CN108991519A - 一种用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒及其制备方法 - Google Patents

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CN108991519A CN201810770667.8A CN201810770667A CN108991519A CN 108991519 A CN108991519 A CN 108991519A CN 201810770667 A CN201810770667 A CN 201810770667A CN 108991519 A CN108991519 A CN 108991519A
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Abstract

本发明涉及一种用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒及其制备方法，所述富含植物营养组织细胞颗粒为由可食用植物的胚性细胞构成的粒径不大于10mm的颗粒。本发明首次公开了富含植物营养组织细胞颗粒的饮料添加成分，含有蛋白质和可溶性糖等营养成分，且具有较好的清除自由基能力和抗氧化能力，并将植物营养细胞首次作为添加颗粒加入饮品中，显著提升了饮品的保健功能；同时该颗粒咀嚼后口感清爽润滑，口感独特。

Description

一种用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒及其制备 方法
技术领域
本发明涉及一种用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒及其制备方法，属于饮料制备技术领域。
背景技术
饮品通常是指以水为主要原料，经过添加各种辅助配料再通过各种工艺生产出来供人们直接饮用的液体食品。饮料的作用除补充人体水分外，由于含有糖类、果酸、乳类以及多种微量无机盐、氨基酸、蛋白质、维生素等成分，因此具有一定的营养功能。
饮料一般可分为含酒精饮品和无酒精饮品。按照GB10789-2007饮料通则，将无酒精饮料分为果蔬汁饮料类、蛋白饮料类、包装饮用水类、茶饮料类、咖啡饮料类、固体饮料类、特殊用途饮料类、植物饮料类、风味饮料类、其它饮料类等10类。
随着人们生活水平不断提高，人们对饮品消费提出了多样化需求，饮用既营养又健康的饮品逐渐成为一种新时尚。开发与众不同、满足人们对营养健康饮品的更高需求、对促进饮品业进一步发展和满足人们生活水平不断提高的需求具有重要意义。
愈伤组织(callus)是原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：启动期、分裂期和形成期。启动期指细胞准备进行分裂的时期。外源植物生长素对诱导细胞开始分裂效果很好。常用的有萘乙酸、吲哚乙酸、细胞分裂素等。通常使用细胞分裂素和生长素比例在1:1来诱导植物材料愈伤组织的形成。分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞，含有蛋白质、糖类等营养成分。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞等等。外植体的细胞经过启动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。
目前，通过文献检索，没有发现向饮品中添加植物来源的胚性营养组织细胞的相关报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒及其制备方法。
本发明技术方案如下：
一种用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒，所述富含植物营养组织细胞颗粒为由可食用植物的胚性细胞构成的粒径不大于10mm的颗粒。
根据本发明优选的，所述可食用植物选自：胡萝卜(Daucus carota L.)、番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)、蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)玉米(Zea mays L.)、小麦(Triticum aestivum L.)；进一步优选的，可食用植物选自蒲公英。
根据本发明优选的，所述的粒径为1～10mm；进一步优选的，所述的粒径为1.0m、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm、5.0mm、5.5mm、6.0mm、6.5mm、7.0mm、7.5mm、8.0mm、8.5mm、9.0mm、9.5mm、10.0mm或任意二者与其之间的范围。
根据本发明优选的，所述的胚性细胞为愈伤组织细胞。
上述用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)选取可食用植物的种子或其他组织进行消毒处理，然后接种于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，制得愈伤组织细胞；
(2)将步骤(1)培养获得的愈伤组织细胞进行继代培养，制得愈伤组织块；
(3)将步骤(2)制得的愈伤组织块经颗粒化处理，制得粒径不大于10mm的富含植物营养组织细胞颗粒。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的材料为蒲公英的幼叶。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的消毒处理，步骤如下：
摘取蒲公英幼叶后，流水冲洗1小时，在超净台上用百分比浓度为70％的酒精消毒20s，无菌水清洗三次，然后用有效氯0.2％的次氯酸钠消毒20min，无菌水清洗三次，剪成0.5×0.5cm叶片，即为愈伤组织诱导组织。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中愈伤组织诱导培养基，为在1/3MS培养基的基础上添加NAA至浓度为0.1～0.3mg/L或2,4-D至浓度为0.2～0.4mg/L，然后添加蔗糖至质量百分比浓度为1～5％。
进一步优选的，所述MS基础培养基，组份如下：
KNO3 1.9g/L，NH4NO3 1.65g/L，MgSO4·7H2O 0.37g/L，KH2PO4 0.17g/L，CaCl2·2H2O0.44g/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.83mg/L，CuSO4.5H2O 40.025mg/L,CoCL2.6H2O 0.025mg/L，Na2-EDTA 37.3mg/L，FeSO4.4H2O27.8mg/L，Na2MoO4·7H2O0.25mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫铵素0.1mg/L，烟酸0.5mg/L，肌酸100mg/L。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中诱导培养条件为：在无菌、暗培养条件下，24～26℃培养11～13h、22～24℃培养11～13h，培养14～16天。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中继代培养基为在1/3MS培养基的基础上添加6-BA至浓度为0.2～0.4mg/L和2,4-D至浓度为0.1～0.3mg/L，然后添加蔗糖至质量百分比浓度为1～5％。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中继代培养条件为：在无菌、暗培养条件下，24～26℃培养11～13h，22～24℃培养11～13h，培养9～11天。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，颗粒化处理为通过漩涡震荡仪在1000～2500rpm/min条件下处理5～20min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，还包括颗粒化处理后的过孔径为10mm的筛分步骤。
一种保健饮品，添加有上述富含植物营养组织细胞颗粒。
根据本发明优选的，所述富含植物营养组织细胞颗粒的添加量为不超过总质量的40％。
根据本发明优选的，所述富含植物营养组织细胞颗粒的添加量为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％或任意二者与其之间的范围。
有益效果
1、本发明首次公开了富含植物营养组织细胞颗粒的饮料添加成分，含有蛋白质和可溶性糖等营养成分，且具有较好的清除自由基能力和抗氧化能力，并将植物营养细胞首次作为添加颗粒加入饮品中，显著提升了饮品的保健功能；同时该颗粒咀嚼后口感清爽润滑，口感独特。
2、本发明采用粒径不大于10mm的胚性细胞颗粒作为添加颗粒加入饮品中，由于可采用不同来源的可食用植物材料培养，因此养分也由此不同。
附图说明
图1是蒲公英愈伤组织细胞可溶性糖测定标准曲线；
图2是蒲公英愈伤组织细胞蛋白质含量测定标准曲线；
图3是蒲公英愈伤组织细胞DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)清除率测定曲线；
图4是蒲公英愈伤组织细胞还原能力测定曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
培养基
MS基础培养基：
KNO3 1.9g/L，NH4NO3 1.65g/L，MgSO4·7H2O 0.37g/L，KH2PO4 0.17g/L，CaCl2·2H2O0.44g/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.83mg/L，CuSO4.5H2O 40.025mg/L,CoCL2.6H2O 0.025mg/L，Na2-EDTA 37.3mg/L，FeSO4.4H2O27.8mg/L，Na2MoO4·7H2O0.25mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫铵素0.1mg/L，烟酸0.5mg/L，肌酸100mg/L。
愈伤组织诱导培养基：
愈伤组织诱导培养基，为在1/3MS培养基的基础上添加NAA至浓度为0.2mg/L或2,4-D至浓度为0.3mg/L，然后添加蔗糖至质量百分比浓度为3％。
继代培养基：
继代培养基为在1/3MS培养基的基础上添加6-BA至浓度为0.3mg/L和2,4-D至浓度为0.2mg/L，然后添加蔗糖至质量百分比浓度为3％。
仪器设备：
漩涡震荡仪，品牌：Thmorgan型号：VM200；
实施例1
用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)选取籽粒饱满的蒲公英种子,去除颖片，流水浸泡24小时，在超净台上提及百分比浓度为70％的酒精消毒20s，无菌水清洗三次，然后用有效氯0.2％的次氯酸钠消毒20min，无菌水清洗三次，然后接种于愈伤组织诱导培养基上，在无菌、暗培养条件下，25℃培养12h，23℃培养12h，进行愈伤组织诱导培养15天，此时蒲公英种胚处诱导出的愈伤组织生长到直径0.2～0.4mm，制得愈伤组织细胞；
(2)将步骤(1)培养获得的愈伤组织细胞在无菌、暗培养条件下，25℃培养12h、23℃培养12h进行继代培养10天，经过多次继代培养，制得愈伤组织块；此时，愈伤组织块应为松散的淡黄色透明细胞团；
(3)将步骤(2)制得的愈伤组织块经漩涡震荡仪在2500rpm/min条件下处理5min，过孔径为3mm的筛网，制得粒径不大于3mm的富含植物营养组织细胞颗粒。
一种保健饮品，向饮品中添加质量10％的上述制备的富含植物营养组织细胞颗粒。
实施例2
用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)选取籽粒饱满的小麦种子，去除颖片，流水浸泡24小时，在超净台上提及百分比浓度为70％的酒精消毒20s，无菌水清洗三次，然后用有效氯0.2％的次氯酸钠消毒20min，无菌水清洗三次，然后接种于愈伤组织诱导培养基上，在无菌、暗培养条件下，25℃培养12h，23℃培养12h，进行愈伤组织诱导培养15天，此时小麦种胚处诱导出的愈伤组织生长到直径0.2～0.4mm，制得愈伤组织细胞；
(2)将步骤(1)培养获得的愈伤组织细胞在无菌、暗培养条件下，25℃培养12h、23℃培养12h进行继代培养10天，经过多次继代培养，制得愈伤组织块；此时，愈伤组织块应为松散的淡黄色透明细胞团；
(3)将步骤(2)制得的愈伤组织块经漩涡震荡仪在1000rpm/min条件下处理20min，过孔径为5mm的筛网，制得粒径不大于5mm的富含植物营养组织细胞颗粒。
植物营养组织细胞颗粒的饮料添加成分，含有蛋白质和可溶性糖等营养成分，且具有较好的清除自由基能力和抗氧化能力，并将植物营养细胞首次作为添加颗粒加入饮品中，显著提升了饮品的保健功能；
一种保健饮品，向饮品中添加质量10％的上述制备的富含植物营养组织细胞颗粒。
实施例3
用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)选取籽粒饱满的玉米种子,去除颖片，流水浸泡24小时，在超净台上提及百分比浓度为70％的酒精消毒20s，无菌水清洗三次，然后用有效氯0.2％的次氯酸钠消毒20min，无菌水清洗三次，然后接种于愈伤组织诱导培养基上，在无菌、暗培养条件下，25℃培养12h，23℃培养12h，进行愈伤组织诱导培养15天，此时玉米种胚处诱导出的愈伤组织生长到直径0.2-0.4mm，制得愈伤组织细胞；
(2)将步骤(1)培养获得的愈伤组织细胞在无菌、暗培养条件下，25℃培养12h、23℃培养12h进行继代培养10天，经过多次继代培养，制得愈伤组织块；此时，愈伤组织块应为松散的淡黄色透明细胞团；
(3)将步骤(2)制得的愈伤组织块经漩涡震荡仪在2000rpm/min条件下处理15，过孔径为10mm的筛网，制得粒径不大于10mm的富含植物营养组织细胞颗粒。
一种保健饮品，向饮品中添加质量10％的上述制备的富含植物营养组织细胞颗粒。
对比例1
一种保健饮品，向饮品中添加质量10％的经细胞破碎后的蒲公英愈伤组织浆液。
实验例1
胚性营养细胞提取液养分及清除自由基、还原力测定
可溶性糖含量测定
将1g蒲公英的愈伤组织加入30ml蒸馏水冰浴研磨，8000r/min离心10min后制得上清液即提取液。
取4支试管，其中3支中加入0.25ml的提取液和0.75ml蒸馏水，另1支加入1.0ml的蒸馏水代替提取液作为空白对照，再加入新鲜配置的蒽酮试剂4.0ml，管口加盖，防止蒸发。沸水保温10分钟后取出，立即用冰浴。以0号管调零并测取另外3支试管中提取液在紫外分光光度计620nm下的各自的吸光值。
取这3支试管吸光度值的平均值，并对应标准葡萄糖溶液的标准曲线查找相对应的糖含量值(配制标准葡萄糖溶液(100μg/ml，图1)，蒽酮试剂(2.0mg/ml)，梯度稀释后制作标准曲线)。根据下列公式计算出蒲公英提取液中可溶性糖的含量。
其中：C——在标准曲线上计算出的糖含量(μg)
V总——提取液总体积(ml)
V测——测定时取用体积(ml)
D——稀释倍数
W——样品重量(g)
106——样品重量单位由g换算成μg的倍数
计算最终蒲公英愈伤组织中可溶性糖的含量为4.948％。
蒲公英愈伤组织中可溶性蛋白质含量的测定
称取1g愈伤组织加10ml蒸馏水冰浴研磨，8000r/min离心10min后制得上清液即提取液。取3支试管，分别加入提取液0.1ml、0.2ml、0.3ml，并加去离子水至1.0ml，向每支试管中加入考马斯亮蓝G-250试剂5.0ml，静置5分钟后在紫外分光光度计595nm的波长下测其吸光度值，其中以1.0ml水加5.0ml的考马斯亮蓝G-250试剂作为空白对照。每组实验平行3次并取平均值。最后根据蛋白质溶液标准曲线(图2)查找出与其相对应的蛋白质含量数值，根据如下公式计算。
其中：
C——对应标准曲线中查得的蛋白质的含量(mg)
V测——蛋白质含量时所加的提取液的体积(ml)
V总——提取液的总体积(ml)
W——愈伤组织样品重量(g)
106——样品重量单位由g换算成μg的倍数
计算得到蒲公英愈伤组织中的蛋白质含量为0.313％。
蒲公英愈伤组织提取液清除自由基能力的测定
称取1g愈伤组织加10ml蒸馏水冰浴研磨，8000r/min离心10min后制得上清液即提取液。将提取液分别配制成0.1g/ml、0.2g/ml、0.3g/ml、0.4g/ml、0.5g/ml的不同浓度的提取液，取8支试管，与每一个浓度对应，在对应的试试管中加入对应的愈伤组织提取液2.0ml，后每支试管加入0.04mg/ml的DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)溶液(用无水乙醇配制)，加完后在25℃避光反应30分钟。计时结束后在紫外分光光度计517nm的波长下测定其吸光值A，其中以2ml水加2ml无水乙醇调零，以VC为阳性对照组，以2ml DPPH加2ml水为空白对照并测定其吸光值A0。
每组实验平行3次，对应浓度取其平均值，蒲公英愈伤组织对DPPH的清除能力根据公式计算得出。
蒲公英愈伤组织提取液浓度从0.1g/ml到0.5g/ml范围内，5个不同浓度所对应的DPPH清除率如图3所示。随着提取液浓度的增加，清除率增高，在浓度达到0.4g/ml时，接近最大值。
蒲公英愈伤组织还原能力的测定
称取1g愈伤组织加10ml蒸馏水冰浴研磨，8000r/min离心10min后制得上清液即提取液。将蒲公英愈伤组织提取液配制成0.1g/ml、0.2g/ml、0.3g/ml、0.4g/ml、0.5g/ml的不同浓度的提取液，取不同浓度提取液1.0ml，依次加入2.5ml的磷酸盐缓冲液(0.2mol/l，pH6.6)，2.5ml的铁氰化钾(1％，w/v)溶液，在50℃水浴下反应20分钟。计时结束后取出，加入0.5ml的三氯乙酸(10％，w/v)，摇匀后终止反应。待反应终止后取出上清2.5ml加入2.5ml水，再加入0.5ml的三氯化铁(0.1％，w/v，浓盐酸溶解后用水配制)，反应后于700nm的波长下测定其吸光值，每组实验平行3次，以水代替提取液为对照组。
蒲公英愈伤组织提取液的还原能力如图4所示。随着提取液浓度的增加，还原能力增强，二者呈现出了较好的线性关系。
实验例2
将实施例1和对比例1制得的保健饮品在常规饮料包装保存条件下保存3个月后，按照实验例1的方法进行检测。
检测结果显示，实施例1中各种营养成分及生物活性没有损失，而对比例1中生物活性物质下降73％。

Claims (9)

1.一种用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒，所述富含植物营养组织细胞颗粒为由可食用植物的胚性细胞构成的粒径不大于10mm的颗粒。
2.如权利要求1所述的用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒，其特征在于，所述可食用植物选自：胡萝卜(Daucus carota L.)、番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)、蒲公英(Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.)玉米(Zea mays L.)、小麦(Triticumaestivum L.)；进一步优选的，可食用植物选自蒲公英。
3.如权利要求1所述的用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒，其特征在于，所述的粒径为1～10mm；进一步优选的，所述的粒径为1.0m、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm、5.0mm、5.5mm、6.0mm、6.5mm、7.0mm、7.5mm、8.0mm、8.5mm、9.0mm、9.5mm、10.0mm或任意二者与其之间的范围。
4.如权利要求1所述的用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒，其特征在于，所述的胚性细胞为愈伤组织细胞。
5.权利要求1所述用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选取可食用植物的种子或其他组织进行消毒处理，然后接种于愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养，制得愈伤组织细胞；
(2)将步骤(1)培养获得的愈伤组织细胞进行继代培养，制得愈伤组织块；
(3)将步骤(2)制得的愈伤组织块经颗粒化处理，制得粒径不大于10mm的富含植物营养组织细胞颗粒。
6.权利要求1所述用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的材料为蒲公英的幼叶；
优选的，所述步骤(1)中的消毒处理，步骤如下：
摘取蒲公英幼叶后，流水冲洗1小时，在超净台上用百分比浓度为70％的酒精消毒20s，无菌水清洗三次，然后用有效氯0.2％的次氯酸钠消毒20min，无菌水清洗三次，剪成0.5×0.5cm叶片，即为愈伤组织诱导组织；
优选的，所述步骤(1)中愈伤组织诱导培养基，为在1/3MS培养基的基础上添加NAA至浓度为0.1～0.3mg/L或2,4-D至浓度为0.2～0.4mg/L，然后添加蔗糖至质量百分比浓度为1～5％；
进一步优选的，所述MS基础培养基，组份如下：
KNO3 1.9g/L，NH4NO3 1.65g/L，MgSO4·7H2O 0.37g/L，KH2PO4 0.17g/L，CaCl2·2H2O0.44g/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，H3BO3 6.2mg/L，KI 0.83mg/L，CuSO4.5H2O 40.025mg/L,CoCL2.6H2O 0.025mg/L，Na2-EDTA 37.3mg/L，FeSO4.4H2O 27.8mg/L，Na2MoO4·7H2O0.25mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫铵素0.1mg/L，烟酸0.5mg/L，肌酸100mg/L。
7.权利要求1所述用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中诱导培养条件为：在无菌、暗培养条件下，24～26℃培养11～13h、22～24℃培养11～13h，培养14～16天；
优选的，所述步骤(2)中继代培养基为在1/3MS培养基的基础上添加6-BA至浓度为0.2～0.4mg/L和2,4-D至浓度为0.1～0.3mg/L，然后添加蔗糖至质量百分比浓度为1～5％；
优选的，所述步骤(2)中继代培养条件为：在无菌、暗培养条件下，24～26℃培养11～13h，22～24℃培养11～13h，培养9～11天。
8.权利要求1所述用于饮品添加的富含植物营养组织细胞颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，颗粒化处理为通过漩涡震荡仪在1000～2500rpm/min条件下处理5～20min；
优选的，所述步骤(3)中，还包括颗粒化处理后的过孔径为10mm的筛分步骤。
9.一种保健饮品，其特征在于，添加有权利要求1所述富含植物营养组织细胞颗粒；
优选的，所述富含植物营养组织细胞颗粒的添加量为不超过总质量的40％；
优选的，所述富含植物营养组织细胞颗粒的添加量为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％或任意二者与其之间的范围。
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