CN108347886A

CN108347886A - 具降低疼痛功效的猴头萜、猴头菇菌丝体活性物质、其制备方法、及含其的医药组合物

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Publication number: CN108347886A
Application number: CN201580000569.0A
Authority: CN
Inventors: 刘佩珊; 陈建志; 陈劲初; 李丽雅; 陈婉屏; 林定威; 徐瑞霞; 朱薇静
Original assignee: Grape King Bio Ltd
Current assignee: Grape King Bio Ltd
Priority date: 2015-09-02
Filing date: 2015-09-02
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2035-09-02
Also published as: US11648233B2; JP2018530316A; JP6757405B2; CN108347886B; US20170312247A1; US20200068815A1; WO2017035801A1

Abstract

一种猴头菇活性物质及其制备方法和包含该活性物质的药物组合物，该活性物质通过下列步骤制备：(a)将猴头菇菌丝体置于平板上，在15‑32℃下温育8‑16天；将步骤(a)培养的猴头菇菌丝体接种于烧瓶培养基上，于温度20‑30℃和pH值为4.5‑6.5下培养3‑5天；(c)将步骤(b)培养的猴头菇菌丝体接种于发酵槽培养基上，于温度24‑32℃和pH值为4.5‑5.5下培养8‑16天，得到发酵液；(d)干燥步骤(c)中得到的发酵液，得到猴头菇菌丝体粉末。再用醇溶剂萃取猴头菇菌丝体粉末，得到醇萃取物，再将其纯化分离，得到猴头萜化合物。

Description

具降低疼痛功效的猴头萜、猴头菇菌丝体活性物质、其制备方法、及含其的医药组合物

技术领域

本发明关于一种具降低疼痛功效的活性物质，尤指一种来自猴头菇的活性物质。

背景技术

痛觉神经传递路径与P2R

痛觉的产生需要经过疼痛信号在一连串的神经路径上传递，最后将信息传达到达大脑，始能让人感受到疼痛。痛觉的神经传递路径的起始为刺激的产生，接着疼痛受器会将此刺激转换为神经信号，并将此神经信号传至背根神经节(DRG)，此信号会再经过脊髓，最后到达大脑的视丘痛觉区。在先前的研究中指出，于上述这一连串的神经传导路径上，可看到嘌呤受体(P2-purinoceptor,P2R)的分布，举例如感觉神经、交感神经、副交感神经、及中枢神经，其中感觉神经上的P2R是以P2X₃R及P2X_2/3R为主。

关于P2R与痛觉的神经传递路径的先前技术，列举如下：

1.基因剃除小鼠模式证实P2X₃R、P2X₄R及P2X₇R与疼痛受器痛觉传输、发炎疼痛及神经病变性疼痛有关(Collier et al.,1966；Cockayne et al.,2000；Souslova et al.,2000；Jarvis et al.,2002；Tsuda et al.,2003；Khakh and North,2006；Burnstock,2008；Beggs et al.,2012)。

2.P2X₃R基因剃除鼠ATP于背根神经节(DRG)上没有引起神经电讯传递且阻断了外围痛觉传输入中枢神经(Cockayne et al.,2000)。

3.去除P2X₃R后，福尔马林导致的发炎性疼痛幅度下降(Souslova et al.,2000)。

4.改以P2X₃R拮抗剂可以阻断立即疼痛、发炎疼痛及神经病变痛相关的内脏疼痛(visceral pain)(Jarvis et al.,2002)。

5.在神经受损鼠上，P2X₄R表现量变多，造成长期痛敏现象(Tsuda et al.,2003)。

6.在基因剃除P2X₄R鼠上，发现小鼠无物理伤害引起的痛敏现象，以及缺少外围神经受损传至脊椎的神经信号路径(Ulmann et al.,2008)。

7.在基因剃除P2X₇R鼠上，发现几乎没有发炎与神经病变的痛敏现象(Chessell et al.,2005)。

8.P2X₇R拮抗剂抑制有神经病变痛与发炎疼痛的效果(Honore et al.,2006)。

P2R

P2R依其受器结构以及信号传递路径可分为二大群(Yang and Liang,2012)，分别为P2X_1–7受器以及P2Y_1-14受器。P2X_1–7受器具有二个穿膜区域(transmembrane domains)，且其蛋白质的C端及N端区域皆位于细胞内，除此之外，在细胞外还有一个蛋白质的环状结构(loop)。在P2X_1–7R当中，最小的P2X₄R具有388个氨基酸；最大的P2X₇R具有595个氨基酸。P2XR为阳离子管道型受器，可以让Na⁺及Ca²⁺通过。受器受到刺激后，Ca²⁺会通过P2XR向细胞内流动，使得细胞内游离钙离子浓度上升([Ca²⁺]c↑)，并以细胞内游离钙离子浓度上升([Ca²⁺]c↑)作为二级信号，引起后续的生理反应，将神经信号经由脊髓传回大脑视丘，而产生痛觉。同时细胞内游离钙离子浓度上升([Ca²⁺]c↑)还会影响细胞的分泌作用，具体来说，其可引起神经免疫型细胞释出细胞激素(cytokine)。另一方面，P2Y_1-14受器为G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor，GPCR)，除了P2Y_11-14受器以外，其余P2Y亚型皆和G蛋白(G-protein,Gq)有连结。当Gq被启动后，其可活化磷脂酶C-β(PLC-β)以裂解4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，进而产生1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)，接着IP3会与细胞内质网上的IP3受器结合，储存于内质网的钙离子就会被释放，造成细胞内游离钙离子浓度上升([Ca²⁺]c↑)。据此，P2XR及P2YR(除P2Y_11-14受器)皆可将细胞内游离钙离子浓度的变化作为侦测受器功能的指针。

ATP

ATP是广为人知的能量携带转移生物分子，在1929年Szent-Gyorgyi发现ATP于细胞外也有生物功能，且于1996年，ATP正式被神经科学领域视为神经传导物质。在P2R相关的神经信息传递路径中，ATP被作为P2R的神经传导物质。当神经受到刺激时，ATP会自突触囊泡释出于突触间隙，并刺激突触后神经元上的P2R，接着ATP会于突触间隙快速地被酵素分解。在先前的文献中也支持着上述的神经传递方式的模型，举例如下：

1.ATP媒介于突触前神经与突触后神经信息传递，扮演神经传导物质的角色(Burnstock,2006a；Burnstock,2008)。

2.组织受伤时会释出ATP，刺激痛觉受器上的P2R媒介痛觉。

3.ATP被发现会刺激人体皮肤上P2R媒介引起痛觉(Collier et al.,1966)。

4.ATP在痛觉传导扮演重要角色(Burnstock,2006b；Burnstock,2013)。

止痛药的需求

随着社会人口的高龄化，以及对生活质量要求的逐渐提升，止痛药物的市场有愈来愈大的趋势。在众多种类的疼痛中，较难解决的疼痛为神经病变所导致的神经性疼痛(neuropathic pain)及癌痛(cancer pain)，一则是因为鲜少有有效的药能全面抑制疼痛，再者此类长期性的疼痛症状需要长期服用止痛剂。目前临床上主要有两类止痛药，一种为吗啡类止痛药，另一种为非麻醉性止痛药。吗啡类止痛药若长期施予患者，会有耐受性及依赖性的问题存在，其中耐受性指的是药物的效力会随着施予药物的次数逐次减弱，而必须将施予的剂量加重才可达到一定的止痛效果。非麻醉性止痛药没有麻醉药的不良效应，例如呼吸抑制、习惯性等，又具有止痛抗发炎作用，可降低上升的体温(解热作用)，以减缓发炎症状。这类药物通常用于缓解风湿病、关节炎、坐骨神经痛、退化性关节炎病等疾病，所引起的轻度至中度的疼痛。此类药物又为非类固醇抗发炎剂(NSAID)，其副作用为同时抑制COX-1和COX-2。其中当COX-2被抑制时，会使PGI2减少而产生消炎止痛的作用，但同时亦会促使血小板的凝集。COX-1被抑制时，则会破坏肠胃道黏膜的完整性及影响肾血流，而导致伤胃伤肾等副作用，且会抑制血小板的凝集而较易出血。因此止痛剂的安全性、副作用、成瘾性及耐受去敏感性皆成为需要解决的问题，以发开出更佳的止痛药剂。

猴头菇

麻醉学专家Allen W.Burton说“止痛类新药还不能满足癌症临床的需求药，我们对许多顽固性疼痛患者常感束手无策(Burton et al.,2007)”。因此以新的生物路径为标的，开发安全且有效的止痛药物对当前的临床医学来说是十分重要且迫切需要的。据此，从安全性的考虑出发，由天然食材中寻找各种活性物质，并以此制备成长期服用的药物是当前产业界的趋势。

根据《中国药用真菌》的记载：“猴头菇味甘、性平、能利五脏、助消化、滋补、对消化不良、神经衰退与十二指肠溃疡及胃溃疡有良好的功效”，由此可知在古代医学上已知猴头菇具有治疗疾病的效果，为药膳两用菌。猴头菇学名Hericium erinaceus，其分类于真菌界(Fungi)、真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、担子菌纲(Basidiomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、齿菌科(Hydnaceae)、猴头菌亚科(Hericioideae)中的猴头菌属(Hericium)。猴头菇在外型上，其子实体外形由长条粗糙的突起组成，而成软圆形状，新鲜时成白色，干燥过后则变为黄褐色。猴头菇子实体或菌丝体中抽出物中含有醣类(Wang et al.,2001；Yang et al.,2003)、猴头素(Erinacines)(Saito et al.,1998；Kenmoku et al.,2002；Kenmoku et al.,2004；Watanabe et al.,2007；Watanabe and Nakada,2008；Lee et al.,2014；Li et al.,2014)、双亚麻油酸磷酯乙烯胺(dilinoleoyl-phosphatidylethanolamine；DLPE)(Nagai et al.,2006)、氨基酸、蛋白质及微量元素(Jia et al.,2004)。在过去文献记载中，不乏是猴头菇多醣体具有免疫调解、降血脂、降血糖或是抑制胃部发炎及胃癌产生的效果。至今，日本学者已由液态发酵产物中分离纯化十三种猴头素(A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、P、Q、R)，且猴头素可刺激小鼠星状细胞分泌神经生长因子(NGF)，以治疗智力衰退、神经衰弱等疾病。发明人从猴头菇菌丝体醇精萃取物中分离、纯化、鉴定出新的化合物猴头萜(heripene)，并经实验结果证实该猴头萜具有止痛的效果，详述如后。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猴头萜及猴头菇活性物质的制备方法，其可用于制成具降低疼痛功效的猴头萜、活性物质、以及包含该猴头萜或该活性物质的医药组合物。

为了达到前述目的，本发明提供一种具降低疼痛功效的猴头菇活性物质的制备方法，包含下列步骤：

(a)取一猴头菇菌丝体接种于一平板上，于温度15-32℃培养8-16天；

(b)将步骤(a)培养的猴头菇菌丝体接种于一烧瓶培养基，并于温度20-30℃及pH值4.5-6.5，培养3-5天；

(c)将步骤(b)培养的猴头菇菌丝体接种于一发酵槽培养基，并于温度24-32℃及pH值4.5-5.5，培养8-16天，取得一猴头菇菌丝体发酵液；

(d)将步骤(c)该猴头菇菌丝体发酵液进行干燥，取得一猴头菇菌丝体粉末。

较佳地，前述制备方法中的步骤(b)的培养为震荡培养，其震荡速率为100-250rpm。

较佳地，前述制备方法中的步骤(c)中发酵槽的槽压为0.8-1.2kg/cm²，搅拌速率为10-120rpm，且以通气速率为0.5-1vvm通入一气体至发酵槽。

较佳地，前述制备方法中的该气体为空气、氧气、二氧化碳、氮气、或其组合。

较佳地，前述制备方法中的步骤(b)与步骤(c)中使用相同的培养基。

较佳地，前述制备方法中的该培养基包含综合性碳氮源、动植物来源蛋白或其水解物、无机盐类、醣类、酵母或麦芽抽出物、和消泡剂中的一种或几种的组合。

较佳地，前述制备方法中的综合性碳氮源为谷类或豆类；无机盐类为硫酸盐类或磷酸盐类。

较佳地，将步骤(d)的该猴头菇菌丝体粉末进一步利用一醇类溶剂萃取，获得一猴头菇菌丝体醇萃物。

较佳地，该醇类溶剂为30-100v/v％乙醇或30-100v/v％甲醇。

较佳地，将该猴头菇菌丝体醇萃物进一步利用水及乙酸乙酯萃取，再以管柱色层分析，获得一具有下述结构式(I)的猴头萜(heripene)：

其中R为氢、氢氧基、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烯基、或C₁-C₁₀炔基，其中前述官能团选择性地被含卤素、氧、氮、磷、或硫的取代基所取代；其中第5、6、9、13、14、21、22、及23碳原子的立体结构为R型或S型。

前述官能团选择性地被前述取代基所取代是指，前述两个R的官能团可个别或同时被含卤素、氧、氮、磷、或硫的取代基取代。

较佳地，当该猴头萜结构式(I)的R为氢时，其为一具有下述结构式(II)的猴头素S(erinacine S)：

较佳地，该水及乙酸乙酯的体积比例为1:4。

较佳地，前述制备方法中的该疼痛为神经性疼痛或癌痛。

较佳地，前述制备方法中的该疼痛的信号路径包含嘌呤受体(P2-purinoceptor,P2R)。

本发明又提供一种具降低疼痛功效的猴头菇活性物质，其是以前述制备方法中任一种方法制备而成。

较佳地，前述活性物质是以前述部分制备方法制备而成，其中该猴头菇活性物质为粉末状。

较佳地，前述活性物质是以前述部分制备方法制备而成，其中该猴头菇活性物质为醇萃物。

较佳地，前述活性物质是以前述部分制备方法制备而成，其中该猴头菇活性物质为具有结构式(I)的猴头萜。

较佳地，当该猴头萜结构式(I)的R为氢时，其为一具有结构式(II)的猴头素S。

本发明另提供一种猴头萜化合物，具有结构式(I)。

较佳地，前述猴头萜化合物具有降低疼痛的功效。

本发明另提供一具降低疼痛功效的医药组合物，其包含前述的猴头菇活性物质，以及生物可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂。

本发明再提供一具降低疼痛功效的医药组合物，其包含前述的猴头萜化合物，以及生物可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂。

附图说明

图1显示实施例4中，猴头素S的HPLC分析图谱。

图2显示实施例5第2点中，以RT-PCR检测细胞上P2R受器的基因表现量。

图3显示实施例6第1点中，以荧光剂填充细胞，并侦测细胞上受器的钙信号。其中，(A)人类骨肉瘤HOS细胞、(B)大鼠神经PC12细胞、(C)人类神经瘤SH-SY5Y细胞以ATP刺激所测得的结果；(D)人类神经瘤SH-SY5Y细胞以碳酰胆碱刺激的结果。

图4显示实施例6第2点中，人类骨肉瘤HOS细胞上P2XR亚型所连接的钙信号。

图5显示实施例6第2点中，人类骨肉瘤HOS细胞上P2YR亚型所连接的钙信号。其中，(A)在无钙缓冲液中，以ATP刺激所引起的钙信号；(B)以UTP刺激所引起的钙信号。

图6显示实施例6第3点中，猴头菇菌丝体醇萃物对人类骨肉瘤HOS细胞以ATP刺激的P2R钙信号的影响。

图7显示实施例6第4点中，施予(A)醇萃物与(B)猴头素S，再对人类骨肉瘤HOS细胞以ATP刺激P2R所引起钙信号的抑制效应。

图8显示实施例7第1点中，施予猴头菇醇萃混合物及猴头菇醇萃物，对于延缓短期疼痛效果所进行的闪尾实验的组间比较。

图9显示实施例7第2点中，施予猴头菇醇萃混合物及猴头菇醇萃物，对于延缓短期疼痛效果所进行的闪尾实验的给药前后差值的组间比较。

图10显示实施例7第3点中，施予猴头菇醇萃混合物及猴头菇醇萃物，对于延缓短期疼痛效果所进行的闪尾实验的给药前后差值计算出的最大可能效果的组间比较。

图11显示实施例7第4点中，施予猴头菇醇萃混合物及猴头菇醇萃物，对于延缓长期疼痛效果所进行的加热板实验的组间比较。

具体实施方式

本发明的目的在于提供一种制备方法，通过该方法可以制备来自于猴头菇的各种型态的活性物质，更进一步纯化分离出新颖化合物猴头萜，该猴头萜与该活性物质可再进一步制备成具有降低疼痛功效的医药组合物。

实验原理

建立P2R细胞模式以侦测P2R功能，首先以RT-PCR侦测细胞株上所表现的P2R，再以刺激剂刺激侦测受器功能，由于P2XR及P2YR皆可连接至钙离子信号，因此以细胞内游离钙离子浓度作为受器功能的侦测项目。虽然痛觉可以通过P2R传输于中枢神经系统产生，但是仍需要通过动物行为上的判定，以确认疼痛产生与否，方能确认本发明的活性物质对疼痛降低的效果。故以疼痛闪尾及热痛觉二种行为试验，判定动物活体的痛觉强度。本发明即通过以上痛觉机制的分析，及动物行为上的活体实验分析，从天然的可食用蕈类中，找寻具潜力的止痛活性成分，并进一步开发为含有该猴头素S或该活性成分的医药组合物。

实验方法

菌种来源：

本发明的实施例所用的猴头菇(Hericium erinaceus)菌种已寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，且其寄存编号为CGMCC No.10905，该菌种初始购自于中国台湾食品工业研究(BCRC 35669)，但本发明所述的猴头菇活性物质不限于由此菌种所得。

液体培养：

猴头菇菌丝体的液体培养方式如下，其包括将菌丝体接种于平板上，于适当温度如15-32℃，培养约14天。接着，刮取菌丝并接种于烧瓶内，且使用下列培养基，在20-30℃、pH值4.5-6.5、振荡速率100-250rpm的条件下振荡培养到log期初期，3-5天。最后，将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基(同烧瓶培养基)内，在24-32℃，槽压0.8-1.2公斤/平方公分，及pH值约4.5-5.5，以0.5-1vvm通气速率通入空气，或空气与氧气，二氧化碳或氮气的混合物，较佳为空气，在10-150rpm搅拌速率下培养8-16天，即得猴头菇菌丝体发酵液，其包括菌丝体与澄清液。

培养基配方如下：

其中该综合性碳氮源可为谷类(如：麦粉、麸皮类)或豆类(如：黄豆粉、绿豆粉、大豆粉等)；其中该无机盐类可为硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸铁、硫酸锌等；其中该醣类可为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖等；其中，除上述成分外其余为水。

于发酵槽培养基中可额外添加消泡剂以抑制于培养过程中大量泡沫的生成，其中该消泡剂可为市售的常规消泡剂，如0.01％消泡剂如含硅油、硅树脂的水性消泡剂。具体实施例的培养方法详述如后。

钙信号的荧光侦测：

细胞以钙离子荧光Fura-2/AM填充细胞，以荧光光谱分析仪(SPEX 1681)，于双激发波长340nm及380nm下，测量放射波长505nm所产生的荧光强度改变情形。实验过程中加入ATP刺激P2R，观测荧光变化，最后加入1质量％毛地黄皂苷(digitonin)，使细胞成通透状态，在含2mM Ca²⁺下得到荧光最大比值(Rmax)，再加入乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(ethyleneglycol bis(2-aminoethylether)tetraacetic acid,EGTA)与钙离子结合，得到荧光最小比值(Rmin)，fura-2与Ca²⁺的解离常数(Kd)为225nM。细胞内钙离子浓度由公式求得(Grynkiewicz et al.,1985)。

疼痛闪尾测试：

疼痛闪尾测试(tail flick test或称热敏甩尾试验)(Fukui et al.,2001；Okada et al.,2002)主要是用于测量鼠尾巴部受红外热刺激的痛觉阈值。在实验过程中，小鼠不进行麻醉的情况下，将小鼠尾巴(距尾端1至2公分处)放置于加热面板的特定沟槽上。接着，将红外线光源校正仪的红外线辐射热源开启，其射出的红外光会通过一抛物面反射镜以聚焦在实验动物的尾巴上，当实验动物因此感觉到疼痛，其尾巴便会轻敲台面，此一反应便称为闪尾反应。当闪尾反应发生时，内置传感器能侦测此一反应，并同时记录闪尾反应时间。痛觉阈值可以通过闪尾秒数显示，也可以通过给药前后闪尾秒数的变化值表示，甚至可将闪尾秒数的变化值进一步计算，数据计算表示方式为最大可能影响百分比(Maximal Possible Effect)。计算公式如下：(％MPE)＝(Postdrug latency–Predrug latency)/(Cutoff time-Predrug latency)×100。

小鼠热痛觉测试：

小鼠热痛觉测试(Hot-Plate Test)(Yaksh and Tyce,1979)首先会将加热板预热至一定值温度，接着将实验动物放在金属面板上，施热以刺激实验动物。当实验动物因热而感觉到疼痛时会产生跳跃的反应，称为缩足反应，而从每只实验动物自放在热板上至出现跳跃所需时间，则称为缩足反应时间。最后再以缩足反应的时间代表为实验动物的痛觉阈值。

实施例1：猴头菇菌丝体的培养与其活性物质的制备

平板培养：

将菌丝体接种于平板培养基上，使用马铃薯糊精培养基(Potato Dextrose Agar,PDA)，于25℃培养约7天。

烧瓶培养：

刮取平板上的菌丝接种于烧瓶内，用下列培养基，在约26℃、pH值5.0、于转速120rpm震荡机上，震荡培养5天；

培养基配方：

发酵槽培养：

发酵槽培养所使用的培养基成分同烧瓶培养步骤，将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基内，在26℃、槽压0.5-1.0公斤/平方公分、pH值5.0、10-150rpm搅拌速度或不搅拌(air lift)的情况下，以0.5-1.0vvm通气速率通入空气，培养12天。12天后，便取得发酵液，该发酵液中包括菌丝体与澄清液，并含有具降低疼痛效果的猴头菇活性物质。该发酵液进行冷冻干燥后，即可得猴头菇菌丝体冻干粉(简称冻干粉)，而20公吨的发酵液在经冷冻干燥处理后，可得约80公斤的冻干粉。

实施例2：猴头菇菌丝体活性物质的醇萃取

将猴头菇菌丝体冻干粉加入为冻干粉25倍重量的95v/v％乙醇进行第一次萃取，接着利用超音波震荡以震荡速率120rpm萃取一小时，取悬浮液进行离心，离心后取上清液。将该上清液以85v/v％乙醇进行第二次萃取，重复上述萃取步骤，取得一上清液。最后将该上清液经减压浓缩，得膏状的猴头菇菌丝体醇萃取物(简称醇萃物)。

实施例3：醇萃混合物的制备

取上述等重的冻干粉与醇萃物均匀混合，接着进行离心，取离心后的上清液，将该上清液以冷冻干燥法使其完全干燥，得猴头菇菌丝体/醇萃取混合物(简称醇萃混合物)。

实施例4：猴头素S标准品的制备与分析

猴头素S标准品的制备法为将猴头菇菌丝体醇萃物经由水与乙酸乙酯以1:4的体积比例进行液液分配萃取，所得的乙酸乙酯层再以硅胶及LH-20硅胶管柱色层分析，以正己烷/乙酸乙酯，体积比10:1、3:1、3:2、1:1、1:2、0:1进行梯度冲提，得到7个分层，第3个分层(正己烷/乙酸乙酯为3:2)再以LH-20硅胶管柱色层分析，而得到新化合物，经化学分析鉴定确认结构(如前述结构式(I))并命名为猴头素S(erinacine S)，再以HPLC做定性分析。以逆向层析管柱Cosmosil 5C18-AR-II在40℃下，用起始比例乙腈60体积％冲提，在20分钟内逐渐提升乙腈至65体积％，流速1ml/min，UV侦测波长为290nm，猴头素S滞留时间为14分钟。该HPLC分析结果显示于图1(标示为猴头素S标准品)。图1中，上层曲线为猴头菇菌丝体冻干粉醇萃物，图1下层则为猴头素S标准品(猴头素S的标准品是申请人经由上述方式制备的标准品，以作为萃取物成分中，猴头素S的定量依据)。

实施例2所制得醇萃物的层析曲线于滞留时间2、7、14分钟有峰值出现，与猴头素S标准品比对于14分钟出现的唯一峰值比较后可以确认，其波峰为猴头素S。醇萃物定量猴头素S为59ppm。

通过NMR得出猴头素S氢谱与碳谱，如下表：

实施例5：P2R细胞模式建立与分析

1.细胞培养

使用3种细胞株，分别为大鼠神经PC12细胞株、人类神经瘤SH-SY5Y细胞株及人类骨肉瘤HOS细胞。PC12细胞株以Dulbecco's改良培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,DMEM)的高糖培养基，其中含10体积％马血清(HS)及5体积％胎牛血清(FBS)培养(Kao et al.,2012)。人类神经瘤SH-SY5Y细胞株(Liu et al.,2009)以含10体积％FBS的DMEM/F-12培养基培养。HOS细胞培养于最低基础培养基(Mimimum Essential Medium,MEM)，内含厄尔盐(Earle's salts)、2mM左旋麸酰胺酸(L-glutamine)及0.1mM非必需氨基酸(non-essential amino acids)，其添加有1.5g/l碳酸氢钠(sodium bicarbonate)、1mM丙酮酸钠(pyruvate sodium)，于使用时外加5体积％FBS。于37℃、5体积％二氧化碳的环境下培养，每2-3天更换培养基，并使用胰蛋白酶(Trypsin)-乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)进行继代培养(Liu et al.,2011)。

2.侦测P2R的mRNA

自细胞萃取传讯RNA(messenger RNA,mRNA)，以制作互补DNA(complementary DNA,cDNA)，设计各P2R亚型受器特定的引子，以通过聚合酶链锁反应(Polymerase chain reaction,PCR)放大侦测P2R亚型受器mRNA的表现量。首先，将细胞以磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline,PBS)冲洗，使用RNA II(MACHEREY-NAGEL)套组，经管柱得到mRNA，以ACTGene ASP-2680机器测量RNA浓度。再以Ⅲ Reverse Transcriptase(Invitrogen)反转录酵素(酶) 进行反聚合酶链锁反应(RT-PCR)，将mRNA反转录为cDNA，再通过此cDNA使用Q-Amp^TM 2XHotstart PCR master mix(含Taq DNA polymerase)加上P2R引子进行PCR。将所得到的PCR产物使用1.5体积％胶体，于含有0.5X三硼酸-乙二胺四乙酸(Tris borate edta,TBE；其中，1X TBE意即90mM Tris-borate/2mM EDTA)缓冲液的电泳槽内，进行胶体电泳。电泳电压设定为50伏特，10分钟后，转换电压为100伏特，再经过约15分钟。电泳结束后，胶体以溴化乙锭(Ethidium bromide,EtBr)染色，并将胶体移至照胶系统以紫外光激发，纪录影像，观察细胞株具有的P2R。

于大鼠神经PC12细胞株、人类神经瘤SH-SY5Y细胞株及人类骨肉瘤HOS细胞上以RT-PCR技术检测P2R的基因表现的结果。图2左列为P2X受器各亚型的mRNA的表现量，右列为P2Y受器各亚型的mRNA的表现量，下方则为各细胞株名称。其显示于人类骨肉瘤HOS细胞上侦测到P2XR亚型有P2X₁R、P2X₄R、P2X₅R、P2X₆R、P2X₇R，P2YR亚型有P2Y₁R、P2Y₂R、P2Y₄R、P2Y₆R、P2Y₁₁R；人类神经瘤SH-SY5Y细胞上可侦测到P2XR亚型有P2X₃R、P2X₄R、P2X₅R、P2X₆R、P2X₇R，P2YR亚型有P2Y₁R、P2Y₂R、P2Y₄R、P2Y₁₁R；于大鼠神经PC12细胞上可侦测到P2XR亚型有P2X₂R、P2X₃R、P2X₄R亚型，P2YR亚型有P2Y₁₂R。

实施例6：活性物质对钙信号的抑制效果分析

1.细胞株上侦测P2R连接的钙信号

于大鼠神经PC12细胞株、人类神经瘤SH-SY5Y细胞株及人类骨肉瘤HOS细胞以Fura-2钙离子敏感荧光染剂填充，以侦测细胞内游离钙离子浓度，并通过ATP刺激细胞膜上的P2R，观察细胞内游离钙离子浓度的变化。图3显示人类骨肉瘤HOS细胞(A)、大鼠神经PC12细胞(B)、人类神经瘤SH-SY5Y细胞(C)以0.1mM ATP刺激所测得的受器钙信号变化。然而，由于人类神经瘤SH-SY5Y细胞内的游离钙离子浓度没有变化，因此为排除细胞没有产生钙离子信号的相关生物分子的可能性，便再以0.1mM碳酰胆碱(carbachol)刺激人类神经瘤SH-SY5Y细胞上的乙酰胆碱受器，以确认该细胞确实有钙离子信号的相关分子，其结果显示于图3(D)。

2.P2R各亚型连接的钙信号

比较三种细胞株通过ATP刺激后的P2R连接钙信号，人类骨肉瘤HOS细胞的钙离子浓度变化最为明显，故较能够清晰判别外加药剂对P2R所造成的影响。因此，选择人类骨肉瘤HOS细胞作为材料，并进一步侦测人类骨肉瘤HOS细胞上可连接钙信号的P2R亚型。采用2-MeATP(P2X₁R,P2X₅R亚型选择性刺激剂)、α,β-MeATP(P2X₇亚型选择性刺激剂)、2-MeSATP(P2X₁亚型选择性刺激剂)以及CTP(P2X₄亚型选择性刺激剂)，以检测人类骨肉瘤HOS细胞上的P2R亚型。图4由左到右依序分别通过CTP、2-MeATP、α,β-MeATP、2-MeSATP的亚型受器的专有刺激剂，所引起的钙离子信号，其结果显示人类骨肉瘤HOS细胞上至少可侦测到P2X₁、P2X₄、P2X₅及P2Y₇所连接的钙信号，其中以P2X₄反应最为显著。

P2Y受器连结Gq，刺激受器后可以活化Gq，进而活化磷脂酶C(phospholipase C)，产生IP3，释出细胞内对IP3敏感的钙储池中的钙离子，因此使用无钙离子的缓冲液，于实验中再加入适量EGTA，即可以螯合缓冲液中残留的钙离子，造成细胞外无可流入的钙离子，在此状况下观测细胞内游离钙离子浓度即可观测到单一由细胞内钙储池中释出的钙离子。图5显示P2Y受器所连接的钙信号，(A)图为使用无钙离子的缓冲液下，所观测到的以ATP刺激P2R所连接的钙信号，由于无外钙入流，因此为P2Y受器连接钙信号的反应，(B)图为以UTP(P2Y2及P2Y4的刺激剂)刺激细胞所引起的钙信号。图5的结果显示，人类骨肉瘤HOS细胞上至少可侦测到P2Y₂R及P2Y₄R所连接的钙信号。

3.猴头菇活性物质抑制P2R连接的钙信号

ATP是P2R在身体内的本体刺激剂，因此采用0.1mM ATP刺激P2R受器。在以ATP刺激P2R引起钙信号前，加入猴头菇醇萃物，由于二级信号相当于受器受刺激后的生理反应，因此由图6可以看出，ATP所引起的P2R的钙信号被完全抑制，而推得猴头菇醇萃物可以抑制P2R功能。前述实验已证实HOS细胞上有各种P2XR及P2YR，猴头菇萃取物即可完全抑制P2R受器功能，因此合理推测猴头菇萃取物对P2X₁、P2X₄、P2X₅及P2Y₇以及P2Y₂及P2Y₄等受器，都有抑制的效果。

4.猴头菇活性物质与猴头素S抑制功能与浓度的相关性

图7(A)显示施予不同浓度2.5、5、50g/ml的猴头菇醇萃物，及图7(B)显示施予不同浓度5、10、15g/ml的猴头素S对人类骨肉瘤HOS细胞以ATP刺激P2R受器所引起的细胞内钙离子的浓度变化，皆有抑制的效果，且随着施予的剂量越大该抑制效果越加显著，表示施予剂量与抑制效果具浓度相关性。

实施例7：猴头菇活性物质对降低动物的疼痛效果测定

本实施例将实施例2所得的醇萃物与实施例3所得的醇萃混合物，通过闪尾实验及加热板实验，观察在短期与长期施予猴头菇活性物质后，小鼠对于外在刺激的疼痛反应于给药前后的差异。

1.短期施予猴头菇活性物质的闪尾试验

本次实验分为三组分别为对照组、猴头菇菌丝体/醇萃取物组(醇萃混合物组)、以及猴头菇醇萃取物组(醇萃物组)。每组5只C57BL/6Narl八周以上公鼠，施药方式为以软管喂食2500mg/kg，对照组则是给予等量的水，并分别在给药前、给药30分钟后、以及给药60分钟后以闪尾试验侦测小鼠痛觉。其实验结果以平均±标准偏差表示，并以student’s t test进行统计，以分析醇萃物组、醇萃混合物组与对照组间的差异度。由此，观察短期施予活性物质对降低疼痛的效果，并将其结果显示于图8。

于给药前，先进行闪尾基础值的测试，3组的闪尾秒数依序分别为对照组4.1±1.5秒；醇萃混合物组4.3±1.9秒；醇萃物组4.5±1.2秒。其中，醇萃混合物组与对照组间student’s t test的p值组间0.8；醇萃取组与对照组间student’s t test的p值0.6；醇萃混合物组与醇萃物组间student’s t test的p值0.8，表示给药前组间并没有显著差异。

于给药30分钟后，以闪尾试验侦测小鼠的痛觉反应，实验结果为对照组闪尾秒数2.0±0.5秒；醇萃混合物组的闪尾秒数6.2±1.6秒；醇萃物组闪尾秒数8.4±1.1秒。醇萃混合物组与对照组间student’s t test的p值0.0008，有显著差异；醇萃物组与对照组间student’s t test的p值0.000009，有显著差异；醇萃混合物组与醇萃物组间student’s t test的p值0.07，没有显著差异。

于给药60分钟后，以闪尾试验侦测小鼠的痛觉反应，实验结果为对照组闪尾秒数2.1±0.57秒；醇萃混合物组闪尾秒数5.7±2.46秒；醇萃物组闪尾秒数7.2±1.9。醇萃混和物组与对照组间student’s t test的p值0.0256，有显著差异；醇萃物组与对照组间student’s t test的p值0.0016，有显著差异；醇萃混合物组与醇萃物组间student’s t test的p值0.33，没有显著差异。

2.短期施予猴头菇活性物质的闪尾试验的给药前后差值

本次实验条件类似于上述“短期施予猴头菇活性物质的闪尾试验”的条件，其比较醇萃物组、醇萃混合物组、与对照组间的闪尾时间相差值的差异。由此，观察短期施予活性物质对降低疼痛的效果，并将其结果显示于图9。

于给药30分钟后，以闪尾试验侦测小鼠的痛觉反应，实验结果为对照组闪尾秒数较给药前对照组闪尾基础值短，相差值为-2.1±1.7秒；醇萃混合物组闪尾秒数较用药前长，相差值为2.6±2.18秒；醇萃物组闪尾秒数较用药前长，相差值为3.9±1.61秒。醇萃混合物组与对照组间student’s t test的p值0.008，有显著差异；醇萃物组与对照组间student’s t test的p值0.00108，有显著差异；醇萃混合物组与醇萃物组间student’s t test的p值0.35，没有显著差异。

于给药60分钟后，以闪尾试验侦测小鼠的痛觉反应，实验结果为对照组闪尾秒数较给药前对照组闪尾基础值短，相差值为-1.0±0.71秒；醇萃混合物组闪尾秒较用药前长，相差值为2.0±2.53秒；醇萃物组闪尾秒数较用药前长，相差值为2.6±1.77秒。醇萃混合物组与对照组间student’s t test的p值0.033，有显著差异；醇萃物组与对照组间student’s t test的p值0.0028，有显著差异；醇萃混合物组与醇萃物组间student’s t test的p值0.66，没有显著差异。

3.短期施予猴头菇活性物质的闪尾试验的最大可能影响百分比

本次实验条件类似于上述“短期施予猴头菇活性物质的闪尾试验”的条件，计算最大可能影响百分比(maximal possible effects，MPE)，将给药后侦测到的闪尾秒数减去给药前闪尾秒数(单一小鼠闪尾基础值)，并将此差值除以单一小鼠闪尾基础值，即得最大可能影响百分比。由此，观察短期施予活性物质对降低疼痛的效果，并将其结果显示于图10。

于给药30分钟后，以闪尾试验侦测小鼠的痛觉反应，实验结果为对照组闪尾秒数较给药前对照组闪尾基础值短，约缩短基础值一半；醇萃混合物组闪尾秒数较用药前长；醇萃物组闪尾秒数较用药前长约一倍。醇萃混合物组与对照组间student’s t test的p值0.03，有显著差异；醇萃物组与对照组间student’s t test的p值0.0134，有显著差异；醇萃混合物组与醇萃物组间student’s t test的p值0.31，无显著差异。

于给药60分钟后，以闪尾试验侦测小鼠的痛觉反应，实验结果为对照组闪尾秒数较给药前闪尾基础值短；醇萃混合物组闪尾秒数较用药前长约一倍；醇萃物组闪尾秒数较用药前长。醇萃混合物组与对照组间student’s t test的p值0.05，有显著差异；醇萃物组与对照组间student’s t test的p值0.004，有显著差异；醇萃混合物组与醇萃物组间student’s t test的p值0.61，没有显著差异。由此推测，猴头菇活性物质有立即降低疼痛的效果，该降低疼痛的效果至少可持续60分钟。

4.长期施予猴头菇活性物质的热痛觉试验

为测验长期施予猴头菇活性物质是否能延缓加热板所引起的痛觉反应，在长期痛觉方面，喂食2500mg/kg的活性物质达3天，每次喂食间隔为24小时。接着于喂食活性物质3天后，进行热痛觉(hot plate)试验，测量抬脚(paw lifting)、舔脚(licking)或跳跃(jumping)的次数，并将其结果显示于图11。

于给药3天后，其实验结果显示，对照组缩足反应时间为6.4±1.8秒；醇萃混合物组缩足反应时间为11.7±2.5秒；醇萃物组缩足反应时间延长至11.5±1.8秒。醇萃混合物组与对照组间student’s t test的p值0.005，有显著差异；醇萃物组与对照组间student’s t test的p值0.0025，有显著差异；醇萃混合物组与醇萃物组间student’s t test的p值0.09，无显著差异。

于给药3天第一次侦测热痛觉反应的30分钟后，以同样实验方法再次测量缩足反应时间。其实验结果显示，对照组缩足反应时间为6.3±0.8秒；醇萃混合物组缩足反应时间为11.8±2.5秒；醇萃物组缩足反应时间为8.9±1.2秒。醇萃混合物组与对照组间student’s t test的p值0.007，有显著差异；醇萃物组与对照组间student’s t test的p值0.010；醇萃混合物组与醇萃物组间student’s t test的p值0.09，无显著差异。

将喂食3天后第一次测量的数据及30分钟后测量的数据合并计算，其实验结果显示，对照组缩足反应时间为5.7±2.4秒；醇萃混合物组缩足反应时间为11.7±2.3秒；醇萃物组缩足反应时间为10.3±2.0秒。醇萃混合物组与对照组间student’s t test的p值0.00006，有显著差异；醇萃物组与对照组间student’s t test的p值0.0003，有显著差异；醇萃混合物组与醇萃物组间student’s t test的p值0.81，无显著差异。

根据此动物试验，醇萃混合物与醇萃物在短期的作用效果观察上，给药30分钟后降低疼痛的效果显著，给药60分钟后降低疼痛的效果有下降的趋势。在长期的喂食醇萃混合物与醇萃物的试验中，有去敏现象发生，降低痛觉的效果也趋向稳定。

综上所述，本发明提供的猴头菇的活性物质，包含：猴头菇菌丝体、猴头菇醇萃物、猴头菇醇萃混合物及猴头素S都经实验证明具有降低疼痛的功效，可广泛应用于治疗减缓疼痛的各项用途。

Claims

一种具降低疼痛功效的猴头菇活性物质的制备方法，包含下列步骤：

(a)取一猴头菇菌丝体接种于一平板上，于温度15-32℃培养8-16天；

(b)将步骤(a)培养的猴头菇菌丝体接种于一烧瓶培养基，并于温度20-30℃及pH值4.5-6.5，培养3-5天；

(c)将步骤(b)培养的猴头菇菌丝体接种于一发酵槽培养基，并于温度24-32℃及pH值4.5-5.5，培养8-16天，取得一猴头菇菌丝体发酵液；

(d)将步骤(c)的该猴头菇菌丝体发酵液进行干燥，获得一猴头菇菌丝体粉末。
如权利要求1所述的制备方法，其中步骤(b)的培养为震荡培养，其震荡速率为100-250rpm。
如权利要求1所述的制备方法，其中步骤(c)中发酵槽的槽压为0.8-1.2kg/cm²，搅拌速率为10-150rpm，且以通气速率为0.5-1vvm通入一气体至发酵槽。
如权利要求3所述的制备方法，其中该气体为空气、氧气、二氧化碳、氮气、或其组合。
如权利要求1所述的制备方法，其中步骤(b)与步骤(c)中使用相同的培养基。
如权利要求5所述的制备方法，其中该培养基包含综合性碳氮源、动植物来源蛋白或其水解物、无机盐类、醣类、酵母或麦芽抽出物、和消泡剂中的一种或几种组合。
如权利要求6所述的制备方法，其中该综合性碳氮源为谷类或豆类；该无机盐类为硫酸盐类或磷酸盐类。
如权利要求1所述的制备方法，其中将步骤(d)的该猴头菇菌丝体粉末进一步利用一醇类溶剂萃取，获得一猴头菇菌丝体醇萃物。
如权利要求8所述的制备方法，其中该醇类溶剂为30-100v/v％乙醇或30-100v/v％甲醇。
如权利要求8所述的制备方法，其中将该猴头菇菌丝体醇萃物进一步利用水及乙酸乙酯萃取，再以管柱色层分析，获得一具有下述结构式(I)的猴头萜：

其中R为氢、氢氧基、C₁-C₁₀烷基、C₁-C₁₀烯基、或C₁-C₁₀炔基，其中前述官能团选择性的被含卤素、氧、氮、磷、或硫的取代基所取代；

其中第5、6、9、13、14、21、22、及23碳原子的立体结构为R型或S型。
如权利要求10所述的制备方法，当该猴头萜结构式(I)的R为氢时，其为一具有下述结构式(II)的猴头素S：
如权利要求10所述的制备方法，其中该水及乙酸乙酯的体积比例为1:4。
如权利要求1所述的制备方法，其中该疼痛为神经性疼痛或癌痛。
如权利要求13所述的制备方法，其中该疼痛的信号路径包含嘌呤受体。
一种具降低疼痛功效的猴头菇活性物质，其是以权利要求1-14中任一项所述的方法制备而成。
如权利要求15所述的活性物质，当以权利要求1-7中任一项所述的方法制备时，其中该猴头菇活性物质为粉末状。
如权利要求15所述的活性物质，当以权利要求8或9所述的方法制备时，其中该猴头菇活性物质为醇萃物。
如权利要求15所述的活性物质，当以权利要求10或12所述的方法制备时，其中该猴头菇活性物质为具有结构式(I)的猴头萜。
如权利要求18所述的活性物质，其中当该猴头萜结构式(I)的R为氢时，其为一具有结构式(II)的猴头素S。
一种猴头萜化合物，其具有结构式(I)。
如权利要求20所述的猴头萜化合物，当该猴头萜结构式(I)的R为氢时，其为一具有结构式(II)的猴头素S。
如权利要求20所述的猴头萜化合物，其具有降低疼痛的功效。
一种具降低疼痛功效的医药组合物，其包含权利要求15-19中任一项所述的猴头菇活性物质，以及生物可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂。
一种具降低疼痛功效的医药组合物，其包含权利要求20-22中任一项所述的猴头萜化合物，以及生物可接受的载剂、赋形剂、稀释剂或辅剂。