CN108291179A - 液体洗涤剂组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及液体洗涤剂组合物，其包含新型蛋白酶，更特别是具有提高的稳定性的新型枯草杆菌酶变体，本发明还涉及使用所述液体洗涤剂组合物进行洗涤(洗碗)的方法和所述液体组合物在洗涤(洗碗)过程中的用途。
Description
技术领域
本发明属于液体洗涤剂领域。本发明提供了液体洗涤剂，其包含新型蛋白酶，更特别是具有提高的稳定性的枯草杆菌酶(subtilase)变体。
背景技术
在洗涤剂行业，酶已在洗涤制剂中实施数十年。由于其在碱性条件下从织物去除蛋白质性污渍的能力，来自杆菌的枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)样丝氨酸蛋白酶，其属于丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌酶亚组，是特别令人感兴趣的。天然存在的(野生型)枯草杆菌酶是源自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’(Uniprot登录号：P00782，本文中以SEQ IDNO:3表示)和源自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶309(Savinase；Uniprot登录号：P29600，本文中以SEQ ID NO:2表示)。尤其是对于液体洗涤剂组合物，一大问题是在洗涤剂组合物的使用寿命期间和/或使用过程中酶活性的降低导致污渍去除减少。因此，需要新的且改进的蛋白酶，特别是与已知的枯草杆菌酶相比具有改善的稳定性。
附图说明
图1为枯草杆菌酶变体(SEQ01；SEQ ID NO:1)与枯草杆菌蛋白酶309(SEQ02；SEQID NO:2)以及枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO:2)与枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQ03；SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的比对。
发明内容
定义
“基础洗涤剂制剂”在本文中理解为除水和任选的酶以外不同洗涤剂组分的组合，以及它们在最终液体洗涤剂组合物中以总液体洗涤剂组合物的重量百分比(重量/重量％)表示的存在的指示。
术语“液体洗涤剂组分”在本文中定义为指可用于洗涤剂组合物中的化学品的类型。洗涤剂组分的实例是表面活性剂、助水溶物、增洁剂(builder)、助增洁剂、螯合剂或螯合试剂、漂白体系或漂白组分、聚合物、织物调色剂、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、分散剂、染料转移抑制剂、荧光增白剂、香料、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、去污聚合物、抗再沉积剂、酶、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。洗涤剂组合物可包含一种或多种任何类型的洗涤剂组分。
除非另有指出，否则术语“液体洗涤剂组合物”包括所有形式的液体洗涤剂组合物，包括重垢液体(heavy-duty liquid，HDL)洗涤剂和精细织物洗涤剂；织物清新剂；织物柔软剂；纺织品和洗衣预去渍剂(pre-spotter)及液体(机器)洗碗组合物。本发明的洗涤剂组合物在环境温度(例如25℃)下为液体。它们可以是各向同性的或结构化的，并且它们的粘度可以是非常低到很高，使得它们可以类似于凝胶。它们包含至少5重量/重量％的水并且优选是水性的，由此水构成组合物中溶剂的大部分。助水溶物如丙二醇和丙三醇/甘油可作为共溶剂以比水少的量包含。组合物中需要水以使表面活性剂、任何聚合物、可溶性增洁剂、酶等保持在溶液中。所述的水量包括游离水和任何束缚水两者。洗涤剂组合物中水的量优选为至少20重量/重量％，优选至少20重量/重量％并且至多95重量/重量％，如至多约70重量/重量％、至多约65重量/重量％、至多约55重量/重量％、至多约45重量/重量％或至多约35重量/重量％的水，更优选至少30重量/重量％。其他类型的液体，包括但不限于烷醇、胺、二醇、醚和多元醇，可包含在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可含有0-30重量/重量％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的，含有约5重量/重量％到少于约15或10重量/重量％的水。
如本文所用，液体洗涤剂组合物是指选自“可倾倒液体”、“凝胶”、“乳膏(cream)”以及它们的组合的形式的组合物。
如本文所定义，“可倾倒液体”是指在25℃和20sec-1的剪切速率下粘度低于约2000mPa*s的液体。在一些实施方式中，在25℃和20sec-1的剪切速率下可倾倒液体的粘度可在约200至约1000mPa*s的范围内。在一些实施方式中，在25℃和20sec-1的剪切速率下可倾倒液体的粘度可在约200至约500mPa*s的范围内。
如本文所定义，“凝胶”是指在25℃和20sec-1的剪切速率下粘度高于约2000mPa*s的透明或半透明液体。在一些实施方式中，在25℃和20sec-1的剪切速率下凝胶的粘度可在约3000至约10,000mPa*s的范围内并且在25℃和0.1sec-1的剪切速率下高于约5000mPa*s。
“乳膏”和“糊(paste)”可互换使用并如本文所定义的是指在25℃和20sec-1的剪切速率下粘度高于约2000mPa*s的不透明液体组合物。在一些实施方式中，在25℃和20sec-1的剪切速率下乳膏的粘度可在约3000至约10,000mPa*s的范围内，或者在25℃和0.1sec-1的剪切速率下高于约5000mPa*s。
术语“改善的性质”意指与本文所定义的枯草杆菌酶变体相关的与亲本枯草杆菌酶相比改善的特征。这样的改善的性质包括但不限于改善的洗涤性能、蛋白酶活性、改善的热活性特征(profile)、改善的热稳定性、改善的pH活性特征、提高的pH稳定性、提高的底物/辅因子特异性、改善的表面性质、提高的底物特异性、提高的产物特异性、提高的稳定性、贮存条件下改善的稳定性和化学稳定性。
术语“稳定性”包括贮存稳定性和使用过程(例如，洗涤过程)中的稳定性的至少一种并反映作为时间的函数的所研究的酶活性(例如，蛋白酶、淀粉酶、甘露聚糖酶和/或果胶酸裂解酶)的稳定性，例如，有多少活性在液体洗涤剂组合物的贮存和/或使用过程(本文也称作“老化过程”)中保留。稳定性受许多因素影响，例如，酶的类型、pH、温度、洗涤剂组成例如增洁剂的量、表面活性剂等。术语“改善的稳定性”或“提高的稳定性”在本文中定义为当在相同的条件下测试时，相对于包含亲本蛋白酶(优选地以SEQ ID NO:2表示的亲本蛋白酶)和/或基准蛋白酶如RelaseTM的组合物的稳定性，包含变体枯草杆菌酶的洗涤剂组合物的老化后蛋白酶活性的提高。蛋白酶稳定性通过比较在包含感兴趣的蛋白酶的液体洗涤剂组合物中于特定的温度下温育特定的时间段(优选地如本文中所示例的)后测得的残余蛋白酶活性来确定。
术语“洗衣”是指家庭洗衣和工业洗衣两者，并意指用含有洗涤剂组合物(例如本发明的组合物)的溶液处理纺织品和/或织物的过程。洗衣过程可例如使用例如家用或工业洗衣机进行或者可用手进行。
术语“洗碗”是指家庭和工业洗碗两者，并意指用含有洗涤剂组合物(例如本发明的组合物)的溶液处理优选厨具和/或餐具/饮具的过程。洗碗过程可例如使用例如家用或工业洗碗机进行或者可用手进行。
术语“成熟多肽”意指处于翻译和任何翻译后修饰如N-端加工、C-端截短、糖基化、磷酸化、自身催化活化等之后的其最终形式的多肽。在一个方面，成熟多肽具有由SEQ IDNO:1的氨基酸1至269、SEQ ID NO:2的氨基酸1至269或SEQ ID NO:3的氨基酸1至275组成的氨基酸序列。本领域已知，宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-端和/或N-端氨基酸)的混合物。
术语“亲本”也可被称为“前体枯草杆菌酶”，并意指对其加以改变以产生本文定义的枯草杆菌酶变体的蛋白酶，即用来描述对其进行突变来获得本文定义的枯草杆菌酶变体的起始蛋白酶。本文定义的枯草杆菌酶变体的亲本优选为源自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌酶，其与SEQ ID NO:2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。例如，亲本蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO:2)。
“蛋白酶”在本文中理解为具有蛋白酶活性的酶。术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)或水解肽键的能力。适用于洗涤剂中的蛋白酶主要是内肽酶(EC 3.4.21)。洗涤剂工业如洗衣中最广泛使用的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶，其是特征在于在活性位点具有的丝氨酸(其与底物形成共价加合物)的蛋白酶亚组。本发明的蛋白酶为内肽酶(EC 3.4.21)，更特别是枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体。根据Siezen et al.,1991,ProteinEngng.4:719-737和Siezen et al.,1997,Protein Science 6:501-523，枯草杆菌酶是指丝氨酸蛋白酶的亚组。枯草杆菌酶(和丝氨酸蛋白酶)特征在于除丝氨酸之外具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸残基和天冬氨酸残基。枯草杆菌酶可划分为6个分部，即枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(Lantibiotic peptidase)家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。存在若干蛋白酶活性类型。三种主要的活性类型为：胰蛋白酶样，其中在P1处的Arg或Lys之后存在酰胺底物的裂解；胰凝乳蛋白酶样，其中在P1处的疏水性氨基酸之一之后发生裂解；和弹性蛋白酶样，具有在P1处的Ala之后的裂解。出于本发明的目的，根据Suc-AAPF-pNA活性试验测定蛋白酶活性，如本文公开的实施例3中的材料和方法部分中详述的。
术语“纺织品”意指任何纺织品材料，包括纱线、纱线中间体、纤维、无纺材料、天然材料、合成材料以及由这些材料制成的织物如服装、衣服和其他物品。当使用术语织物或服装时，其也意在包括更广义的术语纺织品。
“枯草杆菌酶变体”或“变体枯草杆菌酶”或“枯草杆菌酶的变体”在本文中理解为与其亲本相比包含改变(即，在三个或更多个(例如，若干个)位置处的置换、插入和/或删除)的修饰枯草杆菌酶。优选地，如本发明的第一个方面所定义的枯草杆菌酶变体与其亲本相比具有改善的性质。枯草杆菌酶变体可通过在适于包含编码所述枯草杆菌酶变体的基因的微生物表达所述基因的条件下培养所述微生物而获得。编码枯草杆菌酶变体的基因可从编码野生型枯草杆菌酶的基因通过本领域已知的突变或DNA改组技术获得。置换意指用不同的氨基酸替换占据某个位置的氨基酸；删除意指去除占据某个位置的氨基酸；和插入意指在占据某个位置的氨基酸附近并紧接其后添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸。本文通过其具体SEQ ID NO，或通过亲本的SEQ ID NO和其后根据下文指出的命名法在方括号之间的氨基酸置换、删除和/或插入，表示枯草杆菌酶变体的氨基酸序列。如本文所定义的变体枯草杆菌酶及其亲本蛋白酶的氨基酸残基在本文中通过枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQ ID NO:3)中相应氨基酸的位置指示，如从感兴趣的蛋白酶与枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的比对(使用BLAST同源性比对进行，如在下文进一步详述的)中所呈现的。图1为枯草杆菌蛋白酶BPN’(SEQ ID NO:3)、枯草杆菌蛋白酶309(SEQ ID NO:2)和枯草杆菌蛋白酶309的变体(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的比对。
置换：对于氨基酸置换，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、置换的氨基酸。因此，用丙氨酸置换位置226处的苏氨酸命名为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变由加号标记(“+”)分开，例如，“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”，表示位置205和411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)置换。位置前的“X”意指该位置处的任何原始氨基酸可被置换。例如，X9E意指位置9处除E以外的任何氨基酸残基被E所置换；X206L意指位置206处除L以外的任何氨基酸残基被L所置换；和X262E意指位置262处除E以外的任何氨基酸残基被E所置换。
删除：对于氨基酸删除，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，位置195处甘氨酸的删除命名为“Gly195*”或“G195*”。多个删除由加号标记(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
插入：另外的氨基酸残基，例如在G195之后的赖氨酸，的插入可由Gly195GlyLys或G195GK表示。或者，另外的氨基酸残基如在G195之后的赖氨酸的插入可由*195aK表示。当插入多于一个氨基酸残基时，例如在G195之后插入Lys和Ala时，这可表示为：Gly195GlyLysAla或G195GKA。在这样的情况下，插入的氨基酸残基也可通过向在插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置号添加小写字母来编号，在此例子中为：*195aK*195bA。在上面的例子中，序列194至196因此为：
在其中置换和插入发生在同一位置处的情况下，这可表示为S99SD+S99A或简写为S99AD。同一修饰也可表示为S99A+*99aD。
在其中插入与现有氨基酸残基相同的氨基酸残基的情况下，明显的是出现命名法中的简并。例如，如果在上面的例子中在甘氨酸之后插入甘氨酸，则这由G195GG或*195GaG表示。对于以下的变化，同样的实际变化也恰好可表示为A194AG或*194aG：
这样的情况对于本领域技术人员将是显而易见的，且因此G195GG这一表示和对于这种类型的插入的相应表示意在包括这样的等同简并表示。
多重改变：包含多重改变的变体由加号标记(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”，表示位置170和195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸置换。或者，多重改变可由空格或逗号分开，例如分别表示为A170Y G195E或A170Y,G195E。
不同改变：当可在某个位置处引入不同的改变时，所述不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”表示位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸置换。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。或者，不同的改变或任选的置换可在括号中指示，例如，Arg170[Tyr,Gly]或Arg170{Tyr,Gly}或者简写为R170[Y,G]或R170{Y,G}。
术语“洗涤性能”用作洗涤剂在例如洗涤如洗衣过程中去除存在于待清洁的物体上的污渍的能力。洗衣洗涤性能可如实施例4中所示例的那样测量，即通过向纺织品施用(标准化的)污渍，并使纺织品进行洗涤程序和测量经洗涤纺织品的颜色的亮度。当用白光照射时，亮度也可以表示为从样品反射的光的强度。当样品被染污时，反射光的强度低于洁净样品的强度。因此，可使用反射光的强度来度量洗涤性能。颜色测量可使用KodakiQsmart平板扫描仪(Kodak,Midtager 29,DK-2605Denmark)进行，该扫描仪被用来捕获经洗涤纺织品的图像。如果在两种或更多种感兴趣的洗涤剂组合物之间没有显著或有意义的差异，则洗涤性能在本文中以“同等”表示。
术语“野生型枯草杆菌酶”意指由天然存在的野生型生物体如自然界中存在的细菌、古生菌、酵母、真菌、植物或动物表达的蛋白酶。野生型枯草杆菌酶的实例为枯草杆菌蛋白酶BPN’，即SEQ ID NO:2的氨基酸1至275。
如本文所用，除非另有说明，否则提及同一性百分比(％)是指使用以下进行的同源性的评估：1)使用用于氨基酸搜索的blastp和用于核酸搜索的blastn以标准默认参数进行BLAST 2.0Basic BLAST同源性搜索，其中默认地过滤查询序列的低复杂度区域(在Altschul,S.F.,Madden,T.L.,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.&Lipman,D.J.(1997)“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein databasesearch programs.”Nucleic Acids Res.25:3389-3402中描述)；2)BLAST 2比对(使用下述参数)；3)使用标准默认参数的PSI-BLAST(位置特异性迭代BLAST)；和/或4)使用来自碳水化合物活性酶数据库(Carbohydrate Active EnZymes database)的标准默认参数(Coutinho,P.M.&Henrissat,B.(1999)Carbohydrate-active enzymes:an integrateddatabase approach.In"Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering",H.J.Gilbert,G.Davies,B.Henrissat and B.Svensson eds.,The Royal Society ofChemistry,Cambridge,pp.3-12)和/或应用类似的策略使用数据库如Foly数据库(网站：foly.esil.univ-mrs.fr)和PeroxiBase(网站：peroxibase.isb-sib.ch)测定的CAZy同源性。
注意到，由于标准参数在BLAST 2.0Basic BLAST与BLAST 2之间的一些差异，使用BLAST 2程序可能将两个特定序列识别为具有显著同源性，而在BLAST 2.0Basic BLAST中使用所述序列之一作为查询序列进行的搜索可能不将第二序列鉴定为最佳匹配之一。另外，PSI-BLAST提供了自动化的、易用形式的“谱”搜索，这是查找序列同源物或变体的灵敏方式。该程序首先执行空位BLAST数据库搜索。PSI-BLAST程序使用所返回的来自任何显著比对的信息构建位置特异性的得分矩阵，其对于下一轮数据库搜索替换查询序列。因此，应理解，可通过使用这些程序中的任一个测定同一性百分比。
可如Tatusova and Madden,(1999),"Blast 2sequences-a new tool forcomparing protein and nucleotide sequences",FEMS Microbiol Lett.174:247-250中所述使用BLAST 2序列对两个特定序列进行相互比对。BLAST 2序列比对是在blastp或blastn中使用BLAST 2.0算法进行以在两个序列之间进行空位BLAST搜索(BLAST 2.0)，从而允许在所得比对中引入空位(删除和插入)。本文中为了清楚起见，使用如下标准默认参数进行BLAST 2序列比对：
对于blastn，使用0BLOSUM62矩阵：
匹配奖励得分＝1
错配罚分＝-2
开放空位(5)和延伸空位(2)罚分
空位x_下降(50)期望值(10)字段长度(11)过滤器(开)
对于blastp，使用0BLOSUM62矩阵：
开放空位(11)和延伸空位(1)罚分
空位x_下降(50)期望值(10)字段长度(3)过滤器(开)。
除非本文中另有指出，否则与给定SEQ ID NO的同一性意指基于所述序列的全长和连续长度(即，在其整个长度上或作为整体)的同一性。
如本文所用，关于本文所述核酸或氨基酸序列的术语“邻接的(contiguous)”或“连续的(consecutive)”意指以不中断的序列连接。例如，第一序列包含第二序列的30个邻接(或连续)氨基酸意指第一序列包含与第二序列中30个氨基酸残基的不中断序列100％相同的30个氨基酸残基的不中断序列。类似地，第一序列与第二序列具有“100％同一性”或是“100％相同”意指第一序列与第二序列完全匹配而在核苷酸或氨基酸之间没有空位。
当与数值结合使用时(大约10、约10)，词语“大约”或“约”优选意指该值可以是比该值多或少10％的给定值。
在本文件及在其权利要求书中，动词“包含”及其变形是以其非限制性意义使用，以表示该词后面的项目被包括，但不排除未明确提到的项目。另外，由不定冠词“一个/种(a/an)”提及要素并不排除存在多于一个/种该要素的可能性，除非上下文明确要求存在且仅存在该要素中的一个/种。因此，不定冠词“一个/种”通常意指“至少一个/种”。
本说明书中引用的所有专利和参考文献均以其全文通过引用并入本文。
具体实施方式
本发明提供了一种液体洗涤剂组合物，其包含具有与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白酶，其中所述蛋白酶是包含置换X9E+X206L+X262E的枯草杆菌酶变体。优选地，所述蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。优选地，所述蛋白酶与SEQ ID NO:1具有至少95.2％、95.5％、95.9％、96.3％、96.7％、97.0％、97.4％、97.8％、98.1％、98.5％、98.9％、99.3％、99.6％或100％的序列同一性。因此，所述蛋白酶具有与SEQ ID NO:1的少于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸差异的氨基酸序列。
本发明人已发现，与使用参考蛋白酶(RelaseTM或SavinaseTM)相比，在多种液体洗涤剂组合物背景中的老化过程中蛋白酶稳定性的预料不到的提高，而其余酶活性则保持在相当的水平。特别地，与存在RelaseTM或SavinaseTM的情况相比，非蛋白酶的酶活性更少受到根据本发明的蛋白酶的存在影响。对于包含如本文所述的枯草杆菌酶变体的多种液体洗涤剂组合物，发现在37℃或45℃下老化4周后约80％至约100％的残余蛋白酶活性，相比之下，包含亲本枯草杆菌酶而不是所述变体的比较性制剂在37℃下老化4周后残余活性为约50％，在45℃下老化4周后残余活性为约0％。与其亲本相比稳定性的提高在45℃下贮存1周后即已明显。
因此，当在相同的条件下(优选如实施例3中所述)，优选使用洗涤剂A的基础洗涤剂制剂(表1)测试时，与不同之处仅在于枯草杆菌酶变体已由相等重量/重量％的其亲本代替的洗涤剂组合物的蛋白酶稳定性相比，本发明的液体洗涤剂组合物在45℃下温育1周后优选显示出蛋白酶稳定性至少1.1倍、1.2倍、1.5倍、2.0倍、5.0倍、10倍、20倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的提高。
优选地，当在相同的条件下，优选使用洗涤剂A(表1)的基础洗涤剂制剂并于45℃下老化1周(优选如实施例3中所述)测试时，与不同之处仅在于所述蛋白酶已由具有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的蛋白酶代替的相同洗涤剂组合物相比，包含与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性但与其不同的蛋白酶的本发明液体洗涤剂组合物在老化过程中显示出至少60％、70％、85％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的蛋白酶稳定性。更优选地，当在相同的条件下，优选使用洗涤剂A(表1)的基础洗涤剂制剂并于45℃下老化1周(优选如实施例3中所述)测试时，与不同之处仅在于所述蛋白酶已由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶代替的相同洗涤剂组合物相比，包含与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性但与其不同的蛋白酶的所述液体洗涤剂组合物在老化过程中显示出至少60％、70％、85％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的蛋白酶稳定性，并且当在相同的条件下，优选使用洗涤剂A(表1)的基础洗涤剂制剂并于45℃下老化1周(优选如实施例3中所述)测试时，与不同之处仅在于所述蛋白酶已由具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白酶代替的洗涤剂组合物相比，还在老化过程中显示出同等的洗涤性能。
与包含1.0重量/重量％的RelaseTM的类似液体洗涤剂组合物相比，发现包含至少0.5重量/重量％的枯草杆菌酶变体的液体洗涤剂组合物在污渍去除方面同等有效。通常，0.5重量/重量％的枯草杆菌酶变体对多种不同的污渍(例如，蛋、巧克力冰淇淋、血液、droste巧克力奶、巧克力布丁、豌豆、搓揉的草、牛肉饼滴落物、肝、欧芹、青菜、菠菜)表现出与1.0重量/重量％的基准蛋白酶RelaseTM同等的洗涤性能。然而，如本文实施例中所详述的，与包含亲本蛋白酶的大多数液体洗涤剂组合物相比，包含枯草杆菌酶变体的液体洗涤剂组合物在37℃和45℃两者下老化后保持其去除蛋白质性污渍的性能(0.25重量/重量％的枯草杆菌酶变体与0.35重量/重量％的枯草杆菌蛋白酶309相比)。
优选地，具有与SEQ ID NO:1具有至少95％的同一性但与其不同的氨基酸序列的所述蛋白酶包含与SEQ ID NO:1相比的氨基酸改变，所述氨基酸改变是不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸置换或插入；小的删除，通常为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸的删除；小的氨基端或羧基端延伸，如氨基端甲硫氨酸残基；至多13个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或其他功能来促进纯化的小延伸(如聚组氨酸束(poly-histidine tract)、抗原性表位或结合结构域)。
保守置换的实例是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组中。通常不改变特定活性的氨基酸置换是本领域已知的并例如由H.Neurath和R.L.Hill在1979,In,The Proteins,Academic Press,New York中有述。常见的置换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、35Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。或者，所述氨基酸改变具有使得多肽的物理化学性质改变的性质。例如，氨基酸改变可改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
多肽中的关键氨基酸可根据本领域已知的程序如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定。在后一技术中，在分子中的每一残基处引入单丙氨酸突变，并测试所得突变分子的蛋白酶活性以鉴定对分子的活性至关重要的氨基酸残基。另见Hilton et al.,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可通过结构的物理分析来确定，如通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记的技术结合推定的接触位点氨基酸的突变而确定。参见例如deVos et al.,1992,Science 255:306-312；Smith et al.,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver et al.,1992,FEBS Lett.309:59-64。对于BPN’(SEQ ID NO:2)，包含氨基酸S221、H64和D32的催化三联体对于酶的蛋白酶活性是必需的。优选地，如本文所定义的枯草杆菌酶变体包含这些必需氨基酸并且没有这些氨基酸的置换。
优选地，本发明的洗涤剂组合物内包含的蛋白酶具有与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，包含置换X9E+X206L+X262E+X76D(对应于SEQ ID NO:3的多肽的氨基酸位置的位置)，并优选还包含选自以下的一个或多个改变：X3T、X4I、X15T、X24G、X24R、X27R、*36D、X43A、X43C、X43L、X43R、X43W、X68A、X72A、X72V、X78D、X87R、X87S、*97E、X98S、X99A、X99D、X99A、X99D、X99E、X99G、*99D、X101D、X101E、X101G、X101I、X101K、X101L、X101M、X101N、X101R、X103A、X104F、X104I、X104N、X104Y、X106A、X114V、X115T、X115W、X118R、X118V、X120D、X120I、X120N、X120T、X120V、X123S、X128A、X128L、X128S、X129D、X129N、X129Q、X130A、X147W、X149C、X149N、X158E、X160D、X160P、X161C、X161E、X162L、X163A、X163D、X167A、X170S、X182C、X182E、X185C、X185E、X188C、X188D、X188E、X191N、X194P、X195E、X199M、X204D、X204V、X205I、X209W、X212A、X212D、X212G、X212N、X216I、X216T、X216V、X217C、X217D、X217E、X217M、X217Q、X217Y、X218D、X218E、X218T、X222C、X222R、X222S、X225A、X232V、X235L、X236H、X245K、X245R、X252K、X255C、X255E、X256A、X256C、X256D、X256V、X256Y、X259D、X260E、X260P、X261C、X261E、X261F、X261L、X261M、X261V、X261W、X261Y和X274A，或更优选地，至少一个或多个氨基酸置换，其选自：X43R、X185E、X188E、X191N、X194P、X209W、X259D，其中所述位置对应于SEQ ID NO:3的多肽的氨基酸位置。更优选地，本发明的液体洗涤剂组合物中的蛋白酶具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列。
优选地，本发明的洗涤剂组合物内的蛋白酶为源自迟缓芽胞杆菌的枯草杆菌酶的变体，更优选是与SEQ ID NO:2具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的枯草杆菌酶变体。
优选地，本发明的液体洗涤剂组合物中与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％或至少100％序列同一性并包含置换X9E+X206L+X262E的蛋白酶为具有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶309的变体。换句话说，优选地，本发明的液体组合物包含与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的枯草杆菌蛋白酶309变体，其中所述变体至少包含以下氨基酸置换：S9E+Q206L+L262E，其中所述位置对应于SEQ ID NO:3的多肽的氨基酸位置。更优选地，所述蛋白酶包含置换S9E+Q206L+L262E+N76D。
最优选地，所述蛋白酶包含置换S9E+Q206L+L262E+N76D并还包含选自以下的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或全部氨基酸置换：S3T、V4I、A15T、S24G、S24R、K27R、*36D、N43A、N43C、N43L、N43R、N43W、V68A、I72A、I72V、S78D、N87R、N87S、*97E、A98S、S99A、S99D、S99A、S99D、S99E、S99G、*99D、S101D、S101E、S101G、S101I、S101K、S101L、S101M、S101N、S101R、S103A、V104F、V104I、V104N、V104Y、S106A、A114V、G115T、G115W、G118R、G118V、H120D、H120I、H120N、H120T、H120V、N123S、S128A、S128L、S128S、P129D、P129N、P129Q、S130A、V147W、V149C、V149N、A158E、G160D、G160P、S161C、S161E、I162L、S163A、S163D、Y167A、R170S、Q182C、Q182E、N185C、N185E、S188C、S188D、S188E、Q191N、A194P、G195E、V199M、N204D、N204V、V205I、Y209W、S212A、S212D、S212G、S212N、S216I、S216T、S216V、L217C、L217D、L217E、L217M、L217Q、L217Y、N218D、N218E、N218T、M222C、M222R、M222S、P225A、A232V、K235L、Q236H、Q245K、Q245R、N252K、T255C、T255E、S256A、S256C、S256D、S256V、S256Y、S259D、T260E、T260P、N261C、N261E、N261F、N261L、N261M、N261V、N261W、N261Y和T274A，或更优选地，选自N43R、N185E、S188E、Q191N、A194P、Y209W、S259D，其中所述位置对应于SEQ ID NO:2的多肽的氨基酸位置。
最优选地，本发明的液体洗涤剂组合物中包含的蛋白酶具有选自：SEQ ID NO:2[S9E+Q200L+L256E]、SEQ ID NO:2[S9E+Q200L+L256E+N74D]和SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
本发明的洗涤剂组合物内包含的蛋白酶可使用本领域技术人员已知的合适方法制备，优选使用常见的靶向基因突变技术和表达系统。
优选地，本发明的液体洗涤剂组合物包含如以活性酶/洗涤剂组合物总量所表示的0.0001重量/重量％至0.36重量/重量％、或0.0006重量/重量％至0.3重量/重量％、或0.003重量/重量％至0.12重量/重量％、或0.006重量/重量％至0.09重量/重量％之间的量的如本文所定义的枯草杆菌酶变体。
除含有如本文所定义的枯草杆菌酶变体外，液体洗涤剂组合物(本文也称“洗涤剂组合物“)可含有如下文所定义的另外的液体洗涤剂组分以及它们的组合。
优选地，根据本发明的液体洗涤剂组合物为液体洗碗组合物或液体洗衣组合物，更优选为液体机器洗碗组合物或液体洗衣组合物，甚至更优选为液体洗衣组合物。
本发明的洗涤剂组合物可还含有一种或多种另外的酶(如淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶(例如，内切葡聚糖酶)、角质酶、卤代过加氧酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、蛋白酶、黄原胶酶和木葡聚糖酶或它们的任何混合物)，和/或组分如表面活性剂、增洁剂、螯合剂或螯合试剂、漂白体系或漂白组分、聚合物、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂(tannish inhibitor)、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、抗腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂和增溶剂。优选地，根据本发明的洗涤剂组合物包含甘露聚糖酶、淀粉酶或它们的组合，更优选包含甘露聚糖酶。特别地，与例如SavinaseTM或RelaseTM相比，观察到贮存过程中甘露聚糖酶的活性尤其很少受根据本发明的蛋白酶影响。
根据本发明的洗涤剂组合物优选包含表面活性剂，更优选包含去污表面活性剂。去污表面活性剂意指表面活性剂作为清洁过程、优选洗衣过程的部分对被处理的纺织品织物提供去污(即，清洁效果)。
优选地，洗涤剂组合物中存在的表面活性剂的总量为0.1至85重量/重量％，更优选1至60重量/重量％，甚至更优选2至40重量/重量％，还甚至更优选3至35重量/重量％，还甚至更优选5至20重量/重量％。
优选地，去污表面活性剂包含阴离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂或它们的混合物，更优选地包含阴离子型和非离子型表面活性剂。
表面活性剂优选包含生物表面活性剂，更优选源自细菌、真菌和/或其他微生物的生物表面活性剂。表面活性剂优选包含以下中的一种或多种：糖脂生物表面活性剂(其优选为鼠李糖脂或槐糖脂或海藻糖脂或甘露糖赤藓糖醇脂质(MEL)、纤维二糖、基于肽的生物表面活性剂、脂蛋白和脂肽例如表面活性素、脂肪酸例如棒状霉菌酸(corynomucolic acid)(优选具有烃链C12-C14)、磷脂(优选的磷脂为由在正烷烃(其导致水与十六烷之间的界面张力降低至小于1mN m-1)并且30mg L-1的CMC上生长的红串红球菌产生的磷脂酰乙醇胺(Kretschner et al.,1982)，和刺孢青霉酸)；聚合物生物表面活性剂，包括emulsan、甲壳素(liposan)、甘露糖蛋白和多糖-蛋白质复合物。优选地生物表面活性剂包含鼠李糖脂。
基于表面活性剂的总重量，阴离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂或它们的组合的量优选为0.5至95重量/重量％，更优选1至50重量/重量％，甚至更优选1.5至25重量/重量％。如果使用引入阴离子型和非离子型表面活性剂两者的去污性表面活性剂混合物，则优选阴离子型表面活性剂与非离子型表面活性剂的比率为10:1至1:10。
除非另有指出，“非离子型表面活性剂”定义为分子量小于约10,000的两亲分子，其基本上不含在6-11的正常洗涤pH下表现出净电荷的任何官能团。
可使用任何类型的非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂优选为脂肪酸烷氧基化物，更优选乙氧基化物。优选的乙氧基化物具有C8-C35、更优选C10-C24的烷基链；并且优选具有3至25个、更优选5至15个环氧乙烷基团。它们是可商购的，如来自Shell(荷兰海牙)的Neodols；环氧乙烷/环氧丙烷嵌段共聚物，其可具有1,000至30,000的分子量，例如，来自BASF(德国，路德维希港)的Pluronic(商标)；和烷基酚乙氧基化物，例如可得自DowChemical(美国，密歇根州米德兰市)的Triton X-100。合适的非离子型表面活性剂包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化脂肪醇(PFA)、烷氧基化脂肪酸烷基酯如乙氧基化和/或丙氧基化脂肪酸烷基酯、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺GA或脂肪酸葡糖酰胺FAGA)，以及可以商品名SPAN和TWEEN得到的产品，及它们的组合。优选的非离子型表面活性剂为每分子包含3至9个环氧乙烷单元的C12-C18乙氧基化醇。更优选的是平均5至9个环氧乙烷基团、更优选平均7个环氧乙烷基团的C12-C15线形乙氧基化伯醇。
“阴离子型表面活性剂”定义为包含当在水溶液中时在6至11之间的正常洗涤pH下表现出净阴离子电荷的一个或多个官能团的两亲分子。
优选的阴离子型表面活性剂为有机硫反应产物的碱金属盐，其分子结构中具有含约6至24个碳原子的烷基基团及选自磺酸和硫酸酯基团的基团。更优选的阴离子型表面活性剂为以下的碱金属和碱土金属盐：脂肪酸羧酸，脂肪醇硫酸，优选伯烷基硫酸，更优选它们是乙氧基化的，例如烷基醚硫酸；和烷基苯磺酸或它们的混合物。
阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基烷烃磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、烯烃磺酸盐、烷烃-2,3-二基双(硫酸盐)、羟烷基磺酸盐和二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)如十二烷基硫酸钠(SDS)、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲烷烃磺酸盐(SAS)、链烷烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化脂肪酸甘油酯、包括甲酯磺酸盐(MES)的α-磺基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)、烷基或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基琥珀酸或皂的二酯和单酯，以及它们的组合。优选的醇醚硫酸盐为月桂基醚硫酸钠或SLES。
优选地，根据本发明的洗涤剂组合物包含阳离子型表面活性剂、两性型表面活性剂和两性离子型表面活性剂中的一种或多种。
阳离子型表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇胺季铵盐(quat)(ADMEAQ)、鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂基氯化铵(DSDMAC)和烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物以及它们的组合。如果期望，根据本发明的液体洗涤剂组合物可还含有约0重量％至约10重量％的阳离子型表面活性剂。优选的阳离子型表面活性剂为通式R1R2R3R4N+X-的季铵盐，例如其中R1为C12-C14烷基基团、R2和R3为甲基基团、R4为2-羟乙基基团、X-为卤离子。该材料可作为Praepagen(商标)HY自ClariantGmbH以40重量/重量％的水溶液形式商购获得。
两性型表面活性剂是含有酸性基团和碱性基团两者，并且将在6至11之间的正常洗涤pH下作为两性离子存在的分子。优选地两性型或两性离子型表面活性剂的量为0.1至20重量/重量％，更优选0.25至15重量/重量％，甚至更优选0.5至10重量/重量％。
合适的两性离子型表面活性剂示例为可概括地描述为脂族季铵、锍和鏻化合物的衍生物的那些，其具有含约8至约18个碳原子的一个长链基团和选自硫酸根、磺酸根、羧酸根、磷酸根或膦酸根的至少一个水增溶基团。这些化合物的通式为：
R1(R2)xY+R3Z-
其中R1含具有8至18个碳原子、0至10个亚乙基氧基团或0至2个甘油基单元的烷基、烯基或羟烷基基团；Y为氮、硫或磷原子；R2为具有1至3个碳原子的烷基或羟烷基基团；当Y为硫原子时x为1，当Y为氮或磷原子时x为2；R3为具有1至5个碳原子的烷基或羟烷基基团，Z为选自硫酸根、磺酸根、羧酸根、磷酸根或膦酸根的基团。
优选的两性或两性离子型表面活性剂为甜菜碱表面活性剂。更优选地，它们为以下列表中的一种或多种：硫酸根合甜菜碱，如3-(十二烷基二甲基铵)-1-丙烷硫酸盐；和2-(椰油二甲基铵)-1-乙烷硫酸盐。磺基甜菜碱，如：3-(十二烷基二甲基铵)-2-羟基-1-丙烷磺酸盐；3-(十四烷基二甲基铵)-1-丙烷磺酸盐；3-(C12-C14烷基酰氨基丙基二甲基铵)-2-羟基-1-丙烷磺酸盐；和3-(椰油二甲基铵)-1-丙烷磺酸盐。羧基甜菜碱，如(十二烷基二甲基铵)乙酸盐(也称月桂基甜菜碱)；(十四烷基二甲基铵)乙酸盐(也称肉桂基甜菜碱)；(椰油二甲基铵)乙酸盐(也称椰子甜菜碱)；(油基二甲基铵)乙酸盐(也称油基甜菜碱)；(十二烷基氧基甲基二甲基铵)乙酸盐；和(椰油酰氨基丙基二甲基铵)乙酸盐(也称椰油酰氨基丙基甜菜碱或CAPB)。锍甜菜碱，如：(十二烷基二甲基锍)乙酸盐；和3-(椰油二甲基锍)-1-丙烷磺酸盐。鏻甜菜碱，如4-(三甲基鏻)-1-十六烷磺酸盐；3-(十二烷基二甲基鏻)-1-丙烷磺酸盐；和2-(十二烷基二甲基鏻)-1-乙烷硫酸盐。
根据本发明的洗涤剂组合物优选包含羧基甜菜碱或磺基甜菜碱中的一种或多种作为两性或两性离子型表面活性剂，更优选包含月桂基甜菜碱。根据本发明的液体洗涤剂组合物可含有约0重量/重量％至约10重量/重量％的两性离子型表面活性剂。
在一个优选的实施方式中，本发明的液体洗涤剂组合物包含不同表面活性剂的组合，即表面活性剂体系。合适的表面活性剂体系包含表面活性剂体系的10至100重量％的阴离子型表面活性剂。优选地，本发明的液体洗涤剂组合物包含至少3重量/重量％至约40重量/重量％的表面活性剂体系，如约5重量/重量％至约30重量/重量％，包括约5重量/重量％至约15重量/重量％，或约20重量/重量％至约25重量/重量％。表面活性剂体系可完全由至少两种阴离子型表面活性剂组成，但其也可包含其他表面活性剂如非离子型和/或阳离子型表面活性剂。表面活性剂基于应用的类型来选择并包括本领域已知的任何常规表面活性剂。形成表面活性剂体系的表面活性剂可选自“Surface Active Agents”Vol.1,Schwartz and Perry,Interscience 1949；Vol.2,Schwartz,Perry and Berch,Interscience 1958；Manufacturing Confectioners Company出版的“McCutcheon'sEmulsifiers and Detergents”或“Tenside Taschenbuch”,H.Stache,2nd Edn.,CarlHauser Verlag,1981中描述的表面活性剂。
高度优选的表面活性剂体系包含两种不同的阴离子型表面活性剂，优选直链烷基苯磺酸盐和硫酸盐，例如LAS和SLES。
阴离子型表面活性剂还可包括皂(脂肪酸的盐)。优选的皂通过中和氢化椰子脂肪酸制备，例如，Prifac(R)5908(来自Croda)。也可使用饱和和不饱和脂肪酸的混合物。
优选地，表面活性剂体系包含表面活性剂体系的0至100重量％、0至85重量％、10重量％至75重量％或25重量％至50重量％的量的直链烷基苯磺酸盐(LAS)。优选地，表面活性剂体系包含表面活性剂体系的0重量％至90重量％的量的月桂基醚硫酸钠(SLES)。甚至更优选地，表面活性剂体系包含表面活性剂体系的5至75重量％的直链烷基苯磺酸盐(LAS)和表面活性剂体系的5至90重量％的月桂基醚硫酸钠(SLES)。
除阴离子型表面活性剂外，洗涤剂组合物通常含有表面活性剂体系的约0.2重量％至约50重量％的非离子型表面活性剂，例如表面活性剂体系的约0.5％至约30％、特别是约1％至约20％、约3％至约10％，如约3％至约5％或约8％至约12％。
根据本发明的尤其优选的液体洗涤剂包含表面活性剂体系的5至75重量％的直链烷基苯磺酸盐(LAS)、表面活性剂体系的5至90重量％的月桂基醚硫酸钠(SLES)和表面活性剂体系的5至60重量％的非离子型表面活性剂的。
根据本发明的洗涤剂组合物还优选包含漂白剂。用于本文中的漂白剂组分可为适用于洗涤剂组合物中的任何漂白剂，如氧漂白剂以及本领域已知的其他漂白剂。漂白剂可以是活化或未活化的漂白剂。
优选地，根据本发明的洗涤剂组合物包含氧漂白剂、卤素漂白剂或它们的组合。
优选的氧漂白剂为过羧酸漂白剂及其盐，更优选单过氧邻苯二甲酸镁六水合物、间氯过苯甲酸的镁盐、4-壬基氨基-4-氧代过氧丁酸和二过氧十二烷二酸或它们的组合中的一种或多种。
优选地，卤素漂白剂为次卤酸盐漂白剂中的一种或多种，如三氯异氰脲酸、二氯异氰脲酸钠和钾以及N-氯和N-溴烷烃磺酰胺。
优选地，漂白剂以0至50重量/重量％、0.1至25重量/重量％、或0.5至10重量/重量％、更优选地1至5重量/重量％的量添加。
本发明的洗涤剂组合物还优选包含助水溶物。助水溶物是使疏水性化合物在水性溶液中(或反过来，极性物质在非极性环境中)增溶的化合物。通常，助水溶物具有亲水和疏水特性两者(如从表面活性剂知晓的所谓两亲性)；然而，助水溶物的分子结构通常不利于自发的自聚集，参见例如Hodgdon and Kaler,2007,Current Opinion in Colloid&Interface Science 12:121-128的综述。助水溶物不显示在其之上发生自聚集的临界浓度，如对形成胶束、层状或其他明确界定的中间相的表面活性剂和脂质所发现的。相反，许多助水溶物显示出连续型聚集过程，其中聚集体的尺寸随浓度的增加而增长。然而，许多助水溶物改变含有具有极性和非极性特性的物质的体系(包括水、油、表面活性剂和聚合物的混合物)的相行为、稳定性和胶体性质。助水溶物通常用于从制药、个人护理、食品到技术应用的各个行业。洗涤剂组合物中助水溶物的使用允许例如表面活性剂的更浓缩制剂(如在通过除水而使液体洗涤剂密实的过程中)而不引起不期望的现象如相分离或高粘度。洗涤剂可含有0-5重量％、如约0.5至约5％、或约3％至约5％的助水溶物。可采用本领域已知的用于洗涤剂中的任何助水溶物。助水溶物的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺(AO)、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基硫酸钠以及它们的组合。
过氧化氢释放剂优选与漂白活化剂组合使用。优选地，过氧化氢释放剂为四乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰基氧基苯磺酸盐、3,5,-三甲基己醇氧基苯磺酸盐(ISONOBS)、五乙酰基葡萄糖(PAG)、C8(6-辛酰氨基己酰基)氧基苯磺酸盐、C9(6-壬酰氨基己酰基)氧基苯磺酸盐和C10(6-癸酰氨基己酰基)氧基苯磺酸盐中的一种或多种。
优选地，根据本发明的洗涤剂组合物包含增洁剂，更优选地包含铝硅酸盐材料、硅酸盐、聚羧酸盐和脂肪酸、材料如乙二胺四乙酸盐、金属离子螯合剂如氨基多膦酸盐中的一种或多种。甚至更优选地，根据本发明的洗涤剂组合物包含沸石A、柠檬酸或它们的组合。
增洁剂的量优选为0至35重量/重量％，更优选1至20重量/重量％，甚至更优选5至15重量/重量％。
优选地，根据本发明的洗涤剂组合物包含抑泡剂，更优选基于二氧化硅的抑泡剂、基于硅的抑泡剂或它们的混合物。甚至更优选地，根据本发明的洗涤剂组合物包含硅油和2-烷基烷醇的混合物。硅酮指烷基化聚硅氧烷材料。二氧化硅优选以细碎形式使用，例如各种类型的二氧化硅气凝胶和干凝胶和疏水性二氧化硅。
优选地，抑泡剂的量为0.001至2重量/重量％，更优选0.01至1重量/重量％。
优选地，根据本发明的洗涤剂组合物包含甲基纤维素、羧甲基纤维素和羟乙基纤维素以及均聚或共聚的聚羧酸或其盐的一种或多种抗再沉积剂(也称污垢悬浮剂)。
优选地，抗再沉积剂的量为0.5至10重量/重量％，更优选0.75至8重量/重量％，甚至更优选1至6重量/重量％。
优选地，根据本发明的洗涤剂组合物包含一种或多种污垢释放剂，更优选各种排列的对苯二甲酸与乙二醇和/或丙二醇单元的共聚物或三元共聚物。
洗涤剂组合物可包含洗涤剂液体中常见的其他成分。优选地，根据本发明的洗涤剂组合物包含助水溶物、遮光剂、着色剂、香料、成分如香料或护理添加剂的微囊、软化剂、抗氧化剂、pH控制剂和缓冲剂中的一种或多种。
优选地，液体洗涤剂组合物包含至多5重量/重量％、更优选至多3重量/重量％、甚至更优选至多2重量/重量％、还甚至更优选至多1重量/重量％、还甚至更优选至多0.5重量/重量％的(总)螯合剂。还甚至更优选地，组合物不含螯合剂。优选地，液体洗涤剂组合物包含至少一种助水溶物。还甚至更优选地，液体洗涤剂组合物不含螯合剂并且包含至少一种助水溶物。本发明的液体洗涤剂组合物可包含相对高的量的阴离子型表面活性剂，优选在存在至少一种助水溶物而不存在螯合剂的情况下。螯合剂的实例是N-(1,2-二羧乙基)-D,L-天冬氨酸(IDS)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)、磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、1-羟基乙烷1,1-二膦酸(HEPD)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)。
本文定义的枯草杆菌酶变体可通过成品组合物中锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子的水溶性来源的存在而稳定化，所述来源向酶提供这样的离子，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和氧钒(IV))。优选地，本发明的液体洗涤剂组合物包含钙，优选0.01重量/重量％至0.3重量/重量％、0.05重量/重量％至2重量/重量％或0.05重量/重量％至1.5重量/重量％的浓度的CaCl2·2H2O，如约0.05或约0.15重量/重量％(或当量％的替代性钙(II)来源)。
酶如本文所定义的枯草杆菌酶变体可使用常规的稳定剂(进一步)稳定化，例如，多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)，并且洗涤剂组合物可如例如WO 92/19709和WO92/19708中所述配制。
优选地，根据本发明的变体使用如通过引用并入本文的WO2005/105826和WO2009/118375中所述的肽醛或酮(即，基于肽的蛋白酶抑制剂)(进一步)稳定化。更优选的是基于肽的蛋白酶抑制剂，其在WO2009/118575的权利要求中以“肽化合物”公开，该专利申请公开通过引用并入本文。例如，WO2009/118575的权利要求1规定肽化合物(即，基于肽的蛋白酶抑制剂)具有以下结构：
式B2-B1-B0-R的肽化合物，其中
·R为氢、CH3、CX3、CHX2或CH2X，其中X为卤素原子；
·B0为在对位处和/或在间位处具有OH取代基的苯丙氨酸残基；
·B1为单个氨基酸残基；和
·B2由一个或多个氨基酸残基组成，任选地包含N-端保护基团。这些因此更优选作为本发明的基于肽的蛋白酶抑制剂，并且如WO2009/118575中所述的进一步优选的肽化合物也因此进一步优选作为本发明中的基于肽的蛋白酶抑制剂。
优选地，本发明的液体洗涤剂组合物包含基于肽的蛋白酶抑制剂，其中所述基于肽的蛋白酶抑制剂具有以下结构：式B2-B1-B0-R的肽化合物，其中
·R为氢、CH3、CX3、CHX2或CH2X，其中X为卤素原子；
·B0为在对位处和/或在间位处具有OH取代基的苯丙氨酸残基；
·B1为单个氨基酸残基；和
·B2由一个或多个氨基酸残基组成，任选地包含N-端保护基团。
最优选的基于肽的蛋白酶抑制剂为Z-GAY-H(如WO2009/118575中所述)。
优选地，本发明的液体洗涤剂组合物中所述基于肽的蛋白酶抑制剂的量为0.0001重量/重量％至0.0030重量/重量％、或0.0002重量/重量％至0.002重量/重量％，如约0.0002重量/重量％、0.0003重量/重量％、0.00035重量/重量％、0.0004重量/重量％、0.0005重量/重量％、0.0006重量/重量％、0.0007重量/重量％、0.0008重量/重量％、0.0009重量/重量％、0.0010重量/重量％、0.0011重量/重量％、0.0012重量/重量％、0.0013重量/重量％或0.0014重量/重量％、0.0015重量/重量％、0.0016重量/重量％、0.0017重量/重量％、0.0018重量/重量％、0.0019重量/重量％或0.002重量/重量％。
在一些优选的实施方式中，本文提供的洗涤剂组合物通常配制为使得在水性清洁操作中使用的过程中洗涤水具有约5.0至约11.5的pH，或在替代的实施方式中，甚至约6.0至约10.5的pH。在一些优选的实施方式中，液体洗涤剂组合物配制为具有约6至约8的pH。在推荐的使用水平下控制pH的技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，并且是本领域技术人员熟知的。
根据本发明的洗涤剂组合物可通过简单地混合(液体和固体)组分来制备。
优选地，根据本发明的洗涤剂组合物是单位剂量包装的组合物的形式。这样的单位剂量包装是本领域熟知的并通常包含至少部分可溶于水的外包装材料，其一旦与足量的水接触，充分崩解以使得能够释放单位剂量包装的内容物。足量的水例如为标准自动洗衣机的洗涤周期中通常使用的水的量。优选地，洗涤周期涉及与5至100克组合物组合使用10至100升水。
优选地，单位剂量包装包含5至100克组合物。优选地，单位剂量包装包含可溶于水的包装材料，更优选基本上由可溶于水的包装材料组成。
在单位剂量洗涤剂组合物的情况下，单位剂量可包含一个或多个不同的液体部分/隔室和一个或多个不同的固体部分/隔室，在这样的情况下，根据本发明的蛋白酶至少配制在所述一个或多个液体部分/隔室中。优选地，在单位剂量洗涤剂组合物的情况下，其基本上是包装的液体单位剂量组合物(即，具有很少或不具有不同的固体部分/隔室，除了单元包装本身)。
优选地，根据本发明的液体洗涤剂组合物是环境活性的。
本发明的洗涤剂组合物可配制为手动或机器洗衣洗涤剂组合物，包括适于预处理染污织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物。本发明的洗涤剂组合物可配制为手动或机器洗碗洗涤剂组合物。
在一个特别的实施方式中，本发明提供了包含与SEQ ID NO:1具有95％同一性的蛋白酶的液体洗涤剂，其中所述蛋白酶是包含置换X9E+X206L+X262E的枯草杆菌蛋白酶309的变体，并且其中所述液体洗涤剂组合物具有不同于以下两种基础洗涤剂制剂中任一的基础洗涤剂制剂：
(i)3.8％的C10-C13烷基苯磺酸(LAS)、8％的月桂基醚硫酸钠(AEOS)、4％的醇乙氧基化物(AEO)、1％的月桂酸、2％的柠檬酸三钠二水合物、3％的氢氧化钠、0.02％的CaCl2·2H2O、0.1％的Kathon防腐剂和0.4％的三乙醇胺；和
(ii)8％的C10-C13烷基苯磺酸(LAS)、4％的月桂基醚硫酸钠(AEOS)、4％的醇乙氧基化物(AEO)、0.5％的三乙醇胺(TEA)、0.5％的柠檬酸钠、1％的氢氧化钠和0.01％的CaCl2·2H2O。
在第二个方面，本发明提供了使用根据第一个方面的液体洗涤剂组合物洗涤(洗碗)的方法。优选地，所述方法是清洁织物(例如，使纺织品去污)的方法或纺织品护理方法，其包括使织物与包含如本文所定义的蛋白酶变体的洗涤剂组合物在适于清洁织物的条件下接触的步骤。可使纺织品与稀释的洗涤剂接触，例如，通过向加到包含待洗涤纺织品的洗衣机的滚筒中的漂洗水中施加洗涤剂。所述方法优选包括使洗涤剂直接接触洗衣或染污纺织品的步骤，该步骤任选地与使纺织品与洗涤剂经由加到包含纺织品的洗衣机的滚筒中的漂洗水接触相结合。织物也可用溶液在压力下处理。
织物可包括能够在正常消费者使用条件下洗衣的任何织物。洗衣过程中的水温通常为约5℃至约95℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃和约90℃。水与织物的比率通常为约1:1至约30:1。
清洁(即，洗涤)方法或纺织品护理方法可例如在机器洗涤过程中或在手动洗涤过程中进行。洗涤溶液可例如为含有洗涤剂组合物的水性洗涤溶液。过去几年中，越来越感兴趣用可再生的生物组分如酶和多肽代替洗涤剂中源自石油化学品的组分而不削弱洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变时，需要与通常使用的洗涤剂酶如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶相比的新的酶活性或者具有替代和/或改善的性质的新酶，以实现与传统洗涤剂组合物相比相似或改善的洗涤性能。
本发明还涉及本发明的液体洗涤剂组合物在蛋白质性污渍去除过程中的用途。蛋白质性污渍可以是污渍如食物污渍，例如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血液、奶、墨水、草或它们的组合。
在第三个方面，本发明提供了如本文所定义的第一个方面的液体洗涤剂组合物在制品的清洁、优选纺织品和织物的洗衣，如家庭洗衣和工业洗衣中的用途。优选地，本发明的洗涤剂组合物被用于如本文所定义的第二个方面的方法中。
本发明还通过以下实施例进一步描述，这些实施例不应理解为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：枯草杆菌酶变体的制备和表达
所有DNA操作均通过PCR进行(例如，Sambrook et al.；Molecular Cloning；ColdSpring Harbor Laboratory Press)。枯草杆菌酶变体(SEQ ID NO:1)通过DNA片段的传统克隆(Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd,Ed.Cold SpringHarbor 1989)，使用特定置换从枯草杆菌蛋白酶309(SavinaseTM)制备，该DNA片段如本领域技术人员已知的通过用含有所需插入的寡核苷酸的PCR产生。用于表达枯草杆菌酶变体的合适的宿主细胞为枯草芽孢杆菌，并且用于在枯草芽孢杆菌中表达枯草杆菌酶变体的合适的表达质粒为如先前在US 8,758,172中所述的pKH400。使用编码枯草杆菌酶变体的重组枯草芽孢杆菌构建体接种含富培养基(例如，100g/L蔗糖(Danisco目录号109-0429)、40g/L硬皮大豆(大豆粉)、10g/L Na2HPO4·12H2O(Merck目录号6579)、0.1ml/L替代物-Dowfax63N10(Dow))的摇瓶。培养通常在30℃和220rpm的振摇下进行4天。
实施例2：枯草杆菌蛋白酶309变体的纯化
培养液在26000x g下离心20分钟，并小心地从沉淀倾出上清液。通过Nalgene 0.2μm过滤单元过滤上清液以除去剩余的芽孢杆菌宿主细胞。用3M Tris碱调节0.2μm滤液中的pH至pH 8并将该pH调节的滤液施加到在20mM Tris/HCl、1mM CaCl2、pH 8.0中平衡的MEPHypercel柱(Pall Corporation)。在用平衡缓冲液洗涤柱后，用20mM CH3COOH/NaOH、1mMCaCl2、pH 4.5对柱逐步洗脱。使用Suc-AAPF-pNA测定法于pH 9下分析来自柱的级分的蛋白酶活性，并合并峰级分。用20％(体积/体积)的CH3COOH或3M Tris碱将来自MEP Hypercel柱的合并物的pH调节至pH 6，并用去离子水稀释该pH调节的合并物至与20mM MES/NaOH、2mMCaCl2、pH 6.0相同的电导率。将经稀释的合并物施加到在20mM MES/NaOH、2mM CaCl2、pH6.0中平衡的Fast Flow柱(GE Healthcare)。在用平衡缓冲液洗涤柱后，在超过5倍柱体积的相同缓冲液中用线性NaCl梯度(0→0.5M)洗脱蛋白酶变体。使用Suc-AAPF-pNA测定法于pH 9下分析来自柱的级分的蛋白酶活性并通过SDS-PAGE分析活性级分。将在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上仅观察到一个条带的级分合并为纯化制备物并贮存在包含6重量/重量％蛋白酶变体、25重量/重量％丙二醇、25重量/重量％甘油、0.14重量/重量％Z-GAY-H、4重量/重量％肽、源自发酵的糖和盐及39.86重量/重量％水的蛋白酶组合物中。该组合物用于进一步的实验。
实施例3：贮存稳定性试验
使用不同的液体洗涤剂制剂(洗涤剂1、2、3、4)和在类似的洗涤剂制剂(洗涤剂A、B、C、D)中作为基准蛋白酶的RelaseTM(Novozymes)研究包含枯草杆菌酶变体的洗涤剂组合物的贮存稳定性。洗涤剂制剂示于表1中。洗涤剂组合物1至4是根据本发明的组合物，而洗涤剂组合物A至D不是根据本发明的组合物。除6重量/重量％的活性蛋白酶型酶(RelaseTM或枯草杆菌酶变体)外，添加到如上所示洗涤剂基础制剂中的蛋白酶组合物还包含25重量/重量％的丙二醇、25重量/重量％的甘油、0.14重量/重量％的Z-GAY-H、4重量/重量％的肽、源自发酵的糖和盐及水。取完整制剂的等分试样并在不同的温度下贮存固定的时间量。贮存后，如下所示测试酶活性。结果呈现在表2中。
蛋白酶活性的检测
通过采用Suc-AAPF-PNA作为底物的方法测定蛋白水解活性。Suc-AAPF-PNA是N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且是可被内切蛋白酶裂解的封闭肽。裂解后释放游离的PNA分子，该分子具有黄色并因此可通过可见分光光度法在波长405nm处测量。Suc-AAPF-PNA底物由Bachem(目录号L1400，溶解于DMSO中)制造。将待分析的蛋白酶样品在残余的活性缓冲液(100mM Tris pH 8.6)中稀释。通过向96孔微量滴定板转移30μl经稀释的酶样品并加入70μl底物工作溶液(0.72mg/ml，在100mM Tris pH 8.6中)进行测定。将溶液于室温下混合，并在OD 405nm处测量吸收，每20秒一次，持续5分钟。时间依赖性吸收曲线的斜率(每分钟吸光度)与所讨论蛋白酶在给定条件集下的活性成正比。将蛋白酶样品稀释至斜率为线性的水平。
结果
表3详述了使用测试的不同制剂的稳定性测试结果以将枯草杆菌酶变体与RelaseTM进行比较。从表3得出，虽然每种酶活性的贮存稳定性在一定程度上取决于所用的制剂，但与RelaseTM相比，由SEQ ID NO:1表示的枯草杆菌酶变体显示出残余蛋白酶活性的提高。另外，甘露聚糖酶稳定性较少受到枯草杆菌酶变体的存在的影响(数据未示出)。
表1：液体基础洗涤剂制剂(总组合物的重量/重量％)
1包含6重量/重量％枯草杆菌酶变体(SEQ ID NO:1)的蛋白酶组合物；2包含6重量/重量％RelaseTM的蛋白酶组合物
表2：在包含基准蛋白酶(RelaseTM)、由SEQ ID NO:1表示的枯草杆菌酶变体(变体)的不同基础洗涤剂制剂中于30℃、37℃和45℃下贮存4周后的蛋白酶残余活性。
根据本发明的蛋白酶也显示出与SavinaseTM(Novozymes)相比改善的贮存稳定性。
图1：
Claims (15)
1.一种液体洗涤剂组合物，所述液体洗涤剂组合物包含具有与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的蛋白酶，其中所述蛋白酶是包含置换X9E+X206L+X262E的枯草杆菌酶变体。
2.根据权利要求2所述的液体洗涤剂组合物，其中所述蛋白酶还包含置换X76D。
3.根据权利要求1或2所述的液体洗涤剂组合物，其中所述蛋白酶还包含选自以下的一种或多种改变：X3T、X4I、X14T、X24G、X24R、X27R、*36D、X43A、X43C、X43L、X43R、X43W、X68A、X72A、X72V、X78D、X87R、X87S、*97E、X98S、X99A、X99D、X99A、X99D、X99E、X99G、*99D、X101D、X101E、X101G、X101I、X101K、X101L、X101M、X101N、X101R、X103A、X104F、X104I、X104N、X104Y、X106A、X114V、X115T、X115W、X118R、X118V、X120D、X120I、X120N、X120T、X120V、X123S、X128A、X128L、X128S、X129D、X129N、X129Q、X130A、X147W、X149C、X149N、X158E、X160D、X160P、X161C、X161E、X162L、X163A、X163D、X167A、X170S、X182C、X182E、X185C、X185E、X188C、X188D、X188E、X191N、X194P、X195E、X199M、X204D、X204V、X205I、X209W、X212A、X212D、X212G、X212N、X216I、X216T、X216V、X217C、X217D、X217E、X217M、X217Q、X217Y、X218D、X218E、X218T、X222C、X222R、X222S、X225A、X232V、X235L、X236H、X245K、X245R、X252K、X255C、X255E、X256A、X256C、X256D、X256V、X256Y、X259D、X260E、X260P、X261C、X261E、X261F、X261L、X261M、X261V、X261W、X261Y和X274A。
4.根据权利要求1-4中任一项所述的液体洗涤剂组合物，其中所述蛋白酶还包含选自X43R、X185E、X188E、X191N、X194P、X206L、X209W、X259D的1个、2个、3个、4个、5个、6个或全部置换。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的液体洗涤剂组合物，其中所述蛋白酶为源自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌酶的变体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的液体洗涤剂组合物，其中所述蛋白酶为枯草杆菌蛋白酶309的变体，其中枯草杆菌蛋白酶309具有由SEQ ID NO:2表示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的液体洗涤剂组合物，其中与具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的蛋白酶相比，所述蛋白酶在老化过程中显示出至少60％的稳定性。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的液体洗涤剂组合物，其中与具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列的蛋白酶相比，所述蛋白酶在老化过程中显示出同等的洗涤性能。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的液体洗涤剂组合物，其中所述蛋白酶具有由SEQID NO:1表示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的液体洗涤剂组合物，所述液体洗涤剂组合物包含选自淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶(例如，内切葡聚糖酶)、角质酶、卤代过加氧酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、蛋白酶、黄原胶酶和木葡聚糖酶或它们的任何混合物的一种或多种另外的酶。
11.根据权利要求1所述的液体洗涤剂组合物，所述液体洗涤剂组合物包含基于肽的蛋白酶抑制剂，其中所述基于肽的蛋白酶抑制剂具有以下结构：式B2-B1-B0-R的肽化合物，其中
·R为氢、CH3、CX3、CHX2或CH2X，其中X为卤素原子；
·B0为在对位处和/或在间位处具有OH取代基的苯丙氨酸残基；
·B1为单个氨基酸残基；和
·B2由一个或多个氨基酸残基组成，任选地包含N-端保护基团。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的液体洗涤剂组合物，其中所述洗涤剂组合物以单位剂量包装的液体洗涤剂组合物的形式包装。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的液体洗涤剂组合物，其中表面活性剂的总量为0.1至85重量/重量％，优选1至60重量/重量％，更优选2至40重量/重量％，甚至更优选3至35重量/重量％，还甚至更优选5至20重量/重量％。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的液体洗涤剂组合物，其中所述液体洗涤剂组合物为液体洗碗组合物或液体洗衣组合物，优选为液体机器洗碗组合物或液体洗衣组合物，更优选为液体洗衣组合物。
15.一种洗衣的方法，所述方法使用包含具有与SEQ ID NO:1具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的蛋白酶的液体洗衣洗涤剂组合物，其中所述蛋白酶为包含置换X9E+X206L+X262E的枯草杆菌酶变体，所述方法包括使织物与所述液体洗衣洗涤剂组合物在适于清洁所述织物的条件下接触的步骤。
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