JP7294709B2 - 難治性夜間頻尿・夜間多尿症バイオマーカーの測定方法及び難治性夜間頻尿・夜間多尿症の予防剤又は改善剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
下記式(1)で表される化合物は、パルミトイルエタノールアミド(PEA)である。
下記式(2)で表される化合物は、9-ヒドロキシオクタデカジエン酸(9-HODE)である。
下記式(3)で表される化合物は、13-ヒドロキシオクタデカジエン酸(13-HODE)である。
下記式(4)で表される化合物は、4-ヒドロキシドコサヘキサエン酸(4-HDoHE)である。
下記式(5)で表される化合物は、20-ヒドロキシドコサヘキサエン酸(20-HDoHE)である。
下記式(6)で表される化合物は、ラウリン酸(Lauric acid)である。
(a)被験体から血漿サンプルを採取する工程
(b)採取した血漿サンプルから前記式(1)~(6)で表される化合物の量を測定する工程
(c)測定した前記式(1)~(6)で表される化合物の量に基づいて、難治性夜間頻尿・夜間多尿であるかどうかを判定する工程
CE-TOFMS system (Agilent Technologies 社)を用い、キャピラリーとしては、例えばFused silica capillary
i.d. 50 μm × 80 cm (ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社)を用いることができる。
Run buffer:Anion
Buffer Solution (ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社p/n : I3302-1023)
Rinse buffer:Anion
Buffer Solution (ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社p/n : I3302-1023)
Sample injection:Pressure
injection 50 mbar,
25 sec
CE voltage:Positive,
30 kV
MS ionization:ESI
Negative
MS capillary voltage:3,500 V
MS scan range:m/z
50-1,000
Sheath liquid:HMT
Sheath Liquid (ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社p/n : H3301-1020)
とすることができる。
分離して上清を回収する。この上清溶液にpH 3.0以下の塩酸5 mLを加え、メタノール4.5mLおよび純水4.5mLでコンディショニング済みの固相抽出用カートリッジにアプライする。カートリッジに純水4.5mLおよびヘキサン3mLで洗浄を行い、メタノール500μLで溶出する。溶出液を窒素乾固した後、50%アセトニトリル50μLで再溶解する。
LC-MS system (Agilent Technologies 社)を用い、カラムとしては、例えばColumn 2.6μm C8 100A 150×2.1mm (Kinetex社)を用いることができる。
Mobile phase A:アセトニトリル (0.1% ギ酸)
Mobile phase B:純水
(0.1% ギ酸)
Sample injection:5μL
Flow rate:0.4mL/min
Column temp:40℃
MS ionization:AJS
ESI Negative, Positive
Scan type:MRM
とすることができる。
(d)被験物質投与前の被験体から投与前血漿サンプルを採取する工程
(e)投与前血漿サンプルから式(1)~(6)で表される化合物の量を測定する工程
(f)被験体に被験物質を投与する工程
(g)被験物質を投与後の被験体から投与後血漿サンプルを採取する工程
(h)投与後血漿サンプルから式(1)~(6)で表される化合物の量を測定する工程
(i)投与前血漿サンプルからと投与後血漿サンプルからの式(1)~(6)で表される化合物の量の測定結果に基づいて夜間頻尿又は夜間多尿症の予防剤又は改善剤として有用な被験物質を選択する工程
(j)治療前の被験体から投与前血漿サンプルを採取する工程
(k)治療前血漿サンプルから式(1)~(6)で表される化合物の量を測定する工程
(l)被験体に治療を施す工程
(m)治療後の被験体から投与後血漿サンプルを採取する工程
(n)治療後血漿サンプルから式(1)~(6)で表される化合物の量を測定する工程
(o)治療前血漿サンプルからと治療後血漿サンプルからの式(1)~(6)で表される化合物の量の測定結果に基づいて夜間頻尿又は夜間多尿症の治療効果を判定する工程
ものではない。
65歳以上80歳未満の男性の中で、山梨大学医学部付属病院泌尿器科通院中の方を対象にして平均夜間排尿回数が1.5回未満の方を健常人群、1.5回以上の方を夜間頻尿患者群として組み入れた。(組み入れ基準の詳細は、後程表1として示す。)特に、夜間頻尿群に組み入れられた患者は、薬物療法等各種様々な夜間頻尿・夜間多尿に対する治療を行ったが、奏功していない難治性夜間頻尿・夜間多尿を呈する方々である。被験者から、当日朝から絶食していただき、午前中に採血を採取した。採取した血液はEDTA入り試験管に採取し、0℃・3000rpm・10分で遠心した後に血漿成分のみ-80℃凍結保存した。
サンプル採取日までに、3日間連続で被験者は排尿日誌に、排尿時間と排尿量を記録した。さらに、IPSSを実施した。IPSSは世界共通で使われている排尿障害に関する問診票であり、被験者が記載した。(男性下部尿路症状・前立腺肥大症診療ガイドライン 2017年)
・尿路上皮悪性腫瘍と診断された者
・下部尿路痛症候群を有する者
・24時間尿量が40mL/kg以上の多尿患者
・心疾患・肝疾患・腎障害など重篤な合併症を有する患者
・その他、医師の判断により対象として不適当と判断された患者
3-1 水溶性代謝物質の測定
3-1-1 血液からの代謝物質の抽出
血漿サンプル50μLに内部標準入りのメタノールを450μL加え攪拌後、さらにクロロホルム500μL、純水200μLを加えよく攪拌した。攪拌後、4℃、2,300 × gで5分間遠心分離し、分離した水相400μLを分画分子量5 kDaの限外ろ過フィルターを用いて除タンパクした。ろ液を遠心乾固した後、純水25μLで再溶解し、分析に供した。
CE-TOFMSを用いて、夜間頻尿患者および健常人の血漿サンプル中の代謝物質を網羅的に測定した。
Agilent CE-TOFMS system (Agilent
Technologies 社)
Capillary:Fused
silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm (ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社)
測定条件
Run buffer:Anion
Buffer Solution (ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社p/n : I3302-1023)
Rinse buffer:Anion
Buffer Solution (ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社p/n : I3302-1023)
Sample injection:Pressure
injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage:Positive,
30 kV
MS ionization:ESI
Negative
MS capillary voltage:3,500 V
MS scan range:m/z
50-1,000
Sheath liquid:HMT
Sheath Liquid (ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社p/n : H3301-1020)
3-2-1 血液からの代謝物質の抽出
血漿サンプル200μLに内部標準入りのメタノールを800μL加え攪拌後、4℃で1時間のメタノール抽出を行った。メタノール抽出後、4℃、3,000 rpmで10分間遠心分離して上清を回収した。この上清溶液にpH 3.0以下の塩酸5 mLを加え、メタノール4.5mLおよび純水4.5mLでコンディショニング済みの固相抽出用カートリッジにアプライした。カートリッジに純水4.5mLおよびヘキサン3mLで洗浄を行い、メタノール500μLで溶出した。溶出液を窒素乾固した後、50%アセトニトリル50μLで再溶解し、分析に供した。
LC-MSを用いて、夜間頻尿患者および健常人の血漿サンプル中の代謝物質を網羅的に測定した。
3-2-3 脂溶性代謝物質測定条件・装置に関しては以下の通り
Agilent LC-MS system (Agilent Technologies
社)
Column 2.6μm C8 100A 150×2.1mm (Kinetex社)
測定条件
Mobile phase A:アセトニトリル (0.1% ギ酸)
Mobile phase B:純水
(0.1% ギ酸)
Sample injection:5μL
Flow rate:0.4mL/min
Column temp:40℃
MS ionization:AJS
ESI Negative, Positive
Scan type:MRM
更に検討を進め、夜間頻尿/夜間多尿患者と健常人の鑑別能を上げるため、多変量解析手法の一つである多重ロジスティック回帰分析を行い、6種の疾患関連因子候補の中から2種を組み合わせたモデルを作成した。解析にはJMP ver 12.0.0 (SAS Institute社) を使用した。
receiver operating characteristic curves, AUC)は、
PEA:AUC=0.78942
Lauric acid:AUC=0.73228
MLR(PEA+Lauric acid):AUC=0.84550
であり、2個のマーカー候補を組み合わせた結果、鑑別能が向上し、夜間頻尿/夜間多尿患者と健常人を高精度に分類することが可能であった。
Claims (4)
- 前記化合物の量を測定する工程は、液体クロマトグラフィー-質量分析計(LC-MS)を用いて行うことを特徴とする請求項1記載の夜間頻尿又は夜間多尿症のバイオマーカーの測定方法。
- 前記夜間頻尿又は夜間多尿症が、難治性の夜間頻尿又は夜間多尿症であることを特徴とする請求項1および2記載の夜間頻尿又は夜間多尿症のバイオマーカーの測定方法。
- 被験物質を投与前の被検体から採取された血液サンプルから血漿成分が抽出された投与前血漿サンプルを用意する工程と、
前記投与前血漿サンプル中の、下記式(1)~(6)で表される化合物からなる群より選択される少なくとも1種の化合物の量を測定する工程と、
前記被験物質を投与後の前記被検体から採取された血液サンプルから血漿成分が抽出された投与後血漿サンプルを用意する工程と、
前記投与後血漿サンプル中の、下記式(1)~(6)で表される化合物からなる群より選択される前記少なくとも1種の化合物の量を測定する工程と、
前記投与前血漿サンプルからと前記投与後血漿サンプルからの前記化合物の量の測定結果に基づいて夜間頻尿又は夜間多尿症の予防剤又は改善剤として有用な被験物質を選択する工程と、
を備えたことを特徴とする夜間頻尿又は夜間多尿症の予防剤又は改善剤のスクリーニング方法。
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---|---|---|---|
JP2022012337A JP7294709B2 (ja) | 2017-09-29 | 2022-01-28 | 難治性夜間頻尿・夜間多尿症バイオマーカーの測定方法及び難治性夜間頻尿・夜間多尿症の予防剤又は改善剤のスクリーニング方法 |
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2017190024A JP7031104B2 (ja) | 2017-09-29 | 2017-09-29 | 難治性夜間頻尿・夜間多尿症バイオマーカー、これを用いた検査方法及び難治性夜間頻尿・夜間多尿症の予防剤又は改善剤のスクリーニング方法 |
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US20090012173A1 (en) | 2002-09-13 | 2009-01-08 | Sankyo Company, Limited | Method for treatment of nocturia |
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吉良聡,Liquid chromatography-mass spectrometry identification of serum biomarkers for nocturia in aged men,排尿障害プラクティス,2021年06月30日,Vol.29 No.1,Page.79-81 |
吉良聡,夜間頻尿における新規標的分子の網羅的探索:尿を用いたメタボロミクス解析の検討,日本排尿機能学会誌,2018年,Vol.29 No.1,Page.198 |
武田 正之,複雑系ネットワークと動的恒常性破綻による下部尿路機能障害発症機序の研究,https://kaken.nii.ac.jp/ja/file/KAKENHI-PROJECT-15H04972/15H04972seika.pdf |
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