CN108558815A - 一种蓝莓花青素的高效提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及天然产物提取技术领域，提供了一种蓝莓花青素的高效提取方法，包括如下步骤：(1)选材；(2)制备米曲霉发酵大米产物；(3)原料预处理；(4)酶解破壁；(5)蓝莓花青素提取；(6)除杂；(7)浓缩与超滤；(8)柱层析纯化；(9)干燥；(10)检测。本发明不仅操作简便、利于产业化，还使蓝莓细胞释放更多的花青素，极大地提高了蓝莓花青素的提取效率，既降低了工艺成本，提高了经济效益，又降低了工艺操作难度，使本发明所述的技术及工艺具有更大的可操作性和应用型。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物提取技术领域，尤其涉及一种蓝莓花青素的高效提取方法。
背景技术
蓝莓，学名越桔，属于杜鹃花科越橘属植物。蓝莓果为浆果，近圆形，呈蓝色，是少有的蓝色食物之一。研究表明，蓝莓花青素是一种强有力的抗氧化剂，具有保护人体免受自由基的损伤，增强免疫力等功效，对眼科疾病和心脑血管疾病也有较好的疗效，因此可作为一种天然色素资源应用于食品、制药和化妆品等行业。检测结果表明，蓝莓果中花青素的含量高于其他所有水果与蔬菜，排名第一，因此，蓝莓果是良好的提取天然花青素的原料。
目前花青素的提取方法有溶剂法、二氧化碳超临界萃取法、超声波法，生物复合酶法等，这些方法普遍存在提取率低、提取操作难度大或提取成本高等缺点。
据此，目前急需一种克服以上缺点，即能兼顾操作简便、提取率高、提取成本低等优点的蓝莓花青素的高效提取方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简便、提取率高，且提取成本低的蓝莓花青素的高效提取方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种蓝莓花青素的高效提取方法，包括如下步骤：
(1)选材
选取表面完整，且无腐烂迹象的蓝莓果；
(2)制备米曲霉发酵大米产物
取优质大米42-48份，清水洗净，加水侵泡至大米达到无硬芯，再将侵泡好的大米放入电饭锅中煮至一定程度，然后将煮熟的大米分装至容器，接种米曲霉并混匀，再置于33-35℃、90％以上湿度条件下发酵3-3.5天；
取发酵3-3.5天后的大米放入容器中，再加入其质量16-17％的磷酸缓冲液，均质4-5min后，3900-4100r/min下离心6-8min，取上清液备用；
(3)原料预处理
对步骤(1)中蓝莓果进行液氮速冻处理，并快速将蓝莓捣碎，然后加入其质量12-14％的步骤(2)所得上清液，混合均匀，15-25min后用冷冻干燥机在-80℃冷冻干燥，制得蓝莓干粉；
(4)酶解破壁
将步骤(3)所得的蓝莓干粉转移至酶解罐，并向酶解罐加入复合生物酶溶液，酶解时间为7-11h，酶解温度为32-38℃，最终得花青素充分释放的蓝莓酶解物；
其中，复合生物酶溶液的具体配制方法为：首先，向水中加入柠檬酸，然后，用氢氧化钠调节pH至4.2-4.4，加入酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶，混合均匀，得生物复合酶溶液；
(5)蓝莓花青素提取
将浓度为45-65％、pH值为3-5的乙醇与步骤(4)所得的蓝莓酶解物以(5-7)：1的重量比例混合，加热回流提取1-2h，过滤并收集滤液和残渣，残渣再以相同的料液比与同浓度的酸化乙醇溶液混合，再次回流提取1-2h，过滤并收集滤液，合并两次的滤液；
(6)除杂
将步骤(5)所得合并滤液于0-4℃低温下放置15-19h，然后过滤；
(7)浓缩与超滤
先将步骤(6)所得滤液在51-55℃下减压蒸发浓缩9-13h，再将浓缩液通过微孔滤膜进行超滤处理，以除去细菌和大分子蛋白；
(8)柱层析纯化
先将滤液以每小时1-3倍柱体积的速度流过大孔吸附树脂，然后用2-5倍柱体积的蒸馏水以相同的速度流过树脂，洗去大部分杂质，再用1-3柱体积的60-90％的乙醇溶液以相同速度流过树脂，将树脂上吸附的花色苷洗脱下来，收集洗脱液；
(9)干燥
将洗脱液在52-54℃下减压蒸发浓缩以进一步除去乙醇，最后在40-55℃真空环境中干燥；
(10)检测
采用高效液相色谱法对纯化后的蓝莓花青素中的花色苷含量进行检测。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中一定程度指电饭锅中煮至大米熟而不粘。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中米曲霉的接种量为2-4％。
作为本发明的优选方式之一，所述米曲霉的接种量具体为3％。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中磷酸缓冲液的pH为6.5-7.5。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中液氮的温度为(-30)-(-50)℃，流量为4-5m/s。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中制得的蓝莓干粉中的水分低于5％。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中生物复合酶溶液中，酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶的酶活性均为100IU。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(10)中检测出的花色苷含量45％以上。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)操作简便、利于产业化；
(2)米曲霉发酵大米产物中主要含有曲酸和阿魏酸，能有效抑制蓝莓中多酚氧化酶活性，利用液氮处理将蓝莓果破碎，进一步有效地降低了氧化多酚酶的活性，利于提高后续花青素的提取率；
(3)本发明利用酸性纤维素酶100IU，酸性蔗糖酶100IU和酸性单宁酶100IU作为蓝莓细胞壁的生物复合酶，其中，酸性纤维素酶可以降解蓝莓细胞壁中的纤维素成份，有助于细胞破碎；酸性蔗糖酶可以将蓝莓中含有的蔗糖成份水解为葡萄糖和果糖，从而利于花青素的提取；单宁酶可以水解蓝莓果实中含有的鞣酸和部分蛋白质，使蓝莓花青素分离纯化更加容易；三种酶相互配伍，能够显著讲解蓝莓细胞壁的组成成分，以及蓝莓中不利于花青素提取的蔗糖、单宁和蛋白质等成分，使花青素更易释放，释放更彻底；同时，利用柠檬酸溶液作为载体溶解酸性纤维素酶，酸性蔗糖酶和单宁酶，可以提高蓝莓花青素的提取效率。
综上所述，本发明的工艺步骤不仅操作简便、利于产业化，还使蓝莓细胞释放更多的花青素，极大地提高了蓝莓花青素的提取效率，既降低了工艺成本，提高了经济效益，又降低了工艺操作难度，使本发明所述的技术及工艺具有更大的可操作性和应用型。
附图说明
图1是实施例1-3中蓝莓花青素的高效提取方法的流程图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1所示，本实施例的一种蓝莓花青素的高效提取方法，包括如下步骤：
(1)选材
选取表面完整，且无腐烂迹象的蓝莓果；
(2)制备米曲霉发酵大米产物
取优质大米42份，清水洗净，加水侵泡至大米达到无硬芯，再将侵泡好的大米放入电饭锅中煮至大米熟而不粘，然后将煮熟的大米分装至容器，按照接种量2％来接种米曲霉并混匀，再置于33℃、90％湿度条件下发酵3天；
取发酵3天后的大米放入容器中，再加入其质量16％的磷酸缓冲液(pH 6.5)，均质4min后，3900r/min下离心6min，取上清液备用；
(3)原料预处理
对步骤(1)中蓝莓果进行液氮速冻处理(液氮的温度为-30℃，流量为4m/s)，并快速将蓝莓捣碎，然后加入其质量12％的步骤(2)所得上清液，混合均匀，15min后用冷冻干燥机在-80℃冷冻干燥，制得蓝莓干粉；其中，制得的蓝莓干粉中的水分低于5％。
(4)酶解破壁
将步骤(3)所得的蓝莓干粉转移至酶解罐，并向酶解罐加入复合生物酶溶液，酶解时间为7h，酶解温度为32℃，最终得花青素充分释放的蓝莓酶解物；
其中，复合生物酶溶液的具体配制方法为：首先，向水中加入柠檬酸(浓度1％)，然后，用氢氧化钠调节pH至4.2，再加入酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶(酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶的酶活性均为100IU)，混合均匀，得生物复合酶溶液；
(5)蓝莓花青素提取
将浓度为45％、pH值为3的乙醇与步骤(4)所得的蓝莓酶解物以5：1的重量比例混合，加热回流提取1h，过滤并收集滤液和残渣，残渣再以相同的料液比与同浓度的酸化乙醇溶液混合，再次回流提取1h，过滤并收集滤液，合并两次的滤液；
(6)除杂
将步骤(5)所得合并滤液于0℃低温下放置15h，然后过滤；
(7)浓缩与超滤
先将步骤(6)所得滤液在51℃下减压蒸发浓缩9h，再将浓缩液通过微孔滤膜进行超滤处理，以除去细菌和大分子蛋白；
(8)柱层析纯化
先将滤液以每小时1倍柱体积的速度流过大孔吸附树脂，然后用2倍柱体积的蒸馏水以相同的速度流过树脂，洗去大部分杂质，再用1柱体积的60％的乙醇溶液以相同速度流过树脂，将树脂上吸附的花色苷洗脱下来，收集洗脱液；
(9)干燥
将洗脱液在52℃下减压蒸发浓缩以进一步除去乙醇，最后在40℃真空环境中干燥；
(10)检测
采用高效液相色谱法对纯化后的蓝莓花青素中的花色苷含量进行检测，检测结果为45％。
实施例2
如图1所示，本实施例的一种蓝莓花青素的高效提取方法，包括如下步骤：
(1)选材
选取表面完整，且无腐烂迹象的蓝莓果；
(2)制备米曲霉发酵大米产物
取优质大米48份，清水洗净，加水侵泡至大米达到无硬芯，再将侵泡好的大米放入电饭锅中煮至大米熟而不粘，然后将煮熟的大米分装至容器，按照接种量4％来接种米曲霉并混匀，再置于35℃、95％湿度条件下发酵3.5天；
取发酵3.5天后的大米放入容器中，再加入其质量17％的磷酸缓冲液(pH7.5)，均质5min后，4100r/min下离心8min，取上清液备用；
(3)原料预处理
对步骤(1)中蓝莓果进行液氮速冻处理(液氮的温度为-50℃，流量为5m/s)，并快速将蓝莓捣碎，然后加入其质量14％的步骤(2)所得上清液，混合均匀，25min后用冷冻干燥机在-80℃冷冻干燥，制得蓝莓干粉；其中，制得的蓝莓干粉中的水分低于5％。
(4)酶解破壁
将步骤(3)所得的蓝莓干粉转移至酶解罐，并向酶解罐加入复合生物酶溶液，酶解时间为11h，酶解温度为38℃，最终得花青素充分释放的蓝莓酶解物；
其中，复合生物酶溶液的具体配制方法为：首先，向水中加入柠檬酸(浓度1％)，然后，用氢氧化钠调节pH至4.4，再加入酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶(酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶的酶活性均为100IU)，混合均匀，得生物复合酶溶液；
(5)蓝莓花青素提取
将浓度为65％、pH值为5的乙醇与步骤(4)所得的蓝莓酶解物以7：1的重量比例混合，加热回流提取2h，过滤并收集滤液和残渣，残渣再以相同的料液比与同浓度的酸化乙醇溶液混合，再次回流提取2h，过滤并收集滤液，合并两次的滤液；
(6)除杂
将步骤(5)所得合并滤液于4℃低温下放置19h，然后过滤；
(7)浓缩与超滤
先将步骤(6)所得滤液在55℃下减压蒸发浓缩13h，再将浓缩液通过微孔滤膜进行超滤处理，以除去细菌和大分子蛋白；
(8)柱层析纯化
先将滤液以每小时3倍柱体积的速度流过大孔吸附树脂，然后用5倍柱体积的蒸馏水以相同的速度流过树脂，洗去大部分杂质，再用3柱体积的90％的乙醇溶液以相同速度流过树脂，将树脂上吸附的花色苷洗脱下来，收集洗脱液；
(9)干燥
将洗脱液在54℃下减压蒸发浓缩以进一步除去乙醇，最后在55℃真空环境中干燥；
(10)检测
采用高效液相色谱法对纯化后的蓝莓花青素中的花色苷含量进行检测，检测结果为46％。
实施例3
如图1所示，本实施例的一种蓝莓花青素的高效提取方法，包括如下步骤：
(1)选材
选取表面完整，且无腐烂迹象的蓝莓果；
(2)制备米曲霉发酵大米产物
取优质大米54份，清水洗净，加水侵泡至大米达到无硬芯，再将侵泡好的大米放入电饭锅中煮至大米熟而不粘，然后将煮熟的大米分装至容器，按照接种量3％来接种米曲霉并混匀，再置于34℃、92％湿度条件下发酵3.2天；
取发酵3.2天后的大米放入容器中，再加入其质量17％的磷酸缓冲液(pH7.0)，均质4.5min后，4000r/min下离心7min，取上清液备用；
(3)原料预处理
对步骤(1)中蓝莓果进行液氮速冻处理(液氮的温度为-40℃，流量为4.5m/s)，并快速将蓝莓捣碎，然后加入其质量13％的步骤(2)所得上清液，混合均匀，20min后用冷冻干燥机在-80℃冷冻干燥，制得蓝莓干粉；其中，制得的蓝莓干粉中的水分低于5％。
(4)酶解破壁
将步骤(3)所得的蓝莓干粉转移至酶解罐，并向酶解罐加入复合生物酶溶液，酶解时间为9h，酶解温度为35℃，最终得花青素充分释放的蓝莓酶解物；
其中，复合生物酶溶液的具体配制方法为：首先，向水中加入柠檬酸(浓度1％)，然后，用氢氧化钠调节pH至4.3，再加入酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶(酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶的酶活性均为100IU)，混合均匀，得生物复合酶溶液；
(5)蓝莓花青素提取
将浓度为55％、pH值为4的乙醇与步骤(4)所得的蓝莓酶解物以6：1的重量比例混合，加热回流提取1.5h，过滤并收集滤液和残渣，残渣再以相同的料液比与同浓度的酸化乙醇溶液混合，再次回流提取1.5h，过滤并收集滤液，合并两次的滤液；
(6)除杂
将步骤(5)所得合并滤液于2℃低温下放置17h，然后过滤；
(7)浓缩与超滤
先将步骤(6)所得滤液在53℃下减压蒸发浓缩11h，再将浓缩液通过微孔滤膜进行超滤处理，以除去细菌和大分子蛋白；
(8)柱层析纯化
先将滤液以每小时2倍柱体积的速度流过大孔吸附树脂，然后用4倍柱体积的蒸馏水以相同的速度流过树脂，洗去大部分杂质，再用2柱体积的75％的乙醇溶液以相同速度流过树脂，将树脂上吸附的花色苷洗脱下来，收集洗脱液；
(9)干燥
将洗脱液在53℃下减压蒸发浓缩以进一步除去乙醇，最后在50℃真空环境中干燥；
(10)检测
采用高效液相色谱法对纯化后的蓝莓花青素中的花色苷含量进行检测，检测结果为46.8％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种蓝莓花青素的高效提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选材
选取表面完整，且无腐烂迹象的蓝莓果；
(2)制备米曲霉发酵大米产物
取优质大米42-48份，清水洗净，加水侵泡至大米达到无硬芯，再将侵泡好的大米放入电饭锅中煮至一定程度，然后将煮熟的大米分装至容器，接种米曲霉并混匀，再置于33-35℃、90％以上湿度条件下发酵3-3.5天；
取发酵3-3.5天后的大米放入容器中，再加入其质量16-17％的磷酸缓冲液，均质4-5min后，3900-4100r/min下离心6-8min，取上清液备用；
(3)原料预处理
对步骤(1)中的蓝莓果进行液氮速冻处理，并快速将蓝莓捣碎，然后加入其质量12-14％的步骤(2)所得上清液，混合均匀，15-25min后用冷冻干燥机在-80℃冷冻干燥，制得蓝莓干粉；
(4)酶解破壁
将步骤(3)所得的蓝莓干粉转移至酶解罐，并向酶解罐加入复合生物酶溶液，酶解时间为7-11h，酶解温度为32-38℃，最终得花青素充分释放的蓝莓酶解物；
其中，复合生物酶溶液的具体配制方法为：首先，向水中加入柠檬酸，然后，用氢氧化钠调节pH至4.2-4.4，加入酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶，混合均匀，得生物复合酶溶液；
(5)蓝莓花青素提取
将浓度为45-65％、pH值为3-5的乙醇与步骤(4)所得的蓝莓酶解物以(5-7)：1的重量比例混合，加热回流提取1-2h，过滤并收集滤液和残渣，残渣再以相同的料液比与同浓度的酸化乙醇溶液混合，再次回流提取1-2h，过滤并收集滤液，合并两次的滤液；
(6)除杂
将步骤(5)所得合并滤液于0-4℃低温下放置15-19h，然后过滤；
(7)浓缩与超滤
先将步骤(6)所得滤液在51-55℃下减压蒸发浓缩9-13h，再将浓缩液通过微孔滤膜进行超滤处理，以除去细菌和大分子蛋白；
(8)柱层析纯化
先将滤液以每小时1-3倍柱体积的速度流过大孔吸附树脂，然后用2-5倍柱体积的蒸馏水以相同的速度流过树脂，洗去大部分杂质，再用1-3柱体积的60-90％的乙醇溶液以相同速度流过树脂，将树脂上吸附的花色苷洗脱下来，收集洗脱液；
(9)干燥
将洗脱液在52-54℃下减压蒸发浓缩以进一步除去乙醇，最后在40-55℃真空环境中干燥；
(10)检测
采用高效液相色谱法对纯化后的蓝莓花青素中的花色苷含量进行检测。
2.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中一定程度指电饭锅中煮至大米熟而不粘。
3.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中米曲霉的接种量为2-4％。
4.根据权利要求3所述的蓝莓花青素的高效提取方法，其特征在于，所述米曲霉的接种量具体为3％。
5.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中磷酸缓冲液的pH为6.5-7.5。
6.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中液氮的温度为(-30)-(-50)℃，流量为4-5m/s。
7.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中制得的蓝莓干粉中的水分低于5％。
8.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(4)中生物复合酶溶液中，酸性纤维素酶、酸性蔗糖酶和单宁酶的酶活性均为100IU。
9.根据权利要求1所述的蓝莓花青素的高效提取方法，其特征在于，所述步骤(10)中检测出的花色苷含量45％以上。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20180921 |
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