CN108997288A - 一种检测二氧化硫的比率荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测二氧化硫的比率荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针的分子式为C40H35N2O3 +，其名称为：(E)‑4‑(2‑羧基苯基)‑7‑(二乙胺)‑2‑(4‑(二苯基氨基)苯乙烯基)呫吨鎓，简称1‑SO2。本发明检测二氧化硫的荧光探针对二氧化硫检测的选择性高，检测灵敏度高，抗干扰能力强，而且检测时可以根据颜色的变化对体系中是否含有二氧化硫进行识别，现象明显，便于识别。本发明检测二氧化硫的荧光探针的制备方法简单，制备的产品产率高，适合大规模推广应用。

Description

一种检测二氧化硫的比率荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种有机小分子荧光探针，具体涉及一种检测二氧化硫的比率荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
SO2不仅是一种主要的大气污染物，同时也与动物和人类的健康密切相关。SO2在生物体内主要以亚硫酸氢根和亚硫酸根形式存在，其中亚硫酸根具有防腐作用，是一种主要的食品添加剂。空气中少量的SO2能够促使植物叶片的气孔开放从而提高植物的光合作用率。有研究表明，在空气中SO2的浓度过高时，会显著地影响植物的生长甚至会降低作物产量。尽管有研究表明SO2能刺激神经系统的兴奋性，但是，当其浓度较高时却能引起呼吸系统疾病，甚至中毒。一定量的SO2对于那些对它敏感的人群来说，会使他们过敏或是哮喘，从而导致呼吸困难、荨麻疹、肠胃病等。随着现代工业的发展，大量的生矿物质被煅烧加工，进而产生大量的SO2，导致酸雨和很多环境问题。这些对人体、环境的不利影响已经引起越来越多的关注。
随着现代生活水平的提高，人们对健康的关注度也日益提高。近年来，生物体内亚硫酸盐的含量作为机体正常运行的重要指标，己经受到越来越多的关注，快速定量检测生物体内亚硫酸根离子的浓度具有十分重要的意义。因此，开发有效的对于二氧化硫在食物定量安全检测和安全监管、临床和环境应用的方法是非常重要的。传统的检测方法有很多，比如有滴定测量法、色谱法、电化学法、毛细管电泳法、流动注射分析法等，但上述方法大多操作手续繁琐，给实际操作带来一定的困难。
近年来，作为卓越的检测技术，荧光探针因为它的高选择性、高敏感性及实时成像性，已经越来越引起人们的高度关注，被广泛应用于各种物质的检测。通常情况下，荧光探针检测物质是依靠于荧光强度的增加或消减，因此探针的浓度、仪器的效率、环境等因素都会影响信号的输出。但是对于比率型荧光探针来说，利用两个不同波长处荧光强度的变化，可以很好地消除这些因素。
目前检测二氧化硫的荧光探针很少，已经报导过的探针大都是基于对双键的亲核反应，这些探针往往荧光变化比较单一，大大限制了它们的应用。因此，开发新型的荧光探针检测二氧化硫是非常重要的。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种检测二氧化硫的比率荧光探针，该荧光探针本身的荧光为近红外发光，加至水或生物体后所得溶液为蓝色，当与二氧化硫作用后，溶液的颜色逐渐消退，并且显示出可见光区域的荧光增强，现象明显，便于识别。
本发明还提供了该比率荧光探针的制备方法和在检测水体和生物体中二氧化硫的应用，该探针制备方法简单、便于实施，对二氧化硫检测的选择性高，检测灵敏度高，能够明显的反映出水体和生物体内二氧化硫情况。
本发明具体技术方案如下的：
一种检测二氧化硫的比率荧光探针，该比率荧光探针具有式（I）所示的结构式：
。
进一步的，式（I）的比率荧光探针的分子式为C40H35N2O3 +，其名称为：(E)-4-(2-羧基苯基)-7-(二乙胺)-2-(4-(二苯基氨基)苯乙烯基)呫吨鎓，简称1-SO2。
本发明还提供了上述式（I）结构的检测二氧化硫的比率荧光探针的制备方法，该方法包括以下步骤：
（1）将2 -（4 -（二乙氨基）-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸与丙酮在浓硫酸中进行反应，得到化合物B；2 -（4 -（二乙氨基）-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸结构式如下式A所示，化合物B结构式如下式B所示：
；
（2）将化合物B与三苯胺基甲醛在酸性环境中进行反应，得到式（I）所示的检测二氧化硫的荧光探针化合物。
上述制备方法中，反应方程式如下：
进一步的，步骤（1）中， 2 -（4 -（二乙氨基）-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸和丙酮的摩尔比为1：12-150。
进一步的，步骤（1）中，丙酮和浓硫酸的体积比为6：20-200。
进一步的，步骤（1）中，反应温度为45-55℃，反应时间优选为2-12h。
进一步的，步骤（1）中，反应后的反应液倒入冰水中冷却，然后滴入高氯酸使固体析出，将所得固体重结晶，即为化合物B。所用的冰水即为标准压强下的冰水。所得固体优选在乙醇中重结晶。
进一步的，步骤（2）中，化合物B与三苯胺基甲醛的摩尔比为1：1-3。
进一步的，步骤（2）中，酸性环境由酸或酸酐提供，优选由醋酸、醋酸酐或甲磺酸提供；优选的，每mmol化合物B加入10-20ml酸或酸酐中。
进一步的，步骤（2）中，反应温度为50-95℃，反应时间优选为5-6h。
进一步的，步骤（2）中，反应后的反应液旋转蒸发至干，所得固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂进行柱层析分离，得到纯度较高的式（I）所示化合物。
本发明还提供了上述检测二氧化硫的比率荧光探针在检测水体或生物体中二氧化硫中的应用，因为二氧化硫在水体或生物体中以亚硫酸根存在，因此，也可以说是检测水体或生物体中的亚硫酸根。
本发明的检测二氧化硫的比率荧光探针化合物加入水体或生物体中后溶液为蓝色，当其与二氧化硫作用后，溶液的颜色变浅，溶液的荧光在520nm处显著增强，在740nm处荧光减弱。因此，可以根据荧光比率增强、颜色发生明显改变的方式对二氧化硫进行识别和检测。
优选的，本发明提供了一种检测水体或生物体中二氧化硫的方法，该方法是：将检测二氧化硫的比率荧光探针加入待检测水体或生物体中，观察体系的颜色和520nm、740nm处的荧光强度，体系颜色越浅说明二氧化硫含量越高，740nm处的荧光强度越低说明二氧化硫含量越高，520nm处的荧光强度越高说明二氧化硫含量越高，说明二氧化硫含量越高，也就是亚硫酸根含量越高。
优选的，水体或生物体的pH在7左右。水体或生物体中荧光探针的加入量为10μM左右。
进一步的，采用荧光光谱仪对溶液的荧光强度进行检测，检测的激发波长优选为460nm，检测波长为520nm和740nm。
本发明的有益效果：
1.本发明检测二氧化硫的荧光探针对二氧化硫检测的选择性高，检测灵敏度高，抗干扰能力强，而且检测时可以根据颜色的变化对体系中是否含有二氧化硫进行识别，现象明显，便于识别。
2.本发明检测二氧化硫的荧光探针的制备方法简单，制备的产品产率高，适合大规模推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例4中pH=7.4时，不同浓度亚硫酸钠条件下荧光探针的荧光光谱；其中最下面的曲线为不加入亚硫酸钠条件下的荧光曲线，曲线从下往上亚硫酸钠的浓度依次增加，最上面的曲线为亚硫酸钠浓度是300μM的荧光曲线。
图2为本发明实施例4中pH=7.4时，不同浓度亚硫酸钠条件下荧光探针的荧光光谱；其中最上面的曲线为不加入亚硫酸钠条件下的荧光曲线，曲线从上往下亚硫酸钠的浓度依次增加，最下面的曲线为亚硫酸钠浓度是300μM的荧光曲线。
图3为本发明实施例4中pH=7.4时，用激发波长为460nm，在520nm处的荧光强度随着时间变化的荧光光谱；其中最下面的曲线为0min时的荧光曲线，曲线从下往上时间依次增加，最上面的曲线为80min时二氧化硫的荧光曲线。
图4为本发明实施例5中加入不同生物小分子之后的荧光强度变化的对比图。激发波长为460nm，在520nm处的荧光强度对比；1-19分别代表blank、 Ca2+ 、Mg2+、 Zn2+、 Br-、Cl-、Ac-、 H2O2、 ClO-、 •OH、 GSH、 Hcy、 Cys、 NO2 -、 NO3 -、 NO, S2O3 2-、S2-，19代表亚硫酸根。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步说明，下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限制。本发明所用原料，如无特殊说明均为常规市购产品。
本发明所用的冰水为标准压强下的冰水。
实施例1
一种检测二氧化硫的比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）将0.28g白色固体2 -（4 -（二乙氨基）-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸加至6ml丙酮和20ml 98wt%浓硫酸的混合溶液中，混合均匀后在45℃温度下反应12h，反应后，将反应液倒入冰水中，逐滴滴入高氯酸直至固体析出完全，收集固体，将固体用乙醇重结晶，得化合物B(0.21 g，0.63mmol)；
（2）将0.21 g化合物B与等摩尔量的三苯胺基甲醛溶解在10ml甲磺酸中，于90℃反应5h后，将反应液旋转蒸发至干，所得固体用二氯甲烷溶解，用体积比100：1到20：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶剂进行柱层析分离提纯，所用层析柱为硅胶柱，得到产物0.129g，以三苯胺基甲醛计收率为35%，经HPLC检测纯度为95%。
对所得产物进行核磁表征，结果如下：
1H NMR (400 MHz, MeOD-d4) δ 8.10 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 7.96 (d, J = 6.6Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 7.59 (dd, J = 6.1, 3.7 Hz, 2H), 7.47 (d, J= 9.5 Hz, 1H), 7.37 (m, 5H), 7.17 (m, 9H), 6.98 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 3.69 (q,J = 7.0 Hz, 4H), 1.31 (t, J = 7.1 Hz, 6H)。13C NMR (100 MHz, MeOD-d4) δ 165.07,162.63, 158.87, 155.40, 151.38, 146.32, 143.27, 134.55, 130.40, 130.27,129.75, 129.46, 129.29, 129.22, 128.47, 127.44, 126.65, 125.87, 124.78,120.05, 116.34, 116.23, 114.98, 113.52, 95.75, 45.38, 38.81, 33.35, 30.20,28.69, 22.63, 11.36。
从核磁数据可以看出，所得产物结构式如式（I）所示，分子式为C40H35N2O3 +。
实施例2
一种检测二氧化硫的比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）将0.18g白色固体2 -（4 -（二乙氨基）-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸加至6ml丙酮和100ml 98wt%浓硫酸的混合溶液中，混合均匀后在50℃温度下反应8h，反应后，将反应液倒入冰水中，逐滴滴入高氯酸直至固体析出完全，收集固体，将固体用乙醇重结晶，得化合物B(0.14 g，0.42mmol)；
（2）将0.14 g化合物B与其两倍摩尔量的三苯胺基甲醛溶解在5ml醋酸中，于90℃反应5h后，将反应液旋转蒸发至干，所得固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂进行柱层析分离提纯，得到式（I）所示产物0.054g，以化合物B计收率为22%，经HPLC检测纯度为96%。
实施例3
一种检测二氧化硫的比率荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）将0.2g白色固体2 -（4 -（二乙氨基）-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸加至0.6ml丙酮和20ml 98wt%浓硫酸的混合溶液中，混合均匀后在55℃温度下反应2h，反应后，将反应液倒入冰水中，逐滴滴入高氯酸直至固体析出完全，收集固体，将固体用乙醇重结晶，得化合物B(0.1g，0.33mmol)；
（2）将0.1 g化合物B与其三倍摩尔量的三苯胺基甲醛溶解在4ml醋酸酐中，于50℃反应5h后，将反应液旋转蒸发至干，所得固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂进行柱层析分离提纯，得到式（I）所示产物0.015g，以化合物B计收率为8%，经HPLC检测纯度为90%。
实施例4
本发明所得荧光探针可以用于水体或生物体中二氧化硫的识别和检测，因为二氧化硫在水体和生物体中以亚硫酸的形式存在，因此也可以说本发明荧光探针可以用于水体或生物体中亚硫酸根的识别和检测。方法为：向待检测水体或生物体中加入本发明检测二氧化硫的比率荧光探针，调整pH为7左右，用荧光光谱仪检测体系的荧光光谱，荧光光谱的激发波长分别为460nm和640nm，发射波长为520nm和740nm，检测波长为520nm和740nm。随着二氧化硫含量的增加，740nm处的荧光强度会降低，520nm处的荧光强度会增加。通过此规律可以识别和检测二氧化硫。此外，荧光探针加入水体或生物体呈蓝色，与二氧化硫反应颜色会变浅，也可以在检测时设置不含二氧化硫的水提或生物体的空白对照，通过溶液颜色的变化来识别和检测二氧化硫。
下面，以亚硫酸钠水溶液为例，验证本发明荧光探针对不同浓度的二氧化硫的响应情况。
1、检测二氧化硫的比率荧光探针（简称荧光探针，下同）与二氧化硫的滴定实验
在PBS缓冲液（pH=7.4）中，加入初始浓度为1mM的实施例1的荧光探针，使溶液中荧光探针的浓度为10μM。然后，依次加入不同量的初始浓度为1.00mM的亚硫酸钠水溶液，使得溶液中亚硫酸钠的浓度分别为5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、100μM、140μM、180μM、250μM、300μM，同时以不加入亚硫酸钠的作为对照，静置0.5h使亚硫酸钠与荧光探针充分反应。
用荧光光谱仪测试不同浓度亚硫酸钠条件下的荧光光谱，荧光光谱的激发波长分别为460nm和640nm，发射波长为520nm和740nm，检测波长为520nm和740nm，结果分别如图1和图2所示。由图1和2可知，随着亚硫酸钠的浓度的增加，在520nm波长下的荧光强度逐渐增强，在740nm波长下的荧光强度逐渐减弱，说明本发明制备的荧光探针能够对二氧化硫进行响应。
2、检测二氧化硫的比率荧光探针与二氧化硫的荧光变化时间实验
在PBS缓冲液（pH=7.4）中，加入初始浓度为1mM的实施例2的荧光探针，使溶液中荧光探针的浓度为10μM。然后，向其中加入初始浓度为1.00mM的亚硫酸钠水溶液，使得溶液中亚硫酸钠的浓度为300μM，以亚硫酸钠溶液加入时的时间开始计时，测试不同时间条件下溶液的荧光光谱。
用荧光光谱仪测试不同时间条件下的荧光光谱，荧光光谱的激发波长为460nm，发射波长为520nm，检测波长为520nm，结果如图3所示。由图3可知，随着时间的增加，在460nm激发波长下的荧光强度逐渐增强，说明本发明制备的荧光探针能够对二氧化硫进行响应。
实施例5
对本发明检测二氧化硫的比率荧光探针（简称荧光探针，下同）的高选择性、抗干扰能力进行测试，方法如下：
在PBS缓冲液（pH=7.4）中，加入初始浓度为1mM的实施例3的荧光探针，使溶液中荧光探针的浓度为10μM。然后，向其中分别加入不同的生物活性小分子，使生物活性小分子的浓度均为 300μM，生物活性小分子分别为：CaCl2 、MgCl2、 ZnCl2、 NaBr、 NaCl、NaAc、 H2O2、HClO、 •OH、 GSH、 Hcy、 Cys、 NaNO2、 NaNO3、 NO, Na2S2O3、Na2S、亚硫酸钠，同时以不加任何生物活性小分子的荧光探针溶液作为空白对照，加入后静置0.5h进行荧光检测。
用荧光光谱仪测试加入不同生物活性小分子之后的荧光光谱，激发波长为460nm，发射波长为520nm，检测波长为520nm，结果如图4所示。由图4可知，1-19分别代表空白对照、Ca2+ 、Mg2+、 Zn2+、 Br-、 Cl-、Ac-、 H2O2、 ClO-、 •OH、 GSH、 Hcy、 Cys、 NO2 -、 NO3 -、 NO,S2O3 2-、S2-、SO3 2-，520nm处荧光强度只有亚硫酸根明显增强，其它生物活性小分子不对检测结果产生干扰，说明本发明制备的荧光探针对二氧化硫具有较高的选择性和较强的抗干扰能力。
实施例6
对本发明检测二氧化硫的比率荧光探针（简称荧光探针，下同）的灵敏度、检测限进行测试，方法如下：
在PBS缓冲液（pH=7.4）中，加入初始浓度为1mM的实施例1的荧光探针，使溶液中荧光探针的浓度为10μM。然后，依次加入不同量的初始浓度为1.00mM的亚硫酸钠水溶液，使得溶液中亚硫酸钠的浓度分别为5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、100μM、140μM、180μM、250μM、300μM，同时以不加入亚硫酸钠的作为对照，静置0.5h使亚硫酸钠与荧光探针充分反应。
用荧光光谱仪测试不同浓度亚硫酸钠条件下的荧光光谱，绘制亚硫酸钠浓度和荧光强度的标准曲线，得到标准方程，荧光光谱的激发波长分别为460nm和640nm，发射波长为520nm和740nm，检测波长为520nm和740nm。将荧光信号背景噪音值的三倍时的荧光强度带入标准方程，所对应的亚硫酸根浓度即为亚硫酸根的检测限，经计算，该探针对亚硫酸根的检测限为3.2 × 10-6 mol/L，即该探针对二氧化硫的检测限为3.2 × 10-6 mol/L，检测限低。

Claims (10)

1.一种检测二氧化硫的比率荧光探针，其特征是：具有式（I）所示的结构式：
。
2.根据权利要求1所述的比率荧光探针，其特征是：荧光探针的分子式为C40H35N2O3 +。
3.一种权利要求1或2所述的检测二氧化硫的比率荧光探针的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）将2 -（4 -（二乙氨基）-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸与丙酮在浓硫酸中进行反应，得到化合物B；2 -（4 -（二乙氨基）-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸结构式如下式A所示，化合物B结构式如下式B所示：
；
（2）将化合物B与三苯胺基甲醛在酸性环境中进行反应，得到式（I）所示的检测二氧化硫的荧光探针化合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，2 -（4 -（二乙氨基）-2-羟基苯甲酰基）苯甲酸和丙酮的摩尔比为1：12-150。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，丙酮和浓硫酸的体积比为6：20-200。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，化合物B与三苯胺基甲醛的摩尔比为1：1-3。
7.根据权利要求3或6所述的制备方法，其特征是：步骤（2）中，酸性环境由酸或酸酐提供，优选由醋酸、醋酸酐或甲磺酸提供；优选的，每mmol化合物B加入10-20ml酸或酸酐中。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，反应温度为45-55℃，反应时间优选为2-12h；步骤（2）中，反应温度为50-95℃，反应时间优选为5-6h。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：步骤（1）中，反应后的反应液倒入冰水中冷却，然后滴入高氯酸使固体析出，将所得固体重结晶，即为化合物B；步骤（2）中，反应后的反应液旋转蒸发至干，所得固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂进行柱层析分离，得到纯度较高的式（I）所示化合物。
10.一种检测水体或生物体中二氧化硫的方法，其特征是：将权利要求1所述的检测二氧化硫的比率荧光探针加入待检测水体或生物体中，观察体系的颜色和520nm、740nm处的荧光强度，体系颜色越浅、740nm处的荧光强度越低、520nm处的荧光强度越高，说明二氧化硫含量越高。
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