JP7470817B2 - ポックスウイルス細胞外エンベロープビリオン上での膜内在性タンパク質の提示 - Google Patents

ポックスウイルス細胞外エンベロープビリオン上での膜内在性タンパク質の提示 Download PDF

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Description

配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出されている、これによってその全体が参照により組み入れられる配列表を含有する。2021年4月30日に作成された前記ASCIIコピーは、8555_037WO_SL.txtという名称であり、サイズが74,607バイトである。
背景
定義された特異性の抗体が、増大する数の多様な治療応用において使用されている。多数の方法が、ヒト治療用途に有用な抗体を取得するために用いられてきている。これらには、キメラ抗体およびヒト化抗体、ならびに、ライブラリー、例えば、ファージ提示ライブラリーから、またはトランスジェニック動物から選択された完全ヒト抗体が含まれる。バクテリオファージにおいて構築された免疫グロブリンライブラリーは、ナイーブな個体または特異的に免疫化された個体の抗体産生細胞に由来することができ、原則として、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の新たなかつ多様な対形成を含む可能性がある。この戦略は、内因性のレパートリーの限定はこうむらないが、発現した免疫グロブリン断片の相補性決定領域（CDR）が、細菌細胞において適正に合成されてフォールディングされることを必要とする。しかし、多くの抗原結合領域は、細菌細胞において融合タンパク質として正確にアセンブルすることが難しい。加えて、タンパク質は、正常な真核生物翻訳後修飾を受けないであろう。結果として、この方法は、取得することができる抗体特異性に対して様々な選択フィルターをかける。あるいは、完全ヒト抗体は、真核生物系におけるライブラリー、例えば、酵母提示、レトロウイルス提示、またはポックスウイルスなどのDNAウイルスにおける発現から単離することができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,858,559号（特許文献1）および米国特許出願公開第2013-028892号（特許文献2）を参照されたい。
治療用抗体のための多くの重要な標的は、膜内在性タンパク質（IMP）、例えば、コンフォメーションが無傷の状態で発現させて精製することが難しい複数回貫通膜タンパク質（GPCR、イオンチャネルなど）である。単離された状態の適正にフォールディングされた標的タンパク質がないことにより、これらの標的に対する抗体の特定および選択の難易度が高くなる。ある特定のIMPは、細胞、例えば、哺乳動物細胞の表面上で発現させることができるが、細胞全体は複雑な抗原混合物であり、標的発現が低い可能性があるため、および、抗体ライブラリー（例えば、ワクシニアウイルス抗体ライブラリー）を構築するために用いられるある特定の提示パッケージは、細胞全体に非特異的に結合する可能性があるため、細胞全体は、抗体発見における使用について問題がある。提示ライブラリーからおよび動物ベースのシステムからの治療用抗体および抗体様分子の特定および選択を可能にするための、関心対象の標的IMPをその天然コンフォメーションで、十分な濃度でかつ他の細胞タンパク質からの最小の競合で発現させて提示する新たな方法が、必要なままである。
米国特許第7,858,559号 米国特許出願公開第2013-028892号
概要
本開示は、単離された膜内在性タンパク質（IMP）またはその断片を、関心対象の標的IMPに結合する抗体または抗体様分子のスクリーニング、選択、および特定における使用のために、天然コンフォメーションで発現させて提示するための組成物および方法を提供する。
ある特定の態様において、本開示は、膜内在性タンパク質（IMP）またはその断片をコードする第1の核酸断片であって、該IMPまたはその断片が、少なくとも1個の膜外領域、少なくとも1個の膜貫通ドメイン、および少なくとも1個の膜内領域を含み、かつ少なくとも1個の膜内領域をコードする第1の核酸断片の一部分が、第1の核酸断片の5'端または3'端に位置している、第1の核酸断片；ならびに、鶏痘ウイルスFPV108タンパク質もしくはその機能的断片またはウサギポックスウイルスRBXV041タンパク質もしくはその機能的断片をコードする第2の核酸断片であって、IMPの膜内領域をコードする第1の核酸断片の一部分にインフレームで融合している、第2の核酸断片を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。これらの態様にしたがって、ポリヌクレオチドを含有するポックスウイルス感染細胞は、細胞外エンベロープビリオン（EEV）の外側エンベロープ膜の一部としてIMP-FPV108融合タンパク質またはIMP-RBXV041融合タンパク質を発現することができる。ある特定の局面において、IMPは、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、または少なくとも7個の膜貫通ドメインを含む複数回貫通膜タンパク質である。ある特定の局面において、IMPは、表1に列挙される複数回貫通膜タンパク質である。
ある特定の局面において、複数回貫通IMPは、奇数の膜貫通ドメインを有することができ、第1の核酸断片の5'端は、膜外領域をコードすることができ、かつ第1の核酸断片の3'端は、第2の核酸断片の5'端に融合した膜内領域をコードすることができる。ある特定の局面において、このタイプの第1の核酸断片は、例えば、Gタンパク質共役受容体（GPCR）をコードすることができる。ある特定の局面において、GPCRは、ヒトfrizzled-4タンパク質（FZD4）またはその断片であることができ、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 2の20～892位のアミノ酸を含むポリペプチドをコードすることができる。ある特定の局面において、ポリペプチドは、シグナルペプチド、例えば、SEQ ID NO: 2の1～19位のアミノ酸をさらに含むことができる。ある特定の局面において、GPCRは、CXCケモカイン受容体、例えば、CXCR4またはその断片であることができ、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることができる。
ある特定の局面において、複数回貫通IMPは、偶数の膜貫通ドメインを有することができ、第1の核酸断片の5'端および3'端は両方とも膜内領域をコードすることができる。ある特定の局面において、第2の核酸断片は、第1の核酸断片の3'端に融合していることができる。ある特定の局面において、IMPは、例えば、ヒトCD20タンパク質またはCD39またはそれらの断片であることができる。
ある特定の局面において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドの第1の核酸断片と第2の核酸断片とは、直接融合していることができる。ある特定の局面において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、異種ペプチド、例えば、リンカー配列、アミノ酸タグもしくは標識、またはヒスチジンタグなどの精製を容易にするペプチドもしくはポリペプチド配列をコードする第3の核酸断片を含むことができる。ある特定の局面において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ポックスウイルスプロモーター、例えば、p7.5プロモーター、T7プロモーター、またはH5プロモーターに機能的に結合していることができる。
本開示は、さらに、本明細書において提供されるポリヌクレオチドによってコードされるFPV108融合タンパク質またはRBXV041融合タンパク質を提供する。本開示は、さらに、本明細書において提供されるポリヌクレオチドを含むポックスウイルスゲノム、例えば、鶏痘ウイルスゲノムまたはウサギポックスウイルスゲノムを提供する。本開示は、さらに、本明細書において提供されるポックスウイルスゲノムを含む組換え鶏痘ウイルスEEV、および本明細書において提供されるポックスウイルスゲノムを含む組換えウサギポックスウイルスEEVを提供する。
本開示は、さらに、本明細書において提供される鶏痘ウイルスEEVなどの組換えポックスウイルスEEVを作製する方法を提供し、該方法は、鶏痘ウイルス感染性に対して許容状態の宿主細胞に、本明細書において提供されるポックスウイルスゲノムを含む鶏痘ウイルスを感染させる工程、および、宿主細胞から放出されるEEVを回収する工程を含む。同様に、本開示は、本明細書において提供される組換えウサギポックスウイルスEEVを作製する方法を提供し、該方法は、ウサギポックスウイルス感染性に対して許容状態の宿主細胞に、本明細書において提供されるポックスウイルスゲノムを含むウサギポックスウイルスを感染させる工程、および、宿主細胞から放出されるEEVを回収する工程を含む。
本開示は、さらに、膜内在性タンパク質（IMP）またはその断片を天然コンフォメーションで提示する方法を提供し、該方法は、ポックスウイルス感染性に対して許容状態の宿主細胞に、IMPまたはその断片をポックスウイルスEEV特異的タンパク質またはその膜結合断片との融合タンパク質として発現する組換えポックスウイルスを感染させる工程であって、感染宿主細胞によって産生されるEEVが、EEV外側エンベロープ膜の一部としてIMP融合タンパク質を含む、工程、および、宿主細胞から放出されるEEVを回収する工程を含む。ある特定の局面において、IMPまたはその断片は、EEVの表面上に天然コンフォメーションで提示される。ある特定の局面において、EEV特異的タンパク質は、鶏痘ウイルスFPV018タンパク質もしくはウサギポックスウイルスRBXV041タンパク質、その任意の膜結合断片、またはその任意の組み合わせであることができる。
ある特定の局面において、EEV特異的タンパク質は、F13L（SEQ ID NO: 1）またはその機能的断片である。ある特定の局面において、EEV特異的タンパク質は、FPV108（SEQ ID NO: 2）またはRBXV041（SEQ ID NO: 3）である。ある特定の局面において、IMPは、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、または少なくとも7個の膜貫通ドメインを含む複数回貫通膜タンパク質である。ある特定の局面において、IMPは、7回膜貫通ドメインを含むGタンパク質共役受容体（GPCR）、例えば、上記のようなヒトFZD4またはCXCR4であることができ、かつF13L、FPV018、またはRBXV041タンパク質は、IMPのC末端に融合していることができる。ある特定の局面において、IMPまたはその断片、例えば、上記のようなヒトCD20またはCD39は、偶数の膜貫通ドメインを有することができ、IMPまたはその断片のN末端およびC末端は両方とも膜内であり、かつ膜結合EEV特異的タンパク質、例えば、FPV108またはRBXV041は、IMPのN末端またはC末端に融合していることができる。
ある特定の局面において、膜結合EEV特異的タンパク質断片は、ワクシニアウイルスA56Rタンパク質のストーク（stalk）ドメイン、膜貫通ドメイン、および膜内ドメイン、例えば、SEQ ID NO: 5の108～314位のアミノ酸を含むか、またはそれからなることができる。
提供される融合タンパク質は、組換えポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、またはウサギポックスウイルスによって発現される場合に、ポックスウイルス細胞外エンベロープビリオン（EEV）の表面上に天然コンフォメーションで出現することができる。融合タンパク質を含む組換えポックスウイルスEEVもまた、提供される。本開示は、さらに、ポックスウイルスEEV特異的タンパク質またはその膜結合断片に融合した異種IMPまたはその断片を含む組換えポックスウイルスEEを提供し、該融合タンパク質は、EEV外側エンベロープ膜に位置しており、かつ該IMPまたはその断片は、EEVの表面上にその天然コンフォメーションで提示される。ある特定の局面において、組換えポックスウイルスEEVは、鶏痘ウイルスEEVまたはウサギポックスウイルスEEVである。
本開示はまた、以下の工程を含む、複数回貫通膜タンパク質（IMP）に結合する抗体を選択する方法も提供する：（a）本明細書に記載される第1の組換えポックスウイルスEEVおよび第2の組換えポックスウイルスEEVを提供する工程であって、第1の組換えポックスウイルスEEVおよび第2の組換えポックスウイルスEEVが各々、異なる組換えポックスウイルスにおいて生成される、工程；（b）哺乳動物を第1の組換えポックスウイルスで免疫化する工程；（c）複数の抗原結合ドメインを提示する提示パッケージを含む提示ライブラリーと第2の組換えポックスウイルスとを、EEV上に発現したIMPに特異的に結合する抗原結合ドメインを提示する提示パッケージがそれに結合できるように、接触させる工程であって、該提示ライブラリーが、免疫化哺乳動物より単離されたB細胞から生成される、工程；（d）結合していない提示パッケージを除去する工程；および（e）第2の組換えEEV上に発現したIMPに特異的な抗原結合ドメインを提示する提示パッケージを回収する工程。
[本発明1001]
（a）膜内在性タンパク質（IMP）またはその断片をコードする第1の核酸断片であって、該IMPまたはその断片が、少なくとも1個の膜外領域、少なくとも1個の膜貫通ドメイン、および少なくとも1個の膜内領域を含み、かつ該少なくとも1個の膜内領域をコードする第1の核酸断片の一部分が、第1の核酸断片の5'端または3'端に位置している、第1の核酸断片；ならびに
（b）鶏痘ウイルス（FPV）FPV108タンパク質、ウサギポックスウイルス（RBXV）タンパク質RBXV041、またはその機能的断片をコードする第2の核酸断片であって、IMPの膜内領域をコードする第1の核酸断片の一部分にインフレームで融合している、第2の核酸断片
を含む、単離されたポリヌクレオチドであって；
該ポリヌクレオチドを含むポックスウイルス感染細胞が、細胞外エンベロープビリオン（EEV）の外側エンベロープ膜の一部としてIMP-FPV108融合タンパク質またはIMP-RBXV041融合タンパク質を発現することができる、
前記単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1002]
第2の核酸が、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含むFPV108タンパク質またはその機能的断片をコードする、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1003]
第2の核酸が、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を含むRBXV041タンパク質またはその機能的断片をコードする、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1004]
IMPが、少なくとも2個の膜貫通ドメインを含む複数回貫通膜タンパク質である、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1005]
IMPが奇数の膜貫通ドメインを有し、第1の核酸断片の5'端が膜外領域をコードし、第1の核酸断片の3'端が膜内領域をコードし、かつ第2のポリヌクレオチドの5'端が第1の核酸断片の3'端に融合している、本発明1004のポリヌクレオチド。
[本発明1006]
IMPが、Gタンパク質共役受容体（GPCR）を含む、本発明1005のポリヌクレオチド。
[本発明1007]
IMPが、ヒトfrizzled-4タンパク質（FZD4）またはその断片である、本発明1005のポリヌクレオチド。
[本発明1008]
IMPが、CXCケモカイン受容体CXCRまたはその断片である、本発明1005のポリヌクレオチド。
[本発明1009]
CXCケモカイン受容体が、CXCR4またはその断片である、本発明1008のポリヌクレオチド。
[本発明1010]
IMPが偶数の膜貫通ドメインを有し、第1の核酸断片の5'端および3'端が両方とも膜内領域をコードし、かつ第2の核酸断片が第1の核酸断片の3'端に融合している、本発明1004のポリヌクレオチド。
[本発明1011]
IMPが、ヒトCD20もしくはCD39タンパク質、またはその断片である、本発明1010のポリヌクレオチド。
[本発明1012]
ポックスウイルスプロモーターと機能的に結合している、本発明1001～1011のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1013]
第1の核酸断片と第2の核酸断片とが直接融合している、本発明1001～1012のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1014]
異種ペプチドをコードする第3の核酸断片をさらに含む、本発明1001～1013のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1015]
異種ペプチドが、リンカー配列、アミノ酸タグもしくは標識、または精製を容易にするペプチドもしくはポリペプチド配列を含む、本発明1014のポリヌクレオチド。
[本発明1016]
異種ペプチドがヒスチジンタグを含む、本発明1015のポリヌクレオチド。
[本発明1017]
ポックスウイルスプロモーターと機能的に結合している、本発明1001～1016のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1018]
ポックスウイルスプロモーターが、p7.5、H5、またはT7である、本発明1017のポリヌクレオチド。
[本発明1019]
本発明1001～1018のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされる、FPX108融合タンパク質。
[本発明1020]
本発明1001～1018のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされる、RBXV041融合タンパク質。
[本発明1021]
本発明1001～1018のいずれかのポリヌクレオチドを含む、ポックスウイルスゲノム。
[本発明1022]
ワクシニアウイルスゲノムである、本発明1021のポックスウイルスゲノム。
[本発明1023]
鶏痘ウイルスゲノムである、本発明1021のポックスウイルスゲノム。

[本発明1024]
ウサギポックスウイルスゲノムである、本発明1021のポックスウイルスゲノム。
[本発明1025]
本発明1022～1024のいずれかのポックスウイルスゲノムを含む、組換えポックスウイルスEEV。
[本発明1026]
（a）ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、またはウサギポックスウイルスの感染性に対して許容状態の宿主細胞に、それぞれ、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、またはウサギポックスウイルスを感染させる工程であって、該ワクシニアウイルスが本発明1022のポックスウイルスゲノムを含み、該鶏痘ウイルスが本発明1023のポックスウイルスゲノムを含み、かつ該ウサギポックスウイルスが本発明1024のポックスウイルスゲノムを含む、工程；および
（b）宿主細胞から放出されるEEVを回収する工程
を含む、本発明1025の組換えポックスウイルスEEVを作製する方法。
[本発明1027]
（a）ポックスウイルス感染性に対して許容状態の宿主細胞に、膜内在性タンパク質（IMP）またはその断片をEEV特異的タンパク質FPV108もしくはRBX041またはその膜結合断片との融合タンパク質として発現する組換えポックスウイルスを感染させる工程であって、感染宿主細胞によって産生されるEEVが、EEV外側エンベロープ膜の一部としてIMP融合タンパク質を含む、工程；
（b）宿主細胞から放出されるEEVを回収する工程
を含む、IMPまたはその断片を天然コンフォメーションで提示する方法であって、
該IMPまたはその断片が、EEVの表面上に天然コンフォメーションで提示される、前記方法。
[本発明1028]
EEV特異的タンパク質が、FPV108またはその機能的断片である、本発明1027の方法。
[本発明1029]
EEV特異的タンパク質が、RBXV041またはその機能的断片である、本発明1027の方法。
[本発明1030]
IMPが、少なくとも2個の膜貫通ドメインを含む複数回貫通膜タンパク質である、本発明1027～1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
IMPが、7回膜貫通ドメインを含むGタンパク質共役受容体（GPCR）を含み、かつFPV108またはRBX041が、IMPのC末端に融合している、本発明1030の方法。
[本発明1032]
IMPが、ヒトfrizzled-4タンパク質（FZD4）またはその断片である、本発明1031の方法。
[本発明1033]
IMPが、CXCケモカイン受容体である、本発明1030の方法。
[本発明1034]
CXCケモカイン受容体が、CXCR4またはその断片である、本発明1033の方法。
[本発明1035]
IMPまたはその断片が偶数の膜貫通ドメインを有し、かつIMPまたはその断片のN末端およびC末端が両方とも膜内である、本発明1027～1029のいずれかの方法。
[本発明1036]
FPV108またはRBX041が、IMPのC末端に融合している、本発明1035の方法。
[本発明1037]
IMPが、ヒトCD20またはその断片である、本発明1036の方法。
[本発明1038]
（a）SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、またはSEQ ID NO: 11のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質であって、組換えポックスウイルスによって発現される場合に、ポックスウイルス細胞外エンベロープビリオン（EEV）の表面上に天然コンフォメーションで出現する、前記融合タンパク質。
[本発明1039]
本発明1038の融合タンパク質を含む、組換えポックスウイルスEEV。
[本発明1040]
鶏痘ウイルスEEV特異的タンパク質、ウサギポックスウイルスEEV特異的タンパク質、またはその膜結合断片に融合した異種IMPまたはその断片を含む、組換えポックスウイルスEEVであって、該融合タンパク質が、EEV外側エンベロープ膜に位置しており、該IMPまたはその断片が、EEVの表面上にその天然コンフォメーションで提示される、前記組換えポックスウイルスEEV。
[本発明1041]
ポックスウイルスEEVが、鶏痘ウイルスEEVである、本発明1040の組換えポックスウイルスEEV。
[本発明1042]
以下の工程を含む、複数回貫通膜タンパク質（IMP）に結合する抗体を選択する方法：
（a）本発明1025、1039、1040、または1041の組換えEEVを、固体支持体に付着させる工程；
（b）複数の抗原結合ドメインを提示する提示パッケージを含む抗体提示ライブラリーを提供する工程；
（c）該提示ライブラリーとEEVとを、EEV上に発現したIMPに特異的に結合する抗原結合ドメインを提示する提示パッケージがそれに結合できるように、接触させる工程；
（d）結合していない提示パッケージを除去する工程；および
（e）EEV上に発現したIMPに特異的な抗原結合ドメインを提示する提示パッケージを回収する工程。
[本発明1043]
組換えEEVが、固体支持体への付着の前に不活性化される、本発明1042の方法。
[本発明1044]
EEVが、UV照射の存在下でのソラレン（トリオキサレン、4'-アミノメチル-、塩酸塩）とのインキュベーションによって不活性化される、本発明1043の方法。
[本発明1045]
EEVが、表面に付着したトシル基との反応を介して、固体表面に付着される、本発明1042～1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
固体表面が、トシル活性化磁気ビーズである、本発明1045の方法。
[本発明1047]
EEVが、ビオチン化されて、ストレプトアビジンコーティング固体表面に付着される、本発明1042～1044のいずれかの方法。
[本発明1048]
固体表面が、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズである、本発明1047の方法。
[本発明1049]
以下の工程を含む、複数回貫通膜タンパク質（IMP）に結合する抗体を選択する方法：
（a）本発明1025の第1の組換えポックスウイルスEEVおよび第2の組換えポックスウイルスEEVを提供する工程であって、第1の組換えポックスウイルスEEVおよび第2の組換えポックスウイルスEEVが各々、異なるポックスウイルスにおいて生成される、工程；
（b）動物を第1の組換えポックスウイルスで免疫化する工程；
（b）複数の抗原結合ドメインを提示する提示パッケージを含む提示ライブラリーと第2の組換えポックスウイルスとを、EEV上に発現したIMPに特異的に結合する抗原結合ドメインを提示する提示パッケージがそれに結合できるように、接触させる工程であって、該提示ライブラリーが、免疫化哺乳動物より単離されたB細胞から生成される、工程；
（c）結合していない提示パッケージを除去する工程；および
（d）第2の組換えEEV上に発現したIMPに特異的な抗原結合ドメインを提示する提示パッケージを回収する工程。
[本発明1050]
第1の組換えポックスウイルスEEVが、ワクシニアウイルスEEVである、本発明1049の方法。
[本発明1051]
第2の組換えポックスウイルスEEVが、鶏痘ウイルスEEVである、本発明1050の方法。
[本発明1052]
以下の工程を含む、複数回貫通膜タンパク質（IMP）に結合する抗体またはその抗原結合断片を選択する方法：
（a）本発明1025の組換えポックスウイルスEEVを提供する工程；
（b）哺乳動物を組換えポックスウイルスEEVで免疫化する工程；
（c）任意で、該哺乳動物を第2の用量の組換えポックスウイルスEEVで免疫化する工程；
（d）免疫化動物から血清を単離する工程；および
（e）組換えポックスウイルスEEV上に発現したIMPに特異的な抗原結合ドメインを含む抗体またはその抗原結合断片を単離する工程。
鶏痘ウイルス細胞外エンベロープビリオン（EEV）特異的タンパク質またはその断片に融合した膜内在性タンパク質（IMP）またはその断片の概略図である。平行な水平線は、EEV外膜の図解である。「6×His」は、SEQ ID NO: 15として開示されている。図1Aは、膜貫通ドメインおよび膜内ドメインを含むワクシニアA56Rタンパク質の断片に融合したIMPの細胞外ドメイン（ECD）を図解する。図1Bは、鶏痘ウイルスEEV特異的タンパク質FPV108に融合した典型的なGタンパク質共役受容体のトポロジーを図解する。FPV108およびRBXV041タンパク質は、EEV外膜の内側に結合している。図1Cは、FPV108に融合した、偶数の膜貫通ドメインを有するIMP、例えば、CD20のトポロジーを図解する。図1Dは、鶏痘ウイルスEEV特異的タンパク質FPV108に融合したイオンチャネルのトポロジーを図解する。 本明細書において用いられる鶏痘ベクターの概略図である。 ウサギポックスコード領域の図示である。 VVF13L配列、FPV108配列、およびRBXV041配列（出現順に、それぞれ、SEQ ID NO: 16および1～3）のアラインメント。 VVF13L、FPV108、およびRBXV041の間の同一性パーセント。 力価測定するためのプラークアッセイがその後に続く、ProGビーズにカップリングした抗FZD4抗体を用いた、種々のウイルス：VV/FZD4-F13L、MVA/FZD4-F13L、FPV/FZD4-F13L、およびFPV/FZD4-FPV108のプルダウンを示す。データは、対照抗体でプルダウンされた量を引いた後の、抗FZD4抗体でプルダウンされた各ウイルスの％を示す。 種々のウイルス：VV/CD20-F13、FPV/CD20-FPV108、およびFPV/CD20（タグなし）、ならびにQT35/CD20-FPV108発現細胞に野生型FPVを感染させることによるシュードタイピングによって生成されたFPVのプルダウンを示す。プルダウンは、ProGビーズにカップリングした抗CD20抗体を用いて実施し、その後力価測定するためのプラークアッセイを行った。データは、対照抗体でプルダウンされた量を引いた後の、抗CD20抗体でプルダウンされた各ウイルスの％を示す。 種々のウイルス：VV/CD39-F13、FPV/CD39-F13L、およびFPV/CD39-FPV108のプルダウンを示す。プルダウンは、ProGビーズにカップリングした抗CD39抗体を用いて実施し、その後力価測定するためのプラークアッセイを行った。データは、対照抗体でプルダウンされた量を引いた後の、抗CD39抗体でプルダウンされた各ウイルスの％を示す。 種々のウイルス：VV/Sema-A56R、MVA/Sema-A56R、ならびにQT35/CD20-FPV108発現細胞に野生型FPVを感染させることによるか、またはQT35細胞にSema-A56Rを発現する導入プラスミドをトランスフェクトし、かつ野生型FPVを感染させることによるシュードタイピングによって生成されたFPVのプルダウンを示す。プルダウンは、ProGビーズにカップリングした抗Sema抗体を用いて実施し、その後力価測定するためのプラークアッセイを行った。データは、対照抗体でプルダウンされた量を引いた後の、抗Sema抗体でプルダウンされた各ウイルスの％を示す。 FPV-CD20-FPV108（図10A）、MVA-CD20-F13L（図10B）、および対照MVA（T7株、図10C）の感染後のCD20の発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。白抜きのヒストグラムは、抗CD20での染色を示し、塗りつぶしのヒストグラムは、対照IgGでの染色を示す。 図10Aの説明を参照のこと。 図10Aの説明を参照のこと。 FPV-CD39-FPV108（11A）、MVA-CD39-F13L（11B）、および対照MVA（T7株（11C））の感染後のCD39の発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。白抜きのヒストグラムは、抗CD39での染色を示し、塗りつぶしのヒストグラムは、対照IgGでの染色を示す。 図11Aの説明を参照のこと。 図11Aの説明を参照のこと。 シュードタイピングのために用いた、安定にトランスフェクトされたQT35細胞上のCD20-FPV108（12A）、FZD4-FPV108（12B）、およびSema-A56R（12C）の発現を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。 図12Aの説明を参照のこと。 図12Aの説明を参照のこと。 BALB/cマウスにおける初期免疫化およびそれに続くブースター用量のMVA/CD20 EEVまたはFPV/CD20-FPV108 EEVの後の、CD20発現Wil2S細胞上の抗CD20血清抗体結合を示す棒グラフである。 MVA/CD20 EEVで免疫化されたマウスのB細胞から、FPV/CD20-FPV108上のパンニングで選択された、5種類の抗CD20抗体の表である。表は、CD20発現Wil2S細胞に対する結合、およびCD20陰性細胞に対する結合の欠如を示す。 CD20発現Wil2S細胞に対する結合を示す、MVA/CD20-F13LおよびFPV/CD20-FPV108 EEVでの本明細書に記載されるインビトロ選択プロトコールを用いて選択された、5種類の抗CD20抗体の表である。
詳細な説明
本開示は、膜内在性タンパク質（IMP）、例えば、複数回貫通（IMP）を、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、またはウサギポックスウイルスの細胞外エンベロープビリオン粒子（EEV）の表面上にコンフォメーションが無傷または天然の状態で、EEV特異的膜結合タンパク質、例えばF13L、FPV108、またはRBXV041のポリペプチドセグメントとの融合物として発現させて提示するための方法および組成物を提供する。
定義
「1つの（a）」または「1つの（an）」実体という用語は、その実体の1つまたは複数を指し；例えば、「1つの結合分子（a binding molecule）」は、1つまたは複数の結合分子を表すように理解される。そのように、「1つの」（または「ある」）、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つの」という用語は、本明細書において互換的に用いることができる。
さらに、本明細書において用いられる場合の「および／または」は、互いを伴うかまたは伴わない、2つの特定された特徴または構成要素の各々の具体的な開示として取られるべきである。したがって、本明細書における「Aおよび／またはB」などの句において用いられる際の「および／または」という用語は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」（単独）、ならびに「B」（単独）を含むように意図される。同様に、「A、B、および／またはC」などの句において用いられる際の「および／または」という用語は、以下の態様：A、B、およびC；A、B、またはC；AまたはC；AまたはB；BまたはC；AおよびC；AおよびB；BおよびC；A（単独）；B（単独）；ならびにC（単独）の各々を包含するように意図される。
別の方法で定義されない限り、本明細書において用いられる技術用語および科学用語は、本開示が関連している技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press；およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、当業者に、本開示において用いられる用語の多くの一般的な辞書を提供する。
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（Systeme International de Unites）（SI）に許容される形態で表される。数値範囲は、範囲を定義する数を含める。別の方法で示されない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシへの方向で左から右へ書く。本明細書において提供される表題は、本開示の種々の局面または局面の限定ではなく、それらは、全体として本明細書を参照することによって有することができる。したがって、すぐ下記で定義される用語は、その全体が本明細書を参照することによってより完全に定義される。
本明細書において用いられる際、「天然に存在しない」物質、組成物、実体、および／または物質、組成物、もしくは実体の任意の組み合わせの用語、またはその任意の文法的バリアントは、当業者によって「天然に存在する」として十分に理解されているか、あるいは、判事または行政機関もしくは司法機関によって「天然に存在する」と判定もしくは解釈されるか、またはいずれかの場合に判定もしくは解釈される可能性がある、物質、組成物、実体、および／または物質、組成物、もしくは実体の任意の組み合わせのそれらの形態を明示的に除外するが、除外するだけである条件的な用語である。
本明細書において用いられる際、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」を包含するように意図され、アミド結合（ペプチド結合としても公知である）によって直鎖状に連結された単量体（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、2個以上のアミノ酸の任意の1本の鎖または複数本の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。したがって、2個以上のアミノ酸の1本の鎖または複数本の鎖を指すために用いられる、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれらと互換的に用いることができる。「ポリペプチド」という用語はまた、非限定的にグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、および公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すようにも意図される。ポリペプチドは、生物学的供給源に由来することができるか、または、組換え技術によって作製することができるが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されない。ポリペプチドは、化学合成によることを含む、任意の様式において生成することができる。
本明細書において開示されるポリペプチドは、約3個以上、5個以上、10個以上、20個以上、25個以上、50個以上、75個以上、100個以上、200個以上、500個以上、1,000個以上、または2,000個以上のアミノ酸のサイズであることができる。ポリペプチドは、定義された三次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有さない。定義された三次元構造を有するポリペプチドは、フォールディングされていると呼ばれ、定義された三次元構造を保有しないが、むしろ多数の異なるコンフォメーションを採ることができるポリペプチドは、フォールディングされていないと呼ばれる。本明細書において用いられる際、糖タンパク質という用語は、アミノ酸、例えば、セリンまたはアスパラギンの酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に付着している少なくとも1つの炭水化物部分にカップリングしたタンパク質を指す。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体によっては、その天然の境遇にないポリペプチドが意図される。いかなる特定のレベルの精製も必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その本来のまたは天然の環境から取り去ることができる。宿主細胞において発現される組換えで作製されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適している技法によって分離されているか、分画されているか、または部分的にもしくは実質的に精製されている天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドと同様に、本明細書において開示されるように単離されたと考えられる。
本明細書において用いられる際、「天然に存在しない」ポリペプチドという用語、またはその任意の文法的バリアントは、当業者によって「天然に存在する」として十分に理解されているか、あるいは、判事または行政機関もしくは司法機関によって「天然に存在する」と判定もしくは解釈されるか、またはいずれかの場合に判定もしくは解釈される可能性がある、ポリペプチドのそれらの形態を明示的に除外するが、除外するだけである条件的な用語である。
本明細書において開示される他のポリペプチドは、前述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、またはバリアンド、およびその任意の組み合わせである。本明細書において開示される「断片」、「バリアント」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、例えば、抗原に特異的に結合する対応する天然の抗体またはポリペプチドの特性の少なくともいくつかを保持する、任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、本明細書において別の場所で議論される特異的な抗体断片に加えて、例えば、タンパク質分解断片、および欠失断片を含む。例えばポリペプチドのバリアントは、上記のような断片を含み、およびまた、アミノ酸の置換、欠失、または挿入のために変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドも含む。ある特定の局面において、バリアントは、天然に存在しないことができる。天然に存在しないバリアントは、技術分野で公知の変異誘発技法を用いて作製することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または付加を含むことができる。誘導体は、元のポリペプチド上では見出されない追加的な特徴を呈するように変更されているポリペプチドである。例には、融合タンパク質が含まれる。バリアントポリペプチドはまた、本明細書において「ポリペプチド類似体」と呼ぶこともできる。本明細書において用いられる際、ポリペプチドの「誘導体」はまた、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された1個または複数個のアミノ酸を有する対象ポリペプチドを指すこともできる。また、20種類の標準的なアミノ酸の1種類または複数種類の誘導体を含有するそれらのペプチドも、「誘導体」として含まれる。例えば、4-ヒドロキシプロリンは、プロリンと置換されることができ；5-ヒドロキシリジンは、リジンと置換されることができ；3-メチルヒスチジンは、ヒスチジンと置換されることができ；ホモセリンは、セリンと置換されることができ；オルニチンは、リジンと置換されることができる。
「保存的アミノ酸置換」とは、1個のアミノ酸が、類似した側鎖を有する別のアミノ酸で置き換えられているものである。類似した側鎖を有するアミノ酸のファミリーが、当技術分野において定義されており、塩基性側鎖を有するアミノ酸のファミリー（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸のファミリー（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸のファミリー（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸のファミリー（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β-分岐型側鎖を有するアミノ酸のファミリー（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸のファミリー（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。例えば、チロシンからフェニルアラニンへの置換は、保存的置換である。ある特定の態様において、本開示のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、そのアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の、結合分子が結合する抗原に対する結合を取り消さない。抗原結合を解消しないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を特定する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Brummell et al., Biochem. 32:1180-1 187 (1993)；Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)；およびBurks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)を参照されたい）。
本明細書において用いられる際、「膜内在性タンパク質」または「IMP」という用語は、生体膜に付着しているタンパク質またはポリペプチドを指す。IMPの1つの例は、生体膜の脂質二重層に1回または複数回またがる膜貫通タンパク質である。1回貫通膜タンパク質は、膜を1回だけ横切り、他方、複数回貫通膜タンパク質は、出たり入ったりして縫うように進み、数回横切る。I型1回貫通タンパク質は、膜の外側すなわち「膜外」にそのアミノ末端が、膜の内側すなわち「膜内」にそのカルボキシル末端が位置づけられる。II型1回貫通タンパク質は、膜内側にそのアミノ末端を有する。複数回貫通膜貫通タンパク質は、膜を2回以上通過し、様々な異なるトポロジーを有することができる。偶数の膜貫通ドメインを有するそれらのタンパク質は、膜の同じ側にそのアミノ末端およびカルボキシ末端の両方を有することになる。そのようなタンパク質の1つの例は、B細胞上に発現しているCD20である。偶数の膜貫通ドメインを有するIMPの別の例は、CD39であり、これは、ATPおよび効率の低いADPをCa2+およびMg2+依存的な様式でリン酸加水分解し、AMPを生成する。CD39は、2つの膜貫通ドメインを有する。奇数の膜貫通ドメインを有するそれらのタンパク質は、膜の反対側にそのアミノ末端およびカルボキシ末端を有することになる。例には、Gタンパク質共役受容体が含まれ、それは典型的に、7回膜貫通ドメインを有し、膜外側にアミノ末端および膜内側にカルボキシ末端を有する。ある特定のIMPは、膜貫通ドメインを有さず、その代わりに、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトールまたはパルミトイル基などの脂質を介して、膜に固定される。IMPは、トランスポーター、リンカー、チャネル、受容体、酵素、エネルギー変換、または細胞接着を含むがそれらに限定されない、無数の生物学的機能を有する。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸および複数の核酸を包含するように意図され、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーRNA（mRNA）、cDNA、またはプラスミドDNA（pDNA）を指す。ポリヌクレオチドは、従来的なホスホジエステル結合または非従来的な結合（例えば、ペプチド核酸（PNA）において見出されるようなアミド結合）を含むことができる。「核酸」または「核酸配列」という用語は、任意の1つまたは複数の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチド中に存在するDNA断片またはRNA断片を指す。
「単離された」核酸またはポリヌクレオチドによっては、その天然の環境から分離されている核酸またはポリヌクレオチドの任意の形態が意図される。例えば、ゲル精製ポリヌクレオチド、またはベクターに含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、「単離されて」いると考えられることになる。また、ポリヌクレオチドセグメント、例えば、クローニングのための制限部位を有するように操作されているPCR産物は、「単離されて」いると考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞において維持される組換えポリヌクレオチド、または緩衝液もしくは食塩水などの非天然溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたRNA分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロのRNA転写物が含まれ、該転写物は、天然に見出されるものではない。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、さらに、合成で作製されたそのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントであることができるか、またはそれらを含むことができる。
本明細書において用いられる際、「天然に存在しない」ポリヌクレオチド、またはその任意の文法的バリアントは、当業者によって「天然に存在する」として十分に理解されているか、あるいは、判事または行政機関もしくは司法機関によって「天然に存在する」と判定もしくは解釈されるか、またはいずれかの場合に判定もしくは解釈される可能性がある、ポリヌクレオチドのそれらの形態を明示的に除外するが、除外するだけである条件的な定義である。
本明細書において用いられる際、「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部分である。「停止コドン」（TAG、TGA、またはTAA）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部と考えることができる。しかし、いずれかの隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。2種類以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物中に、例えば、単一のベクター中に、または、別々のポリヌクレオチド中に、例えば、別々の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、いずれかのベクターは、単一のコード領域を含有することができるか、または、2種類以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターが、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることができる。加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、別のコード領域に融合しているかまたは融合していないかいずれかの、異種コード領域を含むことができる。異種コード領域には、非限定的に、分泌シグナルペプチドまたは異種機能的ドメインなどの、特化されたエレメントまたはモチーフをコードするものが含まれる。
ある特定の態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。DNAの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、1種類または複数種類のコード領域に機能的に結合したプロモーターおよび／または他の転写制御エレメントもしくは翻訳制御エレメントを含むことができる。機能的結合とは、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドについてのコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に置くような様式で、1種類または複数種類の調節配列に結合している場合である。2種類のDNA断片（ポリペプチドコード領域およびそれに結合したプロモーターなど）は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写を結果としてもたらす場合に、および、2種類のDNA断片の間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を干渉しないか、または転写されるべきDNA鋳型の能力を干渉しない場合に、「機能的に結合」している。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合に、ポリペプチドをコードする核酸に機能的に結合していることになる。プロモーターは、あらかじめ決められた細胞においてDNAの実質的な転写を指示する、細胞特異的プロモーターであることができる。プロモーターのほかにも、他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルを、細胞特異的転写を指示するためにポリヌクレオチドに機能的に結合させることができる。
様々な転写制御領域が、当業者に公知である。これらには、非限定的に、サイトメガロウイルス由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメント（イントロンAと併用する、最初期プロモーター）、シミアンウイルス40由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメント（初期プロモーター）、ならびにレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）由来のプロモーターおよびエンハンサーセグメントなどであるがそれらに限定されない、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域が含まれる。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ-グロビンなどの脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに、真核細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。追加的な適している転写調節領域には、組織特異的なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が含まれる。
ポックスウイルスプロモーター（例えば、p7.5もしくはH5）またはバクテリオファージT7プロモーターもまた、転写制御領域として用いることができる。T7プロモーターを使用する場合には、誘導性ワクシニア発現系を利用することができる。ワクシニア発現系は、T7 RNAポリメラーゼについてのバクテリオファージT7遺伝子1コード領域全体をコードする第1の組換えワクシニアウイルス、ならびに、T7プロモーターおよび終結調節エレメントが隣接した関心対象の遺伝子をコードする第2の組換えワクシニアウイルスを含むことができるが、それらに限定されない。両方の組換えワクシニアウイルスでの真核細胞の二重感染は、T7 RNAポリメラーゼの合成およびT7プロモーターによって制御される関心対象の遺伝子の発現を結果としてもたらす。
同様に、様々な翻訳制御エレメントが、当業者に公知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドン、ならびに、ピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、CITE配列とも呼ばれる、内部リボソーム進入部位、すなわちIRES）が含まれるが、それらに限定されない。
他の態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA、またはリボソームRNAの形態における、RNAであることができる。
ポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、本明細書において開示されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードする追加的なコード領域に結合させることができる。シグナル仮説にしたがうと、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有し、それは、ひとたび成長するタンパク質鎖の粗面小胞体を横切る輸出が開始されると、成熟タンパク質から切断される。脊椎動物細胞から分泌されるポリペプチドは、ポリペプチドのN末端に融合したシグナルペプチドを有することができ、それは、ポリペプチドの分泌型すなわち「成熟」型を産生するために完全なポリペプチドすなわち「完全長」ポリペプチドから切断されることを、当業者は承知している。ある特定の態様において、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖シグナルペプチドもしくは軽鎖シグナルペプチド、または、それに機能的に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する、その配列の機能的誘導体が用いられる。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能的誘導体を用いることができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）またはマウスβ-グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
本明細書において用いられる際、「ライブラリー」とは、ポリヌクレオチドの代表的な属、例えば、単一の動物種、組織タイプ、臓器、または細胞タイプ由来のそれらの起源を通して関連している、例えば、ポリヌクレオチドの群であり、ライブラリーは、集合的に、所定のポリヌクレオチドの属内の少なくとも2種類の異なる種を含む。ポリヌクレオチドのライブラリーは、所定のポリヌクレオチドの属内の、例えば、少なくとも2、少なくとも5、少なくとも10、100、103、104、105、106、107、108、または109種類の異なる種を含むことができる。ある特定の局面において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドのライブラリーは、関心対象のポリペプチドを含有する多数のポリペプチドをコードすることができる。ある特定の局面において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドのライブラリーは、多数の免疫グロブリンサブユニットポリペプチド、例えば、重鎖サブユニットポリペプチドまたは軽鎖サブユニットポリペプチドをコードすることができる。この文脈において、本明細書において提供される「ライブラリー」は、共通の属のポリヌクレオチドを含み、該属は、ある特定のタイプおよびクラスの免疫グロブリンサブユニットポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、例えば、ライブラリーは、ヒトμ、γ-1、γ-2、γ-3、γ-4、α-1、α-2、ε、もしくはδ重鎖、または、ヒトκもしくはラムダ軽鎖をコードし得る。本明細書において提供される方法にしたがって構築されたいずれか1つのライブラリーの各メンバーは、同じ重鎖もしくは軽鎖定常領域、および／または膜固定ドメインをコードすることができるが、ライブラリーは、集合的に、共通定常領域に結合した少なくとも2、少なくとも5、または少なくとも10、100、103、104、105、106、107、108、または109種類の異なる可変領域を含むことができる。
他の態様において、ライブラリーは、軽鎖可変領域または重鎖可変領域、ならびに／または軽鎖可変領域および重鎖改変領域の両方などの、可変領域を含む複数の免疫グロブリン一本鎖断片、例えば、ScFv断片を含むことができる。
本明細書において用いられる際、「提示ライブラリー」とは、ライブラリーポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをその表面上に発現する「提示パッケージ」において各々が運ばれる、ポリヌクレオチドのライブラリーである。例えば、抗体提示ライブラリーは、各々が抗体の抗原結合ドメインをその表面上に提示する、複数の提示パッケージを含むことができる。提示ライブラリーを、例えば、固体表面上に固定化された関心対象の抗原と相互作用させた場合に、抗原に結合するそれらの提示パッケージを、ライブラリーの残りの部分から単離して回収することができる。提示パッケージの表面上に提示された抗原結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを、次いで単離することができる。提示ライブラリーには、非限定的に、細菌におけるファージ提示ライブラリー、または真核生物系におけるライブラリー、例えば、酵母提示、レトロウイルス提示、またはポックスウイルスなどのDNAウイルスにおける発現が含まれる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,858,559号および米国特許第8,637,031号を参照されたい。ある特定の局面において、抗体提示ライブラリーは、「提示パッケージ」がEEV粒子であるように、EEV特異的タンパク質との融合タンパク質として、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルスベクター、鶏痘ウイルス（FPV）ベクター、またはウサギポックスウイルス（RBXV）ベクターにおいて調製することができる。米国特許第8,637,031号を参照されたい。
そのような提示ライブラリーを、本明細書において提供される鶏痘ウイルスEEVまたはウサギポックスウイルスEEVの表面上に提示されるIMP融合タンパク質に対してスクリーニングすることができる。
「レシピエント細胞」または「宿主細胞」または「細胞」によっては、その中で組換えタンパク質を発現させることができる、ウイルスを増やすことができる、または、本明細書において提供されるポリヌクレオチドライブラリーを構築し、かつ／もしくは増やすことができる細胞または細胞集団が意味される。本明細書において提供される宿主細胞は、典型的に、真核生物の細胞または細胞株、例えば、脊椎動物、哺乳動物、げっ歯類、マウス、霊長類、またはヒトの細胞または細胞株である。「宿主細胞集団」によっては、本明細書において提供される「ライブラリー」を、構築し、増やし、かつ／または発現させることができる培養細胞の群が意味される。必要に応じて、ワクシニアウイルス、FPV、またはウサギポックスウイルスの感染性に対して許容状態である任意の宿主細胞が、本開示によって提供される方法に適している。本明細書において提供される方法における使用のための宿主細胞は、接着性、例えば、固体基質に付着して成長する宿主細胞であることができ、あるいは、宿主細胞は浮遊状態であることができる。
本明細書において提供される宿主細胞は、タンパク質、例えば、細胞またはライブラリーによって発現される関心対象のタンパク質が、細胞もしくはウイルスの膜表面上に発現されるか、または可溶性ポリペプチドとして完全に分泌されるかのいずれかのように、細胞の内部から分泌される、構成的分泌経路を含むことができる。ある特定の局面において、生体膜の上またはその中に発現される関心対象のタンパク質、例えば、IMPは、宿主細胞によって産生されるエンベロープウイルス、例えば細胞外エンベロープワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、またはウサギポックスウイルス、すなわちEEVの表面上に発現される。IMPは、1つまたは複数の移行停止シグナル、または「膜貫通ドメイン」の存在によってER膜中に保持され得る以外は、ER内腔を通過して、完全分泌型または完全分泌タンパク質と同じ経路に従うことができる。膜貫通ドメインは、膜を横断する際にαヘリックスコンフォメーションを採る約20アミノ酸の疎水性ストレッチである。膜に埋め込まれたタンパク質は、形質膜のリン脂質二重層に固定される。関心対象のポリペプチドの膜貫通型、例えば、膜固定免疫グロブリン重鎖ポリペプチドは、典型的に、完全分泌型が利用するようなアミノ末端シグナルペプチドを利用する。
シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインすなわち「膜内」ドメインは、多種多様な膜結合タンパク質および／または完全分泌タンパク質について公知である。
適している膜貫通ドメインは、ワクシニアウイルスEEV特異的タンパク質A56R、またはFPV EEV特異的タンパク質もしくはEEV特異的FPV膜貫通タンパク質のFPV108、FPV109、もしくはFPV198、またはウサギポックスウイルス膜貫通タンパク質RPXV041のTMドメインを含むことができるが、それらに限定されない。ある特定の局面において、EEV特異的タンパク質、例えば、FPV108、またはRBXV041、またはVV F13Lは、ウイルスエンベロープの内表面に固定されることができ、そのうち後者は、本明細書において別の場所でより詳細に議論されるパルミトイル基を介して、ウイルスエンベロープの内表面に固定される。
本明細書において用いられる際、「結合分子」という用語は、その最も広い意味において、受容体、例えば、エピトープまたは抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。本明細書においてさらに記載される際、結合分子は、本明細書に記載される1個または複数個の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。結合分子の非限定的な例は、抗原特異的結合を保持する抗体またはその断片である。
「結合ドメイン」および「抗原結合ドメイン」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、エピトープに特異的に結合するのに必要であり、かつ十分である結合分子の領域を指す。例えば、「Fv」、例えば、抗体の可変重鎖および可変軽鎖は、2本の別々のポリペプチドサブユニットとしてまたは一本鎖としてのいずれかで、「結合ドメイン」であると考えられる。
他の抗原結合ドメインには、非限定的に、ラクダ科の種に由来する抗体の可変重鎖（VHH）、またはフィブロネクチンスキャフォールドにおいて発現させた6個の免疫グロブリン相補性決定領域（CDR）が含まれる。
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において互換的に用いることができる。抗体（または本明細書において開示されるその断片、バリアント、もしくは誘導体）は、少なくとも重鎖の可変領域（例えば、ラクダ科の種について）、または少なくとも重鎖および軽鎖の可変領域を含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的十分に理解されている。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)を参照されたい。別の方法で述べられない限り、「抗体」という用語は、抗体の小さな抗原結合断片から完全サイズの抗体、例えば、2本の完全重鎖および2本の完全軽鎖を含むIgG抗体に及ぶ任意のものを包含する。
「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に識別することができる種々の広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖が、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、その中にいくつかのサブクラス（例えば、γ1～γ4またはα1～α2）を有することを認識しているであろう。抗体の「クラス」をそれぞれ、IgG、IgM、IgA IgG、またはIgEと決定することが、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2などは、十分に特徴決定されており、機能的専門化を付与することが公知である。
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。各重鎖クラスは、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。概して、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、B細胞、または遺伝子操作された宿主細胞のいずれかによって生成される場合、軽鎖および重鎖は、互いに共有結合で結合しており、2本の重鎖の「尾」部分は、共有結合性ジスルフィド結合または非共有結合性結合によって互いに結合している。重鎖において、アミノ酸配列は、Y形状のフォーク状の端のN末端から、各鎖の底部のC末端まで続く。ある特定の抗体、例えば、IgG抗体の基本構造は、本明細書において「H2L2」構造とも呼ばれる「Y」構造を形成する、ジスルフィド結合を介して共有結合で接続された2本の重鎖サブユニットおよび2本の軽鎖サブユニットを含む。
「エピトープ」という用語は、抗体に対する特異的結合が可能である任意の分子決定基を含む。ある特定の局面において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの、分子の化学的活性表面のグループ分けを含むことができ、ある特定の局面において、三次元構造特性、および、または特異的な電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体が結合する標的の領域である。
「標的」という用語は、最も広い意味において、結合分子が結合することができる物質を含むように用いられる。標的は、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または他の分子であることができる。さらに、「標的」は、例えば、結合分子が結合することができる、結合エピトープを含む細胞、臓器、または生物であることができる。
軽鎖および重鎖は両方とも、構造的および機能的な相同性の領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は、機能的に用いられる。この点において、可変軽（VL）鎖部分および可変重（VH）鎖部分の両方の可変領域（本明細書において互換的に「可変ドメイン」と呼ぶことができる）は、抗原認識および特異性を決定することが認識されるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（CL）および重鎖の定常ドメイン（例えば、CH1、CH2、またはCH3）は、分泌、経胎盤移動性、Fc受容体結合、補体結合などのような生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインのナンバリングは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端からより遠くになるにつれて増大する。N末端部分が可変領域であり、C末端部分には定常領域があり；CH3（またはIgMの場合にはCH4）ドメインおよびCLドメインは、それぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端にある。
抗体抗原結合ドメイン中に存在する、6個の「相補性決定領域」すなわち「CDR」は、抗体が水性環境においてその三次元形状を呈する際に抗原結合ドメインを形成するように特異的に位置づけられる、アミノ酸の短い非連続性の配列である。「フレームワーク」領域と呼ばれる、抗原結合ドメイン中のアミノ酸の残りの部分は、より低い分子間変動性を示す。フレームワーク領域は、主として、βシートコンフォメーションを採り、CDRは、βシート構造を接続し、いくつかの場合にはその一部を形成する、ループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間非共有結合性相互作用によってCDRを正確な方向に位置づけることを提供するスキャフォールドを形成するように作用する。位置づけられたCDRによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補的な表面を画定する。この相補的な表面は、抗体のその同起源のエピトープに対する非共有結合性結合を促進する。それぞれ、CDRおよびフレームワーク領域を作り上げるアミノ酸は、種々の異なる様式において定義されているため、任意の所定の重鎖または軽鎖可変領域について当業者が容易に特定することができる（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、"Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983)；およびChothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)を参照されたい）。
当技術分野内で用いられ、かつ／または許容される用語の2つ以上の定義がある場合には、本明細書において用いられる用語の定義は、それとは反対に明示的に述べられない限り、すべてのそのような意味を含むように意図される。具体例は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続性の抗原結合部位を説明するための、「相補性決定領域」（「CDR」）という用語の使用である。これらの特定の領域は、例えば、参照により本明細書に組み入れられるKabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)およびChothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)によって記載されている。免疫グロブリン可変ドメインはまた、CDRを含む可変領域セグメントを特定するために、例えば、IMGT情報システム（www://imgt.cines.fr/）（IMGT（登録商標）/V-Quest）を用いて解析することもできる（例えば、Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36:W503-508, 2008を参照されたい）。
Kabat et al.はまた、任意の抗体に適用可能である可変ドメイン配列についてのナンバリングシステムも定義した。当業者は、「Kabatナンバリング」のこのシステムを任意の可変ドメイン配列に、配列自体のほかのいかなる実験データにも頼ることなく、明白に割り当てることができる。本明細書において用いられる際、「Kabatナンバリング」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)によって示されるナンバリングシステムを指す。しかし、Kabatナンバリングシステムの使用が明示的に記されていない限り、連続したナンバリングが、本開示におけるすべてのアミノ酸配列について用いられる。
結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Fab、Fab'、およびF(ab')2、Fd、Fv、一本鎖Fv（scFv）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Fv（sdFv）、ラクダ科VHH抗体などの単一ドメイン抗体、VLドメインまたはVHドメインのいずれかを含む断片、Fab発現ライブラリーによって産生される断片が含まれるが、それらに限定されない。scFv分子は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第5,892,019号に記載されている。本開示によって包含される免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY）、クラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2）、またはサブクラスであることができる。また、二価であり、IgNAR可変ドメイン（VNAR）を含む一本鎖を含む、免疫グロブリン新抗原受容体（IgNAR）アイソタイプも企図される。（Walsh et al., Virology 411:132-141, 2011を参照されたい。）
「特異的に結合する」によっては、結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および、結合は、抗原結合ドメインとエピトープとの間のいくらかの相補性を必然的に伴うことが、概して意味される。この定義にしたがって、結合分子は、ランダムな無関係のエピトープに結合するであろうよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合に、そのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、ある特定の結合分子がある特定のエピトープに結合する相対親和性を認定するために、本明細書において用いられる。例えば、結合分子「A」は、所定のエピトープに対して結合分子「B」よりも高い特異性を有すると考えることができるか、または、結合分子「A」は、関連するエピトープ「D」に対して有するよりも高い特異性で、エピトープ「C」に結合すると言うことができる。
本明細書において用いられる際、「親和性」という用語は、例えば、免疫グロブリン分子の、1個または複数個の抗原結合ドメインとの個々のエピトープの結合の強度の測定値を指す。例えば、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)のページ27～28を参照されたい。本明細書において用いられる際、「結合力」という用語は、抗原結合ドメインの集団と抗原との間の複合体の全体の安定性を指す。例えば、Harlowのページ29～34を参照されたい。結合力は、集団中の個々の抗原結合ドメインの特異的なエピトープとの親和性、ならびにまた、免疫グロブリンおよび抗原の結合価の両方に関連している。例えば、二価モノクローナル抗体と、ポリマーなどの高度に反復するエピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高い結合力の1つであると考えられる。二価モノクローナル抗体と、細胞表面上に高密度で存在する受容体との間の相互作用もまた、高い結合力であると考えられる。
本明細書において用いられる際、「重鎖サブユニット」または「重鎖ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖、結合分子に由来するアミノ酸配列を含み、例えば、重鎖サブユニットを含む抗体は、VHドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、またはそのバリアントもしくは断片のうちの少なくとも1つを含むことができる。
本明細書において用いられる際、「軽鎖サブユニット」または「軽鎖ドメイン」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは、VLドメインまたはCL（例えば、CκまたはCλ）ドメインのうちの少なくとも1つを含む。
結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、それらが認識するかまたは特異的に結合する抗原のエピトープまたは一部分の観点から、記載するかまたは特定することができる。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の一部分が、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープまたは少なくとも2つのエピトープを含むことができ、抗原のサイズ、コンフォメーション、およびタイプに応じて、任意の数のエピトープを含むことができる。
本明細書において用いられる際、「連結した」、「融合した」、もしくは「融合物」という用語、または他の文法的同等物は、互換的に用いることができる。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含むいかなる手段によっても、2種類以上のエレメントまたは構成要素を合わせて連結することを指す。「インフレーム融合」とは、元のORFの翻訳リーディングフレームを維持する様式で、連続的なより長いオープンリーディングフレーム（ORF）を形成するための、2種類以上のポリヌクレオチドORFの連結を指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のORFによってコードされるポリペプチドに対応する2種類以上のセグメントを含有する単一のタンパク質（そのセグメントは、通常、天然においてそのように連結されていない）である。リーディングフレームは、このように、融合したセグメントを通して連続的に作られるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的にまたは空間的に分離され得る。例えば、IMPおよびワクシニアウイルスEEV特異的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合していることができるが、「融合した」オープンリーディングフレームが、連続的なポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、リンカーまたはスペーサーをコードするポリヌクレオチドによって分離され得る。
本明細書において用いられる際、「ヘマグルチニンタグ」または「HAタグ」という用語は、98～106位のアミノ酸に対応するヒトインフルエンザヘマグルチニン表面糖タンパク質（HA）に由来するタンパク質である。HAタグは、発現ベクターにおける一般的なエピトープタグとして広範に用いられる。組換えタンパク質を、組換えタンパク質の生物活性または生体内分布を干渉するとは見られないHAタグを発現するように、操作することができる。このタグは、関心対象のタンパク質の検出、単離、および精製を容易にする。
ポリペプチドの文脈において、「直鎖状配列」または「配列」とは、配列中の互いに隣接するアミノ酸がポリペプチドの一次構造において連続性である、アミノ末端すなわちN末端からカルボキシル末端すなわちC末端までのポリペプチドにおけるアミノ酸の順序である。
ポリペプチドの別の部分に対して「アミノ末端」すなわち「N末端」であるポリペプチドの部分は、一連のポリペプチド鎖においてより早く来る部分である。同様に、ポリペプチドの別の部分に対して「カルボキシ末端」すなわち「C末端」であるポリペプチドの部分は、一連のポリペプチド鎖においてより後に来る部分である。
本明細書において用いられる「発現」という用語は、それによって遺伝子が生化学物質、例えば、ポリペプチドを産生するプロセスを指す。プロセスは、遺伝子ノックダウン、ならびに一過性発現および安定発現の両方を非限定的に含む、細胞内での遺伝子の機能的存在の任意の顕在化を含む。それは、非限定的に、遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）への転写、およびそのようなmRNAのポリペプチドへの翻訳を含む。最終的な望ましい産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質および任意の前駆体の創出を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書において用いられる際、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーRNA、または、転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであることができる。本明細書に記載される遺伝子産物は、さらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を伴う核酸、または、翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解性切断などを伴うポリペプチドを含む。
「真核生物」または「真核性生物」という用語は、原生動物、真菌、酵母、緑藻、単細胞植物、多細胞植物、ならびに、脊椎動物および無脊椎動物の両方のすべての動物を含む、動物界、植物界、および原生生物界におけるすべての生物を包含するように意図される。用語は、細菌またはウイルスを包含しない。「真核細胞」は、単数の「真核細胞」および複数の「真核細胞」を包含するように意図され、真核生物に由来する細胞を含む。
「脊椎動物」という用語は、単数の「脊椎動物」および複数の「脊椎動物」を包含するように意図され、哺乳類および鳥類、ならびに、魚類、爬虫類、および両生類を含む。
「哺乳動物」という用語は、単数の「哺乳動物」および複数の「哺乳動物」を包含するように意図され、ヒト；類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジーなどの霊長類；イヌおよびオオカミなどのイヌ科動物；ネコ、ライオン、およびトラなどのネコ科動物；ウマ、ロバ、およびシマウマなどのウマ科動物、ウシ、ブタ、およびヒツジなどの食用動物；シカおよびキリンなどの有蹄動物；マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどのげっ歯類；ならびにクマを含むが、それらに限定されない。ある特定の局面において、哺乳動物はヒト対象である。
「組織培養」または「細胞培養」または「培養」または「培養すること」という用語は、細胞構成の保存、細胞機能の保存、さらなる分化、またはこの3つすべてを可能にする条件下での、インビトロでの植物または動物の組織または細胞の維持または成長を指す。「初代組織細胞」とは、組織から直接採取されたものであり、すなわち、生物において同じ機能を果たす同じ種類の細胞集団である。例えば、そのような組織細胞のタンパク質分解酵素であるトリプシンでの処理は、それらを、培養プレート上に播種した場合に成長するかまたは細胞構成を維持する個々の初代組織細胞に解離する。組織培養において初代細胞の増倍から生じた細胞培養物は、「二次細胞培養物」と呼ばれる。大抵の二次細胞は、有限の回数分裂し、次いで死ぬ。しかし、少しの二次細胞は、この「危機時期」を通過することができ、その後、無期限に増倍して継続的な「細胞株」を形成することができる。その中で細胞を培養する液体培地を、本明細書において「培養培地」または「培養培地」と呼ぶ。所望の分子、例えば、ウイルスまたはタンパク質、例えば、免疫グロブリン分子が、その中での細胞の培養の最中にその中に分泌されている細胞培地を、「調整培地」と呼ぶことができる。
本明細書において用いられる際、「特定する」という用語は、所望の分子、例えば、所望の特徴または機能を有する関心対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、そのような分子の多数またはライブラリーから差別化される方法を指す。特定法は、「選択」および「スクリーニング」または「パンニング」を含む。本明細書において用いられる際、「選択」法とは、所望の分子を、例えば、薬物耐性を介してライブラリーから直接分離することができるものである。本明細書において用いられる際、「スクリーニング」法または「パンニング」法とは、所望の分子を含むプールを、所望の分子を検出することができるアッセイに供するものである。分子が検出されるプールのアリコートを、次いで、所望の分子由来の高度に濃縮されているプールが達成されるまで、同様にアッセイされる逐次的により小さなプールに分ける。
ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、またはウサギポックスウイルスEEVベクター
本明細書において提供されるIMP融合タンパク質は、ポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、またはウサギポックスウイルスベクターにおいて産生される。「ポックスウイルス」という用語は、ポックスウイルス科の任意のメンバーを含む。例えば、Virology, 2d Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Eds., Raven Press, p. 2080 (1990)中のB. Mossを参照されたい。オルソポックスウイルス属には、例えば、ワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス（天然痘を引き起こすウイルス）、およびアライグマポックスウイルスが含まれる。ワクシニアウイルスは、基本型のオルソポックスウイルスである。鶏痘ウイルス（FPV）は、ポックスウイルス科のコルドポックスウイルス（Chordopoxvirinae）亜科、アビポックスウイルス（APV）属に属する。アビポックスウイルス（APV）属は、家禽、シチメンチョウ、ハト、および多くの野鳥に感染するポックスウイルスのクラスターからなる。ウサギポックスウイルスは、レポリポックスウイルス属に属し、ウサギ、ノウサギ、およびリスに感染する。ウサギポックスウイルスは、抗原的にワクシニアウイルスに関連している。最初の市販のウイルスベクターワクチンは、鶏痘ウイルスであり、これは、ワクシニアウイルスと同様に、異種タンパク質の発現用のベクターとして十分に特徴決定されている。
ポックスウイルスベクター、特に、ワクシニアウイルスベクター、FPVベクター、またはウサギポックスウイルスベクターが、本明細書において提供されるIMP融合タンパク質を発現させるために用いられる。ある特定の局面において、IMP融合タンパク質をコードする遺伝子の位置は、感染性ウイルスが産生されるように、ウイルスの増殖および複製にとっては非必須であるポックスウイルスベクターの領域にあることができる。FPVゲノムは、配列決定されており、オープンリーディングフレームの各々が、数字によって特定されている。FPVゲノム中への外来遺伝子の挿入に最も広く用いられる遺伝子座は、それぞれ、FPV左アーム（FPV 084、085、および086）と右アーム（FPV 087および088）との接合部に相当する、FPV 086と087との間にある。FPVベクターマップを、図2に示す。
ウサギポックスウイルスの場合、完全なコード領域が配列決定されている。図3を参照されたい。予測される遺伝子に番号を付け、直線の矢印で示す；他のOPV中に存在する遺伝子の断片を含有する領域を、フレーム変化を表すようにずらした矢印で示し、ローマ数字を与えた。白抜き矢じりは、ORFが図解の2行にわたって分割されていることを示す。スケールをkbで示し；太線はゲノムのITRを表す：*は停止コドンである。（Journal of General Virology, 86 (Pt 11):2969-77, December 2005）
ワクシニアウイルスゲノムの様々な非必須領域が特徴決定されてきているが、外来遺伝子の挿入に最も広く用いられる遺伝子座は、ゲノムのHindIII J断片中に位置するチミジンキナーゼ座である。
ある特定のFPVベクターにおいて、086と087との間の配列は、本明細書において別の場所で記載されるような、三分子組換え法の組換えウイルス作製の好都合な使用を可能にする、1個または2個の特有の制限酵素部位を含有するように操作されている。ある特定のワクシニアウイルスベクターにおいて、tk座は、本明細書において別の場所で記載されるように、三分子組換え法組換えウイルス作製の好都合な使用を可能にする、1個または2個の特有の制限酵素部位を含有するように操作されている。
本明細書において提供されるIMP融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ポックスウイルス感染細胞の細胞質において機能する転写制御領域との機能的結合の下で、ワクシニアウイルスベクター、FPVベクター、またはウサギポックスウイルスベクターなどのポックスウイルスベクター中に挿入することができる。
ポックスウイルス転写制御領域は、プロモーターおよび転写終結シグナルを含む。ポックスウイルスにおける遺伝子発現は、時間的に調節されており、初期遺伝子、中間遺伝子、および後期遺伝子のためのプロモーターは、変動する構造を保有する。ある特定のポックスウイルス遺伝子は、構成性に発現しており、これらの「初期-後期」遺伝子のためのプロモーターは、ハイブリッド構造を持つ。合成初期-後期プロモーターもまた、開発されてきている。本明細書において提供されるIMP融合タンパク質を発現するのに適しているポックスウイルスプロモーターには、7.5-kDプロモーター、MILプロモーター、37-kDプロモーター、11-kDプロモーター、11Lプロモーター、12Lプロモーター、13Lプロモーター、15Lプロモーター、17Lプロモーター、28-kDプロモーター、H1Lプロモーター、H3Lプロモーター、H5Lプロモーター、H6Lプロモーター、H8Lプロモーター、D11Lプロモーター、D12Lプロモーター、D13Lプロモーター、A1Lプロモーター、A2Lプロモーター、A3Lプロモーター、およびP4bプロモーターなどの後期プロモーターが含まれるが、それらに限定されない。例えば、Virology, 2d Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Eds., Raven Press, p. 2090 (1990)中のMoss, B., "Poxviridae and their Replication"を参照されたい。
適しているポックスウイルスベクターには、野生型ワクシニアウイルス、例えば、ウェスタンリザーブ（Western Reserve）株もしくはWR株、弱毒化ワクシニアウイルス、例えば、改変ワクシニアアンカラ（Ankara）（MVA）（Mayr, A. et al., Infection 3:6-14 (1975)）、野生型鶏痘ウイルス、およびウサギポックスウイルス、ならびにそれらの弱毒化もしくは改変バージョンが含まれる。
ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、FPV、またはウサギポックスウイルスは、その複製サイクルの最中に、その膜構造が異なる4種類の感染性形態：細胞内成熟ビリオン（IMV）、細胞内エンベロープビリオン（IEV）、細胞結合エンベロープビリオン（CEV）、および細胞外エンベロープビリオン（EEV）を産生する。一般的見解は、IMVは単一のリポタンパク質膜を有し、他方、CEVおよびEEVは両方とも2つの膜層によって囲まれており、IEVは3つのエンベロープを有することである。EEVは、宿主細胞の形質膜から脱落し、EEV膜は、トランスゴルジに由来する。
感染後、ウイルスはその膜を失い、DNA／タンパク質コアが、微小管に沿って細胞中に輸送される。初期のワクシニアmRNA、鶏痘mRNA、およびウサギポックスmRNAによってコードされるタンパク質（「初期」はDNA複製前として定義される）は、ウイルスコアの脱コートおよびその後のDNA複製をもたらす。この複製は、ERの本質的に上部に位置する「ウイルス工場」と称されるものにおいて起こる。ウイルス工場内で、未熟ビリオン（IV）がアセンブルし、プロセシングされてIMV（細胞内成熟ウイルス）を形成する。IMVは、ERに由来する膜を含有する。IMVの大多数は、細胞溶解によって細胞から放出される。いくつかのIMVは、トランスゴルジネットワークまたは初期エンドソームの膜によるラッピングの部位まで、微小管上を輸送される。二重膜によるIMV粒子のラッピングは、IEV（細胞内エンベロープウイルス）と呼ばれるワクシニアの形態を創出する。IEVは、次いで、細胞表面まで微小管上を輸送される。外側IEV膜が、形質膜と融合して、細胞表面でCEV（細胞結合エンベロープウイルス）を曝露する。宿主細胞由来のアクチン重合が、CEVを駆動して隣接細胞に感染させ得るか、またはウイルスが、EEVとして放出され得る。例えば、Kim L. Roberts and Geoffrey L. Smith. Trends in Microbiology 16(10):472-479 (2008)；Geoffrey L. Smith, et al., Journal of General Virology 83:2915-2931 (2002)を参照されたい。
少なくとも6種類のウイルスにコードされたタンパク質が、ワクシニアウイルスのEEVエンベロープ膜の構成要素として報告されている。これらのうち、4種類のタンパク質（A33R、A34R、A56R、およびB5R）は、糖タンパク質であり、1種類（A36R）は、非グリコシル化膜貫通タンパク質であり、1種類（F13L）は、パルミトイル化末梢膜タンパク質である。例えば、Lorenzo et al., Journal of Virology 74(22):10535 (2000)を参照されたい。感染の最中に、これらのタンパク質は、ゴルジ複合体に局在化し、そこでそれらは感染性ウイルス中に組み入れられ、次いで、感染性ウイルスが輸送されて細胞外培地中に放出される。本明細書において提供される際、IMP融合タンパク質は、EEV特異的タンパク質、例えば、F13LまたはA56Rとの融合タンパク質としてEEV膜に方向づけられ、その上に発現する。
FPVは、EEVに関連するタンパク質をコードする3種類の遺伝子を含有する（Moss B. Poxviridae: the viruses and their replication. In: Fields B N, Knipe D M, Howley P M, et al., editors. Fields virology. Philadelphia, Pa: Lippincott-Raven; 1996. pp. 2637-2671；Ogawa R, Calvert J G, Yanagida N, Nazerian K. Insertional inactivation of a fowlpox virus homologue of the vaccinia virus F12L gene inhibits the release of enveloped virions. J Gen Virol. 1993;74: 55-64）。EEV特異的タンパク質FPV108、FPV109、およびFPV198は、それぞれ、ワクシニアウイルスF13L、F12L、およびA34Rに類似している（Calvert J G, Ogawa R, Yanagida N, Nazerian K., Identification and functional analysis of the fowlpox virus homolog of the vaccinia virus p37K major envelope antigen gene. Virology. 1992;191: 783-792）。FPVからは、ワクシニアウイルスEEV遺伝子B5R、A33R、A36R、およびA56Rの明らかなホモログが失われている。しかし、以下で議論されるように、ワクシニアA56Rは、組換え鶏痘ウイルスにおいて機能する。
本明細書において提供される際、IMP融合タンパク質は、EEV特異的タンパク質、例えば、ワクシニアウイルスF13LまたはA56R、FPV108（F13LのFPVホモログ）、FPV109、およびFPV198、ウサギポックスウイルスRBXV041（F13Lのウサギポックスウイルスホモログ）との融合タンパク質としてEEV膜に方向づけられ、その上に発現する。F13L（SEQ ID NO: 1）、FPV108（SEQ ID NO: 2）、およびRBPV041（SEQ ID NO: 3）タンパク質は、それぞれ、ワクシニアウイルス、FPV、またはウサギポックスウイルスの最も外側のEEV膜の内部表面に結合している。これらのタンパク質の各々のアミノ酸配列およびそれらの互いとのアラインメントを、図4に示す。これらの3種類のEEVタンパク質の間の同一性パーセントを、図5に示す。
ワクシニアウイルスWR株由来のF13Lタンパク質のアミノ酸配列を、SEQ ID NO: 1として示す。2個のパルミトイル化システイン残基（SEQ ID NO: 1の85および86位のアミノ酸）に下線を引いている。F13Lは、膜を横切らないため、膜貫通ドメインまたはシグナルペプチドを有さない。
Figure 0007470817000001
A56Rタンパク質は、ワクシニアウイルスヘマグルチニンであり、アミノ末端細胞外（「膜外」）ドメイン、1回膜貫通ドメイン、および細胞質（「膜内」）ドメインを含む、標準的なI型膜内在性タンパク質である。A56Rは、約33個のアミノ酸のN末端シグナルペプチド、約34位～約103位のアミノ酸にわたるIg様ドメイン、約121位～約275位のアミノ酸にわたるストーク領域、約276位～約303位のアミノ酸にわたる膜貫通ドメイン、および約304位～314位のアミノ酸にわたる細胞質（「膜内」）ドメインを含む。DeHaven et al., J. Gen Virol. 92:1971-1980 (2011)を参照されたい。A56Rを、SEQ ID NO: 5として示す。
Figure 0007470817000002
FPV108タンパク質は、F13Lホモログである。EEV膜タンパク質は、EEVの形成、放出、および感染性に関与している。FPV108の配列を、以下に示す。
Figure 0007470817000003
本明細書において提供されるIMP融合タンパク質は、任意の適しているワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、またはウサギポックスウイルスにおいて発現させることができる。ある特定の態様において、EEV融合タンパク質をコードするDNAを、感染性ウイルスが産生されるように、ベクターの増殖および複製にとっては非必須であるワクシニアウイルスゲノム、FPVゲノム、またはウサギポックスウイルスゲノムの領域中に挿入することができる。ワクシニアウイルスゲノムおよび鶏痘ウイルスゲノムの様々な非必須領域が特徴決定されてきているが、外来遺伝子の挿入に最も広く用いられる遺伝子座は、ワクシニアウイルスゲノムのHindIII J断片中に位置するチミジンキナーゼ座であり、鶏痘ウイルスについては、FPV 086と087との間の非コード領域中にある。本明細書において提供されるIMP融合タンパク質は、ポックスウイルス感染細胞の細胞質において機能する転写制御領域との機能的結合の下で、ワクシニアベクター、鶏痘ベクター、またはFPVベクター中に挿入することができる。
本明細書に記載される方法における使用に適しているプロモーターには、非限定的に、初期／後期7.5-kDプロモーター、または初期／後期H5プロモーター（またはそのバリアント）が含まれる。適しているFPVプロモーターには、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、WO1989003879において開示されているものが含まれる。
三分子組換え法
ZaudererのPCT公開番号第WO 00/028016号および米国特許第7,858,559号において開示されている三分子組換えは、関心対象のタンパク質を発現させるため、および、またはワクシニアウイルスにおいてライブラリーを作製するための、高効率、高力価の作製法である。三分子組換え法により、少なくとも90％の効率、および、少なくとも、直接ライゲーションによって得られるものよりも少なくとも2桁高い力価での組換えウイルスの生成が可能になる。
ある特定の局面において、本明細書に記載される、ワクシニアウイルス、FPV、またはウサギポックスウイルスにおける発現およびEEV上での提示のためのIMP融合タンパク質は、三分子組換えによって、ポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、またはウサギポックスウイルスベクターにおいて構築することができる。
ある特定の態様において、ワクシニアウイルスTk遺伝子中のポリヌクレオチド隣接領域、ワクシニアウイルスH5プロモーター、ならびに所望の融合タンパク質についてのコード領域を挿入するためのNcoI制限部位およびBsiWI制限部位を含む、EEVにおける発現のためのIMP融合タンパク質用の導入プラスミドが提供される。ある特定の態様において、鶏痘ウイルスゲノムの遺伝子座086と087との間の配列中のポリヌクレオチド隣接領域、ワクシニアウイルスH5プロモーター、ならびに所望の融合タンパク質についてのコード領域を挿入するためのXhoI制限部位およびNcoI制限部位、ならびにH5プロモーターを含む、EEVにおける発現のためのIMP融合タンパク質用の導入プラスミドが提供される。
膜内在性タンパク質
本開示は、膜内在性タンパク質（IMP）を、タンパク質が天然に発現している細胞において出現するであろうような、タンパク質の天然コンフォメーションにほぼ等しい、コンフォメーションが無傷の状態で発現させるための方法を提供する。本開示にしたがって、IMPを、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、FPV、またはウサギポックスウイルスのEEV上に発現しているポックスウイルスタンパク質との融合タンパク質として発現させる。本明細書において提供されるIMP融合タンパク質は、EEVの表面上で発現されて提示される場合に、結合分子のライブラリー、例えば、抗体提示ライブラリーをスクリーニングするための標的抗原として有用である。
任意のIMPを、本明細書において提供される方法にしたがって、融合タンパク質として構築することができる。ある特定の局面において、IMPは、免疫療法の標的である。ある特定の局面において、IMPは、CD20、CD39、イオンチャネルタンパク質、またはGタンパク質共役受容体（GPCR）などの複数回貫通IMPである。本明細書において提供されるIMP融合タンパク質の構築における使用に適している複数回貫通ヒトIMPには、非限定的に、表1に列挙されるタンパク質が含まれる。
（表１）例示的なヒト複数回貫通膜内在性タンパク質
Figure 0007470817000004
Figure 0007470817000005
Figure 0007470817000006
Figure 0007470817000007
Figure 0007470817000008
Figure 0007470817000009
ある特定の局面において、複数回貫通IMPは、Gタンパク質共役受容体（GPCR）、例えば、FZD4、CXCR4、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体5、またはロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体4である。ある特定の局面において、複数回貫通IMPは、CD20；プリン作動性受容体P2X 2；frizzledクラス受容体7、またはC-X-Cモチーフケモカイン受容体4である。
他の局面において、複数回貫通IMPは、CD39である。ある特定の局面において、複数回貫通IMPは、イオンチャネルタンパク質、例えば、CLC、CLIC、ベストロフィン、およびCFTRを含むおよそ13メンバーからなるチャネルのスーパーファミリーを構成するクロライドチャネル；カリウムチャネル；電位依存性カリウムチャネル、例えば、Kvs、Kirsなど；カルシウム活性化カリウムチャネル、例えば、BKCa、またはMaxiK、SKなど；内向き整流カリウムチャネル；二孔ドメイン（two-pore-domain）カリウムチャネル（リークチャネル）；ナトリウムチャネル；電位依存性ナトリウムチャネル（NaV）；上皮性ナトリウムチャネル（ENaC）；カルシウムチャネル（CaV）；プロトンチャネル；電位依存性プロトンチャネル；非選択性カチオンチャネル；一過性受容体電位チャネル；小胞体チャネル：RyR、SERCA、ORAi；ミトコンドリアチャネル：内膜のmPTP、KATP、BK、IK、CLIC5、Kv7.4、ならびに外膜チャネルとしてのVDACおよびCLIC4；一過性受容体電位チャネル；ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット5；ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット9；ナトリウム電位依存性チャネルαサブユニット10；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーAメンバー1；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーAメンバー2；過分極活性化環状ヌクレオチド依存性カリウムチャネル1；過分極活性化環状ヌクレオチド依存性カリウムおよびナトリウムチャネル2；過分極活性化環状ヌクレオチド依存性カリウムチャネル3；過分極活性化環状ヌクレオチド依存性カリウムチャネル4；カリウム電位依存性チャネルサブファミリーHメンバー1；副甲状腺ホルモン1受容体のいずれかである。
ポックスウイルスEEV上での発現のための、IMP融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本開示は、膜内在性タンパク質またはその断片の、ワクシニアウイルスEEVに特異的なタンパク質またはその断片との融合物としての、生体膜の状況においてコンフォメーションが無傷の形態での発現のための、単離されたポリヌクレオチドを提供する。「コンフォメーションが無傷」によっては、タンパク質が、その天然の状態で出現するであろうと同じ程度に、生体脂質二重層膜の状況において天然コンフォメーションまたは天然に近いコンフォメーションで出現するか、または提示されることが意味される。
1つの局面において、本開示は、膜内在性タンパク質（IMP）またはその断片、例えば、複数回貫通IMPをコードする第1の核酸断片であって、該IMPまたはその断片が、少なくとも1個の膜外領域、少なくとも1個の膜貫通ドメイン、および少なくとも1個の膜内領域を含み、かつ少なくとも1個の膜内領域をコードする第1の核酸断片の一部分が、第1の核酸断片の5'端または3'端に位置している、第1の核酸断片；ならびに、ワクシニアウイルスF13Lタンパク質（SEQ ID NO: 1）もしくはその機能的断片、FPV108（SEQ ID NO: 2）もしくはその機能的断片、またはRPXV041（SEQ ID NO: 3）もしくはその機能的断片をコードする第2の核酸断片であって、IMPの膜内領域をコードする第1の核酸断片の一部分にインフレームで融合している、第2の核酸断片を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。第1の核酸断片と第2の核酸断片とは、場合によっては、リンカーまたは他のスペーサーをコードする核酸によって分離され得る。ポリヌクレオチドは、さらに、ポックスウイルス感染細胞の細胞質におけるポリヌクレオチドの発現を可能にする、第1の核酸断片および第2の核酸断片と機能的に結合したポックスウイルスプロモーターを含むことができる。この局面にしたがって、ポリヌクレオチドを含有するポックスウイルス感染細胞は、細胞外エンベロープビリオン（EEV）、例えばワクシニアウイルスEEV、鶏痘ウイルスEEV、またはウサギポックスウイルスEEVの外側エンベロープ膜の一部として、それぞれ、IMP-F13L融合タンパク質、IMP-FPV108融合タンパク質、またはIMP-RPXV041融合タンパク質を発現することができる。IMPのFPV108との融合物としての発現を示す模式図を、図1B、図1C、および図1Dに示す。
ある特定の局面において、IMPまたはその断片は、イオンチャネルタンパク質および表1に列挙されているタンパク質などの、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、またはさらにそれよりも多い膜貫通（TM）ドメインを含む、複数回貫通膜タンパク質であることができる。
IMPが、奇数のTMドメインを有する場合には、N末端またはC末端のいずれかの、IMPの一方の端が、天然で、生体膜の膜外側に位置することになり、IMPの他方の端が、IMPの膜内側に位置することになる。F13Lタンパク質、FPV108タンパク質、およびRPXV041タンパク質は、ポックスウイルスEEVの外膜に対して全体に内部にあるため、膜に対して内部に位置するN末端またはC末端のIMPの端は、例えば、F13L、FPV108、またはRPXV041に融合していることができる。したがって、タンパク質のN末端が膜外であり、かつC末端が膜内である典型的な7-TMドメインGPCRなどのIMPについて、F13L、FPV108、またはRPXV041のN末端は、例えば、これらのEEV特異的タンパク質について図1Bに示すように、GPCRのC末端に融合していることができる。したがって、第1の核酸断片が奇数の膜貫通ドメインを有するIMPをコードし、第1の核酸断片の5'端が膜外領域をコードし、かつ第1の核酸断片の3'端がIMPの膜内領域をコードしており、後者が、F13L、もしくはFPVホモログFPV108、もしくはRPXV041、またはその断片をコードする核酸断片の5'端に融合している、上記のようなポリヌクレオチドが提供される。
このタイプの例示的なポリヌクレオチドにおいて、第1のポリヌクレオチドは、F13L、FPV108、またはRPXV041のN末端に融合した、ある特定のヒトがんの免疫療法の標的である、ヒトfrizzled-4タンパク質（FZD4）またはその断片をコードすることができる。したがって、FZD4-FPV108融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。この局面にしたがう例示的なポリヌクレオチドは、下記に示すような、成熟融合タンパク質であるSEQ ID NO: 4の20～892位のアミノ酸をコードする。ポリヌクレオチドは、さらに、シグナルペプチド、例えば、FZD4のシグナルペプチドであるSEQ ID NO: 4の1～19位のアミノ酸をコードすることができる。
Figure 0007470817000010
このタイプの別の例示的なポリヌクレオチドにおいて、第1のポリヌクレオチドは、FPV108のN末端に融合した、CXCケモカイン受容体またはその断片をコードすることができる。CXCケモカイン受容体は、同様に、ある特定のヒトがんの免疫療法の標的である。例示的なCXCケモカイン受容体は、CXCR4またはその断片である。したがって、CXCケモカイン受容体-FP108融合タンパク質、例えば、CXCR4-FPV108融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。この局面にしたがう例示的なポリヌクレオチドは、下記に示すようなSEQ ID NO: 9をコードする。
Figure 0007470817000011
当業者に明白であるように、偶数の膜貫通ドメインを有する複数回貫通膜タンパク質は、そのN末端およびそのC末端が、膜の膜外側または膜の膜内側のいずれかの、膜の同じ側であるように、生体膜中に挿入されることになる。F13Lタンパク質、FPV108タンパク質、およびRPXV041タンパク質は、全体的にポックスウイルスEEVの膜内側に位置しているため、膜に適正に埋め込まれたIMP-F13L融合タンパク質、IMP-FPV108融合タンパク質、またはRBXV041融合タンパク質の形成は、IMPまたはその断片のN末端またはC末端の少なくとも1つが膜に対して内部である必要があることになる。IMPが偶数のTMドメインを有し、両方が内部に位置している場合に、ポックスウイルスEEV特異的タンパク質、例えば、F13L、FPV108、またはRPXV041は、IMPのN末端またはIMPのC末端のいずれかに融合していることができる。完全長IMPが、N末端およびC末端が両方とも膜外であるように位置している場合に、奇数のTMドメインを有するIMPの断片は、ポックスウイルスEEV特異的タンパク質に融合していることができる。
したがって、本開示は、第1の核酸断片の5'端および3'端が両方とも膜内領域をコードする、偶数の膜貫通ドメインを有するIMPをコードする上記のようなポリヌクレオチドを提供する。ある特定の局面において、ポックスウイルスEEV特異的タンパク質、例えば、F13L、FPV108、またはRPXV041をコードする核酸断片の3'端は、IMPをコードする核酸断片の5'端に融合していることができ、ある特定の局面において、ポックスウイルスEEV特異的タンパク質をコードする核酸断片の5'端は、IMPをコードする核酸断片の3'端に融合していることができる。
このタイプの例示的なIMPは、B細胞白血病、リンパ腫、および骨髄腫の免疫療法の標的である、ヒトB細胞上に発現する4-TMドメインIMPのヒトCD20である。CD20のC末端がFPV108のN末端に融合しているCD20-FPV108融合タンパク質の図解を、図1Cに示す。したがって、CD20-FPV108融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。この局面にしたがう例示的なポリヌクレオチドは、下記に示すようなSEQ ID NO: 10をコードする。
Figure 0007470817000012
このタイプの別の例示的なポリヌクレオチドにおいて、第1のポリヌクレオチドは、FPV108のN末端に融合した、2個の膜貫通ドメインを有するタンパク質であるCD39またはその断片をコードすることができる。CD39は、ある特定のヒトがんの抗腫瘍免疫応答免疫療法を促進する標的である。したがって、CD39-FPV108融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。この局面にしたがう例示的なポリヌクレオチドは、下記に示すSEQ ID NO: 11をコードする。
Figure 0007470817000013
本開示はまた、第1の核酸断片の5'端が膜内領域をコードする、単一の膜貫通ドメインを有するIMPをコードする上記のようなポリヌクレオチドも提供する。ある特定の局面において、ポックスウイルスEEV特異的タンパク質、例えば、F13L、FPV108、またはRPXV041をコードする核酸断片の3'端は、IMPをコードする核酸断片の5'端に融合していることができ、ある特定の局面において、ポックスウイルスEEV特異的タンパク質をコードする核酸断片の5'端は、IMPをコードする核酸断片の3'端に融合していることができる。
このタイプの例示的なIMPは、種々のがん、炎症性障害、ならびに神経変性障害および神経変性疾患の免疫療法の標的である、単一TMドメインIMPのヒトセマフォリン、SEMAである。SEMA-A56R融合タンパク質、例えば、SEMA4DのC末端がVV A56RのN末端に融合しているセマフォリン4D（SEMA4D）の図解を、図1Aに示す。したがって、SEMA-A56R融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。この局面にしたがう例示的なポリヌクレオチドは、下記に示すようなSEQ ID NO: 6をコードする。
Figure 0007470817000014
上記で提供されるポリヌクレオチドにおいて、第1の核酸断片と第2の核酸断片とは、直接融合していることができるか、あるいは、リンカーまたはスペーサーまたは他のポリペプチド断片をコードする核酸断片によって分離され得る。ある特定の局面において、上記で提供されるポリヌクレオチドは、さらに、第1の核酸断片と第2の核酸断片との間、またはいずれかの側のいずれかに、異種ペプチドポリペプチドをコードする第3の核酸断片を含むことができる。異種ペプチドは、例えば、リンカー配列、アミノ酸タグもしくは標識、または精製を容易にするペプチドもしくはポリペプチド配列であることができる。ある特定の局面において、異種ペプチドは、例えば、融合タンパク質のC末端に融合した6ヒスチジンタグ（SEQ ID NO: 15）である。
ある特定の局面において、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ポックスウイルスプロモーターと機能的に結合している。適しているプロモーターは、本明細書において別の場所で記載される。ある特定の局面において、プロモーターは、ポックスウイルスp7.5プロモーターまたはポックスウイルスH5プロモーターである。あるいは、参照により本明細書に組み入れられるWO 198900379において開示されているものを含む鶏痘ウイルスプロモーターを、用いることができる。
本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ポックスウイルスゲノムであることができるか、またはその一部であることができ、該ポックスウイルスゲノムは、適している許容状態の宿主細胞中への導入時に、その表面上にIMP-F13L融合タンパク質、IMP-FPV108融合タンパク質、またはIMP-RPXV041融合タンパク質を提示する感染性EEVを産生することができる。ある特定の局面において、ポックスウイルスゲノムは、ワクシニアウイルスゲノム、例えば、ワクシニアウイルスWRゲノムまたはMVAゲノムである。他の局面において、ポックスウイルスゲノムは、鶏痘ウイルスゲノムまたはウサギポックスウイルスゲノムである。記載されるポリヌクレオチドを含むポックスウイルスゲノムは、標準的な分子生物学的技法およびウイルス学技法によって、例えば、本明細書に記載される三分子組換えを用いることによって作製することができる。本明細書において提供されるポックスウイルスゲノムは、組換えポックスウイルスの一部として、または、適しているヘルパーウイルス、例えば、鶏痘ウイルスを伴って裸のDNAとして、許容状態の細胞中に導入することができる。本開示は、さらに、提供されるポックスウイルスゲノムを含む組換えポックスウイルス、例えば、組換えワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、またはウサギポックスウイルスを提供する。
IMP-EEV融合タンパク質、組換えポックスウイルスEEV、および作製法
本開示は、さらに、上記のポリヌクレオチドによってコードされるものなどの、IMP-EEV特異的融合タンパク質を提供する。さらに、IMP-EEV特異的融合タンパク質は、組換えポックスウイルスEEV、例えば、組換えワクシニアウイルスEEV、組換え鶏痘ウイルス、または組換えウサギポックスウイルスの表面上に発現させることができる。提供される融合タンパク質を含む組換えポックスウイルスEEV、例えば、組換えワクシニアウイルスEEV、鶏痘ウイルスEEV、またはウサギポックスウイルスEEVが、本開示によって提供される。例えば、ワクシニアウイルスEEVは、FPV108などの鶏痘ウイルスEEV特異的タンパク質、またはRBXV041などのウサギポックスウイルスEEV特異的タンパク質とのIMP融合物を含む、IMP融合タンパク質を発現することができる。同様に、組換え鶏痘ウイルスEEVは、その表面上に、鶏痘ウイルスEEV特異的タンパク質、ワクシニアウイルスEEV特異的タンパク質、またはウサギポックスウイルスEEV特異的タンパク質に融合したIMPを含む、IMP-EEV特異的融合タンパク質を発現することができる。
組換えポックスウイルスEEVは、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、またはウサギポックスウイルスの感染性に対して許容状態の宿主細胞に、上記で提供されるポックスウイルスゲノムを含む適切なポックスウイルスを感染させる工程、および、感染宿主細胞から放出されるEEVを回収する工程を含む方法によって、作製することができる。したがって、上記のようなポリヌクレオチドによってコードされるIMP-ポックスウイルスEEV特異的融合タンパク質が提供される。
さらに、本開示は、ポックスウイルスタンパク質、例えば、F13L、A56RなどのEEVに特異的なワクシニアウイルスタンパク質、またはFPV108、FPV109、もしくはFPV148などのEEVに特異的な鶏痘ウイルスタンパク質、またはRBXV041などのEEVに特異的なウサギポックスウイルスタンパク質に融合した、複数回貫通IMP、および1回貫通IMP、またはさらにちょうどIMPの細胞外ドメイン（ECD）であることができるIMPまたはその断片を含む融合タンパク質、「IMP-EEV融合タンパク質」を提供する。例示的なECD融合タンパク質を、以下に記載する。本明細書において提供されるIMP-EEV融合タンパク質は、IMP、例えば、複数回貫通IMP、1回貫通IMP、またはIMPのECDを、ポックスウイルスEEVの表面上にコンフォメーションが無傷の形態で提示することができる。標的IMPに特異的に結合する抗原結合ドメインについての抗体提示ライブラリーのスクリーニングにおける使用のために、ポックスウイルスEEVの表面上でのIMPの提示は、典型的であるような、組換え細胞、例えば、CHO細胞の表面上にIMPを提示することを上回る、多くの利点をもたらす。例えば、IMPを、細胞上よりもEEV上で、より高密度で発現させることができる。さらに、ポックスウイルスEEVは、細胞の表面上で発現され得る数百とは対照的に、その表面上に約6種類以下の異なるポックスウイルスタンパク質（例えば、ワクシニアウイルスF13L、A56R、B5R、33R、A34R、およびA36R；鶏痘ウイルスFPV108、FPV109、およびFPV148）のみを発現する。最後に、本明細書において提供されるIMP-F13L融合タンパク質、IMP-FPV108融合タンパク質、またはRBXV041融合タンパク質を発現する不活性化EEVは、固体支持体に付着させることができ、ライブラリースクリーニングにおける利便性をもたらす。
したがって、本開示は、膜内在性タンパク質（IMP）またはその断片を、例えば、IMPに特異的な抗原結合ドメインについての抗体提示ライブラリーのスクリーニングにおける使用のために、天然コンフォメーションで提示する方法を提供する。方法は、ポックスウイルス感染性に対して許容状態の宿主細胞に、IMPまたはその断片をポックスウイルスEEV特異的タンパク質またはその膜結合断片との融合タンパク質として発現する組換えポックスウイルスを感染させる工程であって、感染宿主細胞によって産生されるEEVが、EEV外側エンベロープ膜の一部としてIMPを含む、工程；および、宿主細胞から放出されるEEVを回収する工程を含む。IMP。ある特定の局面において、EEV特異的タンパク質またはその断片は、ワクシニアウイルスのA56Rタンパク質、F13Lタンパク質、その任意の膜結合断片、またはその任意の組み合わせ、または、FPV108、FPV109、もしくはFPV148、もしくはRBXV041タンパク質、その任意の膜結合断片、またはその任意の組み合わせであることができる。
ある特定の局面において、EEV特異的タンパク質は、F13L（SEQ ID NO: 1）もしくはその機能的断片、またはFPV108（SEQ ID NO: 2）もしくはその機能的断片、またはRBXV041（SEQ ID NO: 3）もしくはその機能的断片であり、例えば、IMPが、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、または少なくとも7個の膜貫通ドメインを含む複数回貫通膜タンパク質である場合に、融合タンパク質は、上記で提供されるポリヌクレオチドによって発現されるものであることができる。
ある特定の局面において、膜結合EEV特異的タンパク質断片は、SEQ ID NO: 5の108～314位のアミノ酸を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる断片である、ワクシニアウイルスA56Rタンパク質のストークドメイン、膜貫通ドメイン、および膜内ドメインを含む。いくつかの例示的な融合パートナーのうちの1つは、下記のSEQ ID NO: 12中に太字で示す、ヒトFZD4のECDを含む。この例示的局面にしたがって、本開示は、ポックスウイルス感染性に対して許容状態の宿主細胞に、SEQ ID NO: 12の20～370位のアミノ酸を含む融合タンパク質をコードする組換えポックスウイルスを感染させる工程を含む、ヒトFZD4のコンフォメーションが無傷の断片をポックスウイルスEEVの表面上に提示する方法を提供する。ある特定の局面において、融合タンパク質は、さらに、シグナルペプチド、例えば、SEQ ID NO: 12の1～19位のアミノ酸を含むことができる。
Figure 0007470817000015
別の例示的な融合パートナーは、下記のSEQ ID NO: 7中に太字で示す、ヒトErbB2（Her2）のECDを含む。この例示的局面にしたがって、本開示は、ポックスウイルス感染性に対して許容状態の宿主細胞に、SEQ ID NO: 7の20～855位のアミノ酸を含む融合タンパク質をコードする組換えポックスウイルスを感染させる工程を含む、ヒトHer2のコンフォメーションが無傷の断片をポックスウイルスEEVの表面上に提示する方法を提供する。ある特定の局面において、融合タンパク質は、さらに、シグナルペプチド、例えば、SEQ ID NO: 7の1～19位のアミノ酸を含むことができる。
Figure 0007470817000016
別の例示的な融合パートナーは、下記のSEQ ID NO: 8中に太字で示す、ヒトCD100（セマフォリン4D）のECDを含む。この例示的局面にしたがって、本開示は、ポックスウイルス感染性に対して許容状態の宿主細胞に、SEQ ID NO: 8の20～935位のアミノ酸を含む融合タンパク質をコードする組換えポックスウイルスを感染させる工程を含む、ヒトCD100のコンフォメーションが無傷の断片をポックスウイルスEEVの表面上に提示する方法を提供する。ある特定の局面において、融合タンパク質は、さらに、シグナルペプチド、例えば、SEQ ID NO: 8の1～19位のアミノ酸を含むことができる。
Figure 0007470817000017
本開示は、さらに、SEQ ID NO: 4の20～892位のアミノ酸；SEQ ID NO: 9；SEQ ID NO: 4；SEQ ID NO: 12の20～370位のアミノ酸；SEQ ID NO: 8の20～935位のアミノ酸；その任意の組み合わせ、その任意の断片、またはその任意のバリアントを含む融合タンパク質を提供し、該融合タンパク質は、組換え鶏痘ウイルスによって発現される場合に、鶏痘ウイルス細胞外エンベロープビリオン（EEV）の表面上に天然コンフォメーションで出現する。
本明細書において提供される任意のEEV融合タンパク質を含む、組換え鶏痘ウイルスまたは組換えウサギポックスウイルスなどの組換えポックスウイルスEEVもまた、提供される。
抗体を選択する方法
本開示は、さらに、関心対象の複数回貫通膜タンパク質に結合する結合分子、例えば、抗体、抗原結合抗体断片、または抗体様結合分子を選択する方法を提供する。方法は、本明細書に記載される組換えポックスウイルスゲノムを用いて第1の組換えポックスウイルスEEVおよび第2の組換えポックスウイルスEEVを生成させる工程であって、第1の組換えポックスウイルスEEVおよび第2の組換えポックスウイルスEEVが各々、異なるポックスウイルスにおいて生成され、例えば、融合タンパク質上の同じIMPをコードするワクシニアウイルスポリペプチドおよび鶏痘ウイルスポリペプチドである、工程を含む。結果として生じた組換えポックスウイルスEEVの各々は、その表面上にIMPを天然形態で発現する。第1の組換えポックスウイルスEEVを用いて、哺乳動物、例えば、マウスを免疫化する。次いで、複数の抗原結合ドメインを提示する提示ライブラリーと、免疫化哺乳動物より単離されたB細胞から生成させ、抗体支持体に付着した第2の組換えポックスウイルスEEVとを、第2の組換えポックスウイルスEEV上に発現したIMPに特異的に結合する提示パッケージがそれに結合できるように、接触させる。次いで、任意の結合していない提示パッケージを除去して、第2の組換えEEV上に発現したIMPに特異的な抗原結合ドメインを提示する提示パッケージを回収する。ワクシニアウイルスと鶏痘ウイルスとは、抗原的に別個であるため、IMPではなくウイルスを認識して結合する任意の抗体は、このようにして排除される。
複数の結合ドメイン、例えば、抗体、抗体様分子、または他の結合分子を含む、免疫化哺乳動物より単離されたB細胞から生成される任意の提示ライブラリーが、本方法に適している。例えば、提示ライブラリーは、ファージ提示ライブラリー、酵母提示ライブラリー、または本明細書において別の場所で記載されるワクシニアウイルスベクターもしくは鶏痘ウイルスベクターにおいて構築されたライブラリーであることができる。
ある特定の局面において、第2の組換えEEVは、固体支持体への付着の前に不活性化され得る。例えば、EEVは、UV照射の存在下でのソラレン（トリオキサレン、4'-アミノメチル-、塩酸塩）とのインキュベーションによって不活性化され得る。
任意の適している固体支持体を、用いることができる。本明細書において用いられる際、「固体支持体」とは、当技術分野において公知であるような、種々の形態のうちの任意であることができる、EEVを結合できる任意の支持体である。周知の支持体には、組織培養プラスチック、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、および磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、本開示の目的で、ある程度まで可溶性、または不溶性のいずれかであることができる。支持体材料は、カップリングしたEEVが、抗体などの提示された結合分子に結合することができる限り、事実上任意の構造形状を有することができる。このように、支持体形状は、ビーズにおけるように球形であるか、または、試験管の内側表面もしくはロッドの外表面におけるように円柱形であることができる。あるいは、表面は、シート、試験ストリップなどのように平坦であることができる。典型的な支持体には、ビーズ、例えば、磁石によって懸濁液から取り出すことができるDYNABEADS（登録商標）などの磁気ポリスチレンビーズが含まれる。支持体形状には、チューブ、ビーズ、マイクロビーズ、ウェル、プレート、組織培養プレート、ペトリプレート、マイクロプレート、マイクロタイタープレート、フラスコ、スティック、ストリップ、バイアル、パドルなどが含まれ得る。固体支持体は、磁気性または非磁気性であることができる。当業者は、本明細書において提供されるEEVを結合するのに適している多くの他の担体を知っているか、または、同じものを容易に把握することができるであろう。ある特定の局面において、本明細書において提供されるEEVは、例えば、表面に付着したトシル基、エポキシ基、カルボン酸基、またはアミノ基との反応を介して、固体支持体に付着され得る。例えば、EEVは、トシル活性化磁気ビーズ、例えば、MYONE（商標）トシル活性化ビーズの表面に付着され得る。あるいは、EEVは、ビオチン化されて、ストレプトアビジン固体表面、例えば、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズに付着され得る。
別の局面において、本開示は、関心対象の複数回貫通膜タンパク質に結合する結合分子、例えば、抗体、抗原結合抗体断片、または抗体様結合分子を選択するための動物ベースのシステムを提供する。方法は、哺乳動物、例えば、マウスを、その表面上に関心対象のIMPを天然形態で発現する、本明細書に記載される組換えポックスウイルスEEVで免疫化する工程を含む。免疫化は、任意の経路、例えば、腹腔内注射によることができる。免疫化哺乳動物は、IMPに対する抗体の産生を増強するために、1つまたは複数のブースター投与量の組換えポックスウイルスEEVを投与することができる。任意の1回目のブースター用量は、最初の免疫化用量後5～14日以内に、例えば、最初の免疫化用量の投与の5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、13日、もしくは14日後、またはその後に投与することができる。任意の2回目のブースター用量は、1回目のブースター用量後1週間～2週間以内に投与することができる。免疫化動物を、最初の免疫化後またはブースト後の種々の時点に、採血して、例えば、関心対象の抗原を発現する細胞に対するフローサイトメトリーによって、抗IMP抗原結合分子の存在について試験することができる。抗IMP抗原結合分子を、本明細書において上述されるように、免疫化動物の血清から単離する。
本開示は、別の方法で示されない限り、当技術分野の技能内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技法を使用する。そのような技法は、文献において完全に説明されている。（例えば、Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)；D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II；Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；Mullis et al. 米国特許第4,683,195号；Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation；Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)；Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning；学術論文、Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155；Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)；Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV；Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)；およびAusubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)を参照されたい。）
抗体工学の一般原理は、Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)に示されている。タンパク質工学の一般原理は、Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)に示されている。抗体および抗体-ハプテン結合の一般原理は、Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.)；およびSteward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)に示されている。追加的に、当技術分野において公知であり、具体的には記載されていない免疫学における標準的な方法は、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York；Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.)およびMishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)にしたがうことができる。
免疫学の一般原理を示す標準的な参照著作物には、Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York；Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY)；Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY)；Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevier, Amsterdam)；Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunology (4th ed.; H. Freeman & Co.)；Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby)；Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division)；Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlag)；Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)；Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall, 2003)；Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press)；Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)が含まれる。
上記で引用される参照文献のすべて、および本明細書において引用されるすべての参照文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。以下の実施例は、例証を目的として与えられ、限定を目的としては与えられない。
実施例1：融合タンパク質構築
IMPを、以下の方法によって、EEV特異的タンパク質F13L、A56R、およびFPV108を用いてポックスウイルスEEV中に組み込んだ。概して、図1Aに図解するように、HER2、CD100（セマフォリン4D）、およびFZD4の細胞外ドメインを、1回貫通EEV特異的膜タンパク質A56Rとの融合物として組み込んだ。成熟FZD4-ECD-A56R融合タンパク質は、SEQ ID NO: 12の20～370位のアミノ酸を含み、成熟HER2-ECD-A56R融合タンパク質は、SEQ ID NO: 7の20～855位のアミノ酸を含み、および成熟CD100-ECD-A56R融合タンパク質は、SEQ ID NO: 8の20～935位のアミノ酸を含む。成熟CD100-ECD-A56R融合タンパク質は、SEQ ID NO: 8の20～935位のアミノ酸を含む。図1Bおよび図1Cは、GPCR、CD39、およびCD20などの複数回貫通タンパク質をいかに、EEV膜結合タンパク質F13L、FPV108、またはRBXV041との融合物としての複数回貫通膜タンパク質としてEEV中に組み込むことができるかを、図解的に示す。
IMPを、以下の方法によって、EEV特異的タンパク質FPV108またはVV A56Rを用いて鶏痘ウイルスEEV中に組み込んだ。6ウェルプレート中のQT35細胞に、FPVをMOI 1.5で2時間感染させ、次いで、FPV導入ベクターH5-FPV-CD100-A56R-Iresneo、H5-FPV-CD20-FPV108-IresNeo、またはH5-FPV-muCD39-FPV108-IresNeoをトランスフェクトした。48時間後に、ウイルスを採取し、力価測定した。バルクウイルスを用いて、6ウェルプレート中のQT35細胞に一晩感染させ、細胞を、抗原特異的抗体で染色して、選別した。ウイルスを、選別された細胞から凍結／融解によって抽出し、QT35細胞において3～4日間増幅させて、2回目または3回目の選別のために力価測定した。2ラウンドまたは3ラウンドの選別後に、選別されたウイルスを増幅させ、プラークピッキングのためにプレーティングした。増幅されたプラークを、ベクター特異的プライマーおよび遺伝子特異的プライマーでPCRにより確認した。混合挿入物を有するクローンを選び取り、正しい挿入物のみが残るまでの追加のラウンドのために、さらにプラーク形成させた。
FPVをまた、安定細胞株を用いたシュードタイピングによっても生成させた。QT35細胞に、Sema-A56またはCD20-FPV108のいずれかをコードする哺乳動物発現ベクターを、lipofectamineを用いてトランスフェクトした。両方のベクターはまた、G418耐性も有する。薬物選択後に、細胞を、Sema4DまたはCD20の表面発現について選別し、拡大増殖させた。抗原発現細胞を、6ウェルプレートまたはT175フラスコ中に播種し、FPVを感染させた。48時間後に、上清中のEEVを採取し、FPVを、プルダウンアッセイを用いて抗原組込みについて試験した。
FPV中への抗原組込みをまた、感染／トランスフェクションによっても行った。感染／トランスフェクション：6ウェルプレート中のQT35細胞に、FPVをmoi＝1で感染させた。2時間後に、細胞を洗浄し、次いで、Sema ECD-A56の発現がワクシニアH5プロモーターによって制御されるワクシニア導入プラスミドを、lipofectamineを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、EEVを細胞上清から採取し、ProGビーズにコンジュゲートされた抗SEMA4D mabを用いたプルダウンアッセイにおいて試験した。
FZD4、CD20、およびCD39を、FPV108および／またはF13Lとの複数回貫通膜融合物として、鶏痘EEVおよび／またはワクシニアウイルスEEV中に組み込み、Sema-ECDを、A56Rとの1回貫通膜融合物として、鶏痘EEVならびにワクシニアウイルスおよびMVA EEV中に組み込んだ。
プロテインG Dynabeads（ThermoFisher）を、ボルテックスによって混合し、必要とされる量（試料あたり25 ul）を、1.2 mlスクリューキャップチューブにおける1 mlリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に分注した。チューブをDynal磁石（ThermoFisher）上に置き、ビーズを沈殿させた。上清を除去し、ビーズを、1 mlのPBSにおいて1回洗浄した。次いで、ビーズを、抗抗原抗体（25μlのビーズあたり5μgの抗体）を含む0.5 mlのPBSに再懸濁して、混合した。ビーズを、室温で1時間回転させて、抗体を磁気ビーズにカップリングさせた。次いで、ビーズを、Dynal磁石を用いて1 mlのPBSで2回洗浄し、次いで、25μlの最初のビーズ体積あたり25μlのPBSに再懸濁した。EEV試料は、そのまま（上清）用いたか、またはEMEM＋10％ FBSにおいておよそ2×106 pfu/mlに希釈したかのいずれかであった。次いで、抗体カップリングビーズを、室温で1時間回転させて、抗原発現ウイルスの抗体捕捉を促進した。陽性対照と陰性対照の組み合わせを、可能な場合には含めた。次いで、ビーズを、1 mlのEMEM＋10％ FBSで5回洗浄し、各洗浄からの上清を、非結合画分として合わせてプールした。結合画分（ビーズ＋ウイルス）は、1 mlのEMEM＋10％ FBSに再懸濁した。結合画分および非結合画分の両方を、培地における連続希釈によって力価測定し、次いで、アリコートを、単層の細胞（MVAはBHK、FPVはQT35、VVはBSC-1）上に二連でかぶせて、3～4日間感染させた。次いで、細胞を、20％エタノール中の0.1％クリスタルバイオレットで染色し、プラークを計数した。非結合溶液の力価にその体積（6 ml）を掛け、総ウイルスの関数として結合パーセンテージを計算した。陰性対照結合パーセンテージを、この値から引いて、特異的抗原結合パーセンテージを得た。
種々の構築物についてのプルダウンデータを、図6（FZD-F13LおよびQT35-FZD4-FPV108）；図7（CD20-F13L、CD20-FPV108、およびQT35-CD20-FPV108）；図8（CD39-GFP-F13L；CD39-F13L；CD39-FPV108）；ならびに図9（Sema-ECD-A56RおよびQT-Sema-A56R）に示し、これは、構築物がウイルス膜中に組み込まれ、IMPがエンベロープ表面上に発現していることを実証する。
FPV108融合タンパク質（CD20、CD39、FZD4）の調製
F13L融合タンパク質（FZD4-F13L、CD20-F13L、およびCXCR4-F13L）を、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第10,577,427号に記載されるように生成させた。
FPV108融合タンパク質（CD20およびCD39）の調製
遺伝子または遺伝子断片を、標準的な相同組換え法を用いて、FPV中にインフレームで挿入した。関心対象の遺伝子または遺伝子断片、例えば、CD20またはCD39を、Nco/Xho I部位でFPV遺伝子086と087との間に挿入し、FPV108でタグ付加した。CD20遺伝子を、NCO I制限部位を融通するために5'端で修飾した。CD39遺伝子の修飾は、必要とされなかった。Nco/Xho I部位には、FPV左アーム（FPV 084、085、および086）およびFPV右アーム（FPV 087および088）を含む相同組換え部位、ならびに内部リボソーム侵入部位（IRES）エレメントおよびネオマイシン耐性遺伝子（NEO）が隣接して、同じプロモーターの制御下での関心対象の遺伝子またはその断片およびFPV108遺伝子の遺伝子の同時発現を可能にし、かつクローンの選択（NEO耐性）を可能にする。FPVのベクターマップを、図2に示す。結果として生じたCD20-FPV108融合タンパク質およびCD39-FPV108融合タンパク質を、上記に示す（それぞれ、SEQ ID NO: 10およびSEQ ID NO: 11）。
実施例2：EEV上でのCD20-FPV108融合タンパク質およびCD39-FPV108融合タンパク質の発現
QT35細胞に、CD20-FPV融合タンパク質（SEQ ID NO: 10）もしくはCD39-FPV108融合タンパク質（SEQ ID NO: 11）をコードするIMVまたは対照鶏痘ウイルスのいずれかを、細胞あたり1ウイルスの多重感染度（MOI）で2日間感染させ、その後、EEVを含有する上清を採取して、破片を低速遠心分離によって除去した。プロテインG DYNABEADS（登録商標）（110μL）を磁石でプルダウンして、1 mLのPBS＋20μgの精製抗CD20抗体または抗CD39抗体を、適切なようにビーズに添加した。溶液を、室温で穏やかな回転を伴い、30～60分間インキュベートして、抗体をプロテインGビーズにカップリングさせた。10μgの精製mIgG1アイソタイプ対照を、完全なブロッキングを確実にするために溶液に添加し、溶液を、室温で穏やかな回転を伴い、さらに10～30分間インキュベートした。ビーズを、磁石でプルダウンし、1 mLのPBSで1回洗浄して、110μLのPBSに再懸濁した。
50μLの抗CD20-プロテインG DYNABEADS（登録商標）または抗CD39-プロテインG DYNABEADS（登録商標）を、1 mLのCD20-F13Lまたは対照鶏痘EEV上清に添加して、室温で穏やかな回転を伴い、1時間インキュベートした。ビーズを、磁石を用いて沈殿させ、結合していない上清を除去した。次いで、ビーズを、1 mLの、10％ FBSおよび1 mM HEPESを補給したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）培地（10％ DMEM）で5回洗浄した。すべての洗浄液を、結合していない上清とプールした（「非結合」）。次いで、ビーズ（「結合」）を、1 mLの10％ DMEMに再懸濁した。「非結合」および「結合」を、QT35細胞上で力価測定し、メチルセルロースを含有する増殖培地で覆った。2日間プラークを形成させ、次いで、細胞を固定して、0.1％クリスタルバイオレット溶液で染色した。プラークを計数して、「非結合」および「結合」におけるプラーク形成単位（pfu）の数を決定し、そこから、ビーズに結合したEEVの％を計算することができた。抗CD20コーティングビーズおよび抗CD39コーティングビーズに結合したEEV％は、CD20-FPV108 EEV融合タンパク質およびCD39-FPV108 EEV融合タンパク質について、鶏痘ウイルス対照についてよりも有意に高く、CD20およびCD39が、EEV膜表面上に発現していることが示された。
実施例3：鶏痘ウイルス中への抗原組込み
感染／トランスフェクション：QT35細胞に、以下の抗原構築物を発現するFPVを1のmoiで感染させた：CD20-FPV108（SEQ ID NO: 10）、CD39-FPX108（SEQ ID NO: 11）、およびFZD4-FPV108（SEQ ID NO: 4）。2時間後に、細胞を洗浄し、次いで、Sema ECD-A56の発現がワクシニアH5プロモーターによって制御されるワクシニア導入プラスミドを、lipofectamineを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、EEVを細胞上清から採取し、ProGビーズにコンジュゲートされた抗SEMA-4D mabを用いたプルダウンアッセイにおいて試験した。
抗原を発現するEEVのプルダウンアッセイおよび力価：プロテインG Dynabeads（ThermoFisher）を、ボルテックスによって混合し、試料あたり25μlを、1.2 mlスクリューキャップチューブにおける1 mlリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に分注した。チューブをDynal磁石（ThermoFisher）上に置き、ビーズを沈殿させるために2分間放置した。上清を除去し、ビーズを、1 mlのPBSにおいて1回洗浄した。次いで、ビーズを、抗抗原抗体（25μlのビーズあたり5μgの抗体）を含む0.5 mlのPBSに再懸濁して、混合した。ビーズを、室温で1時間回転させて、抗体を磁気ビーズにカップリングさせた。次いで、ビーズを、Dynal磁石を用いて1 mlのPBSで2回洗浄し、次いで、25μlの最初のビーズ体積あたり25μlのPBSに再懸濁した。EEV試料は、そのまま（上清）用いたか、またはM199＋10％ FBSにおいておよそ2×106 pfu/mlに希釈したかのいずれかであった。抗体カップリングビーズを、EEV試料に添加し、室温で1時間回転させて、抗原発現ウイルスの抗体捕捉を促進した。陽性対照と陰性対照の組み合わせを、可能な場合には含めた。次いで、ビーズを、1 mlのM199＋10％ FBSで5回洗浄し、各洗浄からの上清を、非結合画分として合わせてプールした。結合画分（ビーズ＋ウイルス）は、1 mlのM199＋10％ FBSに再懸濁した。結合画分および非結合画分の両方を、培地における連続希釈によって力価測定し、次いで、アリコートを、単層の細胞（FPVはQT35）上に二連で分注し、1～2時間感染させた。細胞を、0.5％メチルセルロースを含有する増殖培地で覆い、37℃、7％ CO2で3～4日間インキュベートした。ウイルスプラークを、20％エタノール中の0.1％クリスタルバイオレットで細胞を染色することによって計数した。非結合溶液の力価にその体積（6 ml）を掛け、総ウイルスの関数として結合パーセンテージを計算した。陰性対照についての結合％を、試料の結合％から引いて、特異的抗原結合パーセンテージを得た。
シュードタイプウイルス産生のためのQT35安定トランスフェクタントの生成：QT35細胞を、6ウェルプレート中に播種し、約80％コンフルエントになるまで増殖させた。細胞に、Lipofectamine 2000試薬を用いて製造業者の説明書に従って、哺乳動物発現ベクター構築物あたり1ウェルでトランスフェクトした。空ベクターおよびベクターなしを、対照として含めた。翌日、細胞を採取して、薬物選択のためにG418を含有するQT35培地（QT35培地：M199培地、10％ FBS、5％トリプトースリン酸ブロス、1 mM HEPES、2 mM L-グルタミン、0.08 mg/ml G418）を含むT175フラスコ中に分注した。薬物を含有する培地を、2～3日ごとに交換して、選択圧を維持した。ベクターなし細胞が死滅した時に、トランスフェクタントを、BD FACS Ariaソーターでの蛍光活性化細胞選別（FACS）のために抗抗原抗体を用いて染色した。高い抗原発現を有する細胞を収集し、培養して、選別後の濃縮を、フローサイトメトリーによって判定した。2回目の選別を行って、高い抗原発現についてさらに濃縮した。
上記の構築物を用いたウイルス膜またはQT35細胞膜中への抗原の組込みを、図6～12に示す。図10および11に示すヒストグラムは、感染（図10および11）またはシュードタイプのためのQT35トランスフェクション（図12）に基づく、細胞膜中への構築物の組込みを示す。図6～9におけるプルダウン棒グラフは、EEV膜中への組込みを示す。
安定細胞株を用いたシュードタイピング：QT35細胞に、Sema-A56、FZD4-FPV108、またはCD20-FPV108のいずれかの哺乳動物発現ベクターを、lipofectamineを用いてトランスフェクトした。すべてのベクターはまた、G418耐性（Neo遺伝子によって付与される）も有する。薬物選択後に、細胞を、Sema-4D、FZD4、またはCD20の表面発現について選別し、拡大増殖させた。抗原発現細胞を、ウェルプレートまたはT175フラスコ中に播種し、FPVを1のmoiで感染させた。48時間後に、上清中のEEVを採取し、上記のようなプルダウンアッセイを用いて、FPVを抗原組込みについて試験した。
FPV組換え体の生成：QT35に、FPVを1.5のMOIで2時間感染させ、次いで、FPV導入ベクターH5-HPV-CD-A56R-IresNeo、H5-FPV-CD20-FPV108-IresNeo、またはH5-FPV-muCD39-FPV108-IresNeoをトランスフェクトした。48時間後に、ウイルスを採集し、力価測定した。
バルクウイルスを用いて、QT35細胞に一晩感染させた。細胞を、抗原特異的抗体で染色して、選別した。FPVを、選別された細胞から凍結／融解によって抽出し、QT35細胞において3～4日間増幅させて、2回目または3回目の選別のために力価測定した。2ラウンドまたは3ラウンドの選別後に、選別されたウイルスを増幅させ、プラークピッキングのためにプレーティングした。増幅されたプラークを、ベクター特異的プライマーおよび遺伝子特異的プライマーを用いたPCRによって確認した。混合挿入物を有するクローンを選択し、正しい挿入物のみが残るまでの追加のラウンドのために、さらにプレーティングした。
シュードタイプウイルス生成のためのQT35安定トランスフェクタントの細胞表面発現を解析するフローサイトメトリー：QT35安定細胞株を、Accutaseを用いて採取し、計数し、沈殿させ、FACS緩衝液（1×PBS、1％ BSA、および2mM EDTA）においてmLあたり200万細胞で再懸濁した。50マイクロリットル（100,000細胞）を、96ウェルV底プレートの各ウェル中に分注した。50マイクロリットルの抗抗原抗体を、各ウェルに添加して、FACS緩衝液中の5 ug/mlの最終濃度の抗体を得た。抗体と細胞とを、氷上で1時間インキュベートした。細胞を沈殿させ、次いで、抗ヒトFc-APC抗体（Biolegend）を含有するFACS緩衝液に再懸濁して、氷上で30分間インキュベートした。細胞を、再度沈殿させ、FACS緩衝液で洗浄して、FACS緩衝液中の0.5％パラホルムアルデヒドで固定し、その後、生／死識別をヨウ化プロピジウムで、BD FACS Canto IIで行った。APCヒストグラムは、PI陰性（生）細胞集団からプロットした。結果を、図10～12に示し、以下で議論する。
FPV組換え体の細胞表面発現をMVAと比較して解析するフローサイトメトリー：QT35細胞を、6ウェル組織培養プレートに一晩播種し、翌日、FPVまたはMVA構築物（IMV）のいずれかを、細胞あたり1ウイルスの多重感染度（MOI）で感染させた。ウイルスを、37℃、7％ CO2で一晩感染させた。翌朝、細胞を、Accutaseを用いて採取し、沈殿させ、5 mlのFACS緩衝液（1×PBS、1％ BSA、および2 mM EDTA）で洗浄した。次いで、各ウェルの細胞を、200μlのFACS緩衝液に再懸濁し、50μlを、96ウェルV底プレートの各ウェル中に分注した。50マイクロリットルの抗抗原抗体を、各ウェルに添加して、FACS緩衝液中の5 ug/mlの最終濃度の抗体を得た。抗体と細胞とを、氷上で1時間インキュベートした。細胞を沈殿させ、次いで、抗ヒトFc-APC抗体（Biolegend）を含有するFACS緩衝液に再懸濁して、氷上で30分間インキュベートした。細胞を、再度沈殿させ、FACS緩衝液で洗浄して、FACS緩衝液中の0.5％パラホルムアルデヒドで固定し、その後、生／死識別をヨウ化プロピジウムで、BD FACS Canto IIで行った。APCヒストグラムは、PI陰性（生）細胞集団からプロットした。
図10および11は、それぞれ、CD20-FPV108構築物およびFPV-H5-muCD39-FPV108構築物を用いた鶏痘におけるIMP（CD20およびCD39）の発現が、対照（MVAにおけるそれぞれ、MVA-T7-CD20-G-FおよびMVA-HA-56-muCD39-F）のものに類似していることを実証する。図12は、CD20-FPV108（図12A）、FZD4-FPV108（図12B）、およびSEMA4D-A56R（図12C）構築物をトランスフェクトしたQT35細胞の細胞表面上の、それぞれ、CD20、FZD4、およびSEMA4Dの発現を示す。
実施例4
実施例4：免疫化に対する抗ウイルス抗体応答を排除するためのワクシニアウイルスおよびFPVでの交互の免疫化およびパンニング
組換えワクシニアウイルス株または鶏痘ウイルス株のいずれかでの免疫化は、組換え抗原に対する非常に強力な抗体応答を生成させる。動物を、組換えポックスウイルス、例えば、組換えワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスで免疫化し、提示ライブラリーを、免疫化動物より単離されたB細胞から生成させる。次いで、免疫化動物から生成された提示ライブラリーを、適切なように、別個の組換えポックスウイルス、例えば、鶏痘ウイルスまたはワクシニアウイルス／MVA上に提示された抗原に対して「パンニング」または「スクリーニング」する。これは、抗ベクター抗体を排除することによって、関心対象の抗原に対する選択を容易にする。このアプローチを用いて、最大で10億の抗体の組み合わせを、インビトロでスクリーニングしてクローニングし、配列決定した。免疫化時間、スクリーニング、および検証を含めて、全プロセスは、約2ヶ月で完了する。
免疫化
ベースライン力価を提供するために、雌のBALB/cマウス（Jackson；8週齢）を、免疫化の前に採血した。9週齢で（0日目に）、群あたり最低3匹のマウスを用いて、マウスを、腹腔内への107 pfuのEEVで免疫化した。マウスを、免疫化後21日目に採血し、0日目のように第2の用量のEEVでブーストした。ブースト後の種々の時点で、マウスを採血し、赤血球を沈殿させるためのBD Microtainer SSTチューブを用いた13,000 rpmで3分間の遠心分離によって、すべての血清を単離した。各マウスを分離したままで、血清を取り出して、新しいチューブにおいて凍結した。場合によっては、マウスを、応答を増加させるためにEEVで2回目にブーストした。
マウス抗CD20抗体の存在について血清を解析するために、各血清試料を、FACS緩衝液（1×PBS、1％ BSA、および2 mM EDTA）において連続希釈し、マウス抗抗原結合について、抗マウス-APC二次検出試薬がその後に続く、関心対象の抗原を発現する細胞に対するフローサイトメトリーによって試験した。各試料のGMFIを、抗マウス-APC単独のGMFIで割って、バックグラウンドに対する倍率を計算した。同じ群および日におけるマウスについての値を、平均して、標準偏差と共にプロットした。図13に示すように、マウスは、第1の用量の投与後に応答を起こし、これは、第2の免疫化用量後に増強される。
図13に示すように、MVA/CD20またはFPV/CD20のいずれかでの免疫化は、CD20+ Wil2S細胞に対する結合を実証する血清抗体価を、結果としてもたらした。
免疫化マウスB細胞からのファージ提示ライブラリーの生成
骨髄および脾臓を、免疫化マウスから採取し、RNAlater（商標）（ThermoFisherカタログ番号AM7020）中に保存した。RNAを、RNAeasy kit（Qiagen）を用いて抽出し、DNAse処理して、nanodropによって定量した。cDNAを、標準的なプロトコールを用いて調製し、その後RNAase処理を行った。cDNA合成のために、マウスγ定常1遺伝子および定常2遺伝子の定常ドメインに特異的なプライマーを用いて、cDNAをプライミングした。これは、活性化B細胞における抗体を選択した。重鎖可変領域を、標準的な方法を用いて、かつBssHII制限部位およびBsteII制限部位を含有するマウスVH遺伝子プライマーおよびJH遺伝子プライマーの混合物を利用して、PCR増幅した。PCR産物を、ゲル精製した。V遺伝子を、NxGen T4 DNAリガーゼ、Lucigen 3024-1を用いて、BssHII/BsteII部位でファージミドプール（pAD）（リボソーム結合部位（RBS）によって分離されたヒト定常領域に融合した21種類のヒト生殖系列可変軽鎖を含有するプールにおけるpADファージミド骨格）中にバルククローニングした。ライゲーション反応物で、エレクトロポレーションを介してTG1 Electrocompetent cells, Lucigen #60502-2を形質転換して、1時間増殖させ、グルコースおよびアンピシリンを含む2YXT緩衝液において振盪を伴い、37℃で5時間、培養物を拡大増殖させた。4℃、6200 rpmで15分間の遠心分離によって、ファージミドライブラリーを採取した。沈殿を、凍結培地（2XYT、グリセロール、グルコース、およびAmpを含有する）に再懸濁した。ライブラリーの品質管理のために、細菌をプレーティングしてライブラリーを力価測定し、ファージミドのサブセットをミニプレップして配列決定した。
ファージを生成させるために、ライブラリーを、2XYT/アンピシリン/グルコースにおいて対数期まで増殖させ、次いで、ハイパーファージを1時間、37℃で感染させ、その後、細胞を、遠心分離によって沈殿させ、2XYT/Amp/カナマイシンに再懸濁し、30°で一晩、振盪を伴って増殖させた。翌日、ファージを、PEG沈殿によって採取して、1 mlのPBSに再懸濁した。
ライブラリーパンニングのために、トシル活性化MyOne DYNABEADS（登録商標）（100μL）を、磁石でプルダウンして、1 mLのPBSで2回洗浄した。ビーズを磁石でプルダウンし、PBSを除去して、3×108 pfuのFPV/CD20-FPV108または対照FPVを、各々50μlのビーズに添加した。ビーズおよび抗原-EEVを、37℃で18～20時間回転させた。ビーズを沈殿させ、上清を除去した。ビーズを、1 mLの1×PBS、10％ FBS、および0.5％ BSAで、37℃で2時間ブロッキングした。ビーズを、沈殿させて、1 mLの1×PBSで洗浄し、その後、CD20については100μLの1×PBSに、対照FPVについては150μlに再懸濁した。CD20免疫化マウスから生成されたファージライブラリー（1 ml、およそ1011 pfu）を、2％ミルクおよび10％ FBSで30分間ブロッキングした。ファージライブラリーを、対照FPVとカップリングした50μlビーズに30分間添加して、バックグラウンドおよび任意の抗FPV結合を枯渇させた。ビーズを磁石でプルダウンして、非結合ファージを、対照FPVでコーティングされた新しい50μlのビーズを含む新しいチューブに移した。ファージを、30分間結合させ；非結合ファージを、上記のように除去し、3回目に対照FPV/ビーズに30分間結合させた。次いで、非結合ファージを、新しいチューブに移し、CD20 FPV/ビーズを添加した。ファージを、RTで1時間、回転を伴って結合させた。非結合ファージを、PBS/10％ FBSにおける10×1 mlの洗浄によって除去し、結合ファージを用いて、対数期TG1細胞に2XYT/グルコースにおいて37°で1時間、振盪を伴って感染させた。1時間後に、ハイパーファージおよびアンピシリンを添加し、細胞を、37°で1時間、振盪を伴って増殖させた。1時間後に、細胞を、遠心分離によって沈殿させ、2XYT/Amp/カナマイシンに再懸濁し、ファージを産生するように30°で一晩、振盪を伴って増殖させた。次の日、ファージを、PEG沈殿によって採取し、1 mlのPBSに再懸濁した。次いで、ファージを、上記のように追加の2ラウンドのパンニングに供した。第3ラウンドのパンニング後に、Tg1細胞に、1時間感染させ、次いで、プラスミドを拡大するように2XYT/Amp/グルコースにおいて30°で一晩増殖させた。
翌日、Rd3のパンニングされたファージミドを有するTG1細胞を、遠心分離して沈殿させ、次いで、プラスミドDNAを抽出した（Qiagen HiSpeed Maxiprep kit、カタログ番号12662）。連結された重鎖および軽鎖を含有する発現カセット（可変軽鎖/定常軽鎖-RBSエレメント-可変重鎖）を、BsrG1制限部位およびNheI制限部位、ならびに標準的なライゲーションおよび形質転換のプロトコールを用いて、哺乳動物発現二重遺伝子ベクターpEFDGV（Kan）中にプールとしてサブクローニングした（pEFDGVは、クローニング時に抗体カセットを完成させるように重鎖定常を含有する）。ライブラリーを、50 mg/mLカナマイシンを含有する4枚の標準的な150 mm LB AGARプレート（LB-Kan50）上にプレーティングして、37℃で一晩インキュベートした。対照の「ベクターのみ」プレートも含めた。コロニーを計数し、バックグラウンドを決定した。およそ5000個のコロニーを、プレートから採取し（プレートあたり10 MLのLB/グリセロールを、各プレートに適用し、滅菌セルスクレーパーを用いて、コロニーを寒天表面からそっと持ち上げた）、プラスミドDNAを、Qiagen plasmid DNA kitを用いて抽出した。続いて、このプールを、SalI/BssHIで消化して、RBSエレメントを除去し、哺乳動物同時発現のためにIRESエレメントで置き換えた。形質転換体を、良好なコロニー分離を確実にするために種々の密度で100 mm LB-Kan50プレート上にプレーティングして、37℃で一晩インキュベートした。94個のコロニーを、1.6 mL/ウェルのLB/Kan50を含有する96ウェルディープウェル増殖プレート中に選び取り、37℃で22時間増殖させた。スポットプレートを、将来、各個々のクローンの今後の増殖を可能にするように配列させた。プラスミドDNAを、Qiagen turbo 96 kitを用いて、この形式で単離した。DNA濃度を、nanodropによって測定して、単一のプレート濃度を割り当てるように平均し、DNAをトランスフェクションに引き渡した。
DNAを、軽鎖可変領域のためのEf1Fフォワードプライマー
Figure 0007470817000018
および重鎖可変領域のためのcGSリバースプライマー
Figure 0007470817000019
の2つのプライマーを用いて、Genewizで配列決定した。
トランスフェクションのために、CHO-S細胞を、125μl DMEM-10％ FBSにおいてトランスフェクションの前日に、96ウェルプレートにウェルあたり50,000細胞で播種した。翌日、75μlのLipofectamine 2000（各ウェル1.65μl）とOptimemとの混合物を、0.8 ugのDNAに添加し、室温で20分間インキュベートした。DMEM-10％ FBSを、細胞を含有するプレートから吸引した。次いで、このLipofectamine、Optimem、およびDNAの混合物を、150μlのOptimemと共にCHO細胞に添加した。プレートを、37℃で3日間インキュベートした。3日後に、プレートを、1200×gで5～7分間回転させ、上清を採取した。次いで、上清を、Wil2S（CD20+）に対する結合およびCHO（CD20陰性）に対する結合の欠如を伴うフローサイトメトリーによって、抗CD20抗体について試験した。図14は、上記のプロトコールを用いて選択された5種類の特有の抗CD20抗体の結合を示す。多数の追加の結合物を特定した。
抗ウイルス抗体応答を排除するための、ワクシニアウイルスおよびFPVでの交互のパンニング
抗原を発現するFPVおよびワクシニアウイルスを、インビトロパンニングに用いた。ファージ提示ライブラリーを、標準的な方法を用いて、ファージミドベクター中の合成V遺伝子配列から作製した。ライブラリーは、およそ1010種類の特有のV遺伝子の組み合わせを含有し、かつ、およそ1012 pfu/mlの力価を有していた。抗ベクター抗体は、異なるラウンドについてウイルスを交替することによって容易に除去されるため、2種類の抗原的に別個のバックグラウンドの株における抗原組換え体が利用可能であることは、所望の抗原に対する抗体の選択を容易にする。
トシル活性化MyOne DYNABEADS（登録商標）（100μL）を、磁石でプルダウンして、1 mLのPBSで2回洗浄した。ビーズを磁石でプルダウンし、PBSを除去して、3×108 pfuのFPV/CD20-FPV108または対照FPVを、各々50μlのビーズに添加した。ビーズおよび抗原-EEVを、37℃で18～20時間回転させた。ビーズを沈殿させ、上清を除去した。ビーズを、1 mLの1×PBS、10％ FBS、および0.5％ BSAで、37℃で2時間ブロッキングした。ビーズを、沈殿させて、1 mLの1×PBSで洗浄し、その後、CD20については100μLの1×PBSに、対照FPVについては150μlに再懸濁した。ファージライブラリー（1 ml、およそ1012 pfu）を、2％ミルクおよび10％ FBSで30分間ブロッキングした。ファージライブラリーを、wt FPVとカップリングした50μlビーズに30分間添加して、バックグラウンドおよび任意の抗FPV結合を枯渇させた。ビーズを磁石でプルダウンして、非結合ファージを、対照FPVでコーティングされた新しい50μlのビーズを含む新しいチューブに移した。ファージを、30分間結合させ；非結合ファージを、上記のように除去して、3回目に対照FPV/ビーズに30分間結合させた。次いで、非結合ファージを、新しいチューブに移し、CD20 FPV/ビーズを添加した。ファージを、RTで1時間、回転を伴って結合させた。非結合ファージを、PBS/10％ FBSにおける10×1 mlの洗浄によって除去し、結合ファージを用いて、対数期TG1細胞に2XYT/グルコースにおいて37°で1時間、振盪を伴って感染させた。1時間後に、ハイパーファージおよびアンピシリンを添加し、細胞を、37°で1時間、振盪を伴って増殖させ、次いで、遠心分離によって沈殿させ、2XYT/Amp/カナマイシンに再懸濁し、30°で一晩、振盪を伴って増殖させた。次の日、ファージを、PEG沈殿によって採取し、1 mlのPBSに再懸濁した。次いで、ファージを、上記のように追加の3ラウンドのパンニングに供した。第2ラウンドのパンニングについては、MVA/CD20および対照MVAを、パンニング抗原として用いた。第3ラウンドについては、FPV/CD20および対照FPVを用い、第4ラウンドについては、MVA/CD20および対照MVAを用いた。第4ラウンドのパンニング後に、Tg1細胞に、結合ファージを1時間感染させ、次いで、プラスミドを拡大するように2XYT/Amp/グルコースにおいて30°で一晩増殖させた。
翌日、Rd3のパンニングされたファージミドを有するTG1細胞を、遠心分離して沈殿させ、次いで、プラスミドDNAを抽出した（Qiagen HiSpeed Maxiprep kit、カタログ番号12662）。連結された重鎖および軽鎖を含有する発現カセット（可変軽鎖/定常軽鎖-RBSエレメント-可変重鎖）を、BsrG1制限部位およびNheI制限部位、ならびに標準的なライゲーションおよび形質転換のプロトコールを用いて、哺乳動物発現二重遺伝子ベクターpEFDGV（Kan）中にプールとしてサブクローニングした（pEFDGVは、クローニング時に抗体カセットを完成させるように重鎖定常を含有する）。ライブラリーを、50 mg/mLカナマイシンを含有する4枚の標準的な150 mm LB AGARプレート（LB-Kan50）上にプレーティングして、37℃で一晩インキュベートした。対照のベクターのみプレートも含めた。コロニーを計数し、バックグラウンドを決定した。およそ5000個のコロニーを、プレートから採取し（プレートあたり10 MLのLB/グリセロールを、各プレートに適用し、滅菌セルスクレーパーを用いて、コロニーを寒天表面からそっと持ち上げた）、プラスミドDNAを、Qiagen plasmid DNA kitを用いて抽出した。続いて、このプールを、SalI/BssHIで消化して、RBSエレメントを除去し、哺乳動物同時発現のためにIRESエレメントで置き換えた。形質転換体を、良好なコロニー分離を確実にするために種々の密度で100 mm LB-Kan50プレート上にプレーティングして、37℃で一晩インキュベートした。94個のコロニーを、1.6 mL/ウェルのLB/Kan50を含有する96ウェルディープウェル増殖プレート中に選び取り、37℃で22時間増殖させた。スポットプレートを、将来、各個々のクローンの今後の増殖を可能にするように配列させた。プラスミドDNAを、Qiagen turbo 96 kitを用いて、この形式で単離した。DNA濃度を、nanodropによって測定して、単一のプレート濃度を割り当てるように平均し、DNAをトランスフェクションに引き渡した。
DNAを、軽鎖可変領域のためのEf1Fフォワードプライマー
Figure 0007470817000020
および重鎖可変領域のためのcGSリバースプライマー
Figure 0007470817000021
の2つのプライマーを用いて、Genewizで配列決定した。
トランスフェクションのために、CHO-S細胞を、125μl DMEM-10％ FBSにおいてトランスフェクションの前日に、96ウェルプレートにウェルあたり50,000細胞で播種した。次の日、75μlのLipofectamine 2000（各ウェル1.65μl）とOptimemとの混合物を、0.8 ugのDNAに添加し、室温で20分間インキュベートした。DMEM-10％ FBSを、細胞を含有するプレートから吸引した。次いで、このLipofectamine、Optimem、およびDNAの混合物を、150μlのOptimemと共にCHO細胞に添加した。プレートを、37℃で3日間インキュベートした。3日後に、プレートを、1200×gで5～7分間回転させ、上清を採取した。次いで、上清を、Wil2S（CD20+）に対する結合およびCHO（CD20陰性）に対する結合の欠如を伴うフローサイトメトリーによって、抗CD20抗体について試験した。図15は、このプロトコールによって選択された5種類の特有の抗CD20抗体の結合を示す。

Claims (48)

  1. （a）膜内在性タンパク質（IMP）またはその断片をコードする第1の核酸断片であって、該IMPまたはその断片が、少なくとも1個の膜外領域、少なくとも1個の膜貫通ドメイン、および少なくとも1個の膜内領域を含み、かつ該少なくとも1個の膜内領域をコードする第1の核酸断片の一部分が、第1の核酸断片の5'端または3'端に位置している、第1の核酸断片；ならびに
    （b）鶏痘ウイルス（FPV）FPV108タンパク質またはその機能的断片をコードする第2の核酸断片であって、IMPの膜内領域をコードする第1の核酸断片の一部分にインフレームで融合している、第2の核酸断片
    を含む、単離されたポリヌクレオチドであって；
    該ポリヌクレオチドを含むポックスウイルス感染細胞が、細胞外エンベロープビリオン（EEV）の外側エンベロープ膜の一部としてIMP-FPV108融合タンパク質を発現することができる、
    前記単離されたポリヌクレオチド。
  2. 第2の核酸が、SEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を含むFPV108タンパク質またはその機能的断片をコードする、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
  3. IMPが、少なくとも2個の膜貫通ドメインを含む複数回貫通膜タンパク質である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
  4. IMPが奇数の膜貫通ドメインを有し、第1の核酸断片の5'端が膜外領域をコードし、第1の核酸断片の3'端が膜内領域をコードし、かつ第2のポリヌクレオチドの5'端が第1の核酸断片の3'端に融合している、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
  5. IMPが、Gタンパク質共役受容体（GPCR）を含む、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
  6. IMPが、ヒトfrizzled-4タンパク質（FZD4）またはその断片である、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
  7. IMPが、CXCケモカイン受容体CXCRまたはその断片である、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
  8. CXCケモカイン受容体が、CXCR4またはその断片である、請求項7に記載のポリヌクレオチド。
  9. IMPが偶数の膜貫通ドメインを有し、第1の核酸断片の5'端および3'端が両方とも膜内領域をコードし、かつ第2の核酸断片が第1の核酸断片の3'端に融合している、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
  10. IMPが、ヒトCD20もしくはCD39タンパク質、またはその断片である、請求項9に記載のポリヌクレオチド。
  11. ポックスウイルスプロモーターと機能的に結合している、請求項1～10のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  12. 第1の核酸断片と第2の核酸断片とが直接融合している、請求項1～11のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  13. 異種ペプチドをコードする第3の核酸断片をさらに含む、請求項1～12のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
  14. 異種ペプチドが、リンカー配列、アミノ酸タグもしくは標識、または精製を容易にするペプチドもしくはポリペプチド配列を含む、請求項13に記載のポリヌクレオチド。
  15. 異種ペプチドがヒスチジンタグを含む、請求項14に記載のポリヌクレオチド。
  16. ポックスウイルスプロモーターと機能的に結合している、請求項1～15のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  17. ポックスウイルスプロモーターが、p7.5、H5、またはT7である、請求項16に記載のポリヌクレオチド。
  18. 請求項1～17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、FPV108融合タンパク質。
  19. 請求項1～17のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ポックスウイルスゲノム。
  20. ワクシニアウイルスゲノムである、請求項19に記載のポックスウイルスゲノム。
  21. 鶏痘ウイルスゲノムである、請求項19に記載のポックスウイルスゲノム。
  22. ウサギポックスウイルスゲノムである、請求項19に記載のポックスウイルスゲノム。
  23. 請求項20～22のいずれか一項に記載のポックスウイルスゲノムを含む、組換えポックスウイルスEEV。
  24. （a）インビトロで、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、またはウサギポックスウイルスの感染性に対して許容状態の宿主細胞に、それぞれ、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、またはウサギポックスウイルスを感染させる工程であって、該ワクシニアウイルスが請求項20に記載のポックスウイルスゲノムを含み、該鶏痘ウイルスが請求項21に記載のポックスウイルスゲノムを含み、かつ該ウサギポックスウイルスが請求項22に記載のポックスウイルスゲノムを含む、工程；および
    （b）宿主細胞から放出されるEEVを回収する工程
    を含む、請求項23に記載の組換えポックスウイルスEEVを作製する方法。
  25. （a）インビトロで、ポックスウイルス感染性に対して許容状態の宿主細胞に、膜内在性タンパク質（IMP）またはその断片をEEV特異的タンパク質FPV108またはその膜結合断片との融合タンパク質として発現する組換えポックスウイルスを感染させる工程であって、感染宿主細胞によって産生されるEEVが、EEV外側エンベロープ膜の一部としてIMP融合タンパク質を含む、工程；
    （b）宿主細胞から放出されるEEVを回収する工程
    を含む、IMPまたはその断片を天然コンフォメーションで提示する方法であって、
    該IMPまたはその断片が、EEVの表面上に天然コンフォメーションで提示される、前記方法。
  26. IMPが、少なくとも2個の膜貫通ドメインを含む複数回貫通膜タンパク質である、請求項25に記載の方法。
  27. IMPが、7回膜貫通ドメインを含むGタンパク質共役受容体（GPCR）を含み、かつFPV108が、IMPのC末端に融合している、請求項26に記載の方法。
  28. IMPが、ヒトfrizzled-4タンパク質（FZD4）またはその断片である、請求項27に記載の方法。
  29. IMPが、CXCケモカイン受容体である、請求項26に記載の方法。
  30. CXCケモカイン受容体が、CXCR4またはその断片である、請求項29に記載の方法。
  31. IMPまたはその断片が偶数の膜貫通ドメインを有し、かつIMPまたはその断片のN末端およびC末端が両方とも膜内である、請求項25または26に記載の方法。
  32. FPV108が、IMPのC末端に融合している、請求項31に記載の方法。
  33. IMPが、ヒトCD20またはその断片である、請求項32に記載の方法。
  34. （a）SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、またはSEQ ID NO: 11のアミノ酸配列を含む、融合タンパク質であって、組換えポックスウイルスによって発現される場合に、ポックスウイルス細胞外エンベロープビリオン（EEV）の表面上に天然コンフォメーションで出現する、前記融合タンパク質。
  35. 請求項34に記載の融合タンパク質を含む、組換えポックスウイルスEEV。
  36. 鶏痘ウイルスFPV108タンパク質またはその膜結合断片に融合した異種IMPまたはその断片を含む、組換えポックスウイルスEEVであって、該融合タンパク質が、EEV外側エンベロープ膜に位置しており、該IMPまたはその断片が、EEVの表面上にその天然コンフォメーションで提示される、前記組換えポックスウイルスEEV。
  37. ポックスウイルスEEVが、鶏痘ウイルスEEVである、請求項36に記載の組換えポックスウイルスEEV。
  38. 以下の工程を含む、複数回貫通膜タンパク質（IMP）に結合する抗体を選択する方法：
    （a）請求項23、35、36、または37に記載の組換えEEVを、固体支持体に付着させる工程；
    （b）複数の抗原結合ドメインを提示する提示パッケージを含む抗体提示ライブラリーを提供する工程；
    （c）該提示ライブラリーとEEVとを、EEV上に発現したIMPに特異的に結合する抗原結合ドメインを提示する提示パッケージがそれに結合できるように、接触させる工程；
    （d）結合していない提示パッケージを除去する工程；および
    （e）EEV上に発現したIMPに特異的な抗原結合ドメインを提示する提示パッケージを回収する工程。
  39. 組換えEEVが、固体支持体への付着の前に不活性化される、請求項38に記載の方法。
  40. EEVが、UV照射の存在下でのソラレン（トリオキサレン、4'-アミノメチル-、塩酸塩）とのインキュベーションによって不活性化される、請求項39に記載の方法。
  41. EEVが、表面に付着したトシル基との反応を介して、固体表面に付着される、請求項38～40のいずれか一項に記載の方法。
  42. 固体表面が、トシル活性化磁気ビーズである、請求項41に記載の方法。
  43. EEVが、ビオチン化されて、ストレプトアビジンコーティング固体表面に付着される、請求項38～40のいずれか一項に記載の方法。
  44. 固体表面が、ストレプトアビジンコーティング磁気ビーズである、請求項43に記載の方法。
  45. 以下の工程を含む、複数回貫通膜タンパク質（IMP）に結合する抗体を選択する方法：
    （a）請求項23に記載の第1の組換えポックスウイルスEEVおよび第2の組換えポックスウイルスEEVを提供する工程であって、第1の組換えポックスウイルスEEVおよび第2の組換えポックスウイルスEEVが各々、異なるタイプのポックスウイルスにおいて生成される、工程；
    （b）動物を第1の組換えポックスウイルスで免疫化する工程；
    （b）複数の抗原結合ドメインを提示する提示パッケージを含む提示ライブラリーと第2の組換えポックスウイルスとを、EEV上に発現したIMPに特異的に結合する抗原結合ドメインを提示する提示パッケージがそれに結合できるように、接触させる工程であって、該提示ライブラリーが、免疫化哺乳動物より単離されたB細胞から生成される、工程；
    （c）結合していない提示パッケージを除去する工程；および
    （d）第2の組換えEEV上に発現したIMPに特異的な抗原結合ドメインを提示する提示パッケージを回収する工程。
  46. 第1の組換えポックスウイルスEEVが、ワクシニアウイルスEEVである、請求項45に記載の方法。
  47. 第2の組換えポックスウイルスEEVが、鶏痘ウイルスEEVである、請求項46に記載の方法。
  48. 以下の工程を含む、複数回貫通膜タンパク質（IMP）に結合する抗体またはその抗原結合断片を選択する方法：
    （a）請求項23に記載の組換えポックスウイルスEEVを提供する工程；
    （b）哺乳動物を組換えポックスウイルスEEVで免疫化する工程；
    （c）任意で、該哺乳動物を第2の用量の組換えポックスウイルスEEVで免疫化する工程；
    （d）免疫化動物から血清を単離する工程；および
    （e）組換えポックスウイルスEEV上に発現したIMPに特異的な抗原結合ドメインを含む抗体またはその抗原結合断片を単離する工程。
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