CN110106261A

CN110106261A - 嘉兴黑猪及生肉制品的snp标记组合和鉴定方法

Info

Publication number: CN110106261A
Application number: CN201910462678.4A
Authority: CN
Inventors: 王起山; 潘玉春; 岳阳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-05-30
Also published as: WO2020238218A1; CN110106261B

Abstract

本发明公开了一种嘉兴黑猪及生肉制品的SNP标记组合和鉴定方法，通过提取生猪肉或肉制品的基因组DNA，经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，根据测序结果特点位点的SNP基因型鉴定嘉兴黑猪及其肉制品；所述的Sanger测序，其鉴定位点为：pig2‑60239356、pig8‑5778954、pig7‑37079960、pig13‑16955200和pig13‑111071937位点处出现特异突变；本发明解决现有技术中尚未有嘉兴黑猪及其肉制品相关的鉴定方法的问题。

Description

嘉兴黑猪及生肉制品的SNP标记组合和鉴定方法

技术领域

本发明涉及的是一种食品安全监测领域，具体涉及一种嘉兴黑猪及生肉制品的SNP标记组合和鉴定方法。

背景技术

太湖流域地方品种猪主要有：二花脸猪、梅山猪、枫泾猪、沙乌头猪、米猪、嘉兴黑猪，其中梅山猪因体型大小分为中梅山猪和小梅山猪。太湖流域地方品种猪同根共源，又各具特点，但因其体型外貌相近，尤其是仔猪，在生产中存在混淆的情况，而通过传统体型外貌品种鉴定方法将太湖流域地方品种猪各个品种进行区分难度较大，不利于有效地开展保种和开发利用工作。另一方面，太湖流域地方品种猪肉质鲜美而广受消费者欢迎，其经济价值高于市场常见的杜洛克、长白、大白猪等杂交后代猪肉，因而市场上出现了上述杂交后代猪肉假冒的太湖流域地方品种猪肉销售的情况，以及将上述杂交猪肉掺假在太湖流域地方品种猪肉产品(例如火腿、肉馅等)的销售行为，但传统方法无法对宰杀分割肉和处理后的肉制品进行准确归属判断。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，具有位点丰富、分布广泛、遗传稳定性高、具有代表性、检测便捷快速等特点。而其中，在一定的品种(群体)范围内，只在一个群体中出现的SNP被称作品种特异SNP。品种特异SNP位点筛选和位点组合方法研究是开展品种和制品鉴定的关键。

第三代分子标记SNP相对于前两代分子标记具有变异丰富、对DNA样本要求低、稳定性高、测定准确、检测方法简便且通量高等优点。目前，第三代分子标记SNP已广泛应用于亲子鉴定、动植物品种(品系)鉴定、遗传育种等领域。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种鉴定嘉兴黑猪及生肉制品的SNP标记组合和鉴定方法，利用第三代分子标记鉴别及Sanger测序技术鉴别嘉兴黑猪及生肉制品，解决现有技术中尚未有嘉兴黑猪及其肉制品相关的鉴定方法的问题，提供了一种结果准确、操作简单、价格低廉的鉴定嘉兴黑猪及其肉制品的方法和相关专用引物。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种嘉兴黑猪及生肉制品的SNP标记组合，包括：pig2-60239356、pig8-5778954、pig7-37079960、pig13-16955200和pig13-111071937；所述pig2-60239356表示猪2号染色体第60239356位位点，pig8-5778954表示猪8号染色体第5778954位位点，pig7-37079960表示猪7号染色体第37079960位位点，pig13-16955200表示猪13号染色体第16955200位位点，pig13-111071937表示猪13号染色体第111071937位位点。

进一步地，基于SNP标记组合的嘉兴黑猪及其生肉制品鉴定方法，首先提取待鉴定的生猪肉或肉制品的基因组DNA，然后经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP标记组合各个检测位点的信息，当SNP标记组合任意三个位点处出现特异突变，即可鉴定为嘉兴黑猪及其肉制品。

进一步地，所述的PCR扩增，pig2-60239356处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示，pig8-5778954处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.3～4所示，pig7-37079960处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.5～6所示，pig13-16955200处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.7～8所示，pig13-111071937处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.9～10所示。

进一步地，测序产物鉴定位点对比信息如下表所示：

SNP	REF	ALT
			pig2-60239356	C	T
pig8-5778954	G	A
			pig7-37079960	G	A
pig13-16955200	T	C
			pig13-111071937	G	T

表中REF代表参考基因型，ALT代表突变基因型。

进一步地，所述的鉴定位点信息为：各个检测位点的突变基因型与参考基因型，当待测猪检测位点出现参考基因型时认为该位点没有鉴定意义，当待测猪检测位点出现突变基因型时，认为该位点具有鉴定意义。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明以嘉兴黑猪品种特有SNP位点为鉴定依据，从分子层面研究鉴别嘉兴黑猪的方法，并以Sanger测序为主要分子鉴定方法，能够将嘉兴黑猪与其他猪品种(品系)相互鉴定区分，并能将嘉兴黑猪与常见西方猪种鉴定区分，例如：小梅山猪、枫泾猪、中梅山猪、二花脸猪、米猪、沙乌头猪、长白猪、大白猪、杜洛克、皮特兰、巴克夏等。

具体实施方式

以下对本发明具体实施方式作进一步详细说明。

本发明涉及一种嘉兴黑猪及生肉制品的SNP标记，包括：pig2-60239356、pig8-5778954、pig7-37079960、pig13-16955200和pig13-111071937；所述pig2-60239356表示猪2号染色体第60239356位位点，pig8-5778954表示猪8号染色体第5778954位位点，pig7-37079960表示猪7号染色体第37079960位位点，pig13-16955200表示猪13号染色体第16955200位位点，pig13-111071937表示猪13号染色体第111071937位位点。

本发明提供了一种基于上述SNP标记组合的嘉兴黑猪及生肉制品鉴定方法，首先提取待鉴定的生猪肉或肉制品的基因组DNA，然后经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP标记组合各个检测位点的信息，当SNP标记组合任意三个位点处出现特异突变，即可鉴定为嘉兴黑猪及其肉制品。

所述的PCR扩增，其中涉及的引物如表1所示：

表1扩增位点引物及产物信息

表中F代表上游引物，R代表下游引物，length代表标准产物长度，F'-position代表SNP位点在扩增产物的位置。

所述的PCR扩增，反应体系为模板DNA 1ng/uL、引物1uL、H₂O 3.8uL、2×Taq PCRMasrer Mix 50uL；和/或，所述PCR反应的反应程序为95℃预变性2min，95℃预变性30s，60℃退火温度30s，72℃延伸1min，循环次数30次，72℃再延伸10min。

所述的琼脂糖凝胶的质量浓度为2％。

所述的凝胶电泳，其条带长度要求为如表1所示。

测序产物鉴定位点对比信息如表2所示：

表2测序产物鉴定位点对比信息

SNP	REF	ALT
			pig2-60239356	C	T
pig8-5778954	G	A
			pig7-37079960	G	A
pig13-16955200	T	C
			pig8-5778954	G	T

表中REF代表参考基因型，ALT代表突变基因型。

如表2所示，各个检测位点的突变基因型与参考基因型，当待测猪检测位点出现参考基因型时认为该位点没有鉴定意义，当待测猪检测位点出现突变基因型时，认为该位点具有鉴定意义，例如一头待测猪A在pig2-60239356位点，如果测序数据为C，则认为待测猪A在pig2-60239356位点不具备鉴定意义；如果测序数据为T，则认为待测猪A在pig2-60239356位点具有鉴定意义。

由于单个位点作为鉴定依据的存在假阳性错判，且错判概率较高，所以本发明利用位点组合作为鉴定Marker。

各个品种鉴定位点组合鉴定Marker信息如表3所示。

表3鉴定标记组合信息

如表3所示，Marker1-10为嘉兴黑猪鉴定标记组合，例如当待测猪A具备10个Marker组合中的任意一种位点突变组合的时候，则认为待测猪A为嘉兴黑猪。

所述的嘉兴黑猪肉制品是指嘉兴黑猪分割肉及以嘉兴黑猪为原料加工制备的腌制品和熟食制品。

随机选取待测猪种耳组织样本5份，采用SDS法提取组织DNA。

利用引物对DNA样品进行PCR反应扩增。

PCR反应的反应体系为10uL体系：模板DNA 1ng/uL、引物1uL、H₂O 3.8uL、2×TaqPCR Masrer Mix 50uL；和/或，PCR反应的反应程序为95℃预变性2min，95℃预变性30s，60℃退火温度30s，72℃延伸1min，循环次数30次，72℃再延伸10min。

用2％的琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，凝胶电泳条件为电流10A，电压100伏，时间40分钟。不同引物的扩增产物与表1中的标准产物长度进行比对，产物长度在误差范围内且与标准产物长度一致，则认为扩增结果合格。

将合格的样本PCR扩增产物进行Sanger测序，得到各个检测位点的信息，对测序结果进行分析：

表4样本测序结果SNP多态性分析表

样品/SNP

REF

ALT

1

2

3

4

5

pig2-60239356

C

T

√

pig8-5778954

G

A

√

pig7-37079960

G

A

√

pig13-16955200

T

C

√

pig13-111071937

G

T

√

表中REF代表参考基因型，ALT代表突变基因型，√代表检测到突变基因型。

如表4所示，由测序数据可得，若只采用单一位点作为鉴定依据，一头待测猪同时归属于多个品种。

利用位点组合Marker的方式来进行鉴定：1号猪在pig2-60239356、pig8-5778954、pig7-37079960、pig13-16955200、pig13-111071937位点检测到突变，符合Marker1、Marker2、Marker3、Marker4、Marker5、Marker6、Marker7、Marker8、Marker9、Marker10的鉴定信息，鉴定1号猪为嘉兴黑猪；2号猪在未检测到突变，不符合Marker信息，鉴定2号猪不是嘉兴黑猪；3号猪在pig8-5778954、pig7-37079960、pig13-16955200、pig13-111071937位点检测到突变，符合Marker4、Marker7、Marker9、Marker10，鉴定3号猪为嘉兴黑猪；4号猪在pig2-60239356、pig13-16955200位点检测到突变，不符合Marker信息，鉴定4号猪不是嘉兴黑猪；5号猪在pig13-16955200位点检测到突变，不符合Marker信息，鉴定5号猪不是嘉兴猪。

目前国内外没有关于嘉兴黑猪种及其肉制品品种(品系)鉴定的相关专利，将第三代分子标记运用于嘉兴黑猪及其肉制品品种(品系)鉴定，填补了市场的空缺，有效解决了嘉兴黑猪(品系)的鉴伪问题。该鉴定方法相对于现有利用第一代分子标记(RFLP)和第二代分子标记(SSR)做猪种鉴定的专利，具有操作更加简单、结果更加准确、快速高效的优点。同时本发明利用第三代分子标记SNP克服了前两代分子标记可使用位点少的缺点，相对前两代分子标记的鉴别技术来说，也简化了鉴别方法。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 嘉兴黑猪及生肉制品的SNP标记组合和鉴定方法

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

agtagcagca tattcgcact 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

ctaacattgg cacttcaggc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 3

attcctaagt gatgttttgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 4

agacagaggg tgatgggtaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 5

catcttggga ctcaactgct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 6

cacaaatacg aaaggacacg 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 7

tagggacgca gacccaaggc acagt 25

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 8

ccatgacatt tagattacaa cagaaaggca aag 33

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 9

tgaagatgtg aacaagagcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 10

gatgcccact ttacacctaa 20

Claims

1.一种嘉兴黑猪及生肉制品的SNP标记组合，其特征在于，包括：pig2-60239356、pig8-5778954、pig7-37079960、pig13-16955200和pig13-111071937；所述pig2-60239356表示猪2号染色体第60239356位位点，pig8-5778954表示猪8号染色体第5778954位位点，pig7-37079960表示猪7号染色体第37079960位位点，pig13-16955200表示猪13号染色体第16955200位位点，pig13-111071937表示猪13号染色体第111071937位位点。

2.一种基于权利要求1所述SNP标记组合的嘉兴黑猪及其生肉制品鉴定方法，其特征在于，首先提取待鉴定的生猪肉或肉制品的基因组DNA，然后经PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序，得到SNP标记组合各个检测位点的信息，当SNP标记组合任意三个位点处出现特异突变，即可鉴定为嘉兴黑猪及其肉制品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增，pig2-60239356处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示，pig8-5778954处的上下游引物的序列如SEQ IDNO.3～4所示，pig7-37079960处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.5～6所示，pig13-16955200处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.7～8所示，pig13-111071937处的上下游引物的序列如SEQ ID NO.9～10所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，测序产物鉴定位点对比信息如下表所示：

表中REF代表参考基因型，ALT代表突变基因型。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的鉴定位点信息为：各个检测位点的突变基因型与参考基因型，当待测猪检测位点出现参考基因型时认为该位点没有鉴定意义，当待测猪检测位点出现突变基因型时，认为该位点具有鉴定意义。