ES2935585T3 - Presentación de proteínas integrales de membrana presentadas sobre viriones con envoltura extracelular de poxvirus - Google Patents

Presentación de proteínas integrales de membrana presentadas sobre viriones con envoltura extracelular de poxvirus Download PDF

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Renee A Kirk
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Abstract

Esta divulgación proporciona composiciones y métodos para expresar y mostrar proteínas integrales de membrana (IMP) aisladas o fragmentos de las mismas en una conformación nativa para su uso en la exploración, selección e identificación de anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos que se unen a un IMP objetivo de interés. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Presentación de proteínas integrales de membrana presentadas sobre viriones con envoltura extracelular de poxvirus
Antecedentes
Se están empleando anticuerpos de especificidad definida en un número creciente de aplicaciones terapéuticas diversas. Se han utilizado varios métodos para obtener anticuerpos útiles para el uso terapéutico humano. Estos incluyen anticuerpos quiméricos y humanizados, y anticuerpos totalmente humanos seleccionados de bancos, por ejemplo, bancos de presentación de fagos, o de animales transgénicos. Los bancos de inmunoglobulinas construidos en bacteriófagos pueden proceder de células productoras de anticuerpos de individuos no expuestos o específicamente inmunizados y podrían, en principio, incluir nuevos y diversos emparejamientos de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas humanas. Aunque esta estrategia no adolece de una limitación intrínseca del repertorio, requiere que las regiones determinantes de la complementariedad ("complementarity determining regions", CDR) del fragmento de inmunoglobulina expresado se sinteticen y se plieguen correctamente en células bacterianas. Sin embargo, muchas regiones de unión al antígeno son difíciles de ensamblar correctamente como una proteína de fusión en células bacterianas. Además, la proteína no sufrirá las modificaciones postraduccionales eucariotas normales. En consecuencia, este método impone un filtro selectivo diferente a las especificidades de anticuerpos que pueden obtenerse. Como alternativa, se pueden aislar anticuerpos totalmente humanos a partir de bancos en sistemas eucariotas, por ejemplo, presentación en levaduras, presentación retroviral o expresión en virus de ADN, como los poxvirus. Véase, por ejemplo la patente de EE. UU. n.° 7858559y la solicitud de patente de EE. UU. n.° de publicación 2013-028892.
Muchas dianas importantes para anticuerpos terapéuticos son proteínas integrales de membrana ("integral membrane proteins", IMP), por ejemplo, proteínas de membrana de paso múltiple (GPCR, canales iónicos, etc.) que son difíciles de expresar y purificar en un estado conformacionalmente intacto. La ausencia de proteínas diana correctamente plegadas en estado aislado dificulta la identificación y selección de anticuerpos contra estas dianas. Aunque algunas IMP pueden expresarse en la superficie de células, por ejemplo, células de mamíferos, las células enteras son problemáticas para su uso en el descubrimiento de anticuerpos, porque son mezclas complejas de antígenos, la expresión de la diana puede ser baja y porque algunos paquetes de presentación utilizados para construir bancos de anticuerpos (por ejemplo, bancos de anticuerpos del virus vaccinia) pueden unirse a células enteras de forma no específica. Se ha notificado que las IMP (incluidas las IMP con múltiples bucles transmembrana) pueden presentarse sobre partículas similares a virus ("virus-like particles", VLP) mediante la fusión de las IMP con una gag retroviral, que es una proteína específica del virión con envoltura extracelular ("extracellular enveloped virion", EEV). Dichas VLP pueden utilizarse para seleccionar anticuerpos contra la IMP (documento WO2015/193143 y documento US2004/014033). También se ha divulgado la presentación de un fragmento de anticuerpo en la superficie de un EEV, mediante la producción de una quimera entre el fragmento de anticuerpo y la proteína de vaccinia A56R (documento WO2013/163602). Siguen siendo necesarios nuevos métodos para expresar y presentar IMP diana de interés en su conformación nativa a una concentración suficiente y con una competencia mínima de otras proteínas celulares para permitir la identificación y la selección de anticuerpos terapéuticos y moléculas similares a anticuerpos a partir de bancos de presentación.
Sumario
La presente divulgación proporciona composiciones y métodos para expresar y presentar proteínas integrales de membrana (IMP) aisladas, o sus fragmentos, en una conformación nativa para su uso en el cribado, la selección y la identificación de anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos que se unen a una IMP diana de interés. La invención, resumida en este punto, se define en las reivindicaciones.
En un primer aspecto, la divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende:
(a) un primer fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína integral de membrana (IMP), o uno de sus fragmentos, en el que la IMP, o uno de sus fragmentos, comprende al menos una región extramembrana, al menos un dominio transmembrana y al menos una región intramembrana, y en el que una porción del primer fragmento de ácido nucleico que codifica al menos una región intramembrana está situada en el extremo 5' o 3' del primer fragmento de ácido nucleico; y
(b) un segundo fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína F13L del virus vaccinia, o uno de sus fragmentos funcionales, en el que el segundo fragmento de ácido nucleico está fusionada dentro del marco con una porción del primer fragmento de ácido nucleico que codifica una región intramembrana de la IMP;
en el que una célula infectada por el virus vaccinia que comprende el polinucleótido puede expresar una proteína de fusión IMP-F13L como parte de la membrana de la envoltura externa de un virión con envoltura extracelular (EEV).
En algunas realizaciones, la IMP del primer aspecto de la divulgación es una proteína de membrana de paso múltiple que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete dominios transmembrana.
En algunas realizaciones, la IMP de algunas realizaciones del primer aspecto de la divulgación tiene un número impar de dominios transmembrana, el extremo 5' del primer fragmento de ácido nucleico del primer aspecto de la divulgación codifica una región extramembrana, el extremo 3' de dicho primer fragmento de ácido nucleico codifica una región intramembrana, y el extremo 5' del segundo polinucleótido del primer aspecto de la divulgación está fusionado con el extremo 3' del primer fragmento de ácido nucleico.
En algunas realizaciones, la IMP de las realizaciones del primer aspecto de la divulgación comprende:
(a) un receptor acoplado a proteína G ("G-protein coupled receptor", GPCR);
(b) la proteína humana frizzled-4 (FZD4), o uno de sus fragmentos;
(c) un receptor de quimiocinas CXC; o
(d) el receptor de quimiocinas CXC CXCR4, o uno de sus fragmentos.
En algunas realizaciones, la IMP de algunas realizaciones del primer aspecto de la divulgación tiene un número par de dominios transmembrana, ambos extremos 5' y 3' del primer fragmento de ácido nucleico del primer aspecto de la divulgación codifican regiones intramembrana, y el segundo fragmento de ácido nucleico del primer aspecto de la invención está fusionado con el extremo 3' del primer fragmento de ácido nucleico.
En algunas realizaciones, la IMP del primer aspecto de la invención es la proteína CD20 humana, o uno de sus fragmentos.
En algunas realizaciones, el polinucleótido de las realizaciones del primer aspecto de la divulgación se asocia operablemente con un promotor de poxvirus.
En un segundo aspecto, la divulgación proporciona la proteína de fusión F13L codificada por el polinucleótido de las realizaciones del primer aspecto de la divulgación.
En un tercer aspecto, la divulgación proporciona un genoma de poxvirus que comprende el polinucleótido de las realizaciones del primer aspecto de la divulgación.
En algunas realizaciones, el genoma de poxvirus del tercer aspecto de la divulgación es un genoma de virus vaccinia. En un cuarto aspecto, la divulgación proporciona un método para producir un EEV de virus vaccinia recombinante, que comprende:
(a) infectar una célula hospedadora que puede ser infectada por el virus vaccinia con un virus vaccinia que comprende el genoma del virus vaccinia de las realizaciones del segundo aspecto de la divulgación, y (b) recuperar los EEV liberados de la célula hospedadora.
En un quinto aspecto, la divulgación proporciona un método para presentar una proteína integral de membrana (PIM), o uno de sus fragmentos, en una conformación nativa que comprende:
(a) infectar células hospedadoras que pueden ser infectadas por poxvirus con un virus vaccinia recombinante que expresa la IMP, o uno de sus fragmentos, como una proteína de fusión con la proteína F13L del virus vaccinia, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo la IMP una proteína de membrana de paso múltiple que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete dominios transmembrana, y en el que los EEV producidos por la célula hospedadora infectada comprenden la proteína de fusión IMP-F13L como parte de la membrana de la envoltura externa del EEV; (b) recuperar los EEV liberados de la célula hospedadora;
en el que la IMP, o uno de sus fragmentos, se presenta en la superficie del EEV en una conformación nativa.
En algunas realizaciones, la IMP del quinto aspecto de la divulgación:
(a) comprende un receptor acoplado a proteína G (GPCR)
que comprende siete dominios transmembrana seleccionados del grupo que consiste en:
(i) la proteína humana frizzled-4 (FZD4), o uno de sus fragmentos;
(ii) un receptor de quimiocinas CXC; o
(iii) el receptor de quimiocinas CXC CXCR4, o uno de sus fragmentos;
en la que F13L está fusionado con el C-terminal de la IMP; o
(b) es la CD20 humana, o uno de sus fragmentos.
En algunas realizaciones, la proteína de fusión F13L del segundo aspecto de la divulgación comprende:
(a) los aminoácidos 20 a 892 de SEQ ID NO: 2;
(b) SEQ ID NO: 3; o
(c) SEQ ID NO: 4;
y la proteína de fusión, cuando es expresada por un poxvirus recombinante, aparece en la superficie de un virión con envoltura extracelular (EEV) de poxvirus en una conformación nativa.
En un sexto aspecto, la divulgación proporciona un EEV de poxvirus recombinante que comprende una proteína de fusión IMP-F13L codificada por el polinucleótido de las realizaciones del primer aspecto de la divulgación, en el que la IMP es una proteína de membrana de paso múltiple heteróloga que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete dominios transmembrana, y en el que la proteína de fusión está situada en la membrana de la envoltura externa del EEV, y en el que la IMP, o uno de sus fragmentos ,se presenta en la superficie del EEV en su conformación nativa.
En algunas realizaciones, el EEV de poxvirus recombinante del sexto aspecto de la divulgación es un EEV de virus vaccinia recombinante.
En un séptimo aspecto, la divulgación proporciona un método para seleccionar anticuerpos que se unen a una proteína de membrana de paso múltiple que comprende:
(a) fijar el EEV recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16 a un soporte sólido;
(b) proporcionar un banco de presentación de anticuerpos, en el que el banco comprende paquetes de presentación que muestran una pluralidad de dominios de unión al antígeno;
(c) poner en contacto el banco de presentación con el EEV de modo que los paquetes de presentación que presentan dominios de unión al antígeno que se unen específicamente a la IMP expresada en el EEV puedan unirse a ella;
(d) retirar los paquetes de presentación que no se han unido; y
(e) recuperar los paquetes de presentación que presentan un dominio de unión al antígeno específico para la IMP expresada sobre el EEV.
Breve descripción de los dibujos/figuras
Figura 1A-C: Representación esquemática de proteínas integrales de membrana (IMP), o uno de sus fragmentos, fusionadas con proteínas específicas de viriones con envoltura extracelular (EEV) del virus vaccinia o sus fragmentos. Las líneas horizontales paralelas son un diagrama de la membrana externa del EEV. La figura 1A representa esquemáticamente el dominio extracelular ("extracellular domain", ECD) de una IMP fusionada con un fragmento de la proteína de vaccinia A56R que incluye el dominio transmembrana y el dominio intramembrana. La figura 1B representa esquemáticamente la topología de un receptor acoplado a proteína G típico fusionado con la proteína F13L específica del EVV del virus vaccinia. F13L se asocia con la cara interna de la membrana externa de la EEV a través de la palmitoilación. La figura 1C representa esquemáticamente la topología de una IMP con un número par de dominios transmembrana (por ejemplo, CD20), fusionada con F13L.
Figura 2: Demostración de la incorporación de las proteínas de fusión CD20-F13L y CD20 ECD-A56R a partículas de EEV de virus vaccinia.
Figura 3A: Demostración de la incorporación preferente de la proteína de fusión CD20-F13L sobre la CD20 sin marcar en partículas de EEV de virus vaccinia.
Figura 3B: Demostración de la incorporación preferente de la proteína de fusión FZD4-F13L sobre la FZD4 sin marcar (sin fusionar) en partículas de EEV de virus vaccinia.
Figura 4: Incorporación de más proteínas de fusión IMP-EEV en EEV de virus vaccinia. "CD20" es una proteína de fusión CD20-F13L, "CXCR4" es una proteína de fusión CXCR4-F13L, "Her2" es una proteína de fusión Her2 ECD-A56R; y "CD100" es una proteína de fusión CD100 ECD-A56R.
Figura 5: Esquema de ensayo para el cribado de un banco de presentación de anticuerpos para detectar paquetes de presentación que se unen a una IMP de interés expresada sobre EEV de virus vaccinia.
Figura 6A: Unión del EEV de virus vaccinia que expresa un anticuerpo anti-HER-2 al EEV de virus vaccinia que expresa el ECD HER2 como fusión con la proteína A56R del virus vaccinia, unido por grupos tosilo a esferas magnéticas.
Figura 6B: Unión del EEV de virus vaccinia que expresa un anticuerpo anti-FZD al EEV de virus vaccinia que expresa FZD4 como fusión con la proteína F13L del virus vaccinia, unido por grupos tosilo a esferas magnéticas.
Figura 6C: Unión del EEV de virus vaccinia que expresa un anticuerpo anti-CXCR4 al EEV de virus vaccinia que expresa el CXCR4 como fusión con la proteína F13L del virus vaccinia, unido por grupos tosilo a esferas magnéticas.
Figura 6D: Unión del EEV de virus vaccinia que expresa un anticuerpo anti-CD100 ("sema") al EEV de virus vaccinia que expresa el ECD CD100 como fusión con la proteína a 56R del virus vaccinia, unido por grupos tosilo a esferas magnéticas.
Figura 7: Barridos FACS que muestran el enriquecimiento en anticuerpos anti-FZD4 tras la inmunoadsorción sobre EEV inactivados que expresan FZD-ECD-A45R unidos por grupos tosilo a esferas magnéticas después de 3 (Rd3), 4 (Rd4) y 5 (Rd5) rondas de inmunoadsorción. La fila superior muestra células infectadas por el virus que expresan anticuerpos teñidas con FZD-His 10 pg/ml, seguido de anti-His-Dyelight650 y anti-Fab-FITC. La fila inferior muestra células infectadas por el virus que expresan anticuerpos teñidas con CD100-His10 pg/ml (control negativo), seguido de anti-His-Dyelight650 y anti-Fab-FITC.
Figura 8: Incorporación de dos fusiones de proteínas diferentes (fusión HA-A56R y fusión FZD4-F13L) en EVV de virus vaccinia. Los EEV que expresaban la fusión HA-A56R sola, la fusión FZD4-F13L sola, o ambas proteínas de fusión, se sometieron a pruebas de unión a esferas recubiertas con anti-FZD4 o con anti-HA.
Figura 9: Recuperación específica de EEV que expresan anti-CXCR4 mediante esferas magnéticas recubiertas con EEV que expresan tanto una fusión HA-A56R como una fusión CXCR4-F13L. El antígeno-EEV se acopló a esferas recubiertas con anti-HA.
Figura 10: Unión de EEV biotinilados de virus vaccinia que expresan las proteínas de fusión indicadas a esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina.
Descripción detallada
Esta divulgación proporciona métodos y composiciones para expresar y presentar proteínas integrales de membrana (IMP), por ejemplo, de paso múltiple (IMP), en un estado conformacionalmente intacto o nativo en la superficie de partículas de viriones con envoltura extracelular (EEV) de poxvirus, por ejemplo, virus vaccinia, como una fusión con un segmento polipeptídico de una proteína asociada a membrana específica de EEV, por ejemplo, F13L.
La divulgación técnica detallada que se expone a continuación y el resumen de enseñanzas que le sigue pueden, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención per se, y también pueden proporcionar antecedentes técnicos para desarrollos técnicos relacionados. Se apreciará que los antecedentes técnicos adicionales proporcionados no pretenden definir la invención como tal (que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas), sino más bien situarla en un contexto técnico más amplio. En consecuencia, se apreciará que los términos "realizaciones", "aspectos", "materia" reflejan detalles específicos de la divulgación, pero, en la medida en que se refieren a una parte de los antecedentes técnicos adicionales, no pretenden definir como parte de la invención la materia que no entra dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Definiciones
El término "una" (o "un") entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, "una molécula de unión" se entiende que representa una o más moléculas de unión. Como tales, los términos "un" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" pueden utilizarse indistintamente en el presente documento.
Además, "y/o", cuando se utiliza en el presente documento, debe entenderse como la divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados, con o sin la otra. Por lo tanto, la expresión "y/o" utilizada en una expresión como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Asimismo, la expresión "y/o" utilizada en una expresión como "A, B y/o C" pretende abarcar cada una de las siguientes realizaciones: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).
A menos que se definan de otro modo, los términos y las expresiones técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden habitualmente los expertos en la materia con la que está relacionada esta divulgación. Por ejemplo, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; y the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a los expertos un diccionario general de muchos de los términos y expresiones utilizados en la presente divulgación.
Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación amino-carboxi. Los epígrafes que figuran en el presente documento no constituyen limitaciones de los diversos aspectos o facetas de la divulgación, que pueden tenerse por referencia a la especificación en su conjunto. Por consiguiente, los términos y expresiones definidos inmediatamente a continuación se definen de forma más completa remitiéndose a la memoria descriptiva en su totalidad.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "de origen no natural" o sus variantes gramaticales que acompaña a una sustancia, composición, entidad y/o cualquier combinación de sustancias, composiciones o entidades es una expresión condicional que excluye explícitamente, pero solo excluye a aquellas formas de la sustancia, composición, entidad y/o cualquier combinación de sustancias, composiciones o entidades que los expertos en la materia comprendan que son "de origen natural", o que un juez o un órgano administrativo o judicial haya determinado o interpretado que son naturales, o que puedan ser determinadas o interpretadas como "de origen natural" en cualquier momento por estos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido" pretende abarcar un "polipéptido" en singular, así como "polipéptidos" en plural, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término o expresión utilizado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos se incluyen en la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" puede utilizarse en lugar de cualquiera de estos términos o indistintamente con ellos. El término "polipéptido" también se refiere a los productos de las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, incluidas, entre otras, la glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación y derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido puede proceder de una fuente biológica o producirse mediante tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico indicada. Puede generarse de cualquier manera, incluida la síntesis química.
Un polipéptido, tal como se describe en el presente documento, puede tener un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, o 2000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no necesariamente. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan desplegados. Tal como se utiliza en el presente documento, el término glicoproteína se refiere a una proteína acoplada al menos a un resto carbohidrato que está unido a la proteína a través de una cadena lateral de un aminoácido que contiene oxígeno o nitrógeno, por ejemplo, una serina o una asparagina.
Por polipéptido "aislado", o uno de sus fragmentos, variantes o derivados, se entiende un polipéptido que no se encuentra en su medio natural. No se requiere ningún nivel concreto de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede extraerse de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos producidos de modo recombinante y las proteínas expresadas en células hospedadoras se consideran aislados según se describe en el presente documento, al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente mediante cualquier técnica adecuada.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "de origen no natural" o cualquiera de sus variantes gramaticales que acompaña a un polipéptido es una expresión condicional que excluye explícitamente, pero solo excluye a aquellas formas del polipéptido que los expertos en la materia comprendan que son "de origen natural", o que un juez o un órgano administrativo o judicial haya determinado o interpretado que son naturales, o que puedan ser determinadas o interpretadas como "de origen natural" en cualquier momento por estos.
Otros polipéptidos divulgados en el presente documento son fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores y cualquiera de sus combinaciones. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo", tal como se divulgan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido que conserve al menos algunas de las propiedades del anticuerpo o polipéptido nativo correspondiente, por ejemplo, la unión específica a un antígeno. Los fragmentos de polipéptidos incluyen, por ejemplo, fragmentos proteolíticos, así como fragmentos de deleción, además de los fragmentos de anticuerpos específicos que se analizan en otra parte del presente documento. Las variantes, por ejemplo, de un polipéptido incluyen fragmentos como los descritos anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. En ciertos aspectos, las variantes pueden ser de origen no natural. Las variantes de origen no natural pueden producirse mediante técnicas de mutagénesis conocidas. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Los derivados son polipéptidos que han sido alterados para que presenten características adicionales que no se encuentran en el polipéptido original. Algunos ejemplos son las proteínas de fusión. Los polipéptidos variantes también pueden denominarse en el presente documento "análogos de polipéptidos" Tal como se utiliza en el presente documento, un "derivado" de un polipéptido también puede remitir a un polipéptido sujeto que tiene uno o más aminoácidos químicamente derivatizados por reacción de un grupo funcional lateral. También se incluyen como "derivados" los péptidos que contienen uno o más derivados de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo, la 4-hidroxiprolina puede sustituir a la prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituir a la lisina; la 3-metilhistidina puede sustituir a la histidina; la homoserina puede sustituir a la serina; y la ornitina puede sustituir a la lisina.
Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de aminoácidos con cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de una fenilalanina por una tirosina es una sustitución conservadora. En ciertas realizaciones, las sustituciones conservadoras en las secuencias de los polipéptidos y los anticuerpos de la presente divulgación no anulan la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos al antígeno al que se une la molécula de unión. Los métodos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión al antígeno son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Brummell et al., Biochem., 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng., 12(10):879-884 (1999); y Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:412-417 (1997)).
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "proteína integral de membrana" o "IMP" se refiere a una proteína o un polipéptido que está unido a una membrana biológica. Un ejemplo de IMP es una proteína transmembrana, que atraviesa la bicapa lipídica de la membrana biológica una o más veces. Las proteínas de membrana de paso único atraviesan la membrana una sola vez, mientras que las proteínas de membrana de paso múltiple entran y salen, atravesándola varias veces. Las proteínas de paso único de tipo I se sitúan con su aminoterminal en el lado exterior de la membrana o "extramembrana" y su carboxilo-terminal en el lado interior de la membrana o "intramembrana" Las proteínas de paso único de tipo II tienen su amino-terminal en el lado intramembrana. Las proteínas transmembrana de paso múltiple atraviesan la membrana dos o más veces y pueden tener topologías muy variadas. Las proteínas con un número par de dominios transmembrana tendrán tanto su extremo amino como su extremo carboxi en el mismo lado de la membrana. Un ejemplo de este tipo de proteína es la CD20, que se expresa en los linfocitos B. Las que tienen un número impar de dominios transmembrana tendrán sus extremos amino y carboxi en lados opuestos de la membrana. Algunos ejemplos son los receptores acoplados a proteínas G, que suelen tener 7 dominios transmembrana, con el extremo amino en el lado extramembrana y el extremo carboxi en el lado intramembrana. Algunas IMP no tienen dominios transmembrana, sino que están ancladas a la membrana, por ejemplo, a través de un lípido como el glucosilfosfatidilinositol o un grupo palmitoílo. Las IMP tienen innumerables funciones biológicas, como transportadores, conectores, canales, receptores, enzimas, transducción de energía o adhesión celular, entre otras.
El término "polinucleótido" pretende abarcar un ácido nucleico singular, así como ácidos nucleicos plurales, y se refiere a una molécula o construcción aislada de ácido nucleico, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ADNc o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, como el que se encuentra en los ácidos nucleicos peptídicos (ANP)). Las expresiones "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" se refieren a uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.
Un ácido nucleico o polinucleótido "aislado" significa cualquier forma del ácido nucleico o polinucleótido que está separada de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido purificado en gel o un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se consideraría "aislado" También se considera "aislado" un segmento polinucleotídico, por ejemplo, un producto de PCR, que ha sido diseñado para tener sitios de restricción para la clonación Otros ejemplos de polinucleótidos aislados incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en una solución no nativa, como un tampón o una solución salina. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN de polinucleótidos in vivo o in vitro, en los que dichos transcritos no se encontrarían en la naturaleza. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados incluyen además moléculas de este tipo producidas sintéticamente. Además, el polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador, como un promotor, un sitio de unión a ribosomas o un terminador de transcripción.
Tal como se utiliza en el presente documento, un polinucleótido "de origen no natural" o cualquiera de sus variantes gramaticales, es una definición condicional que excluye explícitamente, pero solo excluye aquellas formas del polinucleótido que los expertos en la materia comprendan que son "de origen natural", o que un juez o un órgano administrativo o judicial haya determinado o interpretado que son naturales, o que puedan ser determinadas o interpretadas como "de origen natural" en cualquier momento por estos.
Tal como se utiliza en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de parada" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores transcripcionales, intrones y similares, no forman parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una única construcción polinucleotídica, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotídicas distintas, por ejemplo, en vectores distintos (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un único vector puede codificar por separado una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, un polinucleótido o un ácido nucleico puede incluir regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no con otra región codificante. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, entre otras, las que codifican elementos o motivos especializados, como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo.
En ciertas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso del ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o la traducción asociados operativamente con una o más regiones codificantes. Una asociación operativa es cuando una región codificante de un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal manera que la expresión del producto génico queda bajo la influencia o el control de la secuencia o secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado a ella) están "asociados operativamente" si la inducción de la función del promotor provoca la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de a Dn no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad del molde de ADN para ser transcrito. Así, una región promotora estaría asociada operativamente a un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor fuera capaz de llevar a cabo la transcripción de dicho ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirija la transcripción sustancial del ADN en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden asociarse operativamente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de célula.
Los expertos en la materia conocen diversas regiones de control de la transcripción. Entre ellas se incluyen, entre otras, regiones de control de la transcripción que actúan en células de vertebrados, como, por ejemplo, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón-A), virus del simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (como el virus del sarcoma de Rous), entre otras. Otras regiones de control de la transcripción incluyen las procedentes de genes de vertebrados, como la actina, la proteína de choque térmico, la hormona de crecimiento bovina y la p-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Otras regiones de control de la transcripción adecuadas incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles por linfocinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas).
Los promotores de poxvirus (por ejemplo, p7.5 o H5) o el promotor del bacteriófago T7 también pueden utilizarse como regiones de control de la transcripción. Cuando se emplea un promotor T7, se puede utilizar un sistema de expresión inducible de vaccinia. El sistema de expresión de vaccinia puede incluir, entre otros, un primer virus vaccinia recombinante que codifica toda la región codificante del gen 1 del bacteriófago T7 que codifica la ARN polimerasa T7, y un segundo virus vaccinia recombinante que codifica un gen de interés flanqueado por un promotor T7 y elementos reguladores de la terminación. La doble infección de células eucariotas con ambos virus vaccinia recombinantes produce la síntesis de la ARN polimerasa T7 y la expresión del gen de interés controlado por el promotor T7.
Del mismo modo, los expertos en la materia conocen diversos elementos de control de la traducción. Estos incluyen, entre otros, sitios de unión a ribosomas, codones de iniciación y terminación de la traducción y elementos procedentes de picornavirus (en concreto, un sitio interno de entrada a ribosomas, o IRES ("internal ribosome entry site"), también denominado secuencia CITE).
En otras realizaciones, un polinucleótido puede ser ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia o ARN ribosómico.
Las regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos pueden asociarse con regiones codificantes adicionales que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido como se divulga en el presente documento. Según la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por las células de mamíferos tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena proteica en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la materia saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrados pueden tener un péptido señal fusionado con el extremo N-terminal del polipéptido, que se escinde del polipéptido completo o "de longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En ciertas realizaciones, se utiliza el péptido señal nativo, por ejemplo, un péptido señal de cadena pesada o de cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esa secuencia que conserve la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está asociado operativamente con él. Como alternativa, puede utilizarse un péptido señal heterólogo de mamífero o uno de sus derivados funcionales. Por ejemplo, la secuencia líder de tipo salvaje puede sustituirse por la secuencia líder del activador tisular del plasminógeno ("tissue plasminogen activatof, TPA) humano o de la p-glucuronidasa de ratón.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "banco" es un género representativo de polinucleótidos, por ejemplo, un grupo de polinucleótidos relacionados, por ejemplo, por su origen a partir de una única especie animal, tipo de tejido, órgano o tipo de célula, en el que el banco comprende colectivamente al menos dos especies diferentes dentro de un género concreto de polinucleótidos. Un banco de polinucleótidos puede incluir, por ejemplo, al menos dos, al menos 5, al menos 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108 o 109 especies diferentes dentro de un género concreto de polinucleótidos. En ciertos aspectos, un banco de polinucleótidos, tal como se proporciona en el presente documento, puede codificar una pluralidad de polipéptidos que contenga un polipéptido de interés. En ciertos aspectos, un banco de polinucleótidos, tal como se proporciona en el presente documento, puede codificar una pluralidad de polipéptidos de subunidades de inmunoglobulina, por ejemplo, polipéptidos de la subunidad de cadena pesada o polipéptidos de la subunidad de cadena ligera. En este contexto, un "banco", tal como se proporciona en el presente documento, comprende polinucleótidos de un género común, siendo el género polinucleótidos que codifican polipéptidos de subunidades de inmunoglobulina de un determinado tipo y clase, por ejemplo, un banco podría codificar una cadena pesada humana p, y-1, Y-2, Y-3, Y-4, a-1, a-2, £ o 8, o una cadena ligera humana k o A. Aunque cada miembro de cualquier banco construido según los métodos proporcionados en el presente documento puede codificar la misma región constante de cadena pesada o ligera y/o un dominio de anclaje a membrana, el banco puede comprender colectivamente al menos dos, al menos 5, o al menos 10, 100, 103, l04, 105, 106, 107, 108 o 109 regiones variables diferentes asociadas con la región constante común.
En otras realizaciones, el banco puede contener una pluralidad de fragmentos monocatenarios de inmunoglobulina que comprenden una región variable, como una región variable de cadena ligera o una región variable de cadena pesada y/o tanto una región variable de cadena ligera como una región variable de cadena pesada, por ejemplo, un fragmento ScFv.
Tal como se utiliza en el presente documento, un "banco de presentación" es un banco de polinucleótidos, cada uno de ellos dentro de un "paquete de presentación" que expresa el polipéptido codificado por el polinucleótido del banco en su superficie. Un banco de presentación de anticuerpos, por ejemplo, puede incluir una pluralidad de paquetes de presentación, cada uno de los cuales presenta un dominio de unión al antígeno de un anticuerpo en su superficie. Cuando se permite que el banco de presentación interactúe con un antígeno de interés, por ejemplo, inmovilizado sobre una superficie sólida, los paquetes de presentación que se unen al antígeno pueden aislarse del resto del banco y recuperarse. A continuación, se puede aislar el polinucleótido que codifica el dominio de unión al antígeno presentado en la superficie del paquete de presentación. Los bancos de presentación incluyen, entre otros, bancos de presentación de fagos en bacterias o bancos en sistemas eucariotas, por ejemplo, presentación en levaduras, presentación retroviral o expresión en virus de ADN, como los poxvirus. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7858559, y la solicitud de patente de EE. UU. n.° de publicación 2013-028892. En ciertos aspectos, un banco de presentación de anticuerpos puede prepararse en un poxvirus, por ejemplo, un vector de virus vaccinia, como proteínas de fusión con una proteína específica de EEV, de modo que los "paquetes de presentación" sean partículas de EEV. Véase la solicitud de patente de EE. UU. n.° de publicación 2013-028892.
Dichos bancos de presentación pueden cribarse frente a las proteínas de fusión de IMP presentadas en la superficie de EEV tal como se proporciona en el presente documento.
Por "célula receptora" o "célula hospedadora" o "célula" se entiende una célula o población de células en las que puede expresarse una proteína recombinante, puede propagarse un virus o pueden construirse y/o propagarse bancos de polinucleótidos según se proporciona en el presente documento. Una célula hospedadora, tal como se proporciona en el presente documento, es generalmente una célula o línea celular eucariota, por ejemplo, una célula o línea celular de vertebrado, de mamífero, de roedor, de ratón, de primate o humana. "Una población de células hospedadoras" significa un grupo de células cultivadas con las que se puede construir, propagar y/o expresar un "banco", tal como se proporciona en el presente documento. Cualquier célula hospedadora que pueda ser infectada por el virus vaccinia es adecuada para los métodos proporcionados por esta divulgación. Las células hospedadoras utilizadas en los métodos proporcionados en el presente documento pueden ser adherentes, por ejemplo, células hospedadoras que crecen adheridas a un sustrato sólido o, como alternativa, las células hospedadoras pueden estar en suspensión.
Las células hospedadoras, tal como se proporcionan en el presente documento, pueden comprender una vía secretora constitutiva, en la que las proteínas, por ejemplo, proteínas de interés expresadas por la célula o por un banco, se secretan desde el interior de la célula para expresarse en una superficie de membrana celular o viral o para secretarse completamente como polipéptidos solubles. En ciertos aspectos, las proteínas de interés expresadas sobre una membrana biológica o dentro de esta, por ejemplo, una IMP, se expresan sobre la superficie de un virus con envoltura producido por la célula hospedadora, por ejemplo, un virus vaccinia extracelular con envoltura, o EEV. Las IMP pueden seguir la misma vía que las formas o proteínas totalmente secretadas, pasando al lumen del RE, salvo que pueden ser retenidos en la membrana del RE por la presencia de una o más señales de parada de la transferencia, o "dominios transmembrana" Los dominios transmembrana son tramos hidrófobos de aproximadamente 20 aminoácidos que adoptan una conformación en alfa-hélice al atravesar la membrana. Las proteínas inmersas en la membrana están ancladas en la bicapa de fosfolípidos de la membrana plasmática. Las formas transmembrana de los polipéptidos de interés, por ejemplo, los polipéptidos de cadena pesada de inmunoglobulina anclados a la membrana, suelen utilizar péptidos señal amino-terminales, al igual que las formas totalmente secretadas.
Se conocen péptidos señal, dominios transmembrana y dominios citosólicos o "intramembrana" para una amplia diversidad de proteínas unidas a membrana y/o totalmente secretadas.
Los dominios transmembrana adecuados pueden incluir, entre otros, el dominio TM de la proteína HA específica de EEV de virus vaccinia A56R, o las proteínas transmembrana específicas de EEV de virus vaccinia A33R, A34R, A36R o B5R. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EE. UU. n.° de publicación 2013/0288927, publicada el 31 de octubre de 2013. En ciertos aspectos, la proteína específica de EEV puede anclarse a la superficie interna de la envoltura vírica a través de un grupo palmitoílo, por ejemplo, la proteína F13L del virus vaccinia, que se analiza con más detalle en otro punto del presente documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión" se refiere, en su sentido más amplio, a una molécula que se une específicamente a un receptor, por ejemplo, un epítopo o un determinante antigénico. Como se describe más adelante, una molécula de unión puede comprender uno o más "dominios de unión al antígeno" descritos en el presente documento. Un ejemplo no limitante de molécula de unión es un anticuerpo o uno de sus fragmentos que conserva la unión específica al antígeno.
Las expresiones "dominio de unión" y "dominio de unión al antígeno" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una región de una molécula de unión que es necesaria y suficiente para unirse específicamente a un epítopo. Por ejemplo, un "Fv", por ejemplo, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de un anticuerpo, ya sea como dos subunidades polipeptídicas separadas o como una única cadena, se considera un "dominio de unión"
Otros dominios de unión al antígeno incluyen, entre otros, la cadena pesada variable (VHH) de un anticuerpo procedente de una especie de camélido, o seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de inmunoglobulina expresadas en un andamiaje de fibronectina.
Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" pueden utilizarse indistintamente en el presente documento. Un anticuerpo (o uno de sus fragmentos, variantes o derivados según se describe en el presente documento) incluye al menos la región variable de una cadena pesada (por ejemplo, para especies de camélidos) o al menos las regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras básicas de las inmunoglobulinas en los sistemas de vertebrados se conocen relativamente bien. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed., 1988). A menos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" abarca desde un pequeño fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo hasta un anticuerpo de tamaño completo, por ejemplo, un anticuerpo IgG que incluye dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas.
El término "inmunoglobulina" comprende diversas clases amplias de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Los expertos en la materia apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (y, m, a, 8, £) con algunas subclases entre ellas (por ejemplo, y1-y4 o a1-a2)). La naturaleza de esta cadena determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, etc., están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional.
Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede unirse a una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas por hibridomas, linfocitos B o células hospedadoras modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el C-terminal en la parte inferior de cada cadena. La estructura básica de ciertos anticuerpos, por ejemplo, los anticuerpos IgG, incluye dos subunidades de cadena pesada y dos subunidades de cadena ligera conectadas covalentemente mediante enlaces disulfuro para formar una estructura en "Y", también denominada en el presente documento estructura "H2L2".
El término "epítopo" incluye cualquier determinante molecular capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. En ciertos aspectos, un epítopo puede incluir agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en ciertos aspectos, puede tener características estructurales tridimensionales y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de una diana a la que se une un anticuerpo.
El término "diana" se utiliza en el sentido más amplio para incluir sustancias a las que puede unirse una molécula de unión. Una diana puede ser, por ejemplo, un polipéptido, un ácido nucleico, un carbohidrato, un lípido u otra molécula. Además, una "diana" puede ser, por ejemplo, una célula, un órgano o un organismo que comprende un epítopo unido al que puede unirse una molécula de unión.
Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se utilizan desde el punto de vista funcional. A este respecto, se apreciará que las regiones variables (que en el presente documento pueden denominarse indistintamente "dominios variables") de las porciones variables de cadena ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento del antígeno y la especificidad. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y de la cadena pesada (por ejemplo, CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas como la secreción, la movilidad transplacentaria, la unión al receptor Fc, la unión al complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se alejan del sitio de unión al antígeno o amino-terminal del anticuerpo. La porción N-terminal es una región variable, y en la porción C-terminal hay una región constante; los dominios CH3 (o CH4 en el caso de la IgM) y CL están en el carboxi-terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente.
Las seis "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" presentes en el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo son secuencias cortas y no contiguas de aminoácidos que están específicamente colocadas para formar el dominio de unión al antígeno cuando el anticuerpo adopta su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los aminoácidos del dominio de unión al antígeno, denominados regiones "marco", muestran una menor variabilidad intermolecular. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de lámina p y las CDR forman bucles que conectan la estructura de lámina p y, en algunos casos, forman parte de ella. Así, las regiones marco actúan formando un andamiaje que permite colocar las CDR en la orientación correcta mediante interacciones no covalentes entre cadenas. El dominio de unión al antígeno formado por las CDR colocadas define una superficie complementaria al epítopo del antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria favorece la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo afín. Los expertos en la materia pueden identificar con facilidad los aminoácidos que componen las CDR y las regiones marco, respectivamente, para cualquier región variable de cadena pesada o ligera concreta, ya que se han definido de diversas formas (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)).
En el caso de que existan dos o más definiciones de un término o expresión que se utilicen y/o acepten en la técnica, la definición del término o la expresión, tal como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos esos significados a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso de la expresión "región determinante de la complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación con el antígeno no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Estas regiones concretas han sido descritas, por ejemplo, por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987). Los dominios variables de inmunoglobulina también pueden analizarse, por ejemplo, utilizando el sistema de información IMGT (www://imgt.cines.fr/) (IMGT®/V-Quest) para identificar segmentos de regiones variables, incluidas las CDR (véase, por ejemplo, Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36:W503-508, 2008).
Kabat et al. también definieron un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Los expertos en la materia pueden asignar sin ambigüedad este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. En el presente documento, la "numeración Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Sin embargo, a menos que se indique explícitamente el uso del sistema de numeración de Kabat, en esta divulgación se utiliza la numeración consecutiva para todas las secuencias de aminoácidos.
Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados incluyen, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de unión al epítopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, Fv unidos por disulfuro (sdFv), anticuerpos de dominio único, como los anticuerpos VHH de camélidos, fragmentos que comprenden un dominio VL o VH, fragmentos producidos por un banco de expresión de Fab. Las moléculas scFv son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 5892 019. Las moléculas de inmunoglobulina o de anticuerpo que abarca la presente divulgación pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. También se contemplan los isotipos del inmunoglobulinas con nuevo receptor de antígeno ("immunoglobulin new antigen receptor", IgNAR) que son bivalentes y comprenden una sola cadena que incluye un dominio variable de IgNAR (VNAR) (véase, Walsh et al., Virology, 411:132-141,2011).
"Se une específicamente" significa, en general, que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, variantes o derivados, se une a un epítopo a través de su dominio de unión al antígeno, y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión al antígeno y el epítopo. Según esta definición, se dice que una molécula de unión se "une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, a través de su dominio de unión al antígeno, con más facilidad de la que se uniría a un epítopo aleatorio no relacionado. El término "especificidad" se utiliza en el presente documento para calificar la afinidad relativa por la que una determinada molécula de unión se une a un determinado epítopo. Por ejemplo, se puede considerar que la molécula de unión "A" tiene una mayor especificidad por un epítopo dado que la molécula de unión "B", o se puede decir que la molécula de unión "A" se une al epítopo "C" con mayor especificidad que la que tiene por el epítopo relacionado "D"
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de la unión de un epítopo individual con uno o más dominios de unión al antígeno, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988) en las páginas 27-28. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la estabilidad global del complejo entre una población de dominios de unión al antígeno y un antígeno. Véase, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez está relacionada tanto con la afinidad de los dominios individuales de unión al antígeno en la población con epítopos específicos, como con las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo altamente repetitiva, como un polímero, sería de alta avidez. Una interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un receptor presente en alta densidad en la superficie de una célula también sería de alta avidez.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "subunidad de cadena pesada" o "dominio de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina. Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que comprende una subunidad de cadena pesada, puede incluir al menos uno de los siguientes: un dominio VH, un dominio CH1, un dominio bisagra (por ejemplo, región bisagra superior, media y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4, o una de sus variantes o fragmentos.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "subunidad de cadena ligera" o "dominio de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. La subunidad de cadena ligera incluye al menos uno de los dominios VL o CL (por ejemplo, Ck o CA).
Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados pueden describirse o especificarse en términos del epítopo o epítopos o porción o porciones de un antígeno que reconocen o al que se unen específicamente. La porción de un antígeno diana que interactúa específicamente con el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo es un "epítopo" o un "determinante antigénico" Un antígeno diana puede comprender un único epítopo o al menos dos epítopos, y puede incluir cualquier número de epítopos, en función del tamaño, la conformación y el tipo de antígeno.
Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "unido", "fusionado" o "fusión" u otros equivalentes gramaticales pueden utilizarse indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes más, por cualquier medio, incluida la conjugación química o los medios recombinantes. Una "fusión dentro del marco" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos ("open reading frames", ORF) polinucleotídicos para formar un ORF continuo más largo, de manera que se mantenga el marco de lectura traduccional de los ORF originales. Así, una proteína de fusión recombinante es una proteína única que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (segmentos que normalmente no están tan unidos en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se convierte de esta forma en continuo a través de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar física o espacialmente separados, por ejemplo, por una secuencia conectora dentro del marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican una IMP y una proteína específica de EEV de virus vaccinia pueden estar fusionados, dentro del marco, pero separados por un polinucleótido que codifica un conector o un espaciador, siempre que los marcos de lectura abiertos "fusionados" se cotraduzcan como parte de un polipéptido continuo.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "marcador de hemaglutinina" o "marcador de HA" es una proteína procedente de una glicoproteína de superficie de la hemaglutinina (HA) de la gripe humana correspondiente a los aminoácidos 98-106. El marcador de HA se utiliza mucho como marcador de epítopos general en los vectores de expresión. Las proteínas recombinantes pueden diseñarse para expresar el marcador de HA, que no parece interferir con la bioactividad o la biodistribución de la proteína recombinante. Este marcador etiqueta facilita la detección, el aislamiento y a purificación de la proteína de interés.
En el contexto de los polipéptidos, una "secuencia lineal" o una "secuencia" es un orden de aminoácidos en un polipéptido desde el amino o N-terminal hasta el carboxilo o C-terminal, en el que los aminoácidos vecinos entre sí en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipéptido.
Una porción de un polipéptido que es "amino-terminal" o "N-terminal" a otra porción de un polipéptido es la porción que aparece antes en la cadena polipeptídica secuencial. Del mismo modo, una porción de un polipéptido que es "carboxi-terminal" o "C-terminal" a otra porción de un polipéptido es la porción que aparece después en la cadena polipeptídica secuencial.
El término "expresión", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un proceso por el cual un gen produce un producto bioquímico, por ejemplo, un polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula incluidas, entre otras, la inactivación del, gen así como tanto la expresión transitoria como la expresión estable. Incluye, entre otras, la transcripción del gen a ARN mensajero (ARNm) y la traducción de dicho ARNm a uno o más polipéptidos. Si el producto final deseado es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese producto bioquímico y de cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico". Tal como se utiliza en el presente documento, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen, o un polipéptido que se traduce a partir de una transcrito. Los productos génicos descritos en el presente documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glucosilación, adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteínas, escisión proteolítica y similares.
El término "eucariota" o la expresión "organismo eucariota" pretende abarcar todos los organismos de los reinos animal, vegetal y protista, incluidos protozoos, hongos, levaduras, algas verdes, plantas unicelulares, plantas pluricelulares y todos los animales, tanto vertebrados como invertebrados. El término y la expresión no incluyen bacterias ni virus. Por "célula eucariota" se entiende tanto una "célula eucariota" en singular como "células eucariotas" en plural, y comprende las células procedentes de un eucariota.
Por el término "vertebrado" se entiende tanto un "vertebrado" en singular como "vertebrados" en plural, y comprende mamíferos y aves, así como peces, reptiles y anfibios.
El término "mamífero" pretende abarcar un "mamífero" en singular y "mamíferos" en plural, e incluye, entre otros, seres humanos; primates, como simios, monos, orangutanes y chimpancés; cánidos, como perros y lobos; félidos, como gatos, leones y tigres; équidos, como caballos, asnos y cebras; animales de producción, como vacas, cerdos y ovejas; ungulados, como ciervos y jirafas; roedores, como ratones, ratas, hámsteres y cobayas; y osos. En ciertos aspectos, el mamífero es un sujeto humano.
Las expresiones "cultivo de tejidos" o "cultivo celular" o los términos "cultivo" o "cultivar" se refieren al mantenimiento o al crecimiento de tejidos o células vegetales o animales in vitro en condiciones que permitan la conservación de la arquitectura celular, la conservación de la función celular, la diferenciación ulterior o las tres cosas. Las "células tisulares primarias" son las células extraídas directamente de un tejido, es decir, una población de células del mismo tipo que desempeñan la misma función en un organismo. El tratamiento de dichas células tisulares con la enzima proteolítica tripsina, por ejemplo, las disocia en células tisulares primarias individuales que crecen o mantienen la arquitectura celular cuando se siembran en placas de cultivo. Los cultivos celulares que surgen de la multiplicación de células primarias en cultivos de tejidos se denominan "cultivos celulares secundarios" La mayoría de las células secundarias se dividen un número finito de veces y luego mueren. Sin embargo, unas pocas células secundarias pueden superar este "periodo de crisis", tras el cual son capaces de multiplicarse indefinidamente para formar una "línea celular" continua El medio líquido en el que se cultivan las células se denomina en el presente documento "medio de cultivo" o "medios de cultivo" El medio de cultivo hacia el que se han secretado moléculas deseadas, por ejemplo, virus o proteínas, por ejemplo, moléculas de inmunoglobulina, durante el cultivo de las células en él puede denominarse "medio acondicionado"
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "identificar" se refiere a métodos en los que una molécula deseada, por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteína de interés con una característica o función deseada, se diferencia de una pluralidad o banco de tales moléculas. Los métodos de identificación incluyen la "selección" y el "cribado" o la "inmunoadsorción". Tal como se utilizan en el presente documento, los métodos de "selección" son aquellos en los que las moléculas deseadas pueden separarse directamente del banco, por ejemplo, por medio de la resistencia a fármacos. Tal como se utilizan en el presente documento, los métodos de "cribado" o "inmunoadsorción" son aquellos en los que las agrupaciones que comprenden las moléculas deseadas se someten a un ensayo en el que puede detectarse la molécula deseada. A continuación, las partes alícuotas de las agrupaciones en las que se detecta la molécula se dividen en agrupaciones sucesivamente más pequeñas que se analizan del mismo modo, hasta que se obtiene una agrupación altamente enriquecida en la molécula deseada.
Vectores de EEV de poxvirus, por ejemplo, de virus vaccinia
Las proteínas de fusión de IMP, tal como se proporcionan en el presente documento, se producen en vectores de poxvirus, por ejemplo, vectores de virus vaccinia. El término "poxvirus" incluye cualquier miembro de la familia Poxviridae. Véase, por ejemplo, B. Moss, en: Virology, 2a edición, B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Eds., Raven Press, pág. 2080 (1990). El género de los ortopoxvirus incluye, por ejemplo, el virus vaccinia, el virus de la viruela (el virus que causa la viruela) y el poxvirus del mapache. El virus vaccinia es el ortopoxvirus prototípico, y ha sido desarrollado y está bien caracterizado como vector para la expresión de proteínas heterólogas.
En las realizaciones en las que se utilizan vectores de poxvirus, en concreto, vectores de virus vaccinia, para expresar proteínas de fusión de IMP, tal como se proporciona en el presente documento, puede utilizarse cualquier vector de poxvirus adecuado. En ciertos aspectos, la ubicación de un gen que codifica una proteína de fusión de IMP puede estar en una región del vector que no es fundamental para el crecimiento y la replicación del virus, de modo que se produzcan virus infecciosos. Aunque se han caracterizado diversas regiones no fundamentales del genoma del virus vaccinia, el locus más utilizado para la inserción de genes extraños es el locus de la timidina cinasa, situado en el fragmento HindlII J del genoma. En ciertos vectores de virus vaccinia, se ha modificado el locus tk para contener uno o dos sitios de enzimas de restricción únicas, lo que permite el uso conveniente del método de recombinación trimolecular para la producción de virus recombinantes, como se describe en otro punto en el presente documento.
Los polinucleótidos que codifican proteínas de fusión de IMP como se proporcionan en el presente documento pueden insertarse en vectores de poxvirus, en concreto vectores de virus vaccinia, en asociación operativa con una región de control transcripcional que actúa en el citoplasma de una célula infectada por poxvirus.
Las regiones de control transcripcional de poxvirus comprenden un promotor y una señal de terminación de la transcripción. La expresión génica en los poxvirus está regulada temporalmente, y los promotores de los genes tempranos, intermedios y tardíos poseen estructuras variables. Algunos genes de poxvirus se expresan de forma constitutiva, y los promotores de estos genes "tempranos-tardíos" presentan estructuras híbridas. También se han desarrollado promotores sintéticos temprano-tardíos. Los promotores de poxvirus adecuados para expresar las proteínas de fusión de IMP proporcionadas en el presente documento incluyen, entre otros, promotores tardíos, como el promotor 7.5-kD, el promotor MIL, el promotor 37-kD, el promotor 11-kD, el promotor 11L, el promotor 12L, el promotor 13L, el promotor 15L, el promotor 17L, el promotor 28-kD, el promotor H1L, el promotor H3L, el promotor H5L, el promotor H6L, el promotor H8L, el promotor D11L, el promotor D12L, el promotor D13L, el promotor A1L, el promotor A2L, el promotor A3L y el promotor P4b. Véase, por ejemplo, Moss, B., "Poxviridae and their Replication", IN Virology, 2a edición, B. N. Fields, D. M. Knipe etal., eds., Raven Press, pág. 2090 (1990).
Los vectores de poxvirus adecuados incluyen el virus vaccinia de tipo salvaje, por ejemplo, la cepa Western Reserve o WR, o el virus vaccinia atenuado, por ejemplo, el virus vaccinia Ankara modificado ("modified vaccinia Ankara", MVA) (Mayr, A., et al., Infection, 3:6-14 (1975)).
Durante su ciclo de replicación, un poxvirus, por ejemplo, un virus vaccinia, produce cuatro formas infecciosas que difieren en su estructura de membrana: el virión maduro intracelular ("intracellular mature virion", IMV), el virión con envoltura intracelular ("intracellular enveloped virion", IEV), el virión con envoltura asociado a la célula ("cell-associated enveloped virion", c Ev ) y el virión con envoltura extracelular ("extracellular enveloped virion", e Ev ). La opinión predominante es que el IMV tiene una sola membrana lipoproteica, mientras que el CEV y el EEV están rodeados por dos capas de membrana y el IEV tiene tres envolturas. El EEV se desprende de la membrana plasmática de la célula hospedadora y la membrana del EEV procede del trans-Golgi.
Tras la infección, el virus pierde sus membranas y el núcleo de proteína/ADN es transportado a lo largo de los microtúbulos al interior de la célula. Las proteínas codificadas por los ARNm tempranos de virus vaccinia ("tempranos" se define como anteriores a la replicación del ADN) conducen al descubrimiento del núcleo del virus vaccinia y a la posterior replicación del ADN. Esta replicación se produce en lo que se denomina "fábricas víricas", situadas fundamentalmente sobre el RE. Dentro de la fábrica vírica, los viriones inmaduros (IV) se ensamblan y se procesan para formar el IMV ("Intracellular Mature Virus", virus intracelular maduro). Los IMV contienen una membrana derivada del RE. La mayoría de los IMV se liberan de la célula por lisis celular. Algunos IMV son transportados sobre microtúbulos a los lugares de envoltura por las membranas de la red trans-Golgi o los endosomas tempranos. La envoltura de las partículas del IMV por una doble membrana crea una forma de virus vaccinia denominada IEV (virus intracelular envuelto). A continuación, los IEV se transportan a la superficie celular sobre microtúbulos. La membrana externa del IEV se fusiona con la membrana plasmática para exponer un CEV (virus con envoltura asociado a la célula) en la superficie celular. La polimerización de la actina de la célula hospedadora puede impulsar al CEV a infectar células vecinas, o el virus puede liberarse como EEV. Véase, por ejemplo, Kim L. Roberts y Geoffrey L. Smith., Trends in Microbiology, 16(10):472-479 (2008); Geoffrey L. Smith, et al., Journal of General Virology, 83:2915-2931 (2002). Se han descrito al menos seis proteínas codificadas por el virus como componentes de la membrana de la envoltura del EEV. De éstas, cuatro proteínas (A33R, A34R, A56R y B5R) son glicoproteínas, una (A36R) es una proteína transmembrana no glicosilada y una (F13L) es una proteína de membrana periférica palmitoilada. Véase, por ejemplo, Lorenzo et al., Journal of Virology, 74(22):10535 (2000). Durante la infección, estas proteínas se trasladan al complejo de Golgi, donde se incorporan al virus infeccioso que, a continuación, es transportado y liberado al medio extracelular. Como se proporciona en el presente documento, las proteínas de fusión de IMP se dirigen a la membrana del EEV y se expresan sobre esta como una proteína de fusión con una proteína específica de EEV, por ejemplo, F13L o A56R.
La proteína F13L se asocia con la superficie interior de la membrana del EEV más externa a través de la palmitoilación de las cisteínas 185 y 186 (Smith, Trends in Microbiol., 16:472-479 (2008)). Los virus vaccinia en los que se deleciona el gen que codifica F13L forman placas diminutas y el número de EEV producidos se reduce significativamente. La secuencia de aminoácidos de la proteína F13L de la cepa WR del virus vaccinia se presenta como SEQ ID NO: 1. Los dos residuos de cisteína palmitoilada (aminoácidos 85 y 86 de SEQ ID NO: 1) están subrayados. Dado que F13L no atraviesa la membrana, no tiene dominio transmembrana ni péptido señal.
>F13L (SEQ ID NO: 1)
MWPF A S VP AGAKCRL VETLPENMDFRSDHLTTFECFNEIITL
AKKYIYIASFCCNPLSTTRGALIFDKLKEASEKGIKIIYLLDER
GKRNLGELQ SFtCPDINFIT VNIDKKNNV GLLLGCF W V SDDE RCYVGNASFTGGSfflTIKTLGVYSDYPPLATDLRRRFDTFKA
FN S AKN SWLNLC S AACCLP YSTAYHIKNPIGGVFFTDSPEHL
LGYSRDLDTDVVIDKLKSAKTSIDIEHLAIVPTTRVDGNSYY
WPDIYNSIIEAAENRGVKIRLLVGNWDKND VY SMATARSLD
ALCVQNDLSVKVFTIQNNTKLLIVDDEYVHITSANFDGTHY
QNHGF V SFNSIDKQL V SEAKKIFERDW V S SHSKSLKI
La proteína A56R es la hemaglutinina del virus vaccinia, y es una proteína integral de membrana de tipo I convencional que comprende un dominio extracelular amino-terminal ("extramembrana"), un único dominio transmembrana y un dominio citoplasmático ("intramembrana"). La A56R comprende un péptido señal N-terminal de aproximadamente 33 aminoácidos, un dominio de tipo Ig que se extiende desde aproximadamente el aminoácido 34 a aproximadamente el aminoácido 103, una región de tallo que se extiende desde aproximadamente el aminoácido 121 a aproximadamente el 275, un dominio transmembrana que se extiende desde aproximadamente el aminoácido 276 a aproximadamente el aminoácido 303, y un dominio citoplasmático ("intermembrana") que se extiende desde aproximadamente el aminoácido 304 al aminoácido 314. Véase DeHaven etal., J. Gen Virol., 92:1971-1980 (2011). La A56R se presenta como SEQ ID NO: 5.
>A56R (SEQ ID NO: 5)
MTRLPILLLLISLVYATPFPQTSKKIGDDATLSCNRNNTNDY
VVMS AW YKEPN SIILL AAK SD VL YFDN YTKDKIS YD SP YDD
L VTTITIK SLT ARD AGT Y V C AFFMT S TTNDTDK VD YEE Y S TE
LIVNTD SESTIDIILSGS TH SPET S SKKPD YIDN SNC S S VFEIAT
PEPITDNVEDHTDTVTYTSDSINTVSASSGESTTDETPEPITD
KEDHTVTDTYSYTTYSTSSGIYTTKSTTDDADLYDTYNDND
TVPPTTVGGSTTSISNYKTKDFVEIFGITALIILSAVAIFCITYY
IYNKRSRKYKTENKV
Las proteínas de fusión de IMP proporcionadas en el presente documento pueden expresarse en cualquier virus vaccinia adecuado. En ciertas realizaciones, el ADN que codifica una proteína de fusión de EEV puede insertarse en una región del genoma del virus vaccinia que no sea fundamental para el crecimiento y la replicación del vector, de modo que se produzcan virus infecciosos. Aunque se han caracterizado diversas regiones no fundamentales del genoma del virus vaccinia, el locus más utilizado para la inserción de genes extraños es el locus de la timidina cinasa, situado en el fragmento HindIII J del genoma. Las proteínas de fusión de IMP, tal como se proporcionan en el presente documento, pueden insertarse en vectores de virus vaccinia en asociación operativa con una región de control transcripcional que actúa en el citoplasma de una célula infectada por poxvirus.
Los promotores adecuados para su uso en los métodos descritos en el presente documento incluyen, entre otros, el promotor temprano/tardío 7.5-kD, o el promotor temprano/tardío H5 (o sus variantes).
El método de recombinación trimolecular
La recombinación trimolecular, como se describe en Zauderer, publicación PCT n.° WO 00/028016 y en la patente de EE. UU. n.° 7858559es un método de alta eficiencia y de producción de títulos elevados para expresar proteínas de interés y/o producir bancos en el virus vaccinia. El método de recombinación trimolecular permite generar virus recombinantes con eficiencias de al menos el 90 % y títulos de al menos 2 órdenes de magnitud superiores a los obtenidos por ligamiento directo.
En ciertos aspectos, las proteínas de fusión de IMP para su expresión en virus vaccinia y su presentación sobre EEV como se describe en el presente documento pueden construirse en vectores de poxvirus, por ejemplo, vectores de virus vaccinia, mediante recombinación trimolecular.
En ciertas realizaciones, se proporciona un plásmido de transferencia para proteínas de fusión de IMP para la expresión en EEV, que comprende un polinucleótido que flanquea regiones en el gen Tk del virus vaccinia, el promotor H5 del virus vaccinia, y sitios de restricción NcoI y BsiWI para insertar regiones codificantes de proteínas de fusión deseadas.
Proteínas integrales de membrana
La divulgación proporciona un método para expresar proteínas integrales de membrana (IMP) en un estado conformacionalmente intacto que se aproxima a la conformación nativa de la proteína tal y como aparecería en una célula en la que la proteína se expresa de forma natural. Según la divulgación, las IMP se expresan como proteínas de fusión con proteínas de poxvirus que se expresan en poxvirus, por ejemplo, EEV de virus vaccinia. Las proteínas de fusión de IMP, tal como se proporcionan en el presente documento, cuando se expresan y presentan en la superficie de EEV, son útiles como antígenos diana para el cribado de bancos de moléculas de unión, por ejemplo, bancos de presentación de anticuerpos.
Cualquier IMP puede construirse como proteína de fusión según los métodos proporcionados en el presente documento. En ciertos aspectos, la IMP es una diana de inmunoterapia. En ciertos aspectos, la IMP es una IMP de paso múltiple, como al CD20 o un receptor acoplado a proteína G (GPCR). Las IMP humanas de paso múltiple adecuadas para su uso en la construcción de proteínas de fusión de IMP según se proporciona en el presente documento incluyen, entre otras, las proteínas enumeradas en la tabla 1.
Tabla 1: Ejemplos de proteínas integrales de membrana de paso múltiple humanas
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En ciertos aspectos, la IMP de paso múltiple es un GPCR, por ejemplo, FZD4 o CXCR4. En ciertos aspectos, la IMP de paso múltiple es CD20.
Polinudeótidos que codifican proteínas de fusión de IMP para su expresión en EEV de poxvirus
La presente divulgación proporciona un polinucleótido aislado para la expresión de una proteína integral de membrana, o uno de sus fragmentos, en una forma conformacionalmente intacta en el contexto de una membrana biológica, en forma de una fusión con una proteína, o uno de sus fragmentos, específica para el EEV de virus vaccinia. Por "conformacionalmente intacta" se entiende que la proteína aparece, o se presenta, en una conformación nativa o cercana a la nativa en el contexto de una membrana biológica de bicapa lipídica, de forma similar a como aparecería la proteína en su estado nativo.
En un aspecto, la divulgación proporciona un polinucleótido aislado que incluye un primer fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína integral de membrana (IMP), o uno de sus fragmentos, por ejemplo, una IMP de paso múltiple, en el que la IMP, o uno de sus fragmentos, comprende al menos una región extramembrana, al menos un dominio transmembrana y al menos una región intramembrana, y en el que una porción del primer fragmento de ácido nucleico que codifica al menos una región intramembrana está situada en el extremo 5' o 3' del primer fragmento de ácido nucleico; y un segundo fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína F13L del virus vaccinia (SEQ ID NO: 1) o uno de sus fragmentos funcionales, en el que el segundo fragmento de ácido nucleico está fusionado dentro del marco con una porción del primer fragmento de ácido nucleico que codifica una región intramembrana de la IMP. El primer fragmento de ácido nucleico y el segundo fragmento de ácido nucleico, en algunos casos, pueden estar separados por un ácido nucleico que codifica un conector u otro espaciador. El polinucleótido puede incluir además un promotor de poxvirus asociado operativamente con el primer y el segundo fragmento de ácido nucleico, permitiendo la expresión del polinucleótido en el citoplasma de una célula infectada por poxvirus. Según este aspecto, una célula infectada por poxvirus que contiene el polinucleótido puede expresar una proteína de fusión IMP-F13L como parte de la membrana de la envoltura externa de un virión con envoltura extracelular (EEV). Los diagramas esquemáticos que muestran la expresión de una IMP como fusión con F13L se muestran en la figura 1B y en la figura 1C.
En ciertos aspectos, la IMP, o uno de sus fragmentos, puede ser una proteína de membrana de paso múltiple que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, o incluso más dominios transmembrana (TM), tales como los enumerados en la tabla 1.
Cuando la IMP tiene un número impar de dominios TM, un extremo de la IMP, ya sea el N-terminal o el C-terminal, estará naturalmente situado en el lado extramembrana de la membrana biológica y el otro extremo de la IMP estará situado en el lado intramembrana de la IMP. Dado que la proteína F13L es totalmente interna a la membrana externa de los EEV de poxvirus, el extremo de la IMP, el N-terminal o el C-terminal, que está situado interno a la membrana puede ser fusionado con F13L. Así, para una IMP como un GPCR de dominio TM-7 típico, en el que el N-terminal de la proteína es extramembrana y el C-terminal es intramembrana, el N-terminal de F13L puede fusionarse con el C-terminal del GPCR como se muestra en la figura 1B. En consecuencia, se proporciona un polinucleótido como se ha indicado anteriormente, en el que el primer fragmento de ácido nucleico codifica una IMP con un número impar de dominios transmembrana, en el que el extremo 5' del primer fragmento de ácido nucleico codifica la región extramembrana, y el extremo 3' del primer fragmento de ácido nucleico codifica la región intramembrana de la IMP, estando este último fusionado con el extremo 5' del fragmento de ácido nucleico que codifica F13L o uno de sus fragmentos.
En un polinucleótido ilustrativo de este tipo, el primer polinucleótido puede codificar la proteína humana frizzled-4 (FZD4), o uno de sus fragmentos, una diana para la inmunoterapia de ciertos cánceres humanos, fusionada con el N-terminal de F13L. En consecuencia, se proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de fusión FZD4-F13L. Un polinucleótido ilustrativo según este aspecto codifica la proteína de fusión madura, los aminoácidos 20 a 892 de SEQ ID NO: 2, como se muestra a continuación. El polinucleótido puede codificar además un péptido señal, por ejemplo, el péptido señal de FZD4, los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 2.
FZD(FL)-F13L (SEQ ID NO: 2)
MGWSCIILFLVATATGAHSFGDEEERRCDPIRISMCQNLGYNVTK
MPNLVGHE LQTDAE LQL TTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCT
EKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPE SLNCSKFPPQN
DHNHMCMEGPGDEEVPLPHKTPIQPGEECHSVGTNSDQYIWVKRS
LNCVLKCGYDAGLY SRSAKE FTDIWMAVWASLCFIS TAFTVLTFL
IDSSRFSYPERPIIFLSMCYNIYSIAYIVRLTVGRERISCDFEEA
AEPVLIQEGLKNTGCAIIFLLMYFFGMASSIWWVILTLTWFLAAG
LKWGHEAI EMHS SYFHIAAWAIPAVKTIVILIMRLVDADE LTGLC
YVGNQNLDALTGFWAPLFTYLVIGTLFIAAGLVALFKIRSNLQK
dgtktdklerlmvkigvfsvlytvpatcviac yfyeisnwalfry
SADDSNMAVEMLKIFMSLLVGITSGMWIWSAKTLHTWQKCSNRLV
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ENMDFRSDHLTTFECFNEIITLAKKYIYIASFCCNPLSTTRGALI
FDKLKEASEKGIKIIVLLDERGKRNLGELQSHCPDINFITVNIDK
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RVDGNSYYWPDIYNSIIEAAINRGVKIRLLVGNWDKNDVYSMATA
RSLDALCVQNDLSVKVFTIQNNTKLLIVDDEYVHITSANFDGTHY
QNHGFVSFNSIDKQLVSEAKKIFERDWVSSHSKSLKI
Subrayado simple - péptido líder (aminoácidos 1-19)
Negrita - Fzd4 humana (aminoácidos 20-520)
Cursiva - F13L (aminoácidos 521-892)
En otro polinucleótido ilustrativo de este tipo, el primer polinucleótido puede codificar un receptor de quimiocina CXC, o uno de sus fragmentos, fusionado con el N-terminal de F13L. Los receptores de quimiocinas CXC son asimismo dianas para la inmunoterapia de ciertos cánceres humanos. Un receptor de quimiocinas CXC ejemplar es CXCR4, o uno de sus fragmentos. En consecuencia, se proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de fusión de receptor de quimiocina CXC-F13L, por ejemplo, una proteína de fusión CXCR4-F13L. Un polinucleótido ilustrativo según este aspecto codifica SEQ ID NO: 3, como se muestra a continuación.
CXCR4-F13L (SEQ ID NO: 3)
MAIPLPLLQIYTSDNYTEEMGSGDYDSMKEPCFREENANFNKIFL
PTIYSIIFLTGIVGNGLVILVMGYQKKLRSMTDKYRLHLSVADLL
FVITLPFWAVDAVANWYFGNFLCKAVHVIY TVNLYS SVLILAFIS
LDRYLAIVHATNSQRPRKLLAEKWYVGVWIPALLLTIPDFIFAN
VSEADDRYICDRFYPNDLWVWFQFQHIMVGLILPGIVILSCYCI
IISKLSHSKGHQKRKALKTTVILILAFFACWLPYYIGISIDSFIL
LEIIKQGCE FENTVHKWISITEALAFFHCCLNPILYAFLGAKFKT
SAQHALTSVSRGSSLKILSKGKRGGHSSVSTESESSSFHSSiWPF
ASVPAGAKCRLVETLPENMDFRSDHLTTFECFNEIITLAKKYIYI
ASFCCNPLSTTRGALIFDKLKEASEKGIKIIVLLDERGKRNLGEL
QSHCPDINFITVNIDKKNNVGLLLGCFWVSDDERCYVGNASFTGG
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CCLPVSTAYHIKNPIGGVFFTDSPEHLLGYSRDLDTDWIDKLKS
AKTSIDIEHLAIVPTTRVDGNSYYWPDIYNSIIEAAINRGVKIRL
LVGNWDKNDVYSMATARSLDALCVQNDLSVKVFTIQNNTKLLIVD
DEYVHITSANFDGTHYQNHGFVSFNSIDKQLVSEAKKIFERDWVS
SHSKSLKI
Negrita - CXCR4 humana (aminoácidos 1-356)
Cursiva - F13L (aminoácidos 357-728)
Como será evidente para los expertos en la materia, una proteína de membrana de paso múltiple que tenga un número par de dominios transmembrana se insertará en una membrana biológica de tal manera que su N-terminal y su C-terminal estén en el mismo lado de la membrana, ya sea en el lado extramembrana de la membrana o en el lado intramembrana de la membrana. Dado que la proteína F13L está situada en su totalidad en el lado intramembrana de los EEV de poxvirus, la formación de una proteína de fusión IMP-F13L correctamente inmersa en la membrana necesitaría que al menos uno del N-terminal o el C-terminal de la IMP, o uno de sus fragmentos, fuera interno a la membrana. Cuando la IMP tiene un número par de dominios TM y ambos están situados internamente, la proteína F13L puede fusionarse con el N-terminal de la IMP o con el C-terminal de la IMP. Si la IMP de longitud completa está situada de tal manera que tanto el N-terminal como el C-terminal son extramembrana, un fragmento de la IMP que tenga un número impar de dominios TM puede fusionarse con F13L.
En consecuencia, la divulgación proporciona un polinucleótido como se describió anteriormente que codifica una IMP con un número par de dominios transmembrana, en el que tanto el extremo 5' como el extremo 3' del primer fragmento de ácido nucleico codifican regiones intramembrana. En ciertos aspectos, el extremo 3' del fragmento de ácido nucleico que codifica F13L puede fusionarse con el extremo 5' del fragmento de ácido nucleico que codifica la IMP, y en ciertos aspectos, el extremo 5' del fragmento de ácido nucleico que codifica F13L puede fusionarse con el extremo 3' del fragmento de ácido nucleico que codifica la IMP.
Una IMP ilustrativa de este tipo es la CD20 humana, una IMP de dominio TM-4 expresada sobre linfocitos B humanos, que es una diana para la inmunoterapia de leucemias de linfocitos B, linfomas y mielomas. En la figura 1C se muestra un diagrama de una proteína de fusión CD20-F13L en la que el C-terminal de CD20 se fusiona con el N-terminal de F13L. En consecuencia, se proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de fusión CD20-F13L. Un polinucleótido ilustrativo según este aspecto codifica SEQ ID NO: 4, como se muestra a continuación.
CD20-F13L (SEQ ID NO: 4)
MATPRNSVNGTFPAEPMKGPIAMQSGPKPLFRRMSSLVGPTQSFF
MRESKTLGAVQIMNGLFHIALGGLLMIPAGIYAPICVTVWYPLWG
GIMYIISGSLLAATEKNSRKCLVKGKMIMNSLSLFAAISGMILSI
MDILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYNCEPANPSEKNSPST
QYCYSIQSLFLGILSVMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRTCSRPKS
NIVLLSAEEKKEQTIEIKEEWGLTE TSSQPKNEEDIEIIPIQEE
EEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP MWPFASVPAGAKCRLVET
LPENMDFRSDHLTTFECFNEIITLAKKYIYIASFCCNPLSTTRGA
LIFDKLKEASEKGIKIIVLLDERGKRNLGELQSHCPDINFITVNI
DKKNNVGLLLGCFWVSDDERCYVGNASFTGGSIHTIKTLGVYSDY
PPLATDLRRRFDTFKAFNSAKNSWLNLCSAACCLPVSTAYHIKNP
IGGVFFTDSPEHLLGYSRDLDTDVVIDKLKSAKTSIDIEHLAIVP
TTRVDGNSYYWPDIYNSIIEAAINRGVKIRLLVGNWDKNDVYSMA
TARSLDALCVQNDLSVKVFTIQNNTKLLIVDDEYVHITSANFDGT
HYQNHGFVSFNSIDKQLVSEAKKIFERDWVSSHSKSLKI
Negrita - CD20 humana (MS4A1) (aminoácidos 1-298)
Cursiva - F13L (aminoácidos 299-669)
En polinucleótidos como los proporcionados anteriormente, el primer y segundo fragmento de ácido nucleico pueden estar directamente fusionados o, como alternativa, pueden estar separados por un fragmento de ácido nucleico que codifica un conector o espaciador u otro fragmento polipeptídico. En ciertos aspectos, un polinucleótido como el proporcionado anteriormente puede incluir además un tercer fragmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido peptídico heterólogo, ya sea entre el primer y el segundo fragmento de ácido nucleico, o a ambos lados. El péptido heterólogo puede ser, por ejemplo, una secuencia conectora, un marcador o detector de aminoácidos, o una secuencia peptídica o polipeptídica que facilite la purificación. En ciertos aspectos, el péptido heterólogo es un marcador de 6-histidina fusionada, por ejemplo, con el extremo C-terminal de la proteína de fusión.
En ciertos aspectos, un polinucleótido tal como se proporciona en el presente documento se asocia operativamente con un promotor de poxvirus. En otro punto del presente documento se describen promotores adecuados. En ciertos aspectos, el promotor es un promotor del poxvirus p7.5 o un promotor del poxvirus H5.
Un polinucleótido, tal como se proporciona en el presente documento, puede ser un genoma de poxvirus o formar parte de este, en el que el genoma de poxvirus, una vez introducido en una célula hospedadora permisiva adecuada, puede producir EEV infecciosos que presenten la proteína de fusión IMP-F13L en su superficie. En ciertos aspectos, el genoma de poxvirus es un genoma de virus vaccinia, por ejemplo, un genoma del virus vaccinia WR o un genoma de MVA. Un genoma de poxvirus que comprende un polinucleótido como el descrito puede producirse mediante técnicas convencionales de biología molecular y virología, por ejemplo utilizando recombinación trimolecular como se describe en el presente documento. Un genoma de poxvirus como el que se proporciona en el presente documento puede introducirse en células permisivas como parte de un poxvirus recombinante, o como ADN desnudo acompañado de virus auxiliares adecuados, por ejemplo, el virus de la viruela aviar. La divulgación proporciona además un poxvirus recombinante, por ejemplo, un virus vaccinia recombinante que comprende el genoma de poxvirus proporcionado.
Proteínas de fusión IMP-EEV, EEV de poxvirus recombinantes y métodos de fabricación
La presente divulgación proporciona además una proteína de fusión IMP-F13L como las codificadas por los polinucleótidos descritos anteriormente. Además, la proteína de fusión IMP-F13L puede expresarse en la superficie de un EEV de poxvirus recombinante, por ejemplo, un EEV de virus vaccinia recombinante. La divulgación proporciona un EEV de poxvirus recombinante, por ejemplo, un EEV de virus vaccinia recombinante que comprende la proteína de fusión. Puede producirse un EEV de poxvirus recombinante mediante un método que incluye infectar una célula hospedadora que puede ser infectada por el virus vaccinia con un virus vaccinia que comprende un genoma poxvírico como el proporcionado anteriormente, y recuperar el EEV liberado de la célula hospedadora infectada. En consecuencia, se proporciona una proteína de fusión IMP-F13L codificada por un polinucleótido como el descrito anteriormente.
Además, la divulgación proporciona proteínas de fusión que comprenden una IMP, o uno de sus fragmentos, que puede ser una IMP de paso múltiple y una IMP de paso único, o incluso solo el dominio extracelular (ECD) de la iMp , fusionada con una proteína de poxvirus, por ejemplo, una proteína del virus vaccinia, específica para EeV, como F13L, A56R, B5R, 33R, A34R, o A36R, una "proteína de fusión iMp-EEV" A continuación se describen ejemplos de proteínas de fusión de ECD. Una proteína de fusión IMP-EEV tal como se proporciona en el presente documento puede presentar la IMP, por ejemplo, una IMP de paso múltiple, una IMP de paso único o un ECD de una IMP, en una forma conformacionalmente intacta en la superficie del EEV de poxvirus. Para el cribado de bancos de anticuerpos en busca de dominios de unión al antígeno que se unen específicamente a una IMP diana, la presentación de IMP en la superficie de EEV de poxvirus ofrece muchas ventajas sobre la presentación de IMP en la superficie de células recombinantes, por ejemplo, células CHO, como es habitual. Por ejemplo, la IMP puede expresarse con mayor densidad sobre EeV que sobre células. Además, los EEV solo expresan aproximadamente seis proteínas de poxvirus diferentes en su superficie (por ejemplo, F13L, A56R, B5R, 33R, A34R y A36R), frente a los cientos que podrían expresarse en la superficie de las células. Por último, los EEV inactivados que expresan proteínas de fusión IMP-F13L, tal como se proporcionan en el presente documento, pueden fijarse a soportes sólidos, lo que ofrece comodidad en el cribado de bancos.
En consecuencia, la presente divulgación proporciona un método para presentar una proteína integral de membrana (IMP), o uno de sus fragmentos, en una conformación nativa para su uso, por ejemplo, en el cribado de bancos de presentación de anticuerpos para detectar dominios de unión al antígeno específicos para la IMP. El método incluye: infectar células hospedadoras que pueden ser infectada por poxvirus con un poxvirus recombinante que expresa la IMP, o uno de sus fragmentos, como proteína de fusión con la proteína específica de EEV de poxvirus, o uno de sus fragmentos asociado a la membrana, en el que el EEV producido por la célula hospedadora infectada comprende la IMP como parte de la membrana de la envoltura externa del EEV; y recuperar el EEV liberado de la célula hospedadora. IMP. En ciertos aspectos, la proteína específica de EEV, o uno de sus fragmentos, puede ser la proteína A33R, la proteína A34R, la proteína A56R, la proteína B5R, la proteína A36R, la proteína F13L del virus vaccinia, cualquiera de sus fragmentos asociado a la membrana o cualquiera de sus combinaciones.
En ciertos aspectos, la proteína específica de EEV es F13L (SEQ ID NO: 1) o uno de sus fragmentos funcionales, y la proteína de fusión puede ser una proteína expresada por un polinucleótido como se ha proporcionado anteriormente, por ejemplo, en la que la IMP es una proteína de membrana de paso múltiple que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete dominios transmembrana.
En ciertos aspectos, el fragmento de proteína específica de EEV asociada a la membrana incluye los dominios de tallo, transmembrana e intramembrana de la proteína A56R del virus vaccinia, un fragmento que comprende, consiste o consiste fundamentalmente en los aminoácidos 108 a 314 de SEQ ID NO: 5. Algunos ejemplos de los varios compañeros de fusión incluyen el ECD de FZD4 humana, mostrado en negrita en SEQ ID NO: 6 a continuación. Según este aspecto ilustrativo, la divulgación proporciona un método para presentar un fragmento conformacionalmente intacto de FZD4 humana en la superficie de un EEV de poxvirus que comprende infectar células hospedadoras que pueden ser infectadas por poxvirus con un poxvirus recombinante que codifica una proteína de fusión que comprende los aminoácidos 20 a 370 de SEQ ID NO: 6. En ciertos aspectos, la proteína de fusión puede comprender además un péptido señal, por ejemplo, los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 6.
FZD-ECD-A56R (SEQ ID NO: 6)
MGWSCIILFLVATATGAHSFGDEEERRCDPIRISMCQNLGYNVTK
MPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCT
EKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQN
DHNHMCMEGPGDEEVPLPHKTPIQPGEE TSTTNDTDKVDYEEYST
ELIVNTDSESTIDIILSGSTHSPETSSKKPDYIDNSNCSSVFEIA
TPEPITDNVEDHTDTVTYTSDSINTVSASSGESTTDETPEPITDK
EDHTVTDTVSYTTVSTSSGIVTTKSTTDDADLYDTYNDNDTVPPT
TVGGSTTSISNYKTKDFVEIFGITALIILSAVAIFCITYYIYNKR
SRKYKTENKV.
Subrayado simple - péptido líder (aminoácidos 1-19)
Negrita - dominio extracelular de FZD4 humana (aminoácidos 20-163)
Cursiva - tallo, transmembrana e intramembrana de A56R (aminoácidos 164 a 370)
Otro ejemplo de compañero de fusión incluye el ECD de ErbB2 humana (Her2), mostrado en negrita en SEQ ID NO: 7 a continuación. Según este aspecto ilustrativo, la divulgación proporciona un método para presentar un fragmento conformacionalmente intacto de Her2 humana en la superficie de un EEV de poxvirus que comprende infectar células hospedadoras que pueden ser infectadas por poxvirus con un poxvirus recombinante que codifica una proteína de fusión que comprende los aminoácidos 20 a 855 de SEQ ID NO: 7. En ciertos aspectos, la proteína de fusión puede comprender además un péptido señal, por ejemplo, los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 7.
Her2-A56R (SEQ ID NO: 7)
MGWSCIILFLVATATGAHSSTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLR
HLYQGCQWQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVR
QVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGL
RELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALT
LIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARC
KGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALV
TYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPL
HNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQ
EFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEIT
GYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISW
LGLRSLRELGSGLAL1HHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTA
NRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVE
ECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVAC
AHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTH
SCVDLDDKGCPAEQRASP TSTTNDTDKVDYEEYSTELIVNTDSES
TIDIILSGSTHSPETSSKKPDYIDNSNCSSVFEIATPEPITDNVE
DHTDTVTYTSDSINTVSASSGESTTDETPEPITDKEDHTVTDTVS
YTTVSTSSGIVTTKSTTDDADLYDTYNDNDTVPPTTVGGSTTSIS
NYKTKDFVEIFGITALIILSAVAIFCITYYIYNKRSRKYKTENKV
Subrayado simple - péptido líder (aminoácidos 1-19)
Negrita - dominio extracelular de ERBB2 humana (HER2) (aminoácidos 20-648)
Cursiva - tallo, transmembrana e intramembrana de A56R (aminoácidos 649 a 855)
Otro ejemplo de compañero de fusión incluye el ECD de CD100 humana (semaforina 4D), mostrado en negrita en SEQ ID n O: 8 a continuación. Según este aspecto ilustrativo, la divulgación proporciona un método para presentar un fragmento conformacionalmente intacto de CD100 humana en la superficie de un EEV de poxvirus que comprende infectar células hospedadoras que pueden ser infectadas por poxvirus con un poxvirus recombinante que codifica una proteína de fusión que comprende los aminoácidos 20 a 935 de SEQ ID NO: 8. En ciertos aspectos, la proteína de fusión puede comprender además un péptido señal, por ejemplo, los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 8.
CD100-A56R (SEQ ID NO: 8)
MGWSCIILFLVATATGAHSFAPIPRITW EHREVH E VOFf íE
PDIYNYSALLLSEDKDTLYIGAREAVFAVNALNISEKQHE
VYWKVSEDKKAKCAEKGKSKQTECLNYIRVLQPLSATS
LYVCGTNAFQPACDHLNLTSFKFLGKNEDGKGRCPFDP
AHSYTSVMVDGELYSGTSYNFLGSEPIISRNSSHSPLRTEY
AIPWLNEPSFVFADVIRKSPDSPDGEDDRVYFFFTEVSVE
YEFVFRVLIPRIARVCKGDQGGLRTLQKKWTSFLKARLI
CSRPDSGLVFNVLRDVFVLRSPGLKVPVFYALFTPQLNN
VGLSAVCAYNLSTAEEVFSHGKYMQSTTVEQSHTKWVR
YN GP VPKPRPGACID SE ARA AN YT S SLNLPDKTLQF VKD
HPLMDDSVTPIDNRPRLIKKDVNYTQIVVDRTQALDGTV
YDVMFVSTDRGALHKAISLEHAVHIIEETQLFQDFEPVQ
TLLLSSKKGNRFVYAGSNSGVVQAPLAFCGKHGTCEDC
VLARDPY C AW SPPT ATC VALHQTE SPSRGLIQEMSGDAS
VCPDKSKGSYRQHFFKHGGTAELKCSQKSNLARVFWKF
QNGVLKAESPKYGLMGRKNLLIFNLSEGDSGVYQCLSE
ERVKNKTVFQVVAKHVLEVKVVPKPVVAPTLSVVQTEG
SRIATKVLYASTQGSSPPTPAVQATSSGAITLPPKPAPTGT
SC E P KIVIN T VPQ L H S E KT M Y L KS S D 77>77 NI) 7 1)K VI) YEEYS
TELIVNTDSESTIDIILSGSTHSPETSSKKPDYIDNSNCSSVFEIATP
EPITDNVEDHTDTVTYTSDSINTVSASSGESTTDETPEPITDKED
HTVTD TVSY TTVS TSSGIVTTKS TTDDADL YD TYNDND TVPPTTV
GGSTTSISNYKTKDFVEIFGITALIILSAVAIFCITYYIYNKRSRKYK
TENKV.
Subrayado simple - péptido líder (aminoácidos 1-19)
Negrita - dominio extracelular de CD100 humana (aminoácidos 20-728)
Cursiva - tallo, transmembrana e intramembrana de A56R (aminoácidos 729 a 935)
En ciertos aspectos, el fragmento de proteína específica de EEV asociada a la membrana incluye los dominios transmembrana e intramembrana de la proteína B5R del virus vaccinia, un fragmento que comprende, consiste o consiste fundamentalmente en los aminoácidos 276 a 317 de SEQ ID NO: 9. En ciertos aspectos, el fragmento de proteína específica de EEV asociada a la membrana incluye los dominios tallo, transmembrana e intramembrana de la proteína B5R del virus vaccinia, un fragmento que comprende, consiste o consiste fundamentalmente en los aminoácidos 238 a 317 de SEQ ID No : 9.
SEQ ID NO: 9: Proteína WR B5R
MKTISVVTLLCVLPAVVYSTCTVPTMNNAKLTSTETSFNDK
QKVTFTCDQGYHSSDPNAYCETDKWKYENPCKKMCTYSD
YISELYNKPLYEVN STMTLSCNGETKYFRCEEKNGNT SWND
T VTCPN AEC QPLQLEHGS CQP VKEK Y SF GE YMTIN CD V GYE
VIGAS YISCTANSWNVIPSCQQKCDMPSLSNGLISGSTFSIGG
VIHLSCKSGFTLTGSP S STCIDGKWNP VLPIC VRTNEEFDPVD
DGPDDETDL SKL SKD V VQ YEQEIE SLE AT YHIIIV ALTIMGVI
FLIS VIVL V C SCDKNNDQ YKFHKLLP
En ciertos aspectos ilustrativos, el compañero de fusión de IMP para el fragmento B5R comprende el dominio extracelular de FZD4 humana, mostrado en negrita en SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 a continuación. Según este aspecto ilustrativo, la divulgación proporciona un método para presentar un fragmento conformacionalmente intacto de FZD4 humana en la superficie de un EEV de poxvirus que comprende infectar células hospedadoras que pueden ser infectadas por poxvirus con un poxvirus recombinante que codifica una proteína de fusión que comprende los aminoácidos 20 a 243 de SEQ ID NO: 10 o los aminoácidos 20 a 281 de SEQ ID NO: 11. En ciertos aspectos, la proteína de fusión puede comprender además un péptido señal, por ejemplo, los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 10.
FZD-B5R (corto) (SEQ ID NO: 10)
MGWSCIILFLVATATGAYAFGDEEERRCDPIRISMCONLG
YNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQF
FLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEF
GF A WPE SLN C SKFPPQNDHNHMCME GPGDEE VPLPHKT
PIQPGEECHSYGTNSDQYIWVKRSLNCVLKCGYDAGLYS
RSAKEG4 TYHIIIVAL TIMG VIFLISVIVL VCSCDKNNDQYKFHK
LLP.
Subrayado simple - péptido líder (aminoácidos 1-19)
Negrita - dominio extracelular de FZD4 humana (aminoácidos 20-200)
Cursiva - TM y cola citoplasmática de B5R (aminoácidos 201-243)
FZD-B5R (largo) (SEQ ID NO: 11)
MGWSCIILFLVATATGAYAFGDEEERRCDPIRISMCONLG
YNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQF
FLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEF
GF A WPE SLN C SKFPPQNDHNHMCME GPGDEE VPLPHKT
PIQPGEECHSVGTNSDQYIWVKRSLNCVLKCGYDAGLYS
RS AKE YVRTNEEFDP VDDGPDDETDLSKLSKD WQYEQEIESL
EA TYHIIIVAL TIMG VIFLISVIVL VCSCDKNNDQYKFHKLLP.
Subrayado simple - péptido líder (aminoácidos 1-19)
Negrita - dominio extracelular de FZD4 humana (aminoácidos 20-200)
Cursiva - tallo, TM y cola citoplasmática de B5R (aminoácidos 201-281)
La divulgación proporciona además una proteína de fusión que comprende: aminoácidos 20 a 892 de SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; s Eq ID NO: 4; aminoácidos 20 a 370 de SEQ ID No : 6; aminoácidos 20 a 855 de SEQ ID NO: 7; aminoácidos 20 a 935 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 20 a 243 de SEQ ID NO: 10; o los aminoácidos 20 a 281 de SEQ ID NO: 11, cualquiera de sus combinaciones, cualquiera de sus fragmentos o cualquiera de sus variantes, en los que la proteína de fusión, cuando es expresada por un poxvirus recombinante, aparece en la superficie de un virión con envoltura extracelular (EEV) de poxvirus en una conformación nativa.
También se proporciona un EEV de poxvirus recombinante que comprende cualquier proteína de fusión de EEV según se proporciona en el presente documento.
Método de selección de anticuerpos
La presente divulgación proporciona además un método para seleccionar moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno o moléculas de unión similares a anticuerpos que se unen a una proteína de membrana de interés de paso múltiple. El método comprende unir un EEV recombinante como se proporciona en el presente documento a un soporte sólido, en el que el EEV recombinante puede presentar una proteína de paso múltiple en su superficie; proporcionar un banco de presentación, por ejemplo, un banco de presentación de anticuerpos, en el que el banco comprende paquetes de presentación que presentan una pluralidad de dominios de unión al antígeno; poner en contacto el banco de presentación con el EEV de manera que los paquetes de presentación que presentan dominios de unión al antígeno que se unen específicamente a la IMP expresada sobre el EEV puedan unirse al mismo; eliminar los paquetes de presentación no unidos; y recuperar los paquetes de presentación que presentan un dominio de unión al antígeno específico para la IMP expresada sobre el EeV.
Cualquier banco de presentación que comprende una pluralidad de dominios de unión, por ejemplo, anticuerpos, moléculas similares a anticuerpos u otras moléculas de unión es adecuado para este método. Por ejemplo, el banco de presentación puede ser un banco de presentación de fagos, un banco de presentación de levaduras o un banco construido en un vector de virus vaccinia como se describe en otro punto del presente documento.
En ciertos aspectos, el EEV recombinante puede inactivarse antes de fijarse al soporte sólido. Por ejemplo, el EEV puede inactivarse mediante incubación con psoraleno (clorhidrato de 4'-aminometiltrioxsaleno) en presencia de irradiación UV.
Puede utilizarse cualquier soporte sólido adecuado. Tal como se utiliza en el presente documento, un "soporte sólido" es cualquier soporte capaz de unirse a un EEV, que puede ser de diversas formas, tal como se conoce en la técnica. Entre los soportes más conocidos se encuentran el plástico de cultivo de tejidos, el vidrio, el poliestireno, el polipropileno, el polietileno, el dextrano, el nailon, las amilasas, las celulosas naturales y modificadas, las poliacrilamidas, los gabros y la magnetita. La naturaleza del portador puede ser soluble hasta cierto punto o insoluble a efectos de la presente divulgación. El material de soporte puede tener prácticamente cualquier configuración estructural, siempre que el EEV acoplado sea capaz de unirse a una molécula de unión presentadas, como un anticuerpo. Así, la configuración del soporte puede ser esférica, como en una esfera, o cilíndrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie exterior de una varilla. Como alternativa, la superficie puede ser plana, como una lámina, una tira reactiva, etc. Los soportes típicos incluyen esferas, por ejemplo, esferas magnéticas de poliestireno, como DYNABEADS®, que pueden extraerse de la suspensión mediante un imán. La configuración del soporte puede incluir un tubo, una esfera, una microesfera, un pocillo, una placa, una placa de cultivo de tejidos, una placa Petri, una microplaca, una placa de microtitulación, un matraz, una varilla, una tira, un vial, una paleta, etc. Un soporte sólido puede ser magnético o no magnético. Los expertos en la materia conocerán muchos otros portadores adecuados para la unión de EEV según se proporciona en el presente documento, o podrán determinarlos con facilidad. En ciertos aspectos, el EEV tal como se proporciona en el presente documento puede unirse al soporte sólido mediante una reacción, por ejemplo, con grupos tosilo, grupos epoxi, grupos ácido carboxílico o grupos amino unidos a la superficie. Por ejemplo, el EEV puede fijarse a la superficie de esferas magnéticas activadas con tosilo, por ejemplo, las esferas MYONE™ activadas con tosilo. Como alternativa, el EEV puede biotinilarse y unirse a una superficie sólida de estreptavidina, por ejemplo, esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina.
Esta divulgación emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las competencias de la técnica. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía (véase, por ejemplo, Sambrook et al., ed. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985), DNA Cloning, volúmenes I y II; Gait, ed. (1984), Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. patente de EE. UU. n.° 4683 195; Hames y Higgins, eds. (1984), Nucleic Acid Hybridization; Hames y Higgins, eds. (1984), Transcription And Translation; Freshney (1987), Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.) Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984), A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller y Calos, eds. (1987), Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, vols. 154 y 155; Mayer y Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londres) Weir y Blackwell, eds. (1986), Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); y en Ausubel et al. (1989), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
Los principios generales de la modificación de anticuerpos se exponen en Borrebaeck, ed. (1995), Antibody Engineering (2a ed., Oxford Univ. Pulse). Los principios generales de la modificación de proteínas se exponen en Rickwood et al. (1995), Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Reino Unido). Los principios generales de los anticuerpos y de la unión anticuerpo-hapteno se exponen en: Nisonoff (1984), Molecular Immunology (2a ed., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); y Steward (1984), Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, Nueva York, N.Y.). Además, pueden seguirse métodos convencionales de inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente, como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Stites et al. (1994), Basic and Clinical Immunology (8a ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn.); y Mishell y Shiigi (eds.) (1980), Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).
Las obras de referencia convencionales que establecen los principios generales de la inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein (1982), J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, Ny ); Kennett et al.y otros, eds. (1980), Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, Ny ); Campbell (1984), "Monoclonal Antibody Technology" en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al. (Elsevier, Amsterdam); Goldsby et al., eds. (2000), Kuby Immunology (4a ed., H. Freeman & Co.); Roitt et al. (2001), Immunology (6a ed., Londres: Mosby); Abbas et al. (2005), Cellular and Molecular Immunology (5a ed., Elsevier Health Sciences Division); Kontermann y Dubel (2001), Antibody Engineering (Springer Verlag); Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003), Genes VIII (Prentice Hall, 2003); Harlow y Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach y Dveksler (2003), PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).
Los siguientes ejemplos se ofrecen a título ilustrativo y no limitante.
Resumen de las indicaciones técnicas
La divulgación proporciona un polinucleótido aislado que incluye: un primer fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína integral de membrana (IMP), o uno de sus fragmentos, en el que la IMP, o uno de sus fragmentos, incluye al menos una región extramembrana, al menos un dominio transmembrana y al menos una región intramembrana, y en el que una porción del primer fragmento de ácido nucleico que codifica al menos una región intramembrana está situada en el extremo 5' o 3' del primer fragmento de ácido nucleico; y un segundo fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína F13L del virus vaccinia, o uno de sus fragmentos funcionales, en el que el segundo fragmento de ácido nucleico está fusionado dentro del marco con una porción del primer fragmento de ácido nucleico que codifica una región intramembrana de la IMP. Según esto, una célula infectada por poxvirus que contenga el polinucleótido puede expresar una proteína de fusión IMP-F13L como parte de la membrana de la envoltura externa de un virión con envoltura extracelular (EEV). La proteína F13L, o uno de sus fragmentos funcionales, puede incluir la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 o uno de sus fragmentos funcionales. La IMP puede ser una proteína de membrana de paso múltiple que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete dominios transmembrana. La IMP puede ser una proteína de membrana de paso múltiple de las enumeradas en la tabla 1.
La IMP de paso múltiple puede tener un número impar de dominios transmembrana, el extremo 5' del primer fragmento de ácido nucleico puede codificar una región extramembrana, y el extremo 3' del primer fragmento de ácido nucleico puede codificar una región intramembrana fusionada con el extremo 5' del segundo fragmento de ácido nucleico. El primer fragmento de ácido nucleico de este tipo puede codificar, por ejemplo, un receptor acoplado a proteína G (GPCR). El GPCR puede ser la proteína humana frizzled-4 (FZD4), o uno de sus fragmentos, y el polinucleótido puede codificar un polipéptido que incluye los aminoácidos 20 a 892 de SEQ ID NO: 2. El polipéptido puede incluir además un péptido señal, por ejemplo, los aminoácidos 1 a 19 de SEQ ID NO: 2. El GPCR puede ser un receptor de quimiocinas CXC, por ejemplo, CXCR4, o uno de sus fragmentos, y el polinucleótido puede codificar un polipéptido que incluya la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
La IMP de paso múltiple puede tener un número par de dominios transmembrana, y tanto el extremo 5' como el extremo 3' del primer fragmento de ácido nucleico pueden codificar regiones intramembrana. El segundo fragmento de ácido nucleico puede fusionarse con el extremo 3' del primer fragmento de ácido nucleico. La IMP puede ser, por ejemplo, la proteína CD20 humana, o uno de sus fragmentos, y el polinucleótido puede codificar un polipéptido que incluya la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4.
El primer y segundo fragmento de ácido nucleico de un polinucleótido proporcionado en el presente documento pueden fusionarse directamente. El polinucleótido, tal como se proporciona en el presente documento, puede incluir un tercer fragmento de ácido nucleico que codifica un péptido heterólogo, por ejemplo, una secuencia conectora, un marcador o detector de aminoácidos, o una secuencia peptídica o polipeptídica que facilita la purificación, como un marcador de histidina. Un polinucleótido como se proporciona en el presente documento puede asociarse operativamente con un promotor de poxvirus, por ejemplo, un promotor p7.5, T7 o H5.
La divulgación proporciona además una proteína de fusión F13L codificada por un polinucleótido como se proporciona en el presente documento. La divulgación proporciona además un genoma de poxvirus, por ejemplo, un genoma de virus vaccinia, que incluye un polinucleótido como se proporciona en el presente documento. La divulgación proporciona además un EEV de virus vaccinia recombinante que incluye un genoma de poxvirus tal como se proporciona en el presente documento.
La divulgación proporciona además un método para producir un EEV de virus vaccinia recombinante como se proporciona en el presente documento, en el que el método incluye infectar una célula hospedadora que puede ser infectada por el virus vaccinia con un virus vaccinia que comprende un genoma de poxvirus como se proporciona en el presente documento, y recuperar el EEV liberado de la célula hospedadora.
La divulgación proporciona además un método para presentar una proteína de membrana integral (IMP), o uno de sus fragmentos, en una conformación nativa, en el que el método incluye infectar células hospedadoras que pueden ser infectadas por poxvirus con un poxvirus recombinante que expresa una IMP, o uno de sus fragmentos, como una proteína de fusión con una proteína específica de EEV de poxvirus, o uno de sus fragmentos asociado a membrana, en el que los EEV producidos por la célula hospedadora infectada comprenden la proteína de fusión IMP como parte de la membrana de la envoltura externa del EEV, y recuperar los EEV liberados de la célula hospedadora. La IMP, o su fragmento, puede presentarse en la superficie del EEV en una conformación nativa. La proteína específica del EEV puede ser la proteína A33R, la proteína A34R, la proteína A56R, la proteína B5R, la proteína A36R, la proteína F13L del virus vaccinia, cualquiera de sus fragmentos asociado a la membrana, o cualquiera de sus combinaciones.
La proteína específica de EEV puede ser F13L (SEQ ID NO: 1) o uno de sus fragmentos funcionales. La IMP puede ser una proteína de membrana de paso múltiple que incluya al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete dominios transmembrana. La IMP puede ser un receptor acoplado a proteína G (GPCR), por ejemplo, FZD4 humano o CXCR4 como se ha descrito anteriormente, que incluye siete dominios transmembrana, y la proteína F13L puede fusionarse con el C-terminal de la IMP. La IMP, o su fragmento, puede tener un número par de dominios transmembrana, por ejemplo, CD20 humana como se ha descrito anteriormente, en la que tanto el N-terminal como el C-terminal de la IMP o su fragmento son intramembrana, y el F13L puede fusionarse con el N-terminal o el C-terminal de la IMP
El fragmento de proteína específica EEV asociada a membrana puede incluir o consistir en los dominios de tallo, transmembrana e intramembrana de la proteína A56R del virus vaccinia, por ejemplo, los aminoácidos 108 a 314 de SEQ ID NO: 5. La porción de IMP de la proteína de fusión A56R puede incluir el dominio extracelular de FZD4 humana, por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir los aminoácidos 20 a 370 de SEQ ID NO: 6, el dominio extracelular de ErbB2 humana (Her2), por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir los aminoácidos 20 a 855 de SEQ ID NO: 7, o el dominio extracelular de CD100 humana (semaforina 4D), por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir los aminoácidos 20 a 935 de SEQ ID NO: 8.
El fragmento de proteína específica EEV asociada a membrana puede incluir o consistir en los dominios transmembrana e intramembrana, o los dominios de tallo, transmembrana e intramembrana de la proteína B5R del virus vaccinia, por ejemplo, los aminoácidos 276 a 317 de SEQ ID NO: 9 o los aminoácidos 238 a 317 de SEQ ID NO: 9, respectivamente. La porción de IMP de la proteína de fusión B5R puede incluir el dominio extracelular de FZD4 humana, por ejemplo, la proteína de fusión puede incluir los aminoácidos 20 a 243 de SEQ ID NO: 10 o los aminoácidos 20 a 281 de SEQ ID NO: 11.
La divulgación proporciona además una proteína de fusión que comprende: aminoácidos 20 a 892 de SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; s Eq ID NO: 4; aminoácidos 20 a 370 de SEQ ID No : 6; aminoácidos 20 a 855 de SEQ ID NO: 7; aminoácidos 20 a 935 de SEQ ID NO: 8; aminoácidos 20 a 243 de SEQ ID NO: 10; aminoácidos 20 a 281 de SEQ ID NO: 11; aminoácidos 20 a 506 de SEQ ID NO: 13; o los aminoácidos 20 a 235 de SEQ ID NO: 14. Una proteína de fusión como la proporcionada, cuando es expresada por un poxvirus recombinante, por ejemplo, un virus vaccinia, puede aparecer en la superficie de un virión con envoltura extracelular (EEV) de poxvirus en una conformación nativa. También se proporciona un EEV de poxvirus recombinante que comprende la proteína de fusión. La divulgación proporciona además un EEV de poxvirus recombinante que incluye una IMP heteróloga, o uno de sus fragmentos, fusionada con una proteína específica del EEV de poxvirus, o uno de sus fragmentos asociado a la membrana, en el que la proteína de fusión está situada en la membrana de la envoltura externa del EEV, y en el que la IMP, o uno de sus fragmentos, se presenta en la superficie del EEV en su conformación nativa. El EEV de poxvirus recombinante puede ser un EEV de virus vaccinia.
La divulgación proporciona además un método para seleccionar anticuerpos que se unen a una proteína de membrana de paso múltiple, en el que el método incluye unir el EEV recombinante como se proporciona en el presente documento a un soporte sólido; proporcionar un banco de presentación de anticuerpos, en el que el banco comprende paquetes de presentación que presentan una pluralidad de dominios de unión al antígeno; poner en contacto el banco de presentación con el EEV de manera que los paquetes de presentación que muestran dominios de unión al antígeno que se unen específicamente a la IMP expresada en el EEV puedan unirse al mismo; eliminar los paquetes de presentación no unidos; y recuperar los paquetes de presentación que presentan un dominio de unión al antígeno específico para la IMP expresada sobre el EEV. La EEV recombinante puede inactivarse antes de su fijación al soporte sólido, por ejemplo, mediante incubación con psoraleno (clorhidrato de 4-aminometiltrioxsaleno) en presencia de irradiación u V. La EEV recombinante puede fijarse a la superficie sólida mediante reacción con grupos tosilo fijados a la superficie. La superficie sólida pueden ser esferas magnéticas activadas con tosilo. La EEV recombinante puede biotinilarse y unirse a una superficie sólida recubierta con estreptavidina, por ejemplo, esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina.
Ejemplos
Ejemplo 1: Construcción de proteínas de fusión
Las IMP fueron incorporadas a EEV de virus vaccinia usando las proteínas específicas de EEV F13L, A56R, y B5R, mediante los siguientes métodos. En general, los dominios extracelulares de HER2, CD100 (semaforina 4D) y FZD4 se incorporaron como fusiones con las proteínas de membrana específicas de EEV de paso único A56R y B5R, tal como se esquematiza en la figura 1A. La proteína de fusión madura FZD4-ECD-A56R comprende los aminoácidos 20 a 370 de SEQ ID NO: 6, la proteína de fusión HER2-ECD-A56R madura comprende los aminoácidos 20 a 855 de SEQ ID NO: 7, y la proteína de fusión madura CD100-ECD-A56R comprende los aminoácidos 20 a 935 SEQ ID NO: 8. La figura 1B y la figura 1C muestran esquemáticamente cómo las proteínas de paso múltiple, como las GPCR y CD20, pueden incorporarse a los EEV como proteínas de membrana de paso múltiple en forma de fusión con la proteína F13L asociada a la membrana de EEV.
Preparación de proteínas de fusión F13L (FZD4-F13L, CD20-F13L y CXCR4-F13L)
Los ADNc que codifican las IMP fueron clonados dentro del marco del gen F13L del virus vaccinia que codifica la glicoproteína de la membrana de EEV palmitoilada (SEQ ID NO: 1) en el plásmido pJEM1 descrito anteriormente con el fin de introducirlo en el virus vaccinia. pJEM1 es un derivado de p7.5/tk descrito en la solicitud de patente de EE. UU. n.° de publicación 2013/0288927, y que cuando se digiere con NcoI o BssHII y BsiWI, contiene regiones flanqueantes capaces de realizar la recombinación homóloga con el gen TK del virus vaccinia y el promotor H5 del virus vaccinia.
El marco de lectura abierto del gen de la proteína de membrana humana MS4A1 (CD20)(NM_021950.3) se clonó dentro del marco con F13L del virus vaccinia utilizando PCR SOE ("Splicing by Overlap Extension", corte y empalme por extensión de solapamiento) según protocolos convencionales por los que los sitios de endonucleasas de restricción NcoI y BsiWI se añadieron al producto PCR codificándolos en los cebadores de flanqueantes más cercanos 5' y 3', respectivamente. Esta estrategia evita la introducción de un péptido líder. El producto final de la PCR y pJEM1 se digirieron con NcoI y BsiWI y las dos especies se unieron mediante ligamiento siguiendo los protocolos convencionales. A continuación, el plásmido circularizado se introdujo en E. coli competentes mediante transformación química y las colonias se seleccionaron en placas de agar con ampicilina.
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La proteína de fusión CD20-F13L resultante codificada por el polinucleótido comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4.
El marco de lectura abierto de la proteína de membrana humana FZD4 (NM_012193.3) se clonó dentro del marco con F13L del virus vaccinia utilizando PCR SOE (corte y empalme por extensión de solapamiento) según protocolos convencionales por los que los sitios de endonucleasas de restricción BssHII y BsiWI se añadieron al producto PCR codificándolos en los cebadores flanqueantes más cercanos 5' y 3', respectivamente. Esta estrategia permite utilizar el péptido líder contenido en pJEM1. El producto final de la PCR y pJEM1 se digirieron con BssHII y BsiWI y las dos especies se unieron mediante ligamiento siguiendo los protocolos convencionales. A continuación, el plásmido circularizado se introdujo en E. coli competentes mediante transformación química y las colonias se seleccionaron en placas de agar con ampicilina. Los cebadores PCR eran específicos para FZD4 y F13L y se ajustan a la misma estrategia general descrita para MS4A1. La proteína de fusión FZD4-F13L madura resultante codificada por el polinucleótido comprende los aminoácidos 20-892 de SEQ ID NO: 2.
El marco de lectura abierto de la proteína de membrana humana CXCR4 (NM_001008540.1) se clonó dentro del marco con F13L del virus vaccinia utilizando PCR SOE (corte y empalme por extensión de solapamiento) según protocolos convencionales por los que los sitios de endonucleasas de restricción NcoI y BsiWI se añadieron al producto PCR codificándolos en los cebadores flanqueantes más cercanos 5' y 3', respectivamente. Esta estrategia evita la introducción de un péptido líder. El producto final de la PCR y el pJEM1 se digirieron con NcoI y BsiWI y las dos especies se unieron mediante ligamiento siguiendo el protocolo convencional. A continuación, el plásmido circularizado se introdujo en E. coli competentes mediante transformación química y las colonias se seleccionaron en placas de agar con ampicilina. Los cebadores PCR eran específicos para CXCR4 y F13L y se ajustan a la misma estrategia general descrita para MS4A1. La proteína de fusión CXCR4-F13L resultante codificada por el polinucleótido comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
Los plásmidos producidos como se ha descrito anteriormente, así como plásmidos similares que codifican versiones sin fusionar ("sin marcar") de CD20, FZD4, CXCR4, CD100 y HER2, se linealizaron y se introdujeron en el virus vaccinia mediante recombinación trimolecular.
Ejemplo 2: Expresión de la proteína de fusión CD20-F13L en EEV
Se infectaron células BHK con la IMV que codifica la proteína de fusión CD20-F13L (SEQ ID NO: 4) o el virus Western Reserve (WR) de control en una multiplicidad de infección (MOI) de 1 virus por célula durante dos días, tras lo cual se recogió el sobrenadante que contenía EEV y se eliminaron los restos mediante centrifugación a baja velocidad. Las DYNABEADS® de proteína G (110 ^l) se extrajeron con un imán y se añadió a las esferas 1 mL de PBS 20 ^g de anticuerpo anti-CD20 purificado. La solución se incubó a temperatura ambiente con una rotación suave durante 30-60 minutos para permitir que el anticuerpo se acoplara a las esferas de proteína G. Se añadieron 10 ^g de control de isotipo mIgG1 purificado a la solución para asegurar el bloqueo completo, y la solución se incubó a temperatura ambiente con rotación suave durante 10-30 minutos más. Las esferas se extrajeron con el imán, se lavaron una vez con 1 mL de PBS y se resuspendieron en 110 ^L de PBS.
Se añadieron 50 ^L de Anti-CD20-Pro G DYNABEADS® a 1 mL de sobrenadante de CD20-F13L o EEV WR y se incubó a temperatura ambiente con rotación suave durante 1 hora. Las esferas se extrajeron con el imán y se eliminó el sobrenadante sin unir. A continuación, las esferas se lavaron cinco veces con 1 mL de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con FBS al 10 % y HEPES 1 mM (DMEM al 10 %). Todos los lavados se reunieron con el sobrenadante sin unir ("Sin unir"). A continuación, las esferas ("Unidas") se resuspendieron en 1 mL de DMEM al 10 %. "Sin unir" y "Unidas" fueron tituladas en células BSC-1 y cubiertas con medio de crecimiento que contenía metilcelulosa. Se dejó que se formaran placas durante dos días y, a continuación, se fijaron las células y se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,1 %. Se contaron las placas para determinar el número de unidades formadoras de placas (ufp) en "Sin unir" y "Unidas", a partir de las cuales se pudo calcular el porcentaje de EEV unido a las esferas. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: Unión de CD20-F13L EEV
Figure imgf000033_0001
El porcentaje de EEV unido a las esferas recubiertas con anti-CD20 fue significativamente mayor para la proteína de fusión CD20-F13L EEV que para la Western Reserve, lo que indica que la CD20 se está expresando en la superficie de la membrana del EEV.
Ejemplo 3: La fusión de CD20 con F13L se expresa con más eficacia en la membrana del EEV
Se infectaron células BHK con la IMV que codifica la proteína de fusión CD20-F13L (SEQ ID NO: 4), proteína de fusión CD20-A56R (SEQ ID NO: 13), CD20 sin marcar (sin fusionar) o dominio extracelular (ECD) HER2-A56R de control (SEQ ID NO: 7) con una MOI = 1 durante dos días, tras lo cual se recogió el sobrenadante que contenía EEV y se eliminaron los restos mediante centrifugación a baja velocidad. Las DYNABEADS® de estreptavidina (200 ^l) se extrajeron con un imán y se añadieron a las esferas 0,2 mL de PBS 20 ^g de anticuerpo anti-CD20 biotinilado purificado o de anticuerpo anti-HER2 biotinilado. La solución se incubó a temperatura ambiente con una rotación suave durante 30 minutos para permitir que el anticuerpo se acoplara a las esferas de estreptavidina. Las esferas se extrajeron con el imán, se lavaron una vez con 1 mL de PBS y se resuspendieron en 200 ^L de PBS.
CD20-A56R: (SEQ ID NO: 13)
MGW S CIILFL V AT AT GAHYELIVNTDSES TIDIILSGS THSPE TS
SKKPDYIDNSNCSSVFEIATPEPITDNVEDHTDTVTYTSDSINTVS
ASSGESTTDETPEPITDKEDHTVTDTVSYTTVSTSSGIVTTKSTTD
DADL YD TYNDND TVPP TTVGGS TTSISNYK TKDFVEIFGITALIIL
SAVAIFCITYYIYNKRSRKYKTENKVMTTPRNSVNGTYY AEPM
KGPIAMQ SGPKPLFRRMS SL V GPTQ SFFMRE SKTLGA V Q
IMN GLFHIAL GGLLMIP AGI Y APIC VT VW YPL W GGIMYII
SGSLLAATEKN SRKCLVKGKMIMN SLSLFAAISGMILSIM
DILNIKISHFLKMESLNFIRAHTPYINIYN CEPANPSEKN SP
STQY CY SIQSLFLGILS VMLIFAFFQELVIAGIVENEWKRT
CSRPKSNIVLLSAEEKKEQTIEIKEEVVGLTETSSQPKNE
EDIEIIPIQEEEEEETETNFPEPPQDQESSPIENDSSP
Subrayado simple - Secuencia señal (aminoácidos 1-19)
Cursiva - A56R truncada (aminoácidos 20-190)
Negrita - Secuencia de CD20 (aminoácidos 191-506)
Se añadieron 50 ^L de esferas de estreptavidina preparadas a 1 mL de cada sobrenadante de EEV y se dejaron girar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Las esferas se extrajeron con el imán y se eliminó el sobrenadante sin unir. A continuación, las esferas se lavaron cinco veces con 1 mL de medio DMEM suplementado con FBS al 10 % y HEPES 1 mM (DMEM al 10 %). Todos los lavados se reunieron con el sobrenadante sin unir ("Sin unir"). A continuación, las esferas ("Unidas") se resuspendieron en 1 mL de DMEM al 10 %. "Sin unir" y "Unidas" fueron tituladas en células BSC-1 y cubiertas con medio de crecimiento que contenía metilcelulosa. Se dejó que se formaran placas durante dos días y, a continuación, se fijaron las células y se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,1 %. Se contaron las placas para determinar el número de unidades formadoras de placas (ufp) en "Sin unir" y "Unidas", a partir de las cuales se pudo calcular el porcentaje de EEV unido a las esferas. Los resultados se muestran en la figura 2.
El porcentaje de EEV unido a las esferas recubiertas con anti-CD20 para CD20-F13L fue mayor que el porcentaje de EEV unido para CD20 sin m
arcar (sin fusionar) o fusionado con A56R, lo que indica una mayor expresión de CD20-F13L en la membrana del EEV. La ausencia de unión a las esferas recubiertas de anti-HER2 confirmó la especificidad del ensayo.
El experimento anterior se repitió utilizando la proteína de fusión CD20-F13L (SEQ ID NO: 4), CD20 sin marcar (sin fusionar), proteína de fusión FZD-F13L (SEQ ID NO: 2), y FZD sin marcar (sin fusionar). El virus se extrajo utilizando esferas recubiertas con anti-CD20 o anti-FZD, tal como se ha descrito anteriormente. Los datos de la figura 3A (esferas recubiertas con anti-CD20) y figura 3B (esferas recubiertas con anti-FZD) demuestran que las proteínas de fusión F13L fueron extraídas específicamente por sus respectivos anticuerpos, y se incorporaron con más eficiencia al virus vaccinia que las proteínas sin marcar (sin fusionar).
Ejemplo 4: El virus vaccinia puede modificarse para expresar diversas construcciones de antígeno-EEV
Se infectaron células BHK con una MOI = 1 con virus que expresaban las siguientes construcciones de antígenos: CD20-F13L (SEQ ID NO: 4), CXCR4-F13L (SEQ ID NO: 3), HER2-ECD-A56R (SEQ ID NO: 7), y CD100-ECD-A56R (SEQ ID NO: 8). Al cabo de dos días, se recogió el sobrenadante que contenía los EEV y se eliminaron los restos mediante centrifugación a baja velocidad. Las DYNABEADS® de estreptavidina se extrajeron con un imán y, para cada muestra, se resuspendieron 50 j l de esferas en 0,1 mL de PBS 5 |jg de anticuerpo anti-CD20 purificado biotinilado, anti-CXCR4 biotinilado (12G5), anti-CD100 biotinilado (2503) o anti-HER2 biotinilado. Las soluciones se incubaron a temperatura ambiente con una rotación suave durante 30 minutos para permitir que el anticuerpo se acoplara a las esferas de estreptavidina. Las esferas se extrajeron con el imán, se lavaron una vez con 1 mL de PBS y se resuspendieron en 100 jL de PBS por muestra.
Se añadieron 100 j l de esferas de estreptavidina preparadas a 1 mL de cada sobrenadante de EEV y se dejaron girar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Las esferas se extrajeron con el imán y se eliminó el sobrenadante sin unir. A continuación, las esferas se lavaron cinco veces con 1 mL de medio DMEM suplementado con FBS al 10 % y HEPES 1 mM (DMEM al 10 %). Todos los lavados se reunieron con el sobrenadante sin unir ("Sin unir"). A continuación, las esferas ("Unidas") se resuspendieron en 1 mL de DMEM al 10 %. "Sin unir" y "Unidas" fueron tituladas en células BSC-1 y cubiertas con medio de crecimiento que contenía metilcelulosa. Se dejó que se formaran placas durante dos días y, a continuación, se fijaron las células y se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,1 %. Se contaron las placas para determinar el número de unidades formadoras de placas (ufp) en "Sin unir" y "Unidas", a partir de las cuales se pudo calcular el porcentaje de EEV unido a las esferas. Los resultados se muestran en la figura 4.
Todos los antígenos-EEV se unieron específicamente a sus correspondientes esferas acopladas a anticuerpos, lo que indica una expresión eficiente del antígeno sobre la membrana de EEV.
Ejemplo 5: El antígeno-EEV puede acoplarse directamente a esferas magnéticas para la selección de anticuerpos
Se infectaron células BHK (2 * 108 células) con una MOI = 1 con virus que expresaba HER2-ECD-A56R (SEQ ID NO: 7), FZD-F13L (SEQ ID NO: 2), CXCR4-F13L (SEQ ID NO: 3) o CD100 (semaforina 4D)-ECD-A56R (SEQ ID NO: 8) en una cámara de cultivo celular cellSTACK cada una (Corning). Al cabo de dos días, se recogió el sobrenadante que contenía los EEV y se eliminaron los restos mediante centrifugación a baja velocidad. A continuación, el sobrenadante aclarado se centrifugó a 13.000 rpm (28.000 * g) durante 1 hora para sedimentar el antígeno-EEV. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 1,5 mL de IX PBS. Los distintos virus se transfirieron a tubos nuevos y se añadió psoraleno (clorhidrato de 4-aminometiltrioxsaleno; Sigma) a 20 jg/m l de concentración final. El EEV y el psoraleno se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de ser irradiados en un STRATALINKER® UV Crosslinker (Stratagene) con 99 999 microjulios. El procedimiento de psoraleno/UV garantiza la inactivación del antígeno-EEV y, por lo tanto, la imposibilidad de que forme placas o se multiplique en cualquier prueba posterior.
Las MyOne DYNABEADS® activadas con tosilo (100 jL ) se extrajeron con un imán y se lavaron con 1 mL de PBS. El imán extrajo las esferas, se retiró el PBS y se añadió 1 mL de cada antígeno-EEV inactivado por psoraleno/UV a una parte alícuota distinta de esferas. Las esferas y el antígeno-EEV se dejaron girar a 37 °C durante 16-20 horas. Las esferas se precipitaron y se eliminó el sobrenadante. Las esferas se bloquearon con 1 mL de IX PBS, FBS al 10 % y BSA al 0,5 % a 37 °C durante 1 hora. Las esferas se sedimentaron y lavaron con 1 mL de IX PBS antes de resuspenderlas en 200 jL de IX PBS.
Se añadieron 100 microlitros de esferas acopladas al antígeno-EEV a 1 mL de cada sobrenadante respectivo de anticuerpo-EEV que expresaba anti-FZD4, anti-CXCR4, anti-CD 100 o anti-HER2, así como al anticuerpo-EEV de control. Los EEV de anticuerpos se produjeron infectando células BHK con una MOI = 1 cada una durante 2 días con virus vaccinia que codificaban las cadenas pesada y ligera de los respectivos anticuerpos, y recolectando los sobrenadantes, seguido de un centrifugado a baja velocidad para eliminar cualquier célula. Las esferas acopladas al virus y el anticuerpo-EEV se dejaron girar a temperatura ambiente durante 2 horas. Las esferas se sedimentaron con el imán y se eliminaron los sobrenadantes sin unir. A continuación, las esferas se lavaron cinco veces con 1 mL de medio DMEM suplementado con FBS al 10 % y HEPES 1 mM (DMEM al 10 %). Todos los lavados se reunieron con el sobrenadante sin unir ("Sin unir"). A continuación, las esferas ("Unidas") se resuspendieron en 1 mL de DMEM al 10 %. "Sin unir" y "Unidas" fueron tituladas en células BSC-1 y cubiertas con medio de crecimiento que contenía metilcelulosa. Se dejó que se formaran placas durante dos días y, a continuación, se fijaron las células y se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,1 %. Se contaron las placas para determinar el número de unidades formadoras de placas (ufp) en "Sin unir" y "Unidas", a partir de las cuales se pudo calcular el porcentaje de EEV unido a las esferas. En la figura 5 se muestra un diagrama del método, y los resultados se muestran en la figura 6A(HER2), la figura 6B (FZD4), la figura 6C (CXCR4), y la figura 6D (CD100 ("Sema")).
El anticuerpo-EEV que expresa anti-HER2 fue específicamente extraído por esferas acopladas con el EEV antígeno HER2-ECD-A56R, el anticuerpo-EEV que expresa anti-FZD fue específicamente extraído por esferas acopladas con el EEV antígeno FZD-F13L, el anticuerpo-EEV que expresa el anti-CXCR4 fue extraído específicamente por las esferas acopladas con el EEV antígeno CXCR4-F13L, y el anticuerpo-EEV que expresa el anti-SEMA fue extraído específicamente por las esferas acopladas con el EEV antígeno Sema-ECD-A56R.
Ejemplo 6: Cribado de bancos de anticuerpos
Se infectaron células BHK con una MOI = 1 cada una con un banco de anticuerpos (H-IgG-A56R) y L48 (derivado de la línea germinal VK1-39) en una cámara de cultivo celular STACK de cuatro células (Corning) (2 x 108 células por piso). El banco de anticuerpos contenía una población diversa de dominios variables de cadena pesada en formato IgG de longitud completa, fusionados dentro del marco a A56R (véase la solicitud de patente de EE. UU. n.° de publicación 2013-0288927). La diversidad de este banco era de aproximadamente 400 millones de clones independientes. Al cabo de dos días, se recogió el sobrenadante que contenía los EEV y se eliminaron los restos mediante centrifugación a baja velocidad. A continuación, el sobrenadante aclarado se centrifugó a 13000 rpm (28 000 x g) durante 1 hora para sedimentar el anticuerpo-EEV. El anticuerpo-EEV se resuspendió en 1 ml de EMEm con un FBS al 10 % y se conservó a 4 grados hasta que estuvo listo para su uso. Para preparar el virus de antígeno de la inmunoadsorción, se infectaron células BHK (2 x 108 células) con una MOI = 1,5 con virus que expresaban FZD4-ECD-A56R (SEQ ID NO: 6) en dos cámaras de cultivo celular cellSTACK (Corning). Al cabo de dos días, se recogió el sobrenadante que contenía los EEV y se eliminaron los restos mediante centrifugación a baja velocidad. A continuación, el sobrenadante aclarado se centrifugó a 13.000 rpm (28.000 x g) durante 1 hora para sedimentar el antígeno-EEV. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 1,0 mL de 1x PBS. Se transfirió 1 mL de EEV FZD4-ECD-A56R a un tubo nuevo y se añadió psoraleno ( clorhidrato de 4'-aminometiltrioxsaleno; Sigma) a 40 |jg/ml de concentración final. El EEV y el psoraleno se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de ser irradiados en un STRATAL® UV Crosslinker (Stratagene) con 99 999 microjulios. El procedimiento de psoraleno/UV garantiza la inactivación del antígeno-EEV y, por lo tanto, la imposibilidad de que forme placas o se multiplique en cualquier prueba posterior.
Las MyOne DYNABEADS® activadas con tosilo (150 jL ) se extrajeron con un imán y se lavaron con 1 mL de PBS, dos veces. Se extrajeron las esferas con el imán, se retiró el PBS y se añadió a las esferas 1 mL de FZD4-ECD-A56R inactivado con psoraleno/UV. Las esferas y el antígeno-EEV se dejaron girar a 37 °C durante 18-20 horas. Las esferas se precipitaron y se eliminó el sobrenadante. Las esferas se bloquearon con 1 mL de 1x PBS, FBS al 10 % y BSA al 0,5 % a 37 °C durante 2 horas. Las esferas se precipitaron y se lavaron con 1 mL de 1x PBS antes de resuspenderlas en 150 jL de 1x PBS.
Se añadieron 50 microlitros de esferas acopladas FZD4-ECD-A56R a 1 mL del banco de anticuerpo-EEV. Las esferas acopladas FZD4-ECD-A56R y el anticuerpo-EEV se dejaron girar a temperatura ambiente durante 2 horas. Las esferas se extrajeron con el imán y se eliminó el sobrenadante sin unir. A continuación, las esferas se lavaron cinco veces con 1 mL de medio DMEM suplementado con FBS al 10 % y HEPES 1 mM (DMEM al 10 %). Todos los lavados se reunieron con el sobrenadante sin unir ("Sin unir'). A continuación, las esferas ("Unidas") se resuspendieron en 1 mL de DMEM al 10 %. "Sin unir" y "Unidas" fueron tituladas en células BSC-1 y cubiertas con medio de crecimiento que contenía metilcelulosa. Se dejó que se formaran placas durante dos días y, a continuación, se fijaron las células y se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,1 %. El virus unido restante (990 j l) se dividió entre 5 matraces T175 que contenían células BSC1 confluentes y se dejó amplificar en DMEM al 2,5 % que contenía G418 1 mg/ml durante 3 días. A continuación, se recogieron las células, se liberó el virus mediante tres ciclos de congelación/descongelación y se tituló el virus.
Para la segunda ronda de selección (Rd2), las cadenas pesadas amplificadas de la ronda 1 fueron coinfectadas junto con L48 fresco en una cellSTACK de BHK. El anticuerpo-EEV se recolectó como se describió anteriormente. Para cada ronda de inmunoadsorción, se produjo virus de antígeno FZD-ECD-A56R fresco, se concentró, se inactivó y se acopló a esferas como se ha descrito anteriormente. Se añadieron 50 microlitros de esferas acopladas FZD4-ECD-A56R a 1 mL de anticuerpo-EEV Rd2. Las esferas acopladas FZD4-ECD-A56R y el anticuerpo-EEV se dejaron girar a temperatura ambiente durante 2 horas. Las esferas se extrajeron con el imán y se eliminó el sobrenadante sin unir. A continuación, las esferas se lavaron cinco veces con 1 mL de medio DMEM suplementado con FBS al 10 % y HEPES 1 mM (DMEM al 10 %). Todos los lavados se reunieron con el sobrenadante sin unir ("Sin unir"). A continuación, las esferas ("Unidas") se resuspendieron en 1 mL de DMEM al 10 %. "Sin unir" y "Unidas" fueron tituladas en células BSC-1 y cubiertas con medio de crecimiento que contenía metilcelulosa. Se dejó que se formaran placas durante dos días y, a continuación, se fijaron las células y se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,1 %. El virus unido restante (990ul) se dividió entre 5 matraces T175 que contenían células BSC1 confluentes y se dejó amplificar en DMEM al 2,5 % que contenía G418 1 mg/ml durante 3 días. A continuación, se recolectaron las células, se liberó el virus mediante tres ciclos de congelación/descongelación y se tituló el virus.
Se realizaron tres ciclos adicionales de inmunoadsorción (Rd3, Rd4 y Rd5) como se describió anteriormente.
Se ensayó el enriquecimiento de las rondas 3, 4 y 5 infectando células A431 en una placa de 6 pocillos con una moi = 1 con cada ronda VH amplificada y L48. Tras dejar que la infección se desarrollase durante la noche, se recogieron las células y se dividieron por la mitad. Una mitad se tiñó con FZD-His 10 ^g/ml, seguido de anti-His-Dyelight650 y anti-Fab-FlTc. La otra mitad se tiñó con CD100-His 10 ^g/ml (control negativo), seguido de anti-His-Dyelight650 y anti-Fab-FITC. Los datos mostrados en la figura 7 muestran un enriquecimiento creciente por ronda de selección. Los anticuerpos de la ronda 5 fueron subclonados en un vector de expresión de mamífero para ser expresados como IgG soluble de longitud completa y transfectados (junto con L48 en un vector de expresión de mamíferos). Los anticuerpos resultantes presentes en el sobrenadante se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la unión a células CHO transfectadas con FZD4 y la ausencia de unión a células CHO transfectadas con CXCR4. Se identificaron varios anticuerpos que se unían específicamente a la FZD.
Ejemplo 7: El EEV de marcador/antígeno doble puede acoplarse a esferas magnéticas
Se infectaron células BHK con dos viriones por célula, uno de los cuales era el marcador de hemaglutinina (HA)-A56R (SEQ ID NO: 14) y el segundo era FZD4-F13L (SEQ ID NO: 2) para producir EEV que expresen tanto el marcador HA como el antígeno FZD4 en su superficie o se infectaron con un virión por célula con cada virus individual. Al cabo de dos días, se recogió el sobrenadante que contenía los EEV y se eliminaron los restos mediante centrifugación a baja velocidad. Las esferas magnéticas de proteína G (150 ^l) se extrajeron con un imán y se añadió a las esferas 1 mL de PBS 30 ^g de anticuerpo anti-FZD4 purificado (C6073). La solución se incubó a temperatura ambiente con una rotación suave durante 25 minutos para permitir que el anticuerpo se acoplara a las esferas de proteína G. Las esferas se extrajeron con el imán, se lavaron una vez con 1 mL de PBS y se resuspendieron en 300 ^L de DMEM FBS al 10 %. Las esferas magnéticas anti-HA-tag (ThermoFisher, 150 ^l) se extrajeron con un imán y se lavaron una vez con 1 mL de PBS antes de resuspender en 150 ^l de PBS.
HA-A56R (SEQ ID NO: 14)
MGWSCIILFL VA TA TGAHSYPYD VPD YA TSTTNDTDKVDYEEYS
TELIVNTDSESTIDIILSGSTHSPETSSKKPDYIDNSNCSSVFEIATP
EPITDNVEDHTDTVTYTSDSINTVSASSGESTTDETPEPITDKED
HTVTD TVSY TTVS TSSGIVTTKS TTDDADL YD TYNDND TVPPTTV
GGSTTSISNYKTKDFVEIFGITALIILSAVAIFCITYYIYNKRSRKYK
TENKV
Subrayado simple - Secuencia señal (aminoácidos 1-19)
Negrita - Marcador de HA (aminoácidos 20-29)
Cursiva - A56R truncada (aminoácidos 30-235)
Se añadieron 50 ^l de esferas anti-marcador de HA preparadas o 100 ^l de proteína G anti-FZD4 preparada a 1 mL de cada sobrenadante de EEV y se dejaron girar a temperatura ambiente durante 60 minutos. Las esferas se extrajeron con el imán y se eliminó el sobrenadante sin unir. A continuación, las esferas se lavaron cinco veces con 1 mL de medio DMe M suplementado con FBS al 10 % y HEPES 1 mM (DMEM al 10 %). Todos los lavados se reunieron con el sobrenadante sin unir ("Sin unir"). A continuación, las esferas ("Unidas") se resuspendieron en 1 mL de DMEM al 10 %. "Sin unir" y "Unidas" fueron tituladas en células BSC-1 y cubiertas con medio de crecimiento que contenía metilcelulosa. Se dejó que se formaran placas durante dos días y, a continuación, se fijaron las células y se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,1 %. Se contaron las placas para determinar el número de unidades formadoras de placas (ufp) en "Sin unir" y "Unidas", a partir de las cuales se pudo calcular el porcentaje de EEV unido a las esferas. Los resultados se muestran en la figura 8. Los EEV que expresaban ambas proteínas de fusión fueron extraídos por cualquiera de los dos anticuerpos.
Ejemplo 8: El EEV de marcador/antígeno doble puede acoplarse a esferas magnéticas y utilizarse para capturar EEV mAb
Se infectaron células BHK (2 x 108 células) con dos viriones por célula, uno de los cuales era HA-A56R (SEQ ID NO: 14) y el segundo era CXCR4-F13L (SEQ ID NO: 3) para producir EEV que expresen tanto el marcador HA como el antígeno CXCR4 en su superficie. Al cabo de dos días, se recogió el sobrenadante que contenía los EEV y se eliminaron los restos mediante centrifugación a baja velocidad. A continuación, el sobrenadante aclarado se centrifugó a 13000 rpm (28000 x g) durante 1 hora para sedimentar el EEV de marcador/antígeno. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 1 mL de 1* PBS. Se añadió psoraleno (clorhidrato de 4'-aminometiltrioxsaleno; Sigma) hasta alcanzar una concentración final de 40 ug/ml. El e Ev y el psoraleno se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de ser irradiados en un Stratalinker UV Crosslinker (Stratagene) con 99999 microjulios dos veces. El procedimiento de psoraleno/UV garantiza la inactivación del antígeno-EEV y, por lo tanto, la imposibilidad de que forme placas o se multiplique en cualquier prueba posterior.
El EEV anti-CXCR4 y el EEV mAb anti-HER2 se produjeron infectando células BHK a dos viriones por célula, en los que un virión era específico de cadena pesada y el segundo era específico de cadena ligera. Al cabo de dos días, se recogieron los sobrenadantes que contenían el EEV anti-CXCR4 y el EEV anti-HER2 y se eliminaron los restos mediante centrifugación a baja velocidad.
Se lavaron 300 microlitros de esferas magnéticas anti-HA con 1 mL de PBS y luego se resuspendieron en un mililitro del EEV HA/CXCR4 inactivado con psoraleno/UV. Las esferas y el EEV se incubaron a temperatura ambiente con una rotación suave durante 90 minutos para permitir que el EEV se acoplara a las esferas anti-HA. Las esferas se extrajeron con el imán, se lavaron una vez con 1 mL de PBS y se resuspendieron en 300 pL de PBS.
Se añadieron 100 pL de EEV HA/CXCR4 acoplado a las esferas anti-HA a 1 mL de cada sobrenadante de EEV mAb y se incubaron a temperatura ambiente con rotación suave durante 1-1,5 horas. Las esferas se extrajeron con el imán y se eliminó el sobrenadante sin unir. A continuación, las esferas se lavaron cinco veces con 1 mL de medio DMEM suplementado con FBS al 10 % y HEPES 1 mM (DMEM al 10 %). Todos los lavados se reunieron con el sobrenadante sin unir ("Sin unir"). A continuación, las esferas ("Unidas") se resuspendieron en 1 mL de DMEM al 10 %. "Sin unir" y "Unidas" fueron tituladas en células BSC-1 y cubiertas con medio de crecimiento que contenía metilcelulosa. Se dejó que se formaran placas durante dos días y, a continuación, se fijaron las células y se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,1 %. Se contaron las placas para determinar el número de unidades formadoras de placas (ufp) en "Sin unir" y "Unidas", a partir de las cuales se pudo calcular el porcentaje de EEV unido a las esferas. Los resultados se muestran en la figura 8. Los EEV anti-CXCR4 fueron capturados específicamente por las esferas recubiertas con EEV que coexpresaban HA-A45R y CXCR4-F13L.
Ejemplo 9: El antígeno-EEV puede biotinilarse para su acoplamiento a esferas magnéticas
Se infectaron células BHK con una MOI = 1 con virus que expresaban FZD4-F13L, FZD4-ECD-A56R o CD20-F13L. Al cabo de dos días, se recogió el sobrenadante que contenía los EEV y se eliminaron los restos mediante centrifugación a baja velocidad. A continuación, el sobrenadante aclarado se centrifugó a 13000 rpm durante 1 hora para sedimentar el antígeno-EEV. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento en 1-2 mL de 1* PBS. Para biotinilar el EEV, se añadieron 2,5 pl de solución madre de Biotin-Xx SSE en 1* PBS (kit de biotinilación de la superficie celular FLUOREPORTER®, Molecular Probes) a 1 mL de cada EEV en PBS y se incubaron en hielo durante 30 minutos. Se añadieron 50 pl de Tris 1 M, pH 8, para inactivar cada reacción.
Para acoplar el biotina-EEV a las esferas, se sedimentaron 150 pL de DYNABEADS® con estreptavidina y se lavaron una vez con 1 mL de 1* PBS. Las esferas se resuspendieron en 150 pl y se añadieron 50 pl a 1 mL de medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) que contenía FBS al 10 % y HEPES 1 mM (EMEM al 10 %). Se añadieron 50 pl de biotina-EEV a las esferas y al medio y se dejaron girar a temperatura ambiente durante 1 hora. Las esferas se extrajeron con el imán y se eliminó el sobrenadante sin unir. A continuación, las esferas se lavaron cinco veces con 1 mL de medio DMEM suplementado con FBS al 10 % y HEPES 1 mM (DMEM al 10 %). Todos los lavados se reunieron con el sobrenadante sin unir ("Sin unir"). A continuación, las esferas ("Unidas") se resuspendieron en 1 mL de DMEM al 10 %. "Sin unir" y "Unidas" fueron tituladas en células BSC-1 y cubiertas con medio de crecimiento que contenía metilcelulosa. Se dejó que se formaran placas durante dos días y, a continuación, se fijaron las células y se tiñeron con una solución de violeta cristal al 0,1 %. Se contaron las placas para determinar el número de unidades formadoras de placas (ufp) en "Sin unir" y "Unidas", a partir de las cuales se pudo calcular el porcentaje de EEV unido a las esferas. Los resultados se muestran en la figura 10.
El antígeno-EEV pudo ser biotinilado y acoplado a esferas magnéticas de estreptavidina.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. - Un polinucleótido aislado que comprende:
(a) un primer fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína integral de membrana (IMP), o uno de sus fragmentos, en el que la IMP, o uno de sus fragmentos, comprende al menos una región extramembrana, al menos un dominio transmembrana y al menos una región intramembrana, y en el que una porción del primer fragmento de ácido nucleico que codifica al menos una región intramembrana está situada en el extremo 5' o 3' del primer fragmento de ácido nucleico; y
(b) un segundo fragmento de ácido nucleico que codifica una proteína F13L del virus vaccinia, o uno de sus fragmentos funcionales, en el que el segundo fragmento de ácido nucleico está fusionado dentro del marco con una porción del primer fragmento de ácido nucleico que codifica una región intramembrana de la IMP; en el que una célula infectada por el virus vaccinia que comprende el polinucleótido puede expresar una proteína de fusión IMP-F13L como parte de la membrana de la envoltura externa de un virión con envoltura extracelular (EEV).
2. - El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que la IMP es una proteína de membrana de paso múltiple que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete dominios transmembrana.
3. - El polinucleótido de la reivindicación 2, en el que la IMP tiene un número impar de dominios transmembrana, en el que el extremo 5' del primer fragmento de ácido nucleico codifica una región extramembrana, en el que el extremo 3' del primer fragmento de ácido nucleico codifica una región intramembrana, y en el que el extremo 5' del segundo polinucleótido está fusionado con el extremo 3' del primer fragmento de ácido nucleico.
4. - El polinucleótido de la reivindicación 3, en el que la IMP comprende:
(a) un receptor acoplado a proteína G ("G-protein coupled receptor", GPCR);
(b) la proteína humana frizzled-4 (FZD4), o uno de sus fragmentos;
(c) un receptor de quimiocinas CXC; o
(d) el receptor de quimiocinas CXC CXCR4, o uno de sus fragmentos.
5. - El polinucleótido de la reivindicación 2, en el que la IMP tiene un número par de dominios transmembrana, y en el que tanto el extremo 5' como el extremo 3' del primer fragmento de ácido nucleico codifican regiones intramembrana, y en el que el segundo fragmento de ácido nucleico está fusionado con el extremo 3' del primer fragmento de ácido nucleico.
6. - El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que la IMP es la proteína CD20 humana, o uno de sus fragmentos.
7. - El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que está operativamente asociado con un promotor de poxvirus.
8. - La proteína de fusión F13L codificada por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. - Un genoma de poxvirus que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. - El genoma de poxvirus de la reivindicación 9, que es un genoma de virus vaccinia.
11. - Un método para producir un EEV de virus vaccinia recombinante, que comprende:
(a) infectar una célula hospedadora que puede ser infectada por el virus vaccinia con un virus vaccinia que comprende el genoma del virus vaccinia de la reivindicación 10, y
(b) recuperar los EEV liberados de la célula hospedadora.
12. - Un método para presentar una proteína integral de membrana (IMP), o uno de sus fragmentos, en una conformación nativa que comprende:
(a) infectar células hospedadoras que pueden ser infectadas por poxvirus con un virus vaccinia recombinante que expresa la IMP, o uno de sus fragmentos, como proteína de fusión con la proteína F13L del virus vaccinia, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo la IMP una proteína de membrana de paso múltiple que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete dominios transmembrana, y en el que los EEV producidos por la célula hospedadora infectada comprenden la proteína de fusión IMP-F13L como parte de la membrana de la envoltura externa del EEV;
(b) recuperar los EEV liberados de la célula hospedadora;
en el que la IMP, o uno de sus fragmentos, se presenta en la superficie del EEV en una conformación nativa.
13. - El método de la reivindicación 12,
(a) en el que la IMP comprende un receptor acoplado a proteína G (GPCR) que comprende siete dominios transmembrana seleccionados del grupo que consiste en:
(i) la proteína humana frizzled-4 (FZD4), o uno de sus fragmentos;
(ii) un receptor de quimiocinas CXC; o
(iii) el receptor de quimiocinas CXC CXCR4, o uno de sus fragmentos;
en la que F13L está fusionado con el C-terminal de la IMP; o
(b) en el que la IMP es la CD20 humana, o uno de sus fragmentos.
14. - La proteína de fusión F13L de la reivindicación 8, que comprende:
(a) los aminoácidos 20 a 892 de SEQ ID NO: 2;
(b) SEQ ID NO: 3; o
(c) SEQ ID NO: 4;
en la que la proteína de fusión, cuando es expresada por un poxvirus recombinante, aparece en la superficie de un virión con envoltura extracelular (EEV) de poxvirus en una conformación nativa.
15. - Un EEV de poxvirus recombinante que comprende una proteína de fusión IMP-F13L codificada por el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la IMP es una proteína de membrana heteróloga de paso múltiple que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis o al menos siete dominios transmembrana, y en el que la proteína de fusión está situada en la membrana de la envoltura externa del EEV, y en el que la IMP, o uno de sus fragmentos, se presenta en la superficie del EEV en su conformación nativa.
16. - El EEV de poxvirus recombinante de la reivindicación 15, en el que el EEV de poxvirus recombinante es un EEV de virus vaccinia recombinante.
17. - Un método para seleccionar anticuerpos que se unen a una proteína de membrana de paso múltiple que comprende:
(a) fijar el EEV recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16 a un soporte sólido;
(b) proporcionar un banco de presentación de anticuerpos, en el que el banco comprende paquetes de presentación que muestran una pluralidad de dominios de unión al antígeno;
(c) poner en contacto el banco de presentación con el EEV de modo que los paquetes de presentación que presentan dominios de unión al antígeno que se unen específicamente a la IMP expresada en el EEV puedan unirse a ella;
(d) retirar los paquetes de presentación que no se han unido; y
(e) recuperar los paquetes de presentación que presentan un dominio de unión al antígeno específico para la IMP expresada sobre el EEV.
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