CN116068161A - 一种诊断肝病的生物标志物及其应用 - Google Patents

一种诊断肝病的生物标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诊断肝病的生物标志物及其应用，本发明涉及医药生物领域。所述的诊断肝病的生物标志物包括23‑NorCA，7,12‑diketoLCA，7‑DHCA，3‑DHCA、CA中的一种或多种。本发明还公开了用于诊断肝病的试剂盒，所述的试剂盒中包括检测上述的生物标志物含量的试剂。本发明提供的生物标志物，为诊断胆汁淤积性肝病提供了更为快捷简便的方法，且尿液样本具有无创性，获取样本也更为便利。用胆汁酸来诊断胆汁淤积性肝病相较于其他指标（ALT、AST、ALP、GGT）在特异性和准确性方面都有较大优势。此外，本发明提供的检测肝病的试剂盒，检测下限为1ng/mL，灵敏度较高。

Description

一种诊断肝病的生物标志物及其应用
技术领域
本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种诊断肝病的生物标志物及其应用。
背景技术
胆汁淤积是指肝内外各种原因造成的胆汁形成、分泌和排泄障碍，胆汁流不能正常流入十二指肠而进入血液的病理状态，临床可表现为瘙痒、乏力、尿色加深和黄疸等症状，以胆汁淤积为主要表现的肝胆疾病统称为胆汁淤积性肝病。此外，许多肝脏疾病都能诱发胆汁淤积，包括药物、酒精、病毒、细菌和化学毒物等感染，原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、IgG4相关自身免疫性胆管炎等自身免疫性肝病，进行性家族性肝内胆汁淤积症等遗传代谢性肝病，以及非酒精性脂肪性肝病，妊娠性胆汁淤积症等肝脏疾病。因此胆汁淤积性肝病在临床的发生概率是相对较高的。
在临床胆汁淤积诊断最常用的生物标志物为ALP、GGT和胆汁酸。当胆汁排泄不畅，毛细胆管内压升高，即可促进ALP的生成增多。ALP升高除见于胆汁淤积外，多种肿瘤、多发性硬化症和妊娠等状态也会引起ALP升高。而GGT与ALP相比对胆汁淤积的敏感度较高，任何原因导致的肝内外梗阻均可使GGT水平明显升高，但是特异性较差，胃肠道疾病、糖尿病、心肌梗死、肥胖症等多种疾病均可引起GGT升高。目前虽然国内外均纳入ALP和GGT作为诊断胆汁淤积的标准，但是在参考范围和临界值设定上均存在争议。ALP或GGT的单纯性升高并不等同于胆汁淤积。
中国专利CN202210522305.3中公开了Nrf2蛋白作为妊娠期肝内胆汁淤积症生物标志物，该发明利用基因敲除技术将小鼠肝脏中的Nrf2基因敲除，发现Nrf2基因的敲除明显增加了血清中总胆汁酸的含量，有效降低了肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的含量，并且使用Nrf2过表达质粒过表达HepaRG细胞中的Nrf2基因，促使胆汁酸代谢基因表达增加，并改善了炎症反应，可用作ICP的药物靶点。可将Nrf2作为标志物用于妊娠期肝内胆汁淤积症诊断、预后评估或筛药。但Nrf2作为肝内胆汁淤积症诊断的特异性较差。
文献（血清MMP-2和MMP-9水平检测作为诊断妊娠期肝内胆汁淤积症新的生物标志物的价值研究，刘秋霞，张慧雅，现代检验医学杂质，2019,34（03），82-90.）中通过检测妊娠期内胆汁淤积症患者空腹血清总胆汁酸，基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）水平，结果显示妊娠期内胆汁淤积症患者血清MMP-2和血清MMP-9水平均显著高于健康妊娠妇女组，其差异具有统计学意义，说明血清MMP-2和MMP-9可作为妊娠期内胆汁淤积症的诊断指标。但该研究中总胆汁酸的含量并不具有显著性差异。
胆汁淤积性肝病的发生发展与胆汁酸产生异常或胆汁酸转运障碍而导致肝内胆汁过度蓄积有关，研究表明当发生胆汁淤积时，血液和尿液中胆汁酸的浓度急剧增高，其中以尿液中胆汁酸的升高幅度最大。
虽然胆汁酸的敏感度高，但其检测方法缺乏标准化，因此目前国内外相关指南中并未将其列入判断标准。所以建立标准化的胆汁酸肠肝循环检测方法学，获得尿液中的敏感度和特异性较高的胆汁酸作为生物标志物，对胆汁淤积性肝病的早期诊断和安全性检测均有极为重要的意义。现有技术尚未公开尿液中胆汁酸单独或组合作为胆汁淤积性肝病的生物标志物相关的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性高、准确性高且灵敏度高的诊断肝病的生物标志物，解决临床上用于诊断肝病的生物标志物的特异性相对较差的问题。
术语及其简称：
天门冬氨酸氨基转移酶（AST）；
谷氨酸氨基转移酶（ALT）；
碱性磷酸酶（ALP）；
谷氨酰转肽酶（GGT）；
总胆汁酸（TBA）；
总胆红素（TBIL）；
直接胆红素（DBIL）；
脱氧胆酸-d4（DCA-d4）；
甘氨脱氧胆酸-d4（GDCA-d4）；
牛磺脱氧胆酸-d4（TDCA-d4）；
胆酸（CA）；
23-去甲氧胆酸（23-NorCA）；
7,12-二酮石胆酸（7,12-diketoLCA）；
7-脱氢胆酸（7-DHCA）；
3-脱氢胆酸（3-DHCA）。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种诊断肝病的生物标志物，所述的生物标志物为23-NorCA，7,12-diketoLCA，7-DHCA，3-DHCA、CA中的一种或多种。
优选地，所述的肝病为胆汁淤积性肝病。
进一步优选地，所述的肝病包括药物、酒精、病毒、细菌和化学毒物等引起的肝内感染、原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、重叠综合征、lgG4相关自身免疫性胆管炎、非酒精性脂肪性肝病、妊娠期肝内胆汁淤积症、家族性肝内胆汁淤积症、Alagille综合征、α1抗胰蛋白酶缺乏症、α-甲酰基-辅酶A消旋酶缺乏症、关节挛缩-肾功能不全-胆汁淤积综合征、常染色体隐性多囊肾病、胆汁酸螯合障碍、胆汁酸再吸收障碍、胆汁酸受体缺乏、胆汁酸合成障碍、胆道闭锁、脑腱性黄瘤症、胆固醇酯储积病、瓜氨酸血症、先天性胆汁酸合成障碍、囊性纤维化、D-双功能蛋白缺乏、慢性特发性黄疸、肝内胆汁淤积症、家族性高胆烷血症、暂时性家族性新生儿高胆红素血症、克里格勒-纳贾尔综合征（Crigler-Najjar综合征）、肾小管性范可尼综合征3型胆囊疾病、遗传性果糖不耐症、鱼鳞病-白细胞空泡-脱发和硬化性胆管炎、Joubert综合征、脂质贮存障碍、一过性婴儿肝衰竭、Meckel综合征、线粒体DNA缺失综合征、新生儿硬化性胆管炎、肾消耗病、尼曼-匹克氏病（Niemann-Pick病）、北美印第安儿童肝硬化、过氧化小体病、肾囊肿-糖尿病综合征、肾-肝-胰发育不良I型谷固醇血症、史-伦-奥三氏综合征（Smith-LemLi-Opitz综合征）、醛糖转移酶缺乏I型酪氨酸血症。
又一方面，本发明提供了一种用于诊断肝病的检测试剂，所述的检测试剂包括检测上述的生物标志物含量的试剂。
优选地，所述的检测上述的生物标志物含量的方法为使用超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）进行检测；
进一步优选地，所述的UPLC的色谱条件如下：
色谱柱为C18色谱柱（1.7μm，100mm×2.1mm）；
流速0.45mL/min，柱温45℃，进样体积10μL；
流动相A为0.01%甲酸（FA）溶液，流动相B为乙腈（ACN）；
梯度洗脱条件为：0.0-0.5 min，5%B；0.5-1.0min，5-20%B；1.0-2.0 min，20-25%B；2.0-5.5min，25% B；5.5-6.0min，25-30%B；6.0-7.0 min，30%B；7.0-7.1min，30-32%B；7.1-8.0 min，32-34%B；8.0-9.5min，34-36%B；9.5-10.0min，36-38%B；10.0-11.0min，38-40%B；11.0-13.0min，40-45%B；3.0-17min，45-70%B；17.0-18.0min，70-100%B；18.0-18.1min，100-5%B；18.1-20.0 min，5%B。
进一步优选地，所述的质谱条件为：
电喷雾离子源（ESI），负离子模式（-），多离子反应监测（MRM）；
工作参数为：毛细管和锥孔电压分别为3.0-40kv，离子源和脱溶剂温度分别为150℃和550℃，脱溶气体和锥形气体流速分别为150 L/Hr和1000L/Hr，氮气和氩气分别用作锥形气体和碰撞气体，其余按照仪器的原始设置不进行改动。
又一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括检测上述的生物标志物含量的检测试剂。
优选地，所述的试剂盒包括生物标志物的标准品溶液和混合内标溶液。
进一步优选地，所述的生物标志物的标准品溶液用甲醇溶液进行配制。
进一步优选地，所述的内标包括DCA-d4、GDCA-d4和TDCA-d4。
再进一步优选地，所述的混合内标溶液中DCA-d4、GDCA-d4和TDCA-d4的浓度比为（1-10）：（5-15）：（15-25）。
优选地，所述的混合内标溶液中DCA-d4、GDCA-d4和TDCA-d4的浓度比为5:10:20。
进一步优选地，所述的混合内标溶液用水-乙腈-甲醇的混合溶液进行配制。
再进一步优选地，所述的水-乙腈-甲醇的混合溶液中各组分的体积比为50:25:25。
优选地，所述的肝病为胆汁淤积性肝病。
优选地，所述的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
（1）配制不同浓度的标准品溶液；
（2）配制内标标准品溶液；
（3）制备受试者血清或尿液样本；
（4）将制得的样本以UPLC-MS/MS进行测定，检测样本中生物标志物的含量。
优选地，所述试剂盒的检测样本为血清、血浆、组织间隙液、尿液中的一种或多种。
进一步优选地，所述试剂盒的检测样本为血清、尿液中的一种或多种。
最优选地，所述试剂盒的检测样本为尿液。
优选地，所述的检测样本的处理方法，包括以下步骤：
（1）样本加入乙腈-甲醇（AM），涡旋，低温超声处理，离心，取上清。
（2）取上清液，氮气吹干，加AM复溶，低温超声处理，离心。
（3）取上清液，氮气吹干，加混合内标溶液复溶，离心，取上清液进样分析。
进一步优选地，步骤（1）中所述的乙腈和甲醇的体积比为1:1。
进一步优选地，步骤（1）中所述的涡旋的时间为5-15s，超声处理的时间为10-20min；
再进一步优选地，步骤（1）中所述的涡旋的时间为10s，超声处理的时间为15min；
进一步优选地，步骤（1）-（3）中所述的离心的转速为15000-25000g，离心的温度为4℃，离心的时间为10-20min；
再进一步优选地，步骤（1）-（3）中所述的离心的转速为20000g，离心的时间为15min。
进一步优选地，步骤（2）中所述的超声处理的时间为10-20min；
再进一步优选地，步骤（2）中所述的超声处理的时间为15min；
又一方面，本发明提供所述的试剂盒具有下述至少一种用途：
（1）在肝病诊断或制备用于肝病诊断的产品中的应用；
（2）在肝病筛查或制备用于肝病筛查的产品中的应用；
（3）在评估肝病风险或制备用于评估肝病风险的产品中的应用；
（4）在肝病预后评估或制备用于肝病预后评估的产品中的应用。
优选地，所述产品为蛋白芯片、试剂盒或制剂。
本发明的有益效果为：
本发明提供了用于诊断胆汁淤积性肝病的新的尿液中生物标志物，为诊断胆汁淤积性肝病提供了更为快捷简便的方法。首先检测的是尿液中的胆汁酸，相比于血清胆汁酸，尿液胆汁酸的变化更为明显，灵敏度更高，且尿液样本具有无创性，获取样本也更为便利。其次用胆汁酸来监测胆汁淤积性肝病较之前的其他指标（ALT、AST、ALP、GGT）在特异性和准确性方面都有较大优势。此外，本发明提供了一种诊断肝病的试剂盒，检测下限为1ng/mL，灵敏度较高。
附图说明
图1为对照组大鼠肝组织的病理图。
图2为ANIT组大鼠肝组织的病理图。
图3为血清中胆汁酸多元分析结果图。
图4为尿液中胆汁酸多元分析结果图。
图5为血清的基于PLS-DA的LV1结果统计图，与对照组相比，* p＜0.05。
图6为尿液的基于PLS-DA的LV1结果统计图，与对照组相比，*** p＜0.001。
图7为血清的基于PLS-DA的VIP结果统计图。
图8为尿液的基于PLS-DA的VIP结果统计图。
图9为ANIT处理后血清中的总胆汁酸含量变化图。
图10为ANIT处理后尿液中的总胆汁酸含量变化图，与对照组相比，* p＜0.05。
图11为ANIT处理后对尿液中23-NorCA含量变化图，与对照组相比，*** p＜0.001。
图12为ANIT处理后对尿液中7,12-diketoLCA含量变化图，与对照组相比，** p＜0.01。
图13为ANIT处理后对尿液中7-DHCA含量变化图，与对照组相比，** p＜0.01。
图14为ANIT处理后对尿液中3-DHCA含量变化图，与对照组相比，** p＜0.01。
图15为ANIT处理后对尿液中CA含量变化图，与对照组相比，** p＜0.01。
图16为ANIT处理后对血清中CA含量变化图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
实施例1建立ANIT诱导的大鼠胆汁淤积性肝病模型
1. 实验受试药
α-萘异硫氰酸酯（ANIT）纯度≥95%，购自sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司，批号STBK0295。
2. 实验材料
大鼠品系：SD大鼠，雄性。
动物体重：选用6-8周龄，体重210-230g的动物，适应性饲养3天后开始给予受试药。
动物来源：北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为SYXK（北京）2016-0011。
动物要求：无特殊病原菌。
实验期间动物饲养条件及饲料和饮水的要求：中国中医科学院中药研究所屏障环境动物实验室。饲养条件：屏障条件，温度23±3℃，相对湿度为40-70%，全新风。采用人工光照，12小时明暗周期。动物被饲养于聚碳酸酯大鼠饲养笼，饮用水：饮用纯净水，每周更换两次高压灭菌的饮水瓶。饲养：使用标准的大鼠颗粒饲料，由北京市科奥协力饲料有限公司提供。
符合动物伦理要求：该动物研究获得了中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会的批准，批准编号：2021B114。
3. 实验仪器
动物天平：Sartorius，德国，型号：BSA224S-CW，BSA3202S-CW。
4. 实验方法
4.1 随机分组
大鼠按体重随机分为两组：对照组和实验组。实验组，即ANIT组，单次灌胃给予ANIT，对照组则给予溶剂对照。
4.2 实验方法
ANIT组大鼠给予ANIT 40mg/kg，单次给药，对照组给予溶剂对照，给药后48h取材。在取材前上代谢笼，收集16h的尿液，用于胆汁酸检测。取材时麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心，离心的转速为3000rpm，离心的时间为15min，获得血清用于生化检测和胆汁酸检测。摘取肝脏，将新鲜肝脏固定于4%甲醛溶液中，用于形态学检查。
4.3 生化检测
使用BX3010全自动生化分析仪（Sysmex，日本）检测大鼠血清中天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBIL）和直接胆红素（DBIL）的水平。
4.4 病理学检查
将固定好的肝脏组织进行修整，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规制备3μm厚度的石蜡切片，进行苏木素-伊红（HE）染色，在显微镜（光学显微镜，DP71型，OLYMPUS，放大倍数为200倍）下观察肝脏组织的损伤情况。
5. 实验结果
ANIT处理后各生化指标的变化情况如表1所示：
表1 ANIT处理后各生化指标的影响
注：与对照组相比，** p<0.01，*** p<0.001。
从上表中可以看出，ANIT组与对照组相比，血清中ALP、GGT、TBA、TBIL-1和DBIL-1水平均显著升高（p<0.01）。
ANIT组和对照组大鼠肝组织病理照片如图1-2所示。从图1中可以看出，对照组肝组织细胞状态未见明显异常，肝小叶结构清晰完整，门静脉区的肝窦、小叶间动脉静脉和小叶间胆管均正常，未见明显的炎性细胞浸润。从图2中可以看出，ANIT组肝小叶结构异常，可见较为严重的胆管增生，且门静脉区域可见较多的炎性细胞浸润，部分肝细胞表现出弥漫性空泡变性。提示已成功建立胆汁淤积性肝病模型。
实施例2
建立血清和尿液中5种胆汁酸检测方法体系，对胆汁淤积性肝病中血清和尿液中胆汁酸的含量进行检测，筛选生物标志物。
1. 实验试剂
甲醇（MeOH）、乙腈（ACN）、甲酸（FA）均为色谱级，购自ThermoFisher公司；屈臣氏双蒸水。
5种胆汁酸标准品和3种内标，分别为CA、TDCA-d4和活性炭购自Sigma公司；
23-NorCA、7,12-diketoLCA、3-DHCA购自zzstandard公司；
DCA-d4、7-DHCA、GDCA-d4购自isosciences公司。
胆汁酸缩写和质谱参数见表2。
表2胆汁酸和内标的质谱参数
2. 实验仪器
液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（LC-MS/MS），厂家：沃特世科技有限公司（Waters），型号ACQUITY UPLC I-CLASS/Triple QuadTM XEVO TQ-S。
3. 实验方法
3.1 标准品溶液的配制和校准
配制储备溶液：精密称取胆汁酸标准品和内标，加甲醇溶解，制备成1mg/mL的储备溶液，放置-20°C储存。
混合内标溶液配制：分别取25μL DCA-d4、50μL GDCA-d4、100μL TDCA-d4储备溶液放置到500mL容量瓶，加水-乙腈-甲醇（50:25:25，v/v/v）稀释到500mL，即得混合内标溶液（DCA-d4，50ng/mL；GDCA-d4，100ng/mL；TDCA-d4，200ng/mL），-20℃储存。
胆汁酸校准溶液配制：将各等份胆汁酸标准储备溶液混合，用水-乙腈-甲醇稀释至1000ng/mL，并连续稀释到500、300、200、100、50、10、5、2、1ng/mL，建立10个校正浓度的标准曲线。每个标准浓度中内标DCA-d4、GDCA-d4和TDCA-d4的浓度一致。
3.2 血清和尿液样本处理
取100μL血清（尿液）加入400μL乙腈-甲醇（AM，50:50，v/v），涡旋10s，低温超声处理15min，离心（20000g，4℃，15min）。取上清液400μL，氮气吹干，加80μL AM复溶，低温超声处理15min，离心（20000g，4℃，15min）。最后取上清液50μL，氮气吹干，加200μL混合内标溶液复溶，离心（20000g，4℃，15min），取上清液进样分析。
3.3 制备空白基质
取20mL血清（尿液）加入4g活性炭，涡旋30s，低温超声处理1h，离心（20000g，4℃，15min）。取10mL上清液，加入1g活性炭，涡旋30s，再次低温超声处理1h，离心（20000g，4℃，15min）。取上清液，即得血清（尿液）的空白基质，储存于-80℃备用。
3.4 UPLC-MS/MS分析
采用WatersACQUITYBEHC18色谱柱（1.7μm，100mm×2.1mm），流速0.45mL/min，柱温45℃，进样体积10μL。流动相A为0.01% 甲酸（FA）溶液，流动相B为乙腈（ACN），梯度洗脱条件为：0.0-0.5 min，5%B；0.5-1.0min，5-20%B；1.0-2.0 min，20-25%B；2.0-5.5min，25% B；5.5-6.0min，25-30%B；6.0-7.0 min，30%B；7.0-7.1min，30-32%B；7.1-8.0 min，32-34%B；8.0-9.5min，34-36%B；9.5-10.0min，36-38%B；10.0-11.0min，38-40%B；11.0-13.0min，40-45%B；3.0-17min，45-70%B；17.0-18.0min，70-100%B；18.0-18.1min，100-5%B；18.1-20.0min，5%B。
质谱条件为电喷雾离子源（ESI），负离子模式（-），多离子反应监测（MRM）。工作参数为：毛细管和锥孔电压分别为3.0-40kv，离子源和脱溶剂温度分别为150℃和550℃，脱溶气体和锥形气体流速分别为150 L/Hr和1000L/Hr，氮气和氩气分别用作锥形气体和碰撞气体，其余按照仪器的原始设置不进行改动。监测离子对以及其他最优参数见表2。
3.5 胆汁酸数据处理
应用软件SIMCA-P 12.0进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），根据PLS-DA模型所得的VIP值和t检验所得的P值（p<0.05）为标准，找出胆汁淤积性肝病的差异胆汁酸，即生物标志物。
4. 实验结果
4.1 标准曲线
不同基质中5种胆汁酸的标准曲线和相关系数如下表3所示：
表3不同基质中5种胆汁酸的标准曲线和相关系数
从上表3中可以看出，不同基质中5种胆汁酸的线性范围均为1-1000ng/mL，5条标准曲线（3批基质）的相关系数（r）均大于0.99。
4.2 血清和胆汁酸多元分析结果
为了检测监督模式分析方法是否存在过拟合现象，需对PLS-DA模型进行测试，通常选择200置换测试，实验结果如图3-8所示，图3-4为血清和尿液的胆汁酸PLS-DA散点图（血清：R2X (cum) = 0.726, R2Y (cum) = 0.682, Q2 (cum) = 0.125；尿液：R2X (cum) =0.988, R2Y (cum) = 0.803, Q2 (cum) = 0.655）；上述结果表明PLS-DA模型中没有过度拟合。
图5为血清样本的基于PLS-DA的LV1值；图6为尿液样本的基于PLS-DA的LV1值；图7为血清样本的PLS-DA的VIP值；图8为尿液样本的PLS-DA的VIP值。图5-8中结果表明尿液中对照组和ANIT组样本的分离良好，且分离程度高于血清的结果，血清中对照组和ANIT组样本部分分离。
4.3 血清和尿液中胆汁酸的含量
ANIT处理后对血清中总胆汁酸的含量变化如图9所示，图9表明，与对照组相比，ANIT组血清总胆汁酸含量表现出明显的上升趋势，升高了94.81%，但无统计学意义（p=0.127）。
ANIT处理后对尿液中总胆汁酸的含量变化如图10所示，图10中，ANIT组与对照组相比，尿液总胆汁酸含量显著升高，升高了30770.43%（p<0.01）。与血清样本相比，尿液样本的获得更为容易，且具有无创性，因此选择尿液胆汁酸用于监测胆汁淤积性肝病的可行性更高。
ANIT处理后尿液中5种胆汁酸含量变化如下表4和图11-15所示：
表4 ANIT处理后对尿液中5种胆汁酸含量的影响（mean±SD，单位ng/mL）
注：与对照组相比，** p<0.01，*** p<0.001。
从表4和图11-15中可以看出，与对照组相比，ANIT组23-NorCA，7,12-diketoLCA，7-DHCA，3-DHCA和CA的含量显著升高（p<0.01），分别升高了72380.00%、29300.00%、974900.00%、30769.09%和29856.84%。图16为ANIT处理后对血清中CA含量变化图。
根据单变量分析中具有统计学意义的变量（p<0.05）和VIP值用作鉴定差异表达的胆汁酸的标准，提示尿液中23-NorCA，7,12-diketoLCA，7-DHCA，3-DHCA和CA可单独或组合作为胆汁淤积的分子标志物，用于胆汁淤积性肝病的监测。
实施例3一种诊断肝病的试剂盒
本试剂盒中包括实施例2中的所有试剂，包括：生物标志物的标准品溶液和混合内标溶液。
配制储备溶液：精密称取胆汁酸标准品和内标，加甲醇溶解，制备成1mg/mL的储备溶液，放置-20℃储存。
混合内标溶液配制：分别取25μL DCA-d4、50μL GDCA-d4、100μL TDCA-d4储备溶液放置到500mL容量瓶，加水-乙腈-甲醇（50:25:25，v/v/v）稀释到500mL，即得混合内标溶液（DCA-d4，50ng/mL；GDCA-d4，100ng/mL；TDCA-d4，200ng/mL），-20℃储存。
胆汁酸校准溶液配制：将各等份胆汁酸标准储备溶液混合，用水-乙腈-甲醇稀释至1000ng/mL，并连续稀释到500、300、200、100、50、10、5、2、1ng/mL，建立10个校正浓度的标准曲线。每个标准浓度中内标DCA-d4、GDCA-d4和TDCA-d4的浓度一致。
以建立的UPLC-MS/MS胆汁酸靶向代谢组学为基础，考察所能检测到的胆汁酸的最低浓度，评估本试剂盒的灵敏度。尿液中5种胆汁酸的定量下限均为1ng/mL，即此试剂盒检测限可低至胆汁酸含量为1ng/mL。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种诊断肝病的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物包括23-NorCA，7,12-diketoLCA，7-DHCA，3-DHCA、CA中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述的肝病为胆汁淤积性肝病。
3.一种用于诊断肝病的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂包括检测权利要求1-2任一项所述的生物标志物含量的试剂。
4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述的检测权利要求1-2任一项所述的生物标志物含量的方法为使用超高相液相色谱-串联质谱法进行检测。
5.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述的超高效液相色谱的色谱条件如下：色谱柱为C18色谱柱，1.7μm，100mm×2.1mm；流速0.45mL/min，柱温45℃，进样体积10μL；流动相A为0.01% 甲酸溶液，流动相B为乙腈；
梯度洗脱条件为：0.0-0.5 min，5%B；0.5-1.0min，5-20%B；1.0-2.0 min，20-25%B；2.0-5.5min，25% B；5.5-6.0min，25-30%B；6.0-7.0 min，30%B；7.0-7.1min，30-32%B；7.1-8.0min，32-34%B；8.0-9.5min，34-36%B；9.5-10.0min，36-38%B；10.0-11.0min，38-40%B；11.0-13.0min，40-45%B；3.0-17min，45-70%B；17.0-18.0min，70-100%B；18.0-18.1min，100-5%B；18.1-20.0 min，5%B。
6.根据权利要求4所述的检测试剂，其特征在于，所述的质谱条件为：
电喷雾离子源，负离子模式，多离子反应监测；工作参数为：毛细管和锥孔电压分别为3.0-40kv，离子源和脱溶剂温度分别为150℃和550℃，脱溶气体和锥形气体流速分别为150L/Hr和1000L/Hr。
7.一种用于诊断肝病的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括权利要求3-6任一项所述的检测试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的肝病为胆汁淤积性肝病。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括生物标志物标准溶液和混合内标溶液；所述的生物标志物标准溶液的配制溶液为甲醇；所述的内标包括DCA-d4、GDCA-d4和TDCA-d4。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的混合内标溶液中DCA-d4、GDCA-d4和TDCA-d4的浓度比为（1-10）：（5-15）：（15-25）。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述的混合内标溶液中DCA-d4、GDCA-d4和TDCA-d4的浓度比为5:10:20。
12.根据权利要求7-11任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为血清、血浆、组织间隙液、尿液中的一种或多种。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为尿液。
14.权利要求1-2任一项所述的生物标志物或权利要求3-6所述的检测试剂或权利要求7-13任一项所述的试剂盒具有下述至少一种用途：
（1）在肝病诊断或制备用于肝病诊断的产品中的应用；
（2）在肝病筛查或制备用于肝病筛查的产品中的应用；
（3）在评估肝病风险或制备用于评估肝病风险的产品中的应用；
（4）在肝病预后评估或制备用于肝病预后评估的产品中的应用。
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