CN105494093B - 睡布袋无菌苗及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种睡布袋无菌苗及其培养方法，该培养方法包括：1)将睡布袋种子置于无菌蒸馏水中浸泡；2)将浸泡后的睡布袋种子剥离种皮，接着依次浸泡于酒精溶液和过氧化氢溶液，然后通过无菌蒸馏水洗涤以得到无菌外植体；3)将无菌外植体接种于培养基；4)将培养基依次经过暗培养和于光暗交替的条件下进行培养。该方法具有优异的繁殖系数与繁殖效率且培养周期短，另外通过该方法培养而得的睡布袋无菌苗生长速度快。
Description
技术领域
本发明涉及睡布袋组织培养，具体地，涉及一种睡布袋无菌苗及其培养方法。
背景技术
睡布袋(Gerradanthus macrorrhizus)为葫芦科(Cucurbitaceae)睡布袋属(Gerradanthus)的著名多肉球茎观赏植物,原产于非洲东部。进入本世纪，以睡布袋等为代表的多肉植物，受到多肉爱好者的追捧。多年生的睡布袋植株以其硕大的球茎,优美的姿态,在多肉植物中备受关注。江苏省中国科学院植物研究所于2005年开始从非洲引进睡布袋种苗进行地栽引种驯化，成功收获种子，近年来通过不断试验，先后获得睡布袋切块繁殖方法和种子苗工厂化生产等方法。
睡布袋常见的繁殖方法有切块繁殖及播种等方法，目前根据已有报道，睡布袋的播种繁殖存在种子获得较难，获取数量有限，发芽时间较长(通常1个月以上)，生长环节受环境因子影响较大等问题，而其他繁殖方法存在繁殖系数不高，效率有限等不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种睡布袋无菌苗及其培养方法，该方法具有优异的繁殖系数与繁殖效率且培养周期短，另外通过该方法培养而得的睡布袋无菌苗生长速度快。
为了实现上述目的，本发明提供了一种睡布袋无菌苗的培养方法，包括：
1)将睡布袋种子置于无菌蒸馏水中浸泡；
2)将浸泡后的睡布袋种子剥离种皮，接着依次浸泡于酒精溶液和过氧化氢溶液，然后通过无菌蒸馏水洗涤以得到无菌外植体；
3)将无菌外植体接种于培养基；
4)将培养基依次经过暗培养和于光暗交替的条件下进行培养。
本发明还提供了一种睡布袋无菌苗，该睡布袋无菌苗通过上述方法培养而得。
通过上述技术方案，本发明通过组织培养的方式培育睡布袋无菌苗，具体过程为：首先将睡布袋种子置于无菌蒸馏水浸泡，接着剥离种皮且依次通过酒精溶液和过氧化氢溶液浸泡、无菌蒸馏水洗涤，然后接种，最后进行培养便可制得生长健壮的睡布袋无菌苗。该方法的培养周期短，且繁殖系数与繁殖效率均十分优异；并且制得的睡布袋无菌苗的品质高。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例1的步骤3)中睡布袋种子刚刚接种到培养基中的生长图；
图2是经过3天暗培养后移至光暗交替条件下培养3天后睡布袋种子开始萌发的生长图；
图3是光暗交替条件下培养3天后14天后的睡布袋种子无菌苗；
图4是长出真叶的睡布袋种子无菌苗。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种睡布袋无菌苗的培养方法，包括：
1)将睡布袋种子置于无菌蒸馏水中浸泡；
2)将浸泡后的睡布袋种子剥离种皮，接着依次浸泡于酒精溶液和过氧化氢溶液，然后通过无菌蒸馏水洗涤以得到无菌外植体；
3)将无菌外植体接种于培养基；
4)将培养基依次经过暗培养和于光暗交替的条件下进行培养。
在本发明的步骤1)中，浸泡的条件可以在宽的范围内选择，但是为了浸泡效果更加，优选地，在步骤1)中，浸泡至少满足以下条件：浸泡温度为22-24℃，浸泡时间为10-12h。
在本发明的步2)中，酒精溶液的浓度以及浸泡的条件可以在宽的范围内选择，但是为了能够充分地消毒，优选地，在步骤2)中，酒精溶液的浓度为70-80重量％，并且睡布袋种子于酒精溶液中浸泡至少满足以下条件：浸泡温度为22-24℃，浸泡时间为30-50s。
在本发明的步2)中，氧化氢溶液的浓度以及浸泡的条件可以在宽的范围内选择，但是为了能够充分地消毒，优选地，在步骤2)中，过氧化氢溶液的浓度为10-20重量％，并且睡布袋种子于过氧化氢溶液中浸泡至少满足以下条件：浸泡温度为22-24℃，浸泡时间为9-15min。
在本发明的步2)中，无菌蒸馏水的洗涤次数可以在宽的范围内选择，但是为了使得睡布袋种子表面的残留的酒精溶液和/或氧化氢溶液能够充分地洗涤干净，优选地，在步骤2)中，无菌蒸馏水的洗涤次数为4-5次。
在本发明的步2)中，培养基可以在宽的范围内选择，但是为了使得睡布袋种子能够吸收足够的营养物质进行发芽和生长，优选地，在步骤3)中，培养基的pH为6-7，并且培养基含有30-35g/L的蔗糖和6.5-7.0g/L的琼脂粉。更优选地，优选地，培养基选自1/4MS、1/2MS和MS培养基中的一种或多 种。其中，1/4MS、1/2MS和MS培养基含有的成分可以参见表1和表2，表2中的各组分的浓度在1/4MS、1/2MS和MS培养基中均相同。
表1
表2
在本发明的步骤3)中，无菌外植体可以直接插入培养基进行培养，也可以先设置培养槽然后再将种子植入其中，为了睡布袋种子能够吸收更足够的营养物质进行发芽和生长，优选地，无菌外植体接种于培养基表面的凹槽内，凹槽的长度为1.2-1.8cm，宽度为0.2-0.4cm。
在本发明的步骤4)中，暗培养的具体条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得睡布袋种子发芽率和生长率更加的优异，优选地，暗培养至少满足以下条件：培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60％，培养时间为3-5天。
在本发明的步骤4)中，光暗交替的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得睡布袋种子发芽率和生长率更加的优异，优选地，于光暗交替的条件下进行培养至少满足以下条件：光照强度为1800-2000lux，光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，相对湿度为50-60％，培养温度为22-24℃，培养时间为12-18天。
在本发明的步骤1)中，浸泡可以治愈本领域的任何一种器皿中进行，但是为了满足种子呼吸，便于流水冲洗种子，避免外界的杂质污染睡布袋种子，优选地，在步骤1)中，浸泡于单层纱布封口的玻璃容器中进行。
在本发明的步骤2)中，浸泡后的睡布袋种子的种皮的剥离方式可以在本领域中任何一种常规的剥离方式，为了能够将种皮快速高效地剥离并且防止在种皮剥离过程中对种胚造成损伤，优选地，在步骤2)中，浸泡后的睡布袋种子的种皮的剥离自种子带翅的一侧开始。
本发明还提供了一种睡布袋无菌苗，该睡布袋无菌苗通过上述方法培养而得。
在本发明中，睡布袋无菌苗的高度可以在宽的范围内选择，但是为了便于睡布袋无菌苗的移植，优选地，睡布袋无菌苗的高度为3-7cm。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
1)2015年9月中旬，选择饱满的睡布袋种子，于23℃下置于盛有无菌蒸馏水的广口瓶(用皮筋将单层纱布套在广口瓶瓶口)中浸种12h，然后将广口瓶直接置于流水中冲洗1h，最后用滤纸吸干种子表面的水分。
2)从种子带翅一侧用镊子小心剥离种皮，将种子先加入23℃的质量分数为75％酒精液浸泡30s，再用23℃的质量分数15％过氧化氢溶液分别浸泡12min，最后用无菌水洗涤5次，得到无菌外植体。
3)首先用消过毒的镊子头，在培养基表面划出一个长约1.5cm，深约0.3cm的凹槽，然后将无菌种子放置在凹槽里，使种子与培养基充分接触；然后将无菌外植体接种到上述pH为6.5的MS培养基中，其中培养基含有质量百分比为30g/L的蔗糖，质量百分比为6.5g/L的琼脂粉。
4)将步骤3得到的组培瓶置于22℃，相对湿度55％条件下暗培养3天，之后在进行光暗交替条件下培养，条件为光照强度2000lux，光照时间为14h/天，黑暗时间为10h/天，温度22℃，相对湿度55％的环境下培养15天，即可获得高6.5cm的无菌苗。
实施例2
按照实施例1的方法进行培养得到高7cm的无菌苗，不同的是，步骤2)中种子置于过氧化氢溶液中浸泡时间为9min。
实施例3
按照实施例1的方法进行培养得到高3cm的无菌苗，不同的是，步骤2)中种子置于过氧化氢溶液中浸泡时间为15min。
实施例4
按照实施例1的方法进行培养得到高5cm的无菌苗，不同的是，步骤3)中MS培养基的pH为6.0。
实施例5
按照实施例1的方法进行培养得到高3.5cm的无菌苗，不同的是，步骤3)中MS培养基的pH为7.0。
实施例6
按照实施例1的方法进行培养得到高3cm的无菌苗，不同的是，步骤3)中的培养基为1/4MS培养基。
实施例7
按照实施例1的方法进行培养得到高4.5cm的无菌苗，不同的是，步骤3)中的培养基为1/2MS培养基。
检测例1
统计上述各个实施例中的污染率、开始发芽时间、达到发芽高峰期时间以及发芽率，具体结果见表3。
表3
上表中：每个实施例中接种5瓶，每瓶接种3粒种子；以2片子叶展开且能够形成胚根或胚芽的种子视为正常发芽种子进行统计；所得数值均为平均值(Mean)，±表示标准误(Std.Error)；不同的小写字母示不同处理之间在0.05水平上存在显著差异。
通过上述实施例可知，本发明提供的培养方法具有优异的繁殖系数与繁殖效率且培养周期短，另外通过该方法培养而得的睡布袋无菌苗生长速度快。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (8)
1.一种睡布袋无菌苗的培养方法，其特征在于，包括：
1)将睡布袋种子置于无菌蒸馏水中浸泡；
2)将所述浸泡后的睡布袋种子剥离种皮，接着依次浸泡于酒精溶液和过氧化氢溶液，然后通过无菌蒸馏水洗涤以得到无菌外植体；
3)将所述无菌外植体接种于培养基；
4)将所述培养基依次经过暗培养和于光暗交替的条件下进行培养；
其中，在所述步骤1)中，所述浸泡至少满足以下条件：浸泡温度为22-24℃，浸泡时间为10-12h；
在步骤2)中，所述酒精溶液的浓度为70-80重量％，并且所述睡布袋种子于所述酒精溶液中浸泡至少满足以下条件：浸泡温度为22-24℃，浸泡时间为30-50s；所述酒精溶液的浓度为70-80重量％，并且所述睡布袋种子于所述酒精溶液中浸泡至少满足以下条件：浸泡温度为22-24℃，浸泡时间为30-50s；
所述暗培养至少满足以下条件：培养温度为21-23℃，相对湿度为50-60％，培养时间为3-5天；且于光暗交替的条件下进行培养至少满足以下条件：光照强度为1800-2000lux，光照时间为12-14h/天，黑暗时间为10-12h/天，相对湿度为50-60％，培养温度为22-24℃，培养时间为12-18天。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在步骤2)中，所述无菌蒸馏水的洗涤次数为4-5次。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，在步骤3)中，所述培养基的pH为6-7，并且所述培养基含有30-35g/L的蔗糖和6.5-7.0g/L的琼脂粉。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述培养基选自1/4MS、1/2MS和MS培养基中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述无菌外植体接种于所述培养基表面的凹槽内，所述凹槽的长度为1.2-1.8cm，宽度为0.2-0.4cm。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的培养方法，其特征在于，在步骤1)中，所述浸泡于单层纱布封口的玻璃容器中进行。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，在步骤1)的所述浸泡之后，所述方法还包括将所述睡布袋种子于流水中冲洗0.5-1h，然后吸干水分。
8.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，在步骤2)中，所述浸泡后的睡布袋种子的种皮的剥离自种子带翅的一侧开始。
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