해 자극 효과를 갖는지 여부를 하기와 같이 검사하였다. 무훼손 나이브 CD8+ T-세포를 백혈구 연층으로부터, 로제트셉 인간 CD8+ T-세포 풍부화 칵테일 (스템셀(StemCell) 15063) 및 피콜 구배 원심분리, 이어서 BD IMag™ 인간 나이브 CD8+ T-세포 풍부화 키트 (BD cat 번호 558569)를 사용한 MACS-기반 음성 선택을 사용하여, 본질적으로 제조업체의 지침에 따라 단리하였다. 단리된 CD8+ T-세포를 항-CD8 및 항-CD45RA 항체를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 순도 및 나이브 정도를 체크하였다. 이어서, 이를 96 웰-플레이트에 1.5 x 105개 세포/웰의 농도로 시딩하였다. 세포를 0.125 μg/ml의 최종 농도의 가용성 항-CD3 mAb (OKT-3) 및 1.0 μg/ml의 최종 농도의 항-CD28 mAb (산퀸(Sanquin), 클론 15E8)에 의해, 정제된 항체의 연속 희석물의 존재 하에 자극하였다. 4일 후, 아이오딘화프로피듐 (PI)을 사용하여 세포의 생존율을 결정하고, 유동 세포측정법에 의해 활성화된 세포의 수를 결정하였다.
상기 실험에 의해 수득된 결과에 기초하여, hCD27.131A 항체를 추가의 분석을 위해 선택하였다. 항체 hCD27.131A (또는 "마우스 모 131A")는 서열식별번호: 7의 VH 영역 및 서열식별번호: 8의 VL 영역을 갖는 마우스 IgG1항체이다.
실시예 3: hCD27 (A59T) 및 mmCD27에 대한 항체 hCD27.15의 친화도
이전에, 효능작용 hCD27.15 항체를 WO2012/004367에 기재된 바와 같이 단리하였다. hCD27.15를 인간화하여 hCD27.15-6B (동일한 CDR 영역, 서열식별번호: 24 및 25를 갖는 WO2012/004367로부터의 hCD27.15의 인간화 버전) 및 키메라 hCD27.15-c4 (마우스 hCD27.15 가변 영역 및 인간 IgG4 불변 영역, 서열식별번호: 22 및 23)를 생산하였다. 각각 도 1 및 2에 제시된 바와 같이, hCD27.15 항체의 이들 버전은 hCD27에서 빈번하게 발생한 SNP (A59T)에 결합하지 않았고 시노몰구스 CD27 (또한 본원에서 MmCD27 또는 마카카 물라타 CD27로 지칭됨)에 결합하지 않았다. 대조적으로, 항체 hCD27.131A는 hCD27에서 빈번하게 발생한 SNP (A59T) 및 시노몰구스 CD27 둘 다에 결합하는 것으로 특이적으로 선택되었다.
실시예 4: hCD27.131A 항체의 인간화
마우스 hCD27.131A 항체를 명세서에 기재된 방법을 사용하여 인간화하였다. 마우스 hCD27.131A 항체로부터, 하기 인간화 가변 중쇄를 구축하고: 131AVH6, 131AVH7, 131AVH8, 131AVH9 (서열식별번호: 10-13); 하기 인간화 가변 경쇄를 구축하였다: 131AVL6, 131AVL7, 131AVL8, 131AVL9 (서열식별번호: 15-18). 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 불변 영역을 갖는 항체 131AVH6VL6, 131AVH6VL7, 131AVH6VL8, 131AVH7VL6, 131AVH7VL7, 131AVH7VL8, 131AVH8VL6, 131AVH8VL7, 131AVH8VL8, 및 131AVH9VL9를 제조하였다.
실시예 5: 세포-표면 CD27에 대한 결합
131AVH6VL6-hIgG1 및 131AVH6VL6-hIgG2 항체를 CHO-EXP1 세포 또는 HEK293EXP1 세포에서 발현시켰다. 1F5 hIgG1 (또는 "1F5", 또는 "1F5IgG1", US2011/0274685의 1F5의 가변 영역을 가짐)은 HEK293EXP1 세포에서 발현시켰다. 정제된 항체를 인간 CD27 발현 CHOK1 세포, 인간 CD27 A59T 발현 CHOK1 세포에 대한 결합, 및 레서스 CD27 발현 CHOK1 세포에 대한 교차-반응성에 대해 세포-기반 ELISA 포맷을 사용하여 검정하였다. 인간 CD27 발현 CHOK1 세포, 인간 CD27 A59T 발현 CHOK1 세포, 및 레서스 CD27 발현 CHOK1 세포를 96-웰 조직-배양 플레이트에 50 μl의 DMEM/F12, 10% BCS 및 겐타마이신 (CHO-K1 배지) 중에 플레이팅하였다. 세포를 검정 2일 전 2x104개 세포/웰로 또는 검정 1일 전 4x104개 세포/웰로 플레이팅하였다. 검정 전에 웰에서 배지를 제거한 다음 mAb를 100 μL 신선한 배양 배지에서 출발 농도 10 μg/mL 및 8 단계의 1:4 연속 희석물로 인큐베이션하였다. 항체를 실온에서 30-60분 동안 인큐베이션하고, 바이오텍(Biotek) EL405x 셀렉트 CW 플레이트 세척기에서 세포 ELISA 세척 프로토콜을 사용하여 PBS/0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 50 마이크로리터의 검출 항체 (HRP-접합된 염소 항-인간 IgG (잭슨(Jackson), cat#109-036-098))를 CHO-K1 배지 중 1:5000 희석물로 첨가하고, 실온에서 30-60분 동안 인큐베이션하였다. 상기 기재된 바와 같이 검정 플레이트를 세척하고, TMB로 현상하고, TMB 정지 용액 (KPL cat# 50-85-06) 또는 0.1N 인산을 사용하여 정지시켰다. 플레이트를 몰레큘라 디바이시스 베르사맥스(Molecular Devices VersaMax) 플레이트 판독기 상에서 450 nm/650 nm에서 판독하였다. 적정 곡선을 사용하여 반수-최대 유효 농도 (EC50)를 결정하였다.
건강한 인간 지원자로부터의 혈액을 팔로 알토(Palo Alto) 지원자 혈액 공여자 프로그램의 일부로서 K2-EDTA를 함유하는 튜브 (BD 바큐테이너, 비디 바이오사이언시스, 카탈로그 no. 367863) 내에 수집하였다. 레서스 원숭이로부터의 혈액을 바이오리클레메이션(Bioreclamation)에서 K2-EDTA를 함유하는 튜브 (BD 바큐테이너, 비디 바이오사이언시스, 카탈로그 no. 367863) 내에 수집하고, 서서히 뒤집고, 4℃에서 저장하고, 밤새 4℃로 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 머크 리서치 래보러토리즈(Merck Research Laboratories)로 운송하였다. 수신하면, 혈액이 용해 또는 응고의 명백한 징후가 없다는 것을 육안으로 확인하였다. 100 마이크로리터의 혈액을 96-웰 블록 (코스타(Costar), 카탈로그 no. 3960)에서 표현형 항체 및 표시된 농도의 시험 또는 대조군 항체 칵테일과 함께 암실에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 1.7 mL의 암모늄-클로라이드-칼륨 적혈구 용해 용액 (라이프 테크놀로지스, 카탈로그 no. A10492-01)과 함께 5분 동안 인큐베이션하여 적혈구 (RBC)를 용해시켰다. 용해 단계를 2ml의 ACK 용해 용액에 이어, 다시 300ml의 ACK 용해 용액으로 1회 초과로 반복하였다. 이어서 1.7 ml 포스페이트 완충 염수 (PBS) (하이클론(Hyclone), 카탈로그 no. SH30028.02)를 첨가한 후 세포를 세척하였다. 이어서 세포를 0.1 μL 고정가능한 생존율 염료 이플루오르506(eFluor506) (이바이오사이언스(eBioscience), 카탈로그 no. 65-0866-18)을 함유하는 PBS 100 μL 중에 재현탁시키고, 암실에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 표지된 세포를 포스페이트 완충 염수 (PBS) (하이클론, 카탈로그 no. SH30028.02) 중 2% 태아 소 혈청 (SAFC, 카탈로그 no. 12103C) 및 2 mM EDTA (라이프 테크놀로지스, 카탈로그 no. 15575-038)를 함유하는 2 mL 염색 완충제 (SB) 중에 재현탁시킴으로써 세척하고 이어서 1300 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 세척 단계를 SB로 기재된 바와 같이 반복한 다음 PBS 중 1% 파라포름알데히드 (일렉트론 마이크로스코피 사이언시스(Electron Microscopy Sciences), 카탈로그 no. 15710)와 암실에서 4℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 고정시켰다. SB에서의 최종 세척 후, LSR-포르테사(LSR-Fortessa) 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)에서 고처리량 샘플러를 사용하여 샘플을 획득하고 플로우조 소프트웨어 (트리 스타 인크.(Tree Star Inc.))에 의해 데이터를 분석하였다.
표 3: 세포-표면 CD27에 대한 131AVH6VL6-hIgG1 및 1F5-hIgG1의 결합
Figure pat00004
형질감염된 CHO 세포 (cELISA) 또는 1차 T 세포 (유동 세포측정법) 상의 세포 표면 인간 CD27에의 결합에 대한 EC50은 131AVH6VL6-hIgG1의 경우 1F5-hIgG1과 비교하여 대략 4-배 더 낮다 (표 3).
인간화 131A-hIgG1 및 131A-hIgG4 변이체 항체를 CHO-EXP1 세포 또는 HEK293EXP1 세포에서 발현시켰다. 정제된 항체를 인간 CD27 발현 CHOK1 세포에 대한 결합에 대해 세포-기반 ELISA 포맷을 사용하여 검정하였다. 인간 CD27 발현 CHOK1 세포를 96-웰 조직-배양 플레이트에 50 μl의 DMEM/F12, 10% BCS (소 소 혈청) (CHO-K1 배지) 중에 플레이팅하였다. 세포를 검정 2일 전 2x104개 세포/웰로 또는 검정 1일 전 4x104개 세포/웰로 플레이팅하였다. 검정 전에 웰에서 배지를 제거한 다음 mAb를 100 μL 신선한 배양 배지에서 출발 농도 10 μg/mL 및 8 단계의 1:5 연속 희석물로 인큐베이션하거나 (hIgG4 항체) 또는 출발 농도 50 μg/mL 및 8 단계의 1:5 연속 희석물로 인큐베이션하였다 (hIgG1 항체). 항체를 실온에서 30-60분 동안 인큐베이션하고, 바이오텍 EL405x 셀렉트 CW 플레이트 세척기에서 세포 ELISA 세척 프로토콜을 사용하여 PBS/0.05% 트윈 20으로 3회 세척하였다. 50 마이크로리터의 검출 항체 (HRP-접합된 염소 항-인간 IgG (서던 바이오테크(Southern Biotech), Cat# 2014-05)를 CHO-K1 배지 중 1:2000 희석물로 첨가하고, 실온에서 30-60분 동안 인큐베이션하였다. 상기 기재된 바와 같이 검정 플레이트를 세척하고, TMB로 현상하고, TMB 정지 용액 (KPL cat# 50-85-06) 또는 0.1N 인산을 사용하여 정지시켰다. 플레이트를 몰레큘라 디바이시스 스펙트라맥스 플러스 384(SpectraMax Plus 384) 플레이트 판독기 상에서 450 nm/650 nm에서 판독하였다. 적정 곡선을 사용하여 반수-최대 유효 농도 (EC50)를 결정하였다.
표 4: 세포-표면 CD27에 대한 결합: 인간화 131A 항-CD27 항체
Figure pat00005
모든 인간화 131A-hIgG1 및 131A-hIgG4 변이체 항체는 형질감염된 CHO 세포 상의 세포 표면 인간 CD27에 대한 결합에 대해 (cELISA) 131AVH6VL6-hIgG1에 대한 EC50의 2-배 이내인 EC50을 가졌고 (표 4), 한편 1F5-hIgG1에 대한 EC50은 131AVH6VL6-hIgG1과 비교하여 대략 4-배 더 높았다 (표 3).
건강한 인간 지원자로부터의 혈액을 스탠포드 혈액 센터로부터 백혈구 연층으로서 수득하고, 피콜-플라크 플러스 (지이 헬스케어, #17-1440-03)를 사용한 밀도 원심분리에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리하였다. 이어서 PBMC 분획 중 나머지 적혈구 (RBC)를 2 mL의 암모늄-클로라이드-칼륨 (ACK) 적혈구 용해 용액 (라이프 테크놀로지스, #A10492-01)과 함께 5분 동안 실온에서 인큐베이션하여 용해시킨 다음, 포스페이트 완충 염수 (PBS) (하이클론, #SH30028.02) 중 2% 태아 소 혈청 (SAFC, #12103C) 및 2 mM EDTA (라이프 테크놀로지스, #15575-038)를 함유하는 10 mL 염색 완충제 (SB) 중에서 세척하고, 이어서 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서 바이셀 자동화 세포 계수기 (베크만 쿨터 #383556)를 사용하여 세포를 계수하고, U-바닥 96 웰 플레이트에 웰당 2x105개의 세포로 분배하였다. 이어서 세포를 0.1 μL 고정가능한 생존율 염료 이플루오르506 (이바이오사이언스, #65-0866-18)을 함유하는 PBS 100 μL 중에 재현탁시키고, 암실에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 표지된 세포를 150ul 염색 완충제 (SB) 중에 재현탁시킴으로써 세척하고 이어서 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 이어서 세포를 1차 항-CD27 항체를 함유하는 SB 100ul 중에 다양한 농도로 재현탁시키고, 암실에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 이전에 기재된 바와 같이 세척 및 원심분리 단계를 행하였다. 이어서, 세포를 인간화 항-CD27 클론을 검출하기 위해 접합된 2차 마우스 항-인간 IgG1 항체 PE (서던 바이오테크 #HP6001), 또는 모 마우스 항-CD27 항체를 검출하기 위한 당나귀 항-마우스 Alexa555 (써모피셔(Thermofisher) # A-31570)로 염색하였다. 세포를 암실에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 세척 및 원심분리 단계를 행하였다. 이어서, 세포를 표면 마커 (CD3, CD4, CD8, CD11b)에 대한 표현형 항체 칵테일로 염색하고, 암실에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 세척 및 원심분리 단계를 행하였다. 마지막으로, 세포를 100ul의 BD 시토픽스 (비디 바이오사이언시스 #554655)와 함께 암실에서 4℃에서 10분 동안 인큐베이션하여 고정시킨 다음, 세척 및 원심분리 단계를 행하였다. LSR-포르테사 유동 세포측정기 (비디 바이오사이언시스)에서 고처리량 샘플러를 사용하여 샘플을 획득하고 플로우조 소프트웨어 (트리 스타 인크.)에 의해 데이터를 분석하였다.
표 5: 인간 T 세포에서 세포-표면 CD27에 대한 인간화 131A 항-CD27 항체의 결합
Figure pat00006
EC50= 반수 최대 유효 농도; SD = 표준 편차; MFI = 평균 형광 강도
* 말초 혈액 (N=2 공여자)으로부터의 T 세포에 대한 유동 세포측정법 MFI
모든 인간화 131A-hIgG1 변이체 항체는 1차 T 세포 (유동 세포측정법)에의 결합에 대해 131AVH6VL6-hIgG1에 대한 EC50과 대등하거나 (10% 내) 또는 그보다 낮은 EC50을 가졌고 (표 5), 한편 1F5-hIgG1에 대한 EC50은 131AVH6VL6-hIgG1과 비교하여 대략 5-배 더 높았다 (표 3).
실시예 6: 인간 CD27 재조합 단백질에의 항-CD27 항체의 결합에 대한 친화도 결정
항-인간 CD27 항체 131AVH6VL6-hIgG1 및 131AVH6VL6-hIgG2의 동역학적 결합 활성을 비아코어 T200 시스템 (비아코어, 지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정하였다. 대략 400 RU의 인간 CD27-Fc 융합 단백질, 대략 2000 RU의 인간 CD27 A59T-Fc 융합 단백질 또는 대략 300 RU의 레서스 마카크 CD27-Fc 융합 단백질을 아민 커플링 화학을 통해 시리즈 S CM5 센서 칩, 카탈로그 번호 BR-1005-30 상에 고정시켰다. HBS-EP+ 완충제 (BR-1006-69)를 구동 완충제로서 50 μL/분의 유량으로 사용하였다. 4.1 nM 내지 400 nM 범위의 다양한 농도의 131AVH6VL6-hIgG1 및 131AVH6VL6-hIgG2를 항원 표면 상에 주입하였다. 항체 주입을 180초 지속하고 주입 해제 후 900초 동안 모니터링하였다. 각각의 주입 사이클 후 3M MgCl2의 30초 주입에 의해 항원 표면을 재생시켰다.
센소그램을 블랭크 표면으로부터의 반응 및 완충제 주입으로부터의 반응을 차감하여 "이중 참조"하고, 회합률 (ka) 및 해리율 (kd) 상수, 및 평형 해리 상수 KD를 분석하는데 사용하였다. 생성된 데이터 세트를 비아코어 T200 평가 소프트웨어 (버전 2.0)를 사용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델과 피팅시켰다. 표 6은 인간 CD27-Fc 융합 단백질, 인간 CD27 A59T-Fc 융합 단백질 및 레서스 마카크 CD27-Fc 융합 단백질에 대한 항-인간 CD27 항체의 친화도를 요약한다.
표 6: 비아코어를 사용한, CD27 항원에 대한 항-인간 CD27 항체의 친화도의 측정
Figure pat00007
비아코어 4000 시스템 (비아코어, 지이 헬스케어, 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하여 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 실험을 수행하여 His9G-태그부착된 인간 및 시노몰구스 CD27 재조합 단백질 ("His9G", 서열식별번호: 69로 개시됨) (사내, HEK293 세포의 일시적 플라스미드 형질감염)에 대한 인간화 항-CD27.131A hIgG1 및 hIgG4 변이체의 동역학적 결합 활성을 결정하였다. 시리즈 S CM5 센서 칩 (GE/비아코어, Cat# BR-1005-30)의 표면을 마우스 항-인간 IgG (Fc) 항체 (인간 항체 포획 키트, GE/비아코어, Cat# BR-1008-39)의 아민-커플링을 통해 제조업체의 프로토콜에 따라 제조하여, 약 9000 RU의 고정된 항체를 생산하였다. 검정은 여과 및 탈기된 HBS-EP+ 구동 완충제, pH 7.4 (GE/비아코어, Cat# 1006-69) 중에서 25℃에서 수행하였다. 항-CD27.131A 키메라 및 변이체를 6.6 nM (1 ug/ml)에서 120초 동안 10 uL/분의 유량으로 포획하였다. 항-인간 Fc 항체로 변형되었지만 CD27 항체가 결여된 유동 세포 스팟을 참조로 사용하였다. His9G-태그부착된 인간 또는 시노몰구스 CD27 단백질 ("His9G", 서열식별번호: 69로 개시됨)의 5-포인트 2-배 일련의 희석물 (3.13 nM에서 50 nM)을 항체 표면 상에 180초 (회합기) 동안 30 uL/분으로 주입한 다음 600초의 완충제 흐름 (해리기)으로 주입하였다. 각각의 주입 사이클 후 3M MgCl2의 30초 주입에 의해 칩 표면을 재생시켰다.
데이터를 블랭크 표면으로부터의 반응 및 완충제 주입으로부터의 반응을 차감하여 이중 참조하고, 회합률 (ka) 및 해리율 (kd) 상수, 및 평형 해리 상수 KD를 분석하는데 사용하였다. 생성된 데이터 세트를 비아코어 4000 비아이밸루에이션 소프트웨어, 버전 1.0 (GE/비아코어)을 사용하여 1:1 랭뮤어 결합 모델과 피팅시켰다. 표 7은 인간 및 시노몰구스 CD27/His 단백질에 대한 인간화 항-CD27.131A hIgG1 및 hIgG4 변이체의 친화도를 요약한다.
표 7: 인간화 항-CD27.131A hIgG1 및 hIgG4 변이체와 His9G-태그부착된 인간 및 시노몰구스 CD27 ("His9G", 서열식별번호: 69로 개시됨)의 상호작용에 대한 친화도 데이터.
Figure pat00008
실시예 7: 마우스 종양 모델에서 1F5-hIgG1과 비교한 131AVH6VL6-hIgG1의 항종양 활성
마우스: 마우스 CD27 유전자의 세포외 도메인을 인간 CD27 유전자의 세포외 도메인과 교환한 다음, 1449개의 SNP 분석이 97.95%-98.99%의 C57BL/6 수용자 게놈을 나타낼 때까지 C56BL6/J 배경과 역교배하여 B6.Cg- Cd27tm1(CD27)Jbo/Tac 마우스 (huCD27KI 마우스)를 생성하였다. 20.3 그램 (범위 17.5 - 23.5 gm)의 평균 체중을 갖는 대략 8 내지 12주령의 암컷 huCD27KI 마우스를 타코닉 래보러토리 (뉴욕주 저먼타운)에 유지되어 있는 머크 육종 콜로니로부터 수득하였다. 통상적인 동물 사료 및 물은 자유롭게 제공되었다.
항체 시약: 모노클로날 항체는 내부 공급원으로부터 동결된 (-80℃) 스톡으로서 수득하였다. 131AVH6VL6-hIgG1 항체 및 1F5-hIgG1을 재조합 세포주에 의해 생산하였다. 마우스 IgG2a 이소형 대조군 (이소형 대조군)을 하이브리도마 세포 배양으로부터 생산하였고, 이는 감염성 활액낭 질환 바이러스 VP2-4-3_GV에 대해 특이적이었다.
항체 시약 제제: 제제 완충제는 단백질을 안정화하고 침전을 방지하기 위해 각 항체에 대해 특이적이다. 제제는 하기와 같다: 이소형 대조군: 20 mM 아세트산나트륨, 9% 수크로스, pH 5.5; 131AVH6VL6-hIgG1: 20 mM 아세트산나트륨, 9% 수크로스, pH 5.5; 1F5-hIgG1: 10mM Na포스페이트 + 75mM NaCl + 3% 수크로스, pH 7.4.
종양 세포주 제조 및 이식: MC38은 C57BL6/J 마우스 결장 선암종으로부터 유래된 세포주이다. 동결된 스톡으로부터의 MC38 세포를 10% 태아 소 혈청 (하이클론 Cat. SH30088.03)이 보충된 DMEM 배지 (셀그로(Cellgro) Cat.10-013CV)에 시험관내 단층 배양물로서, 공기 중 5% CO2의 분위기 하에 37℃에서 유지시켰다. 1 x 106개의 대수기 및 전면생장-미만 MC38 세포를 각각의 마우스의 배측 우측 측복부에 DMEM 기초 배지 100 μL 부피로 피하로 (SC) 주사하였다. 마우스를 먼저, 이식을 위해 사용될 구역을 전자 클리퍼로 면도하였다.
종양 측정 및 체중: 종양을 제1 용량 전날 및 이후 1주 2회 측정하였다. 종양 길이 및 폭은 전자 캘리퍼를 사용하여 측정하였고, 종양 부피는 식 부피 (mm3) = 0.5 x 길이 x 폭2를 사용하여 결정하였고, 여기서 길이는 보다 긴 치수이다. 마우스를 주기적으로 칭량하여 전반적 건강을 모니터링하였다. 처리 전에, 마우스를 칭량하고, 개별 마우스로부터의 종양을 측정하였다. 편견을 방지하기 위해, 체중별 또는 종양 부피별 임의의 이상치를 없애고 나머지 마우스를 동등한 평균 종양 크기에 의해 처리군으로 분배하였다. MC38 종양-보유 마우스의 평균 종양 부피가 ~85 mm3 (범위 70-100 mm3)에 도달한 때인 이식 후 대략 5일에, 투여를 시작하였다. 동물에게 항체를 하기 기재된 바와 같이 투여하였다.
투여 용액 제조, 투여, 및 분석: 동물 모델에서 시험할 항체의 동결된 스톡을 해동하고 웨트 아이스로 옮겼다. 반복되는 동결 해동을 피하기 위해, 스톡의 각각의 바이알을 1회 해동하여 4℃에서 저장하였다. 해동되면, 항체는 1개월 내에 사용하였다. 각각의 투여 전에, 각각의 항체의 스톡 용액을 적절한 희석제 중에 공칭 농도로 희석하고, 즉시 투여하였다. 투여 용액의 분취물을 드라이 아이스로 순간 동결시키고, 분석시까지 -80℃에서 저장하였다. 전기화학발광 검출 및 패턴화된 어레이의 조합인 멀티-어레이 기술에 기초한 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery) (MSD®; 메릴랜드주 록빌) 플랫폼을 사용하여 투여 용액을 평가하였다.
투여 및 결과: MC38 종양-보유 huCD27 녹-인 마우스에 131AVH6VL6-hIgG1, 1F5-hIgG1, 또는 이소형 대조군을 5mg/kg 용량으로, IP로, 총 7회 용량 동안 3-4일마다 투여하였다. 투여 후, 동물을 계속해서 모니터링하고 종양 부피를 1주 2회 측정하였다. 도 4에 제시된 결과에 의해 입증되는 바와 같이, 131AVH6VL6-hIgG1에 대한 항종양 반응은 1F5-hIgG1에 대한 항종양 반응보다 더 컸다.
실시예 8: 마우스 종양 모델에서의 항-PD-1 항체와 조합된 131AVH6VL6-hIgG1의 항종양 활성
마우스: 21.21 그램 (범위 18.06-23.21 그램)의 평균 체중을 갖는 대략 10 내지 13주령의 암컷 B6.Cg- Cd27tm1(CD27)Jbo/Tac (huCD27KI) 마우스를 타코닉 래보러토리 (뉴욕주 저먼타운)에 유지되어 있는 육종 콜로니로부터 수득하였다. 통상적인 동물 사료 및 물은 자유롭게 제공되었다.
항체 시약: 모노클로날 항체는 내부 공급원으로부터 동결된 (-80℃) 스톡으로서 수득하였다. 131AVH6VL6-hIgG1 및 항-뮤린 PD-1 마우스 IgG1 항체 (muDX400)를 재조합 세포주에 의해 생산하였다. 이소형 대조군은 감염성 활액낭 질환 바이러스 VP2-4-3_GV에 대해 특이적인 마우스 IgG2a였고, 하이브리도마 세포 배양으로부터 생산하였다.
항체 시약 제제: 단백질을 안정화하고 침전을 방지하기 위해 모든 항체를 20 mM 아세트산나트륨, 9% 수크로스, pH 5.5 중에 제제화하였다.
종양 세포주 제조 및 이식: MB49는 C57BL6/J 마우스 방광 암종으로부터 유래된 종양 세포주이다. 동결된 스톡으로부터의 MB49 세포를 10% 태아 소 혈청 (하이클론 Cat. SH30088.03)이 보충된 DMEM 배지 (셀그로 Cat.10-013CV)에 시험관내 단층 배양물로서, 공기 중 5% CO2의 분위기 하에 37℃에서 유지시켰다. 5 x 105개의 대수기 및 전면생장-미만 MB49 세포를 각각의 마우스의 배측 우측 측복부에 DMEM 기초 배지 100 μL 부피로 피하로 (SC) 주사하였다. 마우스를 먼저, 이식을 위해 사용될 구역을 전자 클리퍼로 면도하였다.
종양 측정 및 체중: 종양을 제1 용량 전날 및 이후 1주 2회 측정하였다. 종양 길이 및 폭은 전자 캘리퍼를 사용하여 측정하였고, 종양 부피는 식 부피 (mm3) = 0.5 x 길이 x 폭2를 사용하여 결정하였고, 여기서 길이는 보다 긴 치수이다. 마우스를 주기적으로 칭량하여 전반적 건강을 모니터링하였다. 처리 전에, 마우스를 칭량하고, 개별 마우스로부터의 종양을 측정하였다. 편견을 방지하기 위해, 체중별 또는 종양 부피별 임의의 이상치를 없애고 나머지 마우스를 동등한 평균 종양 크기에 의해 처리군으로 분배하였다. MB49 종양-보유 마우스의 평균 종양 부피가 ~91.56 mm3 (범위 80.94-102.89 mm3)에 도달한 때인 이식 후 대략 7일에, 투여를 시작하였다. 동물에게 항체를 하기 기재된 바와 같이 투여하였다.
투여 용액 제조, 투여, 및 분석: 동물 모델에서 시험할 항체의 동결된 스톡을 해동하고 웨트 아이스로 옮겼다. 반복되는 동결 해동을 피하기 위해, 스톡의 각각의 바이알을 1회 해동하고, 1회 사용에 충분한 부피로 분취물을 제조하였다. 이러한 목적을 위해 폴리프로필렌, 저 부착 튜브를 사용하였다. 분취물을 드라이 아이스로 순간 동결시키고, -80℃에서 저장하였다. 각각의 투여 전에, 1개의 분취물을 해동하고, 적절한 희석제 중에 공칭 농도로 희석하고, 즉시 투여하였다. 투여 용액의 분취물을 드라이 아이스로 순간 동결시키고, 분석시까지 -80℃에서 저장하였다. 전기화학발광 검출 및 패턴화된 어레이의 조합인 멀티-어레이 기술에 기초한 메소 스케일 디스커버리 (MSD®; 메릴랜드주 록빌) 플랫폼을 사용하여 투여 용액을 평가하였다.
투여 및 결과: MB49 종양-보유 huCD27 KI 마우스에 131AVH6VL6-hIgG1, muDX400, 131AVH6VL6-hIgG1 +muDX400, 또는 이소형 대조군을 5mg/kg 용량으로, IP로 투여하였다. 131AVH6VL6-hIgG1은 총 6회 용량 동안 3-4일마다 투여하였다. muDX400은 총 4회 용량 동안 매주 투여하였다. 투여 후, 동물을 계속해서 모니터링하고 종양 부피를 1주 2회 측정하였다. 도 5에 제시된 결과에 의해 입증되는 바와 같이, 131AVH6VL6-hIgG1 또는 muDX400 단독에 대해 최소 항종양 반응이 존재하였지만, 131AVH6VL6-hIgG1 + muDX400을 사용한 조합 요법은 유의하게 증진된 항종양 효능으로 이어졌다.
실시예 9: NF-κB 활성화 검정
세포: NF-κB-루시페라제 리포터 구축물 (pNiFty2-Luc, 인비보젠(Invivogen))을 함유하는 HEK293FT 인간 배아 신장 세포를 이전에, 제오신 약물 선택을 사용한 안정한 형질감염 방법에 의해 생성하였다 (293FT-NF-κB-루시페라제 세포).
세포 배양: 293FT-NFκB-루시페라제 세포를 10% 열 불활성화된 태아 소 혈청 (하이클론), 1X Pen/strep/글루타민 (셀그로), 및 200ug/mL 제오신 (라이프 테크놀로지스)으로 보충된 DMEM + 2mM 글루타민 (셀그로)에서 성장시켰다.
항체: hCD27.131A IgG1 및 IgG4 항체를 CHO-EXPI 또는 293-EXPI 세포에서의 일시적 발현에 의해 생산하였다. 1F5 IgG1은 293-EXPI 세포에서의 일시적 발현에 의해 생산하였다. hCD27.15-4B IgG4는 CHO 세포에서의 안정한 발현에 의해 생산하였다. 모든 항체를 표준 단백질 A 방법론에 의해 정제하였다.
형질감염: 인간 CD27 WT (서열 참조: NP_001233), 인간 CD27 변이체 p.Ala59Thr ("A59T", 대립유전자 빈도: 0.2, 서열 참조: rs25680) 또는 레서스 / 시노몰구스 CD27 (서열 참조: XP_001104337.1 / XP_005569963.1)에 대한 단백질을 코딩하는 전장 cDNA를 pCI-네오 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 리포펙타민 2000 (라이프 테크놀로지스)을 사용하여 CD27 플라스미드로 293FT-NFκB-루시페라제 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 유동 세포측정법을 사용하여 모든 CD27 구축물의 표면 발현을 확인하였다.
항체에 의한 자극: CD27 구축물의 일시적 형질감염의 대략 16-20시간 후에, 세포 해리 완충제 (밀리포어(Millipore)) 또는 TyrpLE 익스프레스(TyrpLE Express) (라이프)를 사용하여 세포를 수거하고, 계수하고, 96-웰 투명 바닥 발광 플레이트 (코닝(Corning)) 내로 웰당 5,000-10,000개의 세포로 Opti-MEM (라이프 테크놀로지스)에 재플레이팅하고, 37℃에서 30-180분 동안 휴지/부착되게 한 후, 가용성 항-CD27 항체로 자극하였다. 이어서 가용성 항-hCD27 hCD27.131A IgG1 또는 hCD27.131A IgG4 (최고 용량 10μg/ml), 1F5 IgG1 (최고 용량 10μg/ml) 및 hCD27.15-4B IgG4 (최고 용량 160μg/ml) 항체를 세포에, 표시된 바와 같이 4배 또는 10배 일련의 희석물로 삼중으로 첨가하고, 세포를 37℃에서 16-20시간 동안 인큐베이션하였다.
NF-κB 활성에 대한 검정: 항체와 37℃에서 16-20시간 동안 인큐베이션한 후, 브라이트-글로(Bright-Glo) (프로메가)의 첨가 전 5분 동안 세포를 실온에서 휴지시켰다. 이어서 플레이트를 빛으로부터 보호하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 발광측정기 / 발광 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이스- LJL 바이오시스템 또는 엔비전 시스템) 상에서 분석하였다. 항체에 의한 배수 변화 값을 항체가 부재하는 조건에 기초하여 계산하였다. 배수 변화 값은 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 용량 반응에 대한 비선형 곡선 피트를 적용하는데 사용하였다 [모델: log(효능제) vs. 반응 - 가변 기울기 (4개 파라미터), 어떠한 제약도 적용되지 않음].
CD27 이소형에 걸쳐 가용성 활성을 비교한 경우, hCD27.131A VH6VL6 huIgG1이 모든 이소형에 걸쳐 NF-κB 활성을 유도하는 것에 대해 최고의 잠재력을 나타내었다 (도 6). hCD27.131A VH6VL6 huIgG1은 WT 및 A59T 인간 CD27에 대해 대등한 효력을 나타내었고 (평균 EC50 각각 2.22 및 4.72 nM), 레서스 CD27에 대해 대략 7-배 더 강력한 효력을 나타내었다 (평균 0.29nM) (표 8). 대조적으로, 1F5 huIgG1은 가용성 형태로 일관되게 활성이지 않았고, 따라서 1F5 huIgG1에 대한 EC50 값을 계산할 수 없었다 (도 6).
hCD27.15-4B IgG4 (동일한 CDR 영역, 서열식별번호: 41 및 42를 갖는 WO2012/004367로부터의 hCD27.15의 인간화 버전)는 hCD27 WT 발현 세포에 대해 일관되게 활성을 나타내었지만 CD27 A59T 발현 또는 레서스 CD27 발현 세포에 대해서는 그렇지 않았다. 이는 hCD27.15-4B가 전반적으로 20%의 빈도로 존재하는 CD27의 A59T 대립유전자에 대해 활성이 아닐 것임을 시사한다. 동일한 추세가 모 hCD27.15 클론에 대해 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). 또한, hCD27.15-4B IgG4 mAb는 hCD27.131AVH6VL6-huIgG1 대비, NF-κB 활성을 유도하는 것에서 덜 강력하였다. 이들 실험에서, hCD27.15-4B IgG4는 심지어 160μg/ml의 용량에서도 NF-κB 신호전달에 대해 플래토를 유도하지 않았고, 따라서 EC50 값을 계산할 수 없었다. 표 9는 보다 낮은 용량에서의 활성 차이를 예시하기 위해 단일 2.5μg/ml 농도에서의 NF-κB 활성화에 대한 배수 변화 값을 제시한다. 예를 들어, 2.5μg/ml의 WT CD27 발현 세포에서, hCD27.131A VH6VL6 huIgG1은 hCD27.15-4B IgG4 대비 (평균 배수 변화: 2.52 ± .45 vs. 1.82 ± .38, 대응표본 t-검정 p-값: 0.01) 또는 1F5 huIgG1 대비 (배수 변화: 1.34 ± .29, p-값: 0.001) 더 높은 효력을 나타내었다. 전체적으로, 이들 데이터는 hCD27.131A VH6VL6 huIgG1이 WT CD27, 및 CD27 뿐만 아니라 레서스 CD27의 A59T 부차적 변이체 대립유전자에 대해 분명한 NF-κB 루시페라제 활성을 나타낸다는 것을 보여주고, hCD27.131A VH6VL6 huIgG1이 1F5 huIgG1에 비해 얼마나 더 높은 활성을 보여주는지 및 hCD27.15-4B IgG4에 비해 얼마나 더 강력한 활성을 보여주는지 예시한다.
여러 인간화 hCD27.131A 변이체를 CD27 유도된 NF-κB 루시페라제 활성에 대해 시험하였다 (도 7). 모든 인간화 변이체는 1F5 IgG1보다 더 높은 활성을 나타내었다. 키메라 마우스-인간 hCD27.131A 항체의 직접 비교는 NF-κB 루시페라제 활성에 대한 키메라 huIgG1 또는 huIgG4 프레임워크의 유사한 활성화를 보여주었다 (도 7a). 전체적으로, 모든 인간화 hCD27.131A huIgG1 변이체는 서로 유사하게 거동하였고, 1F5 huIgG1에 비해 분명하게 더 높은 NF-κB 루시페라제 활성을 보여주었다 (10 μg/ml 중앙 배수 변화: 5.32 vs. 2.23, 도 7a). 유사하게, 모든 인간화 hCD27.131A IgG4 변이체는 1F5 huIgG1에 비해 더 높은 활성을 보여주었고 (10μg/ml 중앙 배수 변화: 3.06 vs. 1.73), 개개의 131A IgG4 항체 사이에서 더 큰 활성 범위가 관찰되었다 (도 7b).
표 8: NF-κB-루시페라제 리포터 검정에서의 hCD27.131A VH6VL6 huIgG1, 1F5 huIgG1, hCD27.15-4B IgG4의 생물활성: EC50 및 Emax 값은 피팅된 용량 반응 곡선에 기초함.
Figure pat00009
표 9: NF-κB-루시페라제 리포터 검정에서의 hCD27.131A VH6VL6 huIgG1, 1F5 huIgG1, hCD27.15-4B IgG4의 생물활성: 2.5μg/ml에서의 배수 변화 값.
Figure pat00010
실시예 10: 1차 인간 및 레서스 T 세포 공동-자극 검정에서의 생물활성
인간 풍부화된 CD8+ T 세포를 백혈구 연층으로부터, 로제트셉 인간 CD8+ T 세포 풍부화 칵테일 (스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies), 캐나다 밴쿠버)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수득하였다. 간략하게, 백혈구 연층을 항체 칵테일과 함께 인큐베이션하고, PBS + 2% FBS로 희석한 다음, 부력 밀도 배지 피콜-파크 플러스 (지이 헬스케어, 영국) 상에서 원심분리하여 RBC와 함께 원치않는 세포를 펠릿화하였다. 이어서 풍부화된 CD8+ T 세포를 혈장 및 밀도 배지 계면에서 수득하여, 광범위하게 세척하고, ACK 용해 완충제 (써모 피셔, 미국 매사추세츠주)로 용해시켰다. 샘플을 인간 나이브 CD8+ T 세포 풍부화 세트 (비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주)를 사용하여 추가로 프로세싱하여 나이브 CD8+ T 세포를 단리하였다. 세포를 신선한 상태로 사용하거나, 또는 향후 실험에 사용하기 위해 동결시켰다.
활성화 검정을 위해, 나이브 CD8+ 세포를 DMEM-F12 (깁코, 미국 캘리포니아주), 5% 열 불활성화된 인간 혈청 (시그마, 미국 미주리주), 50 μM 2-메르캅토에탄올 (시그마, 미국 미주리주), 100 U/ml 페니실린 및 100 ug/ml 스트렙토마이신 (스위스 론자) 중에 7.5 x 105개의 세포/ml로 재현탁시켰다. 1.5 x 105개의 세포를 편평-바닥 96-웰 플레이트에서 준최적 용량의 αCD3 (0.025-0.05 μg/ml 클론 OKT3, 바이오레전드, 미국 캘리포니아주) 및 αCD28 (1 μg/ml 클론 15E8, 셀 사이언시스(Cell Sciences), 미국 매사추세츠주)의 존재 하에 가용성 131AVH6VL6-hIgG1, 1F5-hIgG1, 이소형 또는 항-CD3/항-CD28 단독과 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 3일 동안 배양하였다. 자극 후, 세포를 PBS로 세척한 다음, 고정가능한 생존율 염료 (이바이오사이언스, 미국 캘리포니아주)로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 세척에 의해 과량의 염료를 제거하고, 트루스테인 FcX(TruStain FcX) (바이오레전드, 미국 캘리포니아주)를 사용하여 세포를 차단시켰다. 이어서 세포를 표현형 항체 (FITC 마우스 항-인간 CD69 (클론 FN50, 비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주), PE/CF594 마우스 항-인간 CD4 (클론 L200, 비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주), PE/Cy7 마우스 항-인간 CD25 (클론 M-A251, 비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주) 및 퍼시픽 블루 마우스 항-인간 CD3 (클론 SP34-2, 비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주) 및 APC/Cy7 마우스 항-인간 CD8a (클론 RPA-T8, 바이오레전드, 미국 캘리포니아주))와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세척하고 1% 파라포름알데히드로 고정시켰다. T 세포의 활성화를 유동 세포측정법에 의해 BD LSR포르테사™ (비디 바이오사이언시스, 미국 캘리포니아주) 상에서 표면 마커 CD25 및 CD69에 대해 측정하였다. CD8+ T 세포 활성화는 CD25+CD69+인 % CD8+ T 세포에 의해 측정하였다.
131AVH6VL6-hIgG1은 1차 CD8+ T 세포 검정에서 가용성 형태로 활성을 갖는 반면에 (이소형 대조군 대비 평균 2.3-배 증가), 1F5-hIgG1은 그렇지 않았다 (도 14).
표 10
Figure pat00011
실시예 11: 1차 인간 종양 배양물에서의 생물활성
비소세포 폐 암종 (NSCLC), 신세포 암종 (RCC), 및 두경부 암종 (H&N)을 갖는 환자로부터의 인간 종양 시편을 상업적 판매업체로부터 주 및 연방 규정집에 따라 수득하였다.
혼합 종양 TIL을 생성하기 위한 인간 종양의 소화
작업 현장에서 신선한 종양 조직을 수집하고, 밤새 4℃로 AQIX 배지 (AQIX, 영국) 중에서 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 머크 리서치 래보러토리즈로 운송하였다. 스칼펠을 사용한 미세 컷팅에 의해 종양으로부터 단일 세포를 해리한 다음, 100 mg/mL 콜라게나제 유형 I (인비트로젠, cat# 17100-017), 및 10,000 U/mL DNase I (워팅턴 바이오케미칼(Worthington Biochemical), cat# LS002060)이 존재하는 10 mL 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (셀그로, cat# 10-013-CV )를 함유하는 소화 배지에서 37℃에서 30-분 인큐베이션하였다. 소화된 샘플을 수회 위 아래로 피펫팅하고, 70-μM 스트레이너를 통해 여과하고, DMEM 완전 배지에서 세척하였다. 세포 생존율이 30% 미만이면, 피콜-밀도 구배 분리를 수행하여 살아있는 세포를 풍부화하였다. 종양 소화로부터 혼합된 세포를 피콜-파크 플러스 (지이 헬스케어, Cat# 17-1440-03) 밀도 구배 원심분리에 1000 x g에서 20분 동안 적용하였다. 풍부화된 살아있는 세포를 배지:피콜 계면으로부터 수집하고, 둘베코 포스페이트-완충 염수 (DPBS)로 2회 세척하였다.
종양-침윤 T 세포 활성화에 대한 종양 TIL 배양물 상청액에서의 IFNγ 검출
총 0.1 x 106개/웰 종양 소화된 세포를 96-웰 둥근-바닥 플레이트에서 배양하고, 표시된 농도의 131AVH6VL6-hIgG1 (CHO-EXPI 세포의 일시적 플라스미드 형질감염 - 현탁 배양물), 항-PD1 (펨브롤리주맙), 또는 hCD27.15-4BIgG4, IF5-hIgG1, 또는 이소형 (항-PCSK9, IgG1 및 IgG4)의 존재 하에 10 ng/ml 가용성 항-CD3 (바이오레전드, 클론 OKT3, cat# 371304)으로 자극하였다. 상청액을 제6일에 수집하고, 인간 IFNγ 조직 배양 키트 (MSD, cat # K151AEB)를 사용하여 IFNγ를 측정하였다.
CD27은 나이브 T 세포 뿐만 아니라 기억 T 세포 상에서도 발현되기 때문에, 본 발명자들은 131AVH6VL6-hIgG1이 종양 침윤 기억 T 세포에서 공동-자극 효과를 가질 수 있다고 가설화하였다. 131AVH6VL6-hIgG1이 인간 종양 면역 억제 환경에서 T 세포를 활성화하는 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 인간 종양 소화로부터의 혼합 세포 집단을 실험에 사용하였다. 131AVH6VL6-hIgG1 0.1, 1, 10, 및 20 μg/ml를 단일 소화된 종양 조직 세포 배양물에 6일 동안 10 ng/ml 항-CD3의 존재 하에 첨가하였다. IFNγ를 제6일 상청액에서 측정하였다. 20개의 종양으로부터의 결과를 도 8에 제시한다. 131AVH6VL6-hIgG1은 인간 종양 TIL의 항-CD3-유도된 IFNγ 생산을 용량 의존성 방식으로 증진시켰고, 10 및 20 μg/ml에서 통계적으로 유의한 변화가 존재하였다 (각각 p<0.001 및 p<0.01). 131AVH6VL6-hIgG1을 또한 13개의 종양으로부터의 TIL IFNγ 생산 검정에서 2종의 다른 항-CD27 mAb, h27.15-4BIgG4 및 IF5-IgG1과 비교하여 연구하였다 (도 9). 131AVH6VL6-hIgG1은 항-CD3-유도된 IFNγ 생산의 통계적으로 유의한 증가를 나타내는 (p< 0.05) 유일한 mAb였다.
실시예 12: 항-CD27 항체의 에피토프의 확인을 위한 알라닌 스캐닝
CHO-K1 세포, 일시적으로 형질감염된 pCI-네오 공벡터, pCI-네오.hCD27 및 여러 pCI-네오.CD27Ala 돌연변이체 구축물을 사용하여 여러 항-hCD27 항체가 일련의 hCD27 알라닌 돌연변이체에 결합하는 능력을 결정하였다. 형질감염은 6개의 웰 플레이트에서, 둘 다 OPTI-MEMI (깁코, cat.no. 31985) 중에 희석된, 웰당 4 μg 플라스미드 DNA 및 10 μl 리포펙타민 2000 시약 (인비트로젠, 11668-019)을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.
형질감염된 세포를 가습 인큐베이터 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 1일 동안 인큐베이션한 후, 이를 DPBS 중에서 1회 세척하고, 400 μl 무효소 세포 해리 용액 (깁코, 13151-014)으로 탈착시키고, 800 μl 빙냉 MACS 완충제 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 130-091-221) 중에 수집하였다. 탈착된 세포를 96 웰 둥근-바닥 웰 플레이트에 대략 1.2x105개 세포/웰로 옮겼다. 세포를 스핀 다운시킨 후, 상청액을 폐기하고, 세포를 잔류량에 재현탁시키고, 1차 항체를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 DPBS/BSA 1%로 3회 세척한 다음, 원심분리하고, 상청액을 폐기하고, 잔류량에 재현탁시켰다. 염소-항-마우스 IgG-FITC (비디 바이오사이언스, 349031, 2 μl/웰) 또는 염소-항-인간 IgG-FITC (γ-쇄 특이적) (서던바이오테크, 2040-02, 2 μl/웰)를 사용하여 4℃에서 30분 동안 염색하여 1차 항체의 결합을 검출하였다. 1회 세척 후, HTS 플레이트 판독기 (FACS 칸토 II) 및 데이터 분석을 위한 플로우조 소프트웨어를 사용하여 항체 결합을 검출하였다. 파편, 사멸 세포 및 이중선은 분석에서 제외하였다. 결합을 100%로 설정된 hCD27에 대한 항체 결합 대비 FITC 신호의 기하 평균으로서 표현하였다.
도 10에 제시된 바와 같이, 아미노산 P8, H36, R37 및 K38의 돌연변이는, 흑색 음영으로 표시된 바와 같이 hCD27에 대한 마우스 hCD27.131A의 결합의 상실을 야기하였다. hCD27.131A는 hCD27.15, 1A4, 및 1F5IgG1과 별개의 결합 프로파일을 보여주었다.
실시예 13: X선 결정 구조에 의한 CD27 및 131AVH6VL6-hIgG1의 에피토프 맵핑
복합체 형성 및 정제:
각각 2:1 06AOV (CD27) 및 01APN (Fab) 몰비로 4℃에서 48시간 동안 인큐베이션하여 CD27/131AVH6VL6Fab 복합체를 형성하였다. 이어서 반응 혼합물을 슈퍼덱스 200 하이로드 16/600 (120mL) 칼럼 상에 로딩하고, SEC-UPLC 분석에 기초하여 분획을 풀링하였다. 이어서 복합체 풀을 25 mM 트리스, 100 mM NaCl, pH 8.0에 대해 투석하였다. 투석된 물질을 원심분리하고, 22 um 시린지 필터 상에서 여과하였다.
CD27+Fab 결정화 절차
40 mM 카드뮴 클로라이드 스톡 6.25 uL를 25 mM 트리스 pH=8.0 및 100 mM 염화나트륨으로 이루어진 완충제 중 CD27-Fab 복합체의 25 uL 분취물에 첨가하여 결정화를 위한 샘플을 제조하였다. 최종 샘플 단백질 농도는 12.6 mg/ml였고, 카드뮴 클로라이드 농도는 8.0 mM이었다. 샘플을 설정 전 대략 1시간 동안 실온에서 유지시켰다.
초기 스크리닝은 토파즈 자유 계면 확산 마이크로유체 시스템, 토파즈 4.96 칩 (플루이다임(Fluidigm)) 및 상업적으로 입수가능한 스크린을 사용하여 수행하였다. 칩을 실온에서 설정하고, 후속해서 18℃로 유지시켰다. 증기 확산 시스템으로의 전환을 위해 하기 조건을 선택하였다:
스크린: 리가쿠 위자드 크리오 1-2(Rigaku Wizard Cryo 1-2) (Cat# 1008649)
조건: 0.1 M 이미다졸 pH=8.0 + 40% v/v PEG 400
스크린: 제나 바이오사이언스(Jena Bioscience) 클래식 HTS1 (Cat# CS-201L)
조건: 0.1 M 트리스 pH=8.5 + 30% v/v PEG 3000 + 0.2 M 황산리튬
X선 회절 연구를 위한 결정은 시팅 드롭 증기 확산 방법을 사용하여 생산하였다. 포뮬레이터(Formulator) (포뮬라트릭스(Formulatrix))를 사용하여 100 mM 트리스 pH 8.0-8.5 및 PEG 400 30-50% v/v로 이루어진 플레이트 웰 조건을 분배하였다. 동등 부피의 웰 및 단백질 (0.22 uL + 0.22 uL)로 이루어진 드롭을 오릭스4(Oryx4) (더글라스 인스트루먼츠(Douglas Instruments))를 사용하여 실온에서 분배하고, 후속해서 18℃로 유지시켰다. 결정을 1개월 기간을 초과하여 성장시켰다.
결정을 또한, 100 mM 트리스 pH=8.5 및 40% v/v PEG 400으로 이루어진 완충제 중에서 제조된 시드 스톡의 첨가에 의해 생산하였다. 0.30 uL 단백질 + 0.20 uL 웰 + 0.1 uL 시드 스톡으로 이루어진 드롭을 오릭스4 (더글라스 인스트루먼츠)를 사용하여 실온에서 분배하고, 후속해서 18℃로 유지시켰다. 결정을 1개월 기간을 초과하여 성장시켰다.
결정 수거 및 데이터 수집
결정화 트레일 #4482 드롭 F 1로부터의 결정을 0.3 mm 메쉬 리토루프(Litholoop) (몰레큘라 디멘션즈 리미티드(Molecular Dimensions Ltd), 영국 서퍽)를 사용하여 결정화 드롭으로부터 수거하고, 액체 질소 중에서 동결시켰다. 데이터 수집은 아르곤 국립 연구소 (ANL, 일리노이주 레몬트)에서 어드밴스드 포톤 소스 (APS)의 산업상 거대분자 결정학 협회 (IMCA) 빔 라인, 섹터 17에서 수행하였다. 데이터는 필라투스 6M(Pilatus 6M) 검출기 (덱트리스 아게(Dectris AG), 스위스 바덴-다트빌)를 사용하여 1.0Å의 파장에서 수집하였다. 데이터를, 인덱싱 및 통합의 경우 XDS, 척도화의 경우 AIMLESS, 데이터 분석의 경우 POINTLESS, 및 이방성 회절 한계의 적용의 경우 STARANISO를 호출하는 오토프록(autoPROC) 자동화 프로세싱 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하였다. 결정 단위 셀 파라미터는 a=114.20, b=126.10, c=131.600, α=90°, β=90°, γ=90°, 공간군 C222(1)이다.
구조 규명 및 정밀화
MOLREP 프로그램을 사용하여 분자 대체에 의해 구조를 해석하였다. PDB 엔트리 2XTJ 및 5TLS를 Fab 및 항원에 대한 검색 프로브로서 각각 사용하였다. 디폴트 파라미터를 사용하여 VH+VL 영역을 먼저 위치시킨 다음 (Rf/시그마 = 7.91, TF/시그마 = 10.83), 해석을 위한 고정된 입력 모델로서 가변 영역을 사용하여 CH1+CL 단편을 위치시켰다 (Rf/시그마 = 11.56, TF/시그마=23.70). 그러나 이러한 단계에서 항원은 명백하게 배치될 수 없없다 (최고의 "해결책" Rf = 4.73, Tf/시그마 = 3.77). 이어서 오토부스터(autoBUSTER) 소프트웨어를 사용하여 모델을 정밀화하였다. Rfree 및 Rwork의 값은 높았지만 (각각 41.4% 및 38.4%), 전자 밀도 지도는 프로브로서 사용된 Fab와 최종 구조 사이에서 대부분의 서열 치환 및 삽입 또는 결실과 일관성을 나타내었다. 이를 프로그램 COOT를 사용하여 교정하였다. 생성된 구조를 오토부스터를 사용하여 다시, 각각 Rfree 및 Rwork 34.3% 및 30.8%로 정밀화하였다. 고정된 좌표로서 이러한 모델을 사용하여 다시 분자 대체를 시도하였고, 이는 해석 기능을 위한 명백한 해결책을 생성하였다 (TF/시그마=17.67). 재구축 및 정밀화의 추가의 단계는 각각 Rfree 및 Rwork 22.4% 및 20.0%의 최종 값을 발생시켰다. 최종 모델은 CD27 잔기 6에서 88 및 94에서 100, Fab 경쇄 잔기 1에서 212, Fab 중쇄 잔기 1에서 131 및 137에서 217, 6개의 카드뮴 양이온, 1개의 PEG 400 분자 및 288개의 물을 함유한다. 어떠한 규칙적인 글리코실화 부위도 발견되지 않았다.
Fab-항원 상호작용의 분석
하기 표는 Fab와 항원 사이의 모든 접촉을 열거한다 (H-결합은 볼드체 "H", 염 가교는 볼드체 이탤리체 ("SB"), 극성 상호작용에 대해 3.30Å의 컷-오프가 사용됨):
표 11
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수많은 반 데르 발스 접촉에 더하여, 여러 H-결합 및 염 가교가 계면에 수반된다. 파라토프는 각각의 경쇄 및 중쇄로부터의 모든 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 수반한다. 그러나 에피토프는 제1 시스테인-풍부 도메인 (CRD)으로 제한된다. N-말단 근처의 절편, 잔기 8에서 11 및 잔기 17에 더하여, 잔기 34에서 38과 모든 접촉이 이루어진다 (도 11 및 12 참조). 항원-항체 복합체의 형성 시 매립되는 표면의 총량은 각각 CD27 및 Fab 용매 접근가능한 표면의 679Å2 및 616 Å2이다 (도 11 참조).
실시예 14: hCD27에의 결합에 대한 항-CD27 항체의 경쟁 연구
hCD27을 안정하게 발현하는 CHO-K1 세포를 96 웰 플레이트 (눈크(Nunc), 167008)에 4x104개 세포/웰로 시딩하고, 가습 인큐베이터 내에서 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 항-hCD27 항체의 연속 희석물이 37℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 결합되게 하였다. 이어서, 제2 항-hCD27 항체를 고정된 농도로 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELx405 바이오텍 세척기를 사용하여 세포를 DPBS/0.05% 트윈 중에서 3회 세척하였다. 고정된 농도로 첨가된 항-hCD27 항체의 결합을 염소 항-인간-IgG-HRP (잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research), 109-035-088, 1:1000 희석) 또는 염소 항-마우스-IgG-HRP (서던 바이오테크, 1030-05, 1:5000 희석)을 첨가하여 검출하였다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 상기 기재된 바와 같이 3회 세척하였다. TMB 안정화된 발색원 (인비트로젠, SB02)을 첨가하고, 세포를 실온에서 대략 10분 동안 인큐베이션하였다. 동등 부피의 0.5 M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 마지막으로, iEMS 판독기 MF (랩시스템즈(Labsystems)) 또는 엔비전 플레이트 판독기 (퍼킨 엘머)를 사용하여 460 및 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
마우스 hCD27.131A 및 마우스 hCD27.15가 hCD27에의 결합에 대해 1F5IgG1과 교차-경쟁할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 경쟁 세포-기반 ELISA를 수행하였다. 1F5IgG1의 연속 희석물이 CHO-K1 세포 상에 발현된 hCD27에 결합하게 하였다. 다음으로 마우스 hCD27.131A 또는 마우스 hCD27.15의 결합을 검출하였다. 반대의 실험을 또한 수행하였고, 여기서는 마우스 hCD27.131A 또는 마우스 hCD27.15의 연속 희석물이 결합하게 한 다음, 1F5IgG1의 결합을 검출하였다. 도 13에 제시된 바와 같이, 마우스 hCD27.131A는 1F5IgG1의 결합을 방해하지 않았고, 이는 이들 2종의 항체가 hCD27 상의 별개의 에피토프에 결합한다는 것을 나타낸다. 마우스 hCD27.15에 대해 유사한 데이터가 수득되었고, 이는 hCD27에의 결합에 대해 1F5IgG1과 경쟁하지 않는다는 것을 보여주었다. 오직 1F5IgG1이 먼저 결합하게 하였을 때만, 마우스 hCD27.15의 결합의 중간정도의 상실을 고농도에서 관찰할 수 있었다.
본 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 가출원 번호 62/399, 837 및 미국 가출원 번호 62/546,214에 대한 우선권을 주장한다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개별 공보, 데이터베이스 엔트리 (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 GeneID 엔트리), 특허 출원 또는 특허가 구체적이고 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다. 이러한 참조로 포함된다는 언급은, 심지어 이러한 인용이 참조로 포함된다는 해당 언급에 바로 인접하지 않은 경우에도, 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 따라 본 출원인에 의해, 각각 37 C.F.R. §1.57(b)(2)를 준수하여 명백하게 확인되는 각각의 및 모든 개별 공보, 데이터베이스 엔트리 (예를 들어, 진뱅크 서열 또는 GeneID 엔트리), 특허 출원, 또는 특허에 관한 것으로 의도된다. 존재하는 경우에, 본 명세서 내에 참조로 포함된다는 해당 언급의 포함은, 참조로 포함된다는 일반적인 언급을 어떠한 방식으로든 약화시키지 않는다. 본원의 참고문헌의 인용은 참고문헌이 선행 기술과 관련있는 것으로 인정하는 것으로 의도되지 않을 뿐만 아니라, 이들 공보 또는 문헌의 내용 또는 일자로서 어떠한 승인도 구성하지 않는다. 참고문헌이 본 명세서에 제공된 정의와 충돌하는 청구된 용어에 대한 정의를 제공하는 경우, 본 명세서에 제공된 정의가 본 발명을 해석하는 데 사용될 것이다.
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상기 작성된 명세서는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명을 실시할 수 있게 하는데 충분한 것으로 간주된다. 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 상기 기재로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이고, 첨부된 청구범위 내에 속할 것이다.
표 12: 서열 정보
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표 13. 예시적인 PD-1 항체 서열
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표 14: 131AVH6VL6Fab 및 CD27 복합체의 결정 구조로부터의 구조 좌표 (표는 서열식별번호: 70-74를 각각 출현 순서로 개시함)
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SEQUENCE LISTING <110> MERCK SHARP & DOHME CORP. MERCK SHARP & DOHME B.V. <120> ANTI-CD27 ANTIBODIES <130> 23413-US-NP <140> 15/714,585 <141> 2017-09-25 <150> 62,546,214 <151> 2017-08-16 <150> 62/399,837 <151> 2016-09-26 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> M, V, L, I, G, A, S or T <400> 1 Asn Tyr Gly Xaa Asn 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(6) <223> Any amino acid except M or C <400> 2 Trp Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Any amino acid except C <400> 3 Glu Gly Asp Ala Xaa Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> M, V, L, I, G, A, S or T <400> 4 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(2) <223> Any amino acid except M or C <400> 5 Xaa Xaa Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid except M or C <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(5) <223> Any amino acid except M, C or P <400> 6 Gln Gln Xaa Xaa Xaa Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> V or I <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> M, V, L, I, G, A, S or T <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(38) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(48) <223> M, V, L or I <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(50) <223> Any amino acid except M or C <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(55) <223> Any amino acid except M or C <220> <221> MOD_RES <222> (73)..(73) <223> D or E <220> <221> MOD_RES <222> (76)..(76) <223> I or A <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(77) <223> S or T <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> M, L, V or I <220> <221> MOD_RES <222> (83)..(83) <223> L or I <220> <221> MOD_RES <222> (88)..(88) <223> S or N <220> <221> MOD_RES <222> (101)..(102) <223> Any amino acid except M or C <220> <221> MOD_RES <222> (103)..(103) <223> Any amino acid except C <400> 9 Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Xaa Asn Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Xaa 35 40 45 Gly Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Xaa Thr Ser Xaa Xaa Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Xaa Glu Xaa Ser Ser Leu Arg Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 13 Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> E or D <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> V or Q <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> A or S <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> L or A <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> P or V <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> E or D <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> A or V <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> L or I <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> S or T <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> M, V, L, I, G, A, S or T <220> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Q or K <220> <221> MOD_RES <222> (46)..(46) <223> Any amino acid except M or C <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(50) <223> Any amino acid except M or C <220> <221> MOD_RES <222> (69)..(69) <223> D or S <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(71) <223> S or T <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(77) <223> L, M, V or I <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(78) <223> E or Q <220> <221> MOD_RES <222> (82)..(82) <223> F, V, L, I or T <220> <221> MOD_RES <222> (84)..(84) <223> V or T <220> <221> MOD_RES <222> (90)..(90) <223> Any amino acid except M or C <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(92) <223> Any amino acid except M, C or P <400> 14 Xaa Ile Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Xaa Thr Leu Ser Xaa Ser Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Arg Xaa Thr Xaa Xaa Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Ala Pro Lys Arg Xaa Ile Tyr 35 40 45 Xaa Xaa Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Xaa Tyr Xaa Leu Thr Ile Ser Ser Xaa Xaa Pro Glu 65 70 75 80 Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Xaa Xaa Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 16 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 17 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 18 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 18 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser 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Cys Glu Pro Gly Thr Phe Leu Val Lys Asp 20 25 30 Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys His Pro Cys Ile Pro Gly 35 40 45 Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His Cys Glu Ser Cys 50 55 60 Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Ile Arg Asn Cys Thr Ile Thr Ala 65 70 75 80 Asn Ala Val Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys Arg Asp Lys Glu 85 90 95 Cys Thr Glu Cys Asp Pro Pro Pro Asn Pro Ser Leu Thr Thr Trp Pro 100 105 110 Ser Gln Ala Leu Gly Pro His Pro Gln Pro Thr His Leu Pro Tyr Val 115 120 125 Asn Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr Leu Ala 130 135 140 Asp Phe Arg His Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr His Trp Pro Pro 145 150 155 160 Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile Leu Val Ile Phe 165 170 175 Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Thr Leu Phe Leu His 180 185 190 Gln Gln Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Met Glu Pro 195 200 205 Ala Glu Pro Cys Pro Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr 210 215 220 Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Pro 225 230 235 240 <210> 22 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Glu Val Arg Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ile Ile Lys Ala Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Glu Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly 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125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 24 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ile Ile Lys Ala Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Glu Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr 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<223> Any amino acid except M or C <220> <221> MOD_RES <222> (103)..(103) <223> Any amino acid except C <220> <221> MOD_RES <222> (111)..(111) <223> T or S <400> 32 Xaa Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Lys Lys Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Xaa Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Xaa Asn Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Xaa Gly Leu Lys Trp Xaa 35 40 45 Gly Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Xaa Phe Xaa Leu Xaa Thr Ser Xaa Xaa Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Xaa Glu Xaa Ser Ser Leu Arg Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> E, D or Q <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> V or Q <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> A or S <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> T or I <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> L or M <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> L or A <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> P or V <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> E or D <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> K or R <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> A or V <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> L, I or M <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> S or T <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> M, V, L, I, G, A, S or T <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> P or S <220> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Q, K or T <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(42) <223> A or S <220> <221> MOD_RES <222> (46)..(46) <223> Any amino acid except M or C <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(50) <223> Any amino acid except M or C <220> <221> MOD_RES <222> (69)..(69) <223> D or S <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(71) <223> S or T <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(77) <223> L, M, V or I <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(78) <223> E or Q <220> <221> MOD_RES <222> (79)..(79) <223> A or P <220> <221> MOD_RES <222> (82)..(82) <223> F, V, L, I, T or A <220> <221> MOD_RES <222> (84)..(84) <223> V or T <220> <221> MOD_RES <222> (90)..(90) <223> Any amino acid except M or C <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(92) <223> Any amino acid except M, C or P <400> 33 Xaa Ile Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ser Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Xaa Gly Xaa Xaa Pro Lys Arg Xaa Ile Tyr 35 40 45 Xaa Xaa Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Xaa Tyr Xaa Leu Thr Ile Ser Ser Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Xaa Xaa Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 34 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> E or Q <220> <221> MOD_RES 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<223> L or I <220> <221> MOD_RES <222> (88)..(88) <223> S or N <220> <221> MOD_RES <222> (103)..(103) <223> M, L, V or I <220> <221> MOD_RES <222> (111)..(111) <223> T or S <400> 34 Xaa Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Lys Lys Pro Gly Xaa 1 5 10 15 Xaa Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Xaa Asn Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Xaa Gly Leu Xaa Trp Xaa 35 40 45 Gly Xaa Ile Xaa Thr Xaa Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Xaa Phe Xaa Leu Xaa Thr Ser Xaa Xaa Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Xaa Glu Xaa Ser Ser Leu Arg Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asp Ala Xaa Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> E, D or Q <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> V or Q <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> A or S <220> 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(79)..(79) <223> A or P <220> <221> MOD_RES <222> (82)..(82) <223> F, V, L, I, T or A <220> <221> MOD_RES <222> (84)..(84) <223> V or T <220> <221> MOD_RES <222> (90)..(90) <223> W, F or Y <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(91) <223> N or Q <400> 35 Xaa Ile Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ser Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Xaa 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Xaa Gly Xaa Xaa Pro Lys Xaa Xaa Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Xaa Tyr Xaa Leu Thr Ile Ser Ser Xaa Xaa Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Xaa Ala Xaa Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Xaa Ser Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 36 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val 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<400> 37 Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp 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D or S <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(71) <223> S or T <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(77) <223> L or M <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(78) <223> E or Q <220> <221> MOD_RES <222> (84)..(84) <223> V or T <400> 40 Xaa Ile Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Xaa Thr Leu Ser Xaa Ser Xaa Gly 1 5 10 15 Xaa Arg Xaa Thr Xaa Xaa Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Xaa Tyr Xaa Leu Thr Ile Ser Ser Xaa Xaa Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Xaa Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 41 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ile Ile Lys Ala Thr 20 25 30 Tyr Met His 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Phe 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys 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tgtgcctgct gaataacttc 480 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttga 708 <210> 47 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 47 atgggctcca ccgccatcct gggactgctg ctggctgtgc tgcagggcgt gtgcgccgag 60 atccagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gcgcctccgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ccggctacac cttcaccaac tacggcatga actgggtgaa acaggcccca 180 ggccagggcc tgaagtggat gggctggatc aacaccaaca ccggcgagcc cacctacgcc 240 gaagagttca agggccggtt caccttcacc ctggacacct ccatctccac cgcctacatg 300 gaactgtcct ccctgcggag cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg agagggcgac 360 gccatggact attggggcca gggcacaacc gtgaccgtgt cctccgctag caccaagggc 420 ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 480 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 540 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggcc gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 600 agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 660 aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaggttg agcccaaatc ttgtgacaaa 720 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 780 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 840 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 900 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg acgagctgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaatga 1398 <210> 48 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 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Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr 1 5 <210> 57 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 57 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 58 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 58 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Claims (1)

  1. a. X1= M인, 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1,
    b. X1= N, X2= T, X3= N 및 X4= T인, 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2,
    c. X1= M인, 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및
    d. X1= M인, 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1,
    e. X1= D 및 X2= T인, 서열식별번호: 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2, 및
    f. X1= W, X2= N 및 X3= S인, 서열식별번호: 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3
    을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 인간 CD27에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 용도.
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