CN109022530A - 一种人参皂苷Ro的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种保藏编号为CGMCC No.3.3262的梅林青霉菌株在制备人参皂苷Ro中的用途。本发明还提供了使用本发明的梅林青霉菌株制备人参皂苷Ro的方法。本发明首次实现利用梅林青霉菌株生物转化生产人参皂苷Ro，人参皂苷Ro的摩尔转化率达56％以上；本发明只需使用本发明的菌株进行转化，生产成本低，工艺简单，经济效益可观。

Description

一种人参皂苷Ro的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种人参皂苷Ro的制备方法，具体涉及一种采用梅林青霉制备人参皂苷Ro的方法。

背景技术

五加科人参属植物人参(Panax ginseng C.A.Mey)，在我国拥有千年之久的历史，该植物主要分布于中国东北的小兴安岭、长白山等地，朝鲜、韩国、日本和俄罗斯境内也有分布。人参的根茎为传统名贵中药材，具有安神、去邪、明目、益智、延年之功效。人参根茎中的主要活性物质为达玛烷型四环三萜皂苷类化合物，已报道约70个，主要有人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rg1和Re，占人参皂苷总量的80％以上。药理研究也表明人参皂苷具有滋补、强壮、调节机能、提高免疫力、抗炎和抗癌等多种生物活性。齐墩果酸型皂苷作为人参中一类五环三萜皂苷也具有其独特的药理活性作用，相比于达玛烷型皂苷，齐墩果酸型皂苷的含量甚少，有关研究也相对较少。

人参皂苷Ro化学名称为3-O-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸基齐墩果酸28-β-D-吡喃葡萄糖基酯，结构式如下式I所示，是一种齐墩果酸型皂苷，具有抗肿瘤、抗炎、抗补体活性等药理作用，目前人参皂苷Ro多采用溶剂提取结合柱色谱方法从植物中分离获得^[7]，但由于其天然植物中含量并不高，很难实现大规模制备。

微生物转化是通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰和改造，其本质在于以微生物作为载体，利用其代谢过程中产生的酶对外源化合物进行的催化反应，主要反应类型有水解、氧化还原、脱水、甲基化、糖基化、酰基化等。微生物转化具有专一性强、转化酶表达效率高、副反应少、条件温和、减少环境污染、缩短生产周期和减少合成步骤等优点。该方法可以实现化合物的定向转化，且成本低，绿色环保。

但是，现有技术中没有使用微生物转化人参皂苷R_O的方法。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种人参皂苷Ro的制备方法。本发明人发现，梅林青霉菌株CGMCC No.3.3262能够以苷元齐墩果酸为发酵底物进行定向糖苷化，大量生产人参皂苷Ro及其类似物。HPLC结果显示，本发明的方法的人参皂苷Ro产率可达50～85％。本发明的方法有助于人参皂苷Ro的微生物转化生产，以满足当前市场对人参皂苷Ro的需求。

本发明提供了一种人参皂苷Ro的制备方法，所述方法包括使用保藏编号为CGMCCNo.3.3262的梅林青霉菌株转化底物齐墩果酸。

优选地，所述方法包括使用保藏编号为CGMCC No.3.3262的梅林青霉菌株在全自动发酵罐中经发酵转化底物齐墩果酸。

本发明使用的梅林青霉菌株保藏编号为CGMCC No.3.3262，其具体信息详见周宇光.菌种目录(第三版增补版),中国农业科技出版社,2003，p201-202页，可以购自中国科学院微生物研究所。

优选地，所述方法包括以下步骤：

1)将保藏编号为CGMCC No.3.3262的梅林青霉菌株从固体土豆培养基接种至预先配制好的液体土豆培养基中，置于全自动发酵罐中进行培养获得发酵液；

2)将齐墩果酸溶于甲醇、乙醇或其水溶液中，制备为10～100g/L的溶液，加入到步骤1)得到的发酵液中继续发酵培养；

优选地，将齐墩果酸溶于甲醇、乙醇或其水溶液中，制备为20～80g/L的溶液；

更优选地，将齐墩果酸溶于甲醇、乙醇或其水溶液中，制备为40～50g/L的溶液；

3)收集步骤2)得到的发酵液，离心甩滤后收集滤液，减压浓缩至原体积的1/10～1/20，用大孔树脂柱层析分离，以体积比为70:30～0:100的不同浓度的水-乙醇或水-甲醇洗脱，富集转化产物，即为人参皂苷RO。

优选地，在步骤1)中，所述固体土豆培养基包含10～50g/L的葡萄糖和10～20g/L的葡萄糖醛酸；

优选地，所述固体土豆培养基包含20～40g/L的葡萄糖和12～18g/L的葡萄糖醛酸；

更优选地，所述固体土豆培养基包含30g/L的葡萄糖和15g/L的葡萄糖醛酸。

优选地，在步骤1)中，所述液体土豆培养基包含10～50(g/L)的葡萄糖和10～20(g/L)的葡萄糖醛酸；

优选地，所述液体土豆培养基包含20～40(g/L)的葡萄糖和12～18(g/L)的葡萄糖醛酸；

更优选地，所述液体土豆培养基包含30(g/L)的葡萄糖和40(g/L)的葡萄糖醛酸。

优选地，在步骤1)中，所述培养条件如下：

培养温度为24～32℃，pH值为4～6，通气比为0.1～10％(v/v)，搅拌速率为100～360rpm/min，发酵培养24～72小时；

优选地，所述培养条件如下：

培养温度为26～30℃，pH值为4.5～5.5，通气比为1～8％(v/v)，搅拌速率为180～260rpm/min，发酵培养36～60小时；

更优选地，所述培养条件如下：

培养温度为28℃，pH值为5，通气比5％(v/v)，搅拌速率为200rpm/min，发酵培养48小时。

优选地，在步骤2)中，所述发酵培养的条件如下：

培养温度为24～32℃，搅拌速率为100～360rpm/min，发酵培养时间48～120小时；

优选地，所述发酵培养的条件如下：

培养温度为26～30℃，搅拌速率为200～300rpm/min，发酵培养时间60～96小时；

更优选地，所述发酵培养的条件如下：

培养温度为28℃，搅拌速率为220rpm/min，发酵培养时间72～84小时。

优选地，在步骤2)中，所述甲醇水溶液为体积百分比浓度不低于70％的甲醇水溶液；所述乙醇水溶液为体积百分比浓度不低于70％的乙醇水溶液；

优选地，所述发酵培养中，齐墩果酸底物用量与发酵液的比例用量范围为10g～100g/100L；优选地为20g～80g/100L；更优选地为40g～50g/100L；

优选地，在步骤3)中，所述大孔树脂选自HP20型大孔树脂、D101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂或YWD-01型大孔树脂中的一种或多种；

优选地，在步骤3)中，所述转化产物的纯化使用硅胶柱色谱和/或十八键合相硅胶柱色谱进行精制。

本发明的有益效果包括：

1.本发明首次实现利用梅林青霉微生物转化生产人参皂苷Ro，人参皂苷Ro的摩尔转化率达56％以上；

2.本发明的方法为微生物转化法，反应条件温和，对环境没有污染；

3.本发明的菌株梅林青霉具有高产性状稳定的特点，该菌株经过20代的传代，性能保持稳定。

4.本发明只需使用本发明的菌株进行转化，生产成本低，工艺简单，经济效益可观。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应容易理解的是，实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书所涵盖的本发明的范围。

实施例1：使用本发明的菌株制备人参皂苷Ro

1)将所述梅林青霉CGMCC No.3.3262(购自中国科学院微生物研究所)从固体土豆培养基接种至预先配制好的液体土豆培养基中，置于全自动发酵罐中进行培养获得发酵液；

所述固体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，琼脂3kg，葡萄糖1kg，葡萄糖醛酸1kg；

所述液体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，葡萄糖1kg，葡萄糖醛酸1kg；

所述培养条件如下：

培养温度为24℃，pH值为4，通气比0.1％(v/v)，搅拌速率为100rpm/min，发酵培养24小时；

2)将齐墩果酸溶于乙醇配制成10g/L的溶液，按照每100L加入1L的比例加入到步骤1)所述的全自动发酵罐中发酵培养；

所述发酵培养的条件如下：

培养温度为24℃，搅拌速率为360rpm/min，发酵培养时间48小时；

3)收集步骤2)得到的发酵液，离心甩滤后收集滤液，减压浓缩至原体积的1/10，用HP20大孔树脂柱层析分离，用去离子水洗脱2倍柱保留体积，再用体积比为70％～100％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，每个浓度洗脱4倍柱保留体积，将富含人参皂苷Ro转化产物的组分合并浓缩干燥得到富集物，摩尔转化率为59.8％，HPLC含量检测为86.2％。

人参皂苷Ro的核磁共振碳谱数据如下表所示，与文献相对照，确定数据一致，为所报道的人参皂苷Ro。

表1人参皂苷Ro的碳谱核磁共振数据(溶剂：氘代吡啶)

实施例2：使用本发明的菌株制备人参皂苷Ro

1)将所述梅林青霉(来源同实施例1)从固体土豆培养基接种至预先配制好的液体土豆培养基中，置于全自动发酵罐中进行培养获得发酵液；

所述固体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，琼脂3kg，葡萄糖5kg，葡萄糖醛酸2kg；

所述液体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，葡萄糖5kg，葡萄糖醛酸2kg；

所述培养条件如下：

培养温度为32℃，pH值为6，通气比10％(v/v)，搅拌速率为360rpm/min，发酵培养72小时；

2)将齐墩果酸溶于体积比浓度为70％的乙醇水溶液中配制成100g/L的溶液，按照每100L加入1L的比例加入到步骤1)所述的全自动发酵罐中发酵培养；

所述发酵培养的条件如下：

培养温度为32℃，搅拌速率为100rpm/min，发酵培养时间120小时；

3)收集步骤2)得到的发酵液，离心甩滤后收集滤液，减压浓缩至原体积的1/20，用AB-8大孔树脂柱层析分离，用去离子水洗脱2倍柱保留体积，再用体积比为70％～100％的甲醇水溶液梯度洗脱，每个浓度洗脱4倍柱保留体积，将富含人参皂苷Ro的转化产物组分合并浓缩干燥得到富含人参皂苷Ro的转化产物富集物，摩尔转化率为64.7％，HPLC含量检测为79.3％。

实施例3：使用本发明的菌株制备人参皂苷Ro

1)将所述梅林青霉(来源同实施例1)从固体土豆培养基接种至预先配制好的液体土豆培养基中，置于全自动发酵罐中进行培养获得发酵液；

所述固体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，琼脂3kg，葡萄糖2kg，葡萄糖醛酸1.2kg；

所述液体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，葡萄糖2kg，葡萄糖醛酸1.2kg；

所述培养条件如下：

培养温度为26℃，pH值为4.5，通气比1％(v/v)，搅拌速率为260rpm/min，发酵培养36小时；

2)将齐墩果酸溶于体积比浓度为70％的甲醇水溶液配制成20g/L的溶液，按照每100L加入1L的比例加入到步骤1)所述的全自动发酵罐中发酵培养；

所述发酵培养的条件如下：

培养温度为26℃，搅拌速率为200rpm/min，发酵培养时间96小时；

3)收集步骤2)得到的发酵液，离心甩滤后收集滤液，减压浓缩至原体积的1/15，用YWD-01大孔树脂柱层析分离，用去离子水洗脱2倍柱保留体积，再用体积比为70％～100％的甲醇水溶液洗脱，每个浓度洗脱4倍柱保留体积，将富含人参皂苷Ro的转化产物组分合并浓缩干燥得到富含人参皂苷Ro的转化产物富集物，摩尔转化率为69.5％，HPLC含量检测为87.3％。

实施例4：使用本发明的菌株制备人参皂苷Ro

1)将所述梅林青霉(来源同实施例1)从固体土豆培养基接种至预先配制好的液体土豆培养基中，置于全自动发酵罐中进行培养获得发酵液；

所述固体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，琼脂3kg，葡萄糖4kg，葡萄糖醛酸1.8kg；

所述液体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，葡萄糖4kg，葡萄糖醛酸1.8kg；

所述培养条件如下：

培养温度为30℃，pH值为5.5，通气比8％(v/v)，搅拌速率为180rpm/min，发酵培养60小时；

2)将齐墩果酸溶于甲醇配制成80g/L的溶液，按照每100L加入1L的比例加入到步骤1)所述的全自动发酵罐中发酵培养；

所述发酵培养的条件如下：

培养温度为30℃，搅拌速率为300rpm/min，发酵培养时间96小时；

3)收集步骤2)得到的发酵液，离心甩滤后收集滤液，减压浓缩至原体积的1/12，用HP20大孔树脂柱层析分离，用去离子水洗脱2倍柱保留体积，再用体积比为70％～100％的甲醇水溶液洗脱，每个浓度洗脱4倍柱保留体积，将富含人参皂苷Ro的转化产物组分合并浓缩干燥得到富含人参皂苷Ro的转化产物富集物，摩尔转化率为75.3％，HPLC含量检测为88.1％。

实施例5：使用本发明的菌株制备人参皂苷Ro

1)将所述梅林青霉(来源同实施例1)从固体土豆培养基接种至预先配制好的液体土豆培养基中，置于全自动发酵罐中进行培养获得发酵液；

所述固体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，琼脂3kg，葡萄糖3kg，葡萄糖醛酸1.5kg；

所述液体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，葡萄糖3kg，葡萄糖醛酸1.5kg；

所述培养条件如下：

培养温度为28℃，pH值为5，通气比5％(v/v)，搅拌速率为200rpm/min，发酵培养48小时；

2)将齐墩果酸溶于甲醇配制成40g/L的溶液，按照每100L加入1L的比例加入到步骤1)所述的全自动发酵罐中发酵培养；

所述发酵培养的条件如下：

培养温度为28℃，搅拌速率为220rpm/min，发酵培养时间72小时；

3)收集步骤2)得到的发酵液，离心甩滤后收集滤液，减压浓缩至原体积的1/16，用HP20大孔树脂柱层析分离，用去离子水洗脱2倍柱保留体积，再用体积比为70％～100％的甲醇水溶液洗脱，每个浓度洗脱4倍柱保留体积，将富含人参皂苷Ro的转化产物组分合并浓缩干燥得到富含人参皂苷Ro的转化产物富集物，摩尔转化率为81.3％，HPLC含量检测为88.2％。

实施例6：使用本发明的菌株制备人参皂苷Ro

1)将所述梅林青霉(来源同实施例1)从固体土豆培养基接种至预先配制好的液体土豆培养基中，置于全自动发酵罐中进行培养获得发酵液；

所述固体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，琼脂3kg，葡萄糖3kg，葡萄糖醛酸1.5kg；

所述液体土豆培养基每100L中含土豆淀粉20kg，葡萄糖3kg，葡萄糖醛酸1.5kg；

所述培养条件如下：

培养温度为28℃，pH值为5，通气比5％(v/v)，搅拌速率为200rpm/min，发酵培养48小时；

2)将齐墩果酸溶于乙醇配制成50g/L的溶液，按照每100L加入1L的比例加入到步骤1)所述的全自动发酵罐中发酵培养；

所述发酵培养的条件如下：

培养温度为28℃，搅拌速率为220rpm/min，发酵培养时间84小时；

3)收集步骤2)得到的发酵液，离心甩滤后收集滤液，减压浓缩至原体积的1/16，用HP20大孔树脂柱层析分离，用去离子水洗脱2倍柱保留体积，再用体积比为70％～100％的乙醇水溶液洗脱，每个浓度洗脱4倍柱保留体积，将富含人参皂苷Ro的转化产物组分合并浓缩干燥得到富含人参皂苷Ro的转化产物富集物，摩尔转化率为84.7％，HPLC含量检测为89.5％。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (9)

1.一种人参皂苷Ro的制备方法，所述方法包括使用保藏编号为CGMCC No.3.3262的梅林青霉菌株转化底物齐墩果酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括使用保藏编号为CGMCC No.3.3262的梅林青霉菌株在全自动发酵罐中经发酵转化底物齐墩果酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

1)将保藏编号为CGMCC No.3.3262的梅林青霉菌株从固体土豆培养基接种至预先配制好的液体土豆培养基中，置于全自动发酵罐中进行培养获得发酵液；

2)将齐墩果酸溶于甲醇、乙醇或其水溶液中，制备为10～100g/L的溶液，加入到步骤1)得到的发酵液中继续发酵培养；

优选地，将齐墩果酸溶于甲醇、乙醇或其水溶液中，制备为20～80g/L的溶液；

更优选地，将齐墩果酸溶于甲醇、乙醇或其水溶液中，制备为40～50g/L的溶液；

3)收集步骤2)得到的发酵液，离心甩滤后收集滤液，减压浓缩至原体积的1/10～1/20，用大孔树脂柱层析分离，以体积比为70:30～0:100的不同浓度的水-乙醇或水-甲醇洗脱，富集转化产物，即为人参皂苷Ro。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤1)中，所述固体土豆培养基包含10～50g/L的葡萄糖和10～20g/L的葡萄糖醛酸；

优选地，所述固体土豆培养基包含20～40g/L的葡萄糖和12～18g/L的葡萄糖醛酸；

更优选地，所述固体土豆培养基包含30g/L的葡萄糖和15g/L的葡萄糖醛酸。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤1)中，所述液体土豆培养基包含10～50(g/L)的葡萄糖和10～20(g/L)的葡萄糖醛酸；

优选地，所述液体土豆培养基包含20～40(g/L)的葡萄糖和12～18(g/L)的葡萄糖醛酸；

更优选地，所述液体土豆培养基包含30(g/L)的葡萄糖和15(g/L)的葡萄糖醛酸。

6.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤1)中，所述培养条件如下：

培养温度为24～32℃，pH值为4～6，通气比为0.1～10％(v/v)，搅拌速率为100～360rpm/min，发酵培养24～72小时；

优选地，所述培养条件如下：

培养温度26～30℃，pH值为4.5～5.5，通气比为1～8％(v/v)，搅拌速率为180～260rpm/min，发酵培养36～60小时；

更优选地，所述培养条件如下：

培养温度28度，pH值为5，通气比为5％(v/v)，搅拌速率为200rpm/min，发酵培养48小时。

7.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤2)中，所述发酵培养的条件如下：

培养温度为24～32℃，搅拌速率为100～360rpm/min，发酵培养时间48～120小时；

优选地，所述发酵培养的条件如下：

培养温度26～30℃，搅拌速率为200～300rpm/min，发酵培养时间60～96小时；

更优选地，所述发酵培养的条件如下：

培养温度28℃，搅拌速率为220rpm/min，发酵培养时间72～84小时。

8.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤2)中，所述甲醇水溶液为体积百分比浓度不低于70％的甲醇水溶液；所述乙醇水溶液为体积百分比浓度不低于70％的乙醇水溶液；

优选地，所述发酵培养中，齐墩果酸底物用量与发酵液的比例用量范围为10g～100g/100L；更优选地为20g～80g/100L；更进一步优选地为40g～50g/100L。

9.根据权利要求3所述的方法，其中在步骤3)中，所述大孔树脂选自HP20型大孔树脂、D101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂或YWD-01型大孔树脂中的一种或多种；

优选地，在步骤3)中，所述转化产物的纯化使用硅胶柱色谱和/或十八键合相硅胶柱色谱进行精制。