CN108990420B - 肝病相关生物标志物和其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生物标志物和生物标志物组合，可用于评估受试对象的肝病状态、监测肝脏疾病、区分肝脏疾病、治疗本发明方法评估的受试对象、提供诊断受试对象肝病状态的相关检测方法以及试剂盒。

Description

肝病相关生物标志物和其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请主张2016年5月29日提交的编号为62/343,010的美国临时申请的优先权并将通过引用合并至本申请。

技术领域

本发明涉及与肝病(肝脏疾病)有关的生物标志物，使用生物标志物诊断肝脏疾病，监测肝脏疾病进展，对肝脏疾病进行分层，或区分肝脏疾病的方法，用于这些方法的试剂盒，以及通过本发明的方法诊断的受试者的治疗。

背景技术

肝纤维化是肝损伤引起的伤口愈合反应(Chang TT，et al.Long-term entecavirtherapy results in the reversal of fibrosis/cirrhosis and continuedhistological improvement in patients with chronic hepatitis B.Hepatology 52，886-893(2010)；George SL，Bacon BR，Brunt EM，Mihindukulasuriya KL，Hoffmann J，DiBisceglie AM.Clinical，virologic，histologic，and biochemical outcomes aftersuccessful HCV therapy:a 5-year follow-up of 150patients.Hepatology 49，729-738(2009))，是慢性肝功能衰竭的常见原因，也是肝细胞癌的主要风险因素。其中，乙型、丙型肝炎病毒感染，自身免疫性疾病，胆道疾病，酗酒及非酒精性脂肪性肝炎是世界范围内慢性肝病的最常见的原因，在多年或数十年时间中可导致肝纤维化和肝硬化(Bataller R，Brenner DA.Liver fibrosis.The Journal of clinical investigation 115，209-218(2005))。在工业化国家中，约15％到20％的脂肪肝患者会进展为肝纤维化和肝硬化；他们之中，约30-40％的患者终将死于肝功能衰竭，肝癌，或肝移植后癌症复发(Shneider BL，Gonzalez-Peralta R，Roberts EA.Controversies in the management of pediatricliver disease:Hepatitis B，C and NAFLD:Summary of a single topicconference.Hepatology 44，1344-1354(2006))。肝纤维化的检测和分期以及向肝硬化的进展一直是肝脏病学的一个长期挑战。近期研究表明，肝纤维化是可以逆转的(Chang TT，et al.)，因此，强调了需要对这些患者的治疗反应的长期的监测和监视。

对慢性肝病患者的肝病严重程度的客观评估也越来越重要，比如对患病程度较轻的患者的治疗前决策和评估，他们没有接受治疗，仅仅是期望随访。随着肝纤维化/肝硬化患病率的增加，鉴定其进展对临床医生来说是一种挑战。在日常临床常规中，用于监测肝纤维化/肝硬化状态的可靠的血清生物标志物将是十分理想的监测指标。慢性肝病的预后和管理在很大程度上取决于肝纤维化的程度和进展。

目前，肝活组织检查是评估出现肝纤维化和肝纤维化程度的黄金标准。而此种手段有很大的局限性，比如侵入性，取样失误，观察者内和观察者间的可变性创建长时间切身需要精确的非侵入性检查。显著的肝纤维化的出现是抗病毒治疗的指示，而肝硬化的出现是需要特别监测与门静脉高压以及HCC的风险增加有关的并发症的指示。

开发简单而可靠的非侵入性肝病标志物一直都是临床肝脏病学的重要目标并且将促进临床实验的设计。然而，尽管进行了多次尝试，该领域仍未能产生可被多方接受的非侵入性方案。提供非侵入性方法的这些尝试通常分为三类:(ⅰ)由与肝功能相关的常规实验室检查组成的血清学标志物，(ⅱ)由细胞外基质合成和降解的产物和参与这些过程的酶组成的纤维化生物标志物，(ii i)成像技术，其涵盖诸多方面，从普通肝脏非特异性技术，如超声(US)，计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)(Taouli B，Ehman RL，ReederSB.Advanced MRI methods for assessment of chronic liver disease.AJR Americanjournal of roentgenology 2009；193:14-27；.Brancatelli G，Federle MP，AmbrosiniR，et al.Cirrhosis:CT and MR imaging evaluation.European journal of radiology2007；61:57-69.)到肝脏特异性技术，如瞬时弹性成像技术(TE)(FibroScan)(TalwalkarJA.Elastography for detecting hepatic fibrosis:options andconsiderations.Gastroenterology 2008；135:299-302.Sandrin L，Fourquet B，Hasquenoph JM，et al.Transient elastography:a new noninvasive method forassessment of hepatic fibrosis.Ultrasound in medicine&biology 2003；29:1705-13..Meng F，Zheng Y，Zhang Q，et al.Noninvasive Evaluation of Liver FibrosisUsing Real-time Tissue Elastography and Transient Elastography(FibroScan).JUltrasound Med 2015；34:403-10)。但是，成像形式在腹水患者，中心静脉压升高患者和肥胖患者中具有有限的精确度。上述三类中，常规血清学标志物似乎由于其广泛的可用性和成本相对较低，看起来很有吸引力，但目前同样没有提供可被多方接受的方案。这些包括血液学和化学实验室检查组成的评分系统，比如，Fibro检测(Imbert-Bismut F，Ratziu V，Pieroni L，Charlotte F，Benhamou Y，Poynard T.Biochemical markers of liverfibrosis in patients with hepatitis C virus infection:a prospectivestudy.Lancet 2001；357:1069-75)，AST和ALT的比值(Sheth SG，Flamm SL，Gordon FD，Chopra S.AST/ALT ratio predicts cirrhosis in patients with chronic hepatitisC virus infection.Am J Gastroenterol 1998；93:44-8.Park SY，Kang KH，Park JH，etal.[Clinical efficacy of AST/ALT ratio and platelet counts as predictors ofdegree of fibrosis in HBV infected patients without clinically evident livercirrhosis].Korean J Gastroenterol 2004；43:246-51)以及APRI指数(Wai CT，GreensonJK，Fontana RJ，et al.A simple noninvasive index can predict both significantfibrosis and cirrhosis in patients with chronic hepatitis C.Hepatology 2003；38:518-26)在过去几年中被研发并且经过验证被认为是HCV患者中肝纤维化程度的很好的预测因子。然而，这些研究的结果并不一致。因此，仍然需要肝脏疾病状态的非侵入性检查。

因此，本领域需要的是一种生物标志物组合，其能够确定受试者中出现肝脏疾病，区分肝脏疾病，对肝脏疾病进行分期以及监测肝脏疾病的进展。迄今为止，有关非酒精性脂肪性肝炎，肝纤维化和肝硬化以及其他肝病的诊断的文献还没有报道这样的生物标志物组合。

发明概述

本发明涉及与患有肝脏疾病的受试者相关的生物标志物的鉴定。本发明提供用于诊断方法、诊断试剂盒和治疗方法的生物标志物的组合。本发明的诊断方法可选择地包括下列中的任何一者:诊断受试者的肝脏疾病，监测受试者的肝脏疾病进展，通过期和严重程度对受试者的肝脏疾病分层，对受试者的肝脏疾病进行区分。本发明的治疗方法包括治疗由本发明的诊断方法鉴定的受试者。本发明的试剂盒包含用于执行本发明的诊断方法的一种或多种试剂。

第一方面，本发明提供生物标志物组合。该生物标志物组合可被测量并且用于执行本发明的诊断方法。该组合包括一组一种或多种生物标志物，可用于使用生物标志物组合的本发明的方法、试剂盒、计算机可读介质、系统和其他方面。

第二方面，本发明还提供了一种诊断方法。本发明的诊断方法包括测量，从受试者获得的生物样本中，本文教导的组合的每种生物标志物的水平，并且基于测量的水平评估肝脏疾病状态。

可选择地，评估步骤可包括诊断肝脏疾病或其进展状态，监测肝脏疾病进展，或区分两种或更多种肝脏疾病或肝纤维化期。

可选择地，评估步骤可包括将每种生物标志物(例如单独地或共同地)的测量水平与肝脏疾病状态相关联。例如:关联包括：

a.比较组合的每种生物标志物的测量水平与比较水平(例如，指示没有肝脏疾病状态的肝脏疾病状态的水平指示)，以及基于该比较评估受试者；

b.基于模型(例如，算法)的输出评估受试者，其中该模型是根据组合的每种生物标志物的测量水平的输入执行的；或者

c.提供图谱，该图谱由取自受试者的生物样本的质谱分析生成，从该图谱提取数据，以及对数据进行单变量和多变量分析，单变量和多变量分析对，例如一对锋，对应于组合的各自生物标志物，是不可或缺的。

可选择地，肝脏疾病状态是出现脂肪性肝炎(例如，NASH)，肝纤维化，或肝硬化，或其期或等级。例如，肝脏疾病状态可以是肝纤维化期(例如，基于代谢功能反应的早期，中期或晚期)或肝硬化期(例如，肝硬化的Child-Pugh(CP)等级)。

可选择地，受试者是下列中的任一者:以前未被诊断为患有肝脏疾病或肝纤维化的受试者，未经过肝脏疾病治疗的受试者或已经接受肝脏疾病治疗的受试者。

可选择地，样本是血液、血浆、血清。在一个具体实施方案中，该样本是血清。

可选择地，测量方法包括质谱(‘MS’)。可选择地，MS包括飞行时间质谱(‘TOFMS’)，三重四极质谱(‘TQMS’)或四极子飞行时间质谱(‘QTOFMS’)。MS可以如下进行，例如，单独的技术，比如气相色谱(‘GC’)或液相色谱(‘LC’)，比如超高效液相色谱(‘UPLC’)。如此，本发明可以采用GC-MS，LC-MS，UPLC-MS。可选择地，本发明采用GC-TOFMS，UPLC-QTOFMS或LC-TQMS。

第三方面，本发明提供一种治疗方法，包括向已经被本发明的诊断方法评估为患有肝脏疾病的受试者施用或推荐(以下统称或单独地称为“施用”)肝脏疾病治疗。

可选择地，该治疗是减少受试者展示的组合的一种或多种生物标志物的水平与比较水平之间的差距的，指示减少的肝损伤或减小的肝脏疾病严重程度或进展的治疗。

可选择地，治疗包括施用治疗药物，例如，小分子治疗药物。

可选择地，方法进一步包括在施用治疗之后，测量从治疗后的受试者得到的样本中的组合的每种生物标志物水平，并将治疗后水平与治疗前水平进行比较，并评估该治疗是否降低了受试者的肝损伤或降低了肝脏疾病的严重程度或进展。可选择地，方法进一步包括在确定肝损伤或肝脏疾病的严重程度或进展没有通过该治疗降低或产生较差的疗效(例如，进展或严重程度没有降低到预定阀值量)之后改进治疗。

第四方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括一种或多种试剂，用于检测本文教导的一种或多种生物标志物组合。一种或多种试剂包括一种或多种内标物，其中该一种或多种内标物共同地为该组合的每种生物标志物提供至少一种内标物。可选择地，试剂盒包括所述内标物的混合物。可选择地，一种或多种内标物是冻干的。可选择地，一种或多种内标被沉积在过滤装置上。可选择地，在一种或多种试剂被设置在容器内。可选择地，试剂盒包含检测生物标志物的说明书，例如，用以评估肝脏疾病状态(例如:诊断肝纤维化)。

第五部分，本发明提供了一种永久计算机可读介质，其包括软件，该软件用于基于本文教导的组合的一种或多种生物标志物的测量水平评估肝脏疾病状态。该软件包括用于分析从图谱中提取的数据的算法，该图谱是由从受试者得到的生物样本的质谱分析生成的，其中所述数据与组合的生物标志物相关。

在本发明的任一方面，组合包括一种或多种胆汁酸，一种或多种游离脂肪酸，一种或多种氨基酸和/或一种或多种碳水化合物(例如，如表1中所列)。

可选择地，一种或多种胆汁酸选自表1中列出的胆汁酸。

可选择地，一种或多种游离脂肪酸选自表1中列出的胆汁酸。

可选择地，一种或多种氨基酸选自表1中列出的氨基酸。

可选择地，组合包括一种或多种胆汁酸，选自表1中列出的胆汁酸，一种或多种游离脂肪酸，选自表1中列出的胆汁酸，一种或多种氨基酸，选自表1列出的氨基酸，一种或多种碳水化合物，选自表1中列出的碳水化合物。

可选择地，一种或多种胆汁酸选自表2中列出的胆汁酸。

可选择地，一种或多种游离脂肪酸选自表2中列出的胆汁酸。

可选择地，一种或多种氨基酸选自表2中列出的氨基酸。

可选择地，组合包括一种或多种胆汁酸，选自表2中列出的胆汁酸，一种或多种游离脂肪酸，选自表2中列出的胆汁酸，一种或多种氨基酸，选自表2中列出的氨基酸，一种或多种碳水化合物，选自表2中列出的碳水化合物。

可选择地，该组合为表3中列出的组合(即，在表3A或表3B中)。

附图的简要说明

图1描述了利用肝脏疾病患者和健康对照(Ctrl)的所有鉴定的差异胆汁酸(A)，游离脂肪酸(B)和氨基酸(C)建立的OPLS-DA评分图。

图2A描述了使用GCA，GCDCA，TCA和TCDCA诊断(即，区分)0期纤维化(NASH患者)与健康对照的受试者工作特征(ROC)曲线。AUC为0.921。

图2B描述了使用β-丙氨酸诊断(即，区分)0期纤维化(NASH患者)与健康对照的ROC曲线。AUC为1.000。

图2C描述了使用C18:2(反式-9，12)诊断(即，区分)0期纤维化(NASH患者)与健康对照的ROC曲线。AUC为1.000。

图3描述了使用丝氨酸，DCA和7-KLCA的联合诊断(即，区分)0期纤维化与1期纤维化(NAHS对比纤维化)的ROC曲线。AUC为0.886。

图4描述了利用患有0期和1期的肝纤维化的患者的丝氨酸，DCA和7-KLCA建立的OPLS-DA评分图。

图5描述了使用C14:1-顺式9，C20:4-顺式5.8.11.14，β-丙氨酸，瓜氨酸，异亮氨酸、甲硫氨酸，鸟氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，苏氨酸，酪氨酸，CDCA和GUDCA的联合诊断(即，区分)纤维化患者与肝硬化患者的ROC曲线。AUC为0.942。

图6描述了使用患有肝纤维化和肝硬化的患者的C14:1-顺式9，C20:4-顺式5.8.11.14，β-丙氨酸，瓜氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，鸟氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，苏氨酸，酪氨酸，CDCA，和GUDCA建立的OPLS-DA评分图。

图7描述了NASH，肝纤维化和肝硬化患者以及健康对照的GUDCA的柱状图(ng/mL，平均值±SEM)。A，所有受试者；B，男性受试者；和C，女性受试者。与健康对照相比，NASH，肝纤维化和肝硬化患者的GUDCA显著增加，且它们随肝脏疾病进展逐渐增加。**表示p＜0.01，相互比较。

图8描述了NASH，肝纤维化和肝硬化患者以及健康对照的TCDCA柱状图(ng/mL，平均值±SEM)。A，所有受试者；B，男性受试者；和C，女性受试者。与健康对照相比，NASH，肝纤维化和肝硬化患者的TCDCA显著增加，且它们随肝脏疾病进展逐渐增加。**表示p＜0.01，相互比较。

图9描述了NASH，肝纤维化和肝硬化患者以及健康对照的酪氨酸的柱状图(强度，平均值±SEM)。A，所有受试者；B，男性受试者；和C，女性受试者。与健康对照相比，NASH，肝纤维化和肝硬化患者的酪氨酸显著增加，且它们随肝脏疾病进展逐渐增加。**表示p＜0.01，相互比较。

图10描述了不同期的肝纤维化患者和Child-Pugh A，B和C肝硬化患者的GUDCA的柱状图(ng/mL，平均值±SEM)。A，所有受试者；B，男性受试者；和C，女性受试者。GUDCA随肝脏疾病的进展逐渐增加。*表示0.05；**表示p＜0.01，相互比较。

图11描述了不同期的肝纤维化患者和Child-Pugh A，B和C肝硬化患者的酪氨酸的柱状图(强度，平均值±SEM)。A，所有受试者；B，男性受试者；和C，女性受试者。酪氨酸随肝脏疾病的进展逐渐增加。*表示p＜0.05；**表示p＜0.01，相互比较。

图12A描述了利用采用所有测量的胆汁酸的典型判别分析生成的函数建立的图。

图12B描述了利用采用所有测量的游离脂肪酸的典型判别分析生成的函数建立的图。

图12C描述了利用采用所有测量的氨基酸的典型判别分析生成的函数建立的绘图。

图13描述了不同期的肝纤维化患者和Child-Pugh A，B和C肝硬化患者的酪氨酸的柱状图(强度，平均值±SEM)。酪氨酸随肝脏疾脏疾病的进展逐渐增加。*表示p＜0.05；**表示p＜0.01，相互比较。

图14A和图14B描述了本发明的试剂盒。

图15描述了本发明的试剂盒。

图16A-16K描述了说明本发明的生物标志物的诊断效能(diagnostic power)的图表。

图17A-17F描述了说明本发明的生物标志物的诊断效能的图表。

图18描述了利用肝纤维化患者和健康对照的所有鉴定的BAs建立的OPLS-DA评分图。

图19A描述了NASH，纤维化和肝硬化的肝病患者和糖尿病患者和对照的GCA，GCDCA，TCA，TUDCA和7-KLCA(ng/mL，平均值±SEM)的柱状图。

图19B描述了利用建立的BA组合的测试集(testing set)的CLD患者和糖尿病患者的ROC曲线。

图20描述了利用函数建立的图，该函数是利用对照组，NASH、纤维化和肝硬化患者组的GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCA典型判别分析生成的。

图21描述了利用所有差异表达的BAs构建HB，肝纤维化，肝硬化和HCC患者的OPLS-DA评分图。

图22描述了利用函数建立的图，该函数是利用HB，肝纤维化，肝硬化和HCC患者组的GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCA的典型判别分析生成的。

图23描述了胆汁酸调节剂作为肝癌治疗的研究的数据。

图24描述了胆汁酸调节剂作为肝癌治疗的研究的数据。

图25描述了胆汁酸调节剂作为肝癌治疗的研究的数据。

图26描述了胆汁酸调节剂作为肝癌治疗的研究的数据。

图27描述了胆汁酸调节剂作为肝癌治疗的研究的数据。

图28描述了胆汁酸调节剂作为肝癌治疗的研究的数据。

图29描述了通过BAs可协同起作用促进肝脏癌变的发生机制。

图30描述了利用包括甘氨胆酸(GCA)，牛磺胆酸(TCA)，棕榈油酸(C16:1n7)，棕榈酸(C16:0)，棕榈酸(C16:0)/棕榈油酸(C16:1n7)，酪氨酸和果糖的生物标志物组合区分肝纤维化的三个期的ROC曲线。

图31描述了肝脏疾病患者在随机树空间中的分布。

图32描述了对治疗或预防肝脏疾病有用的化合物的实例。

发明的详细说明

方法

概述

本发明的一个实施方式提供包括评估受试者的肝脏疾病状态的诊断方法。可选择地，肝脏疾病状态可以通过测量，从受试者获得的样本中，本文教导的组合的一种或多种生物标志物的水平以及将一种或多种生物标志物的水平的测量水平与疾病状态相关联来评估。基于关联，本发明可以鉴定患有肝脏疾病状态的受试者。例如，肝脏疾病状态可以是肝脏疾病(例如:肝纤维化)的存在或肝脏疾病的严重程度或进展(例如:期或等级，比如区分肝纤维化的期或区分非肝硬化的肝纤维化和肝硬化)。可选择地，本发明的方法可用于诊断肝脏疾病或其进展或严重程度(例如:肝纤维化或肝硬化的进展)，监测肝脏疾病进展(例如:肝纤维化或肝硬化的进展)或区分两种或更多种肝脏疾病。

为了阐述实施本发明的一个非限制性实施例，本发明教导了使用LC-MS或GC-MS和多变量统计分析，通过比较肝脏疾病患者和健康对照的代谢谱来检测人血清样本中的分子变化，鉴定肝脏疾病的代谢物谱(metabolic profiles)，肝脏疾病的生物标志物，以及监测肝脏疾病进展的方法。其他说明性实施例提供了监测诊断方法，该监测诊断方法是基于生物标志物组合的检查的，该生物标志物组合由于在检测肝脏疾病以及肝纤维化和杆硬化进展中有效而被选择。检查具有较高程度的临床敏感性和特异性。可选择地，检查是基于使用联合的MS技术的生物样本分类方法。更具体地说，本发明可选择地利用LCMS和GC-MS来鉴定小分子代谢物，包括在患者血清样本中发现的一组代谢生物标志物。

可选择地，选择被鉴定为患有肝脏疾病的受试者接受肝脏疾病治疗，例如，根据本文教导的治疗方法。

可选择地，该诊断方法包括监测组合的一种或多种生物标志物的水平。该监测方法可包括提供可由受试者首次提供的第一生物样本(例如:经历治疗前或第一阶段治疗后)和可由受试者后来提供的第二生物样本(例如:治疗后或第二阶段治疗后)，测量第一样本和第二样本中的一种或多种生物标志物的水平，以及比较第一样本和第二样本中的测量的生物标记物的水平。

可选择地，本发明的方法包括通过测量包括来自受试者的样本中的一种或多种胆汁酸代谢物的组合以及将一种或多种代谢物的水平与存在或不存在肝脏疾病相关联来诊断或监测肝脏疾病。可选择地，该组合还包含代谢物，例如:脂肪酸，氨基酸和/或碳水化合物(例如:表1所列的)。可选择地，代谢物选自表1中所列的生物标志物。或者，代谢物选自表2中所列的生物标志物。另外或作为选择，组合是表3中所列的组合(例如:表3A或表3B中)。

受试者

本发明的方法可以测量从受试者得到的生物样本中的一种或多种生物标志物的水平。该受试者可以是任何受试者，例如人受试者。

可选择地，受试者是任何恒温动物，例如:哺乳纲的一员，比如，不局限于，人类或非人类灵长类动物，如黑猩猩，猿或猴；农场动物，如牛，羊，猪，山羊或马；家养哺乳动物，如狗或猫；实验动物，如小鼠或大鼠。

受试者可以是任何年龄或性别。例如:受试者可以是成年人，非成年人，婴儿，成年动物或未成年动物。

可选择地，受试者为男性。

可选择地，受试者为女性。

可选择地，本发明的实施方式可包括比较生物标志物组合的水平与对照样本的水平。可选择地，对照是健康对照样本或包含等同于健康对照的生物标志物水平的样本。这里使用的，健康对照指临床上无肝脏疾病(例如:通过肝活组织检查鉴定)的健康受试者。健康对照样本是指已经从健康对照受试者获得的生物流体样本。

出人意料的是，本发明可用于关联受试者的肝脏疾病状态，例如:显示或没有显示肝脏疾病的典型表型的受试者。

可选择地，可实施本发明以评估未被怀疑和不容易患有肝病的受试者的肝脏疾病状态。

可选择地，受试者是以下任一者:以前未被诊断为患有肝脏疾病的受试者，以前未被诊断为患有肝脏疾病的受试者，其中得到了该受试者的样本并且本发明的方法用于评估该样本的肝脏疾病，以前或最近(例如:一年内)没有进行肝活组织检查的受试者，以前未被诊断为乙肝或丙肝病毒感染的受试者，未被诊断为或没有酗酒或过度饮酒的受试者，未被诊断为或未患有非酒精性肝病(NALD)的受试者，未被诊断为或未患有糖尿病或肥胖的受试者，未被诊断为暴露于黄曲霉毒素的受试者，或代谢健康受试者(例如，基于PCT/US16/57538中教导的HBA1c水平或其他代谢诊断)，表达与健康肝功能有关的血清学标志物谱(serological marker profile)的受试者，不表达临床上显著大量的由胞外基质合成和降解的产物以及参与这些过程的酶组成的肝纤维化生物标志物的受试者，如果检查，没有出现选自超声(US)、计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)或瞬时弹性成像(TE)(FibroScan)的提示肝脏疾病的检查结果的受试者，或者，如果检查，没有出现提示肝纤维化的检查结果的受试者，其中检查选自FibroTest、AST与ALT的比值和APRI指数。

可选择地，实施本发明以评估怀疑、证实患有肝脏疾病或存在患有肝脏疾病风险的受试者的肝脏疾病状态。

可选择地，受试者是以下任一种:以前被诊断为或患有乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染的受试者，被诊断为或具有酗酒或重度饮酒的受试者，被诊断为或患有非酒精性肝病(NALD)的受试者，被诊断为或患有糖尿病或肥胖的受试者，已暴露于黄曲霉毒素的受试者，表达与肝功能不良相关的血清学标志物谱的受试者，表达临床显著大量的由细胞外基质合成和降解的产物以及参与这些过程的酶构成的肝纤维化生物标志物的受试者，出现选自超声(US)、计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)，到肝脏特异技术，比如瞬时弹性成像(TE)(FibroScan)的提示肝脏疾病的检查结果的受试者，或者出现检查结果提示患有肝纤维化的受试者，其中检查选自FibroTest、AST与ALT比值和APRI指数的。

可选择地，受试者未患有肝细胞癌(HCC)。或者，可选择地，受试者患有HCC。

虽然本文教导的实施例详细描述了乙型肝炎感染的受试者群体的肝脏疾病状态(例如:脂肪性肝炎，NASH，纤维化或肝硬化)的评分模型和生物标志物信号(biomarkersignatures)的制作，但是发明人相信，生物标志物水平是肝脏的代谢状态的写照，肝脏的代谢状态受肝炎(例如:脂肪性肝炎)、肝纤维化或肝硬化的存在控制，不单单受病毒的存在控制。因此，本发明可以在有或没有乙型肝炎病毒感染的受试者身上实施。同理，尽管本文教导的实施例详细描述了患有NASH的受试者群体的脂肪性肝炎的评分模型和生物标志物信号的制作，但是发明人相信该生物标志物水平是肝脏代谢状态的写照，肝脏代谢状态受肝炎(例如:脂肪性肝炎)存在控制，并且生物标志物用于诊断由任何原因(酗酒或非酗酒)导致的肝纤维化或肝炎。因此，本发明可以在酗酒或非酗酒受试者身上实施，例如，用以鉴定受试者患有酒精性脂肪肝或NASH。

样本

本发明的方法可以测量从受试者得到的生物样本(‘样本’)中的一种或多种生物标志物水平。

可选择地，样本包括血液、血浆或血清或由血液、血浆或血清组成。例如:任何这样的样本可以从禁食一段时间后的受试者获得。禁食样本的收集在本领域是熟知的。

可选择地，样本包括血清或由血清组成。如本文所使用的，“血清”是指除去血纤维蛋白凝块和血细胞后得到的血液流体部分，与循环血液中的血浆不同。

内标物(internal standerds)

可选择地，本发明的方法包括使用测量的一种或多种(例如:每一种)生物标志物的内标物。可选择地，在测量之前，可将内标物与样本混合。

可选择地，在样本制备前在样本中具有已知初始水平的内标物可提供用于使各自生物标志物的信号归一化的测量信号。

样本制备步骤有时会在测量前导致生物标志物的大量损失。虽然开发可预测样品制备技术的和使用相同的分离和测量仪器(例如:相同的LC-MS机器)可提高测量的准确度和精确度，但是使用不同的样本制备介质、方法和测量机器(例如:通过不同的实验室)会导致生物标志物回收和/或测量信号的不可预测的变化。因此，可选择地，内标物在本发明中可用于在样本制备和测量期间校正各自生物标志物的损失(即，回收不一致)和/或信号水平变化。

可选择地，内标物是与组合的相应生物标志物相同的化合物，除了它具有一个或多个原子被该一个或多个原子的稳定的同位素(例如，(2)H，(13)C，(15)N或(18)O)取代之外。例如，给定生物标志物组合的一组内标物可通过提供每种生物标志物的同位素标记的变体来提供。

可选择地，内标化合物与测量的各自一种或多种生物标志物在化学上是类似的，但不相同，使得该内标物在样本制备期间显示类似的行为，但是在检测步骤期间可被唯一地识别。可选择地，选择内标物使得样品制备对内标物的测量信号水平的影响相对于各自生物标志物的测量信号水平是相同的。

可选择地，内标物在一个或更多个制备步骤(例如:提取或纯化)和生物标志物分离步骤之前与样本混合。

可选择地，组合包含多种生物标志物和每种生物标志物的不同的内标物(例如，标记的生物标志物与各自生物标志物相同，除了标记之外)，或者，作为选择，提供至少一种内标物，用于多种生物标志物的归一化(例如:相同化合物类别的生物标志物，一种或多种各自生物标志物，比如多种胆汁酸的标记的类固醇酸或胆汁酸，多种脂肪酸生物标志物的标记的脂肪酸，和/或多种氨基酸的标记的氨基酸)。例如:可选择地，可提供十九烷-d37酸(nonadecanoic-d37)作为本文教导的组合的所有游离脂肪酸的内标物。

可选择地，内标物是同位素标记的化合物。或者，内标物是样本中未发现的(例如在血液、血浆或血清中未发现的)任一化合物。

可选择地，内标物是稳定的同位素标记的化合物(例如，标记的生物标志物的变体或与该生物标志物具有类似性质的化合物的标记的变体)。可选择地，稳定的同位素为(2)H，(13)C，(15)N或(18)O。

可选择地，一种或多种内标物选自标记的类固醇酸(例如:胆汁酸)(例如:用于胆汁酸生物标志物)、标记的脂肪酸(例如:用于脂肪酸生物标志物)和/或标记的氨基酸(例如:用于氨基酸生物标志物)。

可选择地，有用的内标物为有关生物标志物的任何稳定同位素标记的代谢物，在实际样本中被确定为内标物。可选择地，内标物具有和来自组合的待测量的代谢生物标志物相同的化学性质。例如:对于组合的相应生物标志物来说，内标物当通过蛋白质沉淀(例如:通过硫酸铵，三氯乙酸(TCA)，丙酮或乙醇)和/或过滤(例如:使用本文教导的过滤装置)从样本提取时产生回收率。至于特定的生物标志物组合，本领域的技术人员可很容易选择具有与相应的生物标志物相同的或共享的化学性质的内标物，其中相同或共享的化学特性是指影响生物标志物和内标物的回收率的化学特性(例如:分子量，极性，共享的，共享的R基团等)。可选择地，每种内标物都是具有相对于相应的生物标志物不大于或不小于(+/-)10％，7％，5％，4％，3％，2％，1％或0.5％的回收率的内标物。

例如，下面阐明了对本发明中相应的生物标志物测量的有用的内标物:

胆酸(CA)-d4(例如:用于猪胆酸(HCA)

熊脱氧胆酸(ursodeoxycholic acid)(UDCA)-d4(例如:用于甘氨猪脱氧胆酸(glycohyodeoxycholic acid)(GHDCA)，牛磺鹅脱氧胆酸(taurochenodeoxycholic acid)(TCDCA)，牛磺脱氧胆酸(taurodeoxycholic acid)(TDCA)，甘氨猪胆酸(glycohyocholicacid)('GHCA')和/或牛磺猪胆酸(taurohyocholic acid)(THCA))

石胆酸(LCA)-d4(例如:用于牛磺石胆酸(TLCA))

十三烷-d25酸(tridecanoic-d25 acid)(例如:用于单不饱和游离脂肪酸)

十九烷-d37酸(例如:用于饱和游离脂肪酸)

缬氨酸-d8(用于缬氨酸)

亮氨酸-5，5，5-d3(用于亮氨酸)

异亮氨酸-2-d1(用于异亮氨酸)

酪氨酸-3，3-d2(用于酪氨酸)

苯丙氨酸-3，3-d2(用于苯丙氨酸)

可选择地，内标物被配制为用以GC-MS或LC-MS。

基于本文的教导，本领域的技术人员可以基于生物标志物组合的选择很容易地选择有用的内标物。

样本制备

本发明测量的生物标志物可选择地从样本中提取。例如:方法可包括使样本与提取介质接触，从样本中提取生物标志物以及测量提取的脂类(例如:色谱法分离生物标志物之后通过质谱法)的步骤。

提取介质可以是任何允许从测量步骤中未测量的样本的一种或其他组分中提取生物标志物的任何介质。可选择地，提取介质包含溶液(例如:蛋白质沉淀溶液)，过滤装置，或两者皆有。

测量本发明的方法通过测量生物样本中的一种或多种生物标志物的水平来检测生物样本中的一种或多种生物标志物。测量步骤可以是任何对测量本文教导的生物标志物有用的测量方式。例如:可使用测量生物样本(例如:血液，血浆或血清)中的生物标志物水平的任何体外方法。

可选择地，测量方法包括质谱(‘MS’)。例如，MS可以在，分离技术(比如，气相色谱(‘GC’)或液相色谱(‘LC’))之后进行。可选择地，MS包括GC-MS，LC-MS或超高效液相色谱(‘UPLC-MS’)。可选择地，MS是飞行时间法(time-of-flight)，离子阱(ion trap)，四极(quadrupole,)，磁扇形(magnetic sector)，离子回旋共振，静电扇形分析器或其组合或混合。可选择地，MS包括飞行时间质谱(‘TOFMS’)，三重四极质谱(‘TQMS’)或四极飞行时间质谱(‘QTOFMS’)。可选择地，本发明使用GC-TOFMS，UPLC-QTOFMS或LC-TQMS。

可选择地，在测量之前进行提取(例如:过滤)和/或分离(例如:色谱法)步骤。色谱法是一种基于流动相和固定相之间分配行为差异分离样本中成分的方法。通常，色谱柱固定固定相，流动相携带样本通过色谱柱。在固定相中分配更强的样本成分在色谱柱中停留更多时间，与主要保留在流动相中并且更快通过色谱柱的成分分离开。当成分从色谱柱中洗脱时，它们可以进行测量，例如:使用质谱仪。

可选择地，根据色谱柱的试样说明，组合的每种生物标志物都可以从相同的样本试样测量。这样的实施方式可从单个试样中分离全部生物标志物并且通过消除对平行制备、萃取和分离样本的需要，提供有效的方法。

可通过调整色谱条件，例如:包括，柱温度，流动相的组成，流速，流动相的洗脱条件，分析时间以及代谢产物的质量碎裂模式(待测生物标志物的母离子和子离子)，提供所有生物标志物的这样的同时色谱分离，以得到充分的分离。

当关注的生物标志物是分析物(例如:棕榈酸或硬脂酸)时，“测量”步骤可包括测量该分析物的水平(例如:测量指示水平的信号)。当关注的生物标志物是基于多种分析物的计算结果，比如比值(例如:(C22:4n6)/(C20:4n6)比值)时，测量步骤可包括测量多种分析物的每种分析物的水平以及基于测量的分析物水平计算关注的生物标志物的水平。

本文关于生物标志物所使用的术语“水平”可以是样本中出现的生物标志物的任何定量或定性表示，例如，量(例如:质量)或浓度(例如:w/w，w/v或摩尔浓度)。当表达为浓度时，该水平可表达为有关样本制备(例如:提取)之前得到的样本原始体积(或重量)。

肝脏疾病状况

本发明的方法可用于评估肝脏疾病状态，例如:通过将组合的生物标志物水平与肝脏疾病状况相关联。因此，可选择地，本发明的方法可用于鉴定受试者患有肝脏疾病状态。

评估的肝脏疾病状态可以是任何肝病状态，例如:肝脏损伤、肝脏缺陷或异常肝脏情况。可选择地，肝脏疾病状态是肝脏炎症，肝脂肪变性(例如:酒精性的或非酒精性的)，肝炎，脂肪性肝炎(例如:酒精性的或非酒精性的)，肝细胞损伤，NASH，肝纤维化，肝硬化，慢性肝病，或其期，进展或严重程度。

没有脂肪性肝炎或脂肪肝的脂肪变性的特点是，例如:伴有很少或不伴有炎症的脂肪浸润。

脂肪性肝炎，如:非酒精性脂肪性肝炎(NASH’)是一种肝脏情况，其特点是脂肪变性和炎症导致肝细胞受损。脂肪性肝炎中的慢性炎症有时会导致进展到肝纤维化，伴随瘢痕组织的形成。

可选择地，肝纤维化可按期或进展分类(例如:分层)。例如，肝纤维化期包括S0-S4期，选择性地，S0的特点是不存在(基本上不存在或少量存在)肝纤维化，例如:S0的脂肪性肝炎。可选择性地，S1的特点是仅在门脉区域存在(或仅仅实质上存在)轻度纤维化或纤维化(‘门脉脉纤维化’)。可选择地，S2的特点是中度纤维化，或者在门脉区域，或者门静脉周或门脉隔膜之间存在纤维化，但具有完整的肝结构，或者这样的肝纤维化不伴随对小叶结构实质损害。可选择性地，S3的特征是严重的纤维化，或门脉区域之间以及门脉区域和中心静脉之间存在纤维化桥接，或者结构变形但没有明显的肝硬化。可选择地，S4的特点是肝硬化，或假小叶的形成或肝脏结构的变形。在本发明之前，只有使用侵入性检查，(比如，肝脏活组织检查)才可能真正确定肝纤维化的这样的分类。然而，出人意料的是，可测量本文教导的某些生物标志物组合提供用于诊断和分类肝纤维化的依据。尽管存在某些纤维化分类的预先定义(例如S0-S4期)，但是这些分类为过去定义的，按照允许通过肝活组织检查来鉴定它们的方式。由于肝纤维化可在纤维化逐渐增加方面进展，可选择地，本发明可用于提供新的肝纤维化分类(例如:通过严重程度或进展)，该新的肝纤维化分类是根据生物标志物水平的变化(例如:通过模型评分)定义的，可能不一定直接对应于基于活组织检查的期分类。例如，可选择地，肺纤维化可分层为两个期，例如:轻度纤维化(例如:S0-S2或S0-S2的稍微延伸期)和重度纤维化(例如:S3-S4或S3-S4的稍微延伸期)。或者，肺纤维化可以选择性地分层为三个期，例如:包括早期纤维化(例如:S0-S1或S0-S2的稍微延伸期)，中期纤维化(例如:S2或S2的稍微延伸期)和晚期纤维化(例如:S3-S4或S3-S4的稍微延伸期)。或者，肺纤维化可以利用分层为4个或更多个不连续期的模型进行分类，或者使用连续期模型进行分类(例如:其中更高的分数提示肺纤维化程度更高，但是没有通过分界值(cutoffs)分开的不连续期)。

可选择地，肝硬化可通过病情进展或严重程度分类。例如，通过Child-Pugh等级(如A、B和C)分类的肝硬化。与上面对肝纤维化的解释类似，本发明可以按照与先前形成的分类方案(例如Child-Pugh等级)相对应的方式对肝硬化进行分层，或可以使用建立的不同方案对肝硬化进行分层，例如，通过生物标志物评分。例如，肝硬化可利用分层为2个不连续期、3个不连续期或4个或更多个不连续期的模型进行分类，或使用连续期模型(例如，其中评分越高表示肝硬化程度越大，但是没有通过分界值分开的不连续期)进行分类。

令人惊讶的是，本文教导的代谢物组可用于鉴定或区分受试者的肝脏疾病状态。例如，本文教导的组合可用于区分肝纤维化和非肝纤维化，肝硬化和非肝硬化，肝脏疾病(例如脂肪性肝炎)和非肝脏疾病。在本发明之前，需要肝活组织检查的侵入性方法来鉴定这些受试者。

可选择地，本文教导的组合用于区分肝纤维化和非肝纤维化。例如:非肝纤维化可以是任何非肝纤维化，或者可以是健康的肝脏或脂肪性肝炎(例如:NASH)肝脏。

可选择地，本文教导的组合用于区分肝硬化和非肝硬化。非硬化可以是任何非硬化，例如健康肝脏，非肝硬化性肝纤维化(例如:S3纤维化)或非肝硬化性肝损伤(例如:脂肪性肝炎)。

可选择地，本文教导的组合可用于区分肝脏疾病和非肝脏疾病。

例如:肝脏疾病可以是脂肪性肝炎(例如:NASH)或肝纤维化(例如:肝硬化和非肝硬化性肝纤维化)，或者可以是由患有脂肪性肝炎或肝纤维化的受试者定义的肝脏疾病状态。

可选择地，本文教导的组合用于区分肝纤维化的期或严重程度。

优选的，本文教导的组合可用于区分肝硬化的严重程度。

关联

本发明的方法可包括通过将组合的一种或多种生物标志物的测量水平与肝脏疾病状况相关联来评估肝脏疾病状态。基于该关联，受试者可被鉴定为患有肝脏疾病状态，例如:被诊断为肝脏疾病，肝病的分类(例如:通过肝脏疾病类型，期，进展或严重程度)，或监测肝脏疾病状态的变化(例如:进展或严重程度)。受试者被诊断为患有肝脏疾病，肝脏疾病分类或肝脏疾病状态改变，可选择受试者接收肝脏疾病治疗。

可选择地，关联的步骤包括将一种或多种测量的生物标志物水平与各自的比较水平(例如:提示或等同于健康对照受试者的水平)进行比较。另外，可将一种或多种生物标志物的测量水平输入到基于测量水平计算评分的模型中(例如:由计算机执行的数学公式或算法)。

生物标志物水平(例如:测量水平)或评分(例如:通过模型计算的)可分别与比较水平或比较评分进行比较，使用技术手段(诸如参考限、区分限、或诊断或分类)限定阈值，以针对状态(比如，肝脏疾病的存在或严重程度)限定分界点和反常值。生物标志物的比较水平或联合的生物标志物评分可以分别是通常在未患有给定肝脏状态的受试者中找到的水平或评分。可选择地，这样的比较水平和分界点可根据生物标志物是单独使用还是在配方中联合其它生物标志物使用进行评分而变化。或者，比较水平或评分可从之前检查的被诊断为肝脏疾病状态的受试者(例如:根据肝活组织检查)来确定，或者可以是阈值，该阈值被确定为区分存在给定肝脏疾病状态的受试者和未出现给定肝脏疾病状态的受试者(例如，实施例所教导的)。可选择地，比较水平或比较评分分别是区分肝脏疾病的严重程度或进展的水平或评分。另外，或者，可提供几个肝脏疾病分类(例如:期)，其中每个类别由给定的水平或评分范围鉴定。另外，或者，可提供将水平和评分与肝脏疾病状态的分类相关联的公式(例如:曲线)(例如:相对期或严重程度，或绝对期或严重程度)。

优选的，提供谱(profile)，包括生物标志物组合的每种测量水平，并且将测量的谱与比较生物标志物谱(comparator biomarker profile)进行比较。本发明的生物标志物可用于产生比较生物标志物谱。比较生物标志物谱可以是阴性对照，例如:从未患有肝脏疾病状态或具有分类为较轻期或严重程度较轻的肝脏疾病的健康对照受试者获得。或者，比较谱可以是阳性对照，例如:从患有肝脏疾病状态或具有分类为评估期或严重程度的肝脏疾病的受试者获得。可选择地，可以比较不同的比较谱，其中每个比较谱对应显示不同的肝脏疾病分类(例如:期或严重程度)的受试者，以便为监测肝脏疾病提供基础，例如:通过疾病的进展，或为监测治疗的有效性提供基础。可选择地，阴性比较谱和/或阳性比较谱可以存储在永久计算机可读存储器上。

可选择地，本发明的方法使用模型(例如:算法)将测量的生物标志物水平与肝脏疾病状态相关联。这种使用模型的关联可以在已经配置好的系统中运行，例如:下载了程序的计算机(例如，程序存储在永久计算机可读存储器上并且由控制器(比如，微处理器)执行)，该程序执行该模型并且根据输入的测量的标志物水平计算评分。可选择地，本发明的生物标志物组合的测量作为装载有模型的计算机或其微处理器的输入值，该模型执行计算肝脏疾病状态评分的算法。如果除在系统中检查的生物标志物之外，还有一些因素(例如，生理因素)用来计算最终评分，那么这些因素就可以提供给模型，从而可完成评分的计算。或者，该算法可生成初步评分，报告该初步评分并与其他因素外部结合，计算出最终评分。

评分模型可生成评分，该评分提示二元判定，例如，区分存在或不存在特定肝脏疾病状态的评分阈值或分界值，或者该评分可以是对肝脏疾病状态进行分类的评分，例如:根据严重程度，期或进展(例如:其中较高的分数表示更严重期的肝脏疾病，比如肝纤维化)。

评估的肝脏疾病状态可以是任何肝脏疾病(例如:与纤维化有关)并且可通过患有肝脏疾病状态的受试者显示的任何终点鉴定。例如，肝脏疾病状态终点可包括显示存在肝纤维化或特定水平的肝纤维化的肝活组织检查结果。肝脏疾病的其他终点是众所周知的临床诊断的终点。本领域技术人员根据本发明将会理解这样的终点可以变化并且生成有用的肝脏疾病状态终点。

在一个实施方式中，评估肝脏疾病状态包括计算评分。虽然本发明的某些评分方法是利用基于逻辑回归的关联例证的(例如:实施例中详述的)，但是本发明考虑任何关联的方法。例如:在选择本发明公开的一组生物标志物之后，可以使用已知的技术开发用于计算肝脏疾病状态评分的算法，例如，交叉相关，主成分分析(PCA)，因素旋转，逻辑回归(LogReg)，线性判别分析(LDA)，Eigengene线性判别分析(ELDA)，支持向量机(SVM)，随机森林(RF)，递归分叉树(RPART)，相关决策树分类技术，缩小距心(Shrunken Centroids)(SC)，StepAIC，Kth最邻近算法(Kth-Nearest Neighbor)，Boosting，决策树，神经网络，贝叶斯网络，支持向量机和隐马尔可夫模型，线性回归或分类算法，非线性回归或分类算法，变型分析(analysis of variants)(ANOVA)，分层分析或聚类算法；使用决策树的分层算法；基于机器算法的核(kernel based machine algorithms)，例如:核偏最小二乘算法，内核匹配追踪算法，内核Fisher判别分析算法，或内核主成分分析算法，或其他数学和统计方法。

因为评分模型的一个实施例可以包括逻辑函数，其最终值表示存在肝纤维化(或其严重程度)。例如，可选择地，使用这样的评分模型的本发明的方法可包括:a)测量受试者的血清或血浆中的本文教导的组合的每种生物标志物的水平，b)通过包括所述生物标志物的逻辑函数使所述测量的水平联合(组合)以及c)分析所述逻辑函数的最终值以确定肝病状态的存在(例如:肝纤维化)或其严重程度。这样的逻辑函数的最终值分析可以包括将该最终值与将模型应用于检查受试者群体所获得的最终值相关联。可选择地，逻辑函数是通过如下步骤得到的:i)根据患者的肝脏疾病状态(例如:肝纤维化的严重程度)将患者分成不同的组，ii)逻辑回归分析以针对肝病状态的诊断，评估组合的生物标志物的独立区分值，以及iii)通过结合组合的生物标志物建立逻辑函数。这样的实施例在实施例1至实施例16，实施例19和实施例20中中详细描述了。。

建立评分模型的有用的方法还公开在WO 2002/016949；WO 2002/016949:WO2010/149767，WO 2006/10357，WO 2006/082522，WO 2003/073822，WO 2011/039321，WO2005/116901，WO 2010/058295，WO 2010/097472中。

一般而言，使用选择的个体群体，其中有关该群体的生物标志物的值和比如可通过肝活组织检查确定的他们的临床终点(例如，实施例中详细描述的)的历史信息是可以得到的。为了计算给定个体的肝脏疾病状态评分，从该个体收集一个或多个样本，从该一个或多个样本获得生物标志物的值，并将其用作输入数据，即输入到模型(例如:算法)中，用从选择的个体群体获得的实际历史数据拟合。

如上所述，可以用多种方式评估本发明的性能以及绝对和相对临床可用性。在各种性能评估中，可选择地，本发明旨在提供肝脏疾病状况的诊断和治疗监测的准确性。准确性可关系到检查、化验或方法区分患有肝脏疾病状态或未患有肝脏疾病状态的受试者的能力，并且基于受试者是否具有有效水平的一种或多种生物标志物或一种或多种生物标志物水平的实质改变，或从其计算的评分。通过有效水平或实质改变，可选择地是指生物标志物的测量不同于预定分界点(或阈值)，分别对于该生物标志物或其水平变化来说，并且因此提示受试者确定具有特定的肝脏疾病状态或经历了肝脏疾病状态的变化(例如:用监测方法中)。生物标志物水平在存在肝脏疾病状态和不存在肝脏疾病状态之间的差异优选在统计学上是显著的，并且可以是生物标志物水平的增加或生物标志物水平的降低，这从本文教导的实施例中很容易明显看出来。尽管本发明考虑使用一个生物标志物组合，但是对于某些实现统计学显著的群体(例如:显示特定的基因，生理或临床状态)来说，优选的分析和临床准确性因此可包括组合中若干个生物标志物联合在一起使用以及与数学模型(如:算法)结合起来，以达到统计学上显著的评分。

和肝脏疾病状态的分类诊断一样，根据本发明改变检查肝脏疾病状态的分界点或阈值会改变灵敏度和特异性，但通常是定性逆关系。因此，在评估提出的方法的准确性和有用性时，本领域技术人员可选择地同时考虑灵敏度和特异性，并且注意报告灵敏度和特异性所在的分界点是什么，因为灵敏度和特异性可能在分界点的范围内显著变化。使用包含所有潜在分界点值的统计(诸如AUC)，对使用本发明评估肝脏疾病状态来说，有时是优选的。

使用这样的统计，利用本发明的方法评估肝脏疾病状态的诊断准确性的可接受程度，其中AUC(检查或测试的ROC曲线下面积)至少是0.60，或大于例如至少0.65，至少0.70，至少0.75，至少0.80或至少0.85。可选择地，AUC甚至大于例如0.875，至少0.90或至少0.95。

可选择地，通过定义诊断准确性的程度，即ROC曲线上的分界点，定义可接受的AUC值，并确定构成区别存在肝脏疾病状态与不存在肝脏疾病的状态的生物标志物(单独或共同地)的水平(或评分)的相对浓度的可接受范围，。本发明允许本领域技术人员使用本文教导的生物标志物鉴定患有肝脏疾病状态的受试者，准确性高。

模型也可以按照下述内容进行开发(研发)和/或使用。

评分模型的开发

尽管本文教导的实施例提供了开发实施本发明的模型的细节，但是本领域技术人员会理解，使用本文鉴定的生物标志物和本文教导的关系式，用于计算关联和评分的数据模型可以以任何方式建立，并且不需要依赖于本文收集和提供的数据。

例如，模型可以通过从代表性群体获得生物标志物水平数据来建立，该生物标志物水平数据包括来自表现和不表现肝脏疾病状态的特定临床终点(例如:通过肝活组织检查)的代表性群体的数据，例如:实施例中详述的。这些数据可以从本文的教导(例如:实施例中详述的生物标志物数据)或其他手段获得，例如:直接从群体，前瞻(纵向的)和/或包括以前研究的结果的回顾性流行病学数据存储库(比如:私人或公共数据库)获得。生物标志物数据可以来源于单个研究或多个研究，通常包括关于想要的适应症和代表性群体的临床终点的数据，包括本文描述的生物标志物的值，临床注释(其可能包括终点)，尤其是，跨越许多学科用于本发明中用于训练算法的想要的终点。可选择地，然后将生物标志物水平的数据存储在永久计算机可读存储器上。

然后根据需要准备代表性群体的数据集，以满足将用于生物标志物选择的模型或分析的要求，如下所述。例如:数据集的准备可包括准备来自代表性群体(或选择的其子集)内的每个受试者的生物标志物水平值。然而，单独的原始生物标志物水平数据可能并不完全适用于模型训练目的。如此，可使用各种数据准备方法准备数据，例如:间隙填充技术(例如:最近邻插值或其他模式识别)，质量检查，使用各种公式(例如:统计分类算法)的数据组合，归一化和/或变换，例如:对数据取对数来改变数据的分布以满足模型要求(例如，以10为底，自然对数等等))。同样，特定数据准备过程取决于使用代表性群体数据训练的模型。用于各种不同模型类型的特定数据的准备已众所周知，并且不需要进一步描述。

选择特定的生物标志物，随后用于训练用于评估肝脏疾病状态的模型。生物标志物选择可包括利用选择模型(selection model)来验证代表性群体数据集和从提供最可重复的结果的数据集中选择生物标志物数据。数据集验证的例子可以包括但不限于交叉验证(cross-validation)和自助法(bootstrapping)。基于生物标志物选择，可确定和选择在评估肝脏疾病状态中使用的模型。但是，需要指出的是，并非所有模型都提供相同的结果和相同的数据集。例如:不同的模型可以利用不同数量的生物标志物并产生不同的结果，从而增加了生物标志物的联合对选择的模型的重要性。因此，可以选择多个选择模型并与代表性群体数据集或该数据集的子集一并使用，来确定用于肝脏疾病状态评估的最佳模型。上述描述了可用于选择生物标志物的特定模型的例子，包括统计模型，算法等。

对于与数据集或其子集一起使用的每个选择模型来说，可选择地，生物标志物是根据模型中每种生物标志物的统计学显著性来选择的。当输入到每个模型中时，生物标志物可选择地基于统计学显著性的各种标准来选择，还可能涉及累积投票和加权。统计学显著性检验可以包括exit-tests和方差分析(ANOVA)。模型可包括分类模型(例如:LDA，逻辑回归，SVM，RF，树模型等)和生存模型(例如:cox)，上面已经描述了它们的许多示例。

注意，虽然生物标志物可以单独应用于每个选择模型以鉴定统计学显著的生物标志物，但是在一些情况下，单独的单种生物标志物可能提供比预想少的预测能力，在这种情况下可以将生物标志物的联合应用于选择模型。例如:不使用单变量生物标志物选择，而是可以利用多变量生物标志物选择。也就是说，一种生物标志物，当作为单变量输入到选择模型中时，相比它与其他生物标志物联合使用时(例如:多变量输入到模型)，可能不是好的指标，因为每种生物标志物都会给该联合带来额外的信息，如果使用单独生物标志物，该额外的信息可能不被提示。

可选择地，选择，训练和验证用于评估肝脏疾病状态的模型。具体而言，可以基于一个或多个性能标准(其例子上面已经描述了)来选择主要的候选模型。例如:从使用数据集或数据子集，利用各种模型，不仅仅是用于确定统计学显著的生物标志物的模型，而且结果也用于选择最佳模型连同生物标志物。因此，用于评估肝脏疾病状态的评估模型可包括用作选择模型的那些模型中的一个，包括分类模型和存活模型。模型标志物的联合(包括生物标志物子集)可在子集和单个数据集中比较和验证。比较和验证可以重复多次以训练和验证模型并且选择适当的模型，然后将其用作评估肝脏疾病状态的模型。

评分模型的使用

虽然本文教导的实施例提供了用于实施本发明的模型，本领域技术人员将理解使用本文鉴定的生物标志物和本文教导的关系式，任何使用本文教导的生物标志物组合的数学模型都可以用于评估肝脏疾病状态。

例如:可提供数学模型，该数学模型可以基于本文教导的组合的一种或多种生物标志物的输入来计算肝脏疾病状态评分。生物标志物水平数据是从受试者获得的并且可选择地存储在永久存储器中。受试者生物标志物数据可以通过各种手段最初导出，包括自我报告，体格检查，实验室检测和现有医疗记录，图表或数据库。受试者生物标志物水平可根据选择和训练的模型类型(例如:开发本文教导的评分模型的方法中详述的)，根据需要，使用计算，变换，对数，组合，归一化等，来准备。一旦数据准备好之后，受试者生物标志物数据就可输入到模型中。然后，该模型可输出肝脏疾病状态评分(例如:其中评分提示特定肝脏疾病状态的存在或不存在或肝病的阶段或严重程度)。通过评分和其他评估步骤确定的肝脏疾病状态可以是，例如:脂肪性肝炎(例如NASH)，肝纤维化，肝硬化或其期或严重程度。

治疗

在一个实施方式中，本发明的方法包括治疗已被鉴定为患有肝脏疾病状态(例如:脂肪性肝炎，肝纤维化，肝硬化或其期或严重程度)的受试者。

有用的治疗包括改善或降低肝脏疾病状态，预防或减缓肝脏疾病状态的进展，或预防或减缓由肝脏疾病状态引起的另一种病症(例如:肝性脑病，或癌症，如:肝细胞癌)的发展。

在治疗由本发明的诊断方法鉴定为患有肝脏疾病的受试者中使用疗法可以涉及任何疗法，任何肝脏疾病状态以及本文教导的任何生物标志物组合。

可选择地，治疗包括:施用治疗药物，进行手术(例如:肝移植)，停止施用受试者先前接受的治疗药物(例如:引发肝损伤的药物)，规定饮食(例如，降低卡路里或碳水化合物摄入)，停止饮酒，规定锻炼，或规定减肥治疗方案等。

可选择地，治疗包含治疗药物。

可用于本发明的治疗药物可包括，例如:顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(Apicalsodium-dependent bile acid transporters)(ASBT)抑制剂，胆汁酸结合树脂，类固醇酸(例如:胆汁酸)，胆汁酸衍生物，抗胆固醇药物和抗糖尿病药物。

可选择地，有效的治疗药物抑制回肠末端胆汁酸再摄取，减少继发性胆汁酸产生，加速从肠道排泄胆汁酸或抑制胆汁酸合成。

可选择地，治疗包括顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)抑制剂，例如:苯并硫杂庚英衍生物SC-435(benzothiepin derivative SC-435)(参见Bhat BG，et al.Inhibitionof ileal bile acid transport and reduced atherosclerosis in apoE-/-mice bySC-435.Journal of lipid research 44，1614-1621(2003))或264W94(参见Root C，SmithCD，Sundseth SS，Pink HM，Wilson JG，Lewis MC.Ileal bile acid transporterinhibition，CYP7A1 induction，and antilipemic action of 264W94.J Lipid Res 43，1320-1330(2002))，喹啉衍生物R-1446224(参见Kurata H，et al.A novel class ofapical sodium-dependent bile acid transporter inhibitors:the amphiphilic 4-oxo-1-phenyl-1，4-dihydroquinoline derivatives.Bioorganic&medicinal chemistryletters 14，1183-1186(2004))或萘酚衍生物如S-8921(参见Hara S，et al.S-8921，an ileal Na+/bile acid cotransporter inhibitor decreases serum cholesterol inhamsters.Life sciences 60，Pl 365-370(1997))。其他有用的ASBT抑制剂包括在US2014/0323412A1(Gedulin等，申请号:US14/354，553)中公开的结构式I-VI中的任一种，这些文献通过援引并入本文。不受理论的限制，认为ASBT抑制剂可以抑制胆汁酸从回肠向肝细胞的重吸收，从而减少循环中的胆汁酸，以便预防或治疗肝纤维化、肝硬化，或其他相关的肝损伤或疾病的程度或严重程度。

可选择地，治疗包括胆汁酸结合树脂，例如:考来维仑(colesevelam)(参见Aldridge MA，Ito MK.Colesevelam hydrochloride:a novel bile acid-bindingresin.The Annals of pharmacotherapy 35，898-907(2001))或考来烯胺(cholestyramine)或考来替泊(colestipol)(参见Einarsson K，et al.Bile acidsequestrants:Mechanisms of action on bile acid and cholesterolmetabolism.European Journal of Clinical Pharmacology 40，S53-S58)。不受理论的限制，认为胆汁酸结合树脂可去除肠道胆汁酸，导致胆汁酸肠肝循环减少，从而减少胆汁酸，以便预防或治疗肝纤维化、肝硬化或其他相关的肝损伤或疾病的程度或严重程度。

可选择地，治疗包含类固醇酸。有效的类固醇酸包括其非共轭和共轭的形式。可选择地，类固醇酸是胆汁酸，例如:熊脱氧胆酸。在本领域中已知许多其他类固醇酸用于治疗肝脏疾病。

可选择地，治疗包括胆汁酸衍生物，如奥贝胆酸(obeticholic acid)(OCA)(参见Trivedi PJ，Hirschfield GM，Gershwin ME.Obeticholic acid for the treatment ofprimary bil iary cirrhosis.Expert review of clinical pharmacology 9，13-26(2016))。不受理论的限制，认为胆汁酸衍生物可抑制胆汁酸合成，从而减少胆汁酸，以便预防或治疗肝纤维化、肝硬化或其他相关的肝损伤或疾病的程度或严重程度。

可选择地，治疗包括施用抗胆固醇药物。例子包括他汀类(statin)，胆汁酸结合树脂(例如:考来烯胺，考来替泊或考来维仑)，贝特类(fibrates)，依泽替米贝(ezetimibe)，洛美达派(lomitapide)，植物甾醇(phytosterol)或奥利司他(orlistat)。

可选择地，治疗包括施用US2014/0323412A1(Gedulin等人，申请号:US 14/354，553)中公开的任何治疗药物(例如:ASBT抑制剂或吸收抑制剂)，该文献通过援引并入本文。

可选择地，治疗包括施用胆汁酸或其衍生物，如:Jia，PCT申请号:PCT/US16/57538；Miljkovic等人，申请号:US 6,060,46，Kramer等人，申请号:EP 0417725 A2，Pellicciari，申请号:US 8,445,472中所教导的，这些文献通过援引并入本文，用于本文教导的治疗化合物。

胆汁酸结合树脂

可选择地，治疗包括施用Jia申请的PCT申请号:PCT/US16/57538中教导的结构式I的任何化合物，其通过援引结构式I的化合物并入本文。

可选择地，治疗是对患有肝脏疾病状态的受试者的任何标准护理。

可选择地，治疗包括施用选自苦艾蒿(Artemisia absinthium)，波普瑞韦(Boceprevir)，布美他尼，考来烯胺，考来替泊，呋塞米，哈维尼(Harvoni)，氢氯噻嗪，乳果糖，麦考酚酸莫酯(mycophenolate mofetil)，螺内酯(spironolactone)，奥匹替韦(Technivie)，替拉瑞韦，噻嗪，氨苯蝶啶，氢氯噻嗪，Viekira Pak，维生素K，植物甲萘醌，皮质类固醇，胆汁酸，利尿剂，白蛋白和抗生素的治疗药物。

用于本发明的治疗可包括，例如:抗糖尿病药(例如:二甲双胍，罗格列酮或吡格列酮)，减肥药，合理饮食(例如:卡路里或碳水化合物限制)或运动。这样的治疗可提供用于患有脂肪性肝炎的受试者，例如:几乎没有或没有肝纤维化(例如:S0或S1期)。不受理论的限制，认为这些治疗可以使受试者对胰岛素更敏感，并且可以帮助减少脂肪性肝炎(比如NASH)患者的肝损伤。

用于本发明的治疗可包括中断受试者先前服用的治疗药物或暂停治疗药物。不受理论的限制，认为许多治疗药物都会增加肝脏负担并且使肝脏脏疾病状态朝向肝纤维化或其更高期进展。

不受理论的限制，认为本文教导的治疗有效减少或逆转肝脏疾病或减轻、预防肝脏疾病的进展，并且可选择地，将受试者的生物标志物水平更改为提示减低的肝脏疾病的水平，例如:根据测量的生物标志物水平或基于测量生物标志物水平的计算的评分。

可选择地，本发明的方法包括使用本发明的组合评估受试者的肝脏疾病状态，其中评估步骤包括区分不同期或不同严重程度的两种或更多种肝脏疾病状态，并且该方法还包括基于评估选择治疗或基于鉴定的期或严重程度区别地选择治疗。

例如，可选择地，仅仅为肝脏疾病状态已经被评估为较严重的肝脏疾病状态期或严重程的受试者选择治疗。

或者，可选择地，为肝脏疾病状态已经被评估为较严重的肝脏疾病状态期或严重程的受试者选择第一种治疗，为肝脏疾病状态已经被评估为不太严重的肝脏疾病状态期或严重程的受试者选择第二种治。第一种治疗和第二种治疗可能是具有不同严重程度的副作用，侵入性或死亡率的治疗。

例如，可选择地，对于处于较严重期或严重程度的肝纤维化(例如:晚期肝硬化，比如CP期C)的受试者，选择肝移植；对于处于肝纤维化不太严重期或严重程度的受试者，可选择地选择施用治疗药物(例如:小分子治疗药物，ASBT抑制剂，吸收抑制剂，胆汁酸或其衍生物，抗糖尿病药物，类固醇酸或胆汁酸结合树脂)。

作为另一个例子，可选择地，为处于较严重期或严重程度的肝纤维化的受试者选择第一种治疗，比如施用治疗药物(例如:小分子治疗药物，ASBT抑制剂，吸收抑制剂，胆汁酸或其衍生物，类固醇酸或胆汁酸结合树脂)，可选择地，为处于不太严重期或严重程度的肝纤维化(例如S0或基本上没有肝纤维化的脂肪性肝炎)的受试者选择第二种治疗，比如，施用抗糖尿病药物或体重减轻药物或规定改变生活方式(例如:限制卡路里或碳水化合物的摄入或运动)。

可选择地，对处于较严重或晚期肝纤维化的受试者来说，方法可以使用具有非常严重的副作用、侵入性或死亡率的治疗。例如:向处于最相对严重的或最晚期的肝纤维化(例如:晚期肝纤维化)的受试者实施肝移植，向处于相对温和期或严重程度的肝纤维化的受试者施用效力较强的治疗药物(例如:具有较大副作用或死亡率)，向处于相对早期或轻度纤维化的受试者施用效力较弱的治疗药物(例如:具有较小副作用或死亡率)，对显示相对更轻的肝纤维化或没有纤维化的脂肪性肝炎受试者来说，改变生活方式。

虽然本发明考虑每个前面提到的实施例，但是本领域技术人员可以很容易在两种(或更多种)具有不同严重程度的副作用、侵入性或死亡率的治疗之间选择，用于治疗脏疾病状态已经根据期或严重程度评估的受试者。

监测

在一个实施方式中，本发明的方法包括监测本文教导的组合的一种或多种生物标志物的水平。根据本发明，监测方法包括提供第一生物样本和第二样本，其中第一样本为首次从受试者获得，第二生物样本为第二次从受试者获得，其中第二次晚于首次，测量第一样本和第二样本的每一者中的一种或多种生物标志物的水平，以及比较第一样本的测量的水平和第二样本的测量的水平以确定肝脏疾病状态的变化，或将每个样本的测量的水平与肝脏疾病状态相关联，以及比较从第一样本关联(或鉴定)的肝脏疾病状态与从第二样本关联(或鉴定)的肝脏疾病状态。

可选择地，首次是在受试者接受治疗之前，第二次是在受试者接受治疗之后。因此，可选择地，根据本发明，测量生物标志物的水平进一步允许监测受试者的肝脏疾病状态或监测疗效过程。

可选择地，如果第一样本和第二样本的一种或多种生物标志物的水平的比较不提示肝脏疾病状态或期或严重程度的预定(例如:实质)减轻或不提示一种或多种生物标志物的水平的预定(例如:实质)改变，则需要改进治疗方案。

因此，可选择地，评估肝脏疾病状态的方法可用来识别患有肝脏疾病状态的受试者，并且可用于和能够选择和启动各种治疗方案或治疗干预(以下简称“治疗”)，以便治疗受试者。可选择地，测量生物标志物的水平进一步允许监测治疗过程。在这种方法中，第一生物样本从进行治疗之前的受试者提供，第二生物样本可从进行治疗之后的受试者提供。

试剂盒

在一个实施方式中，本发明的方法提供了用于检测本发明的组合的生物标志物的试剂盒。包含在该试剂盒中的是用于检测本发明的组合的一种或多种生物标志物的一种或多种内标物。该一种或多种内标物共同地为本文教导的组合的每种生物标志物提供至少一种内标物。

可选择地，试剂盒包括容器，过滤装置或两者皆有(例如:过滤装置在容器中)。可选择地，容器包括一种或多种内标物。另外或或者，过滤装置包括一种或多种内标物(例如:内标物沉积在过滤装置上)。这样的试剂盒的实例描述在图14A，图14B和图15中。

可选择地，内标物被配制用于GC-MS或LC-MS。

可选择地，一种或多种内标物是多元化的内标物。可选择地，内标物以混合物的形式提供。或者，多元化的内标物中的一种或多种可以彼此分开。

可选择地，一种或多种内标物以固体或液体的形式提供。可选择地，一种或多种内标物是脱水的或冷冻干燥的(例如:通过冻干)。例如:固体内标物可以在使用试剂盒之前悬浮在溶液中。

可选择地，内标物为本文教导的任何内标物。

可选择地，一种或多种内标物包括标记的类固醇酸(例如:胆汁酸)，标记的脂肪酸和/或标记的氨基酸。标签可以是例如:同位素，如:(2)H或(13)C。

可选择地，每种内标物，除了它具有一个或多个其原子被该一个或多个原子的稳定同位素(例如:(2)H，(13)C，(15)N或(18)O)取代之外，与组合的相应生物标志物是相同的化合物。例如:可通过提供每种生物标志物的同位素标记变体提供给定生物标志物组合的一组内标物。可选择地，该组合包括表3中所列的任何组合(即，表3A或表3B)。

可选择地，试剂盒包括过滤装置。可选择地，过滤装置上沉积有一种或多种内标物(例如:图14和图15所示)。可选择地，过滤装置设置在容器内或被配置为放置在容器内或容器上(例如:图14和图15所示)。可选择地，过滤装置可从容器中移除(例如:图14A所示)。可选择地，过滤装置安装到过滤装置支架上，例如，可放置在容器内的过滤装置支架(例如:圆柱形过滤装置支架和/或具有如图14和图15所示的凸缘的过滤装置支架)，例如:本身就是可放置在另一个容器内侧的容器的过滤装置支架(具有坚固的侧壁)，例如:图14A所示。可选择地，当过滤装置放置在容器内时，容器可在过滤装置的每侧保留一定体积的液体，例如:通过在过滤装置的每侧提供空隙或空腔(例如:图14B所示)。这样的试剂盒允许容器离心，以迫使过滤装置第一侧的溶液通过过滤装置到过滤装置的第二侧。过滤装置可被配置为使得滤液包含添加在过滤装置的第一侧的内标物和生物标志物。然后分析滤液(例如:通过GCMS或LCMS)以测量生物标志物和内标物，例如通过移除过滤装置。可选择地，过滤装置是具有允许生物标志物组合和内标物通过但其他成分如蛋白质(例如沉淀的蛋白质)不可通过的孔径的任何过滤装置。例如，过滤装置可以是孔径为0.22μm的过滤装置。可选择地，过滤装置为聚偏二氟乙烯，纤维素(例如:乙酸纤维素)或尼龙过滤装置。可选择地，过滤装置包括抗氧化剂，如:丁基化羟基甲苯(BHT)。

可选择地，一种或多种内标物与抗氧化剂(如丁基羟基甲苯(BHT))混合。例如，可以提供这样的抗氧化剂，以产生内标物(比如，来自降解的脂肪酸)，从而延长试剂盒的保质期。

可选择地，试剂盒包含至少一个容器，该容器包括在其中的一种或多种内标物。可选择地，容器可以是管子，小瓶或多孔或多室板。试剂盒可具有单个容器(例如:单孔或单室)，或具有多个容器(例如:多孔或多室)。例如，试剂盒可以包含多孔板(例如，96孔微量滴定板)其他类似的容器也是合适的。在某些试剂盒中，容器可适用于内标物的测量和受试者样本中一种或多种待评估代谢物的定量。在某些试剂盒中，用于内标物的测量和受试者样本中一种或多种待评估代谢物的定量的容器被配置为用于光谱分析，例如色谱-质谱法。例如，该容器可以被配置为用于GC-TOFMS和/或LC-TQMS。在其他试剂盒中，该容器可以被配置为专门针对受试者样本中的一种或多种待评估代谢物的其他分析测试(检测)(例如:酶，化学，比色，荧光等)。

可选择地，某些试剂盒包括多个容器。例如，某些试剂盒包括具有内标物的一个或多个容器。另外，某些试剂盒包括具有内标物的一个或多个容器以及用于内标物的测量和受试者样本中一种或多种待评估代谢物的定量的额外的容器(例如:多孔板或另外的小管或小瓶)。在某些试剂盒中，有单个容器，用于容纳一种或多种内标物，并且用于内标物的测量和受试者样本中一种或多种待评估代谢物的定量。

在包含多孔，多室或其他多容器装置的试剂盒中，当分配试剂盒供使用时，内标物可选择地放置在一个或多个孔或室中。在某些试剂盒中，内标物被设置在容器外部，使用试剂盒时需要分散在容器内。

试剂盒的容器也可被配置为接受来自至少一个受试者的生物样本。例如:试剂盒包含多个室或孔的情况下，来自受试者的生物样本可以分配到一个或多个室或孔中。在一些情况下，一个或多个受试者的样本可被分配到多个室或孔中。试剂盒的容器通常被配置为容纳流体样本(例如:流体生物样本或已被处理以获得用于分析的流体的固体生物样本)。

某些试剂盒还包括用于内标物的测量和受试者样本中一种或多种待评估代谢物的定量的试剂。这些试剂可被包含在试剂盒中，在一个或多个额外的容器中。

实例性(非限制性例子)试剂盒可包括内标物，每种内标物设置在同一或者单独的容器中。可选择地，容器可以以微量滴定板的形式提供，例如:配置为用于GC-MS或LC-MS装置。微量滴定板可以有足够数量的孔以接收至少一种内标物。内标物的浓度已知，已存在于容器中或用于将已知量的每种内标物分发到微量滴定板的独立孔中。将内标物分发到分析容器中之后，也可将一份受试者样本分发到微量滴定板内。既可以分发单份受试者样本，也可以分发多份。如果将多份分发到微滴定板中，则每份可被分发到单独的孔中。此外，如果将多份分发到微滴度板中，则每份可具有不同的量。

计算机和模块以及自动化系统

本发明的方法可通过使用计算机和，可选择地，相关硬件来实施，计算机和相关硬件被配置为执行测量、关联、和报告中的一个或多个步骤。因此，本发明的一个实施方式提供了包含模块(例如，程序)的计算机可读永久(非易失性的)存储器，该模块被配置为用于测量(例如:将来自分析机器的测量信号转换成生物标志物水平)、评估(例如:将生物标志物水平与肝脏疾病状态相关联或将生物标志物水平输入到计算评分的数学模型中)和/或报告评估结果。可选择地，本发明提供了包括微处理器和存储器的计算机，其中微处理器被配置为执行模块。

测量和/或评估(例如:关联、比较值或计算分数)的步骤可利用包括模块的计算机执行(例如，存储在存储器上并由微处理器运行的程序)。例如，可提供测量模块，其解释来自连接的测量装置(例如，‘MS’)的指示生物标志物水平的信号并计算生物标志物水平。可选择地，测量模块被配置为通过将该信号与从各自内标物获得(例如，通过MS)的信号进行比较使生物标志物的水平归一化。作为一个例子，可提供评估模块，其利用生物标志物水平作为算法(例如:计算肝脏疾病状态的评分或比较生物标志物水平与比较水平的算法)的输入，做出肝脏疾病状态的判定。

可选择地，模型被配置为报告评估结果。报告途径的例子包括可视化显示、数据结构或数据库的链接，或打印机。可选择地，报告途径可以是将检查结果发送到外部装置的数据链接，比如数据结构、数据库、可视化显示或打印机。

本发明的方法是自动化的，使用利用计算机或模拟机器的诊断检测系统。测量生物标志物和生物标志物组合的检测可以在多种诊断检测系统上实施。诊断检测系统可以是通常包括用于从生物样本获得检测结果的工具的装置。这样的工具的例子包括使检测(例如，检测分析)自动化的模块。可选择地，诊断检测系统可以被配置为处理多个生物样本，并且可被编程为对每个样本进行相同的或不同的检测。可选择地，诊断检测系统包括用于收集，存储和/或追踪每个样本的检测结果(通常以数据结构或数据库形式)的工具。例子包括实体或非易失性存储设备(例如:硬盘驱动器，闪存，磁带或纸质打印文件)。可选择地，诊断检测系统包括报告检测结果的工具。报告工具的例子包括可视化显示、数据结构或数据库的链接，或打印机。可选择地，报告工具可以是将检测结果发送到外部设备的数据链接，比如数据结构、数据库、可视化显示或打印机。

生物标志物组合

本发明提供生物标志物组合，用于本发明的方法、试剂盒和其他方面。

可选择地，该组合包含表1中列出的一种或多种生物标志物。

可选择地，该组合包含表2中列出的一种或多种生物标志物。

可选择地，该组合是表3中列出的任何组合(即，在表3A或表3B中)。表3列出了组合A至CJ(88个组合)，其可用于诊断任何肝脏疾病状态(例如:肝炎，肝纤维化或肝硬化)或区分肝脏疾病的进展状态或严重程度(例如:肝纤维化的严重程度或肝硬化的严重程度)。注意，表3A被分割为多个页面，并在随后的页面上重复垂直列出的生物标志物名称(可以通过将页面左右对齐来重建表)；表3B被分割成多个页面，并在随后的页面上重复水平列出的生物标志物名称(可以通过将页面从上到下对齐来重建表)。

可选择地，选择用于水平的水平测量的生物标志物可以是分析物(analyte)(胆汁酸，脂肪酸或氨基酸)，或它可以是基于多种分析物水平的计算结果。例如，计算结果可以是分析物的比值(例如:二十二碳四烯酸(C22:4n-6)/花生四烯酸(C20:4n6)的比值)或一种或多种分析物相对一种或多种分析物或分析物水平的总和的相对水平(例如:百分比)。当第一生物标志物被计算为第二生物标志物与第三生物标志物的比值时,可以通过测量第二生物标志物和第三生物标志物的水平和计算第二生物标志物和第三生物标志物的测量水平的比值测量第一生物标志物水平。

可选择地，根据本发明的生物标志物组合包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10种生物标志物，或更多。

在本发明的任何一个方面，组合可选择地包含一种或多种胆汁酸，一种或多种氨基酸和/或一种或多种游离脂肪酸。

可选择地，生物标志物组合包括一种或多种其他的生物标志物，如:AST(天冬氨酸转氨酶)，ALT(丙氨酸转氨酶)，AST/ALT，AST.ALT，铁蛋白，血小板，凝血酶原指数，透明质酸，例如，如US2011/0313276A1所述。或者，生物标志物组合可选择地不包含这些生物标志物中的一种或多种(或每种)。

可选择地，生物标志物组合包括一种或多种其他生物标志物，例:如α2-巨球蛋白，触珠蛋白，载脂蛋白A1，总胆红素和/或γ-谷氨酰转肽酶(GGT)(例如:经性别和年龄矫正后)，例如，如EP2786287A1所述。或者，生物标志物组可选择地不包含这些生物标志物中的一种或多种。

可选择地，生物标志物组合包括一种或多种其他生物标志物，诸如α2-巨球蛋白，AST，ALT，GGT，γ-球蛋白，总胆红素，白蛋白，α1-球蛋白，2-球蛋白，触珠蛋白，β-球蛋白，apoA1，IL10，TGF-β1，apoA2和/或apoB，例如，如WO 2002/016949中所述。或者，生物标志物组合可选择地不包含这些生物标志物中的一种或多种。

尽管用于本发明的组合可从本文教导的任何生物标志物产生，但是下面三个实施方式列出了用于本发明的实例性生物标志物组合。

在一个实施方式中，本发明的组合包含牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，甘氨胆酸(GCA)，牛磺胆酸(TCA)，12-甲基十三烷酸(C14:0异)，13甲基十四烷酸(13甲基肉豆蔻酸)(C15:0异)，反式亚油酸(Linoelaidic acid)(C18:2n6t)，反式油酸(C18:1n9t)，β-丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸中的一种或多种。这样的组合，例如，可用于诊断肝脏疾病(例如:肝纤维化或肝硬化)。

在一个实施方式中，本发明的组合包含牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，甘氨胆酸(GCA)，甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，牛磺胆酸(TCA)、7-酮石胆酸(7-KLCA)，牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)，肉豆蔻油酸(Myristoleic acid)(C14:1n5)，棕榈油酸(C16:1n7)，反式油酸(C18:1n9t)，芥酸(C22:1n9)，二十碳四烯酸(C22:4n-6)/花生四烯酸(C20:4n6)比值，亚油酸(C18:2n6)/γ-亚麻酸(C18:3n6)比值，棕榈酸(C16:0)，棕榈酸(C16:0)/棕榈油酸(C16:1n7)，酪氨酸，果糖，果糖/葡萄糖比值中的一种或多种。例如，这样的组合可用于对受试者的肝脏疾病进行分期(例如:区分早期，中期或晚期肝纤维化)。

在一个实施方式中，本发明的组合包含棕榈酸(C16:0)，棕榈酸(C16:0)/棕榈油酸(C16:1n7)比值，果糖，果糖/葡萄糖比值中的一种或多种(例如，每种)。例如，这样的组合可用于对受试者的肝脏疾病进行分期(例如:区分早期，中期或晚期肝纤维化)。

表1.肝脏疾病状态的标志物

表2.肝脏疾病状态标志物

表3A.生物标志物组合(‘组合’)

表3A续

表3B.生物标志物“组合”

实施例

以下实施例详细地介绍了生物标志物组合的发现以及它们在构建预测模型中的用途，该预测模型然后用于检测使用生物标志物组合的肝脏疾病的诊断的准确性。在从研究的血清样本产生代谢物谱之后选择生物标志物组合，使用LC-MS和GC-MS测量患者群体样本中的代谢物水平，并且使用统计学方法分析该谱。这些实施例详细阐述了使用本发明的生物标志物组合来评估肝脏疾病状态，例如:NASH，肝纤维化和肝硬化的存在和分类。

实施例1研究的患者群体

上海中医药大学附属曙光医院(中国,上海)和厦门中医医院(中国,厦门)从2013年4月到2013年12月共招募504名诊断为肝纤维化和肝硬化的患者，年龄分布为15-75岁。依据《中国慢性乙型肝炎防治指南》(中国肝脏病学会，中华医学会，中华肝脏病学会，中华医学会肝病学分会，中国传染病学会，中华医学会)和《中国慢性乙型肝炎防治指南(2005)》(中国医学杂志(Engl)2007；120:2159-73)，患者被临床诊断为肝纤维化或肝硬化和感染慢性乙型肝炎。所有患者在评估的时候是临床稳定的。排除标准包括:年龄小于15岁或大于75岁，怀孕或哺乳期妇女，同时感染人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)或戊型肝炎病毒(HEV)；诊断为糖尿病，其他肝脏疾病，肝脏移植，胃肠疾病，胰腺炎，使用精神药物，6个月内饮酒，6周内使用过抗生素、益生菌/益生元(ajaj JS，HeumanDM，Hylemon PB，et al.Randomised clinical trial:Lactobacillus GG modulates gutmicrobiome，metabolome and endotoxemia in patients with cirrhosis.AlimentPharmacol Ther 2014；39:1113-25)。此外，我们排除了肝硬化诊断不明的患者以及无法空腹提供血液样本的患者，并完成了研究。

上海曙光医院体检中心招募502名受试者作为健康对照。健康对照组和肝脏疾病患者之间年龄、性别和BMI无显著差异(表4)。在曙光医院完成常规生化检测以确保研究受试者无炎症和代谢疾病(表4)。进行B超检查以排除脂肪肝患者。排除标准包括:年龄大于75岁或年龄小于15岁，怀孕，哺乳期妇女，有显著的心肺、肾脏、胃肠疾病或肝脏疾病，急性或慢性感染，活跃的恶性肿瘤，需要治疗的其他急性或慢性疾病，在过去2个月内使用过任何处方药。该研究经上海中医药大学和厦门中医医院人体研究委员会批准。所有参与者皆签署了研究知情同意书。

表4中总结了慢性肝病患者的人口学特征和临床资料。研究群体包括502例患者(72％为男性，平均年龄为36.66±11.85岁)，其中46例患者被诊断为0期纤维化，174例患者被诊断为1期纤维化，136例患者被诊断为2期纤维化，57例患者被诊断为3期肝纤维化，39例患者被诊断为肝硬化CP A，30例患者被诊断肝硬化CP B，16例患者被诊断肝硬化CP C。除了失代偿期肝硬化患者外，上述患者的诊断皆通过肝活组织检查得到。与健康对照相比，肝病患者具有明显升高水平的丙氨酸转氨酶(ALT)，天冬氨酸转氨酶(AST)，直接胆红素(DBIL)，间接胆红素(IBIL)，总胆红素(TBIL)，γ-谷氨酰转移酶(GGT)，总胆汁酸(TBA)，平均血小板体积(MPV)，血小板计数(PCT)，血小板分布宽度(PDW)，总蛋白(TP)，球蛋白(GLB)和平均红细胞血红蛋白(MCH)以及降低水平的白蛋白(ALB)，血尿素氮(BUN)，胆固醇(CHOL)，红细胞压积(HCT)，甘油三酯(TG)，前白蛋白(PALB)，平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)，血小板(PLT)，红细胞(RBC)和白细胞WHC)。因为肝功能随着肝纤维化期和肝硬化CP等(分)级增加逐渐恶化，血清ALB，HCT，HGB，PALB，PCT，PLT，RBC，TP，CHE，FT3，FT4，Fib，PTA和CHOL水平逐渐下降，血清ALP，BUN，APTT，TBA，HBcAb，INR，PT，TT，TBIL，DBIL和IBIL水平均显著升高。血清GGT，GLB和AHCV水平随着肝纤维化期的增加而增加，但在肝硬化患者中它们降低。

该研究获得了两家医院的伦理委员会的批准，所有参与者在研究之前皆签署了知情同意书。

表4.测试群体的人口数据。

注：数值以平均值±SEM表示。*表示p＜0.05；**表示p＜0.01，与健康对照组比较。

实施例2肝活组织检查

除了被诊断为失代偿性肝硬化的肝病患者，其余肝病患者在入组后1周内接受超声指导下的肝组织活检。活检标本用10％福尔马林固定，常规石蜡包埋，组织切片用苏木精伊红和曙红和Masson染色处理。诊断需要最小长度至少为1.5cm的肝活组织切片和至少6个门脉区域(portal tracts)。根据Scheuer的分类(Scheuer PJ，Standish RA，DhillonAP.Scoring of chronic hepatitis.Clinics in liver disease 2002；6:335-47，v-vi.)进行坏死性炎症的组织学分级(G0至G4)和肝纤维化的分级(S0至S4)。所有的切片由中国上海复旦大学的三名病理学家独立盲法评估，观察结果通过Kappa一致性检验处理。

实施例3血清样本收集

根据制造商的协议，使用LH750血液学分析仪和Synchron DXC800临床系统(Beckman Coulter，美国)测量血液学和普通生化检测。用化学发光免疫分析仪(CLIA)系统(LUMO，Shinova Systems，上海，中国)测量血清透明质酸(HA)和层粘连蛋白(LN)的浓度。使用自动凝血分析仪(STAGO Compact，Diagnostica Stago，法国)测量凝血功能。使用实时聚合酶链式反应(PCR)系统(LightCycler，480，罗氏，美国)检测血清HBV-DNA水平。

实施例4统计分析

定量变量用平均值±SEM表示，分类变量用数字表示。进行单变量分析(ANOVA，Student t-检验，非参数检验)来鉴定肝纤维化患者与健康对照之间以及不同肝纤维化期的患者之间差异显著的变量。我们认为p＜0.05为显著。将数据导入SIMCA-P+13.0软件(Umetrics，

瑞典)后，首先进行多元统计分析、正交偏最小二乘-鉴别分析(OPLS-DA)以得到对照和肝纤维化患者的胆汁酸的整体概况。然后，我们进行OPLS-DA以区分不同期的肝纤维化患者。通过逐步逻辑回归构建预测模型，其识别与每个临床终点(S1，S2，S3的肝纤维化患者，CPA，CP B，CP C的肝硬化患者)相关的独立因素。通过受试者工作特征(ROC)曲线分析评估单个标志物和标志物组合的总体诊断效能(性能)。上述统计分析使用SPSS 22.0(IBM SPSS，美国)软件进行。还用SPSS对胆汁酸数据进行典型判别分析。使用GraphpadPrism 6.0(GraphPad software，CA，美国)绘制柱状图。

实施例5血清胆酸的分析

血清样本制备

将50μl血清试样与150μl甲醇(含有0.10μM的CA-D4，UDCA-D4和LCA-D4用作内标物)混合，然后，将混合物涡旋2分钟，静置10分钟，然后在4℃20000g离心10分钟，将160μL上清的试样转移到干净的管中并真空干燥。用等量的乙腈(0.1％甲酸)和水(0.1％甲酸)重新溶解残余物至终体积为40μL。离心后，上清液用于UPLC-MS/MS分析。

方法验证

将标准储备溶液的每个试样混合以获得混合储备溶液，用原始混合血清(利用活性炭脱去BAs)将含有全部胆汁酸标准物的校准溶液配制成一系列浓度0.610，1.221，2.441，4.883，9.766，19.531，39.063，78.125，156.250，312.5，625.0，1250.000和2500.00ng/mL。校准曲线和相应的回归系数通过内标物调整获得。

仪器

根据以前报道的方法(Xie G，Zhong W，Li H，et al.Alteration of bile acidmetabolism in the rat induced by chronic ethanol consumption.FASEB journal:official publication of the Federation of American Societies for ExperimentalBiology 2013；27:3583-93.Garcia-Canaveras JC，Donato MT，Castell JV，LahozA.Targeted profiling of circulating and hepatic bile acids in human，mouse，andrat using a UPLC-MRM-MS-validated method.Journal of lipid research 2012；53:2231-41)(对这些方法做了一些修改)测量血清BAs。本研究使用配备有二元溶剂输送管理器和样本管理器的沃特世ACQUITY超高性能液相色谱系统(沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州)。质谱仪为具有ESI的Waters XEVO TQ-S仪器(Waters，Milford，MA)。整个LC-MS系统用MassLynx 4.1软件控制。所有色谱分离均使用ACQUITY BEH C18色谱柱(1.7μm，100mm×2.1mm内部尺寸)(Waters，Milford，MA)进行。

LC-MS分析

流动相由含有的0.1％甲酸的LC-MS级的水(流动相A)和含有0.1％甲酸的LC-MS级的乙腈(流动相B)组成，流速为0.3mL/min。流速为0.45mL/min，流动相梯度如下:0-1分钟(5％B)，1-5分钟(5-25％B)，5-15.5分钟(25-40％B)，15.5-17.5分钟(40-95％B)，17.5-19分钟(95％B)，19-19.5分钟(95-5％B)，19.6-21分钟(5％B)。柱子维持在45℃，所有样本的进样体积为5μl。

质谱仪在1.2kv毛细管电压下以负离子模式运行。源气体和脱溶剂气体的温度分别为150℃和550℃。使用多反应监测器(MRM)收集数据并且每种胆汁酸的锥孔电压和碰撞能量(表5)使用QuanOptimize应用管理器(Waters Corp.，Milford,MA)的优化设置。

数据分析

使用TargetLynx applications manager 4.1版本(Waters Corp.，Milford，MA)分析利用负离子模式得到的UPLC-MS原始数据，以获得矫正后的方程和样本中每种BA的定量浓度。使用student t检验来检验各组BAs测量的差异。随后调整全部代谢物的结果p值，使用错误发现率(FDR)方法解释多重检测。²⁶我们将p值＜0.05认为是显著的。

表5胆汁酸的MRM转换和质谱参数LC-MS/MS分析。

实施例6血清氨基酸分析

按照我们以前的过程，加入两种内标物(10μL L-2-氯苯丙氨酸水溶液，0.3mg/mL，10μL十七烷酸的甲醇溶液，1mg/mL)的每100μL血清样本用于代谢物提取，在-20℃下用300μL甲醇:氯仿(3:1)提取10分钟。12，000rpm离心10分钟之后，300μL上清液的试样用于进一步分析。样本在室温下真空干燥。将残余物进行两步衍生化过程，在30℃下用80μL甲氧胺(15mg/mL吡啶溶液)持续90分钟，在70℃下用80μLBSTFA(1％TMCS)持续60分钟。除了用于质控的内标物外，还制备由多种参考标准物组成的另一个质控样本，并且与每10个样本一起运行。将这种质控样本真空干燥并且使用与样本相同的过程进行衍生化。

样本用Pegasus HT系统(Leco Corporation，St Joseph，美国)与Agilent 6890N气相色谱仪按照“对照-CRC-对照”的顺序进行分析。每10个血清样本后运行质控样本。进样量为1μL，不分流模式。进样设定为270℃。使用DB-5MS毛细管柱(30m×250μm I.D.，膜厚度为0.25μm；Agilent J&W Scientific，CA，美国)分离代谢物。使用氦气作为载气，流速为1.0毫升/分钟。GC烘箱温度从80℃开始持续2分钟，然后以10℃/分钟升温至180℃，以6℃/分钟升至230℃，最后以40℃/分钟升至295℃。295℃为最终温度并保持8分钟。传递界面和离子源的温度分别设定为270℃和220℃。m/z范围设定为30-600，利用电子碰撞电离(70eV)。采集速率设置为20个频谱/秒。

实施例7血清游离脂肪酸的分析

血清FFA提取

将血清样本的30μL试样加入同位素标记的内标物溶液(10μl C19:0-d37，5μg/mL)。用500μL异丙醇:己烷:2M磷酸(40:10:1)提取混合溶液并涡漩2分钟。在室温下保存20分钟后，向样本中加入400μl己烷和300μL水，涡漩2分钟，然后以12，000rpm离心5分钟。将400μL上清液的试样转移到玻璃样本瓶中。用另外的400μl己烷提取残余物，然后涡漩2分钟并以12，000rpm离心5分钟。将400μL上清液的试样转移到相同的玻璃取样小瓶中在室温下真空干燥。将残余物溶于80μL甲醇中，以待UPLC-QTOFMS分析。

通过UPLC-QTOFMS定量分析血清FFA

将5μL的上清液试样注射到保持在40℃的100mm×2.1mm、1.7μmBEH C18柱(Waters，USA)上沃特斯，美国)中，使用超高效液相色谱系统(Waters，USA)。二元梯度洗脱体系由水(A)和含20％v/v异丙醇的乙腈(B)组成，分离是利用下面的梯度实现的:在70％B无梯度(0-2分钟)，线性梯度从70-75％B(2-5分钟)，75-80％B(5-10.0分钟)，80-90％B(10.0-13.0分钟)，90-100％B(13.0-16.0分钟)；在100％B无梯度(16.0-21.0分钟)；线性梯度从100％至70％B(21.0-22.5分钟)，在70％B无梯度(22.5-24.0分钟)。流速为0.4mL/min。分析期间所有样本在4℃保存。样本按照“对照-疾病-对照”的顺序交替进行以使系统分析偏差最小化。使用合并的FFA标准物作为质控，监测仪器性能和数据质量。

使用配备有负离子模式操作的电喷雾离子源的Waters Q-TOF premier(Manchester，英国)收集质谱数据。电喷雾离子源温度设定为120℃，锥形气体流量为50L/h，去溶剂化气体温度为450℃，去溶剂化气体流量为600L/h。毛细管和锥形电压分别设定为2.5kV和55V。对应全部分析来说，亮氨酸脑啡肽用作锁定质量(lock mass)(ES-模式下的m/z 554.2615)，浓度为100ng/mL，流速为0.1mL/min。

使用MarkerLynx Applications Manager 4.1版本(Waters，Manchester，英国)分析UPLC-QTOFMS ESI-原始数据。利用保留时间(RT)和m/z数据作为每个离子的标识符，生成检测到的每个峰的离子强度列表。产生的三维矩阵包含任意分配的峰值指数(保留时间-m/z对)，样本名称(观察值)和离子强度信息(变量)。内标物用于数据质量控制(再现性)。使用保留时间和精确质量，通过与FFA标准品进行比较来鉴别样本中的FFA。

实施例8 NASH，肝纤维化和肝硬化患者的胆汁酸谱

与健康对照相比，包括甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，甘氨胆酸(GCA)，鹅脱氧胆酸(CDCA)，脱氧胆酸(DCA)，甘氨脱氧胆酸(GDCA)，胆酸(CA)，熊脱氧胆酸(UDCA)，甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，甘氨猪脱氧胆酸(GHDCA)，牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，牛磺脱氧胆酸(TDCA)，牛磺胆酸(TCA)，甘氨λ-鼠胆酸(Gλ-MCA)，λ-鼠胆酸(λ-MCA)，7-酮石胆酸(7-KLCA)7-酮脱氧胆酸(7-KDCA)，石胆酸(LCA)，牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)，猪脱氧胆酸(HDCA)，3-酮胆酸(3-KCA)，牛磺λ-鼠胆酸(Tλ-MCA)，牛磺石胆酸(TLCA)和甘氨石胆酸(GLCA)的总共23种胆汁酸在肝病患者中显著增加。当我们比较肝纤维化和肝硬化患者中的胆汁酸时，存在GCDCA，GCA，CDCA，CA，UDCA，GUDCA，GHDCA，TCDCA，TCA，7-KLCA，LCA，TUDCA，3-KCA，Tλ-MCA，TLCA和GLCA的显著不同，并且它们的水平在对照受试者中非常低，在纤维化患者中显著增加(p＜0.01)，并且在肝硬化患者中非常强烈地增加(表6)。

表6.测试群体的血清胆酸浓度

注：数值是利用UPLC-MS/MS测量的平均浓度(纳克/毫升)±SEM。**表示当与健康对照比较时，p值小于0.01。

实施例9 NASH，肝纤维化和肝硬化患者的脂肪酸谱

在不同进展/严重程度水平的肝脏疾病患者和健康对照中共鉴定出50种游离脂肪酸(表7)。根据这些数据，很明显游离脂肪酸水平随着肝病的存在和/或进展而改变(调整)(取决于具体脂肪酸的上升或下降，如表中所示)。数据表明这些标志物可用于区分肝脏疾病与健康对照或区分肝脏疾病状态(例如:通过进展或严重程度)。

表7.测试群体的血清脂肪酸浓度

注：数值是利用UPLC-QTOFMS测量的平均浓度(微克/毫升)±SEM。*表示当与健康对照比时，p值小于0.05；**表示当与健康对照比时，p值小于0.01。

实施例10 NASH，肝纤维化和肝硬化患者的氨基酸谱

在具有不同进展/严重程度的肝病患者和健康对照中总共鉴定出来29种氨基酸(表8)。基于这些数据，很明显氨基酸水平随着肝病的存在和/或进展而改变(调整)(取决于具体氨基酸的上升和下降，如表中所示)。数据表明这些标志物可用于区分肝脏疾病与健康对照或区分肝脏疾病状态(例如:通过进展或严重程度)。

表8.测试群体的血浆氨基酸浓度

注：数据是利用GC-TOFMS测量的平均强度±SEM。*表示当与健康对照比时p值小于0.05；**表示当与健康对照比时p值小于0.01。

实施例11用于区分肝纤维化与健康对照的生物标志物

OPLS-DA显示使用23种胆汁酸(图1A，R2Xcum＝0.719，R2Ycum＝0.778，Q2Ycum＝0.744)，游离脂肪酸(图1B，R2Xcum＝0.664，R2Ycum＝0.829，Q2Ycum＝0.806)和氨基酸(图1C，R2Xcum＝0.516，R2Ycum＝0.793，Q2Ycum＝0.785)区分肝纤维化和健康对照。

实施例12用于区分NASH与健康对照的生物标志物

为了评估血清代谢物用于区分NASH患者与对照受试者的潜在实用性，我们分别基于鉴定的胆汁酸，游离脂肪酸和氨基酸开发了逻辑回归模型。

通过前向逐步分析，我们认定GCA，GCDCA，TCA和TCDCA在回归模型中是NASH或其他脂肪性肝炎疾病的有效预测因子(表9)。使用这些代谢物，我们建立了如下的回归模型:

接下来，我们生成ROC曲线来评估胆汁酸信号作为用于诊断NASH的非侵入性生物标志物的潜在有用性。我们的ROC分析显示胆汁酸生物标志物在区分NASH患者与对照方面是稳健的，曲线下面积(AUC)值为0.921(95％CI＝0.866-0.976)(图2A)。使用0.384的分界值，灵敏度和特异性分别为84.8％和87.0％(表10)。

我们还发现(认定)，C18:2(反式9，12)可以区分NASH患者与对照，曲线下面积(AUC)值为1.000(95％CI＝1.000至1.000)(图2C)。使用0.5μg/mL的分界值，灵敏度和特异性均达到100％(表11)。

我们还发现(认定)β-丙氨酸可以区分NASH患者与对照，曲线下面积(AUC)值为1.000(95％CI＝1.000至1.000)(图2B)。使用111709的分界值，灵敏度和特异性均达到100％(表12)。

表9.逻辑回归分析生物标志物组合的NASH相关的信号。

P值利用沃尔德检验(Wald test)计算。

表10.生物标志物组合(甘氨鹅脱氧胆酸,甘氨胆酸,牛磺鹅脱氧胆酸和牛磺胆酸)用于检测患有NASH的患者(和健康对照相比)的诊断准确性。

表11 C18:2(反式9,12)用于检测患有NASH的患者(和健康对照相比)的诊断准确性。

表12.β-丙氨酸用于检测患有NASH的患者(和健康对照相比)的诊断准确性。

实施例13用于区分NASH和肝纤维化患者的生物标志物

为了评估血清代谢物用于区分NASH患者和纤维化受试者的潜在实用性，我们分别基于鉴定的胆汁酸，游离脂肪酸和氨基酸开发了逻辑回归模型。

通过前向逐步分析，我们认定丝氨酸，DCA和7-KLCA在回归模型中，是疾病状态的有效效预因子(表13)。

接下来，我们生成ROC曲线来评估代谢物信号作为用于区分NASH患者与肝纤维化患者的非侵入性生物标志物的潜在有用性。我们的ROC分析显示代谢生物标志物在区分NASH患者与肝纤维化患者方面是稳健的，曲线下面积(AUC)值为0.866(95％CI＝0.822至0.949)(图3)。使用0.724的分界值，灵敏度和特异性分别为86.4％和84.8％(表14)。用丝氨酸，DCA和7-KLCA建立的OPLS-DA评分图显示肝纤维化患者和NASH患者之间的分离(图4，R2Xcum＝0.666，R2Ycum＝0.654，Q2Ycum＝0.643)。

表13.逻辑回归分析用于区分NASH和S1肝纤维化受试者的代谢物信号。

P值利用沃尔德检验(Wald test)计算。

表14.用于区分NASH受试者和S1肝纤维化受试者的组合信号的诊断准确性。

实施例14用于区分肝纤维化患者和肝硬化患者的生物标志物

为了评估血清代谢物用于区分纤维化患者和肝硬化受试者的潜在实用性，我们分别基于鉴定的胆汁酸，游离脂肪酸和氨基酸，开发了逻辑回归模型。

通过前向逐步分析，我们认定C14.1.顺式9、C20.4.顺式5.8.11.14、β-丙氨酸、瓜氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、鹅脱氧胆酸(CDCA)和甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)是回归模型中疾病状态的有效预测因子(表15)。

接下来，我们生成ROC曲线来评估代谢物信号作为用于区分NASH患者与肝纤维化患者的非侵入性生物标志物的潜在有用性。我们的ROC分析显示代谢物生物标志物在区分肝纤维化和无肝硬化患者与肝硬化患者方面是稳健的，曲线下面积(AUC)值为0.842(95％CI＝0.911-0.974)(图5)。使用0.256为分界值，敏感度和特异性分别为83.5％和95.3％(表16)。利用代谢物生物标志物:C14:1顺式9、C20:4顺式5,8,11,14、β-丙氨酸、瓜氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸、CDCA和GUDCA建立的OPLS-DA评分图显示了肝纤维化患者和肝硬化患者之间的分离(图6，R2Xcum＝0.488，R2Ycum＝0.529，Q2Ycum＝0.513)。

表15用于区分肝纤维化和肝硬化患者的组合信号的逻辑回归分析。

P值利用沃尔德检验(Wald test)计算。

表16代谢物信号用于检测NASH患者(与肝纤维化患者相比)的诊断准确性。

实施例15不同期的肝纤维化和肝硬化患者的代谢物谱

肝脏疾病通常从非酒精性脂肪性肝炎(例如:NASH)逐渐进展至肝纤维化甚至肝硬化。GUDCA，TCDCA和酪氨酸的水平随肝脏疾病进展而逐渐增加(图7，8和9)。肝纤维化也可以通过进展或严重程度进行分期，例如期S1，S2和S3(无肝硬化)和S4(即，肝硬化)。类似地，晚期S4肝纤维化，即肝硬化，可以通过进展或严重程度进一步分期，例如期CP A-C。比较了不同期的肝纤维化和肝硬化患者的胆汁酸水平，结果显示，GUDCA和酪氨酸在三个期的纤维化患者和三个期的肝硬化患者的血清中均有差异性表达(图10，11和13)。

利用函数建立的图(该函数是利用全部差异性表达的胆汁酸，游离脂肪酸和氨基酸的典型判别分析生成的)显示，肝纤维化第1，2，3期的患者和肝硬化CP A,B和C级的患者划分成六个组(图12A，12B和12C)。第1-6组对应于各自的期S1，S2，S3，CPA，CBP和CPC。结果为，在第1期的171例患者中，正确分类145例，正确率为84.8％。第2，3和4期以及CP A，B和C级肝硬化患者的正确分类率分别为91.1％，82.5％，82.1％，70.0％和93.8％(表17，表18和表19)。

表17利用全部测量的胆汁酸对期分类的准确性^a。

表18利用全部测量的游离脂肪酸对期分类的准确性^a。

表19利用全部测量的氨基酸对期分类的准确性^a。

实施例16胆汁酸分析

进一步数据分析提示了其他出人意料的诊断胆汁酸标志物。当比较肝纤维化和肝硬化患者中胆汁酸(BA)水平时，还存在GCDCA，GCA，CDCA，CA，UDCA，GUDCA，GHDCA，TCDCA，TCA，7-KLCA，LCA，TUDCA，3-KCA，THCA，TLCA和GLCA的显著不同，并且它们各自的水平在对照组受试者中非常低，而在纤维化患者中显著增加，且在肝硬化患者中强烈增加。

这些数据支持使用诊断组合中的这些标志物对肝纤维化受试者进行诊断或分类(例如，通过期或严重程度)。

实施例17试剂盒

本发明的试剂盒的示例包括已知量的同位素标记的(例如:用C13标记的)内标物，该内标物对应于组合t的生物标志物。该试剂盒可以包含所有待评估的内标物的单个混合物，或者，可以包含单独量的每种内标物。待评估的代谢物谱中的每种内标物的量可被测量并用于与受试者的样本中相应生物标志物的相应量进行比较。每种内标物在试剂盒中可以是固体形式或液体形式。如果内标物为固体形式，则在使用试剂盒前将其悬浮于溶液中。试剂盒可选择地包含组合的每种代谢生物标志物的至少一种标记的变体。

试剂盒的示例包括至少一个容器，该容器被配置为容纳代谢物组合谱中的内标物。容器可以是小管，小瓶或多孔或多室板。容器可以具有单个孔或室，或者容器也可以具有多个孔或室。例如:容器可以是多孔板(例如，微量滴定板，比如96孔微量滴定板)。其他类似的容器也适用。在一些试剂盒中，容器可适用于内标物的测量和受试者样本中一种或多种待评估生物标志物的定量。在一些试剂盒中，用于内标物的测量和受试者样本中一种或多种代谢物的定量的容器被配置为用于光谱分析，比如，例如:色谱-质谱法。例如:容器可以被配置为用于GC-TOFMS和/或LC-TQMS。在其他试剂盒中，容器可被配置为用于专门针对受试者样本中的一种或多种待评估的代谢物的其他分析测试(例如:酶，化学，比色，荧光等)。如上所述，容器可以被配置为在一个或多个小瓶或小管中，或者在一个或多个室或孔中保存内标物混合物。或者，容器可以被配置为分开保存参考量的每种待评估的内标物(例如，每个室或孔中一种内标物)。

一些试剂盒包含多个容器。例如，一些试剂盒包括具有内标物的一个或多个容器。另外，一些试剂盒包括一个或多个具有内标物的容器以及用于内标物的测量和受试者样本中一种或多种待评估代谢物的定量的额外容器(例如，多孔板或另一个小管或小瓶)。在一些试剂盒中，存在单个容器，用于容纳一种或多种内标物并且用于内标物的测量和受试者样本中一种或多种待评估代谢物的定量。

在容器是多孔或多室的容器的试剂盒中，当分配试剂盒供使用时，参考量的待评估代谢物可位于一个或多个孔或室中。在一些试剂盒中，使用试剂盒时，参考量的待评估代谢物必须分散到一个或多个孔或室中。

试剂盒的容器也可以被配置为接受来自至少一个受试者的生物样本。例如:试剂盒的容器包括多个室或孔的情况下，受试者的生物样本可以分配到一个或多个室或孔中。在一些实例中，可以将一个或多个受试者样本分配到多个室或孔中。试剂盒的容器通常被配置为接受流体样本(例如，流体生物样本或已被处理以获得用于分析的流体的固体生物样本)。

一些试剂盒还包括用于内标物和生物标记物的测量以及受试者样本中一种或多种待评估代谢物的定量的试剂。这些试剂可以被包含在试剂盒内，在一个或多个额外的容器中。

示例性试剂盒包括多种内标物，每种内标物设置在单独的容器中或在相同的容器中。分析容器可选择地为微量滴定板，被配置为用于GC-MS或LC-MS设备。微量滴定板有足够数量的孔以容纳至少一种内标物。内标物将具有已知浓度并且用于将已知量的(或等分量)的每种内标物分配到微量滴定板的单独的孔中。在将内标物分配到分析容器中之后，还可将一份受试者样本分配到微量滴定板中。分配单份受试者样本，或可分配多份。如果将多份分配到微量滴定板中，则可将每一份分配到单独的孔中。另外，如果多份被分配到微量滴定板中，则每一份的量可以不同。

实施例18试剂盒的使用

试剂盒可用于实施本发明的方法，通过使代谢物谱中的代谢物能够定量来提供脏脏疾病状态的估肝。例如:本发明的试剂盒可用于诊断(例如:确定存在或不存在)肝脏疾病状态。另外，本发明的试剂盒可用于确定患有肝脏疾病的受试者是否对肝脏疾病的治疗有响应。

可使用本发明的试剂盒评估从受试者获得的生物样本。样本可以是流体样本(例如:血浆或血清)。在一些试剂盒的使用中，可以在不处理样本的情况下评估受试者样本中的代谢物谱。在其他试剂盒的使用中，受试者样本中的代谢物谱可能要求在被评估之前处理样本。

可选择地，医生可从受试者身上获取样本并将该样本送至临床实验室，使用本发明的试剂盒进行测试。或者，医生所在的临床机构或医疗机构可以使用本发明的试剂盒进行测试。

试剂盒可用于进行多种测试，以测量受试者样本中一种或多种代谢物的量。例如:试剂盒可用于进行受试者样本的光谱分析。一些试剂盒被配置为用于光谱分析，例如:气相色谱和/或液相色谱。例如:试剂盒可以被配置为用于受试者样本中关注的代谢物的LC-TQMS分析。或者，试剂盒可以被配置为使得可以进行专门针对不同类型的代谢物的分析测试(例如:酶，化学，比色，荧光等)，以测量受试者的样本中关注的代谢物的量。在一些使用中，包括在试剂盒中的内标物用作分析测试的阳性对照，进行该分析测试是为了测量受试样本中关注的代谢物的量。在一些使用中，包括在试剂盒中的内标物用于帮助校准和/或测量受试者样本中关注的代谢物的量。根据用以测量受试者样本中关注的代谢物的量的待进行的分析测试的类型，可以将进行该分析测试使用的不同成分分装到具有一种或多种内标物和容器的试剂盒中。

可选择地，从使用试剂盒进行分析测试获得的数据可以是受试者样本中一种或多种关注的代谢物(如本文教导的生物标志物组合)中的每一种的水平(例如，量)。这些数据可以与健康受试者的参考生物标志物水平进行比较。

在从使用试剂盒进行分析测试获得数据(即受试者样本的代谢物谱(即每种关注的代谢物的量)后，可以将数据输入位于实验室的计算机终端上的软件程序中，以生成测试结果报告，然后可以提供给医生或个人。一旦医生从临床实验室收到测试结果报告，该医生就可以评估受试者的身体状况。基于评估的受试者的样品的代谢物谱,如上所述,测试结果报告可以向医生提示受试者患有或没有患有肝脏疾病状态,或具有肝脏疾病(比如肝纤维化)的特定分类(如期、严重程度或进展)，或者提示受试者对肝脏疾病的特定治疗有反应。然后，医生可以根据测试结果报告所提示的个人状态，在必要时，提供建议或为患者选择合适的治疗方法。

实施例19生物标志物组合和诊断模型

从实施例8详述的23种胆汁酸标志物列表中，选择包括标志物子集的组合，以测试较小组合的诊断效能。具体地说，被选择了GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCA，根据它们的个体高差异倍数(‘FC’)，曲线下面积(‘AUC’)和源自在对照和所有肝脏疾病(NASH，纤维化，肝硬化)患者之间建立的OPLS-DA模型的变量投影重要性(VIP)值(表20)。

表20用于区分肝脏疾病患者(与对照相比)的选择的组合的每种生物标志物的ROC曲线分析的曲线下面积(AUC)。

通过联合7种BAs提供BA组合，使用逻辑回归建立单变量。在这个例子中，这个组合被称为BA组合。逻辑回归(LR)用于将该七种胆汁酸联合成单个胆汁酸信号。利用疾病(CHB)和健康对照，或疾病(CHB)和疾病(纤维化)，或疾病(纤维化)和疾病(肝硬化)的二元结果作为因变量，以及七种胆汁酸作为协变量，利用“Enter”方法建立逻辑回归模型，分类分界值为0.5；最大迭代次数为20。逐步回归概率(Probability for Stepwise)：进入值(Entryvalue)为0.05，去除值为0.10。使用的软件为SPSS 23.0(IBM SPSS，美国)。逻辑模型的ROC曲线用该模型的拟合概率标绘，该模型的拟合概率作为计算灵敏度和特异性的可能分界点。

基于测试集的数据开发了用于评估肝脏疾病状态(例如：诊断和/或区分疾病状态)的下面的回归模型。在训练集上训练的每个模型产生提示受试者患有较严重的肝病状态的可能性的概率。

为了区分NASH患者和健康对照，基于七种BAs(表21)开发的逻辑回归模型如下：

概率＝exp{-1.923-0.004(GCDCA)+0.010(GCA)+0.116(TCDCA)-0.072(TCA)-0.035(GUDCA)-0.122(TUDCA)+0.025(7-KLCA)}/(1+exp{-1.923-0.004(GCDCA)+0.010(GCA)+0.116(TCDCA)-0.072(TCA)-0.035(GUDCA)-0.122(TUDCA)+0.025(7-KLCA)})

表21用于区分NASH受试者与比较组(具有对照)的选择的组合的生物标志物信号的逻辑回归分析。

使用Wald检验计算P值。

为了区分NASH患者和纤维化患者，基于七种BAs(表22)开发了逻辑回归模型，该逻辑回归模型如下：

概率＝exp{-0.511-0.0003(GCDCA)+0.001(GCA)+0.007(TCDCA)-0.007(TCA)-0.003(GUDCA)+0.083(TUDCA)+0.491(7-KLCA)}/(1+eexp{-0.511-0.0003(GCDCA)+0.001(GCA)+0.007(TCDCA)-0.007(TCA)-0.003(GUDCA)+0.083(TUDCA)+0.491(7-KLCA)})

表22用于区分NASH与肝纤维化的选择的组合的生物标志物信号的逻辑回归分析。

使用Wald检验计算P值。

为了区分肝硬化患者和纤维化患者，基于七种BAs(表23)建立了逻辑回归模型，该逻辑回归模型如下：

概率＝exp{-2.514-0.0002(GCDCA)+0.001(GCA)+0.0004(TCDCA)-0.001(TCA)+0.001(GUDCA)+0.020(TUDCA)+0.020(7-KLCA)}/(1+exp{-2.514-0.0002(GCDCA)+0.001(GCA)+0.0004(TCDCA)-0.001(TCA)+0.001(GUDCA)+0.020(TUDCA)+0.020(7-KLCA)})

表23用于区分患有肝纤维化的患者与患有肝硬化的患者的选择的组合的生物标志物信号的逻辑回归分析。

基于多变量的ROC曲线产生了有用的诊断功效，对于区分NASH患者与健康对照来说，AUC值为0.935(95％置信区间[CI]＝0.855至0.985)(图16A和16D)(表21)。表24中给出了，使用0.429的分界值，灵敏度为87.0％，特异性为89.1％。矫正BMI，年龄和性别后，血清BA信号仍然是显著的(p＜0.001)，比值比(odds ratio)为567.635(95％CI，60.667至5311.080)(表25)。为了区分NASH和纤维化患者，AUC值为0.861(95％CI＝0.780至0.942)(图16B和16E，表22)。灵敏度和特异性分别为88.8％和82.6％，使用0.811的分界值(表24)。同样地，矫正BMI，年龄和性别后，鉴别的血清BA信号仍然是显著的(p＜0.001)，比值比为75.243(95％CI，24.451至232.654)(表26)。为了区分纤维化与肝硬化患者(表23)，得到了AUC为0.889(95％CI＝0.851-0.926)，78.8％的灵敏度和87.2％的特异性(图16C和16F，表24)。此外，矫正BMI，年龄和性别后，血清BA信号仍然是显著的(p＜0.001)，比值比为177.141(95％CI，38.264至820.068)(表27)。

表24 ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性根据不同研究组。^*

*CI为置信区间。

表25逻辑回归分析显示用于诊断NASH患者与对照的鉴别的BA组合信号不依赖可能的混杂风险因素，包括BMI、年龄和性别的指标。

	比值比(95％置信区间)<sup>3</sup>	标准误差	P值
				NASH相关的胆汁酸信号	567.635(60.667-5311.080)	1.14E+00	2.72E-08
体质指数<sup>1</sup>	1.033(0.866-1.232)	9.00E-02	7.21E-01
				年龄<sup>1</sup>	1.026(0.959-1.098)	3.40E-02	4.55E-01
性别<sup>2</sup>	0.560(0.099-3.182)	8.86E-01	5.13E-01

P值用Wald检验计算。¹BMI和年龄是连续变量。²男性或者女性。³与连续变量或参考组的分类变量的较低值相比，比值比大于1相当于NASH的可能性。

表26逻辑回归分析显示用于诊断肝纤维化患者与NASH患者的鉴别的BA信号不依赖可能的混杂风险因素，包括BMI、年龄和性别。

	比值比(95％置信区间)<sup>3</sup>	标准误差	P值
				肝纤维化相关的胆汁酸信号	75.243(24.451-232.654)	5.75E-01	5.39E-14
体质指数<sup>1</sup>	1.001(0.895-1.119)	5.70E-02	9.87E-01
				年龄<sup>1</sup>	0.993(0.959-1.030)	1.80E-02	7.20E-01
性别<sup>2</sup>	0.392(0.143-1.073)	5.14E-01	6.80E-02

P值用Wald检验计算。¹ BMI和年龄是连续变量。²男性或者女性。³与连续变量或参考组的分类变量的较低值相比,比值比大于1相当于肝纤维化的可能性。

表27逻辑回归分析显示用于诊断肝硬化患者与肝纤维化患者的鉴别的胆汁酸信号不依赖可能的混杂风险因素，包括与BMI、年龄和性别不相关。

P值用Wald检验计算。¹ BMI和年龄是连续变量。²男性或者女性。3与连续变量或参考组的分类变量的较低值相比，比值比大于1相当于肝硬化的可能性。

出人意料地，结果显示本发明的BA组合的AUC高于AST/ALT比值，TBIL，MELD评分，APRI和FIB-4(图16A-C和图17A-D，进一步的细节提供在补充材料中)。这证明了即使与传统临床参数相比，BA组合具有出人意料强大的诊断效能。

然后，我们从利用GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCA的典型判别分析建立了函数图，并且显示，对照，NASH，纤维化和肝硬化患者划分成四个大组(图20)。结果为，在169例对照中，132例或78.1％分类正确。NASH，纤维化和肝硬化患者的正确分类率分别为63.0％，80.7％和70.6％(表28)。

明显地，患者具有逐渐升高的血清GUDCA和TCDCA水平，与肝脏疾病从NASH进展到纤维化以及从纤维化进展到肝硬化是一致的(图16G和16H)。还将BA组合的水平与从65例糖尿病患者获得的BA组合的水平进行比较，正确地区分了糖尿病患者与肝脏疾病患者(图16J和16K和图19)。

表28利用GCA、GCDCA、TCA、TCDCA、GUDCA、TUDCA、DCA和7-KLCA的胆汁酸水平对患有NASH、肝纤维化和肝硬化的患者和对照进行分类的结果^a。

实施例20使用用于多种生物标志物组合评分的模型评估肝脏疾病状态

在不包括实施例8中测试的肝脏疾病受试者的任一个的一个新集(验证集(validation set))的肝脏疾病受试者中测量了选择的胆汁酸组合。验证集包括502名非糖尿病、非酒精性、没有肝脏疾病的健康受试者，与测试集(testing set)一样。来自该集的受试者的数据提供在表29中。为了比较，还在这些受试者中测量了肝脏疾病状态的其他标志物(例如:ALB，ALP，ALT，AST)。

验证集包括患有慢性乙型肝炎的471名肝脏疾病受试者(慢性肝病，CLD)，他们中没有一例包含在测试集中。这471例肝脏疾受试者包括132例无肝纤维化的受试者(HB也称为CHB)、30例S1肝纤维化受试者、26例S2肝纤维化受试者、20例S3肝纤维化受试者、49例CPA肝硬化受试者、99例CP B肝硬化受试者、22例CP C肝硬化受试者以及93例患有肝细胞癌伴随CP C肝硬化的受试者。测量了验证集中组合的每种生物标志物(GCA、GCDCA、TCA、TCDCA、GUDCA、TUDCA和7-KLCA)的水平，表30中显示了测量的水平。验证集的测量值与测试集的测量值是一致的。

表29验证群体的受试者的人口统计学数据。

表格注释:数值以平均值±SEM表示。*表示与健康对照相比p值小于0.05；**表示与健康对照相比p值小于0.01。ALB：白蛋白；ALP，碱性磷酸酶；ALT，谷丙转氨酶；AST，天冬氨酸转氨酶；CHOL，胆固醇；PALB，前白蛋白；PDW，血小板分布宽度；PLT，血小板；TBA，总胆汁酸；TBIL，总胆红素；TG，甘油三脂；AFP，甲胎蛋白；MELD，末期肝病模型；APRI,AST与血小板比值指数；FIB-4(患者年龄、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和血小板)。

表30验证群体中血清胆汁酸浓度

前面的例子中开发的，表明较高的血清BA水平与得肝脏疾病的高风险有关的模型适用于验证群体。验证研究再一次证明了这七种胆汁酸组合区分受试者的能力。具体来说，在对年龄，性别和BMI进行矫正后，利用验证群体的血清样本进行的验证研究，使用在训练集上训练的NASH对比(vs)对照模型，成功地区分了HB患者与健康对照(AUC:0.808(95％CI:0.747-0.868))；使用在训练集上训练的NASH对比肝纤维化模型，成功地区分了HB患者和肝纤维化患者(AUC:0.861(95％CI:0.796-0.926)，以及使用在训练集上训练的肝纤维化对比肝硬化模型成功地区分了肝纤维化患者和肝硬化患者(AUC:0.792(95％CI:0.705-0.879))(图17A-C)。此外，矫正了年龄，性别和BMI后，七种胆汁酸组合能够区分肝硬化患者和HCC患者(AUC:0.871(95％CI:0.815-0.926))(图17D),利用新建立的模型，

概率＝exp{0.503-0.001(GCDCA)-0.0002(GCA)+0.001(TCDCA)-0.001(TCA)+0.001(GUDCA)+0.0001(TUDCA)+0.029(7-KLCA)}/(1+exp{0.503-0.001(GCDCA)-0.0002(GCA)+0.001(TCDCA)-0.001(TCA)+0.001(GUDCA)+0.0001(TUDCA)+0.029(7-KLCA)})

其是在验证集上训练的。

图17E中提供了柱状图，其显示了验证集中GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCA的血清水平的改变。如以前在测试集中所做的，我们使用GCA，GCDCA，TCA，TCDCA，GUDCA，TUDCA和7-KLCA构建了函数图，并且能够显示患有HBV，肝纤维化，肝硬化和HCC的患者划分成四个大组(图21和图22)。图17F显示了患有HBV，S1，S2和S3肝纤维化的患者，CP级A，B和C的肝硬化以及HCC的患者的GUDCA水平。

再次如验证群体中所证明的，出人意料地发现这个胆汁酸组合的AUC大于之前报道的测试AST/ALT比值，TBIL，MELD评分，APRI和FIB-4(图17A-D)。这证明了这个组合的生物标志物，当单独使用或与本文教导的其他生物标志联合使用时，具有非凡的能力。

实施例21通过用胆汁酸调节剂治疗可预防肝癌

该实施例详述了失调的胆汁酸(BAs)与肝脏疾病密切相关，且归因于肠道微生物菌群的改变。该实施例显示，在链脲佐菌素和高脂肪饮食(HFD)诱导的非酒精性脂肪性肝炎-肝细胞癌(NASH-HCC)的小鼠模型中，包括脱氧胆酸盐(DCA)，牛磺胆酸盐(TCA)，牛磺鹅脱氧胆酸盐(TCDCA)和牛磺胆酸盐(TLCA)的疏水BAs的肝内滞留大幅度增加。另外，慢性HFD喂养的小鼠自发形成了肝脏肿瘤，伴随肝BA水平显著增加。通过增强NASH-HCC小鼠模型中疏水性BAs的肠排泄(通过2％消胆胺喂养)来治疗性调节BA水平显著地阻止了HCC发展。肠道微生物菌群的改变与肝脏和粪便中BA水平改变密切相关。HFD诱导的炎症抑制了关键BA转运蛋白，导致肝内BA浓度持续增加。该研究还显示了BA处理的正常人肝细胞系的细胞增殖显著增加，TCDCA处理的HepG2细胞系中肿瘤抑制基因CEBPα的表达下调，表明几种疏水BAs可协同促进肝脏癌变。

推测BAs的肝内积累很大程度地诱导持续的肝细胞损伤，导致随后发展为纤维化和恶性肿瘤。使用了链脲霉素高脂肪饮食(STZ-HFD)诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)-HCC小鼠模型，其与人肝脏疾病从脂肪变性进展到NASH，肝纤维化以及最终HCC高度相关，并且该模型组中近100％的小鼠最终发展为HCC。该推测在慢性HFD喂养的小鼠和人正常肝细胞系和肿瘤细胞系中得到进一步证实。

材料和方法

小鼠和饮食

实验1:通过STZ与HFD联合诱导形成NASH-HCC C57BL/6J小鼠模型。无病原体怀孕14天的C57BL/6J小鼠购自日本CLEA公司(日本，东京)，将新生雄性小鼠分成两组:对照组和模型(STZ-HFD)组。对照组中的小鼠不经任何处理装入笼内，喂养正常饮食(来自CLEAJapan Inc.的CE-2，由12kcal％脂肪，29kcal％蛋白质，59kcal％碳水化合物组成)。STZ-HFD组的小鼠在出生后第2天接受200μg STZ(Sigma，MO，美国)单次皮下注射，4周龄后随意喂食HFD(来自CLEA japan Inc.，HFZ的STZ-FHD组)16周(图23A)。在实验过程中，所有动物的体重每周记录一次。在第6，8，12和20周，将每组6只小鼠安乐死，并收集肝脏，血浆和粪便样本。

实验2:除实验1外，我们用单独HFD喂养C57BL/6J雄性小鼠，观察肝脏癌变，并进一步证实BAs会促进肝脏癌变。包括两组小鼠:(1)对照；(2)HFD。我们在不同的时间点处死小鼠，并在第58周，我们在HFD喂养的小鼠中观察到HCC形成。

实验3:发现实验1中肝癌变的小鼠中BA水平显著增加；重复NASH-HCC小鼠模型来验证BA结合树脂，消胆胺能否减弱/防止肝脏癌变。包括三组小鼠:(1)对照(n＝9)；(2)模型(STZ-HFD，n＝30)和(3)在STZ-HFD-BA树脂(n＝30)组，用包括2％消胆胺的HFD饮食喂养小鼠。所有步骤与实验1相同。在第20周，小鼠安乐死，收集肝脏，血浆和粪便样本(图26A)。

所有的动物手术都根据美国国家科学院制定，美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》(NIH出版物86-23，1985年修订的)进行。

血清ALT和AST的测量

使用FUJI DRI-CHEM 7000(Fujifilm，Tokyo，日本)测量血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平。

组织学评估

将肝组织固定在10％中性福尔马林缓冲液中，包埋在石蜡块中，并通过常规苏木精和曙红(H&E)染色加工。计算个体NAFLD活动评分。

胆汁酸(BAs)的测量

通过超高效液相色谱三重四极杆质谱法(UPLC-TQMS)定量测量血浆，肝脏和粪便中的BA水平。使用ACQUITY BEH C18色谱柱(1.7μm，100mm×2.1mm)(Waters，Milford，MA)进行全部的分离。使用MassLynx 4.1版本进行数据采集，并且使用TargetLynx程序管理器4.1版本(Waters Corp.，Milford，MA)进行BA定量。对于详情，参见支持信息(SupportingInformation)中的方法。

肠道微生物菌群表征

通过使用细菌标签编码的FLX 16S rDNA扩增子焦磷酸测序(bTEFAP)方法表征肠道细菌的多样性，如以前报道的。

实时定量聚合酶链式反应

使用RLT Plus和AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)中的匀浆组织裂解物，按照制造商的协议同时提取DNA和RNA。在RNA纳米6000芯片和2100安捷伦生物分析仪上使用1μL RNA评估RNA完整性。在Applied Biosystems 7900FAST Real-Time PCRSystems(Applied Biosystems)上通过比较循环阈值方法一式三份地测量靶mRNA的表达。正向和反向引物购自Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)。将靶基因的表达归一化为ACTB水平，并使用“dCT”也称为比较Ct方法计算靶基因的相对表达量。

肝脏中TG，IL-6和TNF-α的测量

使用BlueGene Biotech，中国，上海的Elisa试剂盒测量肝脏中的甘油三酯(TG)，白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)的水平。

血浆，肝脏和粪便中LPS的测量

使用小鼠LPS Elisa试剂盒(BlueGene Biotech，中国，上海)，根据制造商的协议测定血浆，肝脏和粪便中脂多糖(LPS)的水平。

统计分析使用GraphPad Prism(6.0版本；GraphPad Software，San Diego，USA)和SPSS 22.0(IBM SPSS，USA)计算所有统计分析。数据表示为平均值±SEM。BA测量中的各组之间的差异通过t检验分析，Holm-Sidak方法用于多个比较校正。我们认为p值＜0.05为显著。进行了Spearman相关分析来评估肠道微生物菌群和肝脏和粪便中的BA水平之间的相互影响，给定数值范围为从1.0(最大正相关)到-1(最大反相关)和0(不相关)。

细胞培养和BA处理

正常人肝细胞系WRL-68和THLE-2购自Sigma。为了BA处理，收获细胞，在PBS中漂洗两次，重悬于添加10％活性炭剥离的FBS的无糖DMEM(Life Technologies)中，并以5×10⁴/孔的密度接种到6孔板中。将葡萄糖(Glc，Sigma)稀释到27.5mM，将油酸(OA，Sigma)稀释到0.3mM以模拟体外高葡萄糖和脂肪条件。将5种胆汁酸，CA，TLCA，TCA，TCDCA，GCDCA，DCA或LCA中的每一种以5μM，50μM，100μM或200μM的浓度加入培养基中。14天处理后，将正常培养基(含有10％FBS的DMEM-F12)加入各孔中置换用过的培养基。在正常培养基中进行细胞增殖和贴壁不依赖性生长分析。此外，进行western印迹分析以分析癌蛋白c-myc表达的改变。

人类癌细胞系HepG2购自Sigma，在添加10％胎牛血清(FBS，Life Technologies)的DMEM-F12(Life Technologies)中培养。为了BA处理，收获细胞，用PBS漂洗两次，接种于添加10％活性炭剥离的FBS和6mM葡萄糖的无糖DMEM(Life Technologies)中。将5种胆汁酸，CA，UDCA，TCDCA，DCA或LCA中的每一种以100μM的浓度加入培养基中。14天后，用新鲜正常培养基(含有10％FBS的DMEM-F12)代替用过的培养基。然后细胞用于细胞增殖分析和肿瘤抑制蛋白CEBPα的western印迹分析。

c-myc(Santa Cruz)，CEBPα(Santa Cruz)和Actin(Li-cor)的一抗是购买的并按制造商指示的浓度稀释使用。

结果

STZ-HFD诱导的NASH-HCC小鼠中肝脏BAs显著增加在雄性C57BL/6J小鼠中成功发展了脂肪变性，NASH，肝纤维化和HCC的病理表型。新生小鼠皮下注射STZ诱导出轻度胰岛炎症和胰岛破坏。出生4周后，给予STZ引发的小鼠HFD，这导致从脂肪肝到NASH，肝纤维化和HCC的连续性组织学改变(图23A)。值得注意的是，所有HFD喂养的小鼠都发展为HCC(图23B)。H&E染色(图23C)显示6周时脂肪肝，但无炎性病灶(中度炎性浸润的脂肪肝包括嗜中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞)第8周时肝细胞的气球样变性，第12周时慢性纤维化和第20周时HCC伴随NAFLD活动评分增加。

在STZ-HFD小鼠中观察到体重增加伴有肝损伤加重。与正常小鼠相比，STZ-HFD组的肝脏重量显著增加，特别是在肝纤维化和HCC阶段(图23D)。STZ-HFD组小鼠中空腹血糖和肝脏TG显著升高(图23E和23F)。可检测到STZ-HFD小鼠中血清ALT和AST轻度升高。与对照相比，STZ-HFD组的血浆、肝脏和粪便中的内毒素(脂多糖，LPS)水平显著增加(图23G)。

重要的是，在第12周和第20周，模型小鼠中肝脏TCA，DCA，GCA，TDCA，TLCA，TUDCA，TCDCA和总BAs的水平大幅增加(图23H)。BAs肝脏积累发生于肝纤维化阶段，而在同一阶段粪便中BAs消失，在HCC阶段逐渐增加。特别是，在所有BA种类中，与对照相比，TCDCA是模型小鼠肝脏中最显著增加的种类。除了这些BAs之外，模型小鼠中的血浆和粪便中的LCA增加。

有趣的是，与对照组相比，模型组肝纤维化阶段(第12周)粪便中的主要BA，CA和CDCA降低，而在血浆和肝脏中，它们的水平是增加的。在肝纤维化阶段，模型组的总粪便BAs比对照略低，而在HCC阶段，它的水平在肝纤维化和HCC阶段，在血浆和肝脏中升高。

肝脏肿瘤在慢性HFD喂养小鼠模型中的发展(发生)

在STZ-HFD处理的小鼠中观察到肝脏中的BAs显著增加，导致HFD诱导的高浓度BAs和它们在肝脏中滞留可能充当肿瘤促进者的推测。由于STZ已经被国际癌症研究机构归类为潜在的致癌物，所以我们研究了单独使用HFD是否会发展成肝癌，尽管我们在用单独STZ处理20周的雄性小鼠中没有观察到HCC。在长期的HFD干预研究中，在58周在一半以上的(11只中的6只)HFD喂养的小鼠)中观察到肝脏肿瘤(图24A和24B)。在HFD喂养诱导的HCC小鼠中，肝重量(图24C)和肝与体重比值(图24D)显著增加。血浆，肝脏和粪便中的LPS水平在HCC小鼠中均明显增加(图24E)。尤其是，肝脏和血浆BAs，TCA，GCA和TCDCA在所有用HFD喂养的小鼠中均增加，但是与正常相比，在发生HCC的小鼠中具有统计学显著性(图24F和24G)。

增加疏水性BAs的肠代谢可预防HCC的发展

结果显示HFD诱导的肝BAs积累会促进肝肿瘤。为了确定BAs在HCC发展中的作用，我们重复了STZ-HFD小鼠模型并且减少了口服消胆胺的小鼠中BAs的量(图25A)。我们观察到，与STZ-HFD模型组相比，消胆胺喂养显著降低肝脏恶性病变的发生率和大小(图25B)。通过消胆胺治疗使STZ-HFD组小鼠的组织学趋向于正常，这被血液和肝组织的逆转的理学特征支持(图25C和25D)。消胆胺给药后，IL-6，TNF-α，胶原蛋白1型和癌相关基因磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(Gpc3)的表达趋于正常(图25E)。消胆胺干预后，BA转运蛋白(图25E)以及BAs，主要地，DCA，TCA和TCDCA，的改变在肝脏(图25F)和血浆中减弱了。对STZ-HFD干预响应的肠道微生物菌群的和血浆，肝脏和粪便中LPS的水平的破坏也通过消胆胺干预恢复正常(图25G和25H)。

肠道微生物菌群在肝癌变过程中显著改变并与改变的BAs相关。

我们的宏基因组学数据显示，在第6,8,12和20周，STZ-HFD干预小鼠的肠道微生物菌群发生显著改变(图26A-26D)。特定微生物的多度随肝脏疾病进展而变化。在模型组中，粪便中的厚壁菌门(Firmicutes)和安定菌门(Antinobacteria)的OTUs的相对多度(％)显著增加，而类杆菌(Bacteroides)和变形菌门(Proteobacteria)与对照相比在门水平(phylum level)上显著降低(图26B)。模型组中梭状芽孢杆菌(Clostridium)，拟杆菌属(Bacteroides)和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)的属水平显著增加(图26C)。粪便梭菌(Clostridium spp.)，类杆菌(Bacteroides spp.)，奇异菌(Bacteroides spp.)，脱硫孤菌(Desulfovibrio spp.)的OTUs的相对多度(％)显著增加，而模型组中Paasutterella spp和Akkermansia spp与对照组相比在种水平(species level)上显著降低(图26D)。据报道，所有这些细菌都参与BA去结合，脱羟基化以及BA降解成CO₂和H₂O。

图26E中肠道微生物菌群变化与BA浓度之间的Spearman相关分析显示TCDCA与Barnesiella(r＝-0.31，p＝0.033)，Odoribacter(r＝-0.29，p＝0.047)，Parasutterella(r＝-0.34，p＝0.019)和Paraprevotella(r＝-0.48，p＝0.001)显著地负相关，与Xylanibacter(r＝0.40，p＝0.05)，埃希氏菌(Escherichia)(r＝0.41，p＝0.004)显著地正相关。TCA与Parabacteroides(r＝0.46，p＝0.001)，Alistipes(r＝0.40，p＝0.005)和Sarcina(r＝0.30，p＝0.038)相关。GCA与Alistipes(r＝0.34，p＝0.017)和Parabacteroides(r＝0.30，p＝0.036)相关。TLCA与Parasutterella(r＝-0.30，p＝0.036)，Paraprevotella(r＝-0.42，p＝0.003)，Parabacteroides(r＝0.29，p＝0.043)和Escherichia(r＝0.50，p＝0.000)相关。TDCA与Alistipes(r＝0.51，p＝0.000)和Parabacteroides(r＝0.58，p＝0.000)相关。

粪便主要BAs、CDCA与Oribacterium(r＝0.31，p＝0.03)和slackia(r＝0.38，p＝0.009)多度正相关，CA与寡单胞菌(stenotrophomonas)正相关(r＝0.53，p＝0.0001)，并且与parabacteroides(r＝-0.29，p＝0.046)多度负相关。另一方面，类杆菌(Bacteroides)与LCA(r＝0.60，p＝8.6E-06)，DCA(r＝0.41，p＝0.005)，TLCA(r＝0.37，p＝0.012)和TDCA(r＝0.38，p＝0.008)正相关。梭菌(Clostridium)与DCA(r＝0.31，p＝0.032)和LCA(r＝0.64，p＝1.1E-06)，GLCA(r＝0.46，p＝0.001)和GDCA(r＝0.48，p＝0.001)之间也存在明显正相关。Allobaculum与TACCA(r＝-0.51，p＝0.000)，GCA(r＝-0.55，p＝0.000)，TLCA(r＝-0.32，p＝0.027)，TUDCA(r＝-0.59，0.000)和TCA(r＝-0.62，p＝0.000)负相关。Parasutterella与DCA(r＝-0.38，p＝0.009)和LCA(r＝-0.69，p＝8.6E-08)负相关。粪肠杆菌(faecalibacterium)与DCA之间呈显著负相关(r＝-0.39，p＝0.008)。LCA与Barnesiella(r＝-0.57，p＝3.3E-05)和异味细菌(odoribacter)(r＝-0.58，p＝4.8E-05)也显著负相关。

BA积累下调参与BA转运和合成的基因

基因表达分析显示了参与肝脏中BA转运和合成的基因下调(图27A)。尤其是，在NASH和肝纤维化的小鼠模型中，小鼠肝脏中肝FXR表达显著降低，表明下调肝外排转运蛋白的机制，从而导致肝细胞中BA积累增加和BA诱导的肝损伤。如由第6，8，12和20周时BSEP显著下调，以及第6周时CYP7A1上调，导致HCC病理发展中肝BA滞留的显著增加所证实的。与在第6,8,12和20周观察到的小鼠模型的肝脏中异常高的BA水平一致。所有这些表明HFD诱导的脂肪肝导致肝脏中BA合成和转运失调，伴随肝FXR和BSEP表达的显著抑制。STZ-HFD治疗抑制BA摄取转运蛋白，牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)，顶端钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)和SHP的表达。

细胞因子表达在肝脏癌变中显著增加

促发炎相关基因(比如IL-6和TNF-α)的表达在脂肪变性和脂肪性肝炎阶段增加，肝纤维化相关基因，TIMP金属肽酶抑制剂1(TIMP-1)和胶原蛋白1型的表达在组织学证明胶原沉积之前增加，以及肝癌相关基因(基质金属蛋白酶9(MMP-9)和Gpc3的表达在HCC期增加(图27B)。所有这些结果表明STZ-HFD-诱导的炎症和氧化应激抑制了主要BA转运蛋白，导致肝内BA浓度增加(图23)，这促进了几种重要的促炎、肝纤维化和癌症标志物。

BAs启动正常肝细胞向恶性转化并抑制肿瘤抑制基因CEBPα在HepG2细胞中的表达

我们通过研究BAs，特别是DCA，LCA，TLCA，TCDCA，TCA，CA，UDCA和GCDCA在用高葡萄糖和脂肪酸浓度培养的正常人肝细胞中的肿瘤促进作用进一步验证了我们的假设。我们发现在高葡萄糖(27.5mM)和油酸(0.3mM)的条件下，DCA，LCA，CA和TCDCA处理显著促进了WRL-68(图28A)和THLE-2以及HepG2细胞的增殖(图28B)。然而，TLCA，TCA和GCDCA处理对WRL-68细胞的增殖几乎没有影响。这些结果表明DCA，LCA或TCDCA能够在高糖和高脂微环境中加速正常肝细胞的生长速度，这可能导致肝细胞的恶性转化。

在高葡萄糖和高脂肪条件下，与亲代细胞相比，DCA或LCA处理并不增强WRL-68的贴壁不依赖性生长，但是与用高葡萄糖和高脂肪处理的细胞相比，显著增加了。

尤其是，DCA，LCA和TCDCA增加了WRL-68细胞中癌蛋白c-myc的表达(图28C)，TCDCA降低了HepG2细胞中肿瘤抑制基因，CEBPα的表达(图28D)。

讨论

在本发明研究之前缺乏对肠道微生物介导的脂肪肝疾病发展及其向HCC进展的确切机制。我们的研究指向肝脏-胆汁酸-微生物菌群代谢轴，其作为肠道微生物菌群和肥胖相关的肝脏癌变之间的内在联系。

使用独特的NASH-HCC小鼠模型，我们显示了在肝脏疾病进展期间，肠道微生物组成的显著改变之后，一组疏水性，因此具有细胞毒性的BAs在肝脏中的积累显著增加。通过由微生物菌群引起的BA的生化转化(去结合，去羟基化，脱氢)，以及同时通过BA的抗菌作用，BAs和肠道微生物菌群之间存在强烈的双向相互作用。推测肠道微生物菌群是依赖FXR方式的胆汁疏水性的决定因素。类似地，FXR和BAs之间的相互作用也是双向的，其中FXR控制肝和肠中的BA合成、转运和代谢，BA激活FXR。FXR有助于维持BA体内稳定和降低BA毒性。在大鼠肝脏中，FXR激活会导致BSEP和SHP的表达上调。SHP干扰控制BA合成的转录基因Cyp7a1和Cyp8b1。SHP还影响NTCP表达，钠依赖性BA将载体从门静脉摄取到肝脏。在回肠末端，FXR激活引起回肠BA结合蛋白的下调和OSTα/β(BA重吸收所必需的肠BA转运蛋白)的上调。在我们的结果中，FXR，BSEP，SHP表达，以及Cyp7a1，Cyp8b1，NTCP和OSTα表达降低解释了BAs在肝脏中积累，这是由于从肝脏到胆汁的转运泵速率降低并且BAs从门静脉的重吸收增加)。

本文展示的结果表明DCA可能在至少某些方面促进HCC发展。BAs，特别是GCA，TCA，GCDCA，TCDCA，GDCA，DCA和TDCA都被认为是胃肠道癌症的病原体(etiologic agent)。持续暴露于高水平的BAs可诱导突变和异常增殖，这由暴露于DCA，LCA或TCDCA后正常人细胞系WRL-68和THLE-2或HepG2细胞的增殖增强证明。在人HCC中已经观察到转录因子c-myc介导重要的生物效应，包括细胞生长，增殖，分化和凋亡的丧失，和c-myc的过表达。先前的报道显示，BAs(比如DCA和CDCA等)可以在酸性环境中成为c-myc的强效诱导剂，并且更近期的研究进一步证实，在酸性条件下DCA和CDCA通过激活c-myc转录来增加人胃癌细胞内人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达。以前在Fxr缺失小鼠中观察到血清和肝BAs水平升高以及IL-1β表达增加、β-连环蛋白及其靶基因c-myc升高，在12个月龄的时候自发形成肝细胞病变、腺瘤和癌³。

在小鼠模型中具有高BA水平的肝脏显示存在炎症，脂肪性肝炎，纤维化和细胞凋亡。已知炎症刺激细胞死亡并增加细胞更新，从而促进肝脏肿瘤发生、STZ干预和连续HFD刺激氧化应激和炎症，如由其他报告中显示的连续增加的TNF-α，MMP-9，Timp-1，IL-6，胶原蛋白1型(Collagen Type 1)，Gpc-3,HCC的标志物的水平所证明的。

为了证实HFD诱导的BA过载能否诱导肝肿瘤形成，我们给C57BL/6J小鼠喂HFD共58周。长期饲喂HFD可诱发小鼠肝肿瘤，还观察到小鼠中血浆和肝脏中的TCDCA，TCA和GCA显著增加。TCDCA处理HepG2细胞显著增加细胞增殖、减少表达CEBPα，表明单独BAs可能有促肿瘤作用。CEBPα是肿瘤抑制蛋白，在HCC中被中和或减少。研究表明，CEBP表达升高抑制CEBP基因敲入小鼠的肝脏癌变，在该小鼠中CEBP从甲胎蛋白表达。据报道BAs通过功能FXR位点激活编码SHP的基因，在其启动子中，SHP可结合CEBPα。此外，主要肝脏BA传感器，FXR还抑制gankyrin的表达，gankyrin是介导HCC发展中肿瘤抑制蛋白(例如p53，HNF4α和CEBPα)下调的小蛋白酶体亚基。

消胆胺的口服给药显著降低了IL-6，TNF-α的水平以及胶原蛋白1型和Gpc3的表达，并且可以预防小鼠的肿瘤发生，这为降低升高的BA水平或抵消肠BAs的促炎和促致癌毒性(pro-inflammatory and pro-carcinogenic toxicity)的治疗尝试提供了新动力。

基于这些结果，我们断定BAs可以通过几种机制协同地起作用以促进肝脏癌变(图29)。第一种机制是:BAs缓慢诱导肝细胞的代谢转化。我们的研究结果显示次生BAs和TCDCA能够在高葡萄糖和高脂肪微环境中加速正常肝细胞的生长速率。这不足以证明其肿瘤促进作用。但是如果我们考虑到已广泛报道的次生BAs的细胞凋亡诱导效应，很明显长期暴露于过量的BAs会导致抗细胞凋亡的肝细胞的增加和选择性生长。暴露于高水平BAs的肝细胞的持续更新导致凋亡细胞的持续减少，抗细胞凋亡的肝细胞和/或具有未修复的DNA损伤的细胞增加。

第二种机制是BA诱导的胆汁淤积性肝损伤，这是由于长期暴露于过量肝BAs，导致氧化应激增加，导致肝细胞中DNA损伤、线粒体损伤和细胞膜破裂，最终导致通过增加ROS水平，激活Ras和NF-κB的机制的HCC。我们的结果共同地表明了HFD诱导的肝损伤是由于肠道中次生BAs的产生增加以及BSEP的下调导致到肝脏的循环和肝脏内滞留增加所致。

FXR在肝脏中的抗炎作用的损失是BA促进的肝脏肿瘤发生的另一种机制。肝FXR通过抑制促炎转录因子NF-κB的激活而发挥抗炎活性。然而，这种抑制也是双向的，由BAs介导的。在炎症条件下，促炎性细胞因子，TNF-α和IL-6，调节FXR-α2表达升高，伴随BSEP表达同时减少⁴⁸，胆小管收缩减弱，导致BA在肝细胞中积累。另一方面，肝BA浓度增加可以刺激从Kupffer细胞(肝固有巨噬细胞)分泌促炎性细胞因子，TNF-α和IL-1β，该分泌激活TNF受体信号和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)/JNK途径。肝脏中激活的NF-κB抑制肝FXR信号传导，这反过来下调SHP。已知Fxr^-/-Shp^-/-小鼠，当长期暴露于升高的BAs时，发生自发性肝肿瘤。⁵

另外，如我们的结果所显示的，BA诱导的肠内LPS生成的增加也可能是促进肥胖相关肝脏癌变的重要因素。LPS已被认为是肝损伤发病机制中的重要辅因子，并且已被显示促进肝纤维化。在慢性炎症和自身免疫性疾病的发病机制中，肠道BAs失调可能是增加细菌LPS吸收的起因⁵⁰，从而促进机体的全身性炎症反应。这些过程也是双向调节的，因为LPS水平的增加涉及BA排泄和胆汁流量的减少，导致细菌LPS的肠吸收进一步增加。我们的研究结果表明，消胆胺干预后，参与炎症和氧化应激的基因减弱，同时伴随肝脏中BA积累的减少，指示肝脏病理状态改善。

总而言之，BA促进肝脏癌变是一个复杂的过程，涉及多种机制，多种代谢器官(肝脏，胆汁，肠和肠道微生物组)以及不同BA种类之间的协同作用。现在很清楚HFD诱导的或与肥胖有关的肝脏癌变可以通过改变的肠道微生物菌群介导，这导致高浓度的肝BAs持续滞留。

该实施例表明胆汁酸调节物为鉴定为患有肝脏疾病状态的受试者提供了有用的治疗，并且预防或减缓肝癌和相关病症的进展。

实施例22其他的生物标志物组合的发现

使用单变量和多变量分析最初评估和选择了潜在的生物标志物。单变量分析包括正态分布变量的参数检验(例如，student’s检验和ANOVA)，以及不遵循正态分布的变量的非参数检验(例如Mann Whitney U检验和Kruskal Wallis检验)。使用了偏最小二乘法(PLS)，Pearson/Spearman相关性，聚类，多元线性/逻辑回归和随机森林进一步评估了代谢类型的生物标志物用于区分肝纤维化的不同期的能力。利用发现的潜在的生物标志物的列表，在本发明中，开发了基于随机森林(RF)的机器学习算法，以获得出人意料的生物标志物的联合。证明了包括牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)，甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)，甘氨胆酸(GCA)，甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)，牛磺胆酸

(TCA)，7-酮石胆酸(7-KLCA)，牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)，肉豆蔻油酸(C14:1n5)，棕榈油酸(C16:1n7)，反式油酸(C18:1n9t)，芥酸(C22:1n9)，二十二碳四烯酸(C22:4n-6)/花生四烯酸(C20:4n6)比值，亚油酸(C18:2n6)/γ-亚麻酸(C18:3n6)比值，棕榈酸(C16:0)，棕榈酸(C16:0)/棕榈油酸(C16:1n7)比值，酪氨酸，果糖，果糖/葡萄糖比值的生物标志物组合对肝纤维化具有最强的分层能力，例如区分纤维化期和/或肝硬化。

建立在包括甘氨胆酸(GCA)，牛磺胆酸(TCA)，棕榈油酸(C16:1n7)，棕榈酸(C16:0)，棕榈酸(C16:0)/棕榈油酸(C16:1n7)，酪氨酸和果糖的生物标志物组合上的随机森林(RF)模型对区分三个肝纤维化期病人达到了出人意料的性能，根据受试者工作特征(ROC)曲线，具有曲线下面积(AUC)等于0.96(图30)。

使用这个RF模型，可以利用提供给该模型的这些代谢物变量预测新样本的期的概率(图31)。

因此，本实施例中教导的生物标志物组合提供受试者的肝脏疾病的特效诊断和/或区分肝纤维化期的强大能力。此外，生物标志物的任一种都可以单独使用或与该组合的其他生物标志物的子集(或本文教导的其他组合)联合使用来诊断肝脏疾病和/或区分肝纤维期。

本文所提供的引用文献特此通过援引并入，用于引用的主题。

Claims (25)

1.一种用于肝脏疾病状态诊断的生物标志物组，其特征在于，所述生物标志物组包括：棕榈酸，棕榈油酸，酪氨酸，果糖，葡萄糖，甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨胆酸，以及包括以下之一种或多种：丝氨酸，脱氧胆酸，7-酮石胆酸，花生四烯酸，瓜氨酸，甲硫氨酸，鸟氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，苏氨酸，鹅脱氧胆酸，牛磺鹅脱氧胆酸，牛磺胆酸，12-甲基十三烷酸，13-甲基肉豆蔻酸，反式亚油酸，反式油酸，β-丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甘氨熊脱氧胆酸，7-酮脱氧胆酸，牛磺熊脱氧胆酸，肉豆蔻油酸，芥酸，二十二碳四烯酸，亚油酸，γ-亚麻酸；

所述生物标志物组用于构成用于肝脏疾病状态诊断的生物标志物组合，其中所述用于肝脏疾病状态诊断的生物标志物组合包括：棕榈酸，棕榈酸/棕榈油酸比值，酪氨酸，果糖，果糖/葡萄糖比值，甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨胆酸，以及包括以下生物标志物之一种或多种：丝氨酸，脱氧胆酸，7-酮石胆酸，花生四烯酸，瓜氨酸，甲硫氨酸，鸟氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，苏氨酸，鹅脱氧胆酸，棕榈油酸，牛磺鹅脱氧胆酸，牛磺胆酸，12-甲基十三烷酸，13-甲基肉豆蔻酸，反式亚油酸，反式油酸，β-丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，甘氨熊脱氧胆酸，7-酮脱氧胆酸，牛磺熊脱氧胆酸，肉豆蔻油酸，芥酸，二十二碳四烯酸/花生四烯酸比值，亚油酸/γ-亚麻酸比值。

2.根据权利要求1所述的用于肝脏疾病状态诊断的生物标志物组，其中所述肝脏疾病状态是肝脏疾病的存在或肝脏疾病阶段或肝脏疾病严重程度。

3.根据权利要求1所述的用于肝脏疾病状态诊断的生物标志物组，其中所述肝脏疾病状态指肝炎。

4.根据权利要求1所述的用于肝脏疾病状态诊断的生物标志物组，其中所述肝脏疾病状态指脂肪性肝炎。

5.根据权利要求1所述的用于肝脏疾病状态诊断的生物标志物组，其中所述肝脏疾病状态指非酒精性脂肪性肝炎。

6.根据权利要求1所述的用于肝脏疾病状态诊断的生物标志物组，其中所述肝脏疾病状态指肝纤维化。

7.权利要求1至6中任一项所述的用于肝脏疾病状态诊断的生物标志物组在制备用于肝脏疾病状态诊断的试剂盒中的用途，所述试剂盒用于肝脏疾病状态诊断时，包括测量所述生物标志物组中的全部生物标志物，其中，所述测量所述生物标志物组中的全部生物标志物包括为进行质谱测量而准备样本的步骤。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述质谱测量包括飞行时间质谱测量，离子阱质谱测量，四极杆质谱测量，扇形磁场质谱测量，离子回旋共振质谱测量和静电扇形分析器质谱测量中的一个或多个。

9.根据权利要求7所述的用途，其中所述测量所述生物标志物组中的全部生物标志物包括从所述样本中提取生物标志物。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述提取包括过滤所述样本以提供滤液，并测量所述滤液中的生物标志物的步骤。

11.根据权利要求10所述的用途，包括在过滤前的蛋白质沉淀步骤。

12.根据权利要求7所述的用途，其中所述测量所述生物标志物组中的全部生物标志物包括将生物标志物与一种或多种其他生物标志物分离的步骤。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述分离的步骤包括气相色谱法或液相色谱法。

14.根据权利要求13所述的用途，其中测量步骤包括超高效液相色谱-三重四极杆质谱。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述超高效液相色谱-三重四极杆质谱以负离子模式执行。

16.根据权利要求13所述的用途，其中测量步骤选自酶分析，化学分析，比色分析或荧光分析。

17.一种用于权利要求1至6任一项所述的用于肝脏疾病状态诊断的生物标志物组的测量的试剂盒，其中，该试剂盒包含多种内标物，所述多种内标物对应于所述生物标志物组中的全部生物标志物；其中所述多种内标物：i.不是血液、血浆或血清中天然存在的物质；ii.被同位素标记。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述多种内标物包含类固醇酸，脂肪酸，氨基酸或其组合，其中所述类固醇酸为胆汁酸。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述类固醇酸，所述脂肪酸，所述氨基酸或其组合为所述生物标志物组中的相应生物标志物的稳定同位素标记的变体，并且所述试剂盒包含所述生物标志物组中的每种生物标志物的稳定同位素标记的变体。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的试剂盒，还包括过滤装置，其中所述多种内标物包含在所述过滤装置中。

21.根据权利要求17至19中任一项所述的试剂盒，还包括容器，其中在容器中提供所述多种内标物。

22.根据权利要求17至19中任一项所述的试剂盒，其中所述多种内标物作为混合物提供。

23.如权利要求17至19中任一项所述的试剂盒，其中所述多种内标物是冷冻干燥的。

24.如权利要求17至19中任一项所述的试剂盒，其中所述多种内标物用于气相色谱-质谱测量或液相色谱-质谱测量。

25.根据权利要求17至19中任一项所述的试剂盒，包括多个容器，其中每个容器包括所述多种内标物中的一部分。

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