CN109069613B - 痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示 - Google Patents

痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示 Download PDF

Info

Publication number
CN109069613B
CN109069613B CN201780025118.1A CN201780025118A CN109069613B CN 109069613 B CN109069613 B CN 109069613B CN 201780025118 A CN201780025118 A CN 201780025118A CN 109069613 B CN109069613 B CN 109069613B
Authority
CN
China
Prior art keywords
imp
eev
protein
polynucleotide
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780025118.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109069613A (zh
Inventor
E·S·史密斯
M·帕里斯
M·G·M·斯科瑞文斯
R·A·柯克
A·A·康尼尔森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Vaccinex Inc
Original Assignee
Vaccinex Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vaccinex Inc filed Critical Vaccinex Inc
Priority to CN202211138346.9A priority Critical patent/CN116286909A/zh
Publication of CN109069613A publication Critical patent/CN109069613A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109069613B publication Critical patent/CN109069613B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7158—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/286—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against neuromediator receptors, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24131—Uses of virus other than therapeutic or vaccine, e.g. disinfectant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24142—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/065—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • G01N2333/07—Vaccinia virus; Variola virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)

Abstract

本公开内容提供用于表达和展示处于自然构象的分离的整合膜蛋白(IMP)或其片段的组合物和方法，用于筛选、选择和鉴定与感兴趣的靶IMP结合的抗体或抗体样分子。

Description

痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示
背景技术
越来越多不同治疗应用中采用具有确定特异性的抗体。已有许多方法用以获得用于人类治疗应用的有用抗体。这些包括嵌合和人源化抗体，以及完全人抗体，其选自文库，例如，噬菌体展示文库，或来自转基因动物。细菌噬菌体中构建的免疫球蛋白文库可源自原初或特定免疫个体的产抗体细胞，并且原则上可包括人免疫球蛋白重链和轻链的新式且多样化的配对。尽管该策略不受制于固有库限制，它要求表达的免疫球蛋白片段的互补决定区(CDR)在细菌细胞中合成并正确折叠。然而，许多抗原结合区域难以在细菌细胞中正确组装为融合蛋白。此外，所述蛋白将不会经历正常的真核翻译后修饰。由此，该方法对可获得的抗体特异性施用不同的选择过滤条件。或者，完全人抗体可分离自真核系统中的文库，例如，酵母展示、逆转录病毒展示，或表达于DNA病毒如痘病毒中。参见例如，美国专利号7,858,559和美国专利申请公开号2013-028892，其通过引用其全文的方式纳入本文。
用于治疗性抗体的许多重要靶标是整合膜蛋白(IMP)，例如，多次跨膜蛋白(GPCR，离子通道等)，其难以以构象完整状态进行表达和纯化。分离状态下正确折叠的靶蛋白的缺乏使得对于针对这些靶标的抗体的鉴定和选择成为挑战。尽管某些IMP可在细胞(例如，哺乳动物细胞)表面上表达，用于抗体发现的完整细胞是存在问题的，因为它们是复杂抗原混合物，靶标表达可能较低，还因为用以构建抗体文库(例如，牛痘病毒抗体文库)的某些展示包装物(display package)可以非特异性方式结合至完整细胞。仍然需要用以表达并展示感兴趣的靶IMP的新方法，其中感兴趣的靶IMP处于其自然构象、具有足够浓度，且与其它细胞蛋白的竞争尽量地小，以允许从展示文库鉴定并选择治疗性抗体和抗体样分子。
发明内容
本公开内容提供用于表达和展示处于自然构象的分离的整合膜蛋白(IMP) 或其片段的组合物和方法，用于筛选、选择和鉴定与感兴趣的靶IMP结合的抗体或抗体样分子。
在某些实施方式中，本公开内容提供一种分离的多核苷酸，其包含：第一核酸片段，该第一核酸片段编码整合膜蛋白(IMP)或其片段，其中该IMP或其片段包括至少一个膜外区域、至少一个跨膜结构域和至少一个膜内区域，并且其中，编码至少一个膜内区域的第一核酸片段的部分位于第一核酸片段的5'或3' 端；和，第二核酸片段，该第二核酸片段编码牛痘病毒F13L蛋白或其功能性片段，其中该第二核酸片段框内融合至编码IMP的膜内区域的第一核酸片段的部分。根据这些实施方式，包含所述多核苷酸的痘病毒感染的细胞可表达 IMP-F13L融合蛋白，作为胞外包膜病毒颗粒(EEV)的包膜外膜(outer envelopemembrane)的部分。在某些方面中，F13L蛋白或其功能性片段可包括氨基酸序列SEQ ID NO:1或其功能性片段。在一些方面中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个或至少7个跨膜结构域。在一些方面中，IMP是表1中所列的多次跨膜蛋白。
在一些方面中，多次跨膜的IMP可具有奇数个跨膜结构域，第一核酸片段的5'端可编码膜外区域，且第一核酸片段的3'端可编码与第二核酸片段的5'端融合的膜内区域。在一些方面中，该类型的第一核酸片段可编码，例如，G蛋白偶联受体(GPCR)。在一些方面中，GPCR可以是人卷曲-4蛋白(FZD4)或其片段，并且，所述多核苷酸可编码包括SEQ ID NO:2的氨基酸20-892的多肽。在一些方面中，所述多肽还可包括信号肽，例如，SEQ ID NO:2的氨基酸1-19。在一些方面中，GPCR可以是CXC趋化因子受体，例如，CXCR4，或其片段，并且，所述多核苷酸可编码包括氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽。
在一些方面中，多次跨膜的IMP可具有偶数个跨膜结构域，且第一核酸片段的5'和3'端均可编码膜内区域。在一些方面中，第二核酸片段可融合至第一核酸片段的3'端。在一些方面中，IMP可以是，例如，人CD20蛋白，或其片段，并且，所述多核苷酸可编码包括氨基酸序列SEQ ID NO:4的多肽。
在一些方面中，本文提供的多核苷酸的第一和第二核酸片段可直接融合。在一些方面中，本文提供的多核苷酸可包括第三核酸片段，其编码异源肽，例如，接头序列，氨基酸标签或标记物，或促进纯化的肽或多肽序列，例如组氨酸标签。在一些方面中，本文提供的多核苷酸能操作性地联合痘病毒启动子，例如，p7.5，T7，或H5启动子。
本公开内容还提供由本文提供的多核苷酸编码的F13L融合蛋白。本公开内容还提供包括本文提供的多核苷酸的痘病毒基因组，例如，牛痘病毒基因组。本公开内容还提供包括本文提供的痘病毒基因组的重组牛痘病毒EEV。
本公开内容还提供产生本文提供的重组牛痘病毒EEV的方法，所述方法包括：用包含本文提供的痘病毒基因组的牛痘病毒感染允许牛痘病毒感染的宿主细胞，和，回收由所述宿主细胞释放的EEV。
本公开内容还提供展示处于自然构象的整合膜蛋白(IMP)或其片段的方法，其中，所述方法包括，用重组痘病毒感染允许痘病毒感染的宿主细胞，所述重组痘病毒表达IMP或其片段，该IMP或其片段的形式为与痘病毒EEV特异性蛋白或其膜相关片段的融合蛋白，其中，由受感染的宿主细胞产生的EEV包含该IMP融合蛋白作为EEV包膜外膜的部分，和，回收由所述宿主细胞释放的 EEV。在一些方面中，IMP或其片段以自然构象展示在EEV的表面。在一些方面中，EEV特异性蛋白可以是牛痘病毒A33R蛋白，A34R蛋白，A56R蛋白，B5R 蛋白，A36R蛋白，F13L蛋白，其任何膜相关片段，或其任何组合。
在一些方面中，EEV特异性蛋白是F13L(SEQ ID NO:1)或其功能性片段。在一些方面中，IMP是多次跨膜蛋白，其包括至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个或至少7个跨膜结构域。在一些方面中，IMP可以是G蛋白偶联受体(GPCR)，例如，如上所述的人FZD4或CXCR4，其包括7个跨膜结构域，并且F13L蛋白可融合至IMP的C末端。在一些方面中，IMP或其片段可具有偶数个跨膜结构域，例如，如上所述的人CD20，其中IMP或其片段的N末端和C末端均在膜内，并且F13L可融合至IMP的N末端或C末端。
在一些方面中，膜相关EEV特异性蛋白片段可包括或由如下部分组成：牛痘病毒A56R蛋白的茎部、跨膜和膜内结构域，例如，SEQ ID NO:5的氨基酸 108-314。在一些方面中，A56R融合蛋白的IMP部分可包括人FZD4的胞外结构域，例如，所述融合蛋白可包括SEQID NO:6的氨基酸20-370，人ErbB2(Her2) 的胞外结构域，例如，所述融合蛋白可包括SEQID NO:7的氨基酸20-855，或者，人CD100(轴突导向因子4D)的胞外结构域，例如，所述融合蛋白可包括SEQ ID NO:8的氨基酸20-935。
在一些方面中，膜相关EEV特异性蛋白片段可包括或由如下部分组成：牛痘病毒B5R蛋白的跨膜和膜内结构域，或茎部、跨膜和膜内结构域，例如，分别为SEQ ID NO:9的氨基酸276-317或SEQ ID NO:9的氨基酸238-317。在一些方面中，B5R融合蛋白的IMP部分可包括人FZD4的胞外结构域，例如，所述融合蛋白可包括SEQ ID NO:10的氨基酸20-243或SEQID NO:11的氨基酸20-281。
本公开内容还提供融合蛋白，其包含：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:2的氨基酸20-892；SEQ ID NO:6的氨基酸20-370；SEQ ID NO:7的氨基酸20-855；SEQ ID NO:8的氨基酸20-935；SEQ ID NO:10的氨基酸20-243；SEQ ID NO:11的氨基酸20-281，SEQ IDNO:16的氨基酸20-506，或SEQ ID NO:17的氨基酸20-235。本文提供的融合蛋白，当被重组痘病毒(例如，牛痘病毒)表达时，可以自然构象在痘病毒胞外包膜病毒颗粒(EEV)的表面出现。还提供了包含所述融合蛋白的重组痘病毒EEV。本公开内容还提供重组痘病毒EEV，其包括异源IMP或其片段，该异源IMP或其片段融合至痘病毒EEV特异性蛋白或其膜相关片段，其中，该融合蛋白位于EEV包膜外膜中，并且其中，所述IMP或其片段以其自然构象展示于EEV的表面上。在一些方面中，重组痘病毒EEV是牛痘病毒EEV。
本公开内容还提供选择与多次跨膜蛋白结合的抗体的方法，所述方法包括，使本文提供的重组EEV附连至固体支持物；提供抗体展示文库，其中该文库包含展示包装物，所述展示包装物展示多个抗原结合结构域；使展示文库与 EEV接触，从而展示包装物能够与之结合，所述展示包装物展示能够与EEV上表达的IMP特异性结合的抗原结合结构域；回收未结合的展示包装物；和，回收展示对EEV上表达的IMP具有特异性的抗原结合结构域的展示包装物。在该方法的一些方面中，所述重组EEV在与固体支持物附连之前是失活的，例如通过在UV辐照下与补骨脂素(三甲沙林，4'-氨基甲基-，盐酸盐)孵育。在该方法的一些方面中，重组EEV通过与附连至固体表面的甲苯磺酰基基团反应而被附连至该表面。在一些方面中，固体表面可以是甲苯磺酰基-活化的磁珠。在该方法的一些方面中，重组EEV是生物素化的，且附连至链酶亲和素被覆的固体表面，例如，链酶亲和素-被覆的磁珠。
附图简述
图1A-C：示意性描述融合至牛痘病毒胞外包膜病毒颗粒(EEV)特异性蛋白或其片段的整合膜蛋白(IMP)或其片段。平行的水平线图示EEV外膜。图1A示意性说明与包括跨膜结构域和膜内结构域的牛痘A56R蛋白的片段融合的IMP 的胞外结构域(ECD)。图1B示意性说明与牛痘病毒EEV特异性F13L蛋白融合的典型G蛋白偶联受体的拓扑结构。F13L通过棕榈酰化与EEV外膜的内侧相关联。图1C示意性说明与F13L融合的、具有偶数个跨膜结构域的IMP(例如，CD20) 的拓扑结构。
图2：显示将CD20-F13L和CD20ECD-A56R融合蛋白引入牛痘病毒EEV颗粒。
图3A：显示CD20-F13L融合蛋白相比不带标签的CD20被优先纳入牛痘病毒EEV颗粒。
图3B：显示FZD4-F13L融合蛋白相比不带标签的(未融合的)FZD4被优先纳入牛痘病毒EEV颗粒。
图4：额外IMP-EEV蛋白融合体被纳入牛痘病毒EEV。“CD20”是CD20-F13L 融合蛋白，“CXCR4”是CXCR4-F13L融合蛋白，“Her2”是Her2ECD-A56R融合蛋白；而“CD100”是CD100ECD-A56R融合蛋白。
图5：针对与牛痘病毒EEV上表达的感兴趣的IMP结合的展示包装物来筛选抗体展示文库的试验概述。
图6A：表达抗HER-2抗体的牛痘病毒EEV与表达HER2ECD的牛痘病毒 EEV的结合，作为与牛痘病毒A56R蛋白的融合体形式，通过甲苯磺酰基-基团结合至磁珠。
图6B：表达抗FZD抗体的牛痘病毒EEV与表达FZD4的牛痘病毒EEV的结合，作为与牛痘病毒F13L蛋白的融合体形式，通过甲苯磺酰基-基团结合至磁珠。
图6C：表达抗CXCR4抗体的牛痘病毒EEV与表达CXCR4的牛痘病毒EEV 的结合，作为与牛痘病毒F13L蛋白的融合体形式，通过甲苯磺酰基-基团结合至磁珠。
图6D：表达抗CD100(“sema”)抗体的牛痘病毒EEV与表达CD100ECD的牛痘病毒EEV的结合，作为与牛痘病毒A56R蛋白的融合体形式，通过甲苯磺酰基 -基团结合至磁珠。
图7：FACS扫描，显示在通过甲苯磺酰基-基团结合至磁珠的失活FZD-ECD-A45R-表达型EEV上进行3(Rd3)、4(Rd4)和5(Rd5)轮淘选(panning) 之后，针对抗FZD4抗体的富集。顶部行显示表达抗体的病毒感染的细胞，其用 10μg/ml FZD-His染色，随后用抗His-Dyelight650和抗Fab-FITC染色。底部行显示表达抗体的病毒感染的细胞，其用10μg/mlCD100-His(阴性对照)染色，随后用抗His-Dyelight650和抗Fab-FITC染色。
图8：两种不同的蛋白融合体(HA-A56R融合体和FZD4-F13L融合体)被引入牛痘病毒EEV。测试仅表达HA-A56R融合体的EEV、仅表达FZD4-F13L融合体的EEV，或表达两种融合蛋白的EEV与抗FZD4-被覆的珠或抗HA被覆的珠的结合。
图9：通过磁珠特定地回收抗CXCR4表达型EEV，所述磁珠被覆有表达 HA-A56R融合体和CXCR4-F13L融合体两者的EEV。抗原-EEV偶联至抗HA被覆的珠。
图10：表达指定融合蛋白的生物素化的牛痘病毒EEV与链酶亲和素被覆的磁珠之结合。
具体实施方式
本公开内容提供用于在痘病毒(例如，牛痘病毒)的胞外包膜病毒颗粒颗粒 (EEV)的表面上表达和展示处于构象完整或自然状态的整合膜蛋白(IMP)(例如，多次跨膜的(IMP))的方法和组合物，所述整合膜蛋白为与EEV特异性膜相关蛋白(例如，F13L)的多肽区段的融合体形式。
定义
本文所述术语“一个”或“一种”实体指一种或多种该实体；例如，“一个/种结合分子”应理解为表示一个/种或多个/种结合分子。如此，本文所述术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。
此外，本文所用“和/或”应被视作具体公开了两种特征或组分的每一种，伴随或不伴随另一种。因此，本文短语“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A 和B”、“A或B”、“A”(单独)、和“B”(单独)。同样，短语诸如“A、B、和/或C”中使用的术语“和/或”旨在包括各种以下实施方式：A、B、和C；A、B或C；A或 C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另有定义，本文使用的科技术语与本公开所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。例如，《生物医药和分子生物学简明词典》(Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology)，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社(CRCPress)；《细胞和分子生物学词典》(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；和《牛津生物化学和分子生物学辞典》(OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)，向技术人员提供了本公开使用的很多术语的常用词典。
单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数值。除非另外说明，氨基酸以氨基到羧基的取向从左到右书写。本文提供的标题不是本公开各种方面或某方面的限制，可以参考说明书整体理解本公开的各种方面或实施方式。因此，下面紧接着定义的术语完全参考说明书全文定义。
本文所用术语“非天然产生的”物质、组合物、实体，和/或物质、组合物、实体的任意组合，或其任意语法变化形式是条件术语，其明确排除，但仅排除本领域普通技术人员熟知的“天然产生的”，或者可以是在任何时间，由法官或行政机关或司法机关确定或理解为“天然产生的”物质、组合物、实体，和/或物质、组合物、实体的任意组合的那些形式。
本文所用的术语“多肽”意在包括单数形式“多肽”和复数形式“多肽”，指由酰胺键(也称肽键)线性连接的多个单体(氨基酸)所组成的分子。术语"多肽"指的是两个或更多个氨基酸的任何一条链或多条链，并且不表示特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或其它任何用于指两个或多个氨基酸的一条或多条链的术语均包含于“多肽”的定义内，术语“多肽”可与任意这些术语替代或互换使用。术语“多肽”还指多肽表达后修饰的产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰基化、磷酸化、酰胺化，和通过已知保护/ 阻断基团衍生化、蛋白酶切割或非天然产生氨基酸修饰。多肽可由生物来源衍生或由重组技术产生，但不必定由指定核酸序列翻译而来。其可以任何方式产生，包括通过化学合成。
本文公开的多肽的大小可以是约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或者2,000个或更多个氨基酸。多肽可具有确定的三维结构，但它们不必定具有这种结构。具有确定三维结构的多肽称为折叠多肽，不具有确定三维结构、但可具有大量不同构象的多肽称为未折叠多肽。本文所用的术语糖蛋白指偶联至至少一个糖部分的蛋白质，所述糖部分通过某一氨基酸如丝氨酸或天冬酰胺的含氧或含氮侧链连接于该蛋白质。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物指不处于其天然环境中的多肽。没有规定的具体纯化水平。例如，可从其自然或天然环境中移出分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是如本文公开所分离的，通过任何合适技术分离、分级，或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽也是如此。
本文所用术语“非天然产生的”多肽或其任意语法变化形式是条件性术语，其明确排除，但仅排除本领域普通技术人员熟知的“天然产生的”，或者可以是在任何时间，由法官或行政机关或司法机关确定或理解为“天然产生的”多肽的那些形式。
本文公开的其它多肽是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，及其任何组合。本文所述的术语"片段"、"变体"、"衍生物"和"类似物"包括保持对应的原始抗体或多肽的至少一些性质(例如，特异性结合抗原)的任何多肽。除本文他处讨论的具体抗体片段外，多肽的片段还包括，例如，蛋白酶水解片段以及缺失片段。例如，多肽的变体包括如上所述的片段，以及因氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。在某些方面中，变体可以是非天然产生的。可使用本领域已知的诱变技术生成非天然产生变体。变体多肽可包含保守或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已经改变从而显示原始多肽上不存在的其它特征的多肽。例子包括融合蛋白。多肽变体在本文中也可称作“多肽类似物”。本文所用的多肽的"衍生物"还可指：具有通过功能侧基的反应经由化学方法衍生的一个或多个氨基酸的对象多肽。“衍生物”还包括含有20种标准氨基酸中的一个或多个衍生形式的那些肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；且鸟氨酸可取代赖氨酸。
“保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸被具有相似侧链的另一个氨基酸替代的情况。本领域中已定义了具有类似侧链的氨基酸的家族，包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在某些实施方式中，本公开的多肽和抗体的序列中的保守取代不废除包含所述氨基酸序列的多肽或抗体与所述结合分子结合的抗原的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见，例如，Brummell 等，Biochem.32:1180-1 187(1993)；Kobayashi等，Protein Eng.12(10):879-884 (1999)；和Burks等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:.412-417(1997))。
本文所用的术语“整合膜蛋白”或“IMP”指附连至生物膜的蛋白质或多肽。 IMP的一个示例是跨膜蛋白，其一次或多次跨越生物膜脂双层。单次跨膜 (single-pass)膜蛋白仅一次跨越该膜，而多次跨膜(multi-pass)膜蛋白以跨越数次的方式内外交织。I型单次跨膜蛋白利用其氨基末端位于膜的外侧或“膜外”，而其羧基末端位于膜的内侧或“膜内”。II型单次跨膜蛋白的氨基末端位于膜内侧。多次跨膜的跨膜蛋白两次或更多次通过膜，并且可具有多种不同拓扑结构。具有偶数个跨膜结构域的那些蛋白质的氨基末端和羧基末端均位于膜同侧。此类蛋白质的一个示例是CD20，其表达于B细胞上。具有奇数个跨膜结构域的那些的氨基和羧基末端将位于膜的相对侧。示例包括G蛋白偶联受体，其通常具有7 个跨膜结构域，其中氨基末端位于膜外侧，且羧基末端位于膜内侧。某些IMP 不具有跨膜结构域，而是锚着至膜，例如，通过脂质如糖基磷脂酰肌醇或棕榈酰基团锚着。IMP具有的种种生物功能包括但不限于转运蛋白、接头、通道、受体、酶、能量转运或细胞粘附。
术语“多核苷酸”意在包括单个核酸和多个核酸，指分离的核酸分子或构建物，例如信使RNA(mRNA)、cDNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(如酰胺键，如肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。术语“核酸”或“核酸序列”指多核苷酸中存在的任何一种或多种核酸区段，如DNA或 RNA片段。
"分离的"核酸或多核苷酸意为与其原始环境分离的核酸或多核苷酸的任何形式。例如，凝胶纯化的多核苷酸，或编码载体中所含多肽的重组多核苷酸将被视作是“分离的”。并且，经工程改造具有克隆的限制性位点的多核苷酸区段 (例如PCR产物)也被认为是“分离的”。分离的多核苷酸的其它示例包括在异源性宿主细胞中维持的重组多核苷酸或在非原始溶液(例如缓冲液或盐水)中(部分地或基本上地)纯化的重组多核苷酸。分离的RNA分子包括多核苷酸的体内或体外RNA转录本，其中，所述转录本不是自然中存在的转录本。分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成方式产生的这样的分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调节元件例如启动子、核糖体结合位点，或转录终止子。
本文所用术语“非天然产生的”多核苷酸、或其任意语法变化形式是是条件术语，其明确排除，但仅排除本领域普通技术人员熟知的“天然产生的”，或者可以是在任何时间，由法官或行政机关或司法机关确定或理解为“天然产生的”多核苷酸的那些形式。
本文所用的术语“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但它可被认为是编码区的一部分，而任何侧接序列如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等均不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单一多核苷酸构建物中，例如在单一载体上，或者在分开的多核苷酸构建物中，例如在单独(不同) 载体上。此外，任何载体均能包含单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如，单一载体可分开编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，载体、多核苷酸或核酸可包括异源性的编码区，其融合或未融合至另一个编码区。异源性的编码区包括不限于，编码专有的元件或基序(例如分泌信号肽或异源性的功能结构域)的那些。
在某些实施方式中，所述多核苷酸或核酸是DNA。对DNA而言，包含编码多肽的核酸的多核苷酸正常情况下可包括启动子和/或其它转录或翻译控制元件，这些元件与一个或多个编码区操作性地连接。操作性连接指当基因产物如多肽的编码区与一个或多个调控序列以此方式连接时，将该基因产物的表达置于该调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导使编码所需基因产物的 mRNA转录，且如果两个DNA片段间连接的属性不干扰表达调控序列指导基因产物表达或不干扰转录DNA模板的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区及其相连的启动子)“操作性连接”。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，则启动子区域与多肽编码核酸操作性连接。启动子可以是在预定细胞中指导DNA实质转录的细胞特异性启动子。启动子以外的其它转录控制元件如增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号，能与多核苷酸可操作连接以指导细胞特异性转录。
多种转录控制区对于本领域技术人员而言是已知的。它们包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥作用的转录控制区，例如但不限于，来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-A联用)、猿病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳氏肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括源自脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。其它合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如，通过干扰素或白介素诱导的启动子)。
痘病毒启动子(例如p7.5或H5)或细菌噬菌体T7启动子也可用作转录控制区域。采用T7启动子时，可采用诱导型牛痘表达系统。牛痘表达系统可包括但不限于，第一重组牛痘病毒，其编码整个细菌噬菌体T7基因1编码区(供于T7RNA 聚合酶)，和第二重组牛痘病毒，其编码由T7启动子和终止调节元件侧接的感兴趣的基因。两种重组牛痘病毒对真核细胞的双重感染导致T7RNA聚合酶的合成和由T7启动子控制的感兴趣的基因的表达。
类似地，本领域普通技术人员了解各种翻译控制元件。它们包括但不限于：核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。
在其它实施方式中，多核苷酸可以是RNA，例如，信使RNA(mRNA)、转移RNA或核糖体RNA的形式。
多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌或信号肽的其它编码区相关联，所述编码分泌或信号肽引导本文所述的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白质链向粗面内质网外的输出过程启动，所述序列从成熟蛋白质上切除。本领域普通技术人员了解，脊椎动物细胞分泌的多肽可具有融合于所述多肽N末端的信号肽，它们从完整或“全长”多肽上切割产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方式中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者使用仍然能够指导与其操作性相连多肽分泌的该序列的功能衍生物。或者，可采用异源性的哺乳动物信号肽，或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可用小鼠β-葡萄糖醛酸酶或人组织纤溶酶原激活剂(TPA)的前导序列取代。
本文所用的“文库”是多核苷酸的代表性类簇，例如，通过以下方面相关的多核苷酸的组，例如，它们源于单一动物物种，组织类型，器官，或细胞类型，其中该文库集合性地包含给定多核苷酸类簇中的至少2个不同种类。多核苷酸文库可包括，例如，给定的多核苷酸类簇中的至少2个，至少5，至少10，100， 103，104，105，106，107，108，或109个不同种类。在一些方面中，本文提供的多核苷酸文库可编码包含感兴趣的多肽的多个多肽。在一些方面中，本文提供的多核苷酸文库可编码多个免疫球蛋白亚基多肽，例如，重链亚基多肽或轻链亚基多肽。在该内容中，本文提供的“文库”包含常规类簇的多核苷酸，该类簇为编码某以类型或种类的免疫球蛋白亚基多肽的多核苷酸，例如，文库可编码人μ，γ-1，γ-2，γ-3，γ-4，α-1，α-2，ε，或δ重链，或人κ或λ轻链。尽管根据本文提供的方法构建的任一文库的各成员可编码相同重链或轻链恒定区和/或膜锚着结构域，但该文库可集合性地包含与共同恒定区相关联的至少2个，至少5 个，或至少10个，100个，103个，104个，105个，106个，107个，108个，或109个不同可变区。
在其它实施方式中，该文库可编码多个免疫球蛋白单链片段，其包含可变区，例如轻链可变区或重链可变区，和/或轻链可变区和重链可变区两者，例如， ScFv片段。
本文所用的“展示文库”是多核苷酸的文库，所述多核苷酸各自被携载于“展示包装物”中，该展示包装物表达由其表面上的文库多核苷酸编码的多肽。抗体展示文库，例如，可包括多个展示包装物，其各自在其表面上展示抗体的抗原结合结构域。当允许展示文库与感兴趣的抗原(例如，固定在固体表面上)相互作用时，能够结合所述抗原的那些展示包装物可从文库的剩余部分分离，并回收。然后，可分离编码展示包装物的表面上展示的抗原结合结构域的多核苷酸。展示文库包括但不限于，细菌中的噬菌体展示文库或真核系统中的文库，例如，酵母展示，逆转录病毒展示，或DNA病毒如痘病毒中的表达。参见例如，美国专利号7,858,559和美国专利申请公开号2013-028892，其通过引用其全文的方式纳入本文。在一些方面中，抗体展示文库可在痘病毒(例如，牛痘病毒载体)中，作为与EEV特异性蛋白的融合蛋白形式制备，从而该“展示包装物”为EEV颗粒。参见美国专利申请公开号2013-028892。
此类展示文库可针对在本文提供的EEV表面上展示的IMP融合蛋白进行筛选。
“受体细胞”或“宿主细胞”或“细胞”表示这样的细胞或细胞群，其中重组蛋白可被表达，病毒可被繁衍，或本文提供的多核苷酸文库可被构建和/或传播。本文提供的宿主细胞通常是真核细胞或细胞系，例如，脊椎动物，哺乳动物，啮齿类，小鼠，灵长类，或人细胞或细胞系。“宿主细胞的群”表示一组经培养的细胞，其中本文提供的“文库”可被构建、传播和/或表达。允许牛痘病毒感染的任何宿主细胞均适用于本公开内容提供的方法。用于本文提供的方法的宿主细胞可以是贴壁细胞，例如，附连至固体基材生长的宿主细胞，或者，宿主细胞可以悬浮方式生长。
本文提供的宿主细胞可包含组成型分泌途径，其中蛋白质，例如，由该细胞或文库表达的感兴趣的蛋白质，由细胞的内部分泌，表达于细胞或病毒膜表面上，或完全分泌为可溶性多肽。在一些方面中，表达在生物膜上或生物膜中的感兴趣的蛋白质，例如，IMP，表达在由宿主细胞产生的具有包膜的病毒的表面上，例如，具有胞外包膜的牛痘病毒，或EEV。IMP可遵循与完全分泌形式或蛋白质相同的途径，通过ER腔，不同之处在于它们可因一种或多种停止传递信号或“跨膜结构域”而保留在ER膜中。跨膜结构域是约20个氨基酸的疏水性延伸，其在横贯膜时采取α-螺旋构象。膜包埋蛋白锚着在质膜的磷脂双层中。感兴趣的多肽的跨膜形式，例如，膜锚着的免疫球蛋白重链多肽，通常利用氨基末端信号肽，如同完全分泌形式那样。
已知多种膜结合蛋白和/或完全分泌蛋白的信号肽，跨膜结构域，和细胞溶质或“膜内”结构域。
合适的跨膜结构域可包括但不限于，牛痘病毒EEV特异性HA蛋白A56R的 TM结构域，或EEV特异性牛痘病毒跨膜蛋白A33R，A34R，A36R，或B5R。参见例如，美国专利申请公开号2013/0288927，公开于2013年10月31日，且通过引用其全文的方式纳入本文。在一些方面中，EEV特异性蛋白可通过棕榈酰基团而锚着至病毒包膜的内表面，例如，牛痘病毒蛋白F13L，其更详细描述于本文他处。
本文中所用的术语“结合分子”以其最宽泛的含义指特异性结合至受体(例如，表位或抗原决定簇)的分子。如本文进一步描述，结合分子可包含一种或多种本文所述的“抗原结合结构域”。结合分子的非限制性示例是抗体或其保持抗原-特异性结合性的片段。
术语“结合结构域”和“抗原结合结构域”在本文中可以互换使用，并且指必需且足以特异性结合表位的结合分子的区域。例如，“Fv”，例如，抗体的可变重链和可变轻链，以两个分开多肽亚基或作为单一链形式，被视作是“结合结构域”。
其它抗原结合结构域包括但不限于，源自骆驼科物种的抗体的可变重链 (VHH)，或在纤连蛋白支架上表达的六个免疫球蛋白互补决定区(CDR)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体(或其片段、变体或衍生物，如本文所述)包括至少重链的可变区(例如，对于骆驼科物种而言)或至少重链和轻链的可变区。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对较好地了解的。参见例如，Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，第2版， 1988)。除非另有说明，否则术语“抗体”涵盖从抗体的小抗原结合片段到完全尺寸抗体范围内的任何物质，例如，包括两个完整重链和两个完整轻链的IgG抗体。
术语“免疫球蛋白”包含可通过生物化学方式识别的各种宽泛种类的多肽。本领域技术人员应理解，重链分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(如γ1-γ4或α1-α2)。该链的特性决定抗体“类别”分别为 IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)如IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA1、IgA2等已被充分表征，且已知提供功能性特化。
轻链分类为κ或λ(kappa或lambda)。各重链类别可与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链互相共价结合，并且当由杂交瘤、B细胞或遗传工程改造的宿主细胞生成免疫球蛋白时，两条重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价连接结合在一起。在重链中，氨基酸从Y构型的分叉末端处的N-端到各条链的底部处的C-端。某些抗体(例如，IgG抗体)的基础结构包括两个重链亚基和两个轻链亚基，其通过二硫键共价连接以形成“Y”结构，也在本文中称为“H2L2”结构。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何分子决定簇。在某些方面，表位可包括分子的化学活性表面基团(例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团)，并且在某些方面，表位可具有三维结构特点，和/或特定的电荷特点。表位是由抗体结合的靶标的区域。
术语“靶标”以最广泛的含义使用以包括可由结合分子结合的物质。靶标可以是，例如，多肽、核酸、碳水化合物、脂质或其它分子。此外，例如，“靶标”可以是包含可被结合分子结合的表位的细胞、器官或生物体。
轻链和重链都被划分成具有结构和功能同源性的区域。从功能角度使用术语“恒定”和“可变”。在这方面，应当理解的是可变轻(VL)链或可变重(VK)链部分的可变区(可被称为“可变结构域”，在本文中可交换地使用)决定抗原识别和特异性。相反，轻链的恒定区(CL)和重链的恒定区(例如，CH1、CH2或CH3) 提供生物学特性，例如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照习惯，恒定区结构域的编号随着远离抗原结合位点或抗体的N末端而增加。N末端部分是可变区，而C末端部分是恒定区；CH3(或在IgM的情况中的CH4)和CL结构域实际上分别是重链和轻链的羧基端。
抗体抗原结合结构域中存在的六个“互补决定区”或“CDR”是氨基酸的非连续短序列，其特异性地定位以随着抗体在水性环境中采取其三维构型而形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸称为“构架”区，显示较小的分子间差异。构架区主要采用β-片层构象，并且CDR形成连接β-片层结构的环，而在某些情况中形成β-片层结构的部分。因此，构架区用于通过链间非共价相互作用形成为CDR提供正确方向位置的支架。定位的CDR形成的抗原结合结构域确定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进了抗体与其互补表位的非共价结合。分别组成CDR和构架区域的氨基酸，可由本领域普通技术人员通过任何给定的重或轻链可变区而容易地鉴定，因为它们已以多种不同的方式被定义(参见，"免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)"，Kabat,E.等，美国卫生及公共服务部(U.S.Department of Health and HumanServices)，(1983)；和Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.,196: 901-917(1987)，其通过引用其全文的方式纳入本文)。
除非明确表述为相反的含义，否则在本领域内所使用和/或接受的某一术语有两种或多种定义的情况下，本文所用的术语定义应包括所有这些含义。具体示例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非毗连抗原结合位点。这些具体的区域已被描述，例如，由Kabat等，美国卫生及公共服务部，"免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)"(1983)，和由Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，其通过引用方式纳入本文。可以使用例如IMGT信息系统(www://imgt.cines.fr/)(
Figure GDA0002015313150000151
/V-Quest)对免疫球蛋白可变区进行分析，以鉴定不同区段，包括CDR。(参见例如，Brochet等,Nucl.Acids Res.,36:W503-508, 2008)。
Kabat等也定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将所述“Kabat编号”系统应用于任何可变区序列，而不依赖序列本身外的任何实验数据。本文所用的“Kabat编号”指Kabat等(1983)美国卫生与公众服务部，“免疫学热门蛋白质序列(Sequence of Proteins of Immunological Interest)”(1983)中所述的编号系统。除非明确注明采用Kabat编号系统，否则，对本公开的全部氨基酸序列采用连贯的编号。
结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包括但不限于，多克隆、单克隆、人、人源化的或嵌合抗体、单一链抗体、表位-结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、单一结构域抗体(如骆驼VHH抗体)、包含VL或VH结构域的片段、通过Fab表达文库产生的片段。ScFv分子是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号 5,892,019。本公开所涵盖的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(如IgG、IgE、 IgM、IgD、IgA和IgY)、类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2等)或小类的免疫球蛋白分子。还可以预期的是免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)同种型，其是二价的并且含有包括IgNAR可变区(VNAR)的单链。(参见，Walsh等, Virology 411:132-141,2011)。
“特异性结合”一般表示结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物通过其抗原结合结构域结合表位，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间的一些互补性。按照这一定义，当结合分子通过其抗原结合结构域与表位结合比其与随机、无关的表位结合更容易时，称该结合分子“特异性结合”该表位。本文中使用术语“特异性”定性分析某一抗体与某一表位结合的相对亲和性。例如，可认为结合分子“A”比结合分子“B”对给定表位具有更高特异性，或者可以说结合分子“A”以比其对相关表位“D”的特异性更高的特异性结合表位“C”。
本文所用的术语“亲和性”指单独表位与例如免疫球蛋白分子的一个或多个结合结构域结合的强度之量度。参见例如，Harlow等，《抗体：实验室手册》 (Antibodies:ALaboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)，第27-28页。本文中所用的术语“亲合力(avidity)”指的是抗原结合结构域的群体和抗原之间的复合物的总体稳定性。参见，例如， Harlow，第29-34页。亲合力既与群体中单独抗原结合结构域与特定表位的亲和性相关，也与免疫球蛋白分子和抗原的价态相关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原例如多聚体之间的相互作用是具有高亲合力的一个例子。二价单克隆抗体与以高密度存在于细胞表面上的受体之间的相互作用也将具有高亲合力。
本文中所用的术语“重链亚基”或“重链结构域”包括这样的氨基酸序列，其源自免疫球蛋白重链、结合分子，例如，包含重链亚基的抗体，可包括如下至少一种：VH结构域、CH1结构域、铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区) 结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域，或其变体或片段。
本文所用的术语“轻链亚基”或“轻链结构域”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链亚基包括至少VL或CL(例如，Cκ或Cλ)结构域中的至少一个。
结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可就它们识别或特异性结合的表位或抗原部分进行描述或说明。靶抗原与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶抗原可包含单个表位，或至少两个表位，并可包括任意数量的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。
本文中所用的术语“连接的”、“融合的”或“融合(体)”或其它语法等同形式可互换使用。这些术语指表示包括化学偶联或重组方式在内的各种方式将两个或更多元件或组件接合在一起。“框内融合”指以维持原始多核苷酸开放阅读框 (ORF)翻译读框的方式，将两个或多个ORF连接形成连续的较长ORF。因此，重组融合蛋白是包含两个或多个片段的单一蛋白质，所述片段对应原始ORF编码的多肽(这些片段在自然条件下通常不这样连接)。尽管因此阅读框在融合片段中是连续的，但区段仍可被物理或空间分隔，如框内接头序列。例如，编码IMP 和牛痘病毒EEV特异性蛋白的多核苷酸可框内融合，但由编码接头或间隔体的多核苷酸分隔，只要"融合的"开放阅读框被共同翻译成连续多肽的部分即可。
本文所用的术语“血细胞凝集素标签”或“HA标签”是源自人流感血细胞凝集素表面糖蛋白(HA)的蛋白质(对应于氨基酸98-106)。HA标签被广泛用作表达载体中的表位标签。重组蛋白可被工程改造以表达HA标签，其似乎不干扰重组蛋白的生物活性或生物分布。该标签促进对感兴趣的蛋白质的检测、分离和纯化。
对于多肽而言，"线性序列"或"序列"是多肽中从氨基或N末端至羧基或C末端的成顺序排列的氨基酸，其中该序列中彼此邻接的氨基酸在该多肽的一级结构中是连续的。
多肽的部分位于在连续的多肽链中出现得较早的多肽的另一部分的“氨基末端”或“N末端”。类似地，多肽的部分位于在连续的多肽链中出现得较晚的多肽的另一部分的“羧基末端”或“C末端”。
本文所用的术语“表达”指基因产生生化物质如多肽的过程。该过程包括在细胞内基因功能存在的任何表现，包括但不限于，基因以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于，基因转录成信使RNA(mRNA)和这类mRNA翻译成多肽。如果所需的最终产物是生化物质(biochemical)，则表达包括产生该生化物质和任何前体。基因的表达产生“基因产物”。本文中所用的基因产物可以是核酸，例如，通过基因转录产生的信使RNA，或由转录本翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰的核酸，例如聚腺苷酸化，或具有翻译后修饰的多肽，如甲基化、糖基化、加入脂质、连接其它蛋白质亚基、经蛋白酶水解切割等。
术语“真核细胞”或“真核生物(体)”意在涵盖动物、植物和原生生物中的所有生物体，包括原生动物、真菌、酵母、绿藻、单细胞植物、多细胞植物和所有动物(脊椎动物和无脊椎动物)。该术语不涵盖细菌或病毒。“真核细胞”意在涵盖单数“真核细胞”以及复数“真核细胞”，且包含源自真核细胞的细胞。
术语“脊椎动物”意在涵盖含单数“脊椎动物”以及复数“脊椎动物”且包括哺乳动物和鸟，以及鱼、爬行类和两栖类。
术语“哺乳动物”意在涵盖单数“哺乳动物”和复数“哺乳动物”，且包括但不限于人；灵长类例如猿，猴子，猩猩和黑猩猩；犬类如狗和狼；猫科动物如猫，狮子和老虎；马科动物如马，驴，斑马，食用动物如牛，猪，羊；有蹄类动物如鹿和长颈鹿；啮齿动物如老鼠，大鼠，仓鼠和豚鼠；和熊。在某些方面中，哺乳动物是人对象。
术语“组织培养(物)”或“细胞培养(物)”或“培养物”或“培养”指植物或动物组织或细胞在允许细胞结构、细胞功能保持、进一步分化或全部三者的条件下的体外维持或生长。“原代组织细胞”是直接取自组织的那些细胞，也即，发挥器官中相同功能的相同种类的细胞群。在将它们接种到培养板上时，用蛋白水解酶胰蛋白酶处理这些组织细胞，例如，使它们解离成生长或维持细胞结构的个体原代组织细胞。由组织培养中的原代细胞的复制而产生的细胞培养物称作“次生细胞培养物”。大多数次生细胞分裂有限次数，随后死亡。然而，少数次生细胞，可通过该“危机阶段”，在这之后它们能够无限增殖以形成连续“细胞系”。其中培养细胞的液体培养基在本文中称作“培养基”或“培养介质”。在其中培养细胞的过程中，其中分泌有所需分子，例如，病毒或蛋白质，例如，免疫球蛋白分子，的培养基可称作“条件培养基”。
本文所用的术语“鉴定”指这样的方法，其中将所需分子，例如，编码具有所需特点或功能的感兴趣蛋白质的多肽，从多种此类分子或此类分子的文库区分出来。鉴定方法包括“选择”和“筛选”或“淘选”。本文所用的“选择”方法是其中所需分子可从文库直接分离的那些，例如，通过耐药性。本文所用的“筛选”或“淘选”方法是其中使包含所需分子的汇集体(pool)经历其中所需分子可被检测的测定的那些。然后，将其中分子被检测的汇集体的等分物分成逐级更小的汇集体，对它们进行同样的测定，直至获得所需分子高度富集的汇集体。
痘病毒，例如，牛痘病毒EEV载体
本文提供的IMP融合蛋白在痘病毒载体(例如，牛痘病毒载体)中产生。术语“痘病毒”包括痘病毒科(Poxviridae)家族的任何成员。参见例如，B.Moss，刊于：《病毒学》(Virology)，第2版，B.N.Fields，D.M.Knipe等编，瑞文出版社(Raven Press)，第2080页(1990)。正痘病毒属包括，例如，牛痘病毒，天花病毒(引起天花的病毒)，和浣熊痘病毒。牛痘病毒是典型的正痘病毒，且已被开发且成熟表征为用于表达异源蛋白的载体。
其中痘病毒载体(尤其是牛痘病毒载体)被用以表达本文提供的IMP融合蛋白的那些实施方式中，可采用任何合适的痘病毒载体。在一些方面中，编码IMP 融合蛋白的基因的位置可处于对于病毒生长和复制非必需的载体区域中，从而产生感染性病毒。尽管已经表征了牛痘病毒基因组的多个非必需区域，用于插入外来基因的最广泛应用的基因座是胸苷激酶基因座，其位于该基因组的 HindIII J片段中。在某些牛痘病毒载体中，tk基因座已经工程改造以包含一个或两个独特限制性内切酶位点，允许方便使用三分子重组方法重组病毒生成，如本文他处所述。
编码本文提供的IMP融合蛋白的多肽可被插入痘病毒载体(尤其是牛痘病毒载体)中，与转录控制区域操作性地联合，该转录控制区域在痘病毒感染的细胞的胞质中发挥功能。
痘病毒转录控制区域包含启动子和转录终止信号。痘病毒中的基因表达随时间调节，且早期、中期和晚期基因的启动子含不同结构。某些痘病毒基因是组成型表达的，且用于这些“早期-晚期”基因的启动子含有杂合结构。已开发出合成的早期-晚期启动子。用于表达本文提供的IMP融合蛋白的合适的痘病毒启动子包括但不限于，晚期启动子如7.5-kD启动子，MIL启动子，37-kD启动子， 11-kD启动子，11L启动子，12L启动子，13L启动子，15L启动子，17L启动子， 28-kD启动子，H1L启动子，H3L启动子，H5L启动子，H6L启动子，H8L启动子，D11L启动子，D12L启动子，D13L启动子，A1L启动子，A2L启动子，A3L 启动子，和P4b启动子。参见例如，Moss,B.,“痘病毒科和其复制(Poxviridae and their Replication)”，刊于《病毒学》(Virology)，第二版，B.N.Fields、D.M.Knipe 等编，瑞文出版社(Raven Press)，第2090页(1990)。
合适的痘病毒载体包括野生型牛痘病毒，例如，西部保留地(Western Reserve)或WR毒株，或减毒的牛痘病毒，例如，改良的牛痘安卡拉株(MVA) (Mayr,A.等，Infection 3:6-14(1975))。
在其复制周期中，痘病毒(例如，牛痘病毒)产生4种感染性形式，它们在膜结构中有所不同：胞内成熟病毒颗粒(IMV)，胞内包膜病毒颗粒(IEV)，细胞相关的包膜病毒颗粒(CEV)和胞外包膜病毒颗粒(EEV)。普遍观点是，IMV具有单脂蛋白膜，而CEV和EEV均由两层膜包围，且IEV具有3个包膜。EEV从宿主细胞的质膜脱落，且EEV膜源自转运高尔基氏体。
感染后，病毒失去其膜，并且DNA/蛋白质核心沿微管被传输进入细胞。由早期牛痘mRNA(“早期”界定为DNA复制前)编码的蛋白质导致未被覆的牛痘核心以及后续DNA复制。该复制在称为“病毒工厂(viral factory)”之处发生，其基本位于ER顶部。在病毒工厂中，不成熟的病毒颗粒(IV)组装并经加工以形成 IMV(胞内成熟病毒)。IMV包含源自ER的膜。大多数IMV通过细胞裂解由细胞释放。一些IMV在微管上被转运至转运高尔基氏体网络或早期内体的膜包裹位点。IMV颗粒由双层膜包裹，产生一种牛痘形式，称为IEV(胞内带包膜的病毒)。然后，IEV在微管上被转运至细胞表面。外部IEV膜与质膜融合以在细胞表面处暴露CEV(细胞关联的带包膜病毒)。宿主细胞的肌动蛋白聚合能够驱使CEV感染相邻细胞，或该病毒可以EEV形式释放。参见例如，Kim L.Roberts和Geoffrey L.Smith.Trends inMicrobiology 16(10):472-479(2008)；Geoffrey L.Smith,等， Journal of GeneralVirology 83:2915–2931(2002)。
至少6个病毒编码的蛋白质已被报道为EEV包膜膜的组分。这些之中，4个蛋白质(A33R，A34R，A56R和B5R)为糖蛋白，一个(A36R)是非糖基化的跨膜蛋白，而一个(F13L)是棕榈酰化的外周膜蛋白。参见例如，Lorenzo等，Journal of Virology 74(22):10535(2000)。在感染过程中，这些蛋白质定位于高尔基体复合体，它们在那里被纳入感染性病毒，该病毒随后被转运并释放进入胞外介质。本文中提供的IMP融合蛋白以与EEV特异性蛋白(例如，F13L或A56R)的融合蛋白形式被导向至并表达于EEV膜上。
F13L蛋白通过半胱氨酸185和186的棕榈酰化与最外EEV膜的内表面相关联。Smith，Trends in Microbiol.16:472-479(2008)。其中编码F13L的基因缺失的牛痘病毒形成小斑，且产生的EEV数量显著减小。
来自牛痘病毒毒株WR的F13L蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO:1。两个棕榈酰化的半胱氨酸残基(SEQ ID NO:1的氨基酸85和86)带下划线。因为 F13L。
>F13L(SEQ ID NO:1)
MWPFASVPAGAKCRLVETLPENMDFRSDHLTTFECFNEIITLAKKYIYIA SFCCNPLSTTRGALIFDKLKEASEKGIKIIVLLDERGKRNLGELQSHCPDINFIT VNIDKKNNVGLLLGCFWVSDDERCYVGNASFTGGSIHTIKTLGVYSDYPPLA TDLRRRFDTFKAFNSAKNSWLNLCSAACCLPVSTAYHIKNPIGGVFFTDSPEH LLGYSRDLDTDVVIDKLKSAKTSIDIEHLAIVPTTRVDGNSYYWPDIYNSIIEA AINRGVKIRLLVGNWDKNDVYSMATARSLDALCVQNDLSVKVFTIQNNTKL LIVDDEYVHITSANFDGTHYQNHGFVSFNSIDKQLVSEAKKIFERDWVSSHSK SLKI
A56R蛋白是牛痘病毒血细胞凝集素，并且是标准I型整合膜蛋白，其包含氨基-末端胞外(“膜外”)结构域、单一跨膜结构域，和胞质(“膜内”)结构域。A56R 包含约33个氨基酸的N-末端信号肽、从约氨基酸34延伸至约氨基酸103的Ig样结构域、从约氨基酸121延伸至约氨基酸275的茎部区域，从约氨基酸276延伸至约氨基酸303的跨膜结构域，和从约氨基酸304延伸至氨基酸314的胞质(“膜内”) 结构域。参见DeHaven等，J.Gen Virol.92:1971-1980(2011)。A56R示为SEQ ID NO:5。
>A56R(SEQ ID NO:5)
MTRLPILLLLISLVYATPFPQTSKKIGDDATLSCNRNNTNDYVVMSAWY KEPNSIILLAAKSDVLYFDNYTKDKISYDSPYDDLVTTITIKSLTARDAGTYVC AFFMTSTTNDTDKVDYEEYSTELIVNTDSESTIDIILSGSTHSPETSSKKPDYID NSNCSSVFEIATPEPITDNVEDHTDTVTYTSDSINTVSASSGESTTDETPEPITD KEDHTVTDTVSYTTVSTSSGIVTTKSTTDDADLYDTYNDNDTVPPTTVGGST TSISNYKTKDFVEIFGITALIILSAVAIFCITYYIYNKRSRKYKTENKV
本文提供的IMP融合蛋白可在任何合适的牛痘病毒中表达。在某些实施方式中，可将编码EEV融合蛋白的DNA插入对于载体的生长和复制非必需的牛痘病毒基因组的区域，从而产生感染性病毒。尽管已经表征了牛痘病毒基因组的多个非必需区域，用于插入外来基因的最广泛应用的基因座是胸苷激酶基因座，其位于该基因组的HindIII J片段中。本文提供的IMP融合蛋白可被插入牛痘病毒载体，与转录控制区域操作性地联合，该转录控制区域在痘病毒感染的细胞的胞质中发挥功能。
用于本文所述方法的合适的启动子包括但不限于，早期/晚期7.5-kD启动子，或早期/晚期H5启动子(或其变体)。
三分子重组方法
三分子重组，如Zauderer，PCT公开号WO 00/028016和美国专利号7,858,559 中所公开，是一种用于表达感兴趣的蛋白质和/或产生牛痘病毒文库的高效率、产出高效价的方法。三分子重组方法允许以至少90％的效率和比直接连接产生的那些高至少2个数量级的效价产生重组病毒。
在一些方面中，用于牛痘病毒中表达和在本文所述的EEV上展示的IMP融合蛋白可通过三分子重组在痘病毒载体(例如，牛痘病毒载体)中构建。
在某些实施方式中，提供用于IMP融合蛋白在表达EEV中表达的穿梭质粒，其包含侧接牛痘病毒Tk基因中区域的多肽，牛痘病毒H5启动子，和用于插入所需融合蛋白的编码区域的NcoI与BsiWI限制性位点。
整合膜蛋白
本公开内容提供用于表达处于构象完整状态的整合膜蛋白(IMP)的方法，所述构象完整状态接近该蛋白质的自然构象，所述自然构象为该蛋白质在天然表达该蛋白质的细胞中将呈现的构象。根据本公开内容，IMP以痘病毒上表达的痘病毒蛋白(例如，牛痘病毒EEV)的融合蛋白形式表达。本文提供的IMP融合蛋白，当经表达并在EEV表面上展示时，可用作靶抗原，用于筛选结合分子的文库，例如，抗体展示文库。
任何IMP均可根据本文提供的方法被构建为融合蛋白。在一些方面中，IMP 是用于免疫治疗的靶标。在一些方面中，IMP是多次跨膜的IMP，例如CD20或 G蛋白偶联受体(GPCR)。用于构建本文提供的IMP融合蛋白的合适的多次跨膜的人IMP包括但不限于，表1中所列的蛋白质。
表1：示例性人多次跨膜整合膜蛋白
Figure GDA0002015313150000221
Figure GDA0002015313150000231
Figure GDA0002015313150000241
Figure GDA0002015313150000251
Figure GDA0002015313150000261
Figure GDA0002015313150000271
Figure GDA0002015313150000281
Figure GDA0002015313150000291
在一些方面中，多次跨膜的IMP是GPCR，例如，FZD4或CXCR4。在一些方面中，多次跨膜的IMP是CD20。
编码用于在痘病毒EEV上表达的IMP融合蛋白的多肽
本公开内容提供一种分离的多肽，用于在生物膜方面表达构象完整形式的整合膜蛋白或其片段，其为与对牛痘病毒EEV具有特异性的蛋白质或其片段的融合体形式。“构象完整”表示，蛋白质以自然构象或接近自然的构象在生物质脂双层膜中呈现或展示，大致类似于将会以其自然状态呈现的蛋白质。
一方面，本公开内容提供一种分离的多核苷酸，其包括第一核酸片段，该第一核酸片段编码整合膜蛋白(IMP)或其片段，例如，多次跨膜的IMP，其中，该IMP或其片段包含至少一个膜外区域、至少一个跨膜结构域和至少一个膜内区域，并且其中，编码至少一个膜内区域的第一核酸片段的部分位于第一核酸片段的5'或3'端；和，第二核酸片段，该第二核酸片段编码牛痘病毒F13L蛋白 (SEQ ID NO:1)或其功能性片段，其中第二核酸片段框内融合至编码IMP的膜内区域的第一核酸片段的部分。在一些情况中，第一核酸片段和第二核酸片段可由编码接头或其它间隔体的核酸分隔。该多核苷酸还可包括操作性地联合第一和第二核酸片段的痘病毒启动子，以允许该多核苷酸在痘病毒感染的细胞的胞质中表达。根据该方面，包含该多核苷酸的痘病毒感染的细胞可表达IMP-F13L 融合蛋白，作为胞外包膜病毒颗粒(EEV)的包膜外膜的部分。显示IMP以与F13L 的融合体形式表达的示意性说明示于图1B和图1C。
在一些方面中，IMP或其片段可以是多次跨膜蛋白，其包含至少2个，至少 3个，至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，或甚至更多个跨膜(TM)结构域，例如表1中所列那些。
若IMP具有奇数个TM结构域，则IMP的一端(N末端或C末端)将天然位于生物膜的膜外侧，且IMP的另一端将位于IMP的膜内侧。由于F13L蛋白完全处于痘病毒EEV的外膜内部，所以位于膜内部的IMP的末端(N末端或C末端)可融合至F13L。因此，对于IMP，例如其中该蛋白质的N末端位于膜外且C末端位于膜内的典型的7-TM结构域GPCR，F13L的N末端可融合至GPCR的C末端，如图1B 中所示。因此，提供如上所述的多核苷酸，其中第一核酸片段编码具有奇数个跨膜结构域的IMP，其中第一核酸片段的5'端编码膜外区域，且第一核酸片段的3'端编码IMP的膜内区域，后者融合至编码F13L或其片段的核酸片段的5'端。
在示例性的该类型多核苷酸中，第一多核苷酸可编码人卷曲-4蛋白(FZD4) 或其片段，某些人类癌症的免疫治疗靶标，融合至F13L的N末端。因此，提供编码FZD4-F13L融合蛋白的多核苷酸。根据该方面的示例性多核苷酸编码成熟融合蛋白，SEQ ID NO:2的氨基酸20-892，如下所示。该多核苷酸还可编码信号肽，例如，FZD4的信号肽，SEQ ID NO:2的氨基酸1-19。
FZD(FL)-F13L(SEQ ID NO:2)
Figure GDA0002015313150000311
单下划线–前导肽(氨基酸1-19)
粗体–人Fzd4(氨基酸20-520)
斜体–F13L(氨基酸521-892)
在另一示例性该类型多核苷酸中，第一多核苷酸可编码CXC趋化因子受体或其片段，融合至F13L的N末端。CXC趋化因子受体同样是某些人类癌症免疫治疗的靶标。示例性CXC趋化因子受体是CXCR4，或其片段。因此，提供编码 CXC趋化因子受体-F13L融合蛋白(例如，CXCR4-F13L融合蛋白)的多核苷酸。根据该方面的示例性多核苷酸编码如下所示的SEQID NO:3。
CXCR4-F13L(SEQ ID NO:3)
Figure GDA0002015313150000312
Figure GDA0002015313150000321
粗体–人CXCR4(氨基酸1-356)
斜体–F13L(氨基酸357-728)
本领域普通技术人员应明了，具有偶数个跨膜结构域的多次跨膜蛋白将被插入生物膜，从而其N末端及其C末端在该膜的同侧，在该膜的膜外侧上或在该膜的膜内侧上。由于F13L蛋白整个位于痘病毒EEV的膜内侧上，正确地包埋进入该膜的IMP-F13L融合蛋白的形成将需要IMP或其片段的N末端或C末端中至少一个处于该膜内部。若IMP具有偶数个TM结构域且其均处于内部，则F13L 蛋白可融合至IMP的N末端或IMP的C末端。如果全长IMP的定位使得N末端和C 末端均在膜外，则具有奇数个TM结构域的IMP的片段可融合至F13L。
因此，本公开内容提供如上所述的多核苷酸，其编码具有偶数个跨膜结构域的IMP，其中第一核酸片段的5'和3'端编码膜内区域。在一些方面中，编码F13L 的核酸片段的3'端可融合至编码IMP的核酸片段的5'端，在一些方面中，编码 F13L的核酸片段的5'端可融合至编码IMP的核酸片段的3'端。
示例性的该类型IMP是人CD20，4-TM结构域IMP(表达于人B细胞上)，其为B细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的免疫治疗靶标。其中CD20的C末端融合至 F13L的N末端的CD20-F13L融合蛋白的示意图示于图1C。因此，提供了编码 CD20-F13L融合蛋白的多核苷酸。根据该方面的示例性多核苷酸编码如下所示的SEQ ID NO:4。
CD20-F13L(Seq ID NO:4)
Figure GDA0002015313150000322
Figure GDA0002015313150000331
粗体–人CD20(MS4A1)(氨基酸1-298)
斜体–F13L(氨基酸299-669)
在上文提供的多核苷酸中，第一和第二核酸片段可直接融合，或者它们可由编码接头或间隔体或其它多肽片段的核酸片段间隔。在一些方面中，上文提供的多核苷酸还可包括第三核酸片段，其编码异源肽多肽，处于第一和第二核酸片段之间，或在任一侧。该异源肽可以是，例如，接头序列、氨基酸标签或标记物，或促进纯化的肽或多肽序列。在一些方面中，异源肽是6-组氨酸标签，其例如融合至融合蛋白的C末端。
在一些方面中，本文提供的多核苷酸操作性地联合痘病毒启动子。合适的启动子描述于本文他处。在一些方面中，启动子是痘病毒p7.5启动子或痘病毒 H5启动子。
本文提供的多核苷酸可以是痘病毒基因组或可以是痘病毒基因组的部分，其中，该痘病毒基因组，在引入合适的允许的宿主细胞之后，能产生在它们表面上展示IMP-F13L融合蛋白的感染性EEV。在一些方面中，痘病毒基因组是牛痘病毒基因组，例如，牛痘病毒WR基因组或MVA基因组。包含如上所述的多核苷酸的痘病毒基因组可由标准分子生物学和病毒学技术产生，例如通过采用本文所述的三分子重组法。本文提供的痘病毒基因组可被导入允许的细胞，作为重组痘病毒的部分，或作为裸DNA(其伴有合适的辅助病毒，例如，禽痘病毒)。本公开内容还提供重组痘病毒，例如，重组牛痘病毒，其包含本文提供的痘病毒基因组。
IMP-EEV融合蛋白、重组痘病毒EEV和制备方法
本公开内容还提供IMP-F13L融合蛋白，例如，由上述多核苷酸编码的那些。此外，IMP-F13L融合蛋白可在重组痘病毒EEV(例如，重组牛痘病毒EEV)的表面上表达。本公开内容提供包含本文提供的融合蛋白的重组痘病毒EEV(例如，重组牛痘病毒EEV)。重组痘病毒EEV可通过这样的方法产生，其包括，用上文提供的牛痘病毒包含痘病毒基因组感染允许牛痘病毒感染的宿主细胞，和，回收由受感染的宿主细胞释放的EEV。因此，提供由上文所述的多核苷酸编码的 IMP-F13L融合蛋白。
此外，本公开内容提供融合蛋白，该融合蛋白包含IMP或其片段，其可以是多次跨膜的IMP，和单次跨膜的IMP，或甚至仅IMP的胞外结构域(ECD)，其融合至痘病毒蛋白，例如，牛痘病毒蛋白，对EEV具有特异性，例如F13L，A56R， B5R，33R，A34R，或A36R，一种“IMP-EEV融合蛋白”。下文描述示例性ECD 融合蛋白。本文提供的IMP-EEV融合蛋白能够在痘病毒EEV的表面上展示构象完整形式的IMP，例如，多次跨膜的IMP，单次跨膜IMP或IMP的ECD。为在针对特异性结合至靶IMP的抗原结合结构域的筛选抗体展示文库中应用，IMP在痘病毒EEV表面上的展示提供了优于典型地在重组细胞(例如，CHO细胞)表面上展示IMP的多项益处。例如，相比在细胞上的表达，IMP可以更高密度表达于EEV上。此外，相对于可能在细胞表面上表达的数百种蛋白质，EEV在其表面上表达仅约6种不同痘病毒蛋白(例如，F13L，A56R，B5R，33R，A34R和A36R)。最后，本文提供的表达IMP-F13L融合蛋白的失活EEV可被附连至固体支持物，提供方便的文库筛选。
因此，本公开内容提供一种展示处于自然构象的整合膜蛋白(IMP)或其片段的方法，以用于，例如，针对对于IMP具有特异性的抗原结合结构域筛选抗体展示文库。该方法包括：用重组痘病毒感染允许痘病毒感染的宿主细胞，所述重组痘病毒表达与痘病毒EEV特异性蛋白或其膜相关片段的融合蛋白形式的 IMP或其片段，其中由受感染的宿主细胞产生的EEV包含IMP作为EEV包膜外膜的部分；和，回收由所述宿主细胞释放的EEV。IMP。在一些方面中，EEV特异性蛋白或其片段可以是牛痘病毒A33R蛋白，A34R蛋白，A56R蛋白，B5R蛋白，A36R蛋白，F13L蛋白，其任何膜相关片段，或其任何组合。
在一些方面中，EEV特异性蛋白是F13L(SEQ ID NO:1)或其功能性片段，并且融合蛋白可以是由上文提供的多核苷酸表达的一种，例如，其中IMP是包含至少2个，至少3个，至少4个，至少5个，至少6个或至少7个跨膜结构域的多次跨膜蛋白。
在一些方面中，膜相关EEV特异性蛋白片段包括牛痘病毒A56R蛋白的茎部、跨膜和膜内结构域，包含或由或基本由如下部分组成的片段：SEQ ID NO:5 的氨基酸108-314。若干示例性融合伴侣之一包括人FZD4的ECD，其以粗体示于下方SEQ ID NO:6。根据该示例性方面，本公开内容提供一种在痘病毒EEV 的表面上展示人FZD4的构象完整片段的方法，其包括：用编码融合蛋白的重组痘病毒感染允许痘病毒感染的宿主细胞，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸20-370。在一些方面中，所述融合蛋白还可包含信号肽，例如，SEQ IDNO:6 的氨基酸1-19。
FZD-ECD-A56R(Seq ID NO:6)
Figure GDA0002015313150000351
单下划线–前导肽(氨基酸1-19)
粗体–人FZD4胞外结构域(氨基酸20-163)
斜体–A56R茎部、跨膜和膜内(氨基酸164-370)
另一示例性融合伴侣包括人ErbB2(Her2)的ECD，以粗体示于下方SEQ ID NO:7中。根据该示例性方面，本公开内容提供一种在痘病毒EEV的表面上展示人Her2的构象完整片段的方法，其包括：用编码融合蛋白的重组痘病毒感染允许痘病毒感染的宿主细胞，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:7的氨基酸20-855。在一些方面中，所述融合蛋白还可包含信号肽，例如，SEQ ID NO:7的氨基酸 1-19。
Her2-A56R(SEQ ID NO:7)
Figure GDA0002015313150000352
Figure GDA0002015313150000361
单下划线–前导肽(氨基酸1-19)
粗体–人ERBB2(HER2)胞外结构域(氨基酸20-648)
斜体–A56R茎部、跨膜和膜内(氨基酸649-855)
另一示例性融合伴侣包括人CD100(轴突导向因子4D)的ECD，其以粗体示于下方SEQ ID NO:8中。根据该示例性方面，本公开内容提供一种在痘病毒EEV 的表面上展示人CD100的构象完整片段的方法，其包括：用编码融合蛋白的重组痘病毒感染允许痘病毒感染的宿主细胞，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸20-935。在一些方面中，所述融合蛋白还可包含信号肽，例如，SEQ ID NO:8的氨基酸1-19。
CD100-A56R(SEQ ID NO:8)
Figure GDA0002015313150000362
Figure GDA0002015313150000371
单下划线–前导肽(氨基酸1-19)
粗体–人CD100胞外结构域(氨基酸20-728)
斜体–A56R茎部、跨膜和膜内(氨基酸729-935)
在一些方面中，膜相关EEV特异性蛋白片段包括牛痘病毒B5R蛋白的跨膜和膜内结构域，包含、由或基本由如下部分组成的片段：SEQ ID NO:9的氨基酸276-317。在一些方面中，膜相关EEV特异性蛋白片段包括牛痘病毒B5R蛋白的茎部、跨膜和膜内结构域，包含、由或基本由如下部分组成的片段：SEQ ID NO:9的氨基酸238-317。
SEQ ID NO:9:WR B5R蛋白
MKTISVVTLLCVLPAVVYSTCTVPTMNNAKLTSTETSFNDKQKVTFTCD QGYHSSDPNAVCETDKWKYENPCKKMCTVSDYISELYNKPLYEVNSTMTLS CNGETKYFRCEEKNGNTSWNDTVTCPNAECQPLQLEHGSCQPVKEKYSFGE YMTINCDVGYEVIGASYISCTANSWNVIPSCQQKCDMPSLSNGLISGSTFSIG GVIHLSCKSGFTLTGSPSSTCIDGKWNPVLPICVRTNEEFDPVDDGPDDETDL SKLSKDVVQYEQEIESLEATYHIIIVALTIMGVIFLISVIVLVCSCDKNNDQYKF HKLLP
在某些示例性方面中，B5R片段的IMP融合伴侣包含人FZD4的胞外结构域，其以粗体示于下文中的SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11中。根据该示例性方面，本公开内容提供一种在痘病毒EEV的表面上展示人FZD4的构象完整片段的方法，其包括：用编码融合蛋白的重组痘病毒感染允许痘病毒感染的宿主细胞，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸20-243或SEQ ID NO:11的氨基酸 20-281。在一些方面中，所述融合蛋白还可包含信号肽，例如，SEQ ID NO:10 的氨基酸1-19。
FZD-B5R(短)(SEQ ID NO:10)
Figure GDA0002015313150000381
单下划线–前导肽(氨基酸1-19)
粗体–人FZD4胞外结构域(氨基酸20-200)
斜体–B5R TM和胞质尾(氨基酸201-243)
FZD-B5R(长)(SEQ ID NO:11)
Figure GDA0002015313150000382
单下划线–前导肽(氨基酸1-19)
粗体–人FZD4胞外结构域(氨基酸20-200)
斜体–B5R茎部、TM和胞质尾(氨基酸201-281)
本公开内容还提供融合蛋白，其包含：SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:2的氨基酸20-892；SEQ ID NO:6的氨基酸20-370；SEQ ID NO:7的氨基酸20-855；SEQ ID NO:8的氨基酸20-935；SEQ ID NO:10的氨基酸20-243；或SEQ ID NO:11的氨基酸20-281，其任何组合，其任何片段，或其任何变体，其中该融合蛋白，在由重组痘病毒表达时，以自然构象呈现于痘病毒胞外包膜病毒颗粒(EEV)的表面上。
还提供包含任何本文提供的EEV融合蛋白的重组痘病毒EEV。
选择抗体的方法
本公开内容还提供选择结合分子的方法，所述结合分子例如，抗体，抗原结合性抗体片段，或抗体样结合分子，其结合至感兴趣的多次跨膜蛋白。该方法包括：将本文提供的重组EEV附连至固体支持物，其中，该重组EEV能够在其表面上展示多次跨膜的蛋白质；提供展示文库，例如，抗体展示文库，其中该文库包含展示多个抗原结合结构域的展示包装物；使展示文库与EEV接触，从而展示特异性结合至EEV上表达的IMP的抗原结合结构域的展示包装物能够与之结合；回收未结合的展示包装物；和，回收展示对于EEV上表达的IMP具有特异性的抗原结合结构域的展示包装物。
包含多个结合结构域(例如，抗体，抗体样分子或其它结合分子)的任何展示文库均适于该方法。例如，展示文库可以是噬菌体展示文库、酵母展示文库或如本文他处所述在牛痘病毒载体中构建的文库。
在一些方面中，重组EEV可在附连于固体支持物之前失活。例如，EEV可通过在UV辐照下与补骨脂素(三甲沙林，4'-氨基甲基-，盐酸盐)孵育而失活。
可采用任何合适的固体支持物。本文所用的“固体支持物”是能够结合EEV 的任何支持物，起可以具有本领域中已知的多种形式中的任一种。熟知的支持物包括组织培养塑料，玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龙，淀粉酶，天然和改性纤维素，聚丙烯酰胺，辉长岩和磁铁矿。出于本公开内容的目的，运载体的性质可以是一定程度可溶的或是不可溶的。支持物材料实际上可以具有任何结构构造，只要偶联的EEV能够结合展示的结合分子例如抗体即可。因此，支持物构造可以是球形的，如珠，或圆柱形，如在试管的内表面中，或杆的外表面。或者，该表面可以是平面，例如片层，测试条等。典型的支持物包括珠，例如，磁性聚苯乙烯珠例如
Figure GDA0002015313150000391
其可通过磁体从悬浮液中引出。支持物构造可包括管，珠，微珠，孔，板，组织培养板，培养皿，微孔板，微量滴定板，培养瓶，棒，条，小瓶，桨等。固体支持物可以是磁性或非磁性的。本领域技术人员应知晓用于结合本文提供的EEV的许多其它合适的载体，或将能够容易地确定它们。在一些方面中，本文提供的EEV可通过与例如附连至该表面的甲苯磺酰基(tosyl)基团(例如对甲苯磺酰基)、环氧基基团、羧酸基团或氨基基团反应而被附连至固体支持物。例如，EEV可被附连至甲苯磺酰基-活化的磁珠(例如，MYONETM甲苯磺酰基活化的珠)的表面。或者，EEV可以是生物素化的，且附连至链酶亲和素固体表面，例如，链酶亲和素被覆的磁珠。
***
除非另有说明，本发明将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，Sambrook等编(1989) Molecular Cloning A LaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版；冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press))；Sambrook等编 (1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，(纽约州的冷泉港实验室出版社(Cold Springs HarborLaboratory，NY))；D.N. Glover编，(1985)DNA Cloning(《DNA克隆》)，第I和II卷；Gait编(1984) Oligonucleotide Synthesis(《寡核苷酸合成》)；Mullis等，美国专利号4,683,195； Hames和Higgins编(1984)Nucleic Acid Hybridization(《核酸杂交》)；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation(《转录和翻译》)；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(《动物细胞培养》)(ARL公司(Alan R.Liss，Inc.))；Immobilized Cells And Enzymes(《固定的细胞和酶》)(IRL出版社)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning(《分子克隆实践指南》)；论文，Methods In Enzymology(《酶学方法》)(学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，纽约州)；Miller和Calos编(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(《哺乳动物细胞的转基因载体》)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory))；Wu等编，Methods In Enzymology(《酶学方法》)，第154和155卷； Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》)(学术出版社(Academic Press)，伦敦)；Weir和Blackwell编(1986)HandbookOf Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，第I-IV卷；Manipulating the MouseEmbryo(《小鼠胚胎操作》)，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，(1986)；和Ausubel等(1989)Current Protocolsin Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(马里兰州巴尔的摩的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，Baltimore，Md.))。
抗体工程的一般原理可参见Borrebaeck编(1995)《抗体工程(AntibodyEngineering)》(第2版；牛津大学出版社(Oxford Univ.Press))。蛋白质工程的一般原理可参见Rickwood等编(1995)Protein Engineering，A Practical Approach(《蛋白质工程，实践方法》)，(英国牛津的牛津大学出版社的IRL出版公司(IRL Press at OxfordUniv.Press，Oxford，Eng.))。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理可参见：Nisonoff(1984)Molecular Immunology(《分子免疫学》)(第2版；马萨诸塞州桑德兰的辛奥尔联合公司(Sinauer Associates， Sunderland，Mass.))；和Steward(1984)Antibodies,TheirStructure and Function(《抗体的结构和功能》)(Chapman和Hall，纽约州纽约市)。此外，本领域已知且没有具体描述的免疫学标准方法可按照下述文献所述进行：CurrentProtocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》)，纽约州的约翰韦利父子公司(JohnWiley&Sons)；Stites等编(1994)Basic and Clinical Immunology(《基础和临床免疫学》)(第8版；Appleton和Lange，康涅狄格州的诺沃克(Norwalk， Conn.))和Mishell和Shiigi(编)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(《细胞免疫学的选用方法》)(W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Co)，纽约州)。
列出免疫学通用原理的标准参考文献包括：Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》)，约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州；Klein(1982)J.，Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination(《免疫学：自身-非自身区别的科学》)(约翰韦利父子公司，纽约州)；Kennett等编(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(《单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新领域》)(普莱努公司(Plenum Press)，纽约州)；Campbell(1984)"MonoclonalAntibody Technology"in Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology"(《生化和分子生物学实验室技术》中的“单克隆抗体技术”)，Burden等编(的埃尔斯威尔公司(Elsevere)，阿姆斯特丹)；Goldsby等编(2000)Kuby Immunnology(《库比免疫学》)(第4版；H.弗里曼公司(H.Freemand&Co.))； Roitt等(2001)Immunology(《免疫学》)(第6版；伦敦：摩兹比公司(Mosby))； Abbas等(2005)Cellular and MolecularImmunology(《细胞和分子免疫学》)(第5 版；埃尔斯威尔健康科学分公司(ElsevierHealth Sciences Division))；Kontermann和Dubel(2001)Antibody Engineering(《抗体工程》)(施普林格公司(Springer Verlag))；Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(冷泉港出版社(Cold SpringHarbor Press))； Lewin(2003)Gene VIII(《基因VIII》)(普伦蒂斯霍尔出版社(PrenticeHall) 2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)(冷泉港出版社)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(《PCR引物》)(冷泉港出版社)。
将上文中引用的所有参考文献以及其中引用的所有参考文献通过引用全文纳入本文。通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。
实施例
实施例1：融合蛋白构建
通过如下方法，将IMP引入牛痘病毒EEV，采用EEV特异性蛋白F13L、A56R 和B5R。一般而言，HER2、CD100(轴突导向因子4D)和FZD4的胞外结构域，以与单次跨膜EEV特异性膜蛋白A56R和B5R的融合体的形式引入，如图1A所示意。成熟FZD4-ECD-A56R融合蛋白包含SEQID NO:6的氨基酸20-370，成熟 HER2-ECD-A56R融合蛋白包含SEQ ID NO:7的氨基酸20-855，而成熟 CD100-ECD-A56R融合蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸20-935。图1B和图1C示意性地显示多次跨膜的蛋白例如GPCR和CD20能通过何种方式引入EEV，作为多次跨膜蛋白，以与EEV膜相关蛋白F13L的融合体的形式。
F13L融合蛋白(FZD4-F13L、CD20-F13L和CXCR4-F13L)的制备
将编码IMP的cDNA框内克隆至编码棕榈酰化的EEV膜糖蛋白的牛痘病毒 F13L(SEQID NO:1)进入先前描述用于引入牛痘病毒的pJEM1质粒。pJEM1是美国专利申请公开号2013/0288927中描述的p7.5/tk的衍生物，且当用NcoI或BssHII 和BsiWI消化时，包含能够与牛痘病毒TK基因和牛痘病毒H5启动子同源重组的侧接区域。
按照标准方案采用SOE(重叠延伸剪接技术)PCR，将人膜蛋白MS4A1基因 (CD20)(NM_021950.3)的开放阅读框与牛痘病毒F13L框内克隆，由此，限制性核酸内切酶位点NcoI和BsiWI被添加至PCR产物(通过分别将它们编码成最5'和最3'的侧接引物)。该策略避免了前导肽的引入。最终PCR产物和pJEM1用NcoI 和BsiWI消化，并根据标准方案将两个片段通过连接接合。然后，通过化学转化将环化质粒引入感受态大肠杆菌，并在含氨苄霉素的琼脂平板上选择集落。
Figure GDA0002015313150000421
Figure GDA0002015313150000431
由多核苷酸编码所得CD20-F13L融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。
按照标准方案采用SOE(重叠延伸剪接技术)PCR，将人膜蛋白 FZD4(NM_012193.3)的开放阅读框与牛痘病毒F13L框内克隆，由此，限制性核酸内切酶位点BssHII和BsiWI被添加至PCR产物(通过分别将它们编码成最5'和最3'的侧接引物)。该策略提供pJEM1中所含前导肽的应用。最终PCR产物和 pJEM1用BssHII和BsiWI消化，并根据标准方案将两个片段通过连接接合。然后，通过化学转化将环化质粒引入感受态大肠杆菌，并在含氨苄霉素的琼脂平板上选择集落。PCR引物对FZD4和F13L具有特异性，并按照对于MS4A1所描述的相同通用策略进行。由多核苷酸编码所得的成熟FZD4-F13L融合蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸20-892。
按照标准方案采用SOE(重叠延伸剪接技术)PCR，将人膜蛋白CXCR4 (NM_001008540.1)的开放阅读框与牛痘病毒F13L框内克隆，由此，限制性核酸内切酶位点NcoI和BsiWI被添加至PCR产物(通过分别将它们编码成最5'和最3' 的侧接引物)。该策略避免了前导肽的引入。最终PCR产物和pJEM1用NcoI和 BsiWI消化，并根据标准方案将两个片段通过连接接合。然后，通过化学转化将环化质粒引入感受态大肠杆菌，并在含氨苄霉素的琼脂平板上选择集落。PCR 引物对CXCR4和F13L具有特异性，并按照对于MS4A1所描述的相同通用策略进行。由多核苷酸编码所得的CXCR4-F13L融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
如上所述产生的质粒，以及编码CD20，FZD4，CXCR4，CD100和HER2 的非融合(“不带标签”)形式的相似质粒，经线性化并通过三分子重组引入牛痘病毒。
实施例2：CD20-F13L融合蛋白在EEV上的表达
BHK细胞用编码CD20-F13L融合蛋白(SEQ ID NO:4)的IMV或对照西部保留地(WR)病毒以1病毒/细胞的感染复数(MOI)感染两天，然后通过低速离心收获含EEV的上清液并移除碎片。蛋白G
Figure GDA0002015313150000441
(110μL)用磁体拉下，并向珠添加1mL的PBS+20μg的纯化抗CD20抗体。溶液在柔和振荡下室温孵育30-60分钟，以允许抗体偶联至蛋白G珠。将10μg的纯化的mIgG1同种型对照添加至该溶液以确保完全封闭，然后使该溶液在柔和振荡下室温孵育另10-30 分钟。珠用磁体拉下，用1mL的PBS清洗一次，并在110μL的PBS重悬。
50μL的抗CD20-Pro G
Figure GDA0002015313150000442
添加至1mL的CD20-F13L或WR EEV上清液，并且在柔和振荡下室温孵育1小时。珠用磁体沉淀，然后移出未结合的上清液。然后，珠用补充有10％FBS和1mM HEPES(10％DMEM)的1mL 的杜氏改良依氏培养基(DMEM)培养基清洗5次。将全部清洗物与未结合的上清液(“未结合的”)汇集。然后，将珠(“结合的”)重悬于1mL的10％DMEM中。“未结合的”和“结合的”在BSC-1细胞上滴定，并用含甲基纤维素的生长培养基覆盖。允许斑形成两天，然后固定细胞并用0.1％结晶紫溶液对其染色。斑经计数以确定“未结合的”和“结合的”中的斑形成单位(pfu)的数量，由此可计算结合至珠的EEV的百分比(％)。结果显示于表2。
表2：CD20-F13L EEV结合
EEV上清液 ％结合的
西部保留地 10.8％
CD20-F13L 50.5％
CD20-F13L EEV融合蛋白的结合至抗CD20被覆的珠的EEV百分比(％)显著高于西部保留地的情况，表明CD20表达于EEV膜表面。
实施例3：CD20与F13L的融合更高效地表达于EEV膜上
BHK细胞用编码CD20-F13L融合蛋白(SEQ ID NO:4)，CD20-A56R融合蛋白 (SEQ IDNO:16)，CD20不带标签的(未融合的)或对照HER2-A56R胞外结构域 (ECD)(SEQ ID NO:7)病毒的IMV以MOI＝1感染两天，之后通过低速离心收获含 EEV的上清液并移除碎片。链酶亲和素
Figure GDA0002015313150000444
(200μL)用磁体拉下，并且向珠添加0.2mL的PBS+20μg的纯化的生物素化的抗CD20抗体或生物素化的抗HER2。溶液在柔和振荡下室温孵育30分钟，以允许抗体偶联至链酶亲和素珠。珠用磁体拉下，用1mL的PBS清洗一次，并在200μL的PBS重悬。
CD20-A56R：(SEQ ID NO:16)
Figure GDA0002015313150000443
Figure GDA0002015313150000451
单下划线–信号序列(氨基酸1-19)
斜体–截短的A56R(氨基酸20-190)
粗体–CD20序列(氨基酸191-506)
50μL的经制备的链酶亲和素珠添加至1mL的各EEV上清液，并允许室温旋转45分钟。珠用磁体拉下，然后移出未结合的上清液。然后，珠用补充有10％FBS和1mM HEPES(10％DMEM)的1mL的DMEM培养基清洗5次。将全部清洗物与未结合的上清液(“未结合的”)汇集。然后，将珠(“结合的”)重悬于1mL的 10％DMEM中。“未结合的”和“结合的”在BSC-1细胞上滴定，并用含甲基纤维素的生长培养基覆盖。允许斑形成两天，然后固定细胞并用0.1％结晶紫溶液对其染色。斑经计数以确定“未结合的”和“结合的”中的斑形成单位(pfu)的数量，由此可计算结合至珠的EEV的百分比(％)。结果示于图2。
CD20-F13L的结合至抗CD20被覆的珠的EEV百分比(％)高于不带标签的 (未融合的)或A56R-融合的CD20的EEV结合百分比(％)，表明CD20-F13L在EEV 膜上的更高表达。与抗HER2被覆的珠的结合之缺乏证实该试验的特异性。
上述试验采用CD20-F13L融合蛋白(SEQ ID NO:4)，CD20不带标签的(未融合的)，FZD-F13L融合蛋白(SEQ ID NO:2)，和FZD不带标签的(未融合的)重复。如上所述，病毒用抗CD20或抗FZD被覆的珠沉下。图3A中的数据(抗CD20-被覆的珠)和图3B中的数据(抗FZD-被覆的珠)显示，F13L融合蛋白被其对应抗体显著沉下，并且被更高效地引入牛痘病毒，相比不带标签的(未融合的)蛋白。
实施例4：牛痘病毒可经工程改造以表达多种抗原-EEV构建体
BHK细胞以MOI＝1用表达下述抗原构建体的病毒感染：CD20-F13L(SEQ ID NO:4)，CXCR4-F13L(SEQ ID NO:3)，HER2-ECD-A56R(SEQ ID NO:7)和CD100-ECD-A56R(SEQ ID NO:8)。两天后，通过低速离心收获含EEV的上清液并移除碎片。链酶亲和素
Figure GDA0002015313150000462
用磁体拉下，且对于各样品，50μL的珠重悬于0.1mL的PBS+5μg的纯化的生物素化的抗CD20抗体，生物素化的抗 CXCR4(12G5)，生物素化的抗CD100(2503)，或生物素化的抗HER2。溶液在柔和振荡下室温孵育30分钟，以允许抗体偶联至链酶亲和素珠。珠用磁体拉下，用1mL的PBS/样品清洗一次，并在100μL的PBS重悬。
100μL的经制备的链酶亲和素珠添加至1mL的各EEV上清液，并允许室温旋转45分钟。珠用磁体拉下，然后移出未结合的上清液。然后，珠用补充有10％ FBS和1mM HEPES(10％DMEM)的1mL的DMEM培养基清洗5次。将全部清洗物与未结合的上清液(“未结合的”)汇集。然后，将珠(“结合的”)重悬于1mL的 10％DMEM中。“未结合的”和“结合的”在BSC-1细胞上滴定，并用含甲基纤维素的生长培养基覆盖。允许斑形成两天，然后固定细胞并用0.1％结晶紫溶液对其染色。斑经计数以确定“未结合的”和“结合的”中的斑形成单位(pfu)的数量，由此可计算结合至珠的EEV的百分比(％)。结果示于图4。
所有抗原-EEV均特异性结合至其对应抗体偶联珠，表明抗原在EEV膜上的高效表达。
实施例5：抗原-EEV可直接偶联至磁珠以供抗体选择
BHK细胞(2x 108个细胞)以MOI＝1用表达HER2-ECD-A56R(SEQ ID NO:7)，FZD-F13L(SEQ ID NO:2)，CXCR4-F13L(SEQ ID NO:3)或CD100(轴突导向因子4D)-ECD-A56R(SEQID NO:8)的病毒各在一个cellSTACK细胞培养箱 (Corning公司)中感染。两天后，通过低速离心收获含EEV的上清液并移除碎片。然后，澄清的上清液以13,000rpm(28,000x g)离心1小时以沉淀抗原-EEV。吸出上清液，并使沉淀重悬于1.5mL的1X PBS中。将各种病毒转移至新鲜管中，并添加补骨脂素(三甲沙林，4'-氨基甲基-，盐酸盐；Sigma公司)至20μg/ml终浓度。EEV和补骨脂素室温孵育10分钟，然后在
Figure GDA0002015313150000463
UV Crosslinker(Stratagene公司)中辐照99,999微焦耳。补骨脂素/UV处理确保抗原 -EEV失活，由此无法形成斑或在任何下游测试中复制/增殖。
甲苯磺酰基活化的MyOne
Figure GDA0002015313150000461
(100μL)用磁体拉下，并用1mL 的PBS清洗。珠用磁体拉下，移除PBS，并向分开的珠等分添加1mL的各补骨脂素/UV失活的抗原-EEV。允许珠和抗原-EEV在37℃旋转16-20小时。使珠沉淀并移除上清液。珠用1mL的1X PBS，10％FBS和0.5％BSA在37℃封闭1小时。使珠沉淀并用1mL 1X PBS清洗，然后在200μL的1XPBS中重悬。
将100微升的抗原-EEV偶联的珠添加至1mL的表达抗FZD4，抗CXCR4，抗CD100或抗HER2的各对应抗体-EEV上清液，以及添加至对照抗体-EEV。抗体EEV通过用编码对应抗体的重链和轻链的牛痘病毒各以MOI＝1感染BHK细胞2天，然后通过低速离心移除任何细胞并收获上清液来产生。允许病毒偶联的珠和抗体EEV室温旋转2小时。用磁体使珠沉下，并移出未结合的上清液。然后，珠用补充有10％FBS和1mM HEPES(10％DMEM)的1mL的DMEM培养基清洗5次。将全部清洗物与未结合的上清液(“未结合的”)汇集。然后，将珠(“结合的”)重悬于1mL的10％DMEM中。“未结合的”和“结合的”在BSC-1细胞上滴定，并用含甲基纤维素的生长培养基覆盖。允许斑形成两天，然后固定细胞并用0.1％结晶紫溶液对其染色。斑经计数以确定“未结合的”和“结合的”中的斑形成单位(pfu)的数量，由此可计算结合至珠的EEV的百分比(％)。该方法的图表示于图5，且结果示于图6A(HER2)，图6B(FZD4)，图6C(CXCR4)和图6D(CD100 (“Sema”))。
表达抗HER2的抗体-EEV由与HER2-ECD-A56R抗原EEV偶联的珠特异性地拉下，表达抗FZD的抗体-EEV由与FZD-F13L抗原EEV偶联的珠特异性地拉下，表达抗CXCR4的抗体-EEV由与CXCR4-F13L抗原EEV偶联的珠特异性地拉下，且表达抗SEMA的抗体-EEV由与Sema-ECD-A56R抗原EEV偶联的珠特异性地拉下。
实施例6：抗体文库筛选
BHK细胞用抗体文库(H-IgG-A56R)和L48(derivative of germline VK1-39)各以MOI＝1在4个cellSTACK细胞培养箱(Corning公司)(2x 108个细胞/培养箱)中感染。抗体文库含有多样的全长IgG形式的重链可变结构域的群，其框内融合至A56R(参见美国专利申请公开号2013-0288927，其通过引用全文的方式纳入本文)。该文库的多样性为约4亿个独立克隆。两天后，通过低速离心收获含EEV 的上清液并移除碎片。然后，澄清的上清液以13,000rpm(28,000x g)离心1小时以沉淀抗体-EEV。抗体-EEV重悬于具有10％FBS的1ml EMEM并贮存于4度待用。为了制备用于淘选的抗原病毒，BHK细胞(2x 108细胞)用表达 FZD4-ECD-A56R(SEQ ID NO:6)的病毒以MOI＝1.5在两个cellSTACK细胞培养箱(Corning公司)中感染。两天后，通过低速离心收获含EEV的上清液并移除碎片。然后，澄清的上清液以13,000rpm(28,000x g)离心1小时以沉淀抗原-EEV。吸出上清液，并使沉淀重悬于1.0mL的1XPBS中。将1mL的FZD4-ECD-A56R EEV转移至新鲜的管，并添加补骨脂素(三甲沙林，4'-氨基甲基-，盐酸盐；Sigma 公司)至40μg/ml终浓度。EEV和补骨脂素室温孵育10分钟，然后在
Figure GDA0002015313150000481
UV Crosslinker(Stratagene公司)中辐照99,999微焦耳。补骨脂素/UV处理确保抗原-EEV失活，由此无法形成斑或在任何下游测试中复制/ 增殖。
甲苯磺酰基活化的MyOne
Figure GDA0002015313150000482
(150μL)用磁体拉下，并用1mL 的PBS清洗两次。珠用磁体拉下，移出PBS，并将1mL的补骨脂素/UV失活的 FZD4-ECD-A56R添加至珠。允许珠和抗原-EEV在37℃旋转18-20小时。使珠沉淀并移除上清液。珠用1mL的1X PBS，10％FBS和0.5％BSA在37℃封闭2小时。使珠沉淀并用1mL 1X PBS清洗，然后在150μL的1XPBS中重悬。
将50微升的FZD4-ECD-A56R偶联的珠添加至1mL的抗体-EEV文库。允许 FZD4-ECD-A56R偶联的珠和抗体EEV室温旋转2小时。珠用磁体拉下，然后移出未结合的上清液。然后，珠用补充有10％FBS和1mM HEPES(10％DMEM) 的1mL的DMEM培养基清洗5次。将全部清洗物与未结合的上清液(“未结合的”) 汇集。然后，将珠(“结合的”)重悬于1mL的10％DMEM中。“未结合的”和“结合的”在BSC-1细胞上滴定，并用含甲基纤维素的生长培养基覆盖。允许斑形成两天，然后固定细胞并用0.1％结晶紫溶液对其染色。剩余的结合的病毒(990μl) 分入5个T175培养瓶(含融合BSC1细胞)中，并允许其在含1mg/ml G418的 DMEM2.5％中扩增3天。然后收获细胞，并通过3个冻融循环使病毒释放，并滴定病毒。
对于第二轮选择(Rd2)，来自第1轮的扩增的重链与新鲜L48共感染至一个cellTACK的BHK中。如上所述收获抗体EEV。对于各轮淘选，新鲜 FZD-ECD-A56R抗原病毒经产生、浓缩、失活并偶联至珠，如上所述。将50微升的FZD4-ECD-A56R偶联的珠添加至1mL抗体-EEV Rd2。允许 FZD4-ECD-A56R偶联的珠和抗体EEV室温旋转2小时。珠用磁体拉下，然后移出未结合的上清液。然后，珠用补充有10％FBS和1mM HEPES(10％DMEM) 的1mL的DMEM培养基清洗5次。将全部清洗物与未结合的上清液(“未结合的”) 汇集。然后，将珠(“结合的”)重悬于1mL的10％DMEM中。“未结合的”和“结合的”在BSC-1细胞上滴定，并用含甲基纤维素的生长培养基覆盖。允许斑形成两天，然后固定细胞并用0.1％结晶紫溶液对其染色。剩余的结合的病毒(990μl) 分入5个T175培养瓶(含融合BSC1细胞)中，并允许其在含1mg/mlG418的 DMEM2.5％中扩增3天。然后收获细胞，并通过3个冻融循环使病毒释放，并滴定病毒。
如上所述进行3个额外淘选循环(Rd3、Rd4和Rd5)。
在6孔板中以moi＝1采用各扩增的VH轮和L48测试第3、4和5轮的由受感染的A431细胞的富集。感染过夜后，细胞经收获并对半分。一半用10μg/ml FZD-His染色，然后用抗His-Dyelight650和抗Fab-FITC染色。另一半用10μg/ml CD100-His(阴性对照)染色，然后用抗His-Dyelight650和抗Fab-FITC染色。图7 中所示数据显示各轮选择中越来越高的富集。将第5轮的抗体亚克隆进入哺乳动物表达载体，待以全长表达可溶IgG并转染(伴随哺乳动物表达载体中的L48)。通过流式细胞术测试上清液中的所得抗体与FZD4转染的CHO细胞的结合，以及不结合至CXCR4转染的CHO细胞。鉴定了特异性结合至FZD的多种抗体。
实施例7：双重标签/抗原EEV可偶联至磁珠
以2种病毒颗粒/细胞感染BHK细胞，其中一种病毒颗粒为血细胞凝集素标签(HA)-A56R(SEQ ID NO:17)且第二种为FZD4-F13L(SEQ ID NO:2)，以产生表达在其表面上HA标签和FZD4抗原两者的EEV，或以1种病毒颗粒/细胞采用各个体病毒感染BHK细胞。两天后，通过低速离心收获含EEV的上清液并移除碎片。蛋白G磁珠(150μL)用磁体拉下，并将1mL的PBS+30μg的纯化的抗FZD4 抗体(C6073)添加至珠。溶液在柔和振荡下室温孵育25分钟，以允许抗体偶联至蛋白G珠。珠用磁体拉下，用1mL的PBS清洗一次，并重悬于300μL的DMEM+ 10％FBS中。抗HA-标签磁珠(ThermoFisher公司，150μl)用磁体拉下，并用1mL 的PBS清洗一次，然后在150μL的PBS中重悬。
HA-A56R(SEQ ID NO:17)
Figure GDA0002015313150000491
单下划线–信号序列(氨基酸1-19)
粗体–HA标签(氨基酸20-29)
斜体–截短的A56R(氨基酸30-235)
将50μL的经制备的抗HA标签珠或100μL的经制备的抗FZD4蛋白G添加至 1mL的各EEV上清液并允许室温旋转60分钟。珠用磁体拉下，然后移出未结合的上清液。然后，珠用补充有10％FBS和1mM HEPES(10％DMEM)的1mL的 DMEM培养基清洗5次。将全部清洗物与未结合的上清液(“未结合的”)汇集。然后，将珠(“结合的”)重悬于1mL的10％DMEM中。“未结合的”和“结合的”在 BSC-1细胞上滴定，并用含甲基纤维素的生长培养基覆盖。允许斑形成两天，然后固定细胞并用0.1％结晶紫溶液对其染色。斑经计数以确定“未结合的”和“结合的”中的斑形成单位(pfu)的数量，由此可计算结合至珠的EEV的百分比 (％)。结果示于图8。表达两种融合蛋白的EEV用各抗体拉下。
实施例8：双重标签/抗原EEV可偶联至磁珠并用以捕获mAb EEV
BHK细胞(2x108细胞)以两种病毒颗粒/细胞感染，其中一种病毒颗粒为 HA-A56R(SEQ ID NO:17)且第二种为CXCR4-F13L(SEQ ID NO:3)，以产生在其表面表达HA标签和CXCR4抗原两者的EEV。两天后，通过低速离心收获含 EEV的上清液并移除碎片。然后，澄清的上清液以13,000rpm(28,000xg)离心1 小时以沉淀标签/抗原-EEV。吸出上清液，并使沉淀重悬于1.0mL的1X PBS中。将补骨脂素(三甲沙林，4'-氨基甲基-，盐酸盐；Sigma公司)添加至40ug/ml终浓度。EEV和补骨脂素室温孵育10分钟，然后在Stratalinker UVCrosslinker(Stratagene公司)中辐照99,999微焦耳，两次。补骨脂素/UV处理确保抗原-EEV失活，由此无法形成斑或在任何下游测试中复制/增殖。
抗CXCR4EEV和抗HER2mAb EEV通过以两种病毒颗粒/细胞感染BHK细胞来产生，其中一种病毒颗粒为特定重链且第二种为特定轻链。两天后，通过低速离心收获含抗CXCR4EEV和抗HER2EEV的上清液并去除碎片。
300微升的抗HA磁珠用1mL的PBS清洗，然后重悬于1毫升的补骨脂素/UV 失活的HA/CXCR4EEV。珠和EEV在柔和振荡下室温孵育90分钟，以允许EEV 与抗HA珠偶联。珠用磁体拉下，用1mL的PBS清洗一次，并在300μL的PBS重悬。
将偶联至抗HA珠的100μL的HA/CXCR4EEV添加至1mL的各mAb EEV上清液，并在柔和振荡下室温孵育1-1.5小时。珠用磁体拉下，然后移出未结合的上清液。然后，珠用补充有10％FBS和1mM HEPES(10％DMEM)的1mL的 DMEM培养基清洗5次。将全部清洗物与未结合的上清液(“未结合的”)汇集。然后，将珠(“结合的”)重悬于1mL的10％DMEM中。“未结合的”和“结合的”在BSC-1细胞上滴定，并用含甲基纤维素的生长培养基覆盖。允许斑形成两天，然后固定细胞并用0.1％结晶紫溶液对其染色。斑经计数以确定“未结合的”和“结合的”中的斑形成单位(pfu)的数量，由此可计算结合至珠的EEV的百分比 (％)。结果示于图9。抗CXCR4EEV被用共表达HA-A45R和CXCR4-F13L的EEV 被覆的珠特异性捕获。
实施例9：抗原-EEV可被生物素化用于与磁珠偶联
BHK细胞用表达FZD4-F13L、FZD4-ECD-A56R或CD20-F13L的病毒以 MOI＝1感染。两天后，通过低速离心收获含EEV的上清液并移除碎片。然后，澄清的上清液以13,000rpm离心1小时以沉淀抗原-EEV。吸出上清液，并使沉淀重悬于1-2mL的1X PBS中。为了生物素化EEV，将2.5μL的1X PBS中的生物素 -XX SSE储液(
Figure GDA0002015313150000511
细胞表面生物素化试剂盒，Molecular Probes 公司)添加至1mL的PBS中的各EEV，并冰上孵育30分钟。添加50μL的1M Tris， pH 8以使各反应淬灭。
为了将生物素-EEV与珠偶联，使150μL的链酶亲和素
Figure GDA0002015313150000512
沉淀，并用1mL的1X PBS对其清洗一次。使珠以150μL重悬，并将50μL添加至1 mL的含有10％FBS和1mMHEPES的伊格尔氏最小必需培养基(EMEM)(10％EMEM)。将50μL的生物素-EEV添加至珠和培养基，并允许室温旋转1小时。珠用磁体拉下，然后移出未结合的上清液。然后，珠用补充有10％FBS和1mM HEPES(10％DMEM)的1mL的DMEM培养基清洗5次。将全部清洗物与未结合的上清液(“未结合的”)汇集。然后，将珠(“结合的”)重悬于1mL的10％DMEM 中。“未结合的”和“结合的”在BSC-1细胞上滴定，并用含甲基纤维素的生长培养基覆盖。允许斑形成两天，然后固定细胞并用0.1％结晶紫溶液对其染色。斑经计数以确定“未结合的”和“结合的”中的斑形成单位(pfu)的数量，由此可计算结合至珠的EEV的百分比(％)。结果示于图10。
抗原-EEV能够被生物素化并偶联至磁性链酶亲和素珠。
Figure IDA0001836995720000011
Figure IDA0001836995720000021
Figure IDA0001836995720000031
Figure IDA0001836995720000041
Figure IDA0001836995720000051
Figure IDA0001836995720000061
Figure IDA0001836995720000071
Figure IDA0001836995720000081
Figure IDA0001836995720000091
Figure IDA0001836995720000101
Figure IDA0001836995720000111
Figure IDA0001836995720000121
Figure IDA0001836995720000131
Figure IDA0001836995720000141
Figure IDA0001836995720000151
Figure IDA0001836995720000161
Figure IDA0001836995720000171
Figure IDA0001836995720000181
Figure IDA0001836995720000191
Figure IDA0001836995720000201
Figure IDA0001836995720000211
Figure IDA0001836995720000221
Figure IDA0001836995720000231
Figure IDA0001836995720000241
Figure IDA0001836995720000251
Figure IDA0001836995720000261
Figure IDA0001836995720000271
Figure IDA0001836995720000281
Figure IDA0001836995720000291
Figure IDA0001836995720000301
Figure IDA0001836995720000311
Figure IDA0001836995720000321
Figure IDA0001836995720000331
Figure IDA0001836995720000341
Figure IDA0001836995720000351
Figure IDA0001836995720000361
Figure IDA0001836995720000371
Figure IDA0001836995720000381
Figure IDA0001836995720000391
Figure IDA0001836995720000401
Figure IDA0001836995720000411
Figure IDA0001836995720000421
Figure IDA0001836995720000431
Figure IDA0001836995720000441

Claims (63)

1.一种分离的多核苷酸，其包含：
(a) 第一核酸片段，其编码整合膜蛋白(IMP)或其片段，其中IMP或其片段包含至少一个膜外区域、至少一个跨膜结构域和至少一个膜内区域，并且其中，编码至少一个膜内区域的第一核酸片段的部分位于第一核酸片段的5'或3'端；和
(b)第二核酸片段，其编码牛痘病毒F13L蛋白，其中第二核酸片段框内融合至编码IMP的膜内区域的第一核酸片段的部分；
其中，包含该多核苷酸的痘病毒感染的细胞能表达IMP-F13L融合蛋白，作为胞外包膜病毒颗粒(EEV)的包膜外膜的部分。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中，F13L蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:1。
3.如权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少2个跨膜结构域。
4.如权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少3个跨膜结构域。
5.如权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少4个跨膜结构域。
6.如权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少5个跨膜结构域。
7.如权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少6个跨膜结构域。
8.如权利要求1或权利要求2所述的多核苷酸，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少7个跨膜结构域。
9.如权利要求3-8中任一项所述的多核苷酸，其中，IMP具有奇数个跨膜结构域，其中第一核酸片段的5'端编码膜外区域，其中第一核酸片段的3'端编码膜内区域，并且其中，第二多核苷酸的5'端融合至第一核酸片段的3'端。
10.如权利要求9所述的多核苷酸，其中，IMP包含G蛋白偶联受体(GPCR)。
11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中，IMP是人卷曲-4蛋白(FZD4)，或其片段。
12. 如权利要求11所述的多核苷酸，其编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸20-892的多肽。
13.如权利要求12所述的多核苷酸，其还包含信号肽。
14. 如权利要求13所述的多核苷酸，其中，信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-19。
15.如权利要求10所述的多核苷酸，其中，IMP是CXC趋化因子受体。
16.如权利要求15所述的多核苷酸，其中，CXC趋化因子受体是CXCR4，或其片段。
17. 如权利要求16所述的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽。
18.如权利要求3-8中任一项所述的多核苷酸，其中，IMP具有偶数个跨膜结构域，并且其中，第一核酸片段的5'和3'端编码膜内区域。
19.如权利要求18所述的多核苷酸，其中，第二核酸片段融合至第一核酸片段的3'端。
20.如权利要求19所述的多核苷酸，其中，IMP是人CD20蛋白，或其片段。
21. 如权利要求20所述的多核苷酸，其编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的蛋白质。
22.如权利要求1所述的多核苷酸，其中，第一和第二核酸片段是直接融合的。
23.如权利要求1所述的多核苷酸，其还包含编码异源肽的第三核酸片段。
24.如权利要求23所述的多核苷酸，其中，该异源肽包含接头序列、氨基酸标签或标记物，或促进纯化的肽或多肽序列。
25.如权利要求24所述的多核苷酸，其中，该异源肽包含组氨酸标签。
26.如权利要求1所述的多核苷酸，其操作性地联合痘病毒启动子。
27.如权利要求26所述的多核苷酸，其中，该痘病毒启动子是p7.5或H5或T7。
28.由权利要求1-27中任一项所述的多核苷酸编码的F13L融合蛋白。
29.一种痘病毒基因组，其包含如权利要求1-27中任一项所述的多核苷酸。
30.如权利要求29所述的痘病毒基因组，其为牛痘病毒基因组。
31.一种重组牛痘病毒EEV，其包含如权利要求30所述的痘病毒基因组。
32. 一种产生如权利要求31所述的重组牛痘病毒EEV的方法，其包括：
(a) 用牛痘病毒感染允许牛痘病毒感染的宿主细胞，所述牛痘病毒包含如权利要求29所述的痘病毒基因组，和
(b)回收由所述宿主细胞释放的EEV。
33.一种展示处于自然构象的整合膜蛋白(IMP)或其片段的方法，其包括：
(a)用重组痘病毒感染允许痘病毒感染的宿主细胞，所述重组痘病毒表达IMP或其片段，该IMP或其片段为与痘病毒EEV特异性蛋白F13L的融合蛋白形式，其中，所述融合蛋白由如权利要求1所述的多核苷酸表达获得，其中，由受感染的宿主细胞产生的EEV包含该IMP融合蛋白作为EEV包膜外膜的部分；
(b) 回收由所述宿主细胞释放的EEV
其中，IMP或其片段以自然构象展示在EEV的表面上。
34. 如权利要求33所述的方法，其中，EEV特异性蛋白是F13L，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示。
35.如权利要求34所述的方法，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少2个跨膜结构域。
36.如权利要求34所述的方法，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少3个跨膜结构域。
37.如权利要求34所述的方法，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少4个跨膜结构域。
38.如权利要求34所述的方法，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少5个跨膜结构域。
39.如权利要求34所述的方法，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少6个跨膜结构域。
40.如权利要求34所述的方法，其中，IMP是多次跨膜蛋白，其包含至少7个跨膜结构域。
41.如权利要求35-40中任一项所述的方法，其中，IMP包含G蛋白偶联受体(GPCR)，其含有7个跨膜结构域，并且其中，F13L融合至IMP的C末端。
42.如权利要求41所述的方法，其中，IMP是人卷曲-4蛋白(FZD4)，或其片段。
43. 如权利要求42所述的方法，其中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸20-892。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述融合蛋白还包含信号肽。
45. 如权利要求44所述的方法，其中，所述信号肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸1-19。
46.如权利要求41所述的方法，其中，IMP是CXC趋化因子受体。
47.如权利要求46所述的方法，其中，CXC趋化因子受体是CXCR4，或其片段。
48. 如权利要求47所述的方法，其中，所述融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
49.如权利要求35-40中任一项所述的方法，其中，IMP或其片段具有偶数个跨膜结构域，并且其中，IMP或其片段的N末端和C末端均在膜内。
50.如权利要求49所述的方法，其中，F13L融合至IMP的C末端。
51.如权利要求50所述的方法，其中，IMP是人CD20，或其片段。
52. 如权利要求51所述的方法，其中，所述融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。
53.一种融合蛋白，其包含：
(a)SEQ ID NO:2的氨基酸20-892；
(b)SEQ ID NO:3；
(c)SEQ ID NO:4；
其中，所述融合蛋白，当由重组痘病毒表达时，以自然构象呈现在痘病毒胞外包膜病毒颗粒(EEV)的表面上。
54.一种重组痘病毒EEV，其包含如权利要求53所述的融合蛋白。
55.一种重组痘病毒EEV，其包含异源IMP或其片段，该异源IMP或其片段融合至痘病毒F13L蛋白，其中，该融合蛋白位于EEV包膜外膜中，其中，IMP或其片段以其自然构象展示在EEV的表面上，其中，所述融合蛋白由如权利要求1所述的多核苷酸表达获得。
56.如权利要求54或权利要求55所述的重组痘病毒EEV，其中，痘病毒EEV是牛痘病毒EEV。
57.一种选择结合至多次跨膜蛋白的抗体的方法，其包括：
(a)使如权利要求31或54-56中任一项所述的重组EEV附连至固体支持物；
(b)提供抗体展示文库，其中，该文库包含展示多个抗原结合结构域的展示包装物；
(c)使展示文库与EEV接触，从而展示包装物能够与之结合，该展示包装物展示特异性结合至EEV上表达的IMP的抗原结合结构域；
(d) 回收未结合的展示包装物；和
(e)回收展示对EEV上表达的IMP具有特异性的抗原结合结构域的展示包装物。
58.如权利要求57所述的方法，其中，重组EEV在附连至固体支持物之前是失活的。
59.如权利要求58所述的方法，其中，EEV通过在UV辐照下与补骨脂素孵育而失活。
60.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中，EEV通过与附连至固体表面的甲苯磺酰基基团反应而附连至该表面。
61.如权利要求60所述的方法，其中，该固体表面是甲苯磺酰基-活化的磁珠。
62.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中，EEV是生物素化的，且附连至链酶亲和素被覆的固体表面。
63.如权利要求62所述的方法，其中，该固体表面是链酶亲和素-被覆的磁珠。
CN201780025118.1A 2016-04-22 2017-04-21 痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示 Active CN109069613B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211138346.9A CN116286909A (zh) 2016-04-22 2017-04-21 痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662326501P 2016-04-22 2016-04-22
US62/326,501 2016-04-22
PCT/US2017/028787 WO2017184951A1 (en) 2016-04-22 2017-04-21 Integral membrane protein display on poxvirus extracellular enveloped virions

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211138346.9A Division CN116286909A (zh) 2016-04-22 2017-04-21 痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109069613A CN109069613A (zh) 2018-12-21
CN109069613B true CN109069613B (zh) 2022-10-04

Family

ID=60116403

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211138346.9A Pending CN116286909A (zh) 2016-04-22 2017-04-21 痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示
CN201780025118.1A Active CN109069613B (zh) 2016-04-22 2017-04-21 痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211138346.9A Pending CN116286909A (zh) 2016-04-22 2017-04-21 痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示

Country Status (19)

Country Link
US (3) US10577427B2 (zh)
EP (2) EP3445397B1 (zh)
JP (2) JP7072521B2 (zh)
KR (1) KR102558637B1 (zh)
CN (2) CN116286909A (zh)
AU (1) AU2017252427B2 (zh)
BR (1) BR112018071686A2 (zh)
CA (1) CA3018990A1 (zh)
DK (1) DK3445397T3 (zh)
ES (1) ES2935585T3 (zh)
FI (1) FI3445397T3 (zh)
IL (1) IL262232B2 (zh)
MX (2) MX2018012818A (zh)
PL (1) PL3445397T3 (zh)
PT (1) PT3445397T (zh)
RU (1) RU2759846C2 (zh)
SG (1) SG11201808554TA (zh)
WO (1) WO2017184951A1 (zh)
ZA (1) ZA201806449B (zh)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8496938B2 (en) 2009-05-08 2013-07-30 Vaccinex, Inc. Anti-CD100 neutralizing neutralizing antibodies and methods of using the same
KR101999872B1 (ko) 2011-10-11 2019-07-12 백시넥스 인코포레이티드 혈뇌 장벽 투과성의 조정에 있어서의 세마포린-4d 결합 분자의 용도
US9708601B2 (en) 2012-04-26 2017-07-18 Vaccinex, Inc. Fusion proteins to facilitate selection of cells infected with specific immunoglobulin gene recombinant vaccinia virus
KR20210104166A (ko) 2013-06-25 2021-08-24 백시넥스 인코포레이티드 종양 성장 및 전이를 억제하기 위한 면역 조절 요법과 병용되는 세마포린-4d 억제성 분자의 용도
NZ630892A (en) 2013-10-21 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treating neurodegenerative disorders
CA3032512A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 Vaccinex, Inc. Improved methods for producing polynucleotide libraries in vaccinia virus/eukaryotic cells
CN109706177A (zh) * 2019-01-24 2019-05-03 浙江省医学科学院 一种重组痘苗病毒表面展示系统载体质粒及应用
JP7456584B2 (ja) * 2019-10-02 2024-03-27 バイオノックス インコーポレイテッド 腫瘍標的化タンパク質又はその断片、それに結合する抗体及びその使用
MX2022013930A (es) 2020-05-06 2022-11-30 Vaccinex Inc Despliegue de la proteina de membrana integral en viriones con envoltura extracelular de poxvirus.
JP2023533813A (ja) * 2020-07-14 2023-08-04 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 一定用量配合剤のアッセイ
KR102419397B1 (ko) * 2021-04-02 2022-07-14 주식회사 바이오녹스 항암바이러스 유래 단백질을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체, 이를 발현하는 면역세포 및 이들의 용도
US20240093177A1 (en) 2022-06-10 2024-03-21 Vaccinex, Inc. Methods to select antibodies specific to complex membrane antigens
WO2024117920A1 (en) * 2022-11-29 2024-06-06 Malcorp Biodiscoveries Limited Novel cd20 protein

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0897980A2 (en) * 1997-08-20 1999-02-24 Smithkline Beecham Corporation CXCR4B: A human splice variant of CXCR4 chemokine receptor
CN104520444A (zh) * 2012-04-26 2015-04-15 瓦西尼斯公司 有助于选择被特定免疫球蛋白基因重组牛痘病毒感染的细胞的融合蛋白
WO2015193143A1 (en) * 2014-06-18 2015-12-23 Morphosys Ag Fusion proteins and uses thereof

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US6218525B1 (en) * 1988-02-25 2001-04-17 The General Hospital Corporation Nucleic acid encoding CD28
US6576754B2 (en) 1995-11-09 2003-06-10 Dana-Farber Cancer Institute CD100 antigen and uses therefor
JP4451987B2 (ja) 1998-11-10 2010-04-14 ユニバーシティー オブ ロチェスター 標的抗原に特異的なｔ細胞ならびにこれに基づく方法およびワクチン
US7198920B1 (en) 1999-01-29 2007-04-03 Corika Corporation HER-2/neu fusion proteins
US20040014033A1 (en) 1999-06-30 2004-01-22 Evotec Biosystems Ag, A Corporation Of Germany Virus like particles, their preparation and their use preferably in pharmaceutical screening and functional genomics
AU6267000A (en) * 1999-06-30 2001-01-22 Evotec Oai Ag Virus like particles, their preparation and their use preferably in pharmaceutical screening and functional genomics
AU2001297872B2 (en) 2000-11-17 2006-11-09 University Of Rochester In vitro methods of producing and identifying immunoglobulin molecules in eukaryotic cells
US7645456B2 (en) * 2001-04-23 2010-01-12 Sanofi Pasteur Biologics Co. Vaccinia virus strains
US20030044409A1 (en) * 2001-05-01 2003-03-06 Carson Dennis A. Immunologic compositions and methods for studying and treating cancers expressing frizzled antigens
US7244592B2 (en) 2002-03-07 2007-07-17 Dyax Corp. Ligand screening and discovery
US20040014034A1 (en) 2002-06-06 2004-01-22 Evans David H Method of producing a recombinant virus
US20060003316A1 (en) * 2002-07-15 2006-01-05 John Simard Immunogenic compositions derived from poxviruses and methods of using same
US9809654B2 (en) 2002-09-27 2017-11-07 Vaccinex, Inc. Targeted CD1d molecules
EP1578367A4 (en) 2002-11-01 2012-05-02 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF IMMUNE DISEASES
EP1442749A1 (en) 2003-01-31 2004-08-04 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Use of anti-CD100 antibodies for the treatment and the diagnosis of inflammatory disorder affecting the central nervous system
JP5042631B2 (ja) 2003-12-04 2012-10-03 バクシネックス インコーポレーティッド アポトーシス腫瘍細胞上に露出した細胞内抗原をターゲッティングすることによって腫瘍細胞を死滅させる方法
JP5226311B2 (ja) 2004-08-27 2013-07-03 アルバート アインシュタイン カレッジ オブ メディシン オブ イエシバ ユニバーシティ 免疫及び自己免疫の調節因子としてのセラミド誘導体
US8022043B2 (en) 2004-08-27 2011-09-20 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Ceramide derivatives as modulators of immunity and autoimmunity
AU2005318999B2 (en) * 2004-12-22 2012-07-19 Genentech, Inc. Methods for producing soluble multi-membrane-spanning proteins
US9382327B2 (en) 2006-10-10 2016-07-05 Vaccinex, Inc. Anti-CD20 antibodies and methods of use
WO2008100995A1 (en) 2007-02-14 2008-08-21 Vaccinex, Inc. Humanized anti-cd100 antibodies
JP5357782B2 (ja) 2007-02-21 2013-12-04 バクシネックス インコーポレーティッド 抗原負荷ＣＤ１ｄ分子によるＮＫＴ細胞活性の調節
US8309088B2 (en) 2007-08-10 2012-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating osteoarthritis with an antibody to NGF
CA2710680C (en) 2007-12-26 2018-10-16 Vaccinex, Inc. Anti-c35 antibody combination therapies and methods
WO2010044919A2 (en) 2008-05-28 2010-04-22 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Smallpox dna vaccine and the antigens therein that elicit an immune response
KR20110137290A (ko) 2009-01-08 2011-12-22 알버트 아인슈타인 컬리지 오브 메디신 오브 예쉬바 유니버시티 세포벽 결합 세라미드 유사 당지질을 갖는 박테리아 백신 및 이의 용도
US8496938B2 (en) 2009-05-08 2013-07-30 Vaccinex, Inc. Anti-CD100 neutralizing neutralizing antibodies and methods of using the same
CA2802376A1 (en) 2010-06-14 2011-12-22 Vaccinex, Inc. Anti-vegf antibodies and uses thereof
WO2012006342A2 (en) 2010-07-07 2012-01-12 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Ceramide-like glycolipid-associated bacterial vaccines and uses thereof
WO2012031099A2 (en) 2010-09-02 2012-03-08 Vaccinex, Inc. Anti-cxcl13 antibodies and methods of using the same
DK2711023T3 (en) 2011-05-13 2017-10-16 Nat Univ Corp Tokyo Medical & Dental Univ osteogenesis
KR101999872B1 (ko) 2011-10-11 2019-07-12 백시넥스 인코포레이티드 혈뇌 장벽 투과성의 조정에 있어서의 세마포린-4d 결합 분자의 용도
US8790652B2 (en) 2011-12-06 2014-07-29 Vaccinex, Inc. Use of the combination of semaphorin-4D inhibitory molecules and VEGF inhibitory molecules to inhibit angiogenesis
EP2820045B1 (en) 2012-03-02 2018-08-22 Vaccinex, Inc. Methods for the treatment of b cell-mediated inflammatory diseases
US9090709B2 (en) 2012-03-28 2015-07-28 Vaccinex, Inc. Anti-SEMA4D antibodies and epitopes
US10494440B2 (en) 2012-05-11 2019-12-03 Vaccinex, Inc. Use of semaphorin-4D binding molecules to promote neurogenesis following stroke
EP2951204B1 (en) 2013-01-31 2019-05-22 Vaccinex, Inc. Methods for increasing immunoglobulin a levels
US9371352B2 (en) 2013-02-08 2016-06-21 Vaccinex, Inc. Modified glycolipids and methods of making and using the same
KR20210104166A (ko) 2013-06-25 2021-08-24 백시넥스 인코포레이티드 종양 성장 및 전이를 억제하기 위한 면역 조절 요법과 병용되는 세마포린-4d 억제성 분자의 용도
NZ630881A (en) 2013-10-10 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treatment of atherosclerosis
NZ630892A (en) 2013-10-21 2016-03-31 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d binding molecules for treating neurodegenerative disorders
CA3032512A1 (en) 2016-08-02 2018-02-08 Vaccinex, Inc. Improved methods for producing polynucleotide libraries in vaccinia virus/eukaryotic cells
BR112019017367A2 (pt) 2017-02-22 2020-04-14 Vaccinex Inc detecção precoce de ativação de célula glial em doenças neurodegenerativas ou neuroinflamatórias
DK3600419T5 (en) 2017-03-20 2024-05-27 Vaccinex Inc Treatment of cancer with a semaphorin-4d antibody in combination with an epigenetic modulating agent
MX2019013110A (es) 2017-05-05 2019-12-16 Vaccinex Inc Anticuerpo anti-semaforina 4d humano.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0897980A2 (en) * 1997-08-20 1999-02-24 Smithkline Beecham Corporation CXCR4B: A human splice variant of CXCR4 chemokine receptor
CN104520444A (zh) * 2012-04-26 2015-04-15 瓦西尼斯公司 有助于选择被特定免疫球蛋白基因重组牛痘病毒感染的细胞的融合蛋白
WO2015193143A1 (en) * 2014-06-18 2015-12-23 Morphosys Ag Fusion proteins and uses thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Murine pneumotropic virus chimeric Her2/neu virus-like particles as prophylactic and therapeutic vaccines against Her2/neu expressing tumors;Kalle Andreasson等;《Int J Cancer》;20090101;第124卷(第1期);第150-156页 *
The formation and function of extracellular enveloped vaccinia virus.;Smith GL等;《J Gen Virol》;20021231;第83卷(第22期);2915-2931 *
Topology of epitope-tagged F13L protein, a major membrane component of extracellular vaccinia virions;Matloob Husain等;《Virology》;20030410;第308卷(第2期);第233-242页 *

Also Published As

Publication number Publication date
SG11201808554TA (en) 2018-11-29
EP4059516A1 (en) 2022-09-21
US10550199B2 (en) 2020-02-04
US10577427B2 (en) 2020-03-03
PT3445397T (pt) 2023-01-13
CN109069613A (zh) 2018-12-21
AU2017252427A8 (en) 2018-11-01
AU2017252427A1 (en) 2018-10-18
IL262232B2 (en) 2024-06-01
CA3018990A1 (en) 2017-10-26
US20200216562A1 (en) 2020-07-09
BR112018071686A2 (pt) 2019-02-19
WO2017184951A1 (en) 2017-10-26
US20190112388A1 (en) 2019-04-18
US20190276556A1 (en) 2019-09-12
RU2018140971A (ru) 2020-05-22
IL262232A (en) 2018-11-29
RU2759846C2 (ru) 2021-11-18
US10870707B2 (en) 2020-12-22
IL262232B1 (en) 2024-02-01
JP2019514367A (ja) 2019-06-06
RU2018140971A3 (zh) 2021-03-10
MX2021013783A (es) 2021-12-10
MX2018012818A (es) 2019-07-04
ES2935585T3 (es) 2023-03-08
KR102558637B1 (ko) 2023-07-24
KR20180135483A (ko) 2018-12-20
EP3445397A1 (en) 2019-02-27
AU2017252427B2 (en) 2023-07-13
EP3445397B1 (en) 2022-11-09
JP2022116013A (ja) 2022-08-09
CN116286909A (zh) 2023-06-23
JP7072521B2 (ja) 2022-05-20
FI3445397T3 (fi) 2023-02-20
ZA201806449B (en) 2023-01-25
PL3445397T3 (pl) 2023-03-20
EP3445397A4 (en) 2019-12-25
DK3445397T3 (da) 2023-02-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109069613B (zh) 痘病毒胞外包膜病毒颗粒上的整合膜蛋白展示
US10662422B2 (en) Method for selecting polynucleotides encoding antigen-specific immunoglobulin subunit
JP7470817B2 (ja) ポックスウイルス細胞外エンベロープビリオン上での膜内在性タンパク質の提示
US20240093177A1 (en) Methods to select antibodies specific to complex membrane antigens
EP3784698A1 (en) Recombinant immunoglobulins of a new igg5 class, encoded by the human heavy chain pseudo-gamma gene

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant