CN113303168B

CN113303168B - Egta在增效氯化钙于香菇培养中富钙降镉能力的应用

Info

Publication number: CN113303168B
Application number: CN202110788730.2A
Authority: CN
Inventors: 沈玥; 黄现青; 乔明武; 宋莲军; 程永霞; 李宁; 赵秋艳; 张平安; 马燕; 张蓓; 李倩; 张西亚; 毛烨炫; 王田林; 赵培均; 丁晓
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-07-13
Filing date: 2021-07-13
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2041-07-13
Also published as: CN113303168A

Abstract

本发明属于香菇培养领域，涉及镉胁迫下的香菇培养，特别是指EGTA在增效氯化钙于香菇培养中富钙降镉能力的应用。所述香菇采用液体培养基进行培养。所述体培养基中EGTA的终浓度为12 mmol/L，氯化钙的终浓度为2‑27g/L。本申请的研究发现，在镉胁迫情况下，单独添加EGTA后只可见极少数的香菇菌丝，这说明说明添加EGTA不能减缓对镉造成的伤害，相反会给香菇菌丝造成更大的伤害，但是在添加氯化钙后，香菇菌丝不仅恢复到正常状态，而且生长的更好，经检测，香菇中的镉浓度降低了92.8%‑96.6%，钙浓度提高15‑248倍。

Description

EGTA在增效氯化钙于香菇培养中富钙降镉能力的应用

技术领域

本发明属于香菇培养领域，涉及镉胁迫下的香菇培养，特别是指EGTA在增效氯化钙于香菇培养中富钙降镉能力的应用。

背景技术

香菇不仅营养丰富，还有抗癌、提高免疫力等生理活性。因此，香菇不仅能直接食用，也能作为功能性食品的原料，越来越受到世界各国的青睐，需求量快速增加。我国是世界上香菇的种植和出口大国，栽培香菇一般采用秸秆和木屑培养基。香菇对环境中重金属很敏感，这样的培养基易使香菇中重金属尤其是镉富集，导致镉超标，影响香菇生长，从而影响香菇的产量及质量。另外，人们食用镉超标的香菇后，超标的镉进入人体，对人体免疫力、肝肾等都有较大危害，严重的将会致癌。因此，控制香菇中镉含量，对提高香菇安全性有重大意义。

香菇中钙含量较低，不能满足人们的需要，因此提高香菇中钙含量，对提高香菇营养品质有重大意义。专利ZL 20191111419.3公开了一种降低香菇菌丝中镉含量的方法，该方法通过向培养基中添加低浓度的EDTA，利用EDTA络合金属的能力实现重金属镉含量的降低；专利 201310551811.6通过向培养基中添加石膏来提高香菇菌丝中钙含量；EDTA不仅能吸附培养基中的镉，也能吸附石膏中的钙，若将EDTA与石膏同时使用时，石膏与镉同时在培养基质中，EDTA螯合镉同时也会螯合钙，由于石膏易溶，钙离子更易溶出，EDTA在降低镉含量的同时会降低大量的钙，如何能在提高香菇中钙含量的同时降低重金属镉的含量是本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种EGTA在增效氯化钙于香菇培养中富钙降镉能力的应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

EGTA在增效氯化钙于香菇培养中富钙降镉能力的应用，所述香菇采用液体培养基进行培养。

所述体培养基中EGTA的终浓度为12 mmol/L，氯化钙的终浓度为2-27g/L。

所述香菇培养中采用的为香菇菌丝。

上述的应用适用于镉胁迫情况下的香菇培养。

上述的应用在培育镉浓度降低92.8%-96.6%同时钙浓度升高15-248倍的香菇品种中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、利用本申请的技术方案培养的香菇镉浓度降低92.8%-96.6%，保障香菇安全性，钙浓度提高15-248倍，提高香菇营养品质。

2、本申请的研究发现，在镉胁迫情况下，单独添加EGTA后只可见极少数的香菇菌丝，这说明说明添加EGTA不能减缓对镉造成的伤害，相反会给香菇菌丝造成更大的伤害，但是在添加氯化钙后，香菇菌丝不仅恢复到正常状态，而且生长的更好，经检测，香菇中的镉浓度降低了92.8%-96.6%，钙浓度提高15-248倍。

3、本申请研究发现镉能引起菌丝体内氧化胁迫。丙二醛是脂质过氧化反应的终产物，能引起蛋白质、核酸等大分子的交联聚合，且具有细胞毒性，引起细胞损伤；在镉污染条件下添加氯化钙和EGTA，丙二醛浓度恢复至正常状态，单独添加EGTA没有添加氯化钙时，一方面，EGTA进入体内，螯合了香菇菌丝的内源钙，菌丝严重缺乏营养元素从而导致菌丝死亡，另一方面，EGTA促使Cd进入菌丝中，菌丝中Cd浓度过高从而导致菌丝死亡；添加氯化钙后，香菇菌丝内的Ca²⁺通道打开，总体显著降低了MDA的含量，并增强了SOD、CAT和GSH等抗氧化物质的活性，降低了香菇菌丝中Cd的毒性使其生长恢复到CK组，甚至促进菌丝生长。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同处理下的香菇菌丝生长状况，其中CK为对照组，Cd为2 mg/L Cd处理组，CK+EGTA为EGTA处理组, Cd+EGTA为2 mg/L Cd+EGTA处理组, 10+EGTA为2 mg/L Cd+10 mg/L Ca+EGTA处理组，20+EGTA为2 mg/L Cd+20 mg/L Ca+EGTA处理组，50+EGTA为2 mg/L Cd+50 mg/L Ca+EGTA处理组，70+EGTA为2 mg/L Cd+70 mg/L Ca+EGTA处理组，100+EGTA为2mg/L Cd+100 mg/L Ca+EGTA处理组，150+EGTA为2 mg/L Cd+150 mg/L Ca+EGTA处理组。

图2为不同处理下香菇菌丝中Cd和Ca的含量，其中CK为对照组，Cd为2 mg/L Cd处理组， 10 Ca为2 mg/L Cd+10 mg/L Ca+EGTA处理组，20 Ca为2 mg/L Cd+20 mg/L Ca+EGTA处理组，50 Ca为2 mg/L Cd+50 mg/L Ca+EGTA处理组，70 Ca为2 mg/L Cd+70 mg/L Ca+EGTA处理组，100 Ca为2 mg/L Cd+100 mg/L Ca+EGTA处理组，150 Ca为2 mg/L Cd+150 mg/L Ca+EGTA处理组。不同小写字母表示差异显著 (p<0.05)。

图3为不同处理下培养基中剩余Cd和Ca的含量，CK为对照组，CK+EGTA为EGTA处理组, Cd为2 mg/L Cd处理组，Cd+EGTA为2 mg/L Cd+EGTA处理组,10 Ca为2 mg/L Cd+10 mg/L Ca+EGTA处理组，20 Ca为2 mg/L Cd+20 mg/L Ca+EGTA处理组，50 Ca为2 mg/L Cd+50mg/L Ca+EGTA处理组，70 Ca为2 mg/L Cd+70 mg/L Ca+EGTA处理组，100 Ca为2 mg/L Cd+100 mg/L Ca+EGTA处理组，150 Ca为2 mg/L Cd+150 mg/L Ca+EGTA处理组。不同小写字母表示差异显著 (p<0.05)。

图4为不同处理下香菇菌丝中MDA、SOD、CAT和GSH的活性，其中CK为对照组，Cd为2mg/L Cd处理组， 20 Ca为2 mg/L Cd+20 mg/L Ca+EGTA处理组，50 Ca为2 mg/L Cd+50 mg/L Ca+EGTA处理组，70 Ca为2 mg/L Cd+70 mg/L Ca+EGTA处理组，100 Ca为2 mg/L Cd+100mg/L Ca+EGTA处理组，150 Ca为2 mg/L Cd+150 mg/L Ca+EGTA处理组。不同小写字母表示差异显著 (p<0.05)。

图5为不同处理下香菇菌丝的扫描电镜图，其中a.为CK组，b.为Cd处理组，c.为2mg/L Cd+70 mg/L Ca+EGTA处理组，d.为2 mg/L Cd+100 mg/L Ca+EGTA处理组。

图6为2mg/L镉胁迫下，添加20mg/L的氯化钙、12mmol/L的EGTA对215菌株菌丝生长情况的影响，其中A麦芽浸粉：菌丝在麦芽浸粉培养基中生长情况，B为Cd：2mg/L镉胁迫下，菌丝在麦芽浸粉培养基中生长情况，C为12 EGTA：菌丝在添加12mmol/L EGTA的麦芽浸粉培养基中生长情况，D为Cd+12 EGTA：2mg/L镉胁迫下，菌丝在添加12mmol/L EGTA的麦芽浸粉培养基中生长情况，E为Cd+20Ca+12 EGTA：2mg/L镉胁迫下，菌丝在添加20mg/L氯化钙和12mmol/L EGTA的麦芽浸粉培养基中生长情况。

图7为2mg/L镉胁迫下，添加100mg/L的氯化钙、12mmol/L的EGTA对215菌株菌丝生长情况的影响，其中A麦芽浸粉：菌丝在麦芽浸粉培养基中生长情况，B为Cd：2mg/L镉胁迫下，菌丝在麦芽浸粉培养基中生长情况，C为12 EGTA：菌丝在添加12mmol/L EGTA的麦芽浸粉培养基中生长情况，D为Cd+12 EGTA：2mg/L镉胁迫下，菌丝在添加12mmol/L EGTA的麦芽浸粉培养基中生长情况，E为Cd+100Ca+12 EGTA：2mg/L镉胁迫下，菌丝在添加100mg/L氯化钙和12mmol/L EGTA的麦芽浸粉培养基中生长情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一、本申请采用的实验材料：

供试香菇菌种：本研究使用的菌株是从河南省泌阳县真菌研究所获得的香菇菌株215。

培养基配方：麦芽浸粉20 g、蛋白胨2 g、酵母浸粉1 g、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）2-27mg、CaCl 10-320mg、去离子水1000 ml。

二、实验方法：

2.1 香菇菌丝体的制备

在25℃，150 r/min的条件下，将菌株在麦芽糖培养基中摇床培养20天进行活化。在接种时使所有处理组中的镉浓度达到2 mg/L，然后分别使培养基中含有12 mmol/L EGTA以及10 mg/L Ca、20 mg/L Ca、50 mg/L Ca、70 mg/L Ca、100 mg/L Ca和150 mg/L Ca（10mg/L Ca+EGTA为2 mg/L Cd+10 mg/L Ca+12 mmol/L EGTA、20 mg/L Ca+EGTA为2 mg/L Cd+20 mg/L Ca+12 mmol /L EGTA、50 mg/L Ca+EGTA为2 mg/LCd+50 mg/L Ca+12 mmol/LEGTA、70 mg/L Ca+EGTA为2 mg/L Cd+70 mg/L Ca+12 mmol /L EGTA、100 mg/L Ca+EGTA为2 mg/L Cd+100 mg/L Ca+12 mmol/L EGTA、150 mg/L Ca+EGTA为2 mg/L Cd+150 mg/L Ca+12 mmol/L EGTA处理组），在25℃，150 r/min的条件下摇床培养20天。然后离心收获菌丝体并用去离子水洗涤三次，洗涤后的菌丝进行下一步的实验操作或者放置于-80℃冰箱保存。

2.2 10%组织匀浆的制备

取适量洗涤后的体于研钵中，加入适量液氮，快速研磨成粉，取粉末称重，按重量（g）：体积（ml）=1:9的比例，加入9倍体积的生理盐水，涡旋混匀，3500 r/min离心10 min后取上清即10%匀浆上清液。

2.3 金属含量的测定

洗涤后的菌丝65℃烘干48 h获得香菇菌丝样品。每个样品称取约0.3 g（干重）和5ml硝酸进行微波消解，消化后的样品稀释至50 ml，然后用ICP-MS进行元素分析。测定方法按照GB 5009.268-2016。

2.4 Bradford蛋白浓度测定

取10%组织匀浆，按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书进行测定。标准曲线为y=0.1419x + 0.3828，R²=0.9963。

2.5 MDA、SOD、CAT、GSH含量测定

取10%组织匀浆，分别按照MDA、SOD、CAT、GSH测定试剂盒说明书对其含量进行测定，结果按照组织中蛋白浓度来表示。

2.6 扫描电镜分析

将洗涤后的香菇菌丝在4℃ 2.5 %的戊二醛中（0.1M pH7左右的PBS缓冲液配置）固定浸泡4小时以上，然后采用0.1M pH为7左右的PBS缓冲液洗涤三次，每次10~15 min；接着用梯度乙醇（30%、 50%、 70%、 90%、 100%、 100%）对样品进行脱水，每次 5~10 min；再用无水乙醇与醋酸异戊酯（1:1）置换一次，100%醋酸异戊酯置换两次，每次置换5~10 min；最后用二氧化碳临界干燥仪进行干燥，喷金，在15.0 KV加速电压下观察菌丝形貌。

实施例1

取样香菇菌株215品种，在麦芽浸粉液体培养基中添加2mg/L的氯化镉和10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、70 mg/L、100 mg/L和150 mg/L Ca+EGTA对于香菇菌丝生长状况的影响，结果见图1。

由图1可知，CK组菌丝生长正常，Cd处理组的菌丝量明显少于其他组，说明Cd确实对香菇菌丝造成毒害，影响其正常生长。CK+EGTA和Cd+EGTA处理组的菌丝没有生长，可能是因为在没有添加外源钙的情况下，EGTA进入体内，添加 EGTA螯合了香菇菌丝的内源钙，菌丝严重缺乏营养元素从而导致菌丝死亡，有研究中发现单独添加EGTA可显著增加植物中总Cd含量，所以也有可能是菌丝中Cd浓度过高从而导致菌丝死亡。10+EGTA处理组的菌丝虽然有所生长，但是明显少于CK组和Cd处理组，推测是因为EGTA螯合外源钙后又螯合了大部分内源钙，严重影响了菌丝的生长。与Cd处理组相比，其余Ca+EGTA处理组的菌丝生长量增加，说明EGTA和不同浓度Ca的组合处理降低了香菇菌丝中Cd的毒性使其恢复到CK组，甚至促进菌丝生长，进一步表明Cd的吸收和转运与Ca的转运密切相关。

①、低镉胁迫下Ca+EGTA对香菇菌丝中镉、钙含量的影响

在低镉胁迫下外源添加10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、70 mg/L、100 mg/L和150 mg/L Ca+EGTA对于香菇菌丝中镉、钙含量的影响，研究结果见图2。

由图2可知：外源添加EGTA和不同浓度的Ca可以显著降低香菇菌丝中Cd的含量，10Ca处理组的Cd含量是最低的，但是菌丝不能正常生长；20 Ca、70 Ca、100 Ca和150 Ca四个处理组之间没有显著性差异（p >0.05），说明在2 mg/L Cd处理下外源添加一定浓度的Ca+EGTA可以抑制香菇菌丝对Cd的吸收。与CK组和Cd处理组相比，Ca+EGTA处理组的Ca含量显著增加（p<0.05），10Ca处理组除外；且随着Ca浓度的增加，菌丝中的Ca含量也在增加，尤其是150 mg/L Ca+Cd处理组的Ca含量明显高于其他组。

②、低镉胁迫下Ca+EGTA对培养基中镉、钙含量的影响

为了验证香菇菌丝中增加的Cd和Ca是否来源于培养基，对培养基中Cd和Ca的含量进行了测定，结果见图3。

由图3可知，培养基中Cd和Ca的含量与菌丝中Cd和Ca的含量相对应。如图3-3所示，Cd处理组的Cd含量显著高于CK组（p <0.05），其余Ca+EGTA处理组的Cd含量和Ca含量高于Cd处理组，这与菌丝中的Cd、Ca含量的变化规律相一致。CK+EGTA处理组的Ca含量显著高于CK组（p <0.05），但是该处理下菌丝死亡，这种现象可能是由于菌丝在EGTA的处理下释放Ca所致。Cd+EGTA处理组的Cd含量最高且Ca含量最低，说明EGTA螯合了Ca²⁺后香菇菌丝对镉的吸收受到抑制。

③、低镉胁迫下Ca+EGTA对香菇菌丝中MDA、SOD、CAT、GSH含量的影响

上述结果表明镉的吸收可能与Ca²⁺通道有关，但是Ca+EGTA处理对香菇菌丝中镉吸收的影响机制暂不清楚。由于氧化应激与镉对生物体的毒害作用有关，因此测定了MDA、SOD、CAT和GSH等氧化应激相关指标，探究Ca+EGTA对菌丝氧化应激系统的影响，研究结果见图4。

挥发性丙二醛（MDA）是香菇菌丝细胞膜脂过氧化反应的产物，MDA水平的变化表明氧化应激，因此，MDA含量是量化菌丝氧化应激的良好指标。如图4a.所示，Cd处理组的MDA含量高于CK组，说明低浓度镉也会对香菇菌丝造成氧化损伤，影响菌丝的生长繁殖；Ca+EGTA处理组的MDA含量显著低于Cd组，且和CK组之间没有显著性差异（p>0.05），这个结果表明Ca和EGTA的添加修复了Cd对香菇菌丝产生的氧化损伤，使其生长恢复到正常水平；且EGTA的添加也减缓了Ca对菌丝产生氧化胁迫，M. Nasir Khan等人研究发现在Cd胁迫（0.2 mM）下对Vigna radiata同时进行Ca 和EGTA处理（10 mM CaCl₂+10 mM EGTA）能产生最高浓度的H₂O₂ 和O₂，这与我们的研究结果相反，发明人猜测是由于Ca对Cd积累和转运的影响是剂量依赖性的，而香菇菌丝的Cd胁迫浓度比其低了约11倍，所以Ca和EGTA处理后产生了不同影响。

超氧化物歧化酶（SOD）是抵御活性氧的第一步防线，它可以催化超氧离子（O^2-）歧化生成 H₂O₂ 和O₂，在真菌的氧化应激防御中起重要作用。低镉胁迫下Ca 和EGTA共同处理对香菇菌丝体内SOD酶活性的影响见图4b。与CK组相比，Cd处理组的SOD活性显著降低（p<0.05），说明2 mg/L的Cd消耗了香菇菌丝自身的SOD，但是Cd对菌丝产生的毒害还不足以诱导SOD活性的增加；Ca+EGTA处理组SOD活性升高，恢复至CK组相似水平，和MDA变化规律一致，说明在低镉胁迫下对香菇菌丝进行Ca+EGTA处理可以抑制Cd的毒性，进一步证实了Cd的吸收转运和Ca相关。

过氧化氢酶（CAT）是生物体防御系统的关键酶，是氧化应激代谢的主要成分。与Cd处理相比，低浓度Ca和EGTA处理恢复了CAT的活性，但是高浓度Ca和EGTA处理后CAT活性降低 (图4c)，这些变化通常与内源Ca的浓度有关。

谷胱甘肽是抗Cd毒性的第一道防线，可以直接和金属结合，使细胞免于受到金属诱导的氧化损伤。由图4d可知，Cd处理后GSH含量降低，这是由于Cd与GSH反应形成谷胱甘肽-金属络合物，从而转运到液泡解毒。Ca+EGTA处理组和Cd处理组的GSH含量水平相似，可能是由于EGTA对Ca²⁺的螯合是逐步进行的，所以前期仍会有部分Cd²⁺和Ca²⁺进入细胞内，从而菌丝体消耗部分GSH起到解毒作用。

④、低镉胁迫下Ca+EGTA对香菇菌丝微观结构的影响

通过扫描电镜观察低镉胁迫下Ca+EGTA处理对香菇菌丝结构的影响，结果见图5。

由图5可知，CK组香菇菌丝形态正常，表面有较多突起；Cd处理组菌丝表面发生折皱，似缩水现象，且菌丝之间发生粘连，可能是菌丝表面突起之间发生粘连，说明低镉胁迫可能导致细胞壁组分发生变化，从而使香菇菌丝表面形态发生改变；70 mg/L Ca+EGTA处理组的菌丝形态正常且表面光滑没有突起，说明2 mg/L Cd处理下外源添加70 mg/L Ca+EGTA修复了Cd对菌丝产生的毒害，从而使菌丝正常生长；100 mg/L Ca+EGTA处理组的菌丝形态正常，菌丝表面突起减少且部分发生粘连，说明2 mg/L Cd处理下外源添加100 mg/L Ca+EGTA一定程度减缓了Cd对菌丝产生的毒害。这与香菇菌丝的生长状况相对应。菌丝细胞膜成分和膜通透性在重金属胁迫下会发生改变，以增强菌丝对重金属的抗性。所以，为了生长繁殖，Cd胁迫下的香菇菌丝通过改变细胞形态增加其耐受重金属能力，这是香菇菌丝对镉胁迫的一种响应。

与CK组相比，Cd胁迫抑制了香菇菌丝的生长，菌丝量和钙含量均低于CK组，而Ca+EGTA的共同处理则缓解了镉对香菇菌丝生长的毒害，使菌丝正常生长，且显著抑制了菌丝对镉的吸收并大幅促进了菌丝对钙的吸收。菌丝中的镉和钙来源于培养基。在低镉胁迫下，Ca+EGTA处理对香菇菌丝中镉吸收的抑制作用可能是通过氧化应激发挥作用，显著降低菌丝中MDA含量，增加SOD活性，利用GSH达到解毒作用。

实施例2

取样香菇菌株215品种，在麦芽浸粉液体培养基（普通培养基）中添加2mg/L的氯化镉，再在培养基中添加20mg/L的氯化钙和12mmol/L的EGTA，用麦芽浸粉液体培养基、添加氯化镉的麦芽浸粉培养基、添加EGTA的麦芽浸粉培养基、添加氯化镉和EGTA的麦芽浸粉液体培养基为对照，培养20 天，用微波消解-电感耦合等离子体质谱法等测定香菇菌丝中镉含量。

从图6可以看出，与不含镉的普通培养基（麦芽浸粉培养基）中正常状态的菌丝（图6A）相比，添加氯化镉后香菇菌丝球大，但量少（图6B），这说明镉会毒害香菇菌丝，影响香菇菌丝正常生长；添加EGTA后只可见极少数香菇菌丝（图6C），这说明只添加EGTA会严重影响香菇菌丝正常生长；添加氯化镉和EGTA后也是只可见极少数香菇菌丝（图6D），这说明添加EGTA不能减缓对镉造成的伤害，相反会给香菇菌丝造成更大的伤害；添加氯化镉、氯化钙和EGTA后，菌丝生长恢复正常状态，甚至长得更好（图6E），这说明氯化钙和EGTA的添加可以显著减少镉对香菇产生的负面影响，并可以加快发菌速度。

表1 2mg/L镉胁迫下，添加20mg/L的氯化钙、12mmol/L的EGTA对215菌株菌丝中钙浓度和镉浓度的影响

注：麦芽浸粉：麦芽浸粉培养基中；Cd：麦芽浸粉培养基+2mg/L氯化镉；Cd+20Ca+12EGTA：麦芽浸粉培养基+2mg/L氯化镉+20mg/L氯化钙+12mmol/L EGTA。

从表1可以看出，与不含镉的普通培养基（麦芽浸粉培养基）中正常状态的菌丝相比，添加镉后香菇菌丝中镉浓度显著提高，这说明香菇对环境中的镉非常敏感，能快速富集环境中的镉，另外钙含量也提高，这说明镉能促进香菇对环境中钙的吸收；在添加镉后再添加氯化钙和EGTA，菌丝中镉浓度降低至正常水平。与镉胁迫时菌丝相比，添加氯化钙和EGTA能显著降低镉胁迫下香菇菌丝中镉浓度，降低92.8%，这说明氯化钙和EGTA的添加可以显著减少镉对香菇产生的负面影响，抑制镉胁迫下香菇对镉的吸收，另外钙含量显著提高，提高43.8倍。

实施例3

取样香菇菌株215品种，在麦芽浸粉液体培养基（普通培养基）中添加2mg/L的氯化镉，再在培养基中添加10mg/L的氯化钙和12mmol/L的EGTA，用麦芽浸粉液体培养基、添加氯化镉的麦芽浸粉培养基、添加EGTA的麦芽浸粉培养基、添加氯化镉和EGTA的麦芽浸粉液体培养基为对照，培养20 天，用微波消解-电感耦合等离子体质谱法等测定香菇菌丝中镉含量。结果见图7。

从图7可以看出，与不含镉的普通培养基（麦芽浸粉培养基）中正常状态的菌丝（图7A）相比，添加氯化镉后香菇菌丝球大，但量少（图7B），这说明镉会毒害香菇菌丝，影响香菇菌丝正常生长；添加EGTA后只可见极少数香菇菌丝（图7C），这说明只添加EGTA会严重影响香菇菌丝正常生长；添加氯化镉和EGTA后也是只可见极少数香菇菌丝（图7D），这说明添加EGTA不能减缓对镉造成的伤害，相反会给香菇菌丝造成更大的伤害；添加氯化镉、氯化钙和EGTA后，菌丝生长恢复正常状态，甚至长得更好（图7E），这说明氯化钙和EGTA的添加可以显著减少镉对香菇产生的负面影响，并可以加快发菌速度。

表2 2mg/L镉胁迫下，添加100mg/L的氯化钙、12mmol/L的EGTA对215菌株菌丝中钙浓度和镉浓度的影响

注：麦芽浸粉：麦芽浸粉培养基中；Cd：麦芽浸粉培养基+2mg/L氯化镉；Cd+1000Ca+12EGTA：麦芽浸粉培养基+2mg/L氯化镉+100mg/L氯化钙+12mmol/L EGTA

从表2可以看出，与不含镉的普通培养基（麦芽浸粉培养基）中正常状态的菌丝相比，添加镉后香菇菌丝中镉浓度显著提高，这说明香菇对环境中的镉非常敏感，能快速富集环境中的镉，另外钙含量也提高，这说明镉能促进香菇对环境中钙的吸收；在添加镉后再添加氯化钙和EGTA，菌丝中镉浓度降低至正常水平。与镉胁迫时菌丝相比，添加氯化钙和EGTA能显著降低镉胁迫下香菇菌丝中镉浓度，降低96.1%，这说明氯化钙和EGTA的添加可以显著减少镉对香菇产生的负面影响，抑制镉胁迫下香菇对镉的吸收，另外钙含量显著提高，提高164.3倍。

实施例4

取样香菇菌株215品种，在麦芽浸粉液体培养基中添加2mg/L的氯化镉，再在培养基中分别添加50mg/L的氯化钙、12mmol/L的EGTA和100mg/L的氯化钙、12mmol/L的EGTA，用麦芽浸粉液体培养基、只添加氯化镉的麦芽浸粉培养基为对照，培养20天，测定香菇菌丝中丙二醛含量。

表3 2mg/L镉胁迫下，添加不同浓度的氯化钙、12mmol/L的EGTA对215菌株菌丝中丙二醛浓度的影响

注：麦芽浸粉：麦芽浸粉培养基中；Cd：麦芽浸粉培养基+2mg/L氯化镉；Cd+20Ca+12EGTA：麦芽浸粉培养基+2mg/L氯化镉+20mg/L氯化钙+12mmol/L EGTA；Cd+100Ca+12EGTA：麦芽浸粉培养基+2mg/L氯化镉+100mg/L氯化钙+12mmol/L EGTA。

镉能引起菌丝体内氧化胁迫。丙二醛是脂质过氧化反应的终产物，能引起蛋白质、核酸等大分子的交联聚合，且具有细胞毒性，引起细胞损伤。因此，丙二醛浓度与细胞过氧化损伤程度成正比，是衡量氧化胁迫程度的最常用指标。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.EGTA在增效氯化钙于香菇培养中富钙降镉能力的应用，其特征在于：所述的应用适用于低镉胁迫情况下的香菇培养，所述香菇采用液体培养基进行培养，其中液体培养基中氯化镉的浓度为2mg/L；所述液体培养基中EGTA的终浓度为12 mmol/L，氯化钙的终浓度为10-150mg/mL。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述香菇培养中采用的为香菇菌丝。

3.权利要求2所述的应用在培育镉浓度降低92.8%-96.6%同时钙浓度升高15-248倍的香菇品种中的应用。