CN108341977A - 一种柠檬酸交联壳聚糖水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种柠檬酸交联壳聚糖水凝胶及其制备方法，将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，加热然后加入柠檬酸，之后进行冷冻解冻，得到初步的水凝胶模型，再将水凝胶模型进行酰胺化交联反应，最终得到一种多孔、大孔以及不同形状水凝胶。本发明利用柠檬酸交联壳聚糖，得到一种生物相容性良好用于脊髓损伤修复的水凝胶，该水凝胶用于脊髓损伤可以抑制瘢痕形成以及能够减轻脊髓损伤后二次损伤的炎症反应。

Description

一种柠檬酸交联壳聚糖水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于水凝胶制备领域，特别涉及一种柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法。
背景技术
脊髓损伤是(SCI)是临床上常见的严重疾病之一，车祸、运动、暴力等机械损伤等都导致脊髓损伤，而脊髓损伤会造成患者中枢神经系统感觉运动功能的不可逆性损伤，严重影响患者的生存质量，但目前国内外尚未有有效的治疗手段，其中选用生物体植入材料为脊髓损伤提供良好的再生微环境是其中一个研究方向。
壳聚糖是自然界中唯一一种碱性多糖，是一种由甲壳素脱乙酰得到的天然分子材料，其具有生物相容性好、生物可降解性、抗氧化活性、抗菌性和抗肿瘤活性等特点，因此作为生物材料广泛应用于抗菌敷料和生物体植入材料，由于其可以抑制脊髓损伤后的瘢痕形成，因此在脊髓损伤修复领域得到广泛关注。
柠檬酸是一种三元酸，在生物代谢中具有非常重要的作用，柠檬酸为食用酸类，可增强体内正常代谢，同时柠檬酸具有抗氧化性以及抗炎作用，可以应用于抗凝血剂、解酸药、矫味剂、化妆品等领域。
水凝胶是一种不溶于水的高度交联亲水聚合物，水凝胶具有高水含量，其内部的水使得凝胶内的离子和代谢物与外部组织液进行交换，从而保持组织化学环境的平衡。水凝胶的多孔结构使细胞能够贴附和长入到支架内部。目前水凝胶常应用于软组织修复，例如皮肤损伤修复、脊髓损伤修复，具有很大的作用效果和应用前景，壳聚糖水凝胶应用于脊髓损伤已有研究，但并不能解决脊髓损伤后的二次炎症问题，而柠檬酸根的引入可以有效的减轻脊髓损伤后二次炎症反应，为受损区域提供良好的微环境，进一步促进脊髓损伤的修复。
发明内容
本发明涉及一种柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法，得到具有多孔、大孔以及不同形状水凝胶，能够满足神经细胞的迁移与分化生长。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法，其包括有以下步骤：
1)将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，在一定温度下，将柠檬酸加入到壳聚糖溶液中，搅拌得到共混溶液；
2)反复冷冻解冻共混溶液数次，得到初凝胶；
3)将解冻好的初凝胶进行酰胺化交联反应；
4)洗涤交联后的凝胶至pH为中性。
按上述方案，步骤1)中温度为40～70℃，搅拌时间是1～3小时。
按上述方案，步骤1)中乙酸溶液体积分数为1％～2％，壳聚糖添加量为乙酸溶液的3wt％～4wt％。
按上述方案，步骤1)中柠檬酸与壳聚糖的质量比例为1：6～12。
按上述方案，步骤2)中反复冷冻解冻次数为1～3次。
按上述方案，反复冷冻解冻包括以下步骤：
a)冷冻的温度为-20～-80℃，时间为8～24小时；
b)解冻的温度为20～40℃，解冻的时间为8～24小时。
按上述方案，步骤3)中酰胺化反应为将得到的初凝胶置于酰胺反应催化剂溶液中反应12h～24h。
按上述方案，所用酰胺反应催化剂溶液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液、京尼平溶液和戊二醛溶液中的任意一种，所述的EDC/NHS溶液中所用试剂是MES缓冲液，pH为4～6。
按上述方案，步骤4)中洗涤所用试剂为水、乙醇或碱性溶液，所述的碱性溶液为KOH溶液，磷酸盐缓冲液(PBS)，NaOH溶液中的一种或几种的混合，其中KOH和NaOH溶液的pH为8～11。
一种柠檬酸交联壳聚糖的水凝胶，其特征在于：应用上述制备方法制得，所述的柠檬酸交联壳聚糖的水凝胶具有多孔与大孔结构，能够满足神经细胞的迁移与分化生长。
本发明利用柠檬酸交联壳聚糖，得到一种生物相容性良好用于脊髓损伤修复的水凝胶，该水凝胶用于脊髓损伤可以抑制瘢痕形成以及能够减轻脊髓损伤后二次损伤的炎症反应。其中壳聚糖作为主体材料具有抑制瘢痕的形成，柠檬酸根离子具有抗氧化以及抗炎症的作用。
该水凝胶的形成过程是由柠檬酸的羧基与壳聚糖氨基的之间在低温下形成氢键、壳聚糖发生重排形成物理水凝胶，再通过羧基与氨基之间酰胺化反应加强交联强度构建物理化学水凝胶。
本发明的有益效果：
1.本发明针对脊髓损伤中的瘢痕和二次炎症反应，为受损区域提供良好的再生微环境，在壳聚糖溶液中加入柠檬酸，通过高温溶解，低温凝胶的方法制备出柠檬酸交联壳聚糖水凝胶。
2.本发明先使用冷冻解冻的方法制备出初凝胶，然后在酰胺化反应催化剂溶液中进一步进行酰胺化反应，加强交联强度，形成物理化学交联水凝胶。
附图说明
图1为本发明实施例1的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的红外光谱图；
图2为实施例2的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶扫描电镜图。
具体实施方式
下面通过具体实施对本发明进行进一步说明，但本发明并不限于这些实施例。以下实施例如无具体说明，采用的试剂均为市售的化学纯的化学试剂。
实施例1
将0.6g壳聚糖溶于20ml的1％乙酸溶液中得到3wt％的壳聚糖溶液，在磁力搅拌下溶解，升温至40℃，加入0.1g柠檬酸，所得溶液中柠檬酸与壳聚糖质量比为1/6，搅拌1h，然后将共混后的溶液倒入模具中超声震荡，去除里面的气泡，在-20℃下，冷冻24h，再在20℃下解冻12h得到初凝胶，配制pH为4的MES溶液，在4℃下加入EDC和NHS。然后将初凝胶置入到EDC/NHS的MES溶液中，在4℃下反应12h得到柠檬酸交联壳聚糖水凝胶，取出凝胶，分别在水，乙醇和pH为8的NaOH溶液中洗涤三次，得到最终水凝胶。
如图1，显示本发明实施例1中水凝胶的红外光谱图，可以观察到酰胺键的形成，说明柠檬酸与壳聚糖之间发生了酰胺化反应。
实施例2
将0.6g壳聚糖溶于20ml的1％乙酸溶液中得到3wt％的壳聚糖溶液，在磁力搅拌下溶解，升温至70℃，加入0.05g柠檬酸，所得溶液中柠檬酸与壳聚糖质量比为1/12，搅拌1h，然后将共混后的溶液倒入模具中超声震荡，去除里面的气泡，在-80℃下，冷冻8h，再在40℃下解冻8h得到初凝胶，配制pH为7的MES溶液，在4℃下加入EDC和NHS，然后将初凝胶置入到EDC/NHS的MES溶液中，在4℃下反应12h得到柠檬酸交联壳聚糖水凝胶，取出凝胶，分别在水、乙醇和pH为11的NaOH溶液中洗涤三次，得到最终水凝胶。
如图2所示，可以观察到水凝胶具有多孔大孔的结构。
实施例3
将0.6g壳聚糖溶于20ml的1％乙酸溶液中得到3wt％的壳聚糖溶液，在磁力搅拌下溶解，升温至40℃，加入0.1g柠檬酸，所得溶液中柠檬酸与壳聚糖质量比为1/6，搅拌1h，然后将共混后的溶液倒入模具中超声震荡，去除里面的气泡，在-20℃下，冷冻24h，再在20℃下解冻12h得到初凝胶，然后加入到京尼平溶液中进行酰胺交联反应得到柠檬酸交联壳聚糖水凝胶。分别在水、乙醇和pH为8的NaOH溶液中洗涤三次，得到最终水凝胶。
实施例4
将0.6g壳聚糖溶于15ml的1％乙酸溶液中得到4wt％的壳聚糖溶液，在磁力搅拌下溶解，升温至40℃，加入0.1g柠檬酸，所得溶液中柠檬酸与壳聚糖质量比为1/6，搅拌1h，然后将共混后的溶液倒入模具中超声震荡，去除里面的气泡，在-20℃下，冷冻24h，再在20℃下解冻12h得到初凝胶，然后加入到戊二醛溶液中进行酰胺交联反应得到柠檬酸交联壳聚糖水凝胶。分别在水、乙醇和pH为8的NaOH溶液中洗涤三次，得到最终水凝胶。
实施例5
将0.6g壳聚糖溶于20ml的1％乙酸溶液中得到3wt％的壳聚糖溶液，在磁力搅拌下溶解，升温至40℃，加入0.1g柠檬酸，所得溶液中柠檬酸与壳聚糖质量比为1/6，搅拌1h，然后将共混后的溶液倒入模具中超声震荡，去除里面的气泡，在-20℃下，冷冻24h，再在20℃下解冻12h得到初凝胶，然后加入到戊二醛溶液中进行酰胺交联反应得到柠檬酸交联壳聚糖水凝胶。分别在水、乙醇和pH为8的KOH溶液中洗涤三次，得到最终水凝胶。
实施例6
将0.6g壳聚糖溶于20ml的1％乙酸溶液中得到3wt％的壳聚糖溶液，在磁力搅拌下溶解，升温至40℃，加入0.1g柠檬酸，所得溶液中柠檬酸与壳聚糖质量比为1/6，搅拌1h，然后将共混后的溶液倒入模具中超声震荡，去除里面的气泡，在-20℃下，冷冻24h，再在20℃下解冻12h得到初凝胶，配制pH为6的MES溶液，在4℃下加入EDC和NHS。然后将初凝胶置入到EDC/NHS的MES溶液中，在4℃下反应12h得到柠檬酸交联壳聚糖水凝胶，分别在水、乙醇和pH为11的KOH溶液中洗涤三次，得到最终水凝胶。
实施例7
将0.6g壳聚糖溶于20ml的1％乙酸溶液中得到3wt％的壳聚糖溶液，在磁力搅拌下溶解，升温至40℃，加入0.1g柠檬酸，所得溶液中柠檬酸与壳聚糖质量比为1/6，搅拌1h，然后将共混后的溶液倒入模具中超声震荡，去除里面的气泡，在-20℃下，冷冻24h，再在20℃下解冻12h得到初凝胶，配制pH为4的MES溶液，在4℃下加入EDC和NHS。然后将初凝胶置入到EDC/NHS的MES溶液中，在4℃下反应24h得到柠檬酸交联壳聚糖水凝胶，取出凝胶，分别在水、乙醇和PBS溶液中洗涤三次，得到最终水凝胶。
本发明公开的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶及其制备方法，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变材料和路线等环节实现，本发明的材料和方法仅介绍部分重要实验和部分典型实施例阐明本发明的内容，但这些实例并不限制本发明的保护范围。

Claims (10)

1.柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法，其包括有以下步骤：
1)将壳聚糖溶解在乙酸溶液中，在一定温度下，将柠檬酸加入到壳聚糖溶液中，搅拌得到共混溶液；
2)反复冷冻解冻共混溶液数次，得到初凝胶；
3)将解冻好的初凝胶进行酰胺化交联反应；
4)洗涤交联后的凝胶至pH为中性。
2.根据权利要求1所述的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤1)中温度为40～70℃，搅拌时间是1～3小时。
3.根据权利要求1所述的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤1)中乙酸溶液体积分数为1％～2％，壳聚糖添加量为乙酸溶液的3wt％～4wt％。
4.根据权利要求1所述的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤1)中柠檬酸与壳聚糖的质量比例为1：6～12。
5.根据权利要求1所述的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤2)中反复冷冻解冻次数为1～3次。
6.根据权利要求1所述的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：反复冷冻解冻包括以下步骤：
a)冷冻的温度为-20～-80℃，时间为8～24小时；
b)解冻的温度为20～40℃，解冻的时间为8～24小时。
7.根据权利要求1所述的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤3)中酰胺化反应为将得到的初凝胶置于酰胺反应催化剂溶液中反应12h～24h。
8.根据权利要求7所述的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：所用酰胺反应催化剂溶液为EDC/NHS溶液、京尼平溶液和戊二醛溶液中的任意一种，所述的EDC/NHS溶液中所用试剂是MES缓冲液，pH为4～6。
9.根据权利要求1所述的柠檬酸交联壳聚糖水凝胶的制备方法，其特征在于：步骤4)中洗涤所用试剂为水、乙醇或碱性溶液，所述的碱性溶液为KOH溶液，磷酸盐缓冲液，NaOH溶液中的一种或几种的混合，其中KOH和NaOH溶液的pH为8～11。
10.一种柠檬酸交联壳聚糖的水凝胶，其特征在于：应用权利要求1～9的制备方法制得，所述的柠檬酸交联壳聚糖的水凝胶具有多孔与大孔结构，能够满足神经细胞的迁移与分化生长。
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