CN109400592B - 一种葛根素提取物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种葛根素提取物的制备方法，首先采用绿色木霉对葛根药材进行固体发酵，然后用90％以上乙醇或甲醇对发酵料进行提取，即得葛根素含量达45％以上的葛根素提取物。该制备方法大幅提升了葛根素的提取收得率，大大降低了葛根素的生产成本，且制备工艺简便，易于实现工业化。

Description

一种葛根素提取物的制备方法
技术领域
本发明涉及一种葛根素提取物的制备方法，属于中药提取领域。
背景技术
葛根是豆科葛属植物野葛(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)的根。葛属在我国，除新疆、西藏、青海外，各省均有分布。葛根从根、藤、花到叶所含化学成分不尽相同。葛根中除含有优质淀粉、人体必需氨基酸(赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸等)和微量元素(硒、锌、锰、锗等)外，还含有定量的黄酮类物质，主要活性成分为黄豆苷元(daldzein)、黄豆苷(daidziun)、葛根素(puerarin)、葛根素-7-木糖苷(puerarin-7-xy-loside)等物质。
研究表明，葛根素具有降低血压、减慢心率、扩张冠状血管、改善微循环、抑制动脉硬化、抗心律失常、改善脑循环等心脑血管系统作用、抗血小板聚集、降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗缺氧与抗氧化、收缩和舒张平滑肌、益智、解热、解酒与解毒等方面的功效。此外，葛根素能显著抑制酪氨酸酶的催化活性，中断黑色素氧化过程，抑制黑色素的发生与形成，从而防止黄褐斑、日晒斑等色素沉积。
目前从葛根中提取葛根素大都采用水煮提或酒精热回流提取技术，所得提取物中葛根素含量低，在10-15％之间，其含机械杂质等其它杂质较多，增加了后续葛根素单体制备的难度，葛根素的收得率很低，成本高。葛根素属于异黄酮类物质，其分子结构中带两个酚羟基和一个糖基，柱层析分离中拖尾较严重，如果提取物本身葛根素含量高则可以克服这一问题。因此高含量的葛根素提取物一直是本领域力争获得的。
发明人长期研究、优化葛根素提取制备工艺，在大量的试验研究中惊喜地发现，先用绿色木霉对粉碎的葛根药材进行固体发酵处理，然后再进行提取，可大大提高葛根素的提取收得率，所得葛根素提取物中葛根素的含量可达45％以上，为葛根素单体的制备提供了含量高、质量好、成本低的葛根素提取物，从而完成了本发明。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种葛根素提取物的制备方法。
本发明的技术方案是：
提供一种葛根素提取物的制备方法，其包括用绿色木霉对葛根药材进行固体发酵的步骤。
进一步地，所述葛根素提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将干葛根药材进行干热灭菌处理；
(2)将灭菌处理后的葛根药材粉粹后加水拌匀成湿料；
(3)加入综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液，混匀；
(4)进行固体发酵4-8天，得发酵料；
(5)发酵料经干燥、碾碎后用乙醇或甲醇进行提取，提取液经浓缩后即得葛根素提取物。
在一实施方案中，所述葛根素提取物的制备方法包括以下步骤：
(1)将干葛根药材置于灭菌锅中于120-125℃干蒸60-120min进行干热灭菌处理；
(2)将灭菌处理后的葛根药材粉粹成20-40目粗粉，喷洒药材重量2-2.5倍的水拌匀成湿料；
(3)加入综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液，混匀；
(4)于20-30℃、80-95％相对湿度条件下进行固体发酵5-6天，得发酵料；
(5)发酵料经干燥、碾碎后用乙醇-水溶液或甲醇-水溶液回流提取3次，提取液经浓缩后即得葛根素提取物；所述乙醇-水溶液或甲醇-水溶液其中乙醇或甲醇的重量百分含量≥90％。
在一实施方案中，所述综合马铃薯培养基每1000mL的制备方法为：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000mL煮沸20min，然后滤去马铃薯块，再加入葡萄糖20g、琼脂20g、KH2PO43g、硫胺素8mg、MgSO4·7H2O 1.5g，溶化后补足水至1000mL，经121℃灭菌15min；
所述绿色木霉菌悬液每100mL的制备包括以下步骤：
(1)菌种的复苏及扩大培养：用无菌吸管吸取0.5mL液体培养基，滴入盛有绿色木霉冻干菌种的安瓿内，轻轻振荡，使冻干菌种溶解呈悬浮状，吸取100μL菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，并在28℃相应的温度下培养、活化；
(2)将已活化的菌种接入100mL综合马铃薯培养基中，于28℃，转速为105r/min的恒温振荡培养箱进行扩大培养3d，即得绿色木霉的菌悬液。
在一实施方案中，所述综合马铃薯培养基、绿色木霉菌悬液的加量比例为：每100g干葛根药材加综合马铃薯培养基100mL、绿色木霉菌悬液5mL；所述固体发酵在26-28℃、92-94％％相对湿度条件下进行。
葛根素含量的HPLC检测方法(外标法)：
对照品溶液的制备：取葛根素对照品0.003g，加入1mL 30％的乙醇充分溶解，从溶解液中取出100μL，加入30％的乙醇3.55mL，制成每1mL含有80μg的溶液，即得80μg/mL的对照品溶液。
葛根素提取物供试品溶液的制备：精密称取约10mg葛根素提取物，用30％乙醇溶解并定容至50mL，0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液即得葛根素提取物供试品溶液。
葛根固体样品(发酵或未发酵样品)供试品溶液的制备：取干燥后的固体样品研细，精密称定粉末(过三号筛，50目)约0.1g至锥形瓶中，加入30％乙醇50mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用30％的乙醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液即得葛根固体样品供试品溶液。
色谱条件：ODS－色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流动相甲醇－水(25∶75)，检测波长250nm，流速1.000mL/min，进样量10μL；柱温为室温。
本发明提供的葛根素提取物的制备方法具有以下优点：
(1)通过先对葛根药材粉用绿色木霉进行固体发酵处理，得到较原葛根药材粉更优质的提取原料，为高含量葛根素提取物的制备奠定了物质基础。
(2)大大提升了葛根素的提取收得率，降低了生产成本。
(3)所得葛根素提取物含量高，杂质少，使后续葛根素单体的制备变得更容易，从而进一步提高了生产效率；同时也减少了有机溶剂的使用量，降低了成本且更有利于环保。
(4)工艺简便，易于实现工业化。
(5)降低了葛根药材的使用量，节约了资源。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡按照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1
培养基的配制：综合马铃薯培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，KH2PO4，硫胺素8mg，MgSO4·7H2O 1.5g。配制方法：马铃薯去皮，切成小块，加水1000mL煮沸20min，然后滤去马铃薯块，再加葡萄糖等物质，溶化后补足水至1000mL。经121℃灭菌15min。
绿色木霉菌种的复苏及扩大培养：用无菌吸管吸取0.5mL适宜的液体培养基，滴入装绿色木霉菌种的安瓿内，轻轻振荡，使冻干菌种溶解呈悬浮状，吸取100μL菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，并在28℃相应的温度下培养。配制综合马铃薯液体培养基100mL，在无菌操作台上，将已活化的菌种接入培养基中，于28℃，转速为105r/min的恒温振荡培养箱进行扩大培养3d，即得绿色木霉的菌悬液。
将100g干葛根药材置于灭菌锅中于120-125℃干蒸90min，冷却后粉粹成20-40目粗粉，喷洒药材重量2-2.5倍的水拌匀成湿料；加入制备好的综合马铃薯培养基100mL、绿色木霉菌悬液5mL，混匀；于28℃、92％相对湿度的恒温恒湿培养箱中进行固体发酵5天，得发酵料；将发酵料于60℃恒温干燥箱中干燥2小时，冷却后碾碎，用乙醇重量百分含量90％的乙醇-水溶液回流提取3次(每次500mL)，合并提取液，减压浓缩除去溶剂得葛根素提取物6.25g。经HPLC检测其葛根素含量为48％。
实施例2
药材发酵和提取方法同实施例1，取未发酵的干葛根药材原粉末作为对照(不加绿色木霉菌悬液，其他处理过程同实施例1)。采用高效液相色谱检测了发酵前后葛根药材粉末中葛根素素的含量，平行五次实验测得发酵前葛根素含量为14.0mg/g，发酵后其含量为35.1mg/g，为发酵前的2.5倍。具体数据见表1。葛根药材粉经绿色木霉发酵后，于不同时间点测葛根素含量，平行操作五次取平均值。结果表明绿色木霉对葛根素的增量效果明显，第七天达到峰值。发酵3～5天后能够保证提取到的葛根素的提取率高于未发酵的葛根药材粉。发酵5天与7天葛根素含量相差不大，为缩短发酵时间，节约成本，故选择第五天为最佳发酵时间。具体数据见表2。
表1葛根发酵前后葛根素含量的变化(n＝5)单位：mg/g
Figure GDA0003360519530000041
表2葛根发酵前后葛根素含量的变化(n＝5)单位：mg/g
Figure GDA0003360519530000042

Claims (1)

1.一种葛根素提取物的制备方法，其特征在于，由如下方法制备：
(1)综合马铃薯培养基的配制：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，KH2PO4，硫胺素8mg，MgSO4·7H2O 1.5g；配制方法：马铃薯去皮，切成小块，加水1000mL煮沸20min，然后滤去马铃薯块，再加葡萄糖、琼脂、KH2PO4、硫胺素、MgSO4·7H2O，溶化后补足水至1000mL；经121℃灭菌15min，即得；
(2)绿色木霉菌种的复苏及扩大培养：用无菌吸管吸取0.5mL适宜的液体培养基，滴入装绿色木霉菌种的安瓿内，轻轻振荡，使冻干菌种溶解呈悬浮状，吸取100μL菌体悬浮液，移植于斜面培养基上，并在28℃相应的温度下培养；取配制综合马铃薯液体培养基100mL，在无菌操作台上，将已活化的菌种接入培养基中，于28℃，转速为105r/min的恒温振荡培养箱进行扩大培养3天，即得绿色木霉的菌悬液；
(3)葛根素提取物的制备：将100g干葛根药材置于灭菌锅中于120-125℃干蒸90min，冷却后粉粹成20-40目粗粉，喷洒药材重量2-2.5倍的水拌匀成湿料；加入制备好的综合马铃薯培养基100mL、绿色木霉菌悬液5mL，混匀；于28℃、92％相对湿度的恒温恒湿培养箱中进行固体发酵5天，得发酵料；将发酵料于60℃恒温干燥箱中干燥2小时，冷却后碾碎，用乙醇重量百分含量90％的乙醇-水溶液回流提取3次，每次500mL，合并提取液，减压浓缩除去溶剂得葛根素提取物6.25g；经HPLC检测其葛根素含量为48％。
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