CN109528788A - 一种经皮给药治疗缺血性心脑血管疾病的负载川芎油纳米载体及其制备方法 - Google Patents

一种经皮给药治疗缺血性心脑血管疾病的负载川芎油纳米载体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种经皮给药治疗缺血性心脑血管疾病的负载川芎油纳米载体及其制备方法，该方法将赖氨酸溶于溶剂，碱性条件下水浴搅拌回流，并滴加环氧氯丙烷，脱水重结晶得赖氨酸环氧丙烷中间体；将溶壳聚糖与赖氨酸环氧氯丙烷中间体反应得聚糖/赖氨酸衍生物后，再加入川芎油在无水乙醇溶液中进行混合反应，川芎油负载于壳聚糖/赖氨酸衍生物表面，得目的纳米载体。本发明制备方法简便，适于大规模生产，特别适应于制备具有长循环、可生物降解、控释缓释的治疗药物。本发明制备的纳米粒为圆形颗粒，颗粒规则无粘连，具有较低的细胞毒性和良好的血液相容性，且毒性低，同时载药伴随材料的降解被缓慢释放出来，从而达到较长时间的治疗效果。

Description

一种经皮给药治疗缺血性心脑血管疾病的负载川芎油纳米载 体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种经皮给药治疗缺血性心脑血管疾病的负载川芎油纳米载体及其制备方法。
背景技术
如今，缺血性心脑血管疾病，如冠心病、缺血性脑卒中等，已成为危害人类生命健康的重大疾病；也是现代社会发病率、致残率极高的疾病。如果不采取积极有效的措施，缺血性心脑血管疾病的患病率将会进一步增长。因此，控制缺血性心脑血管疾病相关的危险因素，对有效预防和治疗缺血性心脑血管疾病有非常重要的临床意义和社会价值。使用药物来预防和治疗缺血性心脑血管疾病，是心脑血管疾病的治疗中最为普遍的办法。国内治疗缺血性心脑血管病的药物主要分为化学药物和中药两大类。目前治疗缺血性心脑血管疾病主要以溶栓药、抗凝药、抗血小板聚集药、降血脂药及降血压药为主。缺血性心脑血管疾病需要长期用药，由于化学合成药物长期应用的副作用，使治疗心脑血管中药的研究开发日益受到关注。
川芎油是一种最初从伞形科植物川芎(学名：Ligusticum chuanxiong hort)中提取的生物活性成分。目前，在中国已广泛的用于治疗缺血性心脑血管疾病。它在扩张血管、增加冠状动脉和脑血流量、预防血小板聚集、抑制血栓形成和改善微循环方面起着重要作用。可以通过胃壁迅速吸收，并具有相当短的血浆消除半衰期。尽管川芎油在缺血性心脑血管疾病治疗中取得了一定的治疗效果，但由于川芎油是一种极其容易挥发、水溶性差的化合物，导致生物利用度较低，半衰期短，给药后药物广泛分布于胃、小肠、肝脏、肺脏、胰腺等多器官中并被迅速清除，排出体外。这种药代动力学特点限制了川芎油在缺血性心脑血管治疗领域的使用，影响其药效的发挥。因此，如何提高其利用率依然是亟需解决的重要问题。
目前川芎油在临床上的剂形主要以川芎油软胶囊为主，但口服胶囊吸收缓慢，生物利用度低；若不以胶囊形式制备川芎油又极易挥发，且具有一定的刺激性以及存在一定细胞毒性，在使用时存在局限性。作为静脉注射剂时，虽然加入有机试剂和表面活性剂可以改善川芎油溶解性，但具有一定的刺激性以及细胞毒性，在使用时存在局限性，同时给药次数较多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种经皮给药治疗缺血性心脑血管疾病的负载川芎油纳米载体及其制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种负载川芎油纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
1)赖氨酸环氧丙烷中间体的制备：将赖氨酸溶于溶剂，碱性条件下水浴搅拌回流，并滴加环氧氯丙烷溶液，搅拌至溶液澄清，脱水重结晶，洗涤、干燥得赖氨酸环氧丙烷中间体；
2)壳聚糖/赖氨酸衍生物的制备：将溶胀的壳聚糖溶于水中，碱性条件下水浴搅拌回流，并滴加入赖氨酸环氧氯丙烷中间体溶液，反应完全后，将产物脱水重结晶，洗涤、干燥得到聚糖/赖氨酸衍生物；
3)负载川芎油纳米载体的制备：将壳聚糖/赖氨酸衍生物与川芎油在无水乙醇溶液中进行混合反应，川芎油负载于壳聚糖/赖氨酸衍生物表面，从而得到壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子这一包覆产物，即负载川芎油纳米载体。
优选的，步骤1)中，赖氨酸和环氧氯丙烷的摩尔比为0.1～5:1；更优选为1:1。
优选的，步骤1)中所述溶剂为水。
优选的，步骤1)和步骤2)中，所述碱性条件为pH值为8.5～9.5。
优选的，步骤1)和步骤2)中，所述水浴搅拌回流的水浴温度为30～80℃；更优选为50℃；回流时间为6～24小时；更优选为24小时。
优选的，步骤1)和步骤2)中，所述脱水重结晶采用丙酮脱水重结晶。
优选的，步骤1)和步骤2)中，所述洗涤采用无水乙醇洗涤，所述干燥为40～60℃真空干燥，更优选为40℃真空干燥；
优选的，所述真空干燥时间为12～36h；更优选为真空干燥24h。
优选的，步骤2)中，所述壳聚糖与赖氨酸环氧氯丙烷中间体的质量比为1～10：1，更优选为1～3：1；最优选为1：1。
优选的，步骤2)中，所述溶胀的壳聚糖为用NaOH溶液进行溶胀的壳聚糖。
优选的，步骤3)中，所述壳聚糖/赖氨酸衍生物与川芎油的摩尔比为1～10:1；更优选为8：1。
优选的，步骤3)中，所述的混合反应的时间为2～24小时；更优选为4小时。
上述任一项所述方法制备的负载川芎油纳米载体在制备治疗缺血性心脑血管疾病药物中的应用。
优选的，所述药物为经皮给药的药物。
本发明的有益效果是：
本发明改善了川芎油经皮给药的能力，改善了川芎油的的溶解性，增强其药物释放的时间，提高其生物利用度，减少药物剂量，减少刺激性，为中药治疗缺血性心脑血管疾病提供更可靠、有效的方法。
本发明制备方法简便，适于大规模生产，特别适应于制备具有长循环、可生物降解、控释缓释、运送活性物质的治疗药物。本发明制备的纳米粒，其粒径在10-200nm范围内，形貌为圆形颗粒，颗粒规则无粘连，24小时内药物释放为92％左右，具有较低的细胞毒性和良好的血液相容性，且毒性低，同时载药伴随材料的降解被缓慢释放出来，从而达到较长时间的治疗效果。
本发明纳米材料作为一种新型的载体，具有高载药量、结构稳定、体内滞留时间长等优点，且制备方法简单。
附图说明
图1(A)Lig、(B)Cs/L-Lys和(C)Cs/L-Lys/Lig纳米载体的红外光谱图；
图2壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前(A)和载药后(B)纳米复合物粒径电位图；
图3壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前(A)和载药后(B)纳米复合物透射电镜图；
图4载药纳米粒子药物释放图；
图5壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子的细胞存活率图；
图6壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子不同时间下的溶血率；
图7壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子的APTT与PT图，PBS作对照，A为载药前的壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、B为载药后壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)；
图8壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子的血酸弹力图，PBS作对照A为载药前的壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、B为载药后壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：赖氨酸环氧丙烷中间体的制备
按摩尔比(赖氨酸:环氧氯丙烷)为1:1的比例称取一定质量的赖氨酸和环氧氯丙烷，在常温下，将其赖氨酸溶于100ml蒸馏水，用NaOH溶液将上述溶液调节至pH＝9，然后将溶液转移至三角烧瓶中，在50℃水浴中搅拌回流24小时，用滴液漏斗在搅拌下缓慢加入环氧氯丙烷溶液，在0.5h滴液完毕后，搅拌至溶液完全变为澄清。用5mL丙酮脱水重结晶，再用50mL无水乙醇多次洗涤，40℃真空干燥24小时后得到中间产物：赖氨酸环氧丙烷中间体。
实施例2：壳聚糖/赖氨酸衍生物(简称Cs/L-Lys)的制备
将10g的壳聚糖完全溶胀，抽滤，滤去NaOH，溶于100mL蒸馏水中，用NaOH溶液调节其pH值为8.5～9.5，然后把溶液转移至三角烧瓶中，50℃水浴中搅拌回流12小时。用滴液漏斗在搅拌下缓慢加入赖氨酸环氧氯丙烷中间体(该中间体与壳聚糖的物质的量比为1：1)溶液。反应完成后，抽滤，除去未反应的壳聚糖，然后用10mL丙酮脱水重结晶，50mL无水乙醇多次洗涤至pH＝7，真空干燥后得到壳聚糖/赖氨酸衍生物。
实施例3：壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(CS/L-Lys/Lig)的制备
将实施例2中得到的壳聚糖/赖氨酸衍生物与川芎油以8:1的摩尔比加入到无水乙醇溶液中进行混合反应4小时，川芎油负载在壳聚糖/赖氨酸衍生物表面，从而得到壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(CS/L-Lys/Lig)这一包覆产物，即负载川芎油纳米载体。
实施例4：壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子傅立叶红外光谱测试
方法：FTIR傅立叶红外光谱是一种显示分子振动的光谱，可鉴别待测物质中的官能团，将各个步骤得到的产物和原料做红外测试，可证明目标产物是否被成功合成。分别取适量实施例2壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、实施例3壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)、游离的川芎油Lig和溴化钾，研磨压片，光谱仪测试分析。
结果：检测结果如图1所示。图1-A为川芎油(Lig)的红外谱图，图1-B为壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)的红外谱图，1500cm-1左右为壳聚糖的特征吸收峰，3000cm-1左右为氨基等基团的特征峰；图1-C为壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)的红外谱图，从图上可以看出，川芎油和载体的特征峰都有显示，能够证明实施例3(壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子)制备出了所需的载体而且载药效果理想。
实施例5：壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子动态光散射测试
方法：分别取适量实施例2壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、实施例3壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)、游离的川芎油Lig溶于去离子水中，配成1mg/mL的水溶液，然后采用动态光散射仪对其粒径电位进行测试。
结果：实验结果如图2所示。壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前Cs/L-Lys(图2-A)以及载药后Cs/L-Lys/Lig(图2-B)的粒径分布均匀，Cs/L-Lys的粒径分布在8nm左右，载上川芎油之后Cs/L-Lys/Lig的粒径分布在40nm左右，电位也从最初的-20左右变化到-40左右。说明药物川芎油已成功的负载。
实施例6：壳聚糖/赖氨酸载药前后纳米粒子透射电镜测试
方法：分别取适量实施例2壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、实施例3壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)溶于去离子水中，配成1mg/mL的水溶液，然后采用透射电镜进行透射电镜表征。
结果：实验结果如图3所示，壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前Cs/L-Lys水中分布均匀(图3-A)，形貌为圆形颗粒，尺寸大概在10～200nm范围内，载体壳聚糖/赖氨酸衍生物载药后Cs/L-Lys/Lig颗粒大小变化不大，但是圆形颗粒的表面覆盖上了一层物质的(图3-B)。结果初步证明壳聚糖/赖氨酸可以成功的包载药物川芎油。
综上，本发明实施例制备的纳米粒，其粒径在10-200nm范围内，形貌为圆形颗粒，颗粒规则无粘连，载药率为38％。
实施例7：壳聚糖/赖氨酸/川芎油(Cs/L-Lys/Lig)的药物释放实验
方法：将川芎油及壳聚糖/赖氨酸/川芎油Cs/L-Lys/Lig分布放入50ml的EP管中，加入0.01M的PBS溶液30ml(pH 7.4)。然后将EP管放置在37℃的水浴摇床以250rpm连续震动。在预定的时间点，抽取10ml的释放介质，用新鲜的缓冲液代替。再用0.45μm膜过滤。滤液采用高效液相色谱方法来检测药物释放情况。每个样品平行做三次，结果以平均值和标准偏差表示。
结果：如图4所示，壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(CS/L-Lys/Lig)中川芎油的释放速率在最初12小时内是快速的，12小时之后，随着时间的延长，川芎油的释放速率开始变慢，趋于平缓，缓释效果可长达24小时以上，24小时内药物释放为92％左右。基于这些结果，我们可以得出结论，壳聚糖/赖氨酸纳米胶束的缓释效果良好。
实施例8：壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子的细胞活性实验
方法：通过CCK-8法对壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子进行细胞活性检测。本实验所用的细胞是成纤维细胞(3T3细胞)，而培养该细胞所用的培养液是含有10％的胎牛血清和1％的双抗(青霉素和链霉素的混合液)的DMEM的培养液，并且培养条件是在温度为37℃和CO2浓度为5％的培养箱中。在培养的过程中，每两天要给细胞换一次培养液，换细胞培养液的目的是为细胞增加新的营养物质、去除不贴壁的细胞以及细胞的代谢物。将含有不同浓度的壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)培养基溶液加入96孔板中，然后放在培养箱中，培养到1天后加入CCK-8试剂，按照1:10的比例加入，也就是说100μL的培养液加入10μL的CCK-8试剂，继续培养2-4h。在450nm波长的条件下，使用酶标仪读取每个孔的吸光光度值。
结果：检测结果如图5所示，从中可以看出，壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)对细胞没有毒性，甚至可以促进细胞生长。在装载川芎油后，壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)对细胞生长有一定的抑制作用。当浓度为0.01mg/ml时，该物质对细胞的抑制作用相对较小，说明其具有良好的生物相容性。
实施例9：壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子的溶血实验
方法：将800μL洗净的红细胞(RBC)悬浮于4.2mL的PBS中，配成体积分数为16％的红细胞悬浮液。再分别将0.1mg/mL的壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)加入红细胞悬浮液中，每个分组设置平行实验3组。取1mL的样品溶液于离心管中，并加入50μL16％的红细胞悬液混合均匀，37℃恒温孵育4小时，然后取出离心管，涡旋均匀后，再用1000×g的转速离心5min至红细胞沉淀下来，再用移液枪移取200μL上清液于96孔板中，通过酶标仪(Multiskan MK3，Thermo Scientific)测量540nm处的吸光度，再计算出溶血率。
结果：实验结果如图6所示，由图可以看出壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)的溶血率呈时间依赖性，溶血百分比随孵育时间的增加而略有增加。CS/L-Lys的溶血率在15分钟内低于5％，说明其具有良好的血液安全性和静脉适应性。而CS/L-Lys/Lig在30分钟内溶血率明显增高，高达12％，说明CS/L-Lys共聚物对细胞的毒性较小，且Lig具有一定的溶血作用，这可能与药物的累积释放有关。结果表明，壳聚糖/赖氨酸衍生物纳米粒子不会产生明显的溶血，具有良好的血液相容性。
实施例10：壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子的活化部分凝血活酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)实验
方法：将加入抗凝剂的全血以3000×g的速度离心15min后，收集上清液得到贫血小板血浆。取180μL贫血小板血浆分别与20μL浓度为0.1mg/mL的壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)混合均匀，并以PBS作为对照组，进行凝血分析，每个实验组平行3次。凝血分析仪与APTT、PT所用的试剂与耗材由暨南大学第一附属医院提供。
结果：实验结果如图7所示，壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)的APTT和PT都是在41.77和15.5左右，相差几无，而且与PBS对照组的差别不大。说明本发明实施例中壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)具有很好的血液相容性、生物相容性、安全性等优点。
实施例11：壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子的血栓弹力图实验
方法：用健康的抗凝处理过的全血分别与PBS、壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)混合进行测试。具体是先进行质控标定初始值，然后将900μL全血和100μLPBS或者0.1mg/mL的壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)溶液在高岭土试剂管中混合均匀，从试剂管中取出340μL的不同混合溶液，放置于TEG测试杯中，滴加20μL CaCl2(0.2M)溶液引发凝血，然后于37℃在血栓弹力图仪中进行测试分析。
结果：检测结果如图8所示，图8为PBS与壳聚糖/赖氨酸衍生物载药前后纳米粒子的全血的凝血活性值(TEG)。由图8可以得知，壳聚糖/赖氨酸衍生物(Cs/L-Lys)、壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(Cs/L-Lys/Lig)的R值与PBS的R值相比，其凝血时间略小于PBS，但总体影响不大，具有较优的血液相容性。
我们发现，本发明实施例制备的川芎油纳米载体可以改善药物的吸收和生物可利用度。它可以有效的负载治疗药物，具有缓释和控释的能力，使药物剂量减少，减轻或避免毒副作用，且利于储存等特性，多种药物同时包覆，发挥协同作用。这表明负载川芎油的纳米载体可能是一个很有前景的治疗缺血性心脑血管疾病的手段。
综上所述，本发明改善了川芎油经皮给药的能力，改善了川芎油的的溶解性，增强其药物释放的时间，提高其生物利用度，减少药物剂量，减少刺激性，为中药治疗缺血性心脑血管疾病提供更可靠、有效的方法。
本发明制备方法简便，适于大规模生产，特别适应于制备具有长循环、可生物降解、控释缓释、运送活性物质、治疗药物。本发明制备的纳米粒，其粒径在10-200nm范围内，形貌为圆形颗粒，颗粒规则无粘连，载药率为38％，24小时内药物释放为92％左右，具有较低的细胞毒性和良好的血液相容性。本发明壳聚糖/L-赖氨酸衍生物(简称Cs/L-Lys)，具有优良的生物相容性、血液相容性、吸附性、絮凝性、安全性及微生物降解性等优点，且毒性低，同时载药伴随材料的降解被缓慢释放出来，从而达到较长时间的治疗效果。
本发明纳米材料作为一种新型的载体，具有高载药量、高水溶性、优良的组织渗透性、靶向性等特点，且制备方法简单、结构稳定、体内滞留时间长等优点。
实施例12
1)赖氨酸环氧丙烷中间体的制备
按摩尔比(赖氨酸:环氧氯丙烷)为5:1的比例称取一定质量的赖氨酸和环氧氯丙烷，在常温下，将赖氨酸溶于100ml蒸馏水，用NaOH溶液将上述溶液调节至pH＝8.5，然后将溶液转移至三角烧瓶中，在80℃水浴中搅拌回流6小时。用滴液漏斗在搅拌下缓慢加入环氧氯丙烷，在0.5h滴液完毕后，搅拌至溶液完全变为澄清。用5mL丙酮脱水重结晶，再用50mL无水乙醇多次洗涤，60℃真空干燥12小时后得到中间产物：赖氨酸环氧丙烷中间体。
2)壳聚糖/赖氨酸衍生物(简称Cs/L-Lys)的制备
将10g的壳聚糖完全溶胀，抽滤，滤去NaOH，溶于100mL蒸馏水中，用NaOH溶液调节其pH值为9.5，然后把溶液转移至三角烧瓶中，50℃水浴中搅拌回流12小时。用滴液漏斗在搅拌下缓慢加入赖氨酸环氧氯丙烷中间体(该中间体与壳聚糖的物质的量比为1：10)溶液。反应完成后，抽滤，除去未反应的壳聚糖，然后用10mL丙酮脱水重结晶，50mL无水乙醇多次洗涤至pH＝7，真空干燥后得到壳聚糖/赖氨酸衍生物。
3)壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(CS/L-Lys/Lig)的制备
将上步中得到的壳聚糖/赖氨酸衍生物与川芎油以1:1的摩尔比加入到无水乙醇溶液中进行混合反应24小时，川芎油负载在壳聚糖/赖氨酸衍生物表面，从而得到壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(CS/L-Lys/Lig)这一包覆产物，即负载川芎油纳米载体。
实施例13
1)赖氨酸环氧丙烷中间体的制备
按摩尔比(赖氨酸:环氧氯丙烷)为0.1:1的比例称取一定质量的赖氨酸和环氧氯丙烷，在常温下，将赖氨酸溶于100ml蒸馏水，用NaOH溶液将上述溶液调节至pH＝9.5，然后将溶液转移至三角烧瓶中，在80℃水浴中搅拌回流6小时。用滴液漏斗在搅拌下缓慢加入环氧氯丙烷，在0.5h滴液完毕后，搅拌至溶液完全变为澄清。用5mL丙酮脱水重结晶，再用50mL无水乙醇多次洗涤，40℃真空干燥36小时后得到中间产物：赖氨酸环氧丙烷中间体。
2)壳聚糖/赖氨酸衍生物(简称Cs/L-Lys)的制备
将10g的壳聚糖完全溶胀，抽滤，滤去NaOH，溶于100mL蒸馏水中，用NaOH溶液调节其pH值为9.5，然后把溶液转移至三角烧瓶中，80℃水浴中搅拌回流12小时。用滴液漏斗在搅拌下缓慢加入赖氨酸环氧氯丙烷中间体(该中间体与壳聚糖的物质的量比为1：3)溶液。反应完成后，抽滤，除去未反应的壳聚糖，然后用10mL丙酮脱水重结晶，50mL无水乙醇多次洗涤至pH＝7，真空干燥后得到壳聚糖/赖氨酸衍生物。
3)壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(CS/L-Lys/Lig)的制备
将上步中得到的壳聚糖/赖氨酸衍生物与川芎油以10:1的摩尔比加入到无水乙醇溶液中进行混合反应2小时，川芎油负载在壳聚糖/赖氨酸衍生物表面，从而得到壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子(CS/L-Lys/Lig)这一包覆产物，即负载川芎油纳米载体。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种负载川芎油纳米载体的制备方法，其持征在于，包括以下步骤：
1)赖氨酸环氧丙烷中间体的制备：将赖氨酸溶于溶剂，碱性条件下水浴搅拌回流，并滴加环氧氯丙烷溶液，搅拌至溶液澄清，脱水重结晶，洗涤、干燥得赖氨酸环氧丙烷中间体；
2)壳聚糖/赖氨酸衍生物的制备：将溶胀的壳聚糖溶于水中，碱性条件下水浴搅拌回流，并滴加入赖氨酸环氧氯丙烷中间体溶液，反应完全后，将产物脱水重结晶，洗涤、干燥得到聚糖/赖氨酸衍生物；
3)负载川芎油纳米载体的制备：将壳聚糖/赖氨酸衍生物与川芎油在无水乙醇溶液中进行混合反应，川芎油负载于壳聚糖/赖氨酸衍生物表面，从而得到壳聚糖/赖氨酸/川芎油复合纳米粒子这一包覆产物，即负载川芎油纳米载体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，赖氨酸和环氧氯丙烷的摩尔比为0.1～5:1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中，所述碱性条件为pH值为8.5～9.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中，所述水浴搅拌回流的水浴温度为30～80℃；回流时间为6～24小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中，所述脱水重结晶采用丙酮脱水重结晶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中，所述洗涤采用无水乙醇洗涤，所述干燥为40～60℃真空干燥。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述壳聚糖与赖氨酸环氧氯丙烷中间体的物质的量比为1～10：1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述壳聚糖/赖氨酸衍生物与川芎油的摩尔比为1～10:1。
9.权利要求1～8任一项所述方法制备的负载川芎油纳米载体在制备治疗缺血性心脑血管疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物为经皮给药的药物。
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