CN108703068A - 去除慈姑培养过程中内生菌的方法、培养方法以及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种去除慈姑培养过程中内生菌的方法、培养方法以及应用。该去除慈姑培养过程中内生菌的方法包括：采用硫酸链霉素和氨苄西林组合处理，并将半固体培养基和液体培养基结合进行培养，去除慈姑组织培养过程中的内生菌。该方法具有高效的杀菌、抑菌作用，消除了慈姑组织培养过程中的内生菌，同时避免高浓度抗生素对慈姑产生毒副作用；另外，该方法能够更好地消除内生菌对组培苗产生的生长缓慢、不增殖的影响，可使慈姑组培苗内生菌污染率降低至10％，继代增殖倍数3.5左右，生根率达到90％，能够保证慈姑组培苗正常生长；该方法用于增殖状态中被污染的组培苗处理中，能够彻底消除慈姑组织培养过程中继代增殖和生根时的内生菌，成功解决慈姑组培苗生产过程中内生菌难以去除的瓶颈问题。
Description
技术领域
本发明属于慈姑培养技术领域，具体涉及一种去除慈姑培养过程中内生菌的方法、慈姑的培养方法以及增殖慈姑组培苗的处理方法。
背景技术
慈姑产区种苗均是以传统的球茎留种，品种日益退化，表现为产量逐年降低，品质差，病虫害发生严重，尤其是黑粉病和叶斑病的发生，造成大面积减产。组培苗植株生长整齐健壮、管理方便，且易获优质高产，提高球茎商品性，同时可有效解决种源带病、品种退化等问题。
专利CN10454227B公开了一种慈姑组培苗快速繁殖方法及培养基，方法包括：(1)取慈姑外植体，经脱毒后在固体培养基中培养3周，再接种入间歇浸没式生物反应器中；(2)利用间歇浸没式培养方法；其中，步骤(1)中所述的慈姑外植体的脱毒方法为：将慈姑外植体浸没于含洗衣粉水中，冲洗30min，晾干后，用75％乙醇30s，0.1％升汞10min消毒，后用无菌水冲洗3～5次。该专利文献仅仅公开了一种如何快速繁殖慈姑组培苗的方法，该方法在固体培养前先进行脱毒，先固体培养后放入间歇浸没液体培养，前期的固体培养内生菌污染率较高，无法供给充足的培养材料，没有在培养过程中没有对产生的内生菌进行处理。
慈姑为水生植物，从植株生长到球茎发育都是在水中，易受到微生物的侵染，继代增殖2-3次仍然出现内生菌污染，污染率可达40％以上。因此，去除慈姑组织培养(组培)生产过程中内生菌，去除内生菌的污染，对实现慈姑组培苗工厂化生产和后期优质种苗的提供具有重要现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种去除慈姑培养过程中内生菌的方法、慈姑的培养方法以及增殖慈姑组培苗的处理方法，其彻底消除了内生菌在慈姑组织培养中的污染问题，慈姑的污染率低、增殖率高。
为实现上述目的，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了一种去除慈姑培养过程中内生菌的方法，该方法包括：采用硫酸链霉素和氨苄西林组合处理，并将半固体培养基和液体培养基结合进行培养，去除慈姑组织培养过程中的内生菌。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种去除慈姑培养过程中内生菌的方法，所述硫酸链霉素和氨苄西林组合处理时采用的是硫酸链霉素溶液和氨苄西林溶液；其中所述硫酸链霉素溶液的配制方法包括：称取50mg～400mg的粉状硫酸链霉素，溶于无水乙醇中，最后定容至1L，制得浓度为50mg/L～400mg/L的硫酸链霉素溶液；所述氨苄西林溶液的配制方法包括：称取50mg～400mg的粉状氨苄西林，溶于水中，最后定容至1L，制得浓度为50mg/L～400mg/L的氨苄西林溶液。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种去除慈姑培养过程中内生菌的方法，所述硫酸链霉素溶液的浓度为100mg/L～200mg/L；所述氨苄西林的浓度为100mg/L～150mg/L。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种去除慈姑培养过程中内生菌的方法，所述半固体培养基包括：MS+1～3mg/L的6-BA+0.01～0.05mg/L的NAA+3.5g/L的卡拉胶+20～30g/L的蔗糖，每瓶含有20～30ml培养基。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种去除慈姑培养过程中内生菌的方法，所述液体培养基包括：MS+1～3mg/L的6-BA+0.01～0.05mg/L的NAA+20～30g/L的蔗糖，每瓶含有30ml～40ml培养基。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种去除慈姑培养过程中内生菌的方法，所述培养的条件包括：光照强度为1500-2000lux(勒克斯)，温度24～30℃。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种去除慈姑培养过程中内生菌的方法，所述培养的顺序是先液体培养，然后半固体培养；优选的液体培养时间是1～2d。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明还提供了一种慈姑的培养方法，包括如下步骤：
(1)初代诱导培养：
将切取的慈姑外植体接种在液体培养基上，在温度为24～30℃、光照强度为1500～2000lux的条件下进行初代诱导培养；其中，液体培养基包含1/2～1的MS+1～3mg/L的6-BA+0.01～0.05mg/L的NAA+20～30g/L的蔗糖，培养基中添加50mg/L～400mg/L的硫酸链霉素和50mg/L～400mg/L的氨苄西林，培养基中每瓶含有30ml～40ml培养基；
(2)继代增殖培养：
将初代培养所得慈姑芽转接到半固体培养基进行继代增殖培养，其中，半固体培养基包含：MS+1～3mg/L的6-BA+0.01～0.05mg/L的NAA+3.5g/L的卡拉胶+20～30g/L的蔗糖，培养基中添加50mg/L～400mg/L的硫酸链霉素和50mg/L～400mg/L的氨苄西林，每瓶含有20～30ml培养基，培养条件是：温度为在24～28℃，光照强度为1500～3000lux；以及
(3)生根培养：
将继代苗接种在半固体培养基生根，生根培养的条件是：温度为24～28℃，环境为光强强度为1500～3000lux的光照培养室内，培养时间10d～15d，待到苗高为5cm～8cm、茎粗壮、根系发达时即可将慈姑苗转移到炼苗大棚培养。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种慈姑的培养方法，所述初代诱导培养步骤中的光照时间为16h；
和/或，所述继代增殖培养步骤中的光照时间为12h。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明提供了一种慈姑的培养方法，所述半固体培养基包含：MS+0.5mg/L～1.0mg/L的6-BA+0.5mg/L～1.0mg/L的NAA+3.5g/L的卡拉胶+30g/L的蔗糖，培养基中添加50mg/L～400mg/L的硫酸链霉素和50mg/L～400mg/L的氨苄西林，每瓶含有20～30ml培养基。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明还提供了一种增殖慈姑组培苗的处理方法，该方法包括：
(1)将增殖慈姑组培苗用无菌水冲洗，然后用体积百分比浓度为75％的酒精浸没进行消毒，取出后再用无菌水进行冲洗；
(2)将步骤(1)处理后的慈姑组培苗接种至包含硫酸链霉素和氨苄西林的液体培养基中；以及
(3)继续培养2～3天后液体培养的组培苗接入包含硫酸链霉素和氨苄西林的半固体培养基中培养，直到无内生菌污染的现象即可。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用硫酸链霉素和氨苄西林组合处理，可发挥硫酸链霉素和氨苄西林高效的杀菌、抑菌作用，消除了慈姑组织培养过程中的内生菌，同时避免了盲目使用抗生素，进而避免高浓度抗生素对慈姑产生毒副作用。
(2)本发明采用同时结合半固体培养基和液体培养基进行培养，能够更好地消除内生菌对组培苗产生的生长缓慢、不增殖的影响，可使慈姑组培苗内生菌污染率降低至18％，继代增殖倍数3.5左右，生根率达到90％，能够保证慈姑组培苗正常生长。
(3)相对现有技术，本发明采用先液体培养后转入半固体培养，控制内生菌的污染产生，同时提供在培养过程中已产生内生菌污染的组培苗进行再次处理，保证组培苗不受内生菌污染。
(4)本发明的方案用于增殖状态中被污染的组培苗处理中，能够彻底消除慈姑组织培养过程中继代增殖和生根时的内生菌，成功解决慈姑组培苗生产过程中内生菌难以去除的瓶颈问题，为慈姑组织培养的快速繁殖奠定了基础。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案作进一步进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
上述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：硫酸链霉素对慈姑组培苗的影响
本实施例中慈姑组培苗采用半固体培养基进行培养，其中半固体培养基的配方包括：MS+2.5mg/L的6-BA+0.01mg/L的NAA+3.5g/L的卡拉胶+30g/L的蔗糖，每瓶含有30ml培养基。
由如下表1可看出，当硫酸链霉素的浓度为50mg/L时，慈姑组培苗的污染率为42％、继代增殖倍数为1.0、生根率为85％；而当硫酸链霉素的浓度为200mg/L时，慈姑组培苗的污染率降低至23％、继代增殖倍数为2.1、生根率为72％；但是，当硫酸链霉素的浓度为400mg/L时，慈姑组培苗的污染率几乎与硫酸链霉素浓度为200mg/L时相同，为23％，继代增殖倍数降低，为2.1，生根率也降到最低，为70％。
因此，随着硫酸链霉素的浓度增加，慈姑组培苗内生菌污染率由42％降低至22％，但浓度达到400mg/L时，组培苗不再增殖，且生根率最低。
表1不同浓度的硫酸链霉素对慈姑组培苗的影响
| 硫酸链霉素浓度(mg/L) | 组培苗污染率％ | 继代增殖倍数 | 生根率％ |
| 50 | 42 | 1.0 | 85 |
| 100 | 37 | 2.3 | 85 |
| 150 | 32 | 2.1 | 85 |
| 200 | 23 | 2.1 | 72 |
| 400 | 22 | 1.0 | 70 |
实施例2：氨苄西林对慈姑组培苗的影响
本实施例中慈姑组培苗采用半固体培养基进行培养，其中半固体培养基的配方与实施例1中的配方和体积相同。
由如下表2可看出，当氨苄西林的浓度为50mg/L时，慈姑组培苗的污染率为62％、继代增殖倍数为1.0、生根率为73％；当氨苄西林的浓度为150mg/L时，慈姑组培苗的污染率为42％、继代增殖倍数为2.0、生根率为80％；而当氨苄西林的浓度为200mg/L时，慈姑组培苗的污染率降低至35％，继代增殖倍数不再增加，仍为2.0，生根率开始降低，为71％；当氨苄西林的浓度为400mg/L时，慈姑组培苗的污染率不再降低，仍为35％，继代增殖倍数为1.0，生根率也降到最低，为70％。
因此，随着氨苄西林的浓度增加，慈姑组培苗内生菌污染率由62％降低至35％，但氨苄西林的浓度达到200mg/L时，组培苗不再增殖，且生根率也很低，处理效果差于硫酸链霉素的处理。
表2不同浓度氨苄西林处理对慈姑组培苗的影响
| 氨苄西林浓度(mg/L) | 组培苗污染率％ | 继代增殖倍数 | 生根率％ |
| 50 | 62 | 1.0 | 73 |
| 100 | 45 | 2.1 | 82 |
| 150 | 42 | 2.0 | 80 |
| 200 | 35 | 2.0 | 71 |
| 400 | 35 | 1.0 | 70 |
实施例3：硫酸链霉素和氨苄西林在半固体培养中对慈姑组培苗的影响
本实施例中慈姑组培苗采用半固体培养基进行培养，其中半固体培养基的配方与实施例1中的配方和体积相同。
将硫酸链霉素和氨苄西林制成溶液，其中所述硫酸链霉素溶液的配制方法包括：称取50mg的粉状硫酸链霉素，溶于无水乙醇中，最后定容至1L，制得浓度为50mg/L的硫酸链霉素溶液；所述氨苄西林溶液的配制方法包括：称取50mg的粉状氨苄西林，溶于水中，最后定容至1L，制得浓度为50mg/L的氨苄西林溶液。
由如下表3可看出，当硫酸链霉素的浓度为50mg/L、氨苄西林的浓度为50mg/L时，慈姑组培苗的污染率为45％，继代增殖倍数为2.3，生根率为86％；当硫酸链霉素的浓度为150mg/L、氨苄西林的浓度为150mg/L时，慈姑组培苗的污染率降低至20％，继代增殖倍数增加至3.5，生根率为85％；当硫酸链霉素的浓度为200mg/L、氨苄西林的浓度为200mg/L时，慈姑组培苗的污染率降低至18％，继代增殖倍数开始降低，为3.0，生根率降低至80％；当硫酸链霉素的浓度为400mg/L、氨苄西林的浓度为400mg/L时，慈姑组培苗的污染率不再降低，仍为18％，继代增殖倍数降低到最低，为1.0，生根率页降低至最低，为70％。
总之，将硫酸链霉素和氨苄西林组合处理慈姑组培苗，慈姑组培苗内生菌污染率由45％降低至18％，组培苗继代增殖倍数和生根率等效果均优于实施例1中单独用硫酸链霉素或实施例2中单独用氨苄西林处理慈姑组培苗的情况。
表3不同浓度的硫酸链霉素和氨苄西林处理对慈姑组培苗的影响(半固体培养)
实施例4：硫酸链霉素和氨苄西林在液体培养中对慈姑组培苗的影响
本实施例中慈姑组培苗采用液体培养基进行培养，其中液体培养基的配方包括：MS+2.5mg/L的6-BA+0.01mg/L的NAA+30g/L的蔗糖，每瓶含有40ml培养基。
采用实施例3制备的含有硫酸链霉素溶液和氨苄西林溶液。
由如下表4可看出，当硫酸链霉素的浓度为50mg/L、氨苄西林的浓度为50mg/L时，慈姑组培苗的污染率为43％，继代增殖倍数为3.1，生根率为90％，组培苗玻璃化为8％；当硫酸链霉素的浓度为150mg/L、氨苄西林的浓度为150mg/L时，慈姑组培苗的污染率降低至22％，继代增殖倍数增加至3.8，生根率为86％，组培苗玻璃化15％；当硫酸链霉素的浓度为200mg/L、氨苄西林的浓度为200mg/L时，慈姑组培苗的污染率降低至19％，继代增殖倍数开始降低，为3.5，生根率降低至85％，组培苗玻璃化20％；当硫酸链霉素的浓度为400mg/L、氨苄西林的浓度为400mg/L时，慈姑组培苗的污染率为20％，继代增殖倍数为3.2，生根率页降低至最低，为83％，组培苗玻璃化28％。
总之，由表3和表4可知，将硫酸链霉素和氨苄西林组合处理慈姑组培苗，咱相同硫酸链霉素和氨苄西林浓度条件下，液体培养方式较半固体培养方式慈姑的内生菌污染率和生根率差异不显著，但是增殖倍数方面液体培养方式优于半固体培养方式，不足的是，同时玻璃化苗现象。
表4不同浓度的硫酸链霉素和氨苄西林处理对慈姑组培苗的影响(液体培养)
实施例5：采用硫酸链霉素和氨苄西林结合半固体培养和液体培养的去除慈姑培养过程中内生菌的方法
具体步骤包括：
将慈姑组培苗先接入实施例4中制备的液体培养基；培养1-2d后转入实施例1制备的半固体培养基中，培养基中同时添加硫酸链霉素溶液和氨苄西林溶液；其中，硫酸链霉素溶液的浓度为150mg/L，氨苄西林溶液的浓度为100mg/L。慈姑组培苗的污染率为10％以内，继代增殖倍数为3.5以上，生根率为90％以上。
实施例6：慈姑的培养方法
具体步骤包括：
(1)初代诱导培养：
将切取的慈姑外植体接种在液体培养基上，在温度为28℃、光照强度为2000lux的条件下进行初代诱导培养；其中，液体培养基包含1/2的MS+2.5mg/L的6-BA+0.04mg/L的NAA+25g/L的蔗糖，培养基中还含有150mg/L的硫酸链霉素和100mg/L的氨苄西林，培养基中每瓶含有35ml培养基；培养条件是：温度为在26℃，光照强度为2000lux；
(2)继代增殖培养：
将初代培养所得慈姑芽转接到半固体培养基进行继代增殖培养，其中，半固体培养基包含：MS+2mg/L的6-BA+0.35mg/L的NAA+3.5g/L的卡拉胶+25g/L的蔗糖，培养基中添加150mg/L的硫酸链霉素和100mg/L的氨苄西林，每瓶含有25ml培养基，培养条件是：温度为在26℃，光照强度为2000lux；以及
(3)生根培养：
将继代苗接种在半固体培养基生根，生根培养的条件是：温度为26℃，环境为光强强度为2000lux的光照培养室内，培养时间10d～15d，待到苗高为5cm～8cm、茎粗壮、根系发达时即可将慈姑苗转移到炼苗大棚培养；其中，所述半固体培养基包含：MS+1.0mg/L的6-BA+1.0mg/L的NAA+3.5g/L的卡拉胶+30g/L的蔗糖，培养基中添加150mg/L的硫酸链霉素和100mg/L的氨苄西林，每瓶含有25ml培养基。
实施例7：增殖中内生菌污染的慈姑组培苗的处理方法
具体步骤包括：
(1)从慈姑增殖状态的组培苗中，挑选出培养基内存在内生菌感染的组培苗；在超净工作台上，将存在内生菌的慈姑组培苗取出，用无菌水冲洗2～3遍，然后用75％酒精浸没，进行消毒10s，取出，再用无菌水进行冲洗3～5遍；
(2)将处理后的慈姑组培苗接种至包含150mg/L的硫酸链霉素和的100mg/L氨苄西林的液体培养基中；以及
(3)继续培养2～3天后，将液体培养的组培苗转接入包含150mg/L的硫酸链霉素和的100mg/L氨苄西林的半固体培养基中培养，直到无内生菌污染的现象即可。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种去除慈姑培养过程中内生菌的方法，其特征在于，所述方法包括：采用硫酸链霉素和氨苄西林组合处理，并将半固体培养基和液体培养基结合进行培养，去除慈姑组织培养过程中的内生菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸链霉素和氨苄西林组合处理时采用的是硫酸链霉素溶液和氨苄西林溶液；其中所述硫酸链霉素溶液的配制方法包括：称取50mg～400mg的粉状硫酸链霉素，溶于无水乙醇中，最后定容至1L，制得浓度为50mg/L～400mg/L的硫酸链霉素溶液；所述氨苄西林溶液的配制方法包括：称取50mg～400mg的粉状氨苄西林，溶于水中，最后定容至1L，制得浓度为50mg/L～400mg/L的氨苄西林溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述硫酸链霉素溶液的浓度为100mg/L～200mg/L；所述氨苄西林的浓度为100mg/L～150mg/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述半固体培养基包括：MS+1～3mg/L的6-BA+0.01～0.05mg/L的NAA+3.5g/L的卡拉胶+20～30g/L的蔗糖，每瓶含有20～30ml培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基包括：MS+1～3mg/L的6-BA+0.01～0.05mg/L的NAA+20～30g/L的蔗糖，每瓶含有30ml～40ml培养基。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的条件包括：光照强度为1500-2000lux，温度24～30℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的顺序是先液体培养，然后半固体培养；优选的液体培养时间是1～2d。
8.一种慈姑的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)初代诱导培养：
将切取的慈姑外植体接种在液体培养基上，在温度为24～30℃、光照强度为1500～2000lux的条件下进行初代诱导培养；其中，液体培养基包含1/2～1的MS+1～3mg/L的6-BA+0.01～0.05mg/L的NAA+20～30g/L的蔗糖，培养基中添加50mg/L～400mg/L的硫酸链霉素和50mg/L～400mg/L的氨苄西林，培养基中每瓶含有30ml～40ml培养基；
(2)继代增殖培养：
将初代培养所得慈姑芽转接到半固体培养基进行继代增殖培养，其中，半固体培养基包含：MS+1～3mg/L的6-BA+0.01～0.05mg/L的NAA+3.5g/L的卡拉胶+20～30g/L的蔗糖，培养基中添加50mg/L～400mg/L的硫酸链霉素和50mg/L～400mg/L的氨苄西林，每瓶含有20～30ml培养基，培养条件是：温度为在24～28℃，光照强度为1500～3000lux；以及
(3)生根培养：
将继代苗接种在半固体培养基生根，生根培养的条件是：温度为24～28℃，环境为光强强度为1500～3000lux的光照培养室内，培养时间10d～15d，待到苗高为5cm～8cm、茎粗壮、根系发达时即可将慈姑苗转移到炼苗大棚培养。
9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述初代诱导培养步骤中的光照时间为16h；
和/或，所述继代增殖培养步骤中的光照时间为12h。
10.一种增殖慈姑组培苗的处理方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将增殖慈姑组培苗用无菌水冲洗，然后用体积百分比浓度为75％的酒精浸没进行消毒，取出后再用无菌水进行冲洗；
(2)将步骤(1)处理后的慈姑组培苗接种至包含硫酸链霉素和氨苄西林的液体培养基中；以及
(3)继续培养2～3天后液体培养的组培苗接入包含硫酸链霉素和氨苄西林的半固体培养基中培养，直到无内生菌污染的现象即可。
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