CN108486124A

CN108486124A - 嘉兴黑猪tfam基因特征序列、引物及检测试剂盒

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Publication number: CN108486124A
Application number: CN201810337451.2A
Authority: CN
Inventors: 张金枝; 宋倩倩; 吴芬; 许明曙; 高海霞; 韩祝君
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-03-26
Filing date: 2018-04-10
Publication date: 2018-09-04
Anticipated expiration: 2038-04-10
Also published as: CN108486124B

Abstract

本发明涉及嘉兴黑猪TFAM基因特征序列以及特异性扩增引物，以及包括TFAM基因特征序列以及特异性扩增引物的用于嘉兴黑猪肉质相关性状的检测试剂盒。本发明探讨了TFAM基因表达量与嘉兴黑猪肉质性状及胴体性状的关联分析，从分子水平探索嘉兴黑猪肉质性状相关基因遗传机理，为提高地方猪的肉品质、保护嘉兴黑猪种质资源及开发利用提供相应的理论基础，对改良和提高低产品种的繁殖力和改善肉质具有重要意义。

Description

嘉兴黑猪TFAM基因特征序列、引物及检测试剂盒

(一)技术领域

本发明涉及嘉兴黑猪TFAM基因特征序列以及特异性扩增引物，以及包括TFAM基因特征序列以及特异性扩增引物的用于嘉兴黑猪肉质相关性状的检测试剂盒。

(二)背景技术

嘉兴黑猪是我国的优良的地方品种，经漫长的风土驯化和产区农户长期选育，形成了繁殖力高、肉质好、抗逆性强、杂交配合力好的优良特性，特别是繁殖力高的特性为世人所瞩目，是我国宝贵的猪种资源。

但我国地方猪种由于生长速度慢，出栏率低，屠宰率低、瘦肉率低、饲料转化率低等不足，不能适应养猪业的产业化发展，也无法满足市场对瘦猪肉日益增长的需求，导致群体规模不断萎缩(刘莹莹等，2015年)。20世纪猪育种实践表明，过快的生长速度和过高的瘦肉率导致了猪肉品质的下降和个体生活力的降低。现代猪育种方向因而转向侧重优质猪培育，且倾向利用地方黑色猪种。为了满足市场对猪肉品质优质化、多元化的需求，也为更好地保护和开发利用浙江省著名优良地方猪种嘉兴黑猪，有必要开展优质黑猪配套系培育。

巴克夏猪是英国最古老的培育猪种，迄今已有300余年的历史和200余年的纯繁纪录。由于巴克夏猪肉质优良，盛产雪花瘦肉，日本藉此育成鹿儿岛黑豚。特别是巴克夏猪的前肩雪花肉优势显著使其在世界养猪的品种格局中占有重要地位(张伟力等，2008年)。随着生活水平的提高，人们对极品猪肉消费量的增加，国际、国内市场上对极品黑猪肉的需求日益增加，巴克夏猪在低迷了半个世纪后已经东山再起。因此，将巴克夏猪定为优质黑猪配套系的母系父本品种进行专门化选育，开发嘉兴黑猪为母本的配套系具有重要的现实意义和广阔的开发利用前景(张伟力等，2010年)。在追求数量的同时，提高饲养品种的肉质性状与胴体性能一直是品种选育的目标之一，而且会越来越受到重视。

截止目前，关于嘉兴黑猪及其杂交组合的肉质性状及胴体性状的分子机理影响研究报道较少，特别是TFAM基因对嘉兴黑猪肉质性状及胴体性状的作用未见报道。

线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)是核内编码的高迁移率的蛋白，在细胞质内合成，然后与HSP60-70复合体结合，进而参与线粒体DNA的转录激活和调节线粒体DNA的拷贝数(Fisher et al.，1988，Kanki T et al.，2004，Gaspari M et al.，2004)。此外还对线粒体生物学功能和线粒体DNA的稳定性和完整性及肌浆网钙ATP酶表达起到重要的作用(姚鹏程等，2011，宋银娟等，2017)，其缺失或者过度表达都会影响线粒体基因组稳定性，进而对细胞生长产生影响(Campbell C T et al.，2012)。

TFAM是生物体的能量车间，线粒体疾病重要调控因子以及肉质风味调节因子，在机体内扮演着不可替代的角色。近年来，许多的学者都在研究TFAM基因对人类相关疾病的影响机制。因为由TFAM基因的生物学功能较多，也会影响动物的某些经济性状，所以TFAM基因在动物的生产效应上的研究也在增加。

大理石纹是鉴定猪肉质量的重要直观指标，其纹路会直接影响到肌内脂肪的含量，肌内脂肪的含量对肉的风味和口感都有显著的影响，该性状现在被越来越多的人进行研究和受到重视。脂肪主要是在线粒体中构建的，与线粒体的生物功能有着不可分割的关系(Wilson-Fritch L et al.，2004)，如脂肪酸β-氧化过程主要发生在线粒体中，通过激活丙酮酸羧化酶，为甘油三酯的合成的提供中间物。此外，三羧酸循环中的酯化反应需要线粒体生成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)，从而激活脂肪酸。

在牛的研究中发现TFAM、脂肪结合蛋白4(fatty acid binding protein 4，FABP4)和线粒体聚合酶A(mitochondrial polymerase A)等3个核内编码线粒体基因与大理石纹之间差异显著(Jiang Z et al.，2009)。因此TFAM基因变异可能影响肌内脂肪代谢及下游一系列生物学反应。Jiang等在牛的TFAM基因启动子区筛选到两个SNP位点，通过基因分型，得出两个SNP位点与大理石纹和皮下脂肪沉积显著相关，还造成与脂肪沉积和能量代谢有关的转录因子结合位点改变，证实了线粒体转录机器影响肌肉脂肪的沉积(Jiang Zet al.，2010)。TFAM基因位点的改变对杂交牛胴体性状如嫩度、高品质牛肉比率和可分离牛肉脂肪率都有着显著影响(Kaplanova K et al.，2010)。谢海强等通过比较黔北麻羊和贵州白山羊两个品种中TFAM基因第二外显子中的G1099C该多态性位点的等位基因频率，发现该位点影响这两个品种的肌内脂肪沉积等肉质性状(谢海强等，2013年)。

由上可以看出，TFAM基因对家畜的肉质性状有着重要的影响。目前，关于猪肉肉质相关基因的研究主要集中在GH、IGF、MSTN等上，而关于TFAM基因的报道未见。

TFAM基因是线粒体基因组转录的不可缺少的组成成分，参与机体内的脂肪酸代谢，也影响着生物的某些经济性状。TFAM基因的主要研究集中在人和小鼠上，而对猪的TFAM基因的研究报道极少，更重要的是主要研究TFAM基因在某些疾病上的影响机制，对猪肉质性状的影响的研究还没有。

(三)发明内容

本发明目的是提供嘉兴黑猪TFAM基因特征序列及特异性扩增引物，探讨TFAM基因表达量与嘉兴黑猪肉质性状及胴体性状的关联分析，从分子水平探索嘉兴黑猪肉质性状相关基因遗传机理，为提高地方猪的肉品质、保护嘉兴黑猪种质资源及开发利用提供相应的理论基础，对改良和提高低产品种的繁殖力和改善肉质具有重要意义。

本发明采用的技术方案是：

嘉兴黑猪TFAM基因特征序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

SEQ ID No.1序列如下：

5’-CATGCGCTCGGGAGCTGCACAAGATTGGGGCCTGGTCAGTGCTTTGTCTACGGGTGCAATGGCGCTTCTCCGGGGCGTGTGGGGCGTGCTGAGTGCCCTGGGAAAGTCAGGAGCGGACCTCTGTGCGGTTTGTGGAAGTCGACTGCGCTCTCCGTTCAGTTTTGCGTATGTACCAAGATGGTTTTCATCCACCCTGAGTGGTTTTCCAAAGAAGCCTATGACTTCATACGTTCGATTTTCTAAAGAACAGCTACCCATATTTAAAGCTCAGAACCCAGATGCAAAAAATTCAGAACTAATTAAAAAAATTGCTGAGCTGTGGAGGGAACTTCCTGATTCAGAGAAAAAGATATATGAAGATGCTTATAGGGCAGACTGGCAGGTGTACAAAGAAGAGGTAAACAGAATTCAAGAACAGCTAACTCCAAGTCAAATGGTATCTTTGGAAAAAGAAATCATGCAGAAACGTTTAAAAAAGAAAGCGTTAATCAAAAAGAGAGAATTAACAATGCTTGGAAAACCAAAAAGACCTCGATCAGCTTATAACATTTTTATTGCTGAACGCTTTCAGGAAGCTAAGGATGGTCCATCACAGGTAAAGCTGAAAACTATAAATGAAAACTGGAAAAATCTCTCTAGTTCTCAAAAGCAAGTATATATTCAACTTGCTGAAGATGATAAAGTTCGTTATTATAATGAAATGAAATCTTGGGAAGAACAAATGGTTGAAGTTGGGCGAAACGATCTTATACGTCGCTCAATGAAACATTCAGCAAAGAAAGACACTGAGGAGTGTTGAAATAGAAGGTTGAGCTATGTTCGTATGGTACCCCCCAAAAAAAACACAATTTATAAAAAAAACCCCCCAAAAACAAACCATCCAAAAAAAAAACTTCCCCACCATATTATATTTCCAAAAATAAAATTTTTATAAAAACCAATA-3’；

本发明克隆嘉兴黑猪TFAM基因的编码区序列，进行生物学信息分析，对于深入了解TFAM基因的生物学功能和作用机制有重大的意义。

本发明还涉及嘉兴黑猪TFAM基因的特异性扩增引物，其引物序列如下：

上游引物：5’-TTGCGAGTTCAAGTCGTCAT-3’；

下游引物：5’-GGTTTCTCGTGTCTATCCAT-3’。

本发明还涉及一种嘉兴黑猪肉质相关性状检测试剂盒，主要包括嘉兴黑猪TFAM基因特征序列，嘉兴黑猪TFAM基因的特异性扩增引物，以及PCR反应试剂；

所述嘉兴黑猪TFAM基因特征序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述特异性扩增引物序列如下：

上游引物：5’-TTGCGAGTTCAAGTCGTCAT-3’；

下游引物：5’-GGTTTCTCGTGTCTATCCAT-3’。

本发明还涉及所述的试剂盒在嘉兴黑猪育种中的应用。本发明筛选出对改善猪肉质有利的分子标记，可为改善猪肉品质，加快育种选育提供参考依据。

本发明探讨关键线粒体基因TFAM基因对嘉兴黑猪脂肪代谢的调控机制，为今后筛选出对嘉兴黑猪肉质有利的分子标记或候选基因提供理论依据，对提高嘉兴黑猪肉质、加快品种及配套系选育、进一步开发其种质遗传潜能都具有重要意义。

(四)附图说明

图1为提取的组织样本总RNA的电泳检测图谱；

图2为琼脂糖检测TFAM基因的RT-PCR产物；

图3为嘉兴黑猪TFAM基因部分序列测序图；

图4为嘉兴黑猪TFAM核苷酸和氨基酸序列；

图5为TFAM蛋白三级结构预测；

图6为TFAM基因的荧光定量扩增结果；

图7为TFAM基因的荧光定量溶解曲线；

图8为嘉兴黑猪TFAM基因在不同组织中的表达。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1.1材料与方法

1.1.1实验材料

1.1.1.1实验动物

选取72kg左右健康的嘉兴黑猪1头，由浙江青莲食品股份有限公司提供。屠宰后取其肝脏，放在冻存管中投放进液氮罐中进行速冻，回到实验室后，从液氮罐中取出置于-80℃冰箱中保存，作为试验样品备用。

1.1.1.2主要仪器与试剂

1.1.1.2.1主要仪器

1.1.1.2.2主要试剂

Trizol A⁺试剂、质粒小提试剂盒(No.DP103)、DH5α感受态细胞(No.CB101)、DL2000Marker DL1000Marker购自天根生化科技(北京)有限公司；Prime Script RTreagent Kit with gDNA Eraser(No.DRR037A)、EX Taq(No.DR001A)、Gel Extraction Kit(胶回收试剂盒)均购自宝生物工程(大连)有限公司。Tris碱、酵母提取物、琼脂粉、胰蛋白胨、IPTG(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside)异丙基-β-D-硫代半乳糖苷、X-Ga(5-Bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galactopyranoside)5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷、Amp(Ampicillin)氨苄青霉素均来自实验室。特异性引物、载体通用引物以及pMD19-TSimple Vector载体由杭州擎科梓熙生物技术有限公司提供，去离子水溶解，-20℃保存。

1.1.1.2.3试剂的配制

1)LB固体培养基(按1L体积配制计算)

配制方法：将称量好的溶质溶解于960mL超纯水后，加入约900μL 5mol/L NaOH调节pH至7.2，定容至1000mL，高压灭菌1.5h，待冷却至60℃，每mL培养基加入1.0μL100mg/mL的Kan贮存液至终浓度为100μg/mL，十字摇匀培养基，取已高压灭菌好的玻璃培养皿，每个培养皿中加入适量培养基铺制平板，室温冷却备用。

2)LB液体培养基(按1L体积配制计算)

材料:细菌实验专用胰蛋白胨 10g

细菌实验专用酵母提取物 5g

细菌实验专用NaCl 10g

配制方法：将称量好的溶质溶解于960mL超纯水后，加入约700μL 5mol/L NaOH调节pH至7.2，定容至1000mL，高压灭菌1.5h，4℃保存备用。

3)50×TAE缓冲母液配方(按1L体积配制计算)

材料：Tris 242g

Na2EDTA﹒2H2O 37.2g

CH3COOH 57.1mL

配制方法：将称量好的溶质溶解于溶解于600mL超纯水中，搅拌溶解后，定容至1000mL，室温保存备用。

1×TAE工作液配制：取20mL上述50×TAE母液，加入980mL去离子水，即可得到1×TAE工作缓冲液。

4)1mol/L CaCl2:称取14.7g CaCl2·2H2O溶于足量的水中，定容至100mL，高压灭菌20min，4℃保存备用。常用0.1mol/L CaCl2溶液。

5)含15％甘油的0.1mol/L CaCl2溶液：在10mL 1mol/L CaCl2中加入15mL纯甘油，加水定容至100mL，高压灭菌20min，4℃保存备用。

6)75％酒精：取75mL 100％的纯酒精，加水定容至100mL，4℃保存备用。

7)1％琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖溶于20mL1×TAE电泳缓冲液中，用微波炉加热1分钟左右至完全溶化，放在桌面上冷却至放在手背不热为止，然后加入1微升的核酸染料，混匀后倒入带有电泳梳的小电泳槽中，在桌子上大约放置20分钟左右即可。

1.1.2方法

1.1.2.1引物设计

引物由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成。引物序列信息见表1：

表1：TFAM基因cDNA克隆引物

1.1.3总RNA的提取与检测

1.1.3.1总RNA的提取

利用Trizol试剂提取嘉兴黑猪肝脏组织的总RNA，具体操作如下：

(1)从-80℃的冰箱中取出肝脏的冷冻组织，剪取大约50-100mg左右的样品，加入到有钢珠及添加了1mL Trizol的1.5ml离心管中，将其放入研磨仪中(频率70HZ，时间120s)研磨后在超净工作台上静置5min，使其充分裂解；

(2)将带有已经充分裂解样品的离心管放进离心机中，在12000rpm 4℃下离心10min，然后取上清于另一个新的离心管中，将其沉淀弃掉，这样使细胞膜、细胞器膜等杂质全部倒掉；

(3)再往离心管中加入0.2ml的氯仿，在漩涡混合仪上混匀后静置15min；

(4)在12000rpm 4℃下离心15min，吸上层水相至另一个离心管中；

(5)加入大约0.5ml的异丙醇，混匀后室温放置10min，然后在12000rpm 4℃下离心10min，将上清弃掉，在管的底部会看到胶状RNA沉淀；

(6)加入在4℃预冷的75％的乙醇1ml，温和振荡或多次用移液枪吹打，从而使沉淀呈现悬浮状态，将离心管于8000rpm4℃下离心10min，弃上清；

(7)在室温下晾干或真空干燥5-10min，切记不可过于干燥；

(8)用50μL ddH2O溶解RNA样品，55～60℃水浴5～10min；

(9)测OD值定量RNA浓度并凝胶电泳检测RNA的质量。

1.1.3.2总RNA的质量检测

总RNA的质量检测：取10μL左右的RNA，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，如果可以看见清晰的RNA的三条带，从胶孔处开始分别是28S、18S、5S，其中28S条带的亮度大约是18S的2倍，5S条带最弱，表明提取的RNA质量较好，可用于后续试验。然后对没有降解的具有完整性的总RNA进行OD260/OD280值与浓度的测定。取总RNA大约2μL，在核酸蛋白分析仪中测定A260和A280的值及浓度，OD260/OD280值在1.8-2.0之间表示质量较好，符合反转录对总RNA的浓度要求。

1.1.4逆转录反应

逆转录反应是用RNA作为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA。

1)去除基因组DNA反应

冰上配制反应混合液，分装至每个反应管中，最后加入RNA样品。

42℃水浴2min后，4℃保存。

2)反转录反应

冰上配制反应混合液，分装至上述10μL的每个反应管，轻轻混匀后立即进行反转录反应。

37℃水浴15min，然后85℃金属浴5s，最后4℃保存。

1.1.5PCR反应

以cDNA为模板，用设计好的引物进行PCR反应，完成扩增。

(1)反应体系

(2)反应条件

扩增后取3μL PCR产物用1％的琼脂凝胶进行电泳检测，若在电泳结果中出现了目的条带，进行送样测序，确定最佳的退火温度。然后以最佳的退火温度54℃进行PCR扩增，得到所需要的目的片段。

1.1.6 PCR产物的纯化与回收

用于PCR产物回收的试剂盒是Gel Extraction Kit，操作步骤如下：

(1)在150V电压下，将PCR产物放在1％的琼脂凝胶中电泳约30min；

(2)切下含有目的条带的琼脂块，将其切碎，放进1.5ml的离心管中；

(3)向胶块中加入溶解液Buffer GM，其加量如下：

(4)均匀混合后在37℃下溶解胶块，每隔几分钟需要进行颠倒混匀；

(5)当胶块完全溶解后，可观察到胶块的颜色为黄色；

(6)将溶解后的胶块液移到已安置在收集管上的吸附柱中，12000rpm离心1min，并弃掉收集管中的液体；

(7)在吸附柱中加入700μL的Buffer WB，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；

(8)重复步骤7；

(9)将有吸附柱的空收集管，室温12000rpm离心1min；

(10)将吸附柱一刀一个干净的1.5ml的离心管张静置30min，然后在吸附柱膜的中央处加入30μLddH₂O；

(11)12000rpm离心1min洗脱DNA；

(12)然后测浓度，跑胶确认是否有目的片段。

1.1.7 RT-PCR产物克隆

1.1.7.1目的基因与载体的连接

下面是pMD19-T Simple Vector与回收后的PCR产物连接的体系，注意的是要将载体在冰上进行熔化。

混匀后在16℃下进行孵育过夜。

1.1.7.2连接物的转化

(1)在全量(10μL)连接物中加入100μL DH5α感受态细胞，进行混匀后冰中放置30min。

(2)42℃下热激90s后，立即在冰中放置5min。

(3)加入890μL预热的LB液体培养基，37℃振荡培养60min。

(4)吸取200μL菌液，用涂珠在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上均匀涂抹，室温孵育约30min，37℃倒置过夜培养。

(5)第二天观察菌落生长情况，然后用蓝白斑筛选，蓝色为阴性，白色为阳性，挑选白色单菌落，进行验证。

1.1.7.3重组质粒的鉴定

菌液PCR鉴定：挑白色菌落接种于Amp/LB液体培养基中，在37℃下进行摇菌过夜培养。以0.5μL菌液为模板，进行PCR扩增。

反应体系如下：

反应条件同2.2.4(2).然后取3μL反应物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.1.7.4序列测定

选PCR反应后电泳结果显示有目的条带的菌液送至杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.2结果与分析

1.2.1总RNA提取的结果

图1为提取的组织样本总RNA的电泳检测图谱，从中可以看到有明显的3个条带，从上到下28S条带的亮度约是18S条带的2倍，5S条带是最弱的，说明组织样品中总RNA具有很好的完整性，质量较好，降解少。

根据核酸蛋白检测仪现实的结果表明，提取的总RNA的OD260/OD280的值在1.80-1.95之间，满足1.8<OD260/OD280<2.0的要求，说明RNA没有被蛋白或化学试剂所污染，可以用于后续的试验。

1.2.2 cDNA的PCR扩增

以cDNA为模板，用特异性引物进行RT-PCR扩增，然后用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。图2是TFAM基因RT-PCR产物为943bp的长度，与预期长度相符。

1.2.3目的片段的测序结果

测序后得到嘉兴黑猪TFAM、TFB2M基因的cDNA序列测序图，图3为TFAM、TFB2M基因部分测序结果图。

1.2.4 TFAM基因的序列分析

1.2.4.1嘉兴黑猪TFAM基因的cDNA序列分析

成功扩增出目的片段943bp，采用NCBI上的ORF Finder程序分析嘉兴黑猪TFAM基因序列，获得长度为741bp的CDS区，编码246个氨基酸(图4)。

1.2.4.2嘉兴黑猪TFAM理化性质分析

经过在线软件ExPASy ProtParam分析得出：嘉兴黑猪TFAM蛋白含有20种氨基酸，其中Lys所占比例最高为12.2％，His比例最低为0.4％。TFAM蛋白分子式为C₁₂₈₁H₂₀₅₁N₃₅₇O₃₇₀S₁₁，分子量28726.21，理论等电点PI为9.62。不稳定系数值为46.20，体外哺乳动物网织红细胞内半衰期是30h，脂肪系数74.15，平均疏水系数为-0.746。

经ProtScale程序分析TFAM蛋白疏水性，TFAM编码蛋白疏水性在第165氨基酸位置有最大值3.933，在第172氨基酸位置有最小值-4.100。通过TMHMM预测TFAM蛋白的跨膜结构，发现TFAM氨基酸序列不存在跨膜螺旋结构。由表2可知PSORTⅡPrediction分析后所得到的TFAM的亚细胞定位。经NetPhos 3.1预测分析，TFAM蛋白有20个Ser，3个Thr，5个Tyr可能是潜在的磷酸化位点。由保守结构域分析，发现TFAM有两个HMG(high mobility groupprotein，HMG)结构域位置分别在49-119和154-220氨基酸残基，在第一个结构域的前面存在着一个信号肽，两者中间有一段低复杂度的序列，在136-147氨基酸残基位置。HMG蛋白具有调节核内生物学功能的作用，对DNA的复制、修复及重组也具有调节作用，而且HMG蛋白调控基因的表达转录印证了TFAM在线粒体DNA的转录中发挥重要作用。

表2：TFAM的亚细胞定位

1.2.4.3嘉兴黑猪TFAM二级和三级结构预测分析

运用在线软件SOPMA软件预测了TFAM蛋白二级结构，显示α-螺旋(h)所占的比例为52.03％，共128个；延伸链(e)占14.23％，共35个；β-转角(t)占10.98％，共27个；无规则卷曲(c)有56个，占22.76％。

TFAM蛋白质的三级结构模型预测结果如图5所示，α螺旋和无规卷曲组成了TFAM蛋白质的三级结构，该结果与蛋白质二级结构一致。

1.3讨论

1.3.1嘉兴黑猪TFAM基因的序列分析

目前，TFAM基因已经陆续在山羊、绵羊、人、小鼠、大鼠等物种中被克隆，尤其是对人、山羊和小鼠中进行了相对深入的功能研究，本发明克隆了嘉兴黑猪TFAM基因序列，并运用生物信息学软件对其结构进行了预测，为以后对其功能的研究提供了基础。

通过对嘉兴黑猪TFAM基因的cDNA序列分析发现，嘉兴黑猪TFAM基因编码246个氨基酸，其蛋白含有20种氨基酸，其中Lys所占比例最高为12.2％，His比例最低为0.4％。根据Blast比对的氨基酸相似性发现，嘉兴黑猪TFAM蛋白的氨基酸与大白猪、绵羊、牛的相似性均在90％以上，说明TFAM基因具有很高的保守型，这几个物种之间TFAM基因的生物学功能类似。根据氨基酸之间的差异，可以看出物种间的亲缘关系。当物种间的氨基酸差异越小，说明亲缘关系越近，反之，越远。系统进化树结果表明牛和猪之间的遗传距离相对较近，两者之间的亲缘关系较近。不同的物种TFAM基因的核苷酸存在着差异。这是物种长期进化的结果。

2.3.2嘉兴黑猪TFAM基因的生物学信息分析

本发明通过预测得到嘉兴黑猪TFAM蛋白的等电点PI为9.62，不稳定系数值为46.20，脂溶系数74.15。经统计分析发现，当蛋白质的不稳定系数＞40时该蛋白质不稳定。这说明TFAM蛋白是不稳定碱性脂溶性蛋白。TFAM蛋白疏水性预测，在第165氨基酸位置有最大值3.933，在第172氨基酸位置有最小值-4.100。蛋白跨膜结构预测分析表明，TFAM氨基酸序列不存在跨膜螺旋结构，这说明TFAM不属于膜蛋白或分泌蛋白。综上所述TFAM蛋白可能在机体的生理调控，信号转导上发挥重要作用。

1.4小结

1.4.1 TFAM的ORF长741bp，可编码246个氨基酸。

1.4.2 TFAM蛋白属于不稳定的碱性脂溶性蛋白，TFAM蛋白疏水性存在最大值3.933，最小值-4.100。另外TFAM氨基酸序列不存在跨膜螺旋结构，不属于膜蛋白或分泌蛋白。

实施例2：TFAM基因在嘉兴黑猪不同组织中的差异表达分析

2.1材料与方法

2.1.1试样材料

2.1.1.1试样样品

选择健康、达上市屠宰体重的嘉兴黑猪10头，巴克夏×嘉兴黑猪5头，长白×嘉兴黑猪5头，杜×巴嘉5头、杜×长嘉5头，巴克夏5头，采集组织时所用剪刀、镊子均经过高温灭菌处理后备用。屠宰后，迅速采集心脏、肝脏、脾、肺、皮脂、腹脂、胃、腿肌8个组织，将它们放进冻存管中，快速的投入到液氮罐中带回实验室，并放于-80℃冰箱保存备用。

2.1.1.2试验仪器

剪刀、镊子、冻存管、液氮、冻存盒、实时荧光定量PCR仪(ABI700Real-TimeSystem，美国)、液氮罐(CK509X4，美国)，反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ均购自宝生物工程(大连)有限公司等。

2.1.2方法

2.1.2.1荧光定量PCR的引物设计

根据克隆得到的TFAM和GenBank中登录的GAPDH基因序列，在荧光引物设计的原则下，运用运用引物设计软件Primer5.0设计引物，由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成，引物信息如下：

表3：荧光定量PCR的引物信息

2.1.2.2 RT-qPCR的反应

荧光定量PCR以GAPDH为内参基因，测定TFAM基因在嘉兴黑猪及其杂交组合和外来品种巴克夏在心脏、肝脏、脾、肺、皮脂、腹脂、胃、腿肌8个组织中的表达水平。RT-qPCR的反应体系如下：

表4：RT-qPCR 20μL反应体系

进行相对定量时的反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。反应结束后查看反应结果，检查引物的特异性是否良好。标准曲线与溶解曲线均达到要求取Ct平均值。

2.1.3数据分析

采用相对定量2^-△△Ct法分析TFAM基因在嘉兴黑猪及其杂交组合和外来品种巴克夏不同品种不同组织中的差异表达量，其中△△Ct＝(△△Ct_目的基因-△△C_{t内参基因})试验组-(△△Ct_目的基因-△△Ct_内参基因)对照组。根据结果整理分析不同品种不同组织中TFAM基因的mRNA表达水平。然后将得到的TFAM基因mRNA在不同品种不同组织中的表达量与肉质性状和胴体性状指标进行关联分析。

2.2结果与讨论

2.2.1 RT-PCR溶解曲线和扩增曲线

从图6可以看出，扩增曲线为平滑的S型曲线，基线平整，拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性好。由图7可知，熔解曲线均为单峰，且重合性好，说明扩增产物单一，引物特异性强，可以用于进一步分析。说明本实验中荧光定量PCR反应特异性和重复性良好，表达定量检测结果可靠。

2.2.2 TFAM基因在嘉兴黑猪不同组织中的表达规律

以GAPDH为内参基因，运用实时荧光定量PCR检测TFAM基因在嘉兴黑猪心、肝、脾、肺、皮脂、腹脂、胃、腿肌共八个组织中的mRNA表达水平。表达结果见图8，TFAM基因在嘉兴黑猪各组织中的表达量依次为：脾＞胃＞肝＞心＞皮脂＞腹脂＞肺＞腿肌，其中肺、腿肌中TFAM基因的表达量与脾、胃、肝、心中的有极显著差异(P＜0.01)，与皮脂中的呈显著差异(P＜0.05)；TFAM基因在脾中的表达量与皮脂有着显著差异(P＜0.05)，在腹脂中的表达量与胃中的有着显著性(P＜0.05)。

2.2.3 TFAM基因表达量与肉质和胴体性状的关联性分析

2.2.3.1 TFAM基因表达量与嘉兴黑猪肉质性状的关联性分析

运用SPSS软件中的相关性进行分析TFAM基因在嘉兴黑猪各组织中的表达量与其肉质性状之间的关联性，由表中结果可知：TFAM基因在嘉兴黑猪肺和腿肌中的表达量均与肉色呈显著正相关(P＜0.05)，在肝脏中的表达量与大理石纹和系水力呈显著正相关(P＜0.05)，与失水率呈显著负相关(P＜0.05)；TFAM基因在皮脂和腿肌中表达量与大理石纹呈显著差异，属于正相关(P＜0.05)。TFB2M基因在嘉兴黑猪脾中的表达量与大理石纹呈显著负相关(P＜0.05)，在胃中的表达量与肉色呈显著负相关(P＜0.05)，在皮脂中的表达量与大理石纹和系水力呈正相关显著差异(P＜0.05)，在腿肌中的表达量与嫩度存在显著差异的正相关(P＜0.05)。其余组织表达量与肉质性状指标之间不存在显著差异的正相关和负相关。

表5：各组织TFAM基因表达量与肉质性状相关分析

注：**，在0.01水平(双侧)上显著相关；*，在0.05水平(双侧)上显著相关。

4.2.3.2 TFAM基因表达量与嘉兴黑猪胴体性状的关联性分析

根据SPSS软件进行分析TFAM基因在嘉兴黑猪各组织中的表达量与其胴体性状指标之间的相关性，得出结果如下：TFAM基因在嘉兴黑猪胃中的表达量与皮脂率呈显著负相关(P＜0.05)，在肝脏中的表达量与6-7肋膘厚呈显著负相关(P＜0.05)而与三点平均膘厚呈显著的正相关(P＜0.05)，在心中的表达量与宰前活重呈极显著的正相关(P＜0.01)，在皮脂中的表达量与6-7肋膘厚呈显著正相关(P＜0.05)而与三点平均膘厚呈极显著的负相关(P＜0.05)，在腿肌中的表达量与6-7肋膘厚和皮脂率呈显著正相关(P＜0.05)。

表6：各组织TFAM基因表达量与胴体性状相关系数

2.2.3.3 TFAM基因表达量与嘉兴黑猪背最长肌中肌内脂肪、肌苷酸、谷氨酸、亚油酸含量的关联性分析

分析TFAM基因在嘉兴黑猪各组织中的表达量与肌内脂肪、肌苷酸、谷氨酸、亚油酸含量的关联性，由表中可知，TFAM基因在嘉兴黑猪脾中的表达量与亚油酸含量有负相关的显著差异(P＜0.05)，在胃中的表达量与谷氨酸含量有着负相关的显著差异(P＜0.05)，在肝脏中的表达量与肌内脂肪含量呈显著正相关(P＜0.05)，在心、皮脂中的表达量与肌苷酸含量呈显著的正相关(P＜0.05)，在皮脂和腿肌中的表达量分别与肌内脂肪含量呈极显著(P＜0.01)和显著的正相关(P＜0.05)。

表7：各组织TFAM基因表达量与主要风味物质的相关分析

2.3讨论

2.3.1嘉兴黑猪TFAM基因组织间表达差异

随着生物技术的快速发展，和定量分析已变成科研研究过程中不可或缺，采用实时荧光定量PCR技术从基因的mRNA水平表达进行定量分析已成为生物领域比较广泛的研究。(钟江华等，2011年)。实时荧光定量PCR技术原理是荧光染料与DNA双链的小沟内结合，导致荧光物质的插入使荧光信号增强，当然在使用该方法时要注意非特异性产物和引物二聚体的产生。(陈旭等，2010年)。本发明是研究基因在个体组织中的相对表达量，而相对表达量需要选取在不同细胞及条件下均稳定表达的基因，常用的内参基因有β-actin、GAPDH、18sRNA等(Radonica et al.,2004)。使用内参基因是为了抵消总RNA提取和cDNA反转录效率的差异。本研究采用Real-Time PCR的技术，并选择GAPDH作为内参基因进行相对定量分析，同时构建了TFAM基因的表达方法。从本试验熔解曲线和扩增曲线的图形中可以看出试验结果准确。

组织表达差异结果显示，TFAM基因在心、肝、脾等8个组织中均有表达，表明TFAM基因在嘉兴黑猪各组织中广泛存在。当然基因在各组织中的表达受多种因素的影响，TFAM也不例外。TFAM基因在脾组织中表达量最高，腿肌中的表达量最低。具体表达量顺序为脾＞胃＞肝＞心＞皮脂＞腹脂＞肺＞腿肌。试验表明，TFAM基因在皮脂和腹脂中有较高表达，这在一定程度上表明TFAM基因在脂肪的形成上有一定的调控作用。脾脏是机体的免疫器官，体液免疫以及细胞免疫均受脾脏调控，研究发现脂肪肝肝组织内的淋巴细胞数目减少，表明其对机体免疫功能产生一定影响，脂肪肝形成的主要原因是脂肪酸在肝脏线粒体内β氧化的减少，TFAM基因在脾中的高表达表明TFAM基因可能在某种程度上对脂肪的调控有一定作用。

2.3.2 TFAM基因表达量与肉质性状和胴体性状的相关研究

大量的研究表明TFAM和TFB2M基因可能对家畜的肉质及胴体性状有一定调控作用。到目前为止，关于TFAM基因的表达量与嘉兴黑猪的肉质及胴体性状的相关研究尚未见报道。因此，在转录组水平上研究TFAM基因的表达量与肉质、胴体性状的关系是一大创新，这对期望从分子水平改善嘉兴黑猪的肉质及胴体性状具有重要意义。

目前关于基因表达量与肉质性状以及胴体性状指标之间相关性分析的研究已有报道。刘吉英等通过real-time PCR检测了肌肉黑素皮激素受体4基因mRNA表达水平，并采用生物统计软件分析了其与IMF的关联性(刘吉英，2011)。孙岩岩(2015)对贵州白山羊TFAM基因表达、多态对肉质、屠宰性状的影响进行研究，发现TFAM基因在肺中的表达量与胴体重呈显著正相关，在垂体中的表达量与系水力呈显著负相关。可通过调控该基因的表达量，探究其对贵州白山羊肉质和屠宰性状的影响。本试验中TFAM基因在嘉兴黑猪肺和腿肌中的表达量均与肉色呈显著正相关(P＜0.05)，在肝脏中的表达量与大理石纹、系水力和三点平均膘厚呈显著正相关(P＜0.05)，与失水率、6-7肋膘厚呈显著负相关(P＜0.05)；TFAM基因在皮脂和腿肌中表达量与大理石纹、6-7肋膘厚呈显著差异，属于正相关(P＜0.05)在皮脂中的表达量与三点平均膘厚呈极显著的负相关(P＜0.05)，在腿肌中的表达量与6-7肋膘厚和皮脂率呈显著正相关(P＜0.05)；在嘉兴黑猪胃中的表达量与皮脂率呈显著负相关(P＜0.05)，在心中的表达量与宰前活重呈极显著的正相关(P＜0.01)，与6-7肋膘厚呈显著正相关(P＜0.05)。TFAM基因在嘉兴黑猪脾中的表达量与亚油酸含量有负相关的显著差异(P＜0.05)，在胃中的表达量与谷氨酸含量有着负相关的显著差异(P＜0.05)，在肝脏中的表达量与肌内脂肪含量呈显著正相关(P＜0.05)，在心、皮脂中的表达量与肌苷酸含量呈显著的正相关(P＜0.05)，在皮脂和腿肌中的表达量分别与肌内脂肪含量呈极显著(P＜0.01)和显著的正相关(P＜0.05)。这些结果表明TFAM基因在嘉兴黑猪肉品质和胴体性状方面具有重要的影响。

TFAM基因在各组织中的表达量的以及其对肉质和胴体性状的影响，为今后开展TFAM基因的功能研究和嘉兴黑猪猪肉品质的改善提供理论依据。

2.3.3 TFAM基因表达量与嘉兴黑猪背最长肌中肌内脂肪、肌苷酸、谷氨酸、亚油酸含量的关联性分析

肌苷酸(Inosinic acid,IMP)，即次黄嘌呤核苷酸，是影响肌肉鲜度的重要物质，其含量的高低可间接反映出肉类食品风味的优劣。肌内脂肪则是影响肌肉嫩度和肉香味的主要物质。肌苷酸和肌内脂肪是反映肌肉品质的重要因素，其含量直接影响肌肉的食用价值，尤其影响肌肉的嫩度和烹调产生的香味。肌苷酸和肌内脂肪是影响肌肉风味的主要物质，其含量亦成为衡量肉制品质的重要指标。氨基酸中的谷氨酸是决定猪肉鲜味的重要物质，还具有形成肉鲜味和缓冲酸、碱等不良味道的特殊功效。在不饱和脂肪酸中亚油酸是人体的必需脂肪酸，必须从膳食中获取，能降低血清胆固醇和血液黏稠度，抑制心脑血管疾病及抗癌，在营养和保健上有重要意义。目前关于TFAM基因与嘉兴黑猪背最长肌中肌内脂肪、肌苷酸、谷氨酸、亚油酸含量的关联性的文章还未见报道。本试验中的TFAM基因在嘉兴黑猪脾中的表达量与亚油酸含量有负相关的显著差异(P＜0.05)，在胃中的表达量与谷氨酸含量有着负相关的显著差异(P＜0.05)，在肝脏中的表达量与肌内脂肪含量呈显著正相关(P＜0.05)，在心、皮脂中的表达量与肌苷酸含量呈显著的正相关(P＜0.05)，在皮脂和腿肌中的表达量分别与肌内脂肪含量呈极显著(P＜0.01)和显著的正相关(P＜0.05)。这说明这个基因可能通过调控猪肉质的风味物质如肌苷酸、肌内脂肪、谷氨酸和亚油酸，影响猪的肉质性状，为以后研究基因与性状的关联分析提供依据。

2.4小结

2.4.1 TFAM基因在嘉兴黑猪各组织中均有表达，TFAM基因在脾、胃和肝脏中的表达量相对较高。

2.4.2可通过调控TFAM基因的表达量，探究其对嘉兴黑猪肉质性状、胴体性状以及背最长肌中的风味物质的影响。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 嘉兴黑猪TFAM 基因特征序列、引物及检测试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 943

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

catgcgctcg ggagctgcac aagattgggg cctggtcagt gctttgtcta cgggtgcaat 60

ggcgcttctc cggggcgtgt ggggcgtgct gagtgccctg ggaaagtcag gagcggacct 120

ctgtgcggtt tgtggaagtc gactgcgctc tccgttcagt tttgcgtatg taccaagatg 180

gttttcatcc accctgagtg gttttccaaa gaagcctatg acttcatacg ttcgattttc 240

taaagaacag ctacccatat ttaaagctca gaacccagat gcaaaaaatt cagaactaat 300

taaaaaaatt gctgagctgt ggagggaact tcctgattca gagaaaaaga tatatgaaga 360

tgcttatagg gcagactggc aggtgtacaa agaagaggta aacagaattc aagaacagct 420

aactccaagt caaatggtat ctttggaaaa agaaatcatg cagaaacgtt taaaaaagaa 480

agcgttaatc aaaaagagag aattaacaat gcttggaaaa ccaaaaagac ctcgatcagc 540

ttataacatt tttattgctg aacgctttca ggaagctaag gatggtccat cacaggtaaa 600

gctgaaaact ataaatgaaa actggaaaaa tctctctagt tctcaaaagc aagtatatat 660

tcaacttgct gaagatgata aagttcgtta ttataatgaa atgaaatctt gggaagaaca 720

aatggttgaa gttgggcgaa acgatcttat acgtcgctca atgaaacatt cagcaaagaa 780

agacactgag gagtgttgaa atagaaggtt gagctatgtt cgtatggtac cccccaaaaa 840

aaacacaatt tataaaaaaa accccccaaa aacaaaccat ccaaaaaaaa aacttcccca 900

ccatattata tttccaaaaa taaaattttt ataaaaacca ata 943

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

ttgcgagttc aagtcgtcat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

ggtttctcgt gtctatccat 20

Claims

1.嘉兴黑猪TFAM基因特征序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.嘉兴黑猪TFAM基因的特异性扩增引物，其引物序列如下：

上游引物：5’-TTGCGAGTTCAAGTCGTCAT-3’；

下游引物：5’-GGTTTCTCGTGTCTATCCAT-3’。

3.一种嘉兴黑猪肉质相关性状检测试剂盒，主要包括嘉兴黑猪TFAM基因特征序列，嘉兴黑猪TFAM基因的特异性扩增引物，以及PCR反应试剂；其特征在于：所述嘉兴黑猪TFAM基因特征序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述特异性扩增引物序列如下：

上游引物：5’-TTGCGAGTTCAAGTCGTCAT-3’；

下游引物：5’-GGTTTCTCGTGTCTATCCAT-3’。

4.权利要求3所述的试剂盒在嘉兴黑猪育种中的应用。