KR20180135483A - 폭스바이러스 세포외 피막형 비리온 상에서의 내재막 단백질 디스플레이 - Google Patents

폭스바이러스 세포외 피막형 비리온 상에서의 내재막 단백질 디스플레이 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 관심있는 표적 내재막 단백질(IMP: integral membrane protein)에 결합하는 항체 또는 항체 유사 분자의 스크리닝, 선별 및 동정에 사용하기 위한, 본래의 입체구조로 단리된 IMP 또는 이의 단편을 발현 및 디스플레이하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

폭스바이러스 세포외 피막형 비리온 상에서의 내재막 단백질 디스플레이
특이성이 정의된 항체는 점점 많은 다양한 치료적 용도에 사용되고 있다. 인간 치료용으로 유용한 항체를 얻기 위해 다수의 방법이 사용되어 왔다. 여기에는 라이브러리, 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리나 형질전환 동물로부터 선별된 키메라 및 인간화 항체, 및 완전 인간 항체가 포함된다. 박테리오파지에서 제작된 면역글로불린 라이브러리는 미접촉(na
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ve) 또는 특이적으로 면역된 개체의 항체 생산 세포에서 유래할 수 있으며, 원칙적으로 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 신규의 다양한 쌍을 포함할 수 있다. 이 전략은 본질적인 레퍼토리의 한계로 지장을 받지는 않지만, 발현된 면역글로불린 단편의 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)들은 박테리아 세포에서 합성되고 적절하게 접혀야(folded) 한다. 그러나 많은 항원 결합 영역은 박테리아 세포에서 융합 단백질로서 정확하게 조립되기가 쉽지 않다. 게다가, 단백질은 정상적인 진핵생물의 번역 후 변형을 거치지 못할 것이다. 결과적으로, 이 방법은 얻을 수 있는 항체 특이성에 대해 상이한 선택 필터를 부과한다. 별법으로는, 완전 인간 항체는 진핵생물 계에서의 라이브러리, 예를 들어 효모 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 또는 폭스바이러스(poxvirus)와 같은 DNA 바이러스 내 발현으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 그 전문으로 참고로 포함된 미국 특허 제7,858,559호, 및 미국 특허 출원 공개 제2013-028892호를 참조한다.
치료 항체의 많은 중요한 표적은 입체구조적으로 손상되지 않은 상태로 발현 및 정제하기 어려운 내재막 단백질(IMP: integral membrane protein), 예를 들어 다중 통과 막 단백질(GPCR, 이온 채널 등)이다. 단리된 상태에서 적절하게 접힌 표적 단백질이 없으면 이 표적에 대한 항체의 동정과 선택이 어려워진다. 특정 IMP는 포유동물 세포와 같은 세포 표면 상에서 발현될 수 있지만, 전체 세포는 복잡한 항원 혼합물이기 때문에 표적 발현이 낮을 수 있고, 항체 라이브러리(예를 들어, 백시니아(vaccinia) 바이러스 항체 라이브러리)를 제작하는 데 사용되는 특정 디스플레이 패키지가 전체 세포에 비특이적으로 결합할 수 있기 때문에 전체 세포를 항체 발견에 사용하기에는 문제가 많다. 디스플레이 라이브러리로부터 치료 항체 및 항체 유사 분자의 동정 및 선택을 허용하는 충분한 농도와 다른 세포 단백질과의 최소한의 경쟁으로 본래의 입체구조(native conformation)로 관심있는 표적 IMP를 발현하고 디스플레이하는 새로운 방법이 여전히 요구된다.
본 발명은 관심있는 표적 IMP에 결합하는 항체 또는 항체 유사 분자의 스크리닝, 선별, 및 동정에 사용하기 위한 본래의 입체구조로 단리된 내재막 단백질(IMP) 또는 이의 단편을 발현 및 디스플레이하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다: 하나 이상의 막외(extra-membrane) 영역, 하나 이상의 막관통(transmembrane) 도메인 및 하나의 이상의 막내(intra-membrane) 영역을 포함하는 내재막 단백질(IMP) 또는 이의 단편을 코딩하는 제1 핵산 단편으로서, 하나 이상의 막내 영역을 코딩하는 제1 핵산 단편의 부분이 제1 핵산 단편의 5' 또는 3' 말단에 위치하는 것인 제1 핵산 단편; 및 백시니아 바이러스 F13L 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하며, IMP의 막내 영역을 코딩하는 제1 핵산 단편의 부분에 인프레임으로 융합된 제2 핵산 단편. 이들 실시양태에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폭스바이러스 감염 세포는 IMP-F13L 융합 단백질을 세포외 피막형 비리온(EEV: extracellular enveloped virion)의 외피(outer envelope) 막의 일부로서 발현할 수 있다. 특정 측면에서, F13L 단백질 또는 이의 기능적 단편은 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, IMP는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상의 막관통 도메인을 포함하는 다중 통과 막 단백질이다. 특정 측면에서, IMP는 표 1에 열거된 다중 통과 막 단백질이다.
특정 측면에서, 다중 통과 IMP는 홀수개의 막관통 도메인을 가질 수 있으며, 제1 핵산 단편의 5' 말단은 막외 영역을 코딩할 수 있고, 제1 핵산 단편의 3' 말단은 제2 핵산 단편의 5' 말단에 융합된 막내 영역을 코딩할 수 있다. 특정 측면에서, 이러한 유형의 제1 핵산 단편은 예를 들어 G 단백질 연결 수용체(GPCR: G-protein coupled receptor)를 코딩할 수 있다. 특정 측면에서, GPCR은 인간 프리즐드(frizzled)-4 단백질(FZD4), 또는 이의 단편일 수 있으며, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 2의 아미노산 20 내지 892를 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 특정 측면에서, 폴리펩티드는 신호 펩티드, 예를 들어 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 19를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, GPCR은 CXC 케모카인 수용체, 예를 들어, CXCR4, 또는 이의 단편일 수 있고, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
특정 측면에서, 다중 통과 IMP는 짝수개의 막관통 도메인을 가질 수 있으며, 제1 핵산 단편의 5' 및 3' 말단은 둘 다 막내 영역을 코딩할 수 있다. 특정 측면에서, 제2 핵산 단편은 제1 핵산 단편의 3' 말단에 융합될 수 있다. 특정 측면에서, IMP는 예를 들어, 인간 CD20 단백질, 또는 이의 단편일 수 있으며, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드의 제1 핵산 단편과 제2 핵산 단편은 직접 융합될 수 있다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 이종 펩티드, 예를 들어 링커 서열, 아미노산 태그 또는 표지, 또는 정제를 용이하게 하는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열, 예컨대 히스티딘 태그를 코딩하는 제3 핵산 단편을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 폭스바이러스 프로모터, 예를 들어 p7.5, T7, 또는 H5 프로모터와 작동 가능하게 결합될 수 있다.
또한, 본 발명은 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 F13L 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폭스바이러스 게놈, 예를 들어 백시니아 바이러스 게놈을 제공한다. 또한, 본 발명은 본원에서 제공되는 폭스바이러스 게놈을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스 EEV를 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에서 제공되는 재조합 백시니아 바이러스 EEV의 제조 방법으로서, 본원에서 제공되는 폭스바이러스 게놈을 포함하는 백시니아 바이러스로 백시니아 바이러스 감염성을 허용하는 숙주 세포를 감염시키는 단계, 및 숙주 세포로부터 방출된 EEV를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본래의 입체구조로 내재막 단백질(IMP) 또는 이의 단편을 디스플레이하는 방법으로서, IMP 또는 이의 단편을 폭스바이러스 EEV 특이적 단백질 또는 이의 막 관련 단편과의 융합 단백질로서 발현하는 재조합 폭스바이러스로 폭스바이러스 감염성을 허용하는 숙주 세포를 감염시키는 단계로서, 감염된 숙주 세포에 의해 생성된 EEV가 IMP 융합 단백질을 EEV 외피 막의 일부로서 포함하는 것인 단계, 및 숙주 세포로부터 방출된 EEV를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, IMP 또는 이의 단편은 EEV의 표면 상에 본래의 입체구조로 디스플레이된다. 특정 측면에서, EEV 특이적 단백질은 백시니아 바이러스 A33R 단백질, A34R 단백질, A56R 단백질, B5R 단백질, A36R 단백질, F13L 단백질, 이들의 임의의 막 관련 단편, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
특정 측면에서, EEV 특이적 단백질은 F13L(서열 번호 1) 또는 이의 기능적 단편이다. 특정 측면에서, IMP는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상의 막관통 도메인을 포함하는 다중 통과 막 단백질이다. 특정 측면에서, IMP는 7개의 막관통 도메인을 포함하는 G 단백질 연결 수용체(GPCR), 예를 들어 상기에 기재된 인간 FZD4 또는 CXCR4일 수 있고, F13L 단백질은 IMP의 C-말단에 융합될 수 있다. 특정 측면에서, IMP 또는 이의 단편은 상기 기재된 인간 CD20과 같이 짝수개의 막관통 도메인을 가질 수 있으며, 여기서, IMP 또는 이의 단편의 N-말단 및 C-말단이 둘 다 막 내에 있으며, F13L은 IMP의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
특정 측면에서, 막 관련 EEV 특이적 단백질 단편은 백시니아 바이러스 A56R 단백질, 예를 들어 서열 번호 5의 아미노산 108 내지 314의 줄기(stalk), 막관통, 및 막내 도메인을 포함할 수 있거나, 이들로 이루어질 수 있다. 특정 측면에서, A56R 융합 단백질의 IMP 부분은 인간 FZD4의 세포외 도메인을 포함할 수 있으며, 예를 들어 융합 단백질은 서열 번호 6의 아미노산 20 내지 370, 인간 ErbB2(Her2)의 세포외 도메인을 포함할 수 있으며, 예를 들어 융합 단백질은 서열 번호 7의 아미노산 20 내지 855, 또는 인간 CD100(세마포린 4D)의 세포외 도메인을 포함할 수 있으며, 예를 들어 융합 단백질은 서열 번호 8의 아미노산 20 내지 935를 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 막 관련 EEV 특이적 단백질 단편은 백시니아 바이러스 B5R 단백질의 막관통 및 막내 도메인, 또는 줄기, 막관통, 및 막내 도메인, 예를 들어 각각 서열 번호 9의 아미노산 276 내지 317 또는 서열 번호 9의 아미노산 238 내지 317을 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 특정 측면에서, B5R 융합 단백질의 IMP 부분은 인간 FZD4의 세포외 도메인을 포함할 수 있으며, 예를 들어 융합 단백질은 서열 번호 10의 아미노산 20 내지 243 또는 서열 번호 11의 아미노산 20 내지 281을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열 번호 2의 아미노산 20 내지 892; 서열 번호 3; 서열 번호 4; 서열 번호 6의 아미노산 20 내지 370; 서열 번호 7의 아미노산 20 내지 855; 서열 번호 8의 아미노산 20 내지 935; 서열 번호 10의 아미노산 20 내지 243; 서열 번호 11의 아미노산 20 내지 281, 서열 번호 13의 아미노산 20 내지 506 또는 서열 번호 14의 아미노산 20 내지 235를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 제공되는 융합 단백질은 재조합 폭스바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스에 의해 발현될 때, 폭스바이러스 세포외 피막형 비리온(EEV) 표면 상에 본래의 입체구조로 나타날 수 있다. 또한, 융합 단백질을 포함하는 재조합 폭스바이러스 EEV를 제공한다. 또한, 본 발명은 폭스바이러스 EEV 특이적 단백질 또는 이의 막 관련 단편에 융합된 이종 IMP 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 폭스바이러스 EEV로서, 상기 융합 단백질은 EEV 외피 막에 위치하고, IMP 또는 이의 단편은 EEV의 표면 상에 그의 본래의 입체구조로 디스플레이되는 것인 재조합 폭스바이러스 EEV를 제공한다. 특정 측면에서, 재조합 폭스바이러스 EEV는 백시니아 바이러스 EEV이다.
또한, 본 발명은 다중 통과 막 단백질에 결합하는 항체를 선별하는 방법으로서, 본원에서 제공되는 재조합 EEV를 고체 지지체에 부착시키는 단계; 복수의 항원 결합 도메인을 디스플레이하는 디스플레이 패키지를 포함하는 항체 디스플레이 라이브러리를 제공하는 단계; EEV 상에 발현된 IMP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 디스플레이하는 디스플레이 패키지가 EEV에 결합할 수 있도록 디스플레이 라이브러리를 EEV와 접촉시키는 단계; 결합되지 않은 디스플레이 패키지를 제거하는 단계; 및 EEV 상에 발현된 IMP에 특이적인 항원 결합 도메인을 디스플레이하는 디스플레이 패키지를 회수하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 방법의 특정 측면에서, 재조합 EEV를, 예를 들어, UV 조사 하에 소랄렌(트리옥살렌, 4'-아미노메틸-, 히드로클로라이드)과의 인큐베이션에 의해, 고체 지지체에 부착시키기 전에 불활성화시킨다. 상기 방법의 특정 측면에서, 재조합 EEV는 표면에 부착된 토실기와의 반응을 통해 고체 표면에 부착된다. 특정 측면에서, 고체 표면은 토실에 의해 활성화 자성 비드일 수 있다. 상기 방법의 특정 측면에서, 재조합 EEV는 바이오티닐화되고, 스트렙타비딘 코팅된 고체 표면, 예를 들어 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드에 부착된다.
도 1A-C는 백시니아 바이러스 세포외 피막형 비리온(EEV) 특이적 단백질 또는 이의 단편에 융합된 내재막 단백질(IMP) 또는 이의 단편을 다이어그램으로 나타낸다. 평행한 수평선은 EEV 외부 막의 다이어그램이다. 도 1A는 막관통 도메인 및 막내 도메인을 포함하는 백시니아 A56R 단백질의 단편에 융합된 IMP의 세포외 도메인(ECD: extracellular domain)을 도시한다. 도 1B는 백시니아 바이러스 EEV 특이적 F13L 단백질에 융합된 전형적인 G 단백질 연결 수용체의 토폴로지를 도시한다. F13L은 팔미토일화를 통해 EEV 외부 막의 내측과 결합된다. 도 1C는 F13L에 융합된 짝수개의 막관통 도메인을 갖는 IMP(예를 들어, CD20)의 토폴로지를 도시한다.
도 2는 CD20-F13L 및 CD20 ECD-A56R 융합 단백질이 백시니아 바이러스 EEV 입자로 편입되었음을 입증한다.
도 3A는 비태깅된 CD20에 비해 CD20-F13L 융합 단백질이 백시니아 바이러스 EEV 입자 내로 우선적으로 편입되었음을 입증한다.
도 3B는 비태깅된(비융합된) FZD4에 비해 FZD4-F13L 융합 단백질이 백시니아 바이러스 EEV 입자 내로 우선적으로 편입되었음을 입증한다.
도 4는 추가의 IMP-EEV 단백질 융합체이 백시니아 바이러스 EEV로 편입되었음을 나타낸다. "CD20"은 CD20-F13L 융합 단백질이고, "CXCR4"는 CXCR4-F13L 융합 단백질이고, "Her2"는 Her2 ECD-A56R 융합 단백질이고, "CD100"은 CD100 ECD-A56R 융합 단백질이다.
도 5는 백시니아 바이러스 EEV 상에 발현된 관심있는 IMP에 결합하는 디스플레이 패키지를 위한 항체 디스플레이 라이브러리의 스크리닝 분석법의 개요를 나타낸다.
도 6A는 항-HER-2 항체를 발현하는 백시니아 바이러스 EEV의 토실기 의해 자성 비드에 결합된, 백시니아 바이러스 A56R 단백질과의 융합체로서 HER2 ECD를 발현하는 백시니아 바이러스 EEV와의 결합을 나타낸다.
도 6B는 항-FZD 항체를 발현하는 백시니아 바이러스 EEV의 토실기에 의해 자성 비드에 결합된, 백시니아 바이러스 F13L 단백질과의 융합체로서 FZD4를 발현하는 백시니아 바이러스 EEV와의 결합을 나타낸다.
도 6C는 항-CXCR4 항체를 발현하는 백시니아 바이러스 EEV의 토실기에 의해 자성 비드에 결합된, 백시니아 바이러스 F13L 단백질과의 융합체로서 CXCR4를 발현하는 백시니아 바이러스 EEV와의 결합을 나타낸다.
도 6D는 항-CD100 항체("세마(sema)")를 발현하는 백시니아 바이러스 EEV의 토실기에 의해 자성 비드에 결합된, 백시니아 바이러스 A56R 단백질과의 융합체로서 CD100 ECD를 발현하는 백시니아 바이러스 EEV와의 결합을 나타낸다.
도 7은 3(Rd3), 4(Rd4), 및 5(Rd5) 라운드의 패닝(panning) 후에 토실기에 의해 자성 비드에 결합된 불활성화된 FZD-ECD-A45R-발현 EEV 상에서 패닝 후 항 FZD4 항체의 증식을 나타내는 FACS 스캔이다. 맨 윗줄은 항체를 발현하는 바이러스 감염된 세포를 10 ㎍/ml FZD-His, 이어서 항-His-다이라이트(DyeLight)650 및 항-Fab-FITC로 염색하여 나타낸다. 아래 줄은 항체를 발현하는 바이러스 감염된 세포를 10 ㎍/ml CD100-His(음성 대조군), 이어서 항-His-다이라이트650 및 항-Fab-FITC로 염색하여 나타낸다.
도 8은 두 개의 상이한 단백질 융합체(HA-A56R 융합체 및 FZD4-F13L 융합체)가 백시니아 바이러스 EEV로 편입됨을 나타낸다. HA-A56R 융합체 단독, FZD4-F13L 융합체 단독, 또는 융합 단백질 둘 다를 발현하는 EEV를 항-FZD4-코팅된 비드 또는 항-HA 코팅된 비드와의 결합에 대해 시험하였다.
도 9는 HA-A56R 융합체 및 CXCR4-F13L 융합체를 둘 다 발현하는 EEV로 코팅된 자성 비드에 의해 항-CXCR4-발현 EEV를 특이적으로 회수한 것을 나타낸다. 항원-EEV는 항-HA 코팅된 비드에 결합시켰다.
도 10은 지정된 융합 단백질을 발현하는 바이오티닐화된 백시니아 바이러스 EEV의 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드와의 결합을 나타낸다.
본 발명은 폭스바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스의 세포외 피막형 비리온 입자(EEV)의 표면 상에 입체구조가 손상되지 않은 또는 본래 상태의 내재막 단백질(IMP), 예를 들어 다중 통과(IMP) 단백질을 EEV 특이적 막 관련 단백질, 예를 들어, F13L과의 융합체로서 발현 및 디스플레이하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
정의
용어 "하나의"("a" 또는 "an") 실체는 하나 이상의 그 실체를 지칭한다; 예를 들어, "결합 분자"는 하나 이상의 결합 분자를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 호환적으로 사용될 수 있다.
또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 두 개의 특정된 특징 또는 구성 요소 각각을 나머지가 있거나 없이 구체적으로 개시하는 것으로 간주한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 표현에 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 표현에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음의 각 실시양태를 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 및 과학 용어는 본 발명과 관련된 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 발명에 사용되는 많은 용어에 대한 일반적인 사전을 숙련된 기술자에게 제공한다.
단위, 접두사, 및 기호는 SI(Syst
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me International de Unites) 허용 형식으로 나타낸다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 방향으로 좌측에서 우측으로 기술된다. 본원에 제공된 표제는 본 명세서를 전체로서 참조하여 보여줄 수 있는 본 발명의 다양한 측면 또는 측면들을 제한하는 것이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 명세서 전체를 참조함으로써 더욱 완전하게 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 "자연 발생적이지 않은" 물질, 조성물, 실체, 및/또는 물질, 조성물 또는 실체의 임의의 조합, 또는 이들의 임의의 문법적 변형은 "자연 발생적"인 것으로 당업자에 의해 잘 이해되거나, 판사나 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연 발생적"이라고 결정 또는 해석되거나, 언제든지 그렇게 될 수 있는 물질, 조성물, 실체, 및/또는 물질, 조성물 또는 실체의 임의의 조합의 형태를 배제할 때에만 이들을 명시적으로 이들을 배제하는 조건적인 용어이다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드"는 단수의 "폴리펩티드"뿐 아니라 복수의 "폴리펩티드"를 포함하는 것으로 의도되며, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 알려짐)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 지칭하며, 생성물의 특정 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬을 나타내는데 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에 또는 임의의 이들 용어와 호환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 및 공지된 보호/차단 기, 단백질 분해성 절단 또는 자연 발생적이지 않은 아미노산에 의한 변형에 의한 유도체화를 제한 없이 포함하는 폴리펩티드의 발현 후 변형의 산물을 지칭하고자 한다. 폴리펩티드는 생물학적 공급원으로부터 유래하거나 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 이는 화학 합성을 포함한 임의의 방법으로 생성될 수 있다.
본원에 개시된 폴리펩티드는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상, 또는 2,000개 이상의 아미노산 크기일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원 구조를 가질 수 있지만, 반드시 그런 구조를 갖는 것은 아니다. 정의된 3차원 구조를 갖는 폴리펩티드는 접혔다고 지칭되며, 정의된 3차원 구조를 갖지 않지만, 오히려 다수의 상이한 형태를 채택할 수 있는 폴리펩티드는 접히지 않았다(unfolded)고 지칭된다. 본원에서 사용되는 용어 당단백질은 아미노산의 산소 함유 또는 질소 함유 측쇄, 예를 들어, 세린 또는 아스파라긴을 통해 단백질에 부착되는 하나 이상의 탄수화물 잔기에 결합된 단백질을 지칭한다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체는 자연환경에서 존재하지 않는 폴리펩티드를 의미한다. 특정 수준의 정제가 요구되지 않는다. 예를 들어, 단리된 폴리펩티드는 천연 또는 자연 환경으로부터 제거될 수 있다. 숙주 세포에서 재조합으로 생산된 폴리펩티드 및 발현된 단백질은 임의의 적합한 기술에 의해 분리, 분별, 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드일 때, 본원에 개시된 바와 같이 단리된 것으로 간주한다.
본원에서 사용되는 용어 "자연 발생적이지 않은" 폴리펩티드, 또는 이의 임의의 문법적 변형은 "자연 발생적"인 것으로 당업자에 의해 잘 이해되거나, 판사나 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연 발생적"이라고 결정 또는 해석되거나, 언제든지 그렇게 될 수 있는 폴리펩티드의 형태를 배제할 때에만 이들을 명시적으로 배제하는 조건적인 용어이다.
본원에 개시된 다른 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 단편, 유도체, 유사체, 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합이다. 본원에 개시된 용어 "단편", "변이체", "유도체" 및 "유사체"는 상응하는 천연 항체 또는 폴리펩티드의 특성 중 적어도 일부를 보유하는, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 단편은 예를 들어 본원의 다른 곳에서 논의되는 특정 항체 단편 이외에 결실 단편뿐만 아니라 단백질 분해 단편을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 변이체는 상기에 기재된 단편, 그리고 또한 치환, 결실, 또는 삽입으로 인하여 변형된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 측면에서, 변이체는 자연 발생적이지 않을 수 있다. 자연 발생적이지 않은 변이체는 당 업계에 알려진 돌연변이 유발 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존 적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 유도체는 원래의 폴리펩티드에서 발견되지 않는 추가의 특징을 나타내기 위해서 변형된 폴리펩티드이다. 예로는 융합 단백질이 포함된다. 변이체 폴리펩티드는 또한 본원에서 "폴리펩티드 유사체"로 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 "유도체"는 기능적 측기(side group)의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 아미노산을 갖는 대상 폴리펩티드를 지칭할 수도 있다. 또한, 20가지 표준 아미노산의 하나 이상의 유도체를 포함하는 펩티드가 "유도체"로서 포함된다. 예를 들어, 4-히드록시프롤린은 프롤린에 치환될 수 있다. 5-히드록시리신은 리신에 치환될 수 있다; 3-메틸히스티딘은 히스티딘에 치환될 수 있다; 호모 세린은 세린에 치환될 수 있다; 오르니틴은 리신에 치환될 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산이 유사한 측쇄를 가진 또 다른 아미노산으로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 패밀리는 당 업계에서 정의되어있으며, 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 아스파라긴 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 예를 들어, 페닐알라닌을 티로신에 치환하는 것은 보존적 치환이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 항체의 서열에서 보존적 치환은 결합 분자가 결합하는 항원과 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 항체의 결합을 방해하지 않는다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져있다(예를 들어, 문헌[Brummell et al., Biochem . 32:1180-1 187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng . 12(10):879-884 (1999); 및 Burks et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 94:.412-417 (1997)] 참조).
본원에서 사용되는 용어 "내재막 단백질" 또는 "IMP"는 생물학적 막에 부착된 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. IMP의 하나의 예는 생물학적 막의 지질 이중층에 한 번 이상 걸쳐있는 막관통 단백질이다. 단일 통과 막 단백질은 막을 한 번만 통과하는 한편, 다중 통과 막 단백질은 여러 번 횡단하여 들어갔다 나갔다 한다. I형 단일 통과 단백질은 막의 외측 또는 "막 외"에 아미노 말단이 있고 막의 내측 또는 "막 내"에 카복시 말단이 있게 위치된다. II형 단일 통과 단백질은 막 내측에 그들의 아미노 말단을 갖는다. 다중 통과 막관통 단백질은 막을 두 번 이상 통과하며 다양하게 상이한 토폴로지를 가질 수 있다. 짝수개의 막관통 도메인을 가진 단백질은 막의 같은 쪽에 아미노 말단과 카복시 말단을 둘 다 가질 것이다. 그러한 단백질의 한 예는 B 세포에서 발현되는 CD20이다. 홀수개의 막관통 도메인을 가진 것들은 막의 반대쪽에 그들의 아미노- 및 카복시-말단을 가질 것이다. 예로는 전형적으로 막 외측에 아미노 말단이 있고 막 내측에 카복시 말단이 있는 7개의 막관통 도메인을 갖는 G 단백질 연결 수용체가 포함된다. 특정 IMP는 막관통 도메인을 갖지 않으며 그 대신에 예를 들어 글리코실포스파티딜이노시톨 또는 팔미토일기와 같은 지질을 통해 막에 고정된다. IMP는 수송체, 링커, 채널, 수용체, 효소, 에너지 전달 또는 세포 부착을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 수많은 생물학적 기능을 갖는다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수의 핵산뿐만 아니라 복수의 핵산을 포함하며, 단리된 핵산 분자 또는 구조물, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA), cDNA, 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비통상적 결합(예를 들어, 펩티드 핵산(PNA: peptide nucleic acid)에서 발견되는 바와 같은 아미드 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들어 DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 환경으로부터 분리된 임의 형태의 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 겔-정제된 폴리뉴클레오티드, 또는 벡터에 함유된 폴리펩티드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 "단리된" 것으로 간주할 것이다. 또한, 클로닝을 위한 제한 부위를 갖도록 조작된 폴리뉴클레오티드 분절, 예를 들어 PCR 산물은 "단리된" 것으로 간주한다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예는 이종 숙주 세포에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 완충액 또는 식염수와 같은 비천연 용액 중의 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 RNA 분자는 폴리뉴클레오티드의 생체 내 또는 시험관 내 RNA 전사체를 포함하며, 전사체는 자연에서 발견되는 것이 아니다. 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성적으로 생성된 그러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결 인자와 같은 조절 요소일 수 있거나 이들을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "자연 발생적이지 않은" 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 문법적 변형은 "자연 발생적"인 것으로 당업자에 의해 잘 이해되거나, 판사나 행정 또는 사법 기관에 의해 "자연 발생적"이라고 결정 또는 해석되거나, 언제든지 그렇게 될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 형태를 배제할 때에만 이들을 명시적으로 배제하는 조건적인 용어이다.
본원에서 사용되는 "코딩 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈으로 이루어진 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않더라도, 코딩 영역의 일부로 간주할 수 있지만, 임의의 인접 서열, 예를 들어, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결 인자, 인트론 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 코딩 영역이 단일 폴리뉴클레오티드 구조물, 예를 들어 단일 벡터 상에 또는 별도의 폴리뉴클레오티드 구조물, 예를 들어 분리된(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 또한, 임의의 벡터는 단일 코딩 영역을 포함할 수 있거나, 단일 벡터가 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 면역글로블린 경쇄 가변 영역을 개별적으로 코딩할 수 있는 것과 같이 2개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다. 또한, 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 핵산은 또 다른 코딩 영역에 융합되거나 융합되지 않는 이종 코딩 영역을 포함할 수 있다. 이종 코딩 영역은 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인과 같은 특화된 요소 또는 모티프를 코딩하는 것들을 제한 없이 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. DNA의 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 결합된 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소를 포함할 수 있다. 작동 가능한 결합은 유전자 산물, 예를 들어 폴리펩티드의 코딩 영역이 조절 서열(들)의 영향 또는 조절하에 유전자 산물의 발현을 배치하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 결합될 때이다. 2개의 DNA 단편(예를 들어, 폴리펩티드 코딩 영역 및 그와 결합된 프로모터)은, 프로모터 기능이 유도되어 원하는 유전자 산물을 코딩하는 mRNA의 전사를 일으키고, 발현 조절 서열이 유전자 산물의 발현을 지시하는 능력 또는 DNA 주형의 전사되는 능력이 2개의 DNA 단편 간의 결합의 성질에 의해 방해받지 않는다면, "작동 가능하게 결합"되어 있다. 따라서, 프로모터가 그 핵산의 전사를 수행할 수 있다면 프로모터 영역은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 작동 가능하게 결합되어 있을 것이다. 프로모터는 소정의 세포에서 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 조절 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하게 결합되어 세포 특이적 전사를 지시할 수 있다.
다양한 전사 조절 영역은 당업자에게 공지되어있다. 이들은 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(인트론-A와 결합된 최초기(immediate early) 프로모터), 유인원 바이러스 40(simian virus 40)(초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예를 들어, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus))와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 척추동물 세포에서 기능을 하는 전사 조절 부위를 제한 없이 포함한다. 다른 전사 조절 영역은 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같이 척추동물 유전자로부터 유래한 것들뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 영역은 조직 특이적인 프로모터 및 인핸서뿐 아니라 림포카인 유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터루킨에 의해 유도될 수 있는 프로모터)를 포함한다.
폭스바이러스 프로모터(예를 들어, p7.5 또는 H5) 또는 박테리오파지 T7 프로모터도 전사 조절 영역으로 사용될 수 있다. T7 프로모터를 사용하는 경우, 유도 성 백시니아 발현 시스템이 이용될 수 있다. 백시니아 발현 시스템은 T7 RNA 폴리머라제의 전체 박테리오파지 T7 유전자 1 코딩 영역을 코딩하는 제1 재조합 백시니아 바이러스, 및 T7 프로모터 및 종결 조절 인자가 측면에 인접하는 관심 유전자를 코딩하는 제2 재조합 백시니아 바이러스를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 두 가지 재조합 백시니아 바이러스로 진핵 세포를 이중 감염시키면 T7 RNA 폴리머라제의 합성 및 T7 프로모터에 의해 제어되는 관심 유전자의 발현을 초래한다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 공지되어있다. 이들은 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코르나바이러스(picornavirus)로부터 유래한 요소(특히 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES, CITE 서열로도 언급됨)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 또는 리보솜 RNA 형태의 RNA일 수 있다.
폴리뉴클레오티드 및 핵산 코딩 영역은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩티드를 코딩하는 추가 코딩 영역과 결합될 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비되는 단백질은 성장하는 단백질 사슬의 조면 소포체를 통한 방출이 시작되면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 선도 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 가질 수 있고, 이는 완전 또는 "전체 길이" 폴리펩티드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생성한다는 것을 안다. 특정 실시양태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 이와 작동 가능하게 결합된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능적 유도체가 사용된다. 별법으로, 이종 포유동물 신호 펩티드, 또는 이의 기능적 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 선도 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화 인자(TPA: tissue plasminogen activator) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제의 선도 서열로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "라이브러리"는 예를 들어, 단일 동물 종, 조직 유형, 기관, 또는 세포 유형으로부터의 기원을 통해 관련된 폴리뉴클레오티드의 군과 같은,대표적인 속(genus)의 폴리뉴클레오티드이며, 여기서 라이브러리는 총체적으로 폴리뉴클레오티드의 소정의 속 내의 2종 이상의 상이한 종을 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 라이브러리는 총체적으로 폴리뉴클레오티드의 소정의 속 내에, 예를 들어, 적어도 2가지, 적어도 5가지, 적어도 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109가지의 상이한 종을 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 관심 폴리펩티드를 함유하는 다수의 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 라이브러리는 다수의 면역글로불린 서브유닛 폴리펩티드, 예를 들어, 중쇄 서브유닛 폴리펩티드 또는 경쇄 서브유닛 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 이러한 맥락에서, 본원에서 제공되는 "라이브러리"는 공통 속의 폴리뉴클레오티드를 포함하고(속은 특정 유형 및 부류의 면역글로불린 서브유닛 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드임), 예를 들어, 라이브러리는 인간 μ, γ-1, γ-2, γ-3, γ-4, α-1, α-2, ε, 또는 δ 중쇄, 또는 인간 κ 또는 λ 경쇄를 코딩할 수 있다. 본원에서 제공되는 방법에 따라 제작된 임의의 한 라이브러리의 각 구성원은 동일한 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 및/또는 막 고정 도메인을 코딩할 수 있지만, 라이브러리는 총체적으로 공통의 불변 영역과 관련된 적어도 2가지, 적어도 5가지, 적어도 10, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109가지의 상이한 가변 영역을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 라이브러리는 가변 영역, 예를 들어 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역, 및/또는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 둘 다를 포함하는 다수의 면역글로불린 단일 사슬 단편, 예를 들어, ScFv 단편을 코딩할 수 있다.
본원에서 사용되는 "디스플레이 라이브러리"는 라이브러리 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드를 표면 상에 발현하는 "디스플레이 패키지"에 각각 운반되는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리이다. 예를 들어, 항체 디스플레이 라이브러리는 표면 상에 항체의 항원 결합 도메인을 각각 디스플레이하는 다수의 디스플레이 패키지를 포함할 수 있다. 디스플레이 라이브러리가, 예를 들어, 고체 표면 상에 고정된 관심있는 항원과 상호작용하도록 허용되는 경우, 항원과 결합하는 디스플레이 패키지는 나머지 라이브러리로부터 단리되어 회수될 수 있다. 그 후, 디스플레이 패키지의 표면 상에 디스플레이된 항원 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 단리될 수 있다. 디스플레이 라이브러리는 박테리아의 파지 디스플레이 라이브러리, 또는 진핵생물 계의 라이브러리, 예를 들어 효모 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 또는 폭스바이러스와 같은 DNA 바이러스에서의 발현을 제한 없이 포함한다. 본원에서 그 전문으로 참고 포함된 미국 특허 제7,858,559호, 및 미국 특허 출원 공개 제2013-028892호를 참조한다. 특정 측면에서, 항체 디스플레이 라이브러리는 "디스플레이 패키지"가 EEV 입자가 되도록 EEV 특이적 단백질과의 융합 단백질로서 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터에서 제조될 수 있다. 미국 특헌 출원 공개 제2013-028892호를 참조한다.
이러한 디스플레이 라이브러리는 본원에서 제공된 바와 같이 EEV의 표면 상에 디스플레이된 IMP 융합 단백질에 대해 스크리닝될 수 있다.
"수용체 세포" 또는 "숙주 세포" 또는 "세포"는 재조합 단백질이 발현될 수 있거나, 바이러스가 증식될 수 있거나, 또는 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 라이브러리가 제작되고/거나 증식될 수 있는 세포 또는 세포 집단을 의미한다. 본원에서 제공되는 숙주 세포는 전형적으로 진핵 세포 또는 세포주, 예를 들어 척추동물, 포유동물, 설치류, 마우스, 영장류, 또는 인간 세포 또는 세포주이다. "숙주 세포의 집단"은 본원에서 제공되는 "라이브러리"가 제작, 증식 및/또는 발현될 수 있는 배양된 세포 집단을 의미한다. 백시니아 바이러스 감염성을 허용하는 임의의 숙주 세포가 본 발명에서 제공되는 방법에 적합하다. 본원에서 제공되는 방법에 사용하기 위한 숙주 세포는 고체 기질에 부착되어 성장하는 숙주 세포와 같이 부착성일 수 있거나, 또는 숙주 세포는 현탁상태일 수 있다.
본원에서 제공되는 숙주 세포는 항상적인 분비 경로를 포함할 수 있는데, 여기서 단백질, 예를 들어, 세포 또는 라이브러리에 의해 발현되는 단백질은 세포 또는 바이러스 막 상에 발현되어 세포의 내부로부터 분비되거나 가용성 폴리펩티드로서 완전히 분비된다. 특정 측면에서, 생물학적 막 상에 또는 내에 발현되는 관심 단백질, 예를 들어 IMP는 숙주 세포에 의해 생성된 피막형 바이러스, 예를 들어 세포외 피막형 백시니아 바이러스, 또는 EEV의 표면에서 발현된다. IMP는 하나 이상의 정지-전달 신호 또는 "막관통 도메인"의 존재에 의해 ER 막에 유지될 수 있다는 것을 제외하고는 ER 내강을 통과하여 완전히 분비되는 형태 또는 단백질과 동일한 경로를 따를 수 있다. 막관통 도메인은 막을 가로지르면서 알파 나선형 입체구조를 취하는 약 20개 아미노산의 소수성 스트레치이다. 막에 내재된 단백질은 원형질막의 인지질 이중 층에 고정되어 있다. 관심있는 폴리펩티드의 막관통 형태, 예를 들어 막에 고정된 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드는 전형적으로, 완전히 분비되는 형태와 마찬가지로, 아미노 말단 신호 펩티드를 이용한다.
다양한 막 결합형 단백질 및/또는 완전히 분비되는 단백질에 대한 신호 펩티드, 막관통 도메인, 및 세포질 또는 "막내" 도메인은 공지되어있다.
적합한 막관통 도메인은 백시니아 바이러스 EEV 특이적 HA 단백질 A56R, 또는 EEV 특이적 백시니아 바이러스 막관통 단백질 A33R, A34R, A36R, 또는 B5R의 TM 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 본원에 그 전문이 참고로 포함된, 2013년 10월 31일자로 공개된 미국 특허 출원 공개 제2013/0288927호를 참조한다. 특정 측면에서, EEV 특이적 단백질, 예를 들어, 본원의 다른 곳에서 더 상세히 논의되는 백시니아 바이러스 단백질 F13L은 팔미토일기를 통해 바이러스 외피의 내부 표면에 고정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "결합 분자"는 가장 넓은 의미에서 수용체, 예를 들어 에피토프 또는 항원 결정기에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 본원에서 추가로 기재되는 바와 같이, 결합 분자는 본원에 기재된 하나 이상의 "항원 결합 도메인"을 포함할 수 있다. 결합 분자의 비제한적 예는 항원 특이적 결합을 보유하는 항체 또는 이의 단편이다.
용어 "결합 도메인" 및 "항원 결합 도메인"은 본원에서 호환적으로 사용되고, 에피토프에 특이적으로 결합하기 위해 필수적이고 충분한 결합 분자의 영역을 지칭한다. 예를 들어, "Fv", 예를 들어 2개의 분리된 폴리펩티드 서브유닛으로서 또는 단일 사슬로서 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 "결합 도메인"으로 간주한다.
다른 항원 결합 도메인은 낙타과 종으로부터 유래한 항체의 가변 중쇄(VHH: variable heavy chain), 또는 피브로넥틴 스캐폴드에서 발현되는 6개의 면역글로불린 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)을 제한 없이 포함한다.
용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 호환적으로 사용될 수 있다. 항체(또는 본원에 개시된 바와 같은 이의 단편, 변이체 또는 유도체)는 적어도 중쇄의 가변 영역(예를 들어, 낙타과 종의 경우) 또는 적어도 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 포함한다. 척추동물계에서 기본적인 면역글로불린 구조는 비교적 잘 알려져있다. 예를 들어, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)]을 참조한다. 달리 언급하지 않는 한, 용어 "항체"는 항체의 작은 항원 결합 단편으로부터 완전한 크기의 항체, 예를 들어 2개의 완전한 중쇄 및 2개의 완전한 경쇄를 포함하는 IgG 항체에 이르는 모든 것을 포함한다.
용어 "면역글로불린"은 생화학적으로 구별될 수 있는 다양한 부류의 폴리펩티드를 포함한다. 당업자는 중쇄가 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론(γ, μ, α, δ, ε)과 이들 중 몇몇 서브클래스(예를 들어, γ1-γ4 또는 α1-α2)로 분류된다는 것을 이해할 것이다. IgG, IgM, IgA, IgG, 또는 IgE로서 각각 항체의 "부류"를 결정하는 것은 이 사슬의 특성이다. 면역글로불린 서브클래스(이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등은 잘 특성화되어 있으며 기능적 전문화를 부여하는 것으로 알려져있다.
경쇄는 카파 또는 람다(κ, λ)로 분류된다. 각 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 결합될 수 있다. 일반적으로, 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되어 있고, 두개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마, B 세포 또는 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의해 생성될 때 공유 이황화 결합 또는 비공유 결합으로 서로 결합된다. 중쇄에서, 아미노산 서열은 Y 배열의 갈래로 된 말단에서 N-말단으로부터 각 사슬의 바닥에 있는 C-말단으로 진행한다. 특정 항체, 예를 들어, IgG 항체의 기본 구조는 이황화 결합을 통해 공유결합된 2개의 중쇄 서브유닛과 2개의 경쇄 서브유닛을 포함하여 "본원에서 "H2L2"구조로도 지칭되는 "Y" 구조를 형성한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 결정기를 포함한다. 특정 측면에서, 에피토프는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기를 포함할 수 있으며, 특정 측면에서 3차원 구조적 특성, 및/또는 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 표적 영역이다.
용어 "표적"은 가장 넓은 의미로 결합 분자에 의해 결합될 수 있는 물질을 포함하는 것으로 사용된다. 표적은 예를 들어 폴리펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질 또는 다른 분자일 수 있다. 또한, "표적"은 예를 들어 결합 분자에 의해 결합될 수 있는 결합된 에피토프를 포함하는 세포, 기관 또는 생물체일 수 있다.
경쇄 및 중쇄 모두 구조적 및 기능적 상동성의 영역으로 나뉜다. 용어 "불변" 및 "가변"이 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄 가변(VL) 및 중쇄 가변(VH) 부분 모두의 가변 영역(본원에서 "가변 도메인"으로 호환적으로 불릴 수 있음)이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것을 이해할 것이다. 반대로, 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인(예를 들어, CH1, CH2 또는 CH3)은 분비, 경태반 이동성, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 생물학적 특성을 부여한다. 관례에 따라, 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노 말단으로부터 더 멀어지면서 불변 영역 도메인의 번호는 증가한다. N-말단 부분은 가변 영역이고 C-말단 부분은 불변 영역이다; CH3(또는 IgM의 경우 CH4) 및 CL 도메인은 중쇄 및 경쇄의 카복시 말단에 각각 존재한다.
항체 항원 결합 도메인에 존재하는 여섯 개의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항체가 수성 환경에서 그의 3차원 배열을 가정할 때 항원 결합 도메인을 형성하도록 특이적으로 배치되는 아미노산의 짧고 비연속적인 서열이다. "골격" 영역으로 언급되는 항원 결합 도메인의 나머지 아미노산은 낮은 분자 간 가변성을 나타낸다. 골격 영역은 주로 β-시트 형태를 채택하고 CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프, 경우에 따라 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 따라서, 골격 영역은 쇄간 비공유 결합 상호작용에 의해 CDR을 정확한 방향으로 배치하게 하는 스캐폴드를 형성하도록 작용한다. 배치된 CDR에 의해 형성된 항원 결합 도메인은 면역 반응성 항원 상의 에피토프에 상보적인 표면을 한정한다. 이 상보적인 표면은 그의 동족 에피토프에 대한 항체의 비공유 결합을 촉진한다. CDR 및 골격 영역을 각각 구성하는 아미노산은 다양하고 상이한 방식으로 정의되었기 때문에 당업자에 의해 임의의 주어진 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 대해 용이하게 확인될 수 있다(본원에서 그 전문이 참고로 포함된 문헌["Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); 및 Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)]을 참조한다.
당해 분야에서 사용되고/거나 허용되는 용어의 정의가 2개 이상일 경우, 본원에서 사용되는 용어의 정의는 명시적으로 반대로 언급되지 않는다면 이러한 의미 모두를 포함하고자 한다. 구체적인 예는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 가변 영역 내에서 발견되는 인접하지 않는 항원 결합 부위를 기재하는 용어 "상보성 결정 영역"("CDR")의 사용이다. 이러한 특정 영역은 예를 들어 본원에서 참고로 포함되는 카밧(Kabat) 등의 문헌[U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 및 코티아(Cothia) 등의 문헌[Chothia et al., J. Mol . Biol. 196:901-917 (1987)]에 의해 기재되었다. 또한, 면역글로불린 가변 도메인은 CDR을 포함하는 가변 영역 분절을 확인하기 위해 예를 들어, IMGT 정보 시스템(www://imgt.cines.fr/)(IMGT®/V-Quest)을 사용하여 분석될 수 있다(예를 들어, 문헌[Brochet et al., Nucl . Acids Res., 36:W503-508, 2008) 참조).
카밧 등은 또한 임의의 항체에 적용 가능한 가변 도메인 서열에 대한 번호 매김 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체를 넘어서 어떠한 실험 데이터에 의존하지 않고도 임의의 가변 도메인 서열에 이 "카밧 번호 매김" 시스템을 분명하게 지정할 수 있다. 본원에서 사용되는 "카밧 번호 매김"은 문헌[U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 의해 개시된 번호 매김 체계를 지칭한다. 그러나 카밧 번호 매김 체계의 사용이 명시적으로 언급되지 않는 한, 본 발명에서는 모든 아미노산 서열에 대해 연속적인 번호 매김이 사용된다.
결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 다클론, 단클론, 인간, 인간화 또는 키메라 항체, 단쇄 항체, 에피토프 결합 단편, 예를 들어 Fab 및 Fab' 및 F(ab)2, Fd, Fv, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, 이황화 결합된 Fv(sdFv), 단일 도메인 항체, 예를 들어 낙타과 VHH 항체, VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. ScFv 분자는 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,892,019호에 기재되어있다. 본 발명에 포함되는 면역글로불린 또는 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다. 또한, 2가이고 IgNAR 가변 도메인(VNAR)을 포함하는 단쇄를 포함하는 면역글로불린 신규 항원 수용체(IgNAR) 이소형이 고려된다(문헌[Walsh et al., Virology 411:132-141, 2011)]을 참조).
"특이적으로 결합한다"는 것은 일반적으로 결합 분자, 예를 들어 항체 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체가 그의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 결합한다는 것과 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 사이의 약간의 상보성을 수반한다는 것을 의미한다. 이 정의에 따르면, 결합 분자는 무작위의 관련없는 에피토프에 결합하는 것보다 그의 항원 결합 도메인을 통해 에피토프에 더 쉽게 결합할 때 그 에피토프에 "특이적으로 결합한다"고 한다. 용어 "특이성"은 특정 결합 분자가 특정 에피토프에 결합하는 상대 친화도를 검정하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 결합 분자 "A"는 결합 분자 "B"보다 주어진 에피토프에 대해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 간주할 수 있거나, 결합 분자 "A"는 관련 항원 결정기 "D"에 대해서보다 더 높은 특이성으로 에피토프 "C"에 결합한다고 할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "친화도"는 예를 들어 면역글로불린 분자의 하나 이상의 항원 결합 도메인을 갖는 개개의 에피토프의 결합 강도의 척도를 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)] 27-28 페이지를 참조한다. 본원에서 사용되는 용어 "결합력"은 항원 결합 도메인의 집단과 항원 사이의 복합체의 전체 안정성을 나타낸다. 예를 들어, 상기 문헌[Harlow], 29-34 페이지를 참조한다. 결합력은 특정 에피토프를 갖는 집단 내의 개별 항원 결합 도메인의 친화도, 및 면역글로불린과 항원의 원자가 둘 다와 관련이 있다. 예를 들어, 2가 단클론 항체와 중합체와 같이 고도로 반복적인 에피토프 구조를 갖는 항원 사이의 상호작용은 높은 결합력 중 하나일 것이다. 세포 표면에서 고밀도로 존재하는 수용체와 2가 단클론 항체 사이의 상호작용도 높은 결합력을 가질 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "중쇄 서브유닛" 또는 "중쇄 도메인"은 면역글로불린 중쇄로부터 유래한 아미노산 서열을 포함하고, 결합 분자, 예를 들어 중쇄 서브유닛을 포함하는 항체는 VH 도메인, CH1 도메인, 힌지(예를 들어, 상부, 중간 및/또는 하부 힌지 영역) 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, CH4 도메인, 또는 이의 변이체 또는 단편 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "경쇄 서브유닛" 또는 "경쇄 도메인"은 면역글로불린 경쇄로부터 유래한 아미노산 서열을 포함한다. 경쇄 서브유닛은 VL 또는 CL(예를 들어, Cκ 또는 Cλ) 도메인 중 적어도 하나를 포함한다.
결합 분자, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체는 그들이 인식하거나 특이적으로 결합하는 항원의 에피토프(들) 또는 부분(들)의 측면에서 기술되거나 특정될 수 있다. 항체의 항원 결합 도메인과 특이적으로 상호작용하는 표적 항원의 부분은 "에피토프" 또는 "항원 결정기"이다. 표적 항원은 단일 에피토프 또는 2개 이상의 에피토프를 포함할 수 있으며, 항원의 크기, 입체구조 및 유형에 따라 임의의 개수의 에피토프를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "연결된(linked)", "융합된" 또는 "융합" 또는 다른 문법적 상당 어구는 호환적으로 사용될 수 있다. 이 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단을 포함한 모든 수단에 의해 두 가지 이상의 요소 또는 구성 요소가 함께 결합됨을 의미한다. "인프레임(in-frame) 융합"은 원래의 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)의 번역 리딩 프레임을 유지하는 방식으로 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 ORF를 결합시켜 연속적인 더 긴 ORF를 형성하는 것을 말한다. 따라서, 재조합 융합 단백질은 원래의 ORF에 의해 코딩된 폴리펩티드에 상응하는 2개 이상의 분절을 함유하는 단일 단백질이다(이 분절은 통상 자연에서 그렇게 결합되어 있지 않음). 리딩 프레임이 이와 같이 융합된 분절을 통해 연속적이더라도, 분절은 예를 들어 인프레임 링커 서열에 의해 물리적으로 또는 공간적으로 분리될 수 있다. 예를 들어, IMP 및 백시니아 바이러스 EEV 특이적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인프레임으로 융합될 수 있지만, "융합된" 오픈 리딩 프레임이 연속된 폴리펩티드의 일부로서 동시 번역되기만 한다면, 링커 또는 스페이서를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "헤마글루티닌 태그" 또는 "HA 태그"는 아미노산 98 내지 106에 상응하는 인간 인플루엔자 헤마글루티닌 표면 당단백질(HA)로부터 유래한 단백질이다. HA 태그는 발현 벡터에서 일반적인 에피토프 태그로서 광범위하게 사용된다. 재조합 단백질은 재조합 단백질의 생체 활성 또는 생체 분포를 간섭하지 않는 것으로 보이는 HA 태그를 발현하도록 조작될 수 있다. 이 태그는 관심있는 단백질의 검출, 단리 및 정제를 용이하게 한다.
폴리펩티드와 관련하여, "선형 서열" 또는 "서열"은 아미노 또는 N-말단으로부터 카복실 또는 C-말단으로의 폴리펩티드 내의 아미노산의 순서이며, 여기서 서열에서 서로 인접하는 아미노산은 폴리펩티드의 1차 구조에서 연속적이다.
폴리펩티드의 다른 부분에 대한 "아미노 말단" 또는 "N-말단"인 폴리펩티드 부분은 순차적 폴리펩티드 사슬에서 먼저 오는 부분이다. 유사하게, 폴리펩티드의 다른 부분에 대한 "카복시 말단" 또는 "C-말단"인 폴리펩티드 부분은 순차적 폴리펩티드 사슬의 나중에 오는 부분이다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 유전자가 생화학적인, 예를 들어, 폴리펩티드를 생산하는 과정을 의미한다. 이 과정은 유전자 녹다운(knowdown)뿐 아니라 일시적 발현 및 안정한 발현 둘 다를 제한 없이 포함하는 세포 내 유전자의 기능적 존재의 표현을 포함한다. 여기에는 메신저 RNA(mRNA)로의 유전자의 전사 및 이러한 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 번역이 제한 없이 포함된다. 최종의 원하는 산물이 생화학적이라면, 발현은 그 생화학적인 임의의 전구체의 생성이 포함된다. 유전자 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생성된 메신저 RNA, 또는 전사체로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 산물은 폴리아데닐화와 같은 전사 후 변형된 핵산, 또는 메틸화, 글리코실화, 지질의 첨가, 다른 단백질 서브유닛과의 결합, 단백질 분해성 절단 등과 같은 번역 후 변형된 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
용어 "진핵생물" 또는 "진핵생물 유기체"는 원생동물, 균류, 효모, 녹조류, 단세포 식물, 다세포 식물, 및 모든 동물, 척추동물 및 무척추동물 모두를 비롯한 동물, 식물 및 원생 생물계의 모든 생물체를 포함하는 것으로 의도된다. 이 용어는 박테리아나 바이러스를 포함하지 않는다. "진핵 세포"는 단수의 "진핵 세포"뿐만 아니라 복수의 "진핵 세포"를 포함하고 진핵생물 유래 세포를 포함한다.
용어 "척추동물"은 단수의 "척추동물"뿐만 아니라 복수의 "척추동물"을 포함하는 것으로 의도되며, 포유류 및 조류뿐만 아니라 어류, 파충류, 및 양서류를 포함한다.
용어 "포유동물"은 단수의 "포유동물" 및 복수의 "포유동물"을 포함하는 것으로 의도되며, 인간; 영장류, 예를 들어 유인원, 원숭이, 오랑우탄, 및 침팬지; 개과, 예를 들어 개 및 늑대; 고양잇과, 예를 들어 고양이, 사자, 및 호랑이; 말과, 예를 들어 말, 당나귀, 및 얼룩말, 식용 동물, 예를 들어, 소, 돼지 및 양; 유제류, 예를 들어 사슴 및 기린; 설치류, 예를 들어 마우스, 랫트, 햄스터, 및 기니피그; 및 곰을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 측면에서, 포유동물은 인간 대상체이다.
용어 "조직 배양" 또는 "세포 배양" 또는 "배양" 또는 "배양하는 것"은 세포 구조의 보존, 세포 기능의 보존, 추가로 분화, 또는 세 가지 모두를 허용하는 조건하에서 식물 또는 동물 조직 또는 세포의 시험관 내 유지 또는 성장을 지칭한다. "1차 조직 세포"는 조직으로부터 직접 취해진 것들, 즉 생물체에서 동일한 기능을 수행하는 동일한 종류의 세포 집단이다. 이러한 조직 세포를 단백질 분해 효소 트립신으로 처리하면, 예를 들어 배양 플레이트 상에 접종될 때 세포 구조를 성장시키거나 유지하는 각각의 1차 조직 세포로 해리시킬 수 있다. 조직 배양에서 1차 세포의 증식으로 인해 발생하는 세포 배양을 "2차 세포 배양"이라고 한다. 대부분의 2차 세포는 유한한 횟수로 분열한 후 사멸한다. 그러나 몇몇 2차 세포는 이 "위기 기간"을 지나갈 수 있으며, 그 후에 이들은 무한히 증식할 수 있어 연속적으로 "세포주"를 형성한다. 세포가 배양되는 액체 배지는 본원에서 "배양 배지"라고 지칭한다. 원하는 분자, 예를 들어, 바이러스 또는 단백질, 예를 들어, 면역글로불린 분자가 세포 배양 중에 그 안에 분비된 배양 배지는 "조건화 배지"로 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "동정"은 원하는 분자, 예를 들어, 원하는 특성 또는 기능을 갖는 관심 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이러한 분자의 다수 또는 라이브러리로부터 구별하는 방법을 지칭한다. 동정 방법은 "선별" 및 "스크리닝" 또는 "패닝"을 포함한다. 본원에서 사용되는 "선별" 방법은 원하는 분자를 예를 들어 약제 내성을 통해 라이브러리로부터 직접 분리할 수 있는 방법이다. 본원에서 사용되는 "스크리닝" 또는 "패닝" 방법은 원하는 분자를 포함하는 풀에 원하는 분자를 검출할 수 있는 분석을 수행하는 방법이다. 이어서 분자가 검출된 풀의 분액을 연속적으로 작은 풀로 나누고, 원하는 분자로부터 고도로 농축된 풀을 얻을 때까지 유사하게 분석한다..
폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 EEV 벡터
본원에서 제공되는 IMP 융합 단백질은 폭스바이러스 벡터, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터에서 생산된다. 용어 "폭스바이러스"는 폭스비리데(Poxviridae) 과의 모든 구성원을 포함한다. 예를 들어, 문헌[B. Moss in: Virology, 2d Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Eds., Raven Press, p. 2080 (1990)]을 참조한다. 오르도폭스바이러스(orthopoxvirus)의 속에는, 예를 들어, 백시니아 바이러스, 바리올라(variola) 바이러스(천연두를 야기하는 바이러스), 및 라쿤 폭스바이러스(raccoon poxvirus)가 포함된다. 백시니아 바이러스는 오르도폭스바이러스의 원형이며, 이종 단백질의 발현을 위한 벡터로서 개발되어 잘 특성화되어있다.
본원에서 제공되는 IMP 융합 단백질을 발현하기 위해 폭스바이러스 벡터, 특히 백시니아 바이러스 벡터가 사용되는 실시양태에서, 임의의 적합한 폭스바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 특정 측면에서, IMP 융합 단백질을 코딩하는 유전자의 위치는 바이러스의 성장 및 복제에 필수적이지 않은 벡터의 영역에 존재할 수 있어서 감염성 바이러스가 생성된다. 백시니아 바이러스 게놈의 다양한 필수적이지 않은 영역이 특성화되었지만, 외래 유전자의 삽입을 위해 가장 널리 사용되는 유전자 좌는 게놈의 HindIII J 단편에 위치한 티미딘 키나아제 유전자 좌이다. 특정의 백시니아 바이러스 벡터에서, tk 유전자 좌는 하나 또는 두 개의 고유한 제한 효소 부위를 포함하도록 조작되어, 본원의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 3 분자 재조합 바이러스 생산 방법을 용이하게 이용할 수 있게 한다.
본원에서 제공되는 IMP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폭스바이러스 감염 세포의 세포질에서 기능을 하는 전사 조절 영역과 작동 가능하게 결합되어 폭스바이러스 벡터, 특히 백시니아 바이러스 벡터에 삽입될 수 있다.
폭스바이러스 전사 조절 영역은 프로모터 및 전사 종결 신호를 포함한다. 폭스바이러스의 유전자 발현은 일시적으로 조절되며, 초기, 중기, 및 후기 유전자의 프로모터는 다양한 구조를 갖는다. 특정 폭스바이러스 유전자는 항상적으로 발현되며, 이들 "초기-후기(early-late)" 유전자의 프로모터는 하이브리드 구조를 지닌다. 합성 초기-후기 프로모터도 개발되었다. 본원에서 제공되는 IMP 융합 단백질을 발현하기에 적합한 폭스바이러스 프로모터는 7.5-kD 프로모터, MIL 프로모터, 37-kD 프로모터, 11-kD 프로모터, 11L 프로모터, 12L 프로모터, 13L 프로모터, 15L 프로모터, 17L 프로모터, 28-kD 프로모터, H1L 프로모터, H3L 프로모터, H5L 프로모터, H6L 프로모터, H8L 프로모터, D11L 프로모터, D12L 프로모터, D13L 프로모터 A1L 프로모터, A2L 프로모터, A3L 프로모터, 및 P4b 프로모터와 같은 후기 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Moss, B., "Poxviridae and their Replication" IN Virology, 2d Edition, B. N. Fields, D. M. Knipe et al., Eds., Raven Press, p. 2090 (1990)]을 참조한다.
적합한 폭스바이러스 벡터는 야생형 백시니아 바이러스, 예를 들어 웨스턴 리저브(Western Reserve) 또는 WR 균주, 또는 약독화된 백시니아 바이러스, 예를 들어 변형된 백시니아 앙카라(MVA: modified vaccinia Ankara)[Mayr, A. et al., Infection 3:6-14 (1975)]를 포함한다.
복제 사이클 중에, 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 바이러스는 그의 막 구조가 상이한 4가지 감염 형태, 즉 세포내 성숙 비리온(IMV: intracellular mature virion), 세포내 피막형 비리온(IEV: intracellular enveloped virion), 세포에 회합된 피막형 비리온(CEV: cell-associated enveloped virion) 및 세포외 피막형 비리온(EEV)을 생산한다. IMV는 단일 지단백질 막을 갖는 반면, CEV 및 EEV는 둘 다 두 개의 막 층으로 둘러싸여 있고 IEV는 세 개의 외피를 갖는다는 것이 지배적인 견해이다. EEV는 숙주 세포의 원형질막으로부터 유출되고, EEV 막은 트랜스-골지로부터 유래한다.
감염 후, 바이러스는 막(들)을 잃고 DNA/단백질 코어는 미세 소관을 따라 세포 내로 운반된다. 초기 백시니아 mRNA("초기"는 DNA 복제 전으로 정의됨)에 의해 코딩된 단백질은 백시니아 코어의 탈외피(uncoating)와 후속적인 DNA 복제로 이어진다. 이 복제는 본질적으로 ER 상단에 위치한 "바이러스 공장"이라고 불리는 곳에서 발생한다. 바이러스 공장 내에서, 미성숙 비리온(IV: immature virion)이 조립되고 처리되어 IMV (세포내 성숙 바이러스)를 형성한다. IMV는 ER에서 유래한 막을 포함한다. 대부분의 IMV는 세포 용해에 의해 세포로부터 방출된다. 일부 IMV는 미세 소관을 통해 트랜스 골지 네트워크나 초기 엔도솜의 막에 의해 포장(wrapping)되는 부위로 운반된다. 이중 막에 의한 IMV 입자의 포장은 IEV(세포내 피막형 바이러스)라 불리는 백시니아의 한 형태를 생성한다. 그 후, IEV는 미세 소관을 통해 세포 표면으로 운반된다. 외부 IEV 막은 원형질막과 융합되어 세포 표면에 CEV(세포에 회합된 피막형 바이러스)를 노출시킨다. 숙주 세포로부터의 액틴 중합은 CEV가 이웃 세포를 감염시키도록 유도할 수 있거나, 바이러스는 EEV로서 방출될 수 있다. 예를 들어 문헌[Kim L. Roberts and Geoffrey L. Smith. Trends in Microbiology 16(10):472-479 (2008); Geoffrey L. Smith, et al., Journal of General Virology 83:2915-2931 (2002)]을 참조한다.
적어도 6개의 바이러스 코딩된 단백질이 EEV 외피 막의 성분으로서 보고되었다. 이 중 4개의 단백질(A33R, A34R, A56R, 및 B5R)은 당단백질이고, 하나(A36R)는 비글리코실화된 막관통 단백질이며, 하나(F13L)는 팔미토일화된 외인성(peripheral) 막 단백질이다. 예를 들어, 문헌[Lorenzo et al., Journal of Virology 74(22):10535 (2000)]을 참조한다. 감염 중에, 이 단백질들은 골지 복합체에 국소화되고, 여기서 감염성 바이러스에 편입된 후 운반되어 세포외 배지로 방출된다. 본원에서 제공된 바와 같이, IMP 융합 단백질은 EEV 특이적 단백질, 예를 들어, F13L 또는 A56R과의 융합 단백질로서 EEV 막으로 향하게 되고 EEV 막 상에 발현된다.
F13L 단백질은 시스테인 185 및 186의 팔미토일화를 통해 최외곽 EEV 막의 내부 표면과 결합된다[Smith Trends in Microbiol. 16:472-479 (2008)]. F13L을 코딩하는 유전자가 결실된 백시니아 바이러스는 작은 플라크를 형성하고 생성된 EEV의 수는 상당히 감소된다.
백시니아 바이러스 주 WR의 F13L 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호 1로 제시한다. 2개의 팔미토일화된 시스테인 잔기(서열 번호 1의 아미노산 85 및 86)는 밑줄로 나타낸다. F13L은 막을 통과하지 않기 때문에, 막 통과 도메인이나 신호 펩티드를 갖지 않는다.
Figure pct00003
A56R 단백질은 백시니아 바이러스 헤마글루티닌이며, 아미노 말단 세포 외("막외") 도메인, 단일 막관통 도메인, 및 세포질("막내") 도메인을 포함하는 표준 I형 내재막 단백질이다. A56R은 약 33개 아미노산의 N-말단 신호 펩티드, 약 아미노산 34에서 약 아미노산 103까지 뻗어있는 Ig 유사 도메인, 약 아미노산 121에서 약 아미노산 275까지 뻗어 있는 줄기 영역, 약 아미노산 276에서 약 아미노산 303까지 뻗어있는 막관통 도메인, 및 약 아미노산 304에서 아미노산 314까지 뻗어있는 세포질("막 사이(inter-membrane)") 도메인을 포함한다. 문헌[DeHaven et al., J. Gen Virol . 92:1971-1980 (2011)]을 참조한다. A56R은 서열 번호 5로서 나타낸다.
Figure pct00004
본원에서 제공되는 IMP 융합 단백질은 임의의 적합한 백시니아 바이러스에서 발현될 수 있다. 특정 실시양태에서, EEV 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 벡터의 성장 및 복제에 필수적이지 않은 백시니아 바이러스 게놈의 영역 내로 삽입되어 감염성 바이러스가 생성될 수 있다. 백시니아 바이러스 게놈의 필수적이지 않은 다양한 영역이 특성화되었지만, 외래 유전자의 삽입을 위해 가장 널리 사용되는 유전자 좌는 게놈의 HindIII J 단편에 위치한 티미딘 키나아제 유전자 좌이다. 본원에서 제공되는 IMP 융합 단백질은 폭스바이러스 감염 세포의 세포질에서 기능을 하는 전사 조절 영역과 작동 가능하게 결합되어 백시니아 바이러스 벡터에 삽입될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 프로모터는 초기/후기 7.5-kD 프로모터, 또는 초기/후기 H5 프로모터(또는 이의 변이체)를 제한 없이 포함한다.
3 분자 분자 재조합 방법
PCT 공보 WO 00/028016호 및 미국 특허 제7,858,559호(Zauderer)에 개시된 3 분자 재조합은 관심 단백질을 발현하고 백시니아 바이러스에서 라이브러리를 생산하기 위한 고효율, 고역가 생산 방법이다. 3 분자 재조합 방법은 90% 이상의 효율 및 직접 결찰에 의해 얻어진 것보다 적어도 100배 이상의 역가로 재조합 바이러스의 생성을 가능하게 한다.
특정 측면에서, 본원에 기재된 바와 같이 백시니아 바이러스에서의 발현 및 EEV 상에서의 디스플레이를 위한 IMP 융합 단백질은 3 분자 재조합에 의해 폭스바이러스 벡터, 예를 들어 백시니아 바이러스 벡터에서 제작될 수 있다.
특정 실시양태에서, EEV에서의 발현을 위한 IMP 융합 단백질 전달 플라스미드로서, 백시니아 바이러스 Tk 유전자 내 영역의 측면에 인접한 폴리뉴클레오티드, 백시니아 바이러스 H5 프로모터, 및 원하는 융합 단백질의 코딩 영역을 삽입하기 위한 NcoI 및 BsiWI 제한 부위가 포함된 벡터를 제공한다.
내재막 단백질
본 발명은 단백질이 자연적으로 발현되는 세포에서 나타나는 것처럼 단백질의 본래의 입체구조에 접근하는 입체구조적으로 손상되지 않은 상태의 내재막 단백질(IMP)을 발현하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, IMP는 폭스바이러스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 EEV 상에 발현되는 폭스바이러스 단백질과의 융합 단백질로서 발현된다. 본원에서 제공되는 IMP 융합 단백질은 EEV의 표면 상에 발현되고 디스플레이될 때, 결합 분자의 라이브러리, 예를 들어 항체 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하기 위한 표적 항원으로서 유용하다.
임의의 IMP는 본원에서 제공되는 방법에 따라 융합 단백질로서 제작될 수 있다. 특정 측면에서, IMP는 면역 요법의 표적이다. 특정 측면에서, IMP는 CD20 또는 G-단백질 결합 수용체(GPCR)와 같은 다중 통과 IMP이다. 본원에서 제공되는 IMP 융합 단백질을 제작하는 데 사용하기에 적합한 다중 통과 인간 IMP는 표 1에 열거된 단백질을 제한 없이 포함한다.
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특정 측면에서, 다중 통과 IMP는 GPCR, 예를 들어, FZD4 또는 CXCR4이다. 특정 측면에서, 다중 통과 IMP는 CD20이다.
폭스바이러스 EEV 상의 발현을 위한 IMP 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 생물학적 막과 관련하여 입체구조적으로 손상되지 않은 형태의 내재막 단백질 또는 이의 단편을 백시니아 바이러스 EEV에 특이적인 단백질 또는 이의 단편과의 융합체로서 발현하기 위한 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. "입체구조적으로 손상되지 않은"는 단백질이 본래의 상태로 나타날 때와 마찬가지로 생물학적 지질 이중 막의 환경에서 본래의 또는 본래에 가까운 입체구조로 나타나거나 디스플레이된다는 것을 의미한다.
한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 외부 막 영역, 하나 이상의 막관통 도메인 및 하나 이상의 막내 영역을 포함하는 내재막 단백질(IMP) 또는 이의 단편, 예를 들어 다중 통과 IMP를 코딩하는 제1 핵산 단편으로서, 하나 이상의 막내 영역을 코딩하는 제1 핵산 단편의 부분이 제1 핵산 단편의 5' 또는 3' 말단에 위치하는 것인 제1 핵산 단편; 및 백시니아 바이러스 F13L 단백질(서열 번호 1) 또는 이의 기능적 단편을 코딩하며, IMP의 막내 영역을 코딩하는 제1 핵산 단편의 부분에 인프레임으로 융합된 제2 핵산 단편을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 제1 핵산 단편 및 제2 핵산 단편은 경우에 따라 링커 또는 다른 스페이서를 코딩하는 핵산에 의해 분리될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 제1 및 제2 핵산 단편과 작동 가능하게 결합된 폭스바이러스 프로모터를 추가로 포함할 수 있어, 폭스바이러스 감염 세포의 세포질에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능하게 할 수 있다. 이 측면에 따르면, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 폭스바이러스 감염 세포는 IMP-F13L 융합 단백질을 세포외 피막형 바이러스(EEV)의 외피 막의 일부로 발현할 수 있다. F13L과의 융합체로서 IMP의 발현을 나타내는 개략도를 도 1B 및 도 1C에 나타낸다.
특정 측면에서, IMP 또는 이의 단편은 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상 또는 그 이상의 막관통(TM: transmembrane) 도메인, 예를 들어 표 1에 열거된 것들을 포함하는 다중 통과 막 단백질일 수 있다.
IMP가 홀수개의 TM 도메인을 갖는 경우, IMP의 하나의 말단, N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나는 자연적으로 생물학적 막의 막 외측에 위치하고, IMP의 다른 말단은 IMP의 막 내측에 위치할 것이다. F13L 단백질은 폭스바이러스 EEV의 외막에 완전히 내재하고 있기 때문에, 막의 내부에 위치한 IMP의 말단, N-말단 또는 C-말단이 F13L에 융합될 수 있다. 따라서, 단백질의 N-말단이 막 외에 있고 C-말단이 막 내에 있는 전형적인 7-TM 도메인 GPCR과 같은 IMP의 경우, 도 1B에 나타낸 바와 같이 F13L의 N-말단이 GPCR의 C-말단에 융합될 수 있다. 따라서, 제1 핵산 단편이 홀수개의 막관통 도메인을 갖는 IMP를 코딩하며, 제1 핵산 단편의 5' 말단이 막외 영역을 코딩하고, 제1 핵산 단편의 3' 말단이 IMP의 막내 영역을 코딩하고, 후자가 F13L 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 단편의 5' 말단에 융합되는 상기와 같은 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
이러한 유형의 예시적인 폴리뉴클레오티드에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 F13L의 N-말단에 융합된, 특정 인간 암의 면역 요법을 위한 표적인 인간의 프리즐드-4 단백질(FZD4) 또는 이의 단편을 코딩할 수 있다. 따라서, FZD4-F13L 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이 측면에 따른 예시적인 폴리뉴클레오티드는 하기에 나타낸 바와 같이 서열 번호 2의 아미노산 20 내지 892인 성숙 융합 단백질을 코딩한다. 폴리뉴클레오티드는 신호 펩티드, 예를 들어 FZD4의 신호 펩티드, 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 19를 추가로 코딩할 수 있다.
Figure pct00010
이러한 유형의 또 다른 예시적인 폴리뉴클레오티드에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 F13L의 N-말단에 융합된 CXC 케모카인 수용체 또는 이의 단편을 코딩할 수 있다. CXC 케모카인 수용체는 유사하게 특정 인간 암의 면역 요법의 표적이다. 예시적인 CXC 케모카인 수용체는 CXCR4, 또는 이의 단편이다. 따라서, CXC 케모카인 수용체-F13L 융합 단백질, 예를 들어 CXCR4-F13L 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이 측면에 따른 예시적인 폴리뉴클레오티드는 하기 나타낸 바와 같이 서열 번호 3을 코딩한다.
Figure pct00011
당업자에게 명백한 바와 같이, 짝수개의 막관통 도메인을 갖는 다중 통과 막 단백질은 그의 N-말단 및 그의 C-말단이 막의 동일한 쪽, 막 외측 또는 막 내측의 어느 한쪽에 존재하도록 생물학적 막에 삽입될 것이다. F13L 단백질은 완전히 폭스바이러스 EEV의 막 내측에 위치하기 때문에, 막에 적절하게 삽입된 IMP-F13L 융합 단백질을 형성하기 위해서 IMP 또는 이의 단편의 N-말단 또는 C-말단 중 적어도 하나는 막에 내재해야 한다. IMP가 짝수개의 TM 도메인을 가지며 둘 모두가 내부에 위치한 경우, F13L 단백질은 IMP의 N-말단 또는 IMP의 C-말단의 어느 하나에 융합될 수 있다. 전장 IMP가 N-말단 및 C-말단이 둘 다 막 외에 있도록 위치하는 경우, 홀수개의 TM 도메인을 갖는 IMP의 단편이 F13L에 융합될 수 있다.
따라서, 본 발명은 제1 핵산 단편의 5' 및 3' 말단이 둘 다 막내 영역을 코딩하는 짝수개의 막관통 도메인을 갖는 IMP를 코딩하는 상기에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 측면에서, F13L을 코딩하는 핵산 단편의 3' 말단은 IMP를 코딩하는 핵산 단편의 5' 말단에 융합될 수 있고, 특정 측면에서 F13L을 코딩하는 핵산 단편의 5' 말단은 IMP를 코딩하는 핵산 단편의 3' 말단에 융합될 수 있다.
이러한 유형의 예시적인 IMP는 B 세포 백혈병, 림프종, 및 골수종의 면역 요법의 표적인 인간 B 세포에서 발현되는 4-TM 도메인 IMP인 인간 CD20이다. CD20의 C-말단이 F13L의 N-말단에 융합된 CD20-F13L 융합 단백질의 다이어그램을 도 1C에 나타낸다. 따라서, CD20-F13L 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 이 측면에 따른 예시적인 폴리뉴클레오티드는 하기에 나타낸 바와 같이 서열 번호 4를 코딩한다.
Figure pct00012
상기에 제공된 폴리뉴클레오티드에서, 제1 핵산 단편과 제2 핵산 단편은 직접 융합될 수 있거나, 또는 링커 또는 스페이서 또는 다른 폴리펩티드 단편을 코딩하는 핵산 단편에 의해 분리될 수 있다. 특정 측면에서, 상기에 제공된 폴리뉴클레오티드는 이종 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 제3 핵산 단편을 제1 핵산 단편과 제2 핵산 단편 사이에 또는 어느 한쪽에 추가로 포함할 수 있다. 이종 펩티드는 예를 들어, 링커 서열, 아미노산 태그 또는 표지, 또는 정제를 용이하게 하는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열일 수 있다. 특정 측면에서, 이종 펩티드는 예를 들어 융합 단백질의 C-말단에 융합되는 6-히스티딘 태그이다.
특정 측면에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 폭스바이러스 프로모터와 작동 가능하게 결합된다. 적합한 프로모터는 본원의 다른 부분에 기재되어 있다. 특정 측면에서, 프로모터는 폭스바이러스 p7.5 프로모터 또는 폭스바이러스 H5 프로모터이다.
본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는, 적절한 허용 숙주 세포 내로 도입시에, IMP-F13L 융합 단백질을 그의 표면 상에 디스플레이하는 감염성 EEV를 생성할 수 있는 폭스바이러스 게놈일 수 있거나 또는 이의 일부일 수 있다. 특정 측면에서, 폭스바이러스 게놈은 백시니아 바이러스 게놈, 예를 들어, 백시니아 바이러스 WR 게놈 또는 MVA 게놈이다. 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폭스바이러스 게놈은 표준 분자 생물학 및 바이러스학 기술에 의해, 예를 들어 본원에 기재된 3 분자 재조합을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에서 제공되는 폭스바이러스 게놈은 재조합 폭스바이러스의 일부로서, 또는 적절한 헬퍼 바이러스를 수반하는 누드 DNA로서(예를 들어, 계두 바이러스) 허용 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명은 제공된 폭스바이러스 게놈을 포함하는 재조합 폭스바이러스, 예를 들어 재조합 백시니아 바이러스를 추가로 제공한다.
IMP- EEV 융합 단백질, 재조합 폭스바이러스 EEV , 및 제조 방법
본 발명은 상기에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것과 같은 IMP-F13L 융합 단백질을 추가로 제공한다. 또한, IMP-F13L 융합 단백질은 재조합 폭스바이러스 EEV, 예를 들어 재조합 백시니아 바이러스 EEV의 표면 상에서 발현될 수 있다. 본 발명은 제공된 융합 단백질을 포함하는 재조합 폭스바이러스 EEV, 예를 들어, 재조합 백시니아 바이러스 EEV를 제공한다. 재조합 폭스바이러스 EEV는 상기에 제공되는 바와 같은 폭스바이러스 게놈을 포함하는 백시니아 바이러스로 백시니아 바이러스 감염성을 허용하는 숙주 세포를 감염시키는 단계, 및 감염된 숙주 세포로부터 방출된 EEV를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 상기에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 IMP-F13L 융합 단백질이 제공된다.
또한, 본 발명은 폭스바이러스 단백질, 예를 들어, EEV에 특이적인 백시니아 바이러스 단백질, 예를 들어 F13L, A56R, B5R, 33R, A34R, 또는 A36R에 융합된 다중 통과 IMP, 및 단일 통과 IMP, 또는 IMP의 단지 세포외 도메인(ECD)일 수 있는 IMP 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질인 "IMP-EEV 융합 단백질"을 제공한다. 예시적인 ECD 융합 단백질은 하기에 기재한다. 본원에서 제공되는 IMP-EEV 융합 단백질은 폭스바이러스 EEV의 표면 상에 입체구조적으로 손상되지 않은 형태의 IMP, 예를 들어 다중 통과 IMP, 단일 통과 IMP, 또는 IMP의 ECD를 디스플레이할 수 있다. 표적 IMP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인에 대한 항체 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용하기 위해, 폭스바이러스 EEV의 표면 상에 IMP를 디스플레이하는 것은 재조합 세포, 예를 들어 전형적인 CHO 세포의 표면 상에 IMP를 디스플레이하는 것보다 많은 이점을 제공한다. 예를 들어, IMP는 세포보다 EEV 상에서 더 고밀도로 발현될 수 있다. 더욱이, EEV는 그의 표면 상에 단지 약 6가지의 상이한 폭스바이러스 단백질(예를 들어, F13L, A56R, B5R, 33R, A34R 및 A36R)을 발현하며, 이는 세포의 표면 상에 발현될 수 있는 수백 가지와는 대조적이다. 마지막으로, 본원에서 제공되는 IMP-F13L 융합 단백질을 발현하는 불활성화된 EEV는 고체 지지체에 부착될 수 있어, 라이브러리 스크리닝에서 편의성을 제공한다.
따라서, 본 발명은 예를 들어, IMP에 특이적인 항원 결합 도메인에 대한 항체 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용하기 위한 본래의 입체구조로 내재막 단백질(IMP) 또는 이의 단편을 디스플레이하는 방법을 제공한다. 방법은 IMP 또는 이의 단편을 폭스바이러스 EEV 특이적 단백질 또는 이의 막 관련 단편과의 융합 단백질로서 발현하는 재조합 폭스바이러스로 폭스바이러스 감염성을 허용하는 숙주 세포를 감염시키는 단계로서, 감염된 숙주 세포에 의해 생성된 EEV는 IMP를 EEV 외피 막의 일부로서 포함하는 것인 단계; 및 숙주 세포로부터 방출된 EEV를 회수하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, EEV 특이적 단백질 또는 이의 단편은 백시니아 바이러스 A33R 단백질, A34R 단백질, A56R 단백질, B5R 단백질, A36R 단백질, F13L 단백질, 이들의 임의의 막 관련 단편, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
특정 측면에서, EEV 특이적 단백질은 F13L(서열 번호 1) 또는 이의 기능적 단편이며, 융합 단백질은 상기에 제공된 폴리뉴클레오티드에 의해 발현되는 것, 예를 들어 IMP가 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상의 막관통 도메인을 포함하는 다중 통과 막 단백질인 것일 수 있다.
특정 측면에서, 막 관련 EEV 특이적 단백질 단편은 백시니아 바이러스 A56R 단백질의 줄기, 막관통, 및 막내 도메인, 서열 번호 5의 아미노산 108 내지 314를 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 이들로 본질적으로 이루어지는 단편을 포함한다. 몇몇 예시적인 융합 파트너 중 하나는 하기 서열 번호 6에 굵은 체로 나타낸 인간 FZD4의 ECD를 포함한다. 이 예시적인 측면에 따르면, 본 발명은 폭스바이러스 EEV의 표면 상에 인간 FZD4의 구조적 손상되지 않은 단편을 디스플레이하는 방법으로서, 서열 번호 6의 아미노산 20 내지 370을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폭스바이러스로 폭스바이러스 감염성을 허용하는 숙주 세포를 감염시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 융합 단백질은 신호 펩티드, 예를 들어 서열 번호 6의 아미노산 1 내지 19를 추가로 포함할 수 있다.
Figure pct00013
또 다른 예시적인 융합 파트너는 하기 서열 번호 7에 굵은 체로 나타낸 인간 ErbB2(Her2)의 ECD를 포함한다. 이 예시적인 측면에 따르면, 본 발명은 폭스바이러스 EEV의 표면 상에 인간 Her2의 입체구조적으로 손상되지 않은 단편을 디스플레이하는 방법으로서, 서열 번호 7의 아미노산 20 내지 855를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폭스바이러스로 폭스바이러스 감염성을 허용하는 숙주 세포를 감염시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 융합 단백질은 신호 펩티드, 예를 들어 서열 번호 7의 아미노산 1 내지 19를 추가로 포함할 수 있다.
Figure pct00014
또 다른 예시적인 융합 파트너는 하기 서열 번호 8에 굵은 체로 나타낸 인간 CD100(세마포린 4D)의 ECD를 포함한다. 이 예시적인 측면에 따르면, 본 발명은 폭스바이러스 EEV의 표면 상에 인간 CD100의 입체구조적 손상되지 않은 단편을 디스플레이하는 방법으로서, 서열 번호 8의 아미노산 20 내지 935를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폭스바이러스로 폭스바이러스 감염성을 허용하는 숙주 세포를 감염시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 융합 단백질은 신호 펩티드, 예를 들어 서열 번호 8의 아미노산 1 내지 19를 추가로 포함할 수 있다.
Figure pct00015
특정 측면에서, 막 관련 EEV 특이적 단백질 단편은 백시니아 바이러스 B5R 단백질의 막관통 및 막내 도메인, 서열 번호 9의 아미노산 276 내지 317을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 이들로 본질적으로 이루어지는 단편을 포함한다. 특정 측면에서, 막 관련 EEV 특이적 단백질 단편은 백시니아 바이러스 B5R 단백질의 줄기, 막관통, 및 막내 도메인, 서열 번호 9의 아미노산 238 내지 317을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 이들로 본질적으로 이루어지는 단편을 포함한다.
Figure pct00016
특정 예시적 측면에서, B5R 단편에 대한 IMP 융합 파트너는 하기 서열 번호 10 및 서열 번호 11에 굵은 체로 나타낸 인간 FZD4의 세포외 도메인을 포함한다. 이 예시적인 측면에 따르면, 본 발명은 폭스바이러스 EEV의 표면 상에 인간 FZD4의 입체구조적 손상되지 않은 단편을 디스플레이하는 방법으로서, 서열 번호 10의 아미노산 20 내지 243 또는 서열 번호 11의 아미노산 20 내지 281을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폭스바이러스로 폭스바이러스 감염성을 허용하는 숙주 세포를 감염시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 융합 단백질은 신호 펩티드, 예를 들어 서열 번호 10의 아미노산 1 내지 19를 추가로 포함할 수 있다.
Figure pct00017
Figure pct00018
본 발명은 서열 번호 2의 아미노산 20 내지 892; 서열 번호 3; 서열 번호 4; 서열 번호 6의 아미노산 20 내지 370; 서열 번호 7의 아미노산 20 내지 855; 서열 번호 8의 아미노산 20 내지 935; 서열 번호 10의 아미노산 20 내지 243; 또는 서열 번호 11의 아미노산 20 내지 281, 이들의 임의의 조합, 이들의 임의의 단편, 또는 이들의 임의의 변이체를 포함하는 융합 단백질로서, 재조합 폭스바이러스에 의해 발현되는 경우 폭스바이러스 세포외 피막형 바이러스(EEV)의 표면 상에 본래의 입체구조로 나타나는 융합 단백질을 추가로 제공한다.
또한, 본원에서 제공되는 임의의 EEV 융합 단백질을 포함하는 재조합 폭스바이러스 EEV를 제공한다.
항체 선별 방법
본 발명은 관심있는 다중 통과 막 단백질에 결합하는 결합 분자, 예를 들어 항체, 항원 결합 항체 단편, 또는 항체 유사 결합 분자를 선별하는 방법을 추가로 제공한다. 방법은 표면 상에 다중 통과 단백질을 디스플레이할 수 있는 본원에서 제공되는 재조합 EEV를 고체 지지체에 부착시키는 단계; 복수의 항원 결합 도메인을 디스플레이하는 디스플레이 패키지를 포함하는 디스플레이 라이브러리, 예를 들어 항체 디스플레이 라이브러리를 제공하는 단계; EEV 상에 발현된 IMP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 디스플레이하는 디스플레이 패키지가 EEV에 결합할 수 있도록 디스플레이 라이브러리를 EEV와 접촉시키는 단계; 결합되지 않은 디스플레이 패키지를 제거하는 단계; 및 EEV 상에 발현된 IMP에 특이적인 항원 결합 도메인을 디스플레이하는 디스플레이 패키지를 회수하는 단계를 포함한다.
다수의 결합 도메인, 예를 들어, 항체, 항체 유사 분자 또는 다른 결합 분자를 포함하는 임의의 디스플레이 라이브러리가 상기 방법에 적합하다. 예를 들어, 디스플레이 라이브러리는 파지 디스플레이 라이브러리, 효모 디스플레이 라이브러리 또는 본원의 다른 부분에서 기재되는 바와 같이 백시니아 바이러스 벡터에 제작된 라이브러리일 수 있다.
특정 측면에서, 재조합 EEV는 고체 지지체에 부착되기 전에 불활성화될 수 있다. 예를 들어, EEV는 UV 조사 하에 소랄렌(트리옥살렌, 4'-아미노메틸-, 히드로클로라이드)과의 인큐베이션에 의해 불활성화될 수 있다.
임의의 적합한 고체 지지체가 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "고체 지지체"는 당 업계에 공지된 바와 같이 다양한 형태일 수 있는, EEV에 결합할 수 있는 임의의 지지체이다. 잘 알려진 지지체에는 조직 배양 플라스틱, 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 변성 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 반려암, 및 자철석이 포함된다. 운반체의 성질은 본 발명의 목적상 어느 정도 용해성이거나 불용성일 수 있다. 지지체 물질은, 결합된 EEV가 항체와 같이 디스플레이된 결합 분자에 결합할 수 있는 한, 실질적으로 어떤 구조적 형태이든지 가질 수 있다. 따라서, 지지체 형태는 비드에서와 같이 구형, 시험관의 내부 표면, 또는 막대의 외부 표면에서와 같이 원통형일 수 있다. 또는, 표면은 시트, 테스트 스트립 등과 같이 평평할 수 있다. 전형적인 지지체는 비드, 예를 들어 자석에 의해 현탁액으로부터 꺼낼 수 있는 다이나비드(DYNABEADS)®과 같은 자성 폴리스티렌 비드를 포함한다. 지지체 형태는 튜브, 비드, 마이크로 비드, 웰, 플레이트, 조직 배양 플레이트, 페트리 플레이트, 마이크로 플레이트, 마이크로 타이터 플레이트, 플라스크, 스틱, 스트립, 바이알, 패들 등을 포함할 수 있다. 고체 지지체는 자성 또는 비자성일 수 있다. 당업자는 본원에서 제공되는 EEV에 결합하기 위한 많은 다른 적합한 운반체를 알 것이거나, 이를 쉽게 알 수 있을 것이다. 특정 측면에서, 본원에서 제공되는 EEV는 예를 들어, 표면에 부착된 토실기, 에폭시기, 카복실산기 또는 아미노기와의 반응을 통해 고체 지지체에 부착될 수 있다. 예를 들어, EEV는 토실-활성화 자성 비드, 예를 들어, 마이원(MYONE)™ 토실 활성화 비드의 표면에 부착될 수 있다. 별법으로, EEV는 바이오티닐화되고 스트렙타비딘 고체 표면, 예를 들어 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드에 부착될 수 있다.
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본 발명은 달리 지시되지 않는 한, 당해 분야의 기술 범위 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; 미국 특허 제4,683,195호(Mullis et al.); Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); 및 in Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)]을 참조한다).
항체 공학의 일반적인 원리는 문헌[Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press)]에 개시되어 있다. 단백질 공학의 일반적인 원리는 문헌[Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.)]에 개시되어 있다. 항체 및 항체-합텐 결합의 일반적인 원리는 문헌[Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); 및 Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.)]에 개시되어 있다. 또한, 당 업계에 공지되어 있고 구체적으로 기재되지 않은 면역학의 표준 방법은 문헌[Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) 및 Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY)]에서와 같이 따를 수 있다.
면역학의 일반적인 원리를 설명하는 표준 참고 문헌은 문헌[Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevier, Amsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunology (4th ed.; H. Freeman & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlag); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall, 2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach 및 Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press)]을 포함한다.
상기 인용된 모든 참고 문헌 및 본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전문이 본원에서 참고로 포함된다. 하기의 실시예는 예시로서 제공되는 것이지 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 융합 단백질 구성
IMP는 EEV 특이적 단백질 F13L, A56R 및 B5R을 사용하여 하기 방법에 의해 백시니아 바이러스 EEV에 편입시켰다. 일반적으로, HER2, CD100(세마포린 4D), 및 FZD4의 세포외 도메인을 도 1A에 도시된 바와 같이 단일 통과 EEV 특이적 막 단백질 A56R 및 B5R과 융합체로서 편입시켰다. 성숙 FZD4-ECD-A56R 융합 단백질은 서열 번호 6의 아미노산 20 내지 370을 포함하고, 성숙 HER2-ECD-A56R 융합 단백질은 서열 번호 7의 아미노산 20 내지 855를 포함하고, 성숙 CD100-ECD-A56R 융합 단백질은 서열 번호 8의 아미노산 20 내지 935를 포함한다. 도 1B 및 도 1C는 GPCR 및 CD20과 같은 다중 통과 단백질이 EEV 막 관련 단백질 F13L과의 융합체로서의 다중 통과 막 단백질로서 EEV에 어떻게 편입될 수 있는지를 도식적으로 나타낸다.
F13L 융합 단백질( FZD4 - F13L , CD20- F13L , 및 CXCR4 - F13L )의 제조
IMP 코딩 cDNA를 백시니아 바이러스에 도입하기 위해 이전에 기재된 pJEM1 플라스미드에 팔미토일화된 EEV 막 당단백질(서열 번호 1)을 코딩하는 백시니아 바이러스 F13L 유전자와 인프레임으로 클로닝하였다. pJEM1은 미국 특허 출원 공개 제2013/0288927호에 기재된 p7.5/tk의 유도체이고 NcoI 또는 BssHII 및 BsiWI로 분해될 경우, 백시니아 바이러스 TK 유전자와 상동 재조합 가능한 측면에 인접한 영역 및 백시니아 바이러스 H5 프로모터를 함유한다.
인간 막 단백질 MS4A1 유전자(CD20)(NM_021950.3)의 오픈 리딩 프레임은 제한 엔도뉴클레아제 부위 NcoI 및 BsiWI를 5' 및 3'-가장 측면에 인접한 프라이머 각각에 코딩함으로써 PCR 산물에 첨가하는 표준 프로토콜에 따른 SOE(Splicing by Overlap Extension: 중복 신장에 의한 스플라이싱) PCR을 사용하여 백시니아 바이러스 F13L와 인프레임으로 클로닝하였다. 이 전략은 선도 펩티드의 도입을 피한다. 최종 PCR 산물과 pJEM1을 NcoI 및 BsiWI로 분해하고 두 종을 표준 프로토콜에 따라 결찰을 통해 결합시켰다. 이어서 원형화된 플라스미드를 화학적 형질전환을 통해 컴피턴트(competent) 이. 콜라이(E. coli)에 도입하고, 앰피실린 함유 한천 플레이트에서 콜로니를 선별하였다.
Figure pct00019
폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 결과로 생성된 CD20-F13L 융합 단백질은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다.
인간 막 단백질 FZD4(NM_012193.3)의 오픈 리딩 프레임은 제한 엔도뉴클레아제 부위 BssHII 및 BsiWI를 5' 및 3'-가장 측면에 인접한 프라이머 각각에 코딩함으로써 PCR 산물에 첨가하는 표준 프로토콜에 따른 SOE(중복 신장에 의한 스플라이싱) PCR을 사용하여 백시니아 바이러스 F13L와 인프레임으로 클로닝하였다. 이 전략은 pJEM1 내에 포함된 선도 펩티드의 사용을 제공한다. 최종 PCR 산물과 pJEM1을 BssHII 및 BsiWI로 분해하고 두 종을 표준 프로토콜에 따라 결찰을 통해 결합시켰다. 이어서 원형화된 플라스미드를 화학적 형질전환을 통해 컴피턴트 이. 콜라이에 도입하고, 앰피실린 함유 한천 플레이트에서 콜로니를 선별하였다. PCR 프라이머는 FZD4 및 F13L에 특이적이었고 MS4A1에 대해 기재된 것과 동일한 일반적인 전략을 따른다. 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 결과로 생성된 성숙 FZD4-F13L 융합 단백질은 서열 번호 2의 아미노산 20-892를 포함한다.
인간 막 단백질 CXCR4(NM_001008540.1)의 오픈 리딩 프레임은 제한 엔도뉴클레아제 부위 NcoI 및 BsiWI를 5' 및 3'-가장 측면에 인접한 프라이머 각각에 코딩함으로써 PCR 산물에 첨가하는 표준 프로토콜에 따른 SOE(중복 신장에 의한 스플라이싱) PCR을 사용하여 백시니아 바이러스 F13L와 인프레임으로 클로닝하였다. 이 전략은 pJEM1 내에 선도 펩티드의 도입을 피한다. 최종 PCR 산물과 pJEM1을 NcoI 및 BsiWI로 분해하고 두 종을 표준 프로토콜에 따라 결찰을 통해 결합시켰다. 이어서 원형화된 플라스미드를 화학적 형질전환을 통해 컴피턴트 이. 콜라이에 도입하고, 앰피실린 함유 한천 플레이트에서 콜로니를 선별하였다. PCR 프라이머는 CXCR4 및 F13L에 특이적이었고 MS4A1에 대해 기재된 것과 동일한 일반적인 전략을 따른다. 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 결과로 생성된 성숙 CXCR4-F13L 융합 단백질은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
상기에 기재된 바와 같이 제조된 플라스미드 및 CD20, FZD4, CXCR4, CD100 및 HER2의 비융합("비태깅") 형태를 코딩하는 유사한 플라스미드를 선형화하고 3 분자 재조합을 통해 백시니아 바이러스에 도입하였다.
실시예 2: EEV 상에서의 CD20- F13L 융합 단백질의 발현
BHK 세포를 CD20-F13L 융합 단백질(서열 번호 4)을 코딩하는 IMV 또는 대조군 웨스턴 리저브(WR) 바이러스로 2일 동안 세포당 1 바이러스의 감염 다중도(MOI: multiplicity of infection)로 감염시킨 후 EEV를 함유하는 상등액을 수거하고 저속 원심분리로 잔해를 제거하였다. 단백질 G 다이나비드®(110 ㎕)를 자석으로 풀 다운(pull down)하고 1 ㎖의 PBS + 20 ㎍의 정제된 항-CD20 항체를 비드에 첨가하였다. 용액을 실온에서 서서히 회전시키면서 30 내지 60분 동안 인큐베이션하여 항체가 단백질 G 비드에 결합하도록 하였다. 10 ㎍의 정제된 mIgG1 이소형 대조군을 용액에 첨가하여 완전히 차단하도록 하고, 용액을 실온에서 서서히 회전시키면서 추가로 10 내지 30분 동안 인큐베이션하였다. 비드를 자석으로 풀 다운하고 1 ㎖의 PBS로 1회 세척하고 110 ㎕의 PBS에 재현탁하였다.
50 ㎕의 항-CD20-Pro G 다이나비드®를 1 ㎖의 CD20-F13L 또는 WR EEV 상등액에 첨가하고, 실온에서 서서히 회전하면서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 자석을 사용하여 비드를 펠릿화하고, 결합되지 않은 상등액을 제거하였다. 비드를 10% FBS 및 1 mM HEPES가 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium)(10% DMEM) 1 ㎖로 5회 세척하였다. 모든 세척액은 결합되지 않은 상등액("비결합")과 합하였다. 비드("결합")를 1 ㎖의 10% DMEM에 재현탁하였다. "비결합" 및 "결합"을 BSC-1 세포에서 적정하고 성장 배지 함유 메틸셀룰로오스로 덮었다. 2일 동안 플라크를 형성하도록 한 후, 세포를 고정하고 0.1% 크리스털 바이올렛 용액으로 염색하였다. 플라크를 계수하여 "비결합" 및 "결합"에서의 플라크 형성 단위(pfu: plaque forming unit) 수를 결정하고, 이로부터 비드에 결합된 EEV의 %를 계산할 수 있었다. 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure pct00020
항-CD20 코팅된 비드에 결합된 % EEV는 웨스턴 리저브의 경우보다 CD20-E13V EEV 융합 단백질의 경우에 훨씬 더 높았으며, 이는 CD20이 EEV 막 표면 상에서 발현되고 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3: CD20와 F13L의 융합체는 EEV 막 상에서 더 효율적으로 발현된다.
BHK 세포를 CD20-F13L 융합 단백질(서열 번호 4), CD20-A56R 융합 단백질(서열 번호 13), CD20 비태깅(비융합) 또는 대조군 HER2-A56R 세포외 도메인(ECD)(서열 번호 7)을 코딩하는 IMV로 MOI = 1로 2일 동안 감염시킨 후, EEV를 함유하는 상등액을 수거하고, 저속 원심분리에 의해 잔해를 제거하였다. 스트렙타비딘 다이나비드®(200 ㎕)를 자석으로 풀 다운하고 0.2 ㎖의 PBS + 20 ㎍의 정제된 바이오티닐화된 항-CD20 항체 또는 바이오티닐화된 항 HER-2를 비드에 첨가하였다. 용액을 실온에서 서서히 회전시키면서 30분 동안 인큐베이션하여 항체가 스트렙타비딘 비드에 결합하도록 하였다. 비드를 자석으로 풀 다운하고, 1 ㎖의 PBS로 1회 세척하고 200 ㎕의 PBS에 재현탁하였다.
Figure pct00021
50 ㎕의 제조된 스트렙타비딘 비드를 1 ㎖의 각 EEV 상등액에 첨가하고, 실온에서 45분 동안 회전하도록 하였다. 자석을 사용하여 비드를 펠릿화하고, 결합되지 않은 상등액을 제거하였다. 그 후, 비드를 10% FBS 및 1 mM HEPES가 보충된 DMEM 배지(10% DMEM) 1 ㎖로 5회 세척하였다. 모든 세척액은 결합되지 않은 상등액("비결합")과 합하였다. 그 후, 비드("결합")를 1 ㎖의 10% DMEM에 재현탁하였다. "비결합" 및 "결합"을 BSC-1 세포에서 적정하고 성장 배지 함유 메틸셀룰로오스로 덮었다. 2일 동안 플라크를 형성하도록 한 후, 세포를 고정하고 0.1% 크리스털 바이올렛 용액으로 염색하였다. 플라크를 계수하여 "비결합" 및 "결합"에서의 플라크 형성 단위(pfu) 수를 결정하고, 이로부터 비드에 결합된 EEV의 %를 계산할 수 있었다. 결과를 도 2에 나타낸다.
CD20-F13L에 대한 항-CD20 코팅된 비드에 결합된 EEV %는 비태깅된(비융합된) 또는 A56R-융합된 CD20에 대해 결합된 EEV % 결합보다 컸으며, 이는 EEV 막 상에서 CD20-F13L이 높이 발현되었음을 나타낸다. 항-HER2 코팅된 비드에 대한 결합이 없는 것으로 분석의 특이성을 확인하였다.
CD20-F13L 융합 단백질(서열 번호 4), CD20 비태깅(비융합), FZD-F13L 융합 단백질(서열 번호 2), 및 FZD 비태깅(비융합)을 사용하여 상기 실험을 반복하였다. 상기에 기재된 바와 같이 항-CD20 또는 항-FZD 코팅된 비드를 사용하여 바이러스를 풀 다운하였다. 도 3A(항-CD20 코팅된 비드)및 도 3B(항-FZD 코팅된 비드)의 데이터는 F13L 융합 단백질이 각각의 항체에 의해 특이적으로 풀 다운되었으며 비태깅(비융합) 단백질보다 백시니아 바이러스에 더 효율적으로 편입되었음을 보여준다.
실시예 4: 백시니아 바이러스는 다양한 항원- EEV 구조물을 발현하도록 조 작될 수 있다.
BHK 세포를 하기 항원 구조물을 발현하는 바이러스로 MOI = 1로 감염시켰다: CD20-F13L(서열 번호 4), CXCR4-F13L(서열 번호 3), HER2-ECD-A56R(서열 번호 7), 및 CD100-ECD-A56R(서열 번호 8). 2일 후, EEV를 함유하는 상등액을 수거하고, 저속 원심분리에 의해 잔해를 제거하였다. 스트렙타비딘 다이나비드®를 자석으로 풀 다운하고 각 샘플에 대해, 50 ㎕의 비드를 0.1 ㎖의 PBS + 5 ㎍의 정제된 바이오티닐화된 항-CD20 항체, 바이오티닐화된 항-CXCR4(12G5), 바이오티닐화된 항-CD100(2503), 또는 바이오티닐화된 항-HER2에 첨가하였다. 용액을 실온에서 서서히 회전시키면서 30분 동안 인큐베이션하여 항체가 스트렙타비딘 비드에 결합하도록 하였다. 비드를 자석으로 풀 다운하고, 1 ㎖의 PBS로 1회 세척하고 100 ㎕의 PBS에 재현탁하였다.
100 ㎕의 제조된 스트렙타비딘 비드를 1 ㎖의 각 EEV 상등액에 첨가하고, 실온에서 45분 동안 회전시켰다. 자석을 사용하여 비드를 펠릿화하고, 결합되지 않은 상등액을 제거하였다. 그 후, 비드를 10% FBS 및 1 mM HEPES가 보충된 DMEM 배지(10% DMEM) 1 ㎖로 5회 세척하였다. 모든 세척액은 결합되지 않은 상등액("비결합")과 합하였다. 그 후, 비드("결합")를 1 ㎖의 10% DMEM에 재현탁하였다. "비결합" 및 "결합"을 BSC-1 세포에서 적정하고 성장 배지 함유 메틸셀룰로오스로 덮었다. 2일 동안 플라크를 형성하도록 한 후, 세포를 고정하고 0.1% 크리스털 바이올렛 용액으로 염색하였다. 플라크를 계수하여 "비결합" 및 "결합"에서의 플라크 형성 단위(pfu) 수를 결정하고, 이로부터 비드에 결합된 EEV의 %를 계산할 수 있었다. 결과를 도 4에 나타낸다.
모든 항원-EEV는 상응하는 항체-결합된 비드에 특이적으로 결합하였으며, 이는 EEV 막 상에서 항원이 효율적으로 발현되었음을 나타낸다.
실시예 5: 항체 선별을 위해 항원- EEV를 자성 비드에 직접 결합시킬 수 있다.
BHK 세포(2 x 108개 세포)를 하나의 셀스택(cellSTACK) 세포 배양 챔버(Corning)에서 HER2-ECD-A56R(서열 번호 7), FZD-F13L(서열 번호 2), CXCR4-F13L(서열 번호 3) 또는 CD100(세마포린 4D)-ECD-A56R(서열 번호 8)을 발현하는 바이러스로 MOI = 1로 각각 감염시켰다. 2일 후, EEV를 함유하는 상등액을 수거하고, 저속 원심분리에 의해 잔해를 제거하였다. 이어서, 청정화된 상등액을 13,000 rpm(28,000 x g)에서 1시간 동안 회전시켜 항원-EEV를 펠릿화하였다. 상등액을 흡인하고 펠릿을 1.5 ㎖의 1X PBS에 재현탁하였다. 각각의 바이러스를 새로운 튜브로 옮기고 소랄렌(트리옥살렌, 4'-아미노메틸-, 히드로클로라이드)(Sigma)을 최종 농도 20 ㎍/㎖로 첨가하였다. EEV와 소랄렌을 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후 스트라타링커 UV 크로스링커(STRATALINKER UV Crosslinker)(Stratagene)에서 99,999 마이크로줄로 조사하였다. 소랄렌/UV 절차는 항원-EEV가 불활성화되어 모든 하류 검사에서 플라크를 형성하거나 증식할 수 없도록 한다.
토실 활성화된 마이원 다이나비드®(100 ㎕)를 자석으로 풀 다운하고 1 ㎖의 PBS로 세척하였다. 비드를 자석으로 풀 다운하고, PBS를 제거하고 각각의 솔라렌/UV 불활성화된 항원-EEV 1 ㎖를 별개의 비드 분액에 첨가하였다. 비드와 항원-EEV를 37℃에서 16 내지 20시간 동안 회전하도록 하였다. 비드를 펠릿화하고 상등액을 제거하였다. 비드를 1 ㎖의 1X PBS, 10% FBS 및 0.5% BSA로 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 비드를 펠릿화하고 1 ㎖의 1X PBS로 세척한 후 200 ㎕의 1X PBS에 재현탁하였다.
100 ㎕의 항원-EEV 결합된 비드를 항-FZD4, 항-CXCR4, 항-CD100, 또는 항-HER2를 발현하는 1 ㎖의 각 항체-EEV 상등액, 및 대조군 항체-EEV에 첨가하였다. BHK 세포를 각 항체의 중쇄 및 경쇄 모두를 코딩하는 백시니아 바이러스로 2일 동안 각각 MOI = 1로 감염시키고, 상등액을 수거한 후 저속 회전에 의해 모든 세포를 제거함으로써 항체 EEV를 생성하였다. 바이러스 결합된 비드와 항체 EEV를 실온에서 2시간 동안 회전하도록 하였다. 자석을 사용하여 비드를 펠릿화하고, 결합되지 않은 상등액을 제거하였다. 그 후, 비드를 10% FBS 및 1 mM HEPES가 보충된 DMEM 배지(10% DMEM) 1 ㎖로 5회 세척하였다. 모든 세척액은 결합되지 않은 상등액("비결합")과 합하였다. 그 후, 비드("결합")를 1 ㎖의 10% DMEM에 재현탁하였다. "비결합" 및 "결합"을 BSC-1 세포에서 적정하고 성장 배지 함유 메틸셀룰로오스로 덮었다. 2일 동안 플라크를 형성하도록 한 후, 세포를 고정하고 0.1% 크리스털 바이올렛 용액으로 염색하였다. 플라크를 계수하여 "비결합" 및 "결합"에서의 플라크 형성 단위(pfu) 수를 결정하고, 이로부터 비드에 결합된 EEV의 %를 계산할 수 있었다. 상기 방법의 다이어그램을 도 5에 나타내고 결과를 도 6A(HER2), 도 6B(FZD4), FIG. 6C(CXCR4), 및 도 6D(CD100("세마"))에 나타낸다.
항-HER2를 발현하는 항체-EEV는 HER2-ECD-A56R 항원 EEV와 결합된 비드로 특이적으로 풀 다운하였고, 항-FZD를 발현하는 항체-EEV는 FZD-F13L 항원 EEV와 결합된 비드로 특이적으로 풀 다운하였고, 항-CXCR4를 발현하는 항체-EEV는 CXCR4-F13L 항원 EEV와 결합된 비드로 특이적으로 풀 다운하였고, 항-세마를 발현하는 항체-EEV는 세마-ECD-A56R 항원 EEV와 결합된 비드로 특이적으로 풀 다운하였다.
실시예 6: 항체 라이브러리 스크리닝
BHK 세포를 4개의 셀스택 세포 배양 챔버(Corning)(스태커(stacker) 당 2 x 108개 세포)에서 항체 라이브러리(H-IgG-A56R) 및 L48(생식세포 VK1-39의 유도체)로 각각 MOI = 1로 감염시켰다. 항체 라이브러리는 A56R에 인프레임으로 융합된 전장 IgG 포맷의 중쇄 가변 도메인의 다양한 집단을 포함하였다(본원에서 그 전문이 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2013-0288927호 참조). 이 라이브러리의 다양성은 약 4억개의 독립 클론이었다. 2일 후, EEV를 함유하는 상등액을 수거하고, 저속 원심분리에 의해 잔해를 제거하였다. 이어서, 청정화된 상등액을 13,000 rpm(28,000 x g)에서 1시간 동안 회전시켜 항체-EEV를 펠릿화하였다. 항체-EEV를 10% FBS가 함유된 1 ㎖의 EMEM에 재현탁하고 사용할 준비가 될 때까지 4℃에서 보관하였다. 패닝을 위한 항원 바이러스를 제조하기 위해, BHK 세포(2 × 108개 세포)를 2개의 셀스택 세포 배양 챔버(Corning)에서 FZD4-ECD-A56R(서열 번호 6)을 발현하는 바이러스로 MOI = 1.5로 감염시켰다. 2일 후, EEV를 함유하는 상등액을 수거하고, 저속 원심분리에 의해 잔해를 제거하였다. 이어서, 청정화된 상등액을 13,000 rpm(28,000 x g)에서 1시간 동안 회전시켜 항원-EEV를 펠릿화하였다. 상등액을 흡인하고 펠릿을 1.0 ㎖의 1X PBS에 재현탁하였다. 1 ㎖의 FZD4-ECD-A56R EEV를 새로운 튜브로 옮기고 소랄렌(트리옥살렌, 4'-아미노메틸-, 히드로클로라이드)(Sigma)을 최종 농도 40 ㎍/㎖로 첨가하였다. EEV와 소랄렌을 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후 스트라타링커 UV 크로스링커(Stratagene)에서 99,999 마이크로줄로 조사하였다. 소랄렌/UV 절차는 항원-EEV가 불활성화되어 모든 하류 검사에서 플라크를 형성하거나 증식할 수 없도록 한다.
토실 활성화된 마이원 다이나비드®(150 ㎕)를 자석으로 풀 다운하고 1 ㎖의 PBS로 2회 세척하였다. 비드를 자석으로 풀 다운하고, PBS를 제거하고 1 ㎖의 솔라렌/UV 불활성화된 FZD4-ECD-A56R을 비드에 첨가하였다. 비드와 항원-EEV를 37℃에서 18 내지 20시간 동안 회전하도록 하였다. 비드를 펠릿화하고 상등액을 제거하였다. 비드를 1 ㎖의 1X PBS, 10% FBS 및 0.5% BSA로 37℃에서 2시간 동안 차단하였다. 비드를 펠릿화하고 1 ㎖의 1X PBS로 세척한 후 150 ㎕의 1X PBS에 재현탁하였다.
50 ㎕의 FZD4-ECD-A56R 결합된 비드를 1 ㎖의 항체-EEV 라이브러리에 첨가하였다. FZD4-ECD-A56R 결합된 비드와 항체 EEV를 실온에서 2시간 동안 회전하도록 하였다. 자석을 사용하여 비드를 펠릿화하고, 결합되지 않은 상등액을 제거하였다. 그 후, 비드를 10% FBS 및 1 mM HEPES가 보충된 DMEM 배지(10% DMEM) 1 ㎖로 5회 세척하였다. 모든 세척액은 결합되지 않은 상등액("비결합")과 합하였다. 그 후, 비드("결합")를 1 ㎖의 10% DMEM에 재현탁하였다. "비결합" 및 "결합"을 BSC-1 세포에서 적정하고 성장 배지 함유 메틸셀룰로오스로 덮었다. 2일 동안 플라크를 형성하도록 한 후, 세포를 고정하고 0.1% 크리스털 바이올렛 용액으로 염색하였다. 남아있는 결합된 바이러스(990 ㎕)를 합류(confluent) BSC1 세포를 함유하는 5개의 T175 플라스크에 나누고 1 mg/㎖ G418을 함유하는 DMEM 2.5%에서 3일 동안 증폭하도록 하였다. 그 후 세포를 수거하고 3 사이클의 동결/해동으로 바이러스를 방출시키고 바이러스 역가를 측정하였다.
제2 라운드 선별(Rd2)을 위해, 라운드 1로부터 증폭된 중쇄를 새로운 L48과 함께 하나의 셀스택의 BHK에 공동 감염시켰다. 항체 EEV를 상기에 기재된 바와 같이 수거하였다. 패닝의 각 라운드에 대해, 새로운 FZD-ECD-A56R 항원 바이러스를 상기에 기재된 바와 같이 생산하고, 농축하고, 비활성화하고, 비드에 결합시켰다. 50 ㎕의 FZD4-ECD-A56R 결합된 비드를 1 ㎖의 항체-EEV Rd2에 첨가하였다. FZD4-ECD-A56R 결합된 비드와 항체 EEV를 실온에서 2시간 동안 회전하도록 하였다. 자석을 사용하여 비드를 펠릿화하고, 결합되지 않은 상등액을 제거하였다. 그 후, 비드를 10% FBS 및 1 mM HEPES가 보충된 DMEM 배지(10% DMEM) 1 ㎖로 5회 세척하였다. 모든 세척액은 결합되지 않은 상등액("비결합")과 합하였다. 그 후, 비드("결합")를 1 ㎖의 10% DMEM에 재현탁하였다. "비결합" 및 "결합"을 BSC-1 세포에서 적정하고 성장 배지 함유 메틸셀룰로오스로 덮었다. 2일 동안 플라크를 형성하도록 한 후, 세포를 고정하고 0.1% 크리스털 바이올렛 용액으로 염색하였다. 남아있는 결합된 바이러스(990 ㎕)를 합류 BSC1 세포를 함유하는 5개의 T175 플라스크에 나누어서 1mg/㎖ G418을 함유하는 DMEM 2.5%에서 3일 동안 증폭하도록 하였다. 그 후 세포를 수거하고 3 사이클의 동결/해동으로 바이러스를 방출시키고 바이러스 역가를 측정하였다.
패닝의 추가 3 사이클(Rd3, Rd4, 및 Rd5)을 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다.
라운드 3, 4 및 5는 6웰 플레이트에서 각각 증폭된 VH 라운드 및 L48로 moi = 1에서 감염된 A431 세포에 의한 증식에 대해 시험하였다. 밤새 감염시킨 후 세포를 수거하고 반으로 나누었다. 절반은 10 ㎍/㎖ FZD-His로 염색한 다음 항-His-다이라이트650 및 항-Fab-FITC로 염색하였다. 다른 절반은 10 ㎍/㎖ CD100-His(음성 대조군)로 염색한 후 항-His-다이라이트650 및 항-Fab-FITC로 염색하였다. 도 7에 나타낸 데이터는 선별 라운드마다 증식의 증가를 나타낸다. 라운드 5의 항체를 포유동물 발현 벡터에 서브클로닝하여 전장의 가용성 IgG로서 발현시키고(포유동물 발현 벡터 내 L48과 함께) 형질감염시켰다. 상등액에 존재하는 생성된 항체가 FZD4 형질감염된 CHO 세포와 결합한다는 것과 CXCR4 형질감염된 CHO 세포와 결합하지 않는다는 것에 대해 유동 세포 계측법으로 시험하였다. FZD에 특이적으로 결합하는 많은 항체를 확인하였다.
실시예 7: 이중 태그/항원- EEV를 자성 비드에 결합시킬 수 있다.
BHK 세포를 그의 표면에 HA 태그와 FZD4 항원을 둘 다 발현하는 EEV를 얻기 위해 세포당 2가지의 비리온 - 하나의 비리온은 헤마글루티닌 태그 (HA)-A56R(서열 번호 14)이고 두 번째는 FZD4-F13L(서열 번호 2)-으로 감염시키거나 각각의 바이러스로 세포당 하나의 비리온으로 감염시켰다. 2일 후, EEV를 함유하는 상등액을 수거하고, 저속 원심분리에 의해 잔해를 제거하였다. 단백질 G 자성 비드(150 ㎕)를 자석으로 풀 다운하고 1 ㎖의 PBS + 30 ㎍의 정제된 항-FZD4 항체(C6073)를 비드에 첨가하였다. 용액을 실온에서 서서히 회전시키면서 25분 동안 인큐베이션하여 항체가 단백질 G 비드에 결합하도록 하였다. 비드를 자석으로 풀 다운하고 1 ㎖의 PBS로 1회 세척하고 300 ㎕의 DMEM + 10% FBS에 재현탁하였다. 항-HA-태그 자성 비드(ThermoFisher, 150 ㎕)를 자석으로 풀 다운하고 1 ㎖의 PBS로 1회 세척한 후 150 ㎕의 PBS에 재현탁하였다.
Figure pct00022
50 ㎕의 제조된 항-HA-태그 비드 또는 100 ㎕의 제조된 항-FZD4 단백질 G를 1 ㎖의 각 EEV 상등액에 첨가하고, 실온에서 60분 동안 회전하도록 하였다. 자석을 사용하여 비드를 펠릿화하고, 결합되지 않은 상등액을 제거하였다. 그 후, 비드를 10% FBS 및 1 mM HEPES가 보충된 DMEM 배지(10% DMEM) 1 ㎖로 5회 세척하였다. 모든 세척액은 결합되지 않은 상등액("비결합")과 합하였다. 그 후, 비드("결합")를 1 ㎖의 10% DMEM에 재현탁하였다. "비결합" 및 "결합"을 BSC-1 세포에서 적정하고 성장 배지 함유 메틸셀룰로오스로 덮었다. 2일 동안 플라크를 형성하도록 한 후, 세포를 고정하고 0.1% 크리스털 바이올렛 용액으로 염색하였다. 플라크를 계수하여 "비결합" 및 "결합"에서의 플라크 형성 단위(pfu) 수를 결정하고, 이로부터 비드에 결합된 EEV의 %를 계산할 수 있었다. 결과를 도 8에 나타낸다. 어느 한 항체에 의해서 두 융합 단백질 모두를 발현하는 EEV를 풀 다운하였다.
실시예 8: 이중 태그/항원- EEV를 자성 비드에 결합시켜 mAb EEV를 포획하는 데 사용할 수 있다.
BHK 세포(2x 108개 세포)를 그의 표면에 HA 태그와 FZD4 항원을 둘 다 발현하는 EEV를 얻기 위해 세포당 2가지의 비리온 - 하나의 비리온은 HA-A56R(서열 번호 14)이고 두 번째는 CXCR4-F13L(서열 번호 3)-으로 감염시켰다. 2일 후, EEV를 함유하는 상등액을 수거하고, 저속 원심분리에 의해 잔해를 제거하였다. 이어서, 청정화된 상등액을 13,000 rpm(28,000 x g)에서 1시간 동안 회전시켜 태그/항원-EEV를 펠릿화하였다. 상등액을 흡인하고 펠릿을 1 ㎖의 1X PBS에 재현탁하였다. 소랄렌(트리옥살렌, 4'-아미노메틸-, 히드로클로라이드)(Sigma)을 최종 농도 40 ㎍/㎖로 첨가하였다. EEV와 소랄렌을 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후 스트라타링커 UV 크로스링커(Stratagene)에서 99,999 마이크로줄로 2회 조사하였다. 소랄렌/UV 절차는 항원-EEV가 불활성화되어 모든 하류 검사에서 플라크를 형성하거나 증식할 수 없도록 한다.
BHK 세포를 세포당 2가지의 비리온 - 하나의 비리온은 특이적 중쇄이고 두 번째는 특이적 경쇄-으로 감염시켜 항-CXCR4 EEV 및 항-HER2 mAb EEV를 생성하였다. 2일 후, 항-CXCR4 EEV 및 항-HER2 EEV를 함유하는 상등액을 수거하고, 저속 원심분리에 의해 잔해를 제거하였다.
300 ㎕의 항-HA 자성 비드를 1 ㎖의 PBS로 세척한 후, 1 ㎖의 소랄렌/UV 불활성화된 HA/CXCR4 EEV에 재현탁하였다. 비드와 EEV를 실온에서 서서히 회전시키면서 90분 동안 인큐베이션하여 EEV가 항-HA 비드와 결합하도록 하였다. 비드를 자석으로 풀 다운하고 1 ㎖의 PBS로 1회 세척하고 300 ㎕의 PBS에 재현탁하였다.
항-HA 비드에 결합된 HA/CXCR4 EEV 100 ㎕를 1 ㎖의 각 mAb 항체 EEV 상등액에 첨가하고, 실온에서 서서히 회전시키면서 1 내지 1.5시간 동안 인큐베이션 하였다. 자석을 사용하여 비드를 펠릿화하고, 결합되지 않은 상등액을 제거하였다. 그 후, 비드를 10% FBS 및 1 mM HEPES가 보충된 DMEM 배지(10% DMEM) 1 ㎖로 5회 세척하였다. 모든 세척액은 결합되지 않은 상등액("비결합")과 합하였다. 그 후, 비드("결합")를 1 ㎖의 10% DMEM에 재현탁하였다. "비결합" 및 "결합"을 BSC-1 세포에서 적정하고 성장 배지 함유 메틸셀룰로오스로 덮었다. 2일 동안 플라크를 형성하도록 한 후, 세포를 고정하고 0.1% 크리스털 바이올렛 용액으로 염색하였다. 플라크를 계수하여 "비결합" 및 "결합"에서의 플라크 형성 단위(pfu) 수를 결정하고, 이로부터 비드에 결합된 EEV의 %를 계산할 수 있었다. 결과를 도 9에 나타낸다. HA-A45R 및 CXCR4-F13L을 공동 발현하는 EEV로 코팅된 비드로 항-CXCR4 EEV를 특이적으로 포획하였다.
실시예 9: 항원- EEV를 자성 비드에 결합시키기 위해 바이오티닐 화할 수 있다.
BHK 세포를 FZD4-F13L, FZD4-ECD-A56R 또는 CD20-F13L을 발현하는 바이러스로 MOI = 1로 감염시켰다. 2일 후, EEV를 함유하는 상등액을 수거하고, 저속 원심분리에 의해 잔해를 제거하였다. 이어서, 청정화된 상등액을 13,000 rpm에서 1시간 동안 회전시켜 항원-EEV를 펠릿화하였다. 상등액을 흡인하고 펠릿을 1 내지 2 ㎖의 1X PBS에 재현탁하였다. EEV를 바이오티닐화하기 위해서, 1X PBS 중 바이오틴-XX SSE 저장 용액(플루오레포터(FLUOREPORTER)® 세포 표면 바이오티닐화 키트(Molecular Probes)) 2.5 ㎕를 PBS 중의 각 EEV 1 ㎖에 첨가하고 얼음에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕의 1 M 트리스(Tris), pH 8을 첨가하여 각 반응을 켄칭시켰다.
바이오틴-EEV를 비드에 결합시키기 위해, 150 ㎕의 스트렙타비딘 다이나비드®를 펠릿화하고 1 ㎖의 1X PBS로 1회 세척하였다. 비드를 150 ㎕에 재현탁하고 50 ㎕를 10% FBS 및 1 mM HEPES를 함유하는 이글 최소 필수 배지(EMEM)(10% EMEM) 1 ㎖에 첨가하였다. 50 ㎕의 바이오틴-EEV를 비드와 배지에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 회전하도록 하였다. 자석을 사용하여 비드를 펠릿화하고, 결합되지 않은 상등액을 제거하였다. 그 후, 비드를 10% FBS 및 1 mM HEPES가 보충된 DMEM 배지(10% DMEM) 1 ㎖로 5회 세척하였다. 모든 세척액은 결합되지 않은 상등액("비결합")과 합하였다. 그 후, 비드("결합")를 1 ㎖의 10% DMEM에 재현탁하였다. "비결합" 및 "결합"을 BSC-1 세포에서 적정하고 성장 배지 함유 메틸셀룰로오스로 덮었다. 2일 동안 플라크를 형성하도록 한 후, 세포를 고정하고 0.1% 크리스털 바이올렛 용액으로 염색하였다. 플라크를 계수하여 "비결합" 및 "결합"에서의 플라크 형성 단위(pfu) 수를 결정하고, 이로부터 비드에 결합된 EEV의 %를 계산할 수 있었다. 결과를 도 10에 나타낸다.
항원-EEV를 바이오티닐화하고, 자성 스트렙타비딘 비드에 결합시킬 수 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Smith, Ernest S. Paris, Mark Scrivens, Maria G.M. Kirk, Renee A. Moksa-Cornelison, Angelica A. <120> Integral Membrane Protein Display on Poxvirus Extracellular Enveloped Virions <130> 58008-165443 <140> PCT/US2017/028787 <141> 2017-04-21 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 372 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F13L <400> 1 Met Trp Pro Phe Ala Ser Val Pro Ala Gly Ala Lys Cys Arg Leu Val 1 5 10 15 Glu Thr Leu Pro Glu Asn Met Asp Phe Arg Ser Asp His Leu Thr Thr 20 25 30 Phe Glu Cys Phe Asn Glu Ile Ile Thr Leu Ala Lys Lys Tyr Ile Tyr 35 40 45 Ile Ala Ser Phe Cys Cys Asn Pro Leu Ser Thr Thr Arg Gly Ala Leu 50 55 60 Ile Phe Asp Lys Leu Lys Glu Ala Ser Glu Lys Gly Ile Lys Ile Ile 65 70 75 80 Val Leu Leu Asp Glu Arg Gly Lys Arg Asn Leu Gly Glu Leu Gln Ser 85 90 95 His Cys Pro Asp Ile Asn Phe Ile Thr Val Asn Ile Asp Lys Lys Asn 100 105 110 Asn Val Gly Leu Leu Leu Gly Cys Phe Trp Val Ser Asp Asp Glu Arg 115 120 125 Cys Tyr Val Gly Asn Ala Ser Phe Thr Gly Gly Ser Ile His Thr Ile 130 135 140 Lys Thr Leu Gly Val Tyr Ser Asp Tyr Pro Pro Leu Ala Thr Asp Leu 145 150 155 160 Arg Arg Arg Phe Asp Thr Phe Lys Ala Phe Asn Ser Ala Lys Asn Ser 165 170 175 Trp Leu Asn Leu Cys Ser Ala Ala Cys Cys Leu Pro Val Ser Thr Ala 180 185 190 Tyr His Ile Lys Asn Pro Ile Gly Gly Val Phe Phe Thr Asp Ser Pro 195 200 205 Glu His Leu Leu Gly Tyr Ser Arg Asp Leu Asp Thr Asp Val Val Ile 210 215 220 Asp Lys Leu Lys Ser Ala Lys Thr Ser Ile Asp Ile Glu His Leu Ala 225 230 235 240 Ile Val Pro Thr Thr Arg Val Asp Gly Asn Ser Tyr Tyr Trp Pro Asp 245 250 255 Ile Tyr Asn Ser Ile Ile Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gly Val Lys Ile 260 265 270 Arg Leu Leu Val Gly Asn Trp Asp Lys Asn Asp Val Tyr Ser Met Ala 275 280 285 Thr Ala Arg Ser Leu Asp Ala Leu Cys Val Gln Asn Asp Leu Ser Val 290 295 300 Lys Val Phe Thr Ile Gln Asn Asn Thr Lys Leu Leu Ile Val Asp Asp 305 310 315 320 Glu Tyr Val His Ile Thr Ser Ala Asn Phe Asp Gly Thr His Tyr Gln 325 330 335 Asn His Gly Phe Val Ser Phe Asn Ser Ile Asp Lys Gln Leu Val Ser 340 345 350 Glu Ala Lys Lys Ile Phe Glu Arg Asp Trp Val Ser Ser His Ser Lys 355 360 365 Ser Leu Lys Ile 370 <210> 2 <211> 892 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FZD (FL) - F13L Fusion Protein <400> 2 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Phe Gly Asp Glu Glu Glu Arg Arg Cys Asp Pro Ile Arg 20 25 30 Ile Ser Met Cys Gln Asn Leu Gly Tyr Asn Val Thr Lys Met Pro Asn 35 40 45 Leu Val Gly His Glu Leu Gln Thr Asp Ala Glu Leu Gln Leu Thr Thr 50 55 60 Phe Thr Pro Leu Ile Gln Tyr Gly Cys Ser Ser Gln Leu Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Cys Ser Val Tyr Val Pro Met Cys Thr Glu Lys Ile Asn Ile Pro 85 90 95 Ile Gly Pro Cys Gly Gly Met Cys Leu Ser Val Lys Arg Arg Cys Glu 100 105 110 Pro Val Leu Lys Glu Phe Gly Phe Ala Trp Pro Glu Ser Leu Asn Cys 115 120 125 Ser Lys Phe Pro Pro Gln Asn Asp His Asn His Met Cys Met Glu Gly 130 135 140 Pro Gly Asp Glu Glu Val Pro Leu Pro His Lys Thr Pro Ile Gln Pro 145 150 155 160 Gly Glu Glu Cys His Ser Val Gly Thr Asn Ser Asp Gln Tyr Ile Trp 165 170 175 Val Lys Arg Ser Leu Asn Cys Val Leu Lys Cys Gly Tyr Asp Ala Gly 180 185 190 Leu Tyr Ser Arg Ser Ala Lys Glu Phe Thr Asp Ile Trp Met Ala Val 195 200 205 Trp Ala Ser Leu Cys Phe Ile Ser Thr Ala Phe Thr Val Leu Thr Phe 210 215 220 Leu Ile Asp Ser Ser Arg Phe Ser Tyr Pro Glu Arg Pro Ile Ile Phe 225 230 235 240 Leu Ser Met Cys Tyr Asn Ile Tyr Ser Ile Ala Tyr Ile Val Arg Leu 245 250 255 Thr Val Gly Arg Glu Arg Ile Ser Cys Asp Phe Glu Glu Ala Ala Glu 260 265 270 Pro Val Leu Ile Gln Glu Gly Leu Lys Asn Thr Gly Cys Ala Ile Ile 275 280 285 Phe Leu Leu Met Tyr Phe Phe Gly Met Ala Ser Ser Ile Trp Trp Val 290 295 300 Ile Leu Thr Leu Thr Trp Phe Leu Ala Ala Gly Leu Lys Trp Gly His 305 310 315 320 Glu Ala Ile Glu Met His Ser Ser Tyr Phe His Ile Ala Ala Trp Ala 325 330 335 Ile Pro Ala Val Lys Thr Ile Val Ile Leu Ile Met Arg Leu Val Asp 340 345 350 Ala Asp Glu Leu Thr Gly Leu Cys Tyr Val Gly Asn Gln Asn Leu Asp 355 360 365 Ala Leu Thr Gly Phe Val Val Ala Pro Leu Phe Thr Tyr Leu Val Ile 370 375 380 Gly Thr Leu Phe Ile Ala Ala Gly Leu Val Ala Leu Phe Lys Ile Arg 385 390 395 400 Ser Asn Leu Gln Lys Asp Gly Thr Lys Thr Asp Lys Leu Glu Arg Leu 405 410 415 Met Val Lys Ile Gly Val Phe Ser Val Leu Tyr Thr Val Pro Ala Thr 420 425 430 Cys Val Ile Ala Cys Tyr Phe Tyr Glu Ile Ser Asn Trp Ala Leu Phe 435 440 445 Arg Tyr Ser Ala Asp Asp Ser Asn Met Ala Val Glu Met Leu Lys Ile 450 455 460 Phe Met Ser Leu Leu Val Gly Ile Thr Ser Gly Met Trp Ile Trp Ser 465 470 475 480 Ala Lys Thr Leu His Thr Trp Gln Lys Cys Ser Asn Arg Leu Val Asn 485 490 495 Ser Gly Lys Val Lys Arg Glu Lys Arg Gly Asn Gly Trp Val Lys Pro 500 505 510 Gly Lys Gly Ser Glu Thr Val Val Met Trp Pro Phe Ala Ser Val Pro 515 520 525 Ala Gly Ala Lys Cys Arg Leu Val Glu Thr Leu Pro Glu Asn Met Asp 530 535 540 Phe Arg Ser Asp His Leu Thr Thr Phe Glu Cys Phe Asn Glu Ile Ile 545 550 555 560 Thr Leu Ala Lys Lys Tyr Ile Tyr Ile Ala Ser Phe Cys Cys Asn Pro 565 570 575 Leu Ser Thr Thr Arg Gly Ala Leu Ile Phe Asp Lys Leu Lys Glu Ala 580 585 590 Ser Glu Lys Gly Ile Lys Ile Ile Val Leu Leu Asp Glu Arg Gly Lys 595 600 605 Arg Asn Leu Gly Glu Leu Gln Ser His Cys Pro Asp Ile Asn Phe Ile 610 615 620 Thr Val Asn Ile Asp Lys Lys Asn Asn Val Gly Leu Leu Leu Gly Cys 625 630 635 640 Phe Trp Val Ser Asp Asp Glu Arg Cys Tyr Val Gly Asn Ala Ser Phe 645 650 655 Thr Gly Gly Ser Ile His Thr Ile Lys Thr Leu Gly Val Tyr Ser Asp 660 665 670 Tyr Pro Pro Leu Ala Thr Asp Leu Arg Arg Arg Phe Asp Thr Phe Lys 675 680 685 Ala Phe Asn Ser Ala Lys Asn Ser Trp Leu Asn Leu Cys Ser Ala Ala 690 695 700 Cys Cys Leu Pro Val Ser Thr Ala Tyr His Ile Lys Asn Pro Ile Gly 705 710 715 720 Gly Val Phe Phe Thr Asp Ser Pro Glu His Leu Leu Gly Tyr Ser Arg 725 730 735 Asp Leu Asp Thr Asp Val Val Ile Asp Lys Leu Lys Ser Ala Lys Thr 740 745 750 Ser Ile Asp Ile Glu His Leu Ala Ile Val Pro Thr Thr Arg Val Asp 755 760 765 Gly Asn Ser Tyr Tyr Trp Pro Asp Ile Tyr Asn Ser Ile Ile Glu Ala 770 775 780 Ala Ile Asn Arg Gly Val Lys Ile Arg Leu Leu Val Gly Asn Trp Asp 785 790 795 800 Lys Asn Asp Val 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295 300 Lys Asn Asn Asp Gln Tyr Lys Phe His Lys Leu Leu Pro 305 310 315 <210> 10 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FZD-B5R (short) <400> 10 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala Tyr Ala Phe Gly Asp Glu Glu Glu Arg Arg Cys Asp Pro Ile Arg 20 25 30 Ile Ser Met Cys Gln Asn Leu Gly Tyr Asn Val Thr Lys Met Pro Asn 35 40 45 Leu Val Gly His Glu Leu Gln Thr Asp Ala Glu Leu Gln Leu Thr Thr 50 55 60 Phe Thr Pro Leu Ile Gln Tyr Gly Cys Ser Ser Gln Leu Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Cys Ser Val Tyr Val Pro Met Cys Thr Glu Lys Ile Asn Ile Pro 85 90 95 Ile Gly Pro Cys Gly Gly Met Cys Leu Ser Val Lys Arg Arg Cys Glu 100 105 110 Pro Val Leu Lys Glu Phe Gly Phe Ala Trp Pro Glu Ser Leu Asn Cys 115 120 125 Ser Lys Phe Pro Pro Gln Asn Asp His Asn His Met Cys Met Glu Gly 130 135 140 Pro Gly Asp Glu Glu Val Pro Leu Pro His Lys Thr Pro Ile Gln Pro 145 150 155 160 Gly Glu Glu Cys His Ser Val Gly Thr Asn Ser Asp Gln Tyr Ile Trp 165 170 175 Val Lys Arg Ser Leu Asn Cys Val Leu Lys Cys Gly Tyr Asp Ala Gly 180 185 190 Leu Tyr Ser Arg Ser Ala Lys Glu Cys Ala Thr Tyr His Ile Ile Ile 195 200 205 Val Ala Leu Thr Ile Met Gly Val Ile Phe Leu Ile Ser Val Ile Val 210 215 220 Leu Val Cys Ser Cys Asp Lys Asn Asn Asp Gln Tyr Lys Phe His Lys 225 230 235 240 Leu Leu Pro <210> 11 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FZD-B5R (long) <400> 11 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala Tyr Ala Phe Gly Asp Glu Glu Glu Arg Arg Cys Asp Pro Ile Arg 20 25 30 Ile Ser Met Cys Gln Asn Leu Gly Tyr Asn Val Thr Lys Met Pro Asn 35 40 45 Leu Val Gly His Glu Leu Gln Thr Asp Ala Glu Leu Gln Leu Thr Thr 50 55 60 Phe Thr Pro Leu Ile Gln Tyr Gly Cys Ser Ser Gln Leu Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Cys Ser Val Tyr Val Pro Met Cys Thr Glu Lys Ile Asn Ile Pro 85 90 95 Ile Gly Pro Cys Gly Gly Met Cys Leu Ser Val Lys Arg Arg Cys Glu 100 105 110 Pro Val Leu Lys Glu Phe Gly Phe Ala Trp Pro Glu Ser Leu Asn Cys 115 120 125 Ser Lys Phe Pro Pro Gln Asn Asp His Asn His Met Cys Met Glu Gly 130 135 140 Pro Gly Asp Glu Glu Val Pro Leu Pro His Lys Thr Pro Ile Gln Pro 145 150 155 160 Gly Glu Glu Cys His Ser Val Gly Thr Asn Ser Asp Gln Tyr Ile Trp 165 170 175 Val Lys Arg Ser Leu Asn Cys Val Leu Lys Cys Gly Tyr Asp Ala Gly 180 185 190 Leu Tyr Ser Arg Ser Ala Lys Glu Tyr Val Arg Thr Asn Glu Glu Phe 195 200 205 Asp Pro Val Asp Asp Gly Pro Asp Asp Glu Thr Asp Leu Ser Lys Leu 210 215 220 Ser Lys Asp Val Val Gln Tyr Glu Gln Glu Ile Glu Ser Leu Glu Ala 225 230 235 240 Thr Tyr His Ile Ile Ile Val Ala Leu Thr Ile Met Gly Val Ile Phe 245 250 255 Leu Ile Ser Val Ile Val Leu Val Cys Ser Cys Asp Lys Asn Asn Asp 260 265 270 Gln Tyr Lys Phe His Lys Leu Leu Pro 275 280 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MS4A1S <400> 12 tataccatgg caacacccag aaattcagta aatg 34 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MS4A1AS <400> 13 ggtaccgatg caaatggcca cataggagag ctgtcatttt ctattgg 47 <210> 14 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F13S <400> 14 ccaatagaaa atgacagctc tcctatgtgg ccatttgcat cggtacc 47 <210> 15 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F13AS <400> 15 tatacgtacg ttaatggtga tggtgatgat gaatttttaa cgatttactg tg 52 <210> 16 <211> 506 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD20-A56R Fusion Protein <400> 16 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Thr Glu Leu Ile Val Asn Thr Asp Ser Glu Ser Thr Ile Asp 20 25 30 Ile Ile Leu Ser Gly Ser Thr His Ser Pro Glu Thr Ser Ser Lys Lys 35 40 45 Pro Asp Tyr Ile Asp Asn Ser Asn Cys Ser Ser Val Phe Glu Ile Ala 50 55 60 Thr Pro Glu Pro Ile Thr Asp Asn Val Glu Asp His Thr Asp Thr Val 65 70 75 80 Thr Tyr Thr Ser Asp Ser Ile Asn Thr Val Ser Ala Ser Ser Gly Glu 85 90 95 Ser Thr Thr Asp Glu Thr Pro Glu Pro Ile Thr Asp Lys Glu Asp His 100 105 110 Thr Val Thr Asp Thr Val Ser Tyr Thr Thr Val Ser Thr Ser Ser Gly 115 120 125 Ile Val Thr Thr Lys Ser Thr Thr Asp Asp Ala Asp Leu Tyr Asp Thr 130 135 140 Tyr Asn Asp Asn Asp Thr Val Pro Pro Thr Thr Val Gly Gly Ser Thr 145 150 155 160 Thr Ser Ile Ser Asn Tyr Lys Thr Lys Asp Phe Val Glu Ile Phe Gly 165 170 175 Ile Thr Ala Leu Ile Ile Leu Ser Ala Val Ala Ile Phe Cys Ile Thr 180 185 190 Tyr Tyr Ile Tyr Asn Lys Arg Ser Arg Lys Tyr Lys Thr Glu Asn Lys 195 200 205 Val Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu 210 215 220 Pro Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe 225 230 235 240 Arg Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg 245 250 255 Glu Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His 260 265 270 Ile Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro 275 280 285 Ile Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile 290 295 300 Ile Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys 305 310 315 320 Leu Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala 325 330 335 Ile Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile 340 345 350 Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr 355 360 365 Pro Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys 370 375 380 Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu 385 390 395 400 Gly Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val 405 410 415 Ile Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro 420 425 430 Lys Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr 435 440 445 Ile Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln 450 455 460 Pro Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu 465 470 475 480 Glu Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu 485 490 495 Ser Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro 500 505 <210> 17 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-A56R Fusion Protein <400> 17 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Thr Ser Thr Thr 20 25 30 Asn Asp Thr Asp Lys Val Asp Tyr Glu Glu Tyr Ser Thr Glu Leu Ile 35 40 45 Val Asn Thr Asp Ser Glu Ser Thr Ile Asp Ile Ile Leu Ser Gly Ser 50 55 60 Thr His Ser Pro Glu Thr Ser Ser Lys Lys Pro Asp Tyr Ile Asp Asn 65 70 75 80 Ser Asn Cys Ser Ser Val Phe Glu Ile Ala Thr Pro Glu Pro Ile Thr 85 90 95 Asp Asn Val Glu Asp His Thr Asp Thr Val Thr Tyr Thr Ser Asp Ser 100 105 110 Ile Asn Thr Val Ser Ala Ser Ser Gly Glu Ser Thr Thr Asp Glu Thr 115 120 125 Pro Glu Pro Ile Thr Asp Lys Glu Asp His Thr Val Thr Asp Thr Val 130 135 140 Ser Tyr Thr Thr Val Ser Thr Ser Ser Gly Ile Val Thr Thr Lys Ser 145 150 155 160 Thr Thr Asp Asp Ala Asp Leu Tyr Asp Thr Tyr Asn Asp Asn Asp Thr 165 170 175 Val Pro Pro Thr Thr Val Gly Gly Ser Thr Thr Ser Ile Ser Asn Tyr 180 185 190 Lys Thr Lys Asp Phe Val Glu Ile Phe Gly Ile Thr Ala Leu Ile Ile 195 200 205 Leu Ser Ala Val Ala Ile Phe Cys Ile Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asn Lys 210 215 220 Arg Ser Arg Lys Tyr Lys Thr Glu Asn Lys Val 225 230 235

Claims (76)

  1. (a) 하나 이상의 막외(extra-membrane) 영역, 하나 이상의 막관통(transmembrane) 도메인 및 하나의 이상의 막내(intra-membrane) 영역을 포함하는 내재막 단백질(IMP: integral membrane protein) 또는 이의 단편을 코딩하는 제1 핵산 단편으로서, 하나 이상의 막내 영역을 코딩하는 제1 핵산 단편의 부분이 제1 핵산 단편의 5' 또는 3' 말단에 위치하는 것인 제1 핵산 단편; 및
    (b) 백시니아 바이러스 F13L 단백질 또는 이의 기능적 단편을 코딩하며, IMP의 막내 영역을 코딩하는 제1 핵산 단편의 부분에 인프레임으로(in frame) 융합된 제2 핵산 단편
    을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폭스바이러스 감염 세포는 IMP-F13L 융합 단백질을 세포외 피막형 비리온(EEV: extracellular enveloped virion)의 외피 막의 일부로서 발현할 수 있는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, F13L 단백질 또는 이의 기능적 단편이 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, IMP가 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상의 막관통 도메인을 포함하는 다중 통과 막 단백질인 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, IMP가 홀수개의 막관통 도메인을 가지며, 제1 핵산 단편의 5' 말단은 막외 영역을 코딩하고, 제1 핵산 단편의 3' 말단은 막내 영역을 코딩하며, 제2 폴리뉴클레오티드의 5' 말단은 제1 핵산 단편의 3' 말단에 융합되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, IMP가 G 단백질 연결 수용체(GPCR: G-protein coupled receptor)를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, IMP가 인간 프리즐드(frizzled)-4 단백질(FZD4) 또는 이의 단편인 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 20 내지 892를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서, 신호 펩티드를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서, 신호 펩티드가 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 19를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  10. 제5항에 있어서, IMP가 CXC 케모카인 수용체인 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, CXC 케모카인 수용체가 CXCR4, 또는 이의 단편인 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제3항에 있어서, IMP가 짝수개의 막 통과 도메인을 가지며, 제1 핵산 단편의 5' 말단과 3' 말단 둘 다 막내 영역을 코딩하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항에 있어서, 제2 핵산 단편이 제1 핵산 단편의 3' 말단에 융합되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  15. 제14항에 있어서, IMP가 인간 CD20 단백질, 또는 이의 단편인 폴리뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서, 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 단편과 제2 핵산 단편이 직접 융합되는 것인 폴리뉴클레오티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 펩티드를 코딩하는 제3 핵산 단편을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항에 있어서, 이종 펩티드가 링커 서열, 아미노산 태그 또는 표지, 또는 정제를 용이하게 하는 펩티드 또는 폴리펩티드 서열을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  20. 제19항에 있어서, 이종 펩티드가 히스티딘 태그를 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 폭스바이러스 프로모터와 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드.
  22. 제21항에 있어서, 폭스바이러스 프로모터가 p7.5 또는 H5 또는 T7인 폴리뉴클레오티드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 F13L 융합 단백질.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폭스바이러스 게놈.
  25. 제24항에 있어서, 백시니아 바이러스 게놈인 폭스바이러스 게놈.
  26. 제25항의 폭스바이러스 게놈을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스 EEV.
  27. 제26항에 기재된 재조합 백시니아 바이러스 EEV의 제조 방법으로서,
    (a) 제24항의 폭스바이러스 게놈을 포함하는 백시니아 바이러스로 백시니아 바이러스 감염성을 허용하는 숙주 세포를 감염시키는 단계, 및
    (b) 숙주 세포로부터 방출된 EEV를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  28. 본래의 입체구조로 내재막 단백질(IMP) 또는 이의 단편을 디스플레이하는 방법으로서,
    (a) IMP 또는 이의 단편을 폭스바이러스 EEV 특이적 단백질 또는 이의 막 관련 단편과의 융합 단백질로서 발현하는 재조합 폭스바이러스로 폭스바이러스 감염을 허용하는 숙주 세포를 감염시키는 단계로서, 감염된 숙주 세포에 의해 생성된 EEV는 IMP 융합 단백질을 EEV 외피 막의 일부로서 포함하는 것인 단계;
    (b) 숙주 세포로부터 방출된 EEV를 회수하는 단계
    를 포함하며,
    IMP 또는 이의 단편은 EEV의 표면 상에 본래의 입체구조로 디스플레이되는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, EEV 특이적 단백질이 백시니아 바이러스 A33R 단백질, A34R 단백질, A56R 단백질, B5R 단백질, A36R 단백질, F13L 단백질, 이들의 임의의 막 관련 단편, 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
  30. 제29항에 있어서, EEV 특이적 단백질이 F13L(서열 번호 1) 또는 이의 기능적 단편인 방법.
  31. 제30항에 있어서, IMP가 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상 또는 7개 이상의 막관통 도메인을 포함하는 다중 통과 막 단백질인 방법.
  32. 제31항에 있어서, IMP가 7개의 막관통 도메인을 포함하는 G 단백질 연결 수용체(GPCR)를 포함하고, F13L이 IMP의 C-말단에 융합되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, IMP가 인간 프리즐드-4 단백질(FZD4), 또는 이의 단편인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 2의 아미노산 20 내지 892를 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 융합 단백질이 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 신호 펩티드가 서열 번호 2의 아미노산 1 내지 19를 포함하는 것인 방법.
  37. 제32항에 있어서, IMP가 CXC 케모카인 수용체인 방법.
  38. 제37항에 있어서, CXC 케모카인 수용체가 CXCR4, 또는 이의 단편인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  40. 제31항에 있어서, IMP 또는 이의 단편이 짝수개의 막관통 도메인을 가지며, IMP 또는 이의 단편의 N-말단과 C-말단이 둘 다 막 내에 있는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, F13L이 IMP의 C-말단에 융합되는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, IMP가 인간 CD20, 또는 이의 단편인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  44. 제29항에 있어서, 막 관련 EEV 특이적 단백질 단편이 백시니아 바이러스 A56R 단백질의 줄기(stalk), 막관통 도메인, 및 막내 도메인을 포함하는 것인 방법.
  45. 제30항에 있어서, 막 관련 EEV 특이적 단백질 단편이 본질적으로 서열 번호 5의 아미노산 108 내지 314로 이루어지는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, IMP가 인간 FZD4의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
  47. 제46항에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 6의 아미노산 20 내지 370을 포함하는 것인 방법.
  48. 제46항에 있어서, 융합 단백질이 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 신호 펩티드가 서열 번호 6의 아미노산 1 내지 19를 포함하는 것인 방법.
  50. 제45항에 있어서, IMP가 인간 ErbB2(Her2)의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 7의 아미노산 20 내지 855를 포함하는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 융합 단백질이 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 신호 펩티드가 서열 번호 7의 아미노산 1 내지 19를 포함하는 것인 방법.
  54. 제45항에 있어서, IMP가 인간 CD100(세마포린 4D)의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 8의 아미노산 20 내지 935를 포함하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 융합 단백질이 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 신호 펩티드가 서열 번호 8의 아미노산 1 내지 19를 포함하는 것인 방법.
  58. 제29항에 있어서, 막 관련 EEV 특이적 단백질 단편이 백시니아 바이러스 B5R 단백질의 막관통 및 막내 도메인을 포함하는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 막 관련 EEV 특이적 단백질 단편이 본질적으로 서열 번호 9의 아미노산 276 내지 317로 이루어지는 것인 방법.
  60. 제58항에 있어서, 막 관련 EEV 특이적 단백질 단편이 백시니아 바이러스 B5R 단백질의 줄기, 막관통 도메인, 및 막내 도메인을 포함하는 것인 방법.
  61. 제30항에 있어서, 막 관련 EEV 특이적 단백질 단편이 본질적으로 서열 번호 9의 아미노산 238 내지 317로 이루어지는 것인 방법.
  62. 제59항 또는 제61항에 있어서, IMP가 인간 FZD4의 세포외 도메인을 포함하는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 10의 아미노산 20 내지 243 또는 서열 번호 11의 아미노산 20 내지 281을 포함하는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 융합 단백질이 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 신호 펩티드가 서열 번호 10의 아미노산 1 내지 19를 포함하는 것인 방법.
  66. (a) 서열 번호 2의 아미노산 20 내지 892;
    (b) 서열 번호 3;
    (c) 서열 번호 4;
    (d) 서열 번호 6의 아미노산 20 내지 370;
    (e) 서열 번호 7의 아미노산 20 내지 855;
    (f) 서열 8의 아미노산 20 내지 935;
    (g) 서열 번호 10의 아미노산 20 내지 243; 또는
    (h) 서열 번호 11의 아미노산 20 내지 281
    을 포함하는 융합 단백질로서,
    재조합 폭스바이러스에 의해 발현될 때, 폭스바이러스 세포외 피막형 비리온(EEV)의 표면 상에 본래의 입체구조로 나타나는 융합 단백질.
  67. 제66항의 융합 단백질을 포함하는 재조합 폭스바이러스 EEV.
  68. 폭스바이러스 EEV 특이적 단백질 또는 이의 막 관련 단편에 융합된 이종 IMP 또는 이의 단편을 포함하는 재조합 폭스바이러스 EEV로서, 융합 단백질은 EEV 외피 막에 위치하고, IMP 또는 이의 단편은 EEV의 표면 상에 본래의 입체구조로 디스플레이되는 것인 재조합 폭스바이러스 EEV.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 폭스바이러스 EEV는 백시니아 바이러스 EEV 인 재조합 폭스바이러스 EEV.
  70. 다중 통과 막 단백질에 결합하는 항체를 선별하는 방법으로서,
    (a) 제26항 및 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항의 재조합 EEV를 고체 지지체에 부착시키는 단계;
    (b) 복수의 항원 결합 도메인을 디스플레이하는 디스플레이 패키지를 포함하는 항체 디스플레이 라이브러리를 제공하는 단계;
    (c) EEV 상에 발현된 IMP에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 디스플레이하는 디스플레이 패키지가 EEV에 결합할 수 있도록 디스플레이 라이브러리를 EEV와 접촉시키는 단계;
    (d) 결합되지 않은 디스플레이 패키지를 제거하는 단계; 및
    (e) EEV 상에 발현되는 IMP에 특이적인 항원 결합 도메인을 디스플레이하는 디스플레이 패키지를 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 재조합 EEV를, 고체 지지체에 부착시키기 전에 불활성화시키는 것인 방법.
  72. 제71항에 있어서, EEV를, UV 조사 하에 소랄렌(트리옥살렌, 4'-아미노메틸 -, 히드로클로라이드)과의 인큐베이션에 의해 불활성화시키는 것인 방법.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, EEV가 표면에 부착된 토실기와의 반응을 통해 고체 표면에 부착되는 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 고체 표면이 토실에 의해 활성화된 자성 비드인 방법.
  75. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, EEV가 바이오티닐화되고, 스트렙타비딘 코팅된 고체 표면에 부착되는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 고체 표면이 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드인 방법.
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